CN107937365A

CN107937365A - 一种β‑半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107937365A
Application number: CN201810033883.4A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 吴丹; 高鑫
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2018-04-20
Anticipated expiration: 2038-01-15
Also published as: US11142753B2; US20190218536A1; CN107937365B; US20200347372A1; US10760067B2

Abstract

本发明公开了一种β‑半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用，属于基因工程和酶工程领域。通过将β‑半乳糖苷酶中的特定位点氨基酸进行突变，转入重组菌后，并在优化后的条件下进行酶转化，突变体生产的低聚半乳糖产率达到59.8％，较野生酶提高70％左右，实现了低聚半乳糖产量的提高，具有极高的工业化应用。

Description

一种β-半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种β-半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

低聚半乳糖(GOS)是一种功能性低聚糖，目前广泛应用于食品行业。GOS作为一种新型的功能性食品添加剂，因其独有的生理功能及卓越的物化性质，现已引起全世界的广泛重视。随着GOS开发研究的不断深入,加之我国原材料的丰富,消费市场的无限潜力，GOS的生产在全国已经掀起强烈的势头。目前，我国的低聚糖生产还属新兴行业，GOS的开发还未形成规模，制约我国GOS生产的主要是缺乏性能优良的工业酶，因此，寻找性能优良的工业酶至关重要。

β-半乳糖苷酶是工业酶法生产低聚半乳糖的主要用酶。不同微生物来源的β-半乳糖苷酶由于本身性质不同，生成GOS的能力也不同。目前已知的较好的生产GOS的菌株有B.circulans、Kluyveromyces Lactis、A.oryzae。尽管B.circulans(环状芽孢杆菌)的产率较高，为48.3％，但其生产GOS的产物主要是4'GalLac，其益生效果较差。而作为食品安全菌株的A.oryzae,其生产的GOS主要产物是6'GalLac，6'GalLac比4'GalLac益生效果更好，但其产率只有19％左右，大大限制了它的应用。

因此，提高米曲霉来源β-半乳糖苷酶的GOS产率，为其工业化生产创造条件，是目前要解决的技术问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种β-半乳糖苷酶的突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-半乳糖苷酶的一个或多个氨基酸位点进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-半乳糖苷酶的第140位、第264位、第304位、第806位的氨基酸中的一个或多个位点进行突变。

在本发明的一种实施方式中所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示β-半乳糖苷酶的第140位置的天冬酰胺(Asn)变成半胱氨酸(Cys)，突变体命名为N140C。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示β-半乳糖苷酶的第264位置的苯丙氨酸(Phe)变成色氨酸(Trp)，突变体命名为F264W。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示β-半乳糖苷酶的第304位置的苯丙氨酸(Phe)变成谷氨酰胺(Gln)，突变体命名为F304Q。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示β-半乳糖苷酶的第806位置的色氨酸(Trp)变成苯丙氨酸(Phe)，突变体命名为W806F。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示β-半乳糖苷酶的第264位置的苯丙氨酸(Phe)变成色氨酸(Trp)，将第140位置的天冬酰胺(Asn)变成半胱氨酸(Cys)，突变体命名为N140C/F264W。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示β-半乳糖苷酶的第140位置的天冬酰胺(Asn)变成半胱氨酸(Cys)，将第806位置的色氨酸(Trp)变成苯丙氨酸(Phe)，突变体命名为N140C/W806F。

发明的第二个目的是提供了一种β-半乳糖苷酶的突变体的制备方法，具体步骤如下：

(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带β-半乳糖苷酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含有编码突变体的基因的质粒载体。

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞。

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心，上清液即为β-半乳糖苷酶突变体的粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体是pET系列或pPIC9k中的任意一种。

发明的第三个目的是提供了一种β-半乳糖苷酶的突变体的制备低聚半乳糖的方法，具体步骤如下：

(1)以400g/L-600g/L浓度的乳糖为底物，加入β-半乳糖苷酶，加入醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为4.5-5；

(2)酶转化在水浴摇床进行，反应温度为40-60℃；

(3)反应在5-36h内进行，期间每隔4小时取一次样；

(4)反应产物进行液相分析，计算产率。

在本发明的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶添加量为2.5-5U/mL。

本发明的有益效果：本发明构建了米曲霉来源的β-半乳糖苷酶的突变体，使得转化乳糖产GOS产率从野生菌的35.2％最高提高到了59.8％，解决了此酶工业生产产率较低的问题。此酶相对野生型，转苷活性更强，适用于工业生产。

本发明应用于低聚半乳糖GOS生产，生产的最佳pH是4.5，最优温度是40℃，更适合工业化生产。

本发明在构建的突变体的基础上，对酶转化生产低聚半乳糖GOS进行了优化，使其具有更高的工业生产价值。在最优条件下进行酶转化，产率达到59.8％，比野生型提高70％左右。

附图说明

图1利用野生酶与突变体转化乳糖生低聚半乳糖的最适温度；

图2利用野生型与突变体转化乳糖生低聚半乳糖的最适pH。

具体实施方式

BMGY液体培养基：YNB：13.4g/L；酵母膏：10g/L；蛋白胨：20g/L；甘油：10g/L；K₂HPO₄：2.29g/L；KH₂PO₄:11.8g/L；(NH₄)₂SO₄：10g/L；

BMMY液体培养基：YNB：13.4g/L；酵母膏：10g/L；蛋白胨：20g/L；甲醇：40g/L；K₂HPO₄：2.29g/L；KH₂PO₄:11.8g/L；(NH₄)₂SO₄：10g/L。

酶活测定方法：

β-半乳糖苷酶活性分析用邻硝基苯酚-β-D-半乳吡喃糖苷(oNPG)作底物。

配制20mmol/L oNPG，取100μL适当稀释的发酵液或酶液、1800μL 0.1mol/L pH4.5的醋酸钠缓冲液在60℃保温5min后，加入100μL底物，于60℃保温10min，立即加入1mL1mol/L预冷的Na₂CO₃溶液中止反应并显色，用分光光度计在420nm处测定吸光值。

酶活力单位定义：在上述分析条件下，每分钟催化产生1μmol oNP的酶量为一个活力单位。

HPLC方法分析低聚半乳糖GOS产率

配置60％(W/V)乳糖溶液作为底物，加入一定量的野生酶和双突变体酶液，使得野生型酶液的最终酶活为10U/mL，突变体的最终酶活为2.5U/mL(之前做过加酶量对GOS生产的影响，以上条件分别为突变体及野生型的最适加酶量)。在最适温度及pH条件下进行反应，野生型反应10h(预实验中野生型最高产率的时间)，突变体反应5h(预实验中突变体最高产率的时间)，反应液12000rpm离心10min，取上清，用0.22nm超滤膜过滤后去20uL上HPLC分析。

反应液中，二糖，三糖，四糖，五糖在产物中的量采用HPLC来分析。测定的色谱条件为：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱Hi-Plex Na,(300×7.7mm)，示差检测器为安捷伦G1362A；流动相为纯水，流速为0.3mL/min，柱温设定为80℃。

测定二糖的色谱条件为：Agilent 1200 HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱NH₂-504E(4.6mm×250mm)，示差检测器为安捷伦G1362A；流动相采用78％(v/v)乙腈和水的混合溶液，流速为0.8mL/min，柱温设定为35℃。

低聚半乳糖产率的测定方法：

其中低聚半乳糖的产率为转移二糖、转移三糖和转移四糖的总和。

实施例1：单突变体与野生酶的制备

将β-半乳糖苷酶基因与pMD19-T simple连接，获得AorE/pMD19-T simple质粒，以其为模板，以Sac1m-F、Sac1m-R为引物进行突变。将上述的PCR产物进行Dpn1消化，得到的质粒转入大肠杆菌JM109感受态细胞，得到AorE-M/pMD19-T simple质粒。

Sac1m-F：TCCACAAGATCAGGGCTCTTGGTTTCAAC(下划线为突变位点)

Sac1m-R：GTTGAAACCAAGAGCCCTGATCTTGTGGA(下划线为突变位点)

1、野生酶的制备：将AorE-M/pMD19-T simple质粒与pPIC9k载体进行Snab1与Not1双酶切，酶切产物用T4连接酶连接，连接产物转入大肠杆菌JM109感受态细胞，挑菌提取质粒，质粒命名为AorE-M/pPIC9k。

重组菌毕赤酵母的制备:将AorE-M/pPIC9k质粒电转KM71酵母感受态细胞，重组菌命名为AorE-M/pPIC9k-KM71。

2、单突变体的制备：分别设计并合成N140C、F264W、F304Q、W806F突变的引物，对β-半乳糖苷酶基因进行定点突变。

定点突变体编码基因的PCR扩增：利用快速PCR技术，以携带编码野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因的载体AorE-M/pMD19-T simple为模板，进行PCR，分别获得突变后的质粒。

引入突变的引物分别为：

140m-F:CCGGTTCGTACATCTGTGCCGAGGTCTCA(下划线为突变位点)

140m-R:TGAGACCTCGGCACAGATGTACGAACCGG(下划线为突变位点)

806m-F:CTCGACGAGAATTTCACGGTCGGCGAGGA(下划线为突变位点)

806m-R:TCCTCGCCGACCGTGAAATTCTCGTCGAG(下划线为突变位点)

264m-F:AGCTATCCCCTCGGCTGGGATTGCGCAAACCCAT(下划线为突变位点)

264m-R:ATGGGTTTGCGCAATCCCAGCCGAGGGGATAGCT(下划线为突变位点)

F304-Q：TCCAAGCGGGTGCTAATGACCCATGGGGTG(下划线为突变位点)

264m-R:CACCCCATGGGTCATTAGCACCCGCTTGGA(下划线为突变位点)

分别测序确认β-半乳糖苷酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的质粒与pPIC9k载体进行Snab1与Not1双酶切，酶切产物用T4连接酶连接，连接产物转入大肠杆菌JM109感受态细胞，挑菌提取质粒，转入酵母KM71细胞，获得能够表达突变体基因的重组菌AorE-M/pPIC9k-N140C、AorE-M/pPIC9k-F264W、AorE-M/pPIC9k-F304Q、AorE-M/pPIC9k-W806F。

实施例2：双突变体的构建。

分别以实施例1构建的突变体N140C的质粒作为双突变的模板，并根据实施例1设计的定点突变的引物，使用快速PCR技术，对携带编码突变体N140C的基因的质粒进行定点突变，构建双突变体N140C/F264W与N140C/W806F。分别测序确认β-半乳糖苷酶双突变体的编码基因是否正确，并将测序结果正确的质粒与pPIC9k载体进行Snab1与Not1双酶切，酶切产物用T4连接酶连接，连接产物转入大肠杆菌JM109感受态细胞，挑菌提取正确的质粒，转入酵母KM71细胞，获得能够表达双突变体基因的重组菌AorE-M/pPIC9k-N140C/F264W与AorE-M/pPIC9k-N140C/W806F。

实施例3：野生菌与突变体β-半乳糖苷酶酶液制备

将重组菌AorE-M/pPIC9k/KM71、AorE-M/pPIC9k-N140C、AorE-M/pPIC9k-F264W、AorE-M/pPIC9k-F304Q、AorE-M/pPIC9k-W806F、AorE-M/pPIC9k-N140C/F264W与AorE-M/pPIC9k-N140C/W806F分别液转接于BMGY液体培养基，30℃下培养24h得到种菌液。将上述菌液离心，将菌体全部转入50mLBMMY液体培养基，30℃下培养5天，每24h加入终浓度0.75％甲醇进行诱导产酶。将发酵液进行离心，上清为粗酶液。

测定粗酶液酶活，野生型β-半乳糖苷酶(WT)和突变体的ONPG水解酶活列于表1。

表1野生型β-半乳糖苷酶和突变体酶的酶活

由表1可知：突变体对oNPG水解酶活较野生型有所下降。本实验中，酶活与产率并不是正比关系，水解酶活的高低并不代表产率的高低，水解酶活只是用来作为加酶量的定量。

实施例4：利用突变体酶转化乳糖生产低聚半乳糖的最适温度

配置60％(W/V)乳糖溶液作为底物，60g乳糖溶解在50mLpH4.5，50mml/L醋酸缓冲液中，定容至100mL。加入一定量的野生酶和双突变体酶液，使得酶液的最终酶活为2.5U/mL,置于不同温度下反应，野生型反应10h，突变体反应5h，其中，反应时间由预实验确定，分析低聚半乳糖产率。

由图1可知，野生型β-半乳糖苷酶最适酶转化温度为60℃，突变体最适酶转化温度在40-60℃，野生酶最大产率达到35.7％，而不同突变体最大产率在47.7％-59.8％之间，相比野生酶均有较大提高，其中N140C/F264W双突变体最大产率达到59.8％，是野生酶的1.67倍左右。另外，由图可见，温度对野生酶与突变体在40-60℃影响不大，更适于工业化工业化应用。

实施例5：利用突变体酶转化乳糖生产低聚半乳糖的最适pH

配置60％(W/V)乳糖溶液作为底物，60g乳糖溶解在50mL不同PH50mml/L醋酸缓冲液中，定容至100mL。加入一定量的野生酶和双突变体酶液，使得酶液的最终酶活为2.5U/mL。野生型反应温度为60℃，突变体反应温度根据实施例4中的最适温度而定，在40-60℃之间。野生型反应10h，突变体反应5h，其中，反应时间由预实验确定，分析低聚半乳糖产率。

由图2，除N140C最适pH在5外，其他突变体最适pH均在4.5。野生酶最大产率达到35.7％，而不同突变体最大产率在47.7％-59.8％之间，相比对照均有较大提高，其中N140C/F264W双突变体最大产率达到59.8％，是野生酶的1.67倍左右。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种β-半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3018

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgaagctcc tctctgttgc tgctgttgcc ttgctggcgg cacaggcagc gggtgcttcc 60

atcaagcatc gtctcaatgg cttcacgatc ctggaacatc cggatccggc gaaaagagac 120

ttgctgcaag acattgttac atgggatgac aaatctctgt tcatcaatgg agagaggatt 180

atgttattca gcggagaagt gcatcctttc agattgccag taccttcgct ttggcttgat 240

atcttccaca agatcagggc tcttggtttc aactgtgtat ctttctatat tgattgggct 300

cttctggagg gaaagcctgg cgactacaga gcagaaggca tctttgctct ggaacccttc 360

tttgatgcag ccaaggaagc aggcatttat ctgatcgccc gccccggttc gtacatcaat 420

gccgaggtct caggcggtgg cttccctgga tggttgcaga gggtcaatgg cactcttcgc 480

tcgtctgatg agccattcct taaagctact gataactata tcgccaatgc cgctgctgcc 540

gtggcgaagg ctcaaatcac gaatggaggg ccagtaattc tctaccagcc cgaaaacgaa 600

tacagcggtg gctgctgcgg tgtcaaatac cccgatgcag actacatgca gtatgttatg 660

gatcaggccc ggaaggctga cattgttgta cctttcatca gcaacgatgc ctcaccttct 720

gggcacaatg ctcctggaag tggaacgggc gctgttgata tttatggtca cgatagctat 780

cccctcggct ttgattgcgc aaacccatcc gtatggcccg agggtaaact gcccgacaac 840

ttccgcacgc tccatcttga gcagagccca tcaactccgt attcacttct tgagttccaa 900

gcgggtgctt tcgacccatg gggtggaccc ggctttgaaa aatgctatgc cctcgttaac 960

cacgaattct cgagagtttt ctataggaac gacttgagtt tcggagtttc tacctttaac 1020

ttatacatga ctttcggcgg aacaaactgg ggtaacctcg gacatcccgg tggatataca 1080

tcctacgact acggatcgcc tataactgaa acgcgaaacg ttacacggga gaagtacagc 1140

gacataaagc tccttgccaa ctttgtcaaa gcatcgccat cctatctcac cgctactccc 1200

agaaacctga ctactggtgt ttacacagac acatctgacc tggctgtcac cccgttaatt 1260

ggtgatagtc caggctcatt cttcgtggtc agacatacgg actattccag ccaagagtca 1320

acctcgtaca aacttaagct tcctaccagt gctggtaacc tgactattcc ccagctggag 1380

ggcactctaa gtctcaacgg acgtgactca aaaattcatg ttgttgatta taatgtgtct 1440

ggaacgaaca ttatctattc gacagctgaa gtcttcacct ggaagaagtt tgacggtaac 1500

aaggtcctgg tgttatacgg cggaccgaag gaacaccatg aattggccat tgcctccaag 1560

tcaaatgtga ccatcatcga aggttcggac tctggaattg tctcaacgag gaagggcagc 1620

tctgttatca ttggctggga tgtctcttct actcgtcgca tcgttcaagt cggtgacttg 1680

agagtgttcc tgcttgatag gaactctgct tacaactact gggtccccga actccccaca 1740

gaaggtactt ctcccgggtt cagcacttcg aagacgaccg cctcctccat tattgtgaag 1800

gctggctacc tcctccgagg cgctcacctt gatggtgctg atcttcatct tactgctgat 1860

ttcaatgcca ccaccccgat tgaagtgatc ggtgctccaa caggcgctaa gaatctgttc 1920

gtgaatggtg aaaaggctag ccacacagtc gacaagaacg gcatctggag cagtgaggtc 1980

aagtacgcgg ctccagagat caagctcccc ggtttgaagg atttggactg gaagtatctg 2040

gacacgcttc ccgaaattaa gtcttcctat gatgactcgg cctgggtttc ggcagacctt 2100

ccaaagacaa agaacactca ccgtcctctt gacacaccaa catcgctata ctcctctgac 2160

tatggcttcc acactggcta cctgatctac aggggtcact tcgttgccaa cggcaaggaa 2220

agcgaatttt ttattcgcac acaaggcggt agcgcattcg gaagttccgt atggctgaac 2280

gagacgtatc tgggctcttg gactggtgcc gattatgcga tggacggtaa ctctacctac 2340

aagctatctc agctggagtc gggcaagaat tacgtcatca ctgtggttat tgataacctg 2400

ggtctcgacg agaattggac ggtcggcgag gaaaccatga agaatcctcg tggtattctt 2460

agctacaagc tgagcggaca agacgccagc gcaatcacct ggaagctcac tggtaacctc 2520

ggaggagaag actaccagga taaggttaga ggacctctca acgaaggtgg actgtacgca 2580

gagcgccagg gcttccatca gcctcagcct ccaagcgaat cctgggagtc gggcagtccc 2640

cttgaaggcc tgtcgaagcc gggtatcgga ttctacactg cccagttcga ccttgacctc 2700

ccgaagggct gggatgtgcc gctgtacttc aactttggca acaacaccca ggcggctcgg 2760

gcccagctct acgtcaacgg ttaccagtat ggcaagttca ctggaaacgt tgggccacag 2820

accagcttcc ctgttcccga aggtatcctg aactaccgcg gaaccaacta tgtggcactg 2880

agtctttggg cattggagtc ggacggtgct aagctgggta gcttcgaact gtcctacacc 2940

accccagtgc tgaccggata cgggaatgtt gagtcacctg agcagcccaa gtatgagcag 3000

cggaagggag catactaa 3018

<210> 2

<211> 1005

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Lys Leu Leu Ser Val Ala Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Gln Ala

1 5 10 15

Ala Gly Ala Ser Ile Lys His Arg Leu Asn Gly Phe Thr Ile Leu Glu

20 25 30

His Pro Asp Pro Ala Lys Arg Asp Leu Leu Gln Asp Ile Val Thr Trp

35 40 45

Asp Asp Lys Ser Leu Phe Ile Asn Gly Glu Arg Ile Met Leu Phe Ser

50 55 60

Gly Glu Val His Pro Phe Arg Leu Pro Val Pro Ser Leu Trp Leu Asp

65 70 75 80

Ile Phe His Lys Ile Arg Ala Leu Gly Phe Asn Cys Val Ser Phe Tyr

85 90 95

Ile Asp Trp Ala Leu Leu Glu Gly Lys Pro Gly Asp Tyr Arg Ala Glu

100 105 110

Gly Ile Phe Ala Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ala Ala Lys Glu Ala Gly

115 120 125

Ile Tyr Leu Ile Ala Arg Pro Gly Ser Tyr Ile Asn Ala Glu Val Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Phe Pro Gly Trp Leu Gln Arg Val Asn Gly Thr Leu Arg

145 150 155 160

Ser Ser Asp Glu Pro Phe Leu Lys Ala Thr Asp Asn Tyr Ile Ala Asn

165 170 175

Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Ala Gln Ile Thr Asn Gly Gly Pro Val

180 185 190

Ile Leu Tyr Gln Pro Glu Asn Glu Tyr Ser Gly Gly Cys Cys Gly Val

195 200 205

Lys Tyr Pro Asp Ala Asp Tyr Met Gln Tyr Val Met Asp Gln Ala Arg

210 215 220

Lys Ala Asp Ile Val Val Pro Phe Ile Ser Asn Asp Ala Ser Pro Ser

225 230 235 240

Gly His Asn Ala Pro Gly Ser Gly Thr Gly Ala Val Asp Ile Tyr Gly

245 250 255

His Asp Ser Tyr Pro Leu Gly Phe Asp Cys Ala Asn Pro Ser Val Trp

260 265 270

Pro Glu Gly Lys Leu Pro Asp Asn Phe Arg Thr Leu His Leu Glu Gln

275 280 285

Ser Pro Ser Thr Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Phe Gln Ala Gly Ala Phe

290 295 300

Asp Pro Trp Gly Gly Pro Gly Phe Glu Lys Cys Tyr Ala Leu Val Asn

305 310 315 320

His Glu Phe Ser Arg Val Phe Tyr Arg Asn Asp Leu Ser Phe Gly Val

325 330 335

Ser Thr Phe Asn Leu Tyr Met Thr Phe Gly Gly Thr Asn Trp Gly Asn

340 345 350

Leu Gly His Pro Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Asp Tyr Gly Ser Pro Ile

355 360 365

Thr Glu Thr Arg Asn Val Thr Arg Glu Lys Tyr Ser Asp Ile Lys Leu

370 375 380

Leu Ala Asn Phe Val Lys Ala Ser Pro Ser Tyr Leu Thr Ala Thr Pro

385 390 395 400

Arg Asn Leu Thr Thr Gly Val Tyr Thr Asp Thr Ser Asp Leu Ala Val

405 410 415

Thr Pro Leu Ile Gly Asp Ser Pro Gly Ser Phe Phe Val Val Arg His

420 425 430

Thr Asp Tyr Ser Ser Gln Glu Ser Thr Ser Tyr Lys Leu Lys Leu Pro

435 440 445

Thr Ser Ala Gly Asn Leu Thr Ile Pro Gln Leu Glu Gly Thr Leu Ser

450 455 460

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Lys Ile His Val Val Asp Tyr Asn Val Ser

465 470 475 480

Gly Thr Asn Ile Ile Tyr Ser Thr Ala Glu Val Phe Thr Trp Lys Lys

485 490 495

Phe Asp Gly Asn Lys Val Leu Val Leu Tyr Gly Gly Pro Lys Glu His

500 505 510

His Glu Leu Ala Ile Ala Ser Lys Ser Asn Val Thr Ile Ile Glu Gly

515 520 525

Ser Asp Ser Gly Ile Val Ser Thr Arg Lys Gly Ser Ser Val Ile Ile

530 535 540

Gly Trp Asp Val Ser Ser Thr Arg Arg Ile Val Gln Val Gly Asp Leu

545 550 555 560

Arg Val Phe Leu Leu Asp Arg Asn Ser Ala Tyr Asn Tyr Trp Val Pro

565 570 575

Glu Leu Pro Thr Glu Gly Thr Ser Pro Gly Phe Ser Thr Ser Lys Thr

580 585 590

Thr Ala Ser Ser Ile Ile Val Lys Ala Gly Tyr Leu Leu Arg Gly Ala

595 600 605

His Leu Asp Gly Ala Asp Leu His Leu Thr Ala Asp Phe Asn Ala Thr

610 615 620

Thr Pro Ile Glu Val Ile Gly Ala Pro Thr Gly Ala Lys Asn Leu Phe

625 630 635 640

Val Asn Gly Glu Lys Ala Ser His Thr Val Asp Lys Asn Gly Ile Trp

645 650 655

Ser Ser Glu Val Lys Tyr Ala Ala Pro Glu Ile Lys Leu Pro Gly Leu

660 665 670

Lys Asp Leu Asp Trp Lys Tyr Leu Asp Thr Leu Pro Glu Ile Lys Ser

675 680 685

Ser Tyr Asp Asp Ser Ala Trp Val Ser Ala Asp Leu Pro Lys Thr Lys

690 695 700

Asn Thr His Arg Pro Leu Asp Thr Pro Thr Ser Leu Tyr Ser Ser Asp

705 710 715 720

Tyr Gly Phe His Thr Gly Tyr Leu Ile Tyr Arg Gly His Phe Val Ala

725 730 735

Asn Gly Lys Glu Ser Glu Phe Phe Ile Arg Thr Gln Gly Gly Ser Ala

740 745 750

Phe Gly Ser Ser Val Trp Leu Asn Glu Thr Tyr Leu Gly Ser Trp Thr

755 760 765

Gly Ala Asp Tyr Ala Met Asp Gly Asn Ser Thr Tyr Lys Leu Ser Gln

770 775 780

Leu Glu Ser Gly Lys Asn Tyr Val Ile Thr Val Val Ile Asp Asn Leu

785 790 795 800

Gly Leu Asp Glu Asn Trp Thr Val Gly Glu Glu Thr Met Lys Asn Pro

805 810 815

Arg Gly Ile Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gly Gln Asp Ala Ser Ala Ile

820 825 830

Thr Trp Lys Leu Thr Gly Asn Leu Gly Gly Glu Asp Tyr Gln Asp Lys

835 840 845

Val Arg Gly Pro Leu Asn Glu Gly Gly Leu Tyr Ala Glu Arg Gln Gly

850 855 860

Phe His Gln Pro Gln Pro Pro Ser Glu Ser Trp Glu Ser Gly Ser Pro

865 870 875 880

Leu Glu Gly Leu Ser Lys Pro Gly Ile Gly Phe Tyr Thr Ala Gln Phe

885 890 895

Asp Leu Asp Leu Pro Lys Gly Trp Asp Val Pro Leu Tyr Phe Asn Phe

900 905 910

Gly Asn Asn Thr Gln Ala Ala Arg Ala Gln Leu Tyr Val Asn Gly Tyr

915 920 925

Gln Tyr Gly Lys Phe Thr Gly Asn Val Gly Pro Gln Thr Ser Phe Pro

930 935 940

Val Pro Glu Gly Ile Leu Asn Tyr Arg Gly Thr Asn Tyr Val Ala Leu

945 950 955 960

Ser Leu Trp Ala Leu Glu Ser Asp Gly Ala Lys Leu Gly Ser Phe Glu

965 970 975

Leu Ser Tyr Thr Thr Pro Val Leu Thr Gly Tyr Gly Asn Val Glu Ser

980 985 990

Pro Glu Gln Pro Lys Tyr Glu Gln Arg Lys Gly Ala Tyr

995 1000 1005

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tccacaagat cagggctctt ggtttcaac 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gttgaaacca agagccctga tcttgtgga 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ccggttcgta catctgtgcc gaggtctca 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgagacctcg gcacagatgt acgaaccgg 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ctcgacgaga atttcacggt cggcgagga 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tcctcgccga ccgtgaaatt ctcgtcgag 29

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

agctatcccc tcggctggga ttgcgcaaac ccat 34

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

atgggtttgc gcaatcccag ccgaggggat agct 34

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tccaagcggg tgctaatgac ccatggggtg 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

caccccatgg gtcattagca cccgcttgga 30

Claims

1.一种β-半乳糖苷酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的β-半乳糖苷酶的一个或多个氨基酸位点进行突变。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是将将氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的β-半乳糖苷酶的第140位、第264位、第304位、第806位的氨基酸中的一个或多个位点进行突变。

3.根据权利要求1所述突变体，其特征在于，所述突变体为以下(a)～(d)：

(a)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-半乳糖苷酶的第140位置的天冬酰胺(Asn)变成半胱氨酸(Cys)，突变体命名为N140C；

(b)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-半乳糖苷酶的第264位置的苯丙氨酸(Phe)变成色氨酸(Trp)，突变体命名为F264W；

(c)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-半乳糖苷酶的第304位置的苯丙氨酸(Phe)变成谷氨酰胺(Gln)，突变体命名为F304Q；

(d)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-半乳糖苷酶的第806位置的色氨酸(Trp)变成苯丙氨酸(Phe)，突变体命名为W806F；

(e)突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示β-半乳糖苷酶的第264位置的苯丙氨酸(Phe)变成色氨酸(Trp)，将第140位置的天冬酰胺(Asn)变成半胱氨酸(Cys)，突变体命名为N140C/F264W；

(f)突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示β-半乳糖苷酶的第140位置的天冬酰胺(Asn)变成半胱氨酸(Cys)，将第806位置的色氨酸(Trp)变成苯丙氨酸(Phe)，突变体命名为N140C/W806F。

4.编码权利要求1-3任一所述突变体的基因。

5.携带权利要求4所述基因的载体或重组细胞。

6.表达权利要求1～3任一所述突变体的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带β-半乳糖苷酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含有编码突变体的基因的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述质粒载体是pET系列或pPIC9k中的任意一种。

8.一种应用权利要求1～3任一所述β-半乳糖苷酶的突变体的制备低聚半乳糖的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)以400g/L-600g/L浓度的乳糖为底物，加入述β-半乳糖苷酶，加入醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为4.5-5；

(2)酶转化在水浴摇床进行，反应温度为40-60℃；

(3)反应在5-36h内进行。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶添加量为2.5-5U/mL。

10.权利要求1-3任一突变体在制备用于生产低聚半乳糖的酶制剂上的应用。