CN111154741B

CN111154741B - 一种热稳定性酸性乳糖酶及基因与菌株和应用

Info

Publication number: CN111154741B
Application number: CN202010124180.XA
Authority: CN
Inventors: 杨江科; 成静
Original assignee: Wuhan Polytechnic University
Current assignee: Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2020-02-27
Filing date: 2020-02-27
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2040-02-27
Also published as: CN111154741A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种热稳定性酸性乳糖酶及基因与菌株和应用。本发明的乳糖酶AoGAL的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的乳糖酶AoGAL在原有乳糖酶的基础上通过人工定向改造而来，具有显著提高的温度稳定性和对高温的耐受性。

Description

一种热稳定性酸性乳糖酶及基因与菌株和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种热稳定性酸性乳糖酶及编码基因、重组表达载体、重组表达菌株，以及它们的制备方法和应用。

背景技术

乳糖酶(E.C.3.2.1.23)可特异性地水解乳糖和其它低聚糖和二糖中的β(1-4)半乳糖苷键的水解。在食品领域，乳糖酶主要用来使乳糖水解为葡萄糖和半乳糖。对于内源性乳糖酶功能弱的人群和乳糖不耐受的婴幼儿和成人等人群，在乳品中添加乳糖酶或者口服乳糖酶可以有效地消除乳糖的影响。另一方面，在乳品工业，乳糖酶可使低甜度和低溶解度的乳糖转变为较甜的、溶解度较大的单糖；使冰淇淋、浓缩乳、淡炼乳中乳糖结晶析出的可能性降低，同时增加甜度。随着人们生活水平的日益提高，对牛奶及各种乳制品的需求也逐步增高，但是随之也产生了乳糖不耐受的问题，而消化补充外源性乳糖酶则是缓解乳糖不耐受症状的重要解决办法。在另一领域，乳糖酶能催化β-D-半乳糖苷和α-L-阿拉伯糖苷水解。因此，在饲料中添加乳糖酶，不仅可以水解乳糖，解决乳猪的乳糖不耐受性，同进可以降饲料中的抗营养因子，提高饲料的营养效价。

乳糖酶主要来源于细菌、霉菌、酵母等微生物。通常，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的乳糖酶的最适pH为7.0～7.5之间；来源酵母菌如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的最适pH为6.0～7.0之间；来源于霉菌如黑曲霉(Aspergillusniger)的乳糖酶呈现为酸性偏好性，其最适pH在5.0左右。不同来源的乳糖酶由于其最适pH不同，因而各自的用途不同。来源于黑曲霉的乳糖酶由于其酸性的特性，在乳制品加工如在乳清的加工中去除乳糖、作为口服剂，或在饲料中添加消除乳猪对乳糖不耐受性以及消除其它抗营养因子等领域具有广泛的用途。

乳糖酶的最适温度范围为37～50℃。但是为了扩大乳糖酶的应用领域，特别是在食品、饲料、动物营养等包含高温加工工艺的领域的应用，乳糖酶的热稳定性和高温耐受性需要进一步加强。

乳糖酶的高产菌株是实现乳糖酶的工业应用的前提。目前适用于热稳定性好、酸性的乳糖酶较缺乏。传统的乳糖酶因其表达量低而使得催化效率不高，经济性不好，且热稳定性和耐温性较差、要求反应条件苛刻，并不适用大规模的在高温、酸性环境中应用。

毕赤酵母真核表达系统是目前广泛使用的真核生物表达系统，它具高密度发酵工艺成熟、生产技术配套等优点，是乳糖酶工业化生产的理想菌株。然而，由于受到毕赤酵母对异源基因密码子使用偏好性等因素的影响，来源于曲霉的乳糖酶往往不会高效表达。因此，对异源基因的密码子依据毕赤酵母的偏好性进行优化是提高其产量的有效途径。

因此，需要对乳糖酶进行改造来提高酶对温度的稳定性，通过密码子优化等手段提高乳糖酶的表达水平，降低生产和使用成本。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种热稳定性的酸性乳糖酶及基因、重组表达载体、重组表达菌株、乳糖酶制备方法，旨在提高为乳糖酶的产业化及应用奠定基础。

为了实现上述目的，本发明提供一种热稳定性酸性乳糖酶AoGAL，所述乳糖酶AoGAL的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的乳糖酶AoGAL的适宜温度为60℃，最适pH为5.5。

本发明第二方面提供一种乳糖酶基因aogal，用于编码所述的乳糖酶AoGAL，具体地，所述乳糖酶基因aogal的碱基序列与SEQ ID NO：2所示的碱基序列具有95％以上的同一性。优选地，所述乳糖酶基因aogal含有SEQ ID NO：2所示的碱基序列即可实现本发明的效果。最优选地，所述乳糖酶基因aogal的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

根据本发明，所述乳糖酶基因aogal和乳糖酶AoGAL由来自米曲霉(Aspergillusoryzae)的乳糖酶GAL(GenBank登录号：KF857462)经人工定向改造而来。原始乳糖酶基因gal的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述乳糖酶GAL的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所述。乳糖酶的人工设计如下所述：将乳糖酶基因第166位苯丙氨酸突变为酪氨酸(F166Y)，第249位苏氨酸突变为赖氨酸(T249K)，第296位亮氨酸突变为异亮氨酸(L296I)，第337位丝氨酸突变为苏氨酸(S337T)，第671位甘氨酸突变为天冬氨酸(G671D)，第771位天冬氨酸突变为脯氨酸(D771P)，第774位甲硫氨酸突变为丝氨酸(M774S)，第811位谷氨酸突变为天冬酰胺(E811N)。重新设计的氨基酸所述可采用本领域常规的各种方法实现，其具体操作步骤为本领域技术人员公知，在此不再赘述。

本发明提供了一种重组表达载体，其包括上述乳糖酶基因aogal，还可包括其他功能单元。在乳糖酶AoGAL的氨基酸序列和乳糖酶基因aogal的碱基序列确定的情况下，本领域技术人员能够选择合适的重组表达载体以及其他功能单元，例如，毕赤酵母表达载体。

根据本发明一种具体实施方式，所述重组表达载体的制备方法包括以下步骤：将乳糖酶基因aogal分别用限制性内切酶EcoR I和Not I酶切，获得具有粘性末端的乳糖酶基因aogal片段；将毕赤酵母表达载体pPICZαA分别用限制性内切酶EcoR I和Not I酶切，获得具有粘性末端的载体pPICZαA片段；将所述具有粘性末端的乳糖酶基因aogal片段和所述具有粘性末端的载体pPICZαA片段通过T4 DNA连接酶连接，获得pPIC-aogal重组表达质粒。除载体pPICZαA外，在本发明其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母表达载体。

本发明提供一种重组表达菌株，该菌株含有aogal基因，其表达产物为上述乳糖酶AoGAL。通常来说，所述宿主细胞可以是大肠杆菌、芽孢杆菌、曲霉，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞，例如动物细胞等。优选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。

根据本发明一种具体实施方式，所述重组表达菌株的制备方法包括如下步骤：将pPIC-aogal重组表达质粒通过限制性内切酶(如Bgl II限制性内切酶)线性化；将线性化的pPIC-aogal导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。可选地，通过电转化将重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。在本发明的一些实施例中，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母X-33，当然，在本发明其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母菌株。

本发明对所述重组表达菌株的制备方法没有特别限定，可根据本领域常规技术手段确定。在乳糖酶AoGaL的氨基酸序列确定的情况下，本领域技术人员能够获得合适的重组表达菌株。

本发明中，重组表达菌株制备乳糖酶的方法可以采用本领域常规的方法。根据本发明一种具体实施方式，生产乳糖酶的方法包括：挑取重组表达菌株至培养基中培养约24小时，并收获菌体；将菌体转入新鲜的培养基中，每24小时加入约1％的甲醇，诱导乳糖酶AoGAL的表达。诱导表达约96小时后，离心收集上清液，获得含乳糖酶AoGAL的溶液。在一些实施方式中，也可以通过其它方式进行培养，并将发酵上清液视为乳糖酶产物。

本发明提供一种采用乳糖酶AoGAL水解乳糖的方法，该方法包括：将上述乳糖酶AoGAL与含乳糖的物料接触。所述含乳糖的物料包括各种类型的乳制品，也包括含有乳糖类成分的其它物质。

本发明提供的乳糖酶AoGAL在原有乳糖酶的基础上通过人工定向改造，显著提高了其温度稳定性和对高温的耐受性。本发明提供的乳糖酶基因aogal以乳糖酶AoGAL的氨基酸序列为参照，以毕赤酵母密码子使用频率为标准，采用氨基酸的简并密码子中的高频密码子来翻译对应的氨基酸，从而替换原有的低频密码子，显著提高了人工定向改造后的乳糖酶AoGAL在毕赤酵母细胞中的表达量，提高了乳糖酶的酶活，其制备工艺简单且产量高，降低了乳糖酶的生产成本。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1A和图1B示出了本发明实施例1中原始乳糖酶中引入的突变位点。

图2A和2B为本发明实施例2中乳糖酶基因gal和优化后的乳糖酶基因aogal的密码子的使用频率图。

图3A和图3B为本发明实施例3中将乳糖酶基因克隆入重组表达载体pPICZαA过程的酶切检验结果。

图4为本发明实施例4中产乳糖酶菌株在摇瓶条件下表达的结果。

图5A和5B为本发明实施例5中乳糖酶的最适温度和最适pH的检测结果。

图6A和6B为本发明实施例6中高产乳糖酶AoGAL菌株在50L发酵罐中产乳糖酶的检测。

图7为本发明实施例7中乳糖酶水解牛乳中乳糖的变化曲线。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例用于说明向乳糖酶GAL中引入突变的设计过程。具体实施实施过程如下：

根据乳糖酶GAL的三维结构，所述乳糖酶AoGAL由原始乳糖酶GAL通过蛋白质设计的方式引入了9个位点突变，所述乳糖酶AoGAL的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。具体的设计包括：通过定点突变的方法将原始乳糖酶GAL第166位苯丙氨酸突变为酪氨酸(F166Y)，第249位苏氨酸突变为赖氨酸(T249K)，第296位亮氨酸突变为异亮氨酸(L296I)，第337位丝氨酸突变为苏氨酸(S337T)，第671位甘氨酸突变为天冬氨酸(G671D)，第771位天冬氨酸突变为脯氨酸(D771P)，第774位甲硫氨酸突变为丝氨酸(M774S)，第811位谷氨酸突变为天冬酰胺(E811N)。突变后的乳糖酶AoGAL的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，原始乳糖酶GAL的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

图1A所示为乳糖酶AoGAL中用于改造的氨基酸在三维结构中的位置；图1B所示为活性位点周围的突变氨基酸。

实施例2

本实施例用于说明通过密码子的优化获得乳糖酶基因aogal。

本实施例基于重新设计引入突变后的乳糖酶AoGAL的氨基酸序列，人工重新设计了乳糖酶基因的核苷酸序列。具体包括：以乳糖酶AoGAL的氨基酸序列为基础，在每一个氨基酸对应的简并密码子中，采用在毕赤酵母中高频率使用的密码子替代低频率的密码子，提高乳糖酶在翻译过程中的速度和翻译效率，提高乳糖酶的表达量。完成乳糖酶基因aogal序列的人工设计后，通过化学法人工合成了乳糖酶基因aogal。

本实施例根据乳糖酶的氨基酸序列，经人工设计并优化后的获得了新型乳糖酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示，命名为aogal，所述乳糖酶基因aogal编码出的乳糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。图2A为本发明原始乳糖酶基因gal前100个密码子的使用频率；图2B为经密码子优化后基因aogal中前100个密码子的使用频率。对比可见，本发明所获得的乳糖酶基因aogal的密码子使用频率有明显的优化。

实施例3

本实施例用于说明原始乳糖酶基因gal和优化后的乳糖酶基因aogal重组表达菌株的构建。

在基因aogal(或gal)两端加上酶切位点EcoR I和Not I酶切位点，经EcoR I和NotI酶切；同样载体pPICZαA经EcoR Ⅰ和Not I酶切；将经EcoR Ⅰ和Not I酶切的乳糖酶基因aogal(或gal)和pPICZαA通过T4 DNA连接酶连接，获得pPIC-aogal(或pPIC-gal)重组表达载体。连接体系为：总体积10μL中含有100ng的乳糖酶基因、50ng的pPICZαA和5U的T4 DNA连接酶；在4℃条件下连接过夜。将连接体系转化至大肠杆菌(TOP10)并获得重组表达载体pPIC-aogal(或pPIC-gal)。提取重组表达载体，进行双酶切验证(EcoR I、Not I)，结果如图3A和3B所示(图3A中：M为DL15000 DNA Marker，1泳道为pPIC-gal重组表达载体，2泳道为单酶切后的重组表达载体pPIC-gal，3泳道为双酶切后的重组表达载体pPIC-gal；图3B中，M为DL15000 DNA Marker，1泳道为pPIC-aogal重组表达载体，2泳道为单酶切后的重组表达载体pPIC-aogal，3泳道为双酶切后的重组表达载体pPIC-aogal)。由图可知，乳糖酶基因aogal和gal分别成功连接至pPICZαA重组表达载体上。将重组表达载体pPIC-aogal(或pPIC-gal)转化入巴斯德毕赤酵母X-33中，得到含乳糖酶基因aogal(或gal)的重组表达菌株。

实施例4

本实施例用于说明乳糖酶AoGAL和GAL在摇瓶中的发酵生产。

(1)将实施例2中含aogal和gal基因的毕赤基因工程菌分别接种到5mL YPD培养基中，培养20h，获得种子液；

(2)将上述种子液接种至含25mL BMGY发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养。BMGY发酵培养基的配方为：1％酵母粉、2％蛋白胨、100mM磷酸缓冲液(pH 6.0)、1.34％酵母氮碱、0.004％生物素、1％甘油。培养过夜后，收集菌体并转移到25mL BMMY培养基中继续培养。BMMY培养基的配方为：1％酵母粉、2％蛋白胨、100mM磷酸缓冲液(pH 6.0)、1.34％酵母氮碱、0.004％生物素、0.5％甲醇。每24h补充0.25mL甲醇，至96h时停止发酵。发酵液采用SDS-PAGE进行检测。如图4所示为发酵液的检测结果(图中：M为蛋白质标准，1-3泳道为pPIC-gal表达产物；4-6泳道为pPIC-aogal表达产物。图4说明乳糖酶基因gal和重新设计的乳糖酶基因aogal成功地表达了，且乳糖酶基因aogal的产量明显高于乳糖酶基因gal。

实施例5

本实施例用于测试乳糖酶AoGAL的最适温度和最适pH。

(1)乳糖酶活性采用还原糖法测定。步骤为：取0.5μL稀释适当倍数的发酵上清液，加入到0.5mL 0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值为5.0)和5μL 1M ONPG的混合液中，在特定温度下反应5min，加入0.5mL 1M NaCO₃终止反应。对照组则将发酵上清液煮沸5min灭活，设置两组平行。在OD420 nm处测定其吸光度值。根据所测得的吸光度，参照酶活定义推算出乳糖酶酶活。酶活单位定义为：每分钟ONPG形成1μmol ONP所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

(2)原始乳糖酶GAL和重新设计的乳糖酶AoGAL最适温度的测定体系为：用50mmoLpH 5.0的NaAC-HAC溶液配制成ONPG 1M，加入0.1mL适量稀释后的乳糖酶溶液。将上述反应体系分别置入20℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃和70℃等温度梯度，反应5分钟。反应结束后，采用上述ONPG法测定剩余的乳糖酶的活性，并绘制出乳糖酶活与温度的关系曲线。结果如图5A所示，原始的乳糖酶GAL的最适温度为50℃。经过氨基酸重新设计引入突变的乳糖酶AoGAL的最适温度为60℃。当温度在35℃和80℃之间变化时，仍保留80％以上的酶活。因此，本发明的乳糖酶AoGAL具有良好的热稳定性和耐高温特性。

(3)原始乳糖酶GAL和重新设计的乳糖酶AoGAL最适pH的测定体系为：用50mmoL pH5.0的NaAC-HAC溶液配制成ONPG 1M，加入0.1mL适量稀释后的乳糖酶溶液。将上述反应体系分别置入pH4.0、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH8.0等温度梯度，反应5分钟。反应结束后，采用上述ONPG法测定剩余的乳糖酶的活性，并绘制出乳糖酶活与温度的关系曲线。结果如图5B所示，乳糖酶GAL和AoGAL的最适pH均为pH5.5，当pH在5至6之间变化时，两者均能保持85％以上的酶活性。两者间的酶活与pH关系曲线变化趋势一致。因此，本发明乳糖酶AoGAL为酸性乳糖酶。

实施例6

本实施例用于说明乳糖酶AoGAL在发酵罐中的发酵生产。

(1)将实施例3中的乳糖酶毕赤基因工程菌接种到500mL YPD培养基中，培养24h，获得种子液；

(2)将上述种子液接种至含50-L无机盐发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，其中，发酵培养基包括：1500g KH₂PO₄、35g CaSO₄、200g(NH₄)₂SO₄、250g MgSO₄、600g K₂SO₄和2600g甘油。

(3)在生长的前期阶段，培养温度为300℃，pH值为6.0，转速为300rpm，通气量3.0L/min。本阶段持续约30h。生长阶段结束后即进入甲醇诱导表达阶段。在此阶段，溶氧维持在10-25％，温度28℃，pH值为5.0-6.0，甲醇流速为2.5mL/L/h，流加时间为96h。每隔12h取样，并测定发酵液的乳糖酶活性。定期检测发酵液中的乳糖酶活性。检测结果如图6A和6B所示。由图6A可知，乳糖酶AoGAL生产水平随着培养时间的延长，产量稳步增加。图6B可知乳糖酶活性也同步增加，在培养时间为260h时，发酵液中乳糖酶的活力最高为6,180U/mL发酵液。

实施例7

本实施例用于说明采用乳糖酶AoGAL水解鲜牛乳中的乳糖。

(1)乳糖酶AoGAL水解乳糖：取0.5mL实施例6制备的发酵上清液，用蒸馏水稀释100倍，取0.5mL置于25mL试管中，加入2.5ml发色剂。准确称取乳糖标准工作液0.00mL，0.20mL，0.40mL，0.60mL，0.80mL和1.0mL，分别置于25mL含2.5mL苯酚溶液发色剂的试管中。将加入了乳糖酶的样液、样品空白液和乳糖标准液的试管煮沸6min后取出，冷却后用水稀释至25mL。震荡均匀后，于OD520 nm处测定吸光度值。测定时，乳糖标准液以不添加乳糖标准液的空白液为零点，绘制标准曲线，样液以样品空白液为零点，并从标准曲线中得出样液中乳糖的含量。计算公式：X＝(m1/m2)×100，式中X为样品中乳糖的含量(％)；mL为测定时样液中乳糖的质量，单位为毫克；m2为测定时样液相当于样品的质量，单位为毫克。结果如图7所示(不同浓度的乳糖酶水解牛乳中乳糖的反应曲线)。由图7可知，本发明提供的乳糖酶可以有效地水解牛乳中的乳糖，且随着乳糖酶量加入量的增大，乳糖的降解更为充分。

综上所述，本发明通过酶分子设计向原始乳糖酶中引入9个位点的氨基酸突变，显著提高了其热稳定性和耐高温的特性，并根据毕赤酵母对同一氨基酸的简并密码子的偏好性对乳糖酶基因的核苷酸序列进行优化设计，合成出热稳定性的酸性乳糖酶基因aogal。该基因与表达载体pPICZαA连接后，转入毕赤酵母中表达，获得了高效表达的、高产、热稳定性好的酸性的乳糖酶生产菌株；其在发酵罐中诱导表达260小时后，上清液中乳糖酶的酶活可达6,180U/mL。本发明获得的耐高温乳糖酶的最适温度为60℃，且对果胶具有高效的水解能力。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 武汉轻工大学

<120> 一种热稳定性酸性乳糖酶及基因与菌株和应用

<130> BJI1901918WHPU

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1005

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Leu Leu Ser Val Ala Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Gln Ala

1 5 10 15

Ala Gly Ala Ser Ile Lys His Arg Leu Asn Gly Phe Thr Ile Leu Glu

20 25 30

His Pro Asp Pro Ala Lys Arg Asp Leu Leu Gln Asp Ile Val Thr Trp

35 40 45

Asp Asp Lys Ser Leu Phe Ile Asn Gly Glu Arg Ile Met Leu Phe Ser

50 55 60

Gly Glu Val His Pro Phe Arg Leu Pro Val Pro Ser Leu Trp Leu Asp

65 70 75 80

Ile Phe His Lys Ile Arg Ala Leu Gly Phe Asn Cys Val Ser Phe Tyr

85 90 95

Ile Asp Trp Ala Leu Leu Glu Gly Lys Pro Gly Asp Tyr Arg Ala Glu

100 105 110

Gly Ile Phe Ala Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ala Ala Lys Glu Ala Gly

115 120 125

Ile Tyr Leu Ile Ala Arg Pro Gly Ser Tyr Ile Asn Ala Glu Val Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Phe Pro Gly Trp Leu Gln Arg Val Asn Gly Thr Leu Arg

145 150 155 160

Ser Ser Asp Glu Pro Tyr Leu Lys Ala Thr Asp Asn Tyr Ile Ala Asn

165 170 175

Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Ala Gln Ile Thr Asn Gly Gly Pro Val

180 185 190

Ile Leu Tyr Gln Pro Glu Asn Glu Tyr Ser Gly Gly Cys Cys Gly Val

195 200 205

Lys Tyr Pro Asp Ala Asp Tyr Met Gln Tyr Val Met Asp Gln Ala Arg

210 215 220

Lys Ala Asp Ile Val Val Pro Phe Ile Ser Asn Asp Ala Ser Pro Ser

225 230 235 240

Gly His Asn Ala Pro Gly Ser Gly Lys Gly Ala Val Asp Ile Tyr Gly

245 250 255

His Asp Ser Tyr Pro Leu Gly Phe Asp Cys Ala Asn Pro Ser Val Trp

260 265 270

Pro Glu Gly Lys Leu Pro Asp Asn Phe Arg Thr Leu His Leu Glu Gln

275 280 285

Ser Pro Ser Thr Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Phe Gln Ala Gly Ala Phe

290 295 300

Asp Pro Trp Gly Gly Pro Gly Phe Glu Lys Cys Tyr Ala Leu Val Asn

305 310 315 320

His Glu Phe Ser Arg Val Phe Tyr Arg Asn Asp Leu Ser Phe Gly Val

325 330 335

Thr Thr Phe Asn Leu Tyr Met Thr Phe Gly Gly Thr Asn Trp Gly Asn

340 345 350

Leu Gly His Pro Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Asp Tyr Gly Ser Pro Ile

355 360 365

Thr Glu Thr Arg Asn Val Thr Arg Glu Lys Tyr Ser Asp Ile Lys Leu

370 375 380

Leu Ala Asn Phe Val Lys Ala Ser Pro Ser Tyr Leu Thr Ala Thr Pro

385 390 395 400

Arg Asn Leu Thr Thr Gly Val Tyr Thr Asp Thr Ser Asp Leu Ala Val

405 410 415

Thr Pro Leu Ile Gly Asp Ser Pro Gly Ser Phe Phe Val Val Arg His

420 425 430

Thr Asp Tyr Ser Ser Gln Glu Ser Thr Ser Tyr Lys Leu Lys Leu Pro

435 440 445

Thr Ser Ala Gly Asn Leu Thr Ile Pro Gln Leu Glu Gly Thr Leu Ser

450 455 460

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Lys Ile His Val Val Asp Tyr Asn Val Ser

465 470 475 480

Gly Thr Asn Ile Ile Tyr Ser Thr Ala Glu Val Phe Thr Trp Lys Lys

485 490 495

Phe Asp Gly Asn Lys Val Leu Val Leu Tyr Gly Gly Pro Lys Glu His

500 505 510

His Glu Leu Ala Ile Ala Ser Lys Ser Asn Val Thr Ile Ile Glu Gly

515 520 525

Ser Asp Ser Gly Ile Val Ser Thr Arg Lys Gly Ser Ser Val Ile Ile

530 535 540

Gly Trp Asp Val Ser Ser Thr Arg Arg Ile Val Gln Val Gly Asp Leu

545 550 555 560

Arg Val Phe Leu Leu Asp Arg Asn Ser Ala Tyr Asn Tyr Trp Val Pro

565 570 575

Glu Leu Pro Thr Glu Gly Thr Ser Pro Gly Phe Ser Thr Ser Lys Thr

580 585 590

Thr Ala Ser Ser Ile Ile Val Lys Ala Gly Tyr Leu Leu Arg Gly Ala

595 600 605

His Leu Asp Gly Ala Asp Leu His Leu Thr Ala Asp Phe Asn Ala Thr

610 615 620

Thr Pro Ile Glu Val Ile Gly Ala Pro Thr Gly Ala Lys Asn Leu Phe

625 630 635 640

Val Asn Gly Glu Lys Ala Ser His Thr Val Asp Lys Asn Gly Ile Trp

645 650 655

Ser Ser Glu Val Lys Tyr Ala Ala Pro Glu Ile Lys Leu Pro Asp Leu

660 665 670

Lys Asp Leu Asp Trp Lys Tyr Leu Asp Thr Leu Pro Glu Ile Lys Ser

675 680 685

Ser Tyr Asp Asp Ser Ala Trp Val Ser Ala Asp Leu Pro Lys Thr Lys

690 695 700

Asn Thr His Arg Pro Leu Asp Thr Pro Thr Ser Leu Tyr Ser Ser Asp

705 710 715 720

Tyr Gly Phe His Thr Gly Tyr Leu Ile Tyr Arg Gly His Phe Val Ala

725 730 735

Asn Gly Lys Glu Ser Glu Phe Phe Ile Arg Thr Gln Gly Gly Ser Ala

740 745 750

Phe Gly Ser Ser Val Trp Leu Asn Glu Thr Tyr Leu Gly Ser Trp Thr

755 760 765

Gly Ala Pro Tyr Ala Ser Asp Gly Asn Ser Thr Tyr Lys Leu Ser Gln

770 775 780

Leu Glu Ser Gly Lys Asn Tyr Val Ile Thr Val Val Ile Asp Asn Leu

785 790 795 800

Gly Leu Asp Glu Asn Trp Thr Val Gly Glu Asn Thr Met Lys Asn Pro

805 810 815

Arg Gly Ile Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gly Gln Asp Ala Ser Ala Ile

820 825 830

Thr Trp Lys Leu Thr Gly Asn Leu Gly Gly Glu Asp Tyr Gln Asp Lys

835 840 845

Val Arg Gly Pro Leu Asn Glu Gly Gly Leu Tyr Ala Glu Arg Gln Gly

850 855 860

Phe His Gln Pro Gln Pro Pro Ser Glu Ser Trp Glu Ser Gly Ser Pro

865 870 875 880

Leu Glu Gly Leu Ser Lys Pro Gly Ile Gly Phe Tyr Thr Ala Gln Phe

885 890 895

Asp Leu Asp Leu Pro Lys Gly Trp Asp Val Pro Leu Tyr Phe Asn Phe

900 905 910

Gly Asn Asn Thr Gln Ala Ala Arg Ala Gln Leu Tyr Val Asn Gly Tyr

915 920 925

Gln Tyr Gly Lys Phe Thr Gly Asn Val Gly Pro Gln Thr Ser Phe Pro

930 935 940

Val Pro Glu Gly Ile Leu Asn Tyr Arg Gly Thr Asn Tyr Val Ala Leu

945 950 955 960

Ser Leu Trp Ala Leu Glu Ser Asp Gly Ala Lys Leu Gly Ser Phe Glu

965 970 975

Leu Ser Tyr Thr Thr Pro Val Leu Thr Gly Tyr Gly Asn Val Glu Ser

980 985 990

Pro Glu Gln Pro Lys Tyr Glu Gln Arg Lys Gly Ala Tyr

995 1000 1005

<210> 2

<211> 3018

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagttgt tgtctgttgc tgctgttgct ttgttggctg ctcaagctgc tggtgcttct 60

attaagcata gattgaacgg ttttactatt ttggaacatc cagatccagc taagagagat 120

ttgttgcaag atattgttac ttgggatgat aagtctttgt ttattaacgg tgaaagaatt 180

atgttgtttt ctggtgaagt tcatccattt agattgccag ttccatcttt gtggttggat 240

atttttcata agattagagc tttgggtttt aactgtgttt ctttttacat tgattgggct 300

ttgttggaag gtaagccagg tgattacaga gctgaaggta tttttgcttt ggaaccattt 360

tttgatgctg ctaaggaagc tggtatttac ttgattgcta gaccaggttc ttacattaac 420

gctgaagttt ctggtggtgg ttttccaggt tggttgcaaa gagttaacgg tactttgaga 480

tcttctgatg aaccatactt gaaggctact gataactaca ttgctaacgc tgctgctgct 540

gttgctaagg ctcaaattac taacggtggt ccagttattt tgtaccaacc agaaaacgaa 600

tactctggtg gttgttgtgg tgttaagtac ccagatgctg attacatgca atacgttatg 660

gatcaagcta gaaaggctga tattgttgtt ccatttattt ctaacgatgc ttctccatct 720

ggtcataacg ctccaggttc tggtaagggt gctgttgata tttacggtca tgattcttac 780

ccattgggtt ttgattgtgc taacccatct gtttggccag aaggtaagtt gccagataac 840

tttagaactt tgcatttgga acaatctcca tctactccat actctatttt ggaatttcaa 900

gctggtgctt ttgatccatg gggtggtcca ggttttgaaa agtgttacgc tttggttaac 960

catgaatttt ctagagtttt ttacagaaac gatttgtctt ttggtgttac tacttttaac 1020

ttgtacatga cttttggtgg tactaactgg ggtaacttgg gtcatccagg tggttacact 1080

tcttacgatt acggttctcc aattactgaa actagaaacg ttactagaga aaagtactct 1140

gatattaagt tgttggctaa ctttgttaag gcttctccat cttacttgac tgctactcca 1200

agaaacttga ctactggtgt ttacactgat acttctgatt tggctgttac tccattgatt 1260

ggtgattctc caggttcttt tttcgttgtt agacatactg attactcttc tcaagaatct 1320

acttcttaca agttgaagtt gccaacttct gctggtaact tgactattcc acaattggaa 1380

ggtactttgt ctttgaacgg tagagattct aagattcatg ttgttgatta caacgtttct 1440

ggtactaaca ttatttactc tactgctgaa gtttttactt ggaagaagtt tgatggtaac 1500

aaggttttgg ttttgtacgg tggtccaaag gaacatcatg aattggctat tgcttctaag 1560

tctaacgtta ctattattga aggttctgat tctggtattg tttctactag aaagggttct 1620

tctgttatta ttggttggga tgtttcttct actagaagaa ttgttcaagt tggtgatttg 1680

agagtttttt tgttggatag aaactctgct tacaactact gggttccaga attgccaact 1740

gaaggtactt ctccaggttt ttctacttct aagactactg cttcttctat tattgttaag 1800

gctggttact tgttgagagg tgctcatttg gatggtgctg atttgcattt gactgctgat 1860

tttaacgcta ctactccaat tgaagttatt ggtgctccaa ctggtgctaa gaacttgttt 1920

gttaacggtg aaaaggcttc tcatactgtt gataagaacg gtatttggtc ttctgaagtt 1980

aagtacgctg ctccagaaat taagttgcca gatttgaagg atttggattg gaagtacttg 2040

gatactttgc cagaaattaa gtcttcttac gatgattctg cttgggtttc tgctgatttg 2100

ccaaagacta agaacactca tagaccattg gatactccaa cttctttgta ctcttctgat 2160

tacggttttc atactggtta cttgatttac agaggtcatt ttgttgctaa cggtaaggaa 2220

tctgaatttt ttattagaac tcaaggtggt tctgcttttg gttcttctgt ttggttgaac 2280

gaaacttact tgggttcttg gactggtgct ccatacgctt ctgatggtaa ctctacttac 2340

aagttgtctc aattggaatc tggtaagaac tacgttatta ctgttgttat tgataacttg 2400

ggtttggatg aaaactggac tgttggtgaa aacactatga agaacccaag aggtattttg 2460

tcttacaagt tgtctggtca agatgcttct gctattactt ggaagttgac tggtaacttg 2520

ggtggtgaag attaccaaga taaggttaga ggtccattga acgaaggtgg tttgtacgct 2580

gaaagacaag gttttcatca accacaacca ccatctgaat cttgggaatc tggttctcca 2640

ttggaaggtt tgtctaagcc aggtattggt ttttacactg ctcaatttga tttggatttg 2700

ccaaagggtt gggatgttcc attgtacttt aactttggta acaacactca agctgctaga 2760

gctcaattgt acgttaacgg ttaccaatac ggtaagttta ctggtaacgt tggtccacaa 2820

acttcttttc cagttccaga aggtattttg aactacagag gtactaacta cgttgctttg 2880

tctttgtggg ctttggaatc tgatggtgct aagttgggtt cttttgaatt gtcttacact 2940

actccagttt tgactggtta cggtaacgtt gaatctccag aacaaccaaa gtacgaacaa 3000

agaaagggtg cttactaa 3018

<210> 3

<211> 1005

<212> PRT

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 3

Met Lys Leu Leu Ser Val Ala Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Gln Ala

1 5 10 15

Ala Gly Ala Ser Ile Lys His Arg Leu Asn Gly Phe Thr Ile Leu Glu

20 25 30

His Pro Asp Pro Ala Lys Arg Asp Leu Leu Gln Asp Ile Val Thr Trp

35 40 45

Asp Asp Lys Ser Leu Phe Ile Asn Gly Glu Arg Ile Met Leu Phe Ser

50 55 60

Gly Glu Val His Pro Phe Arg Leu Pro Val Pro Ser Leu Trp Leu Asp

65 70 75 80

Ile Phe His Lys Ile Arg Ala Leu Gly Phe Asn Cys Val Ser Phe Tyr

85 90 95

Ile Asp Trp Ala Leu Leu Glu Gly Lys Pro Gly Asp Tyr Arg Ala Glu

100 105 110

Gly Ile Phe Ala Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ala Ala Lys Glu Ala Gly

115 120 125

Ile Tyr Leu Ile Ala Arg Pro Gly Ser Tyr Ile Asn Ala Glu Val Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Phe Pro Gly Trp Leu Gln Arg Val Asn Gly Thr Leu Arg

145 150 155 160

Ser Ser Asp Glu Pro Phe Leu Lys Ala Thr Asp Asn Tyr Ile Ala Asn

165 170 175

Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Ala Gln Ile Thr Asn Gly Gly Pro Val

180 185 190

Ile Leu Tyr Gln Pro Glu Asn Glu Tyr Ser Gly Gly Cys Cys Gly Val

195 200 205

Lys Tyr Pro Asp Ala Asp Tyr Met Gln Tyr Val Met Asp Gln Ala Arg

210 215 220

Lys Ala Asp Ile Val Val Pro Phe Ile Ser Asn Asp Ala Ser Pro Ser

225 230 235 240

Gly His Asn Ala Pro Gly Ser Gly Thr Gly Ala Val Asp Ile Tyr Gly

245 250 255

His Asp Ser Tyr Pro Leu Gly Phe Asp Cys Ala Asn Pro Ser Val Trp

260 265 270

Pro Glu Gly Lys Leu Pro Asp Asn Phe Arg Thr Leu His Leu Glu Gln

275 280 285

Ser Pro Ser Thr Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Phe Gln Ala Gly Ala Phe

290 295 300

Asp Pro Trp Gly Gly Pro Gly Phe Glu Lys Cys Tyr Ala Leu Val Asn

305 310 315 320

His Glu Phe Ser Arg Val Phe Tyr Arg Asn Asp Leu Ser Phe Gly Val

325 330 335

Ser Thr Phe Asn Leu Tyr Met Thr Phe Gly Gly Thr Asn Trp Gly Asn

340 345 350

Leu Gly His Pro Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Asp Tyr Gly Ser Pro Ile

355 360 365

Thr Glu Thr Arg Asn Val Thr Arg Glu Lys Tyr Ser Asp Ile Lys Leu

370 375 380

Leu Ala Asn Phe Val Lys Ala Ser Pro Ser Tyr Leu Thr Ala Thr Pro

385 390 395 400

Arg Asn Leu Thr Thr Gly Val Tyr Thr Asp Thr Ser Asp Leu Ala Val

405 410 415

Thr Pro Leu Ile Gly Asp Ser Pro Gly Ser Phe Phe Val Val Arg His

420 425 430

Thr Asp Tyr Ser Ser Gln Glu Ser Thr Ser Tyr Lys Leu Lys Leu Pro

435 440 445

Thr Ser Ala Gly Asn Leu Thr Ile Pro Gln Leu Glu Gly Thr Leu Ser

450 455 460

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Lys Ile His Val Val Asp Tyr Asn Val Ser

465 470 475 480

Gly Thr Asn Ile Ile Tyr Ser Thr Ala Glu Val Phe Thr Trp Lys Lys

485 490 495

Phe Asp Gly Asn Lys Val Leu Val Leu Tyr Gly Gly Pro Lys Glu His

500 505 510

His Glu Leu Ala Ile Ala Ser Lys Ser Asn Val Thr Ile Ile Glu Gly

515 520 525

Ser Asp Ser Gly Ile Val Ser Thr Arg Lys Gly Ser Ser Val Ile Ile

530 535 540

Gly Trp Asp Val Ser Ser Thr Arg Arg Ile Val Gln Val Gly Asp Leu

545 550 555 560

Arg Val Phe Leu Leu Asp Arg Asn Ser Ala Tyr Asn Tyr Trp Val Pro

565 570 575

Glu Leu Pro Thr Glu Gly Thr Ser Pro Gly Phe Ser Thr Ser Lys Thr

580 585 590

Thr Ala Ser Ser Ile Ile Val Lys Ala Gly Tyr Leu Leu Arg Gly Ala

595 600 605

His Leu Asp Gly Ala Asp Leu His Leu Thr Ala Asp Phe Asn Ala Thr

610 615 620

Thr Pro Ile Glu Val Ile Gly Ala Pro Thr Gly Ala Lys Asn Leu Phe

625 630 635 640

Val Asn Gly Glu Lys Ala Ser His Thr Val Asp Lys Asn Gly Ile Trp

645 650 655

Ser Ser Glu Val Lys Tyr Ala Ala Pro Glu Ile Lys Leu Pro Gly Leu

660 665 670

Lys Asp Leu Asp Trp Lys Tyr Leu Asp Thr Leu Pro Glu Ile Lys Ser

675 680 685

Ser Tyr Asp Asp Ser Ala Trp Val Ser Ala Asp Leu Pro Lys Thr Lys

690 695 700

Asn Thr His Arg Pro Leu Asp Thr Pro Thr Ser Leu Tyr Ser Ser Asp

705 710 715 720

Tyr Gly Phe His Thr Gly Tyr Leu Ile Tyr Arg Gly His Phe Val Ala

725 730 735

Asn Gly Lys Glu Ser Glu Phe Phe Ile Arg Thr Gln Gly Gly Ser Ala

740 745 750

Phe Gly Ser Ser Val Trp Leu Asn Glu Thr Tyr Leu Gly Ser Trp Thr

755 760 765

Gly Ala Asp Tyr Ala Met Asp Gly Asn Ser Thr Tyr Lys Leu Ser Gln

770 775 780

Leu Glu Ser Gly Lys Asn Tyr Val Ile Thr Val Val Ile Asp Asn Leu

785 790 795 800

Gly Leu Asp Glu Asn Trp Thr Val Gly Glu Glu Thr Met Lys Asn Pro

805 810 815

Arg Gly Ile Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gly Gln Asp Ala Ser Ala Ile

820 825 830

Thr Trp Lys Leu Thr Gly Asn Leu Gly Gly Glu Asp Tyr Gln Asp Lys

835 840 845

Val Arg Gly Pro Leu Asn Glu Gly Gly Leu Tyr Ala Glu Arg Gln Gly

850 855 860

Phe His Gln Pro Gln Pro Pro Ser Glu Ser Trp Glu Ser Gly Ser Pro

865 870 875 880

Leu Glu Gly Leu Ser Lys Pro Gly Ile Gly Phe Tyr Thr Ala Gln Phe

885 890 895

Asp Leu Asp Leu Pro Lys Gly Trp Asp Val Pro Leu Tyr Phe Asn Phe

900 905 910

Gly Asn Asn Thr Gln Ala Ala Arg Ala Gln Leu Tyr Val Asn Gly Tyr

915 920 925

Gln Tyr Gly Lys Phe Thr Gly Asn Val Gly Pro Gln Thr Ser Phe Pro

930 935 940

Val Pro Glu Gly Ile Leu Asn Tyr Arg Gly Thr Asn Tyr Val Ala Leu

945 950 955 960

Ser Leu Trp Ala Leu Glu Ser Asp Gly Ala Lys Leu Gly Ser Phe Glu

965 970 975

Leu Ser Tyr Thr Thr Pro Val Leu Thr Gly Tyr Gly Asn Val Glu Ser

980 985 990

Pro Glu Gln Pro Lys Tyr Glu Gln Arg Lys Gly Ala Tyr

995 1000 1005

<210> 4

<211> 3018

<212> DNA

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 4

atgaagctcc tctctgttgc tgctgttgcc ttgctggcgg cacaggcagc gggtgcttcc 60

atcaagcatc gtctcaatgg cttcacgatc ctggaacatc cggatccggc gaaaagagac 120

ttgctgcaag acattgttac atgggatgac aaatctctgt tcatcaatgg agagaggatt 180

atgttattca gcggagaagt gcatcctttc agattgccag taccttcgct ttggcttgat 240

atcttccaca agatcagagc tcttggtttc aactgtgtat ctttctatat tgattgggct 300

cttctggagg gaaagcctgg cgactacaga gcagaaggca tctttgctct ggaacccttc 360

ttcgatgcag ccaaggaagc aggcatttat ctgatcgccc gccccggttc gtacatcaat 420

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tcgtctgatg agccattcct taaagctact gataactata tcgccaatgc cgctgctgcc 540

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tacagcggtg gctgctgcgg tgtcaaatac cccgatgcag actacatgca gtatgttatg 660

gatcaggccc ggaaggctga cattgttgta cctttcatca gcaacgatgc ctcaccttct 720

gggcacaatg ctcctggaag tggaacgggc gctgttgata tttatggtca cgatagctat 780

ccccttggct ttgattgcgc aaacccatcc gtatggcccg agggtaaact gcccgacaac 840

ttccgcacgc tccatcttga gcagagccca tcaactccgt attcacttct tgagttccaa 900

gcgggtgctt tcgacccatg gggtggaccc ggctttgaaa aatgctatgc cctcgttaac 960

cacgaattct cgagagtttt ctataggaac gacttgagtt tcggagtttc tacctttaac 1020

ttatacatga ctttcggcgg aacaaactgg ggtaacctcg gacatcccgg tggatataca 1080

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agaaacctga ctactggtgt ttacacagac acatctgacc tggctgtcac cccgttaatt 1260

ggtgatagtc caggctcatt cttcgtggtc agacatacgg actattccag ccaagagtca 1320

acctcgtaca aacttaagct tcctaccagt gctggtaacc tgactattcc ccagctggag 1380

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ggaacgaaca ttatctattc gacagctgaa gtcttcacct ggaagaagtt tgacggtaac 1500

aaggtcctgg tgttatacgg cggaccgaag gaacaccatg aattggccat tgcctccaag 1560

tcaaatgtga ccatcatcga aggttcggac tctggaattg tctcaacgag gaagggcagc 1620

tctgttatca ttggctggga tgtctcttct actcgtcgca tcgttcaagt cggtgacttg 1680

agagtgttcc tgcttgatag aaactctgct tacaactact gggtccccga actccccaca 1740

gaaggtactt ctcccgggtt cagcacttcg aagacgaccg cctcctccat tattgtgaag 1800

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ttcaatgcca ccaccccgat tgaagtgatc ggtgctccaa caggcgccaa gaatctgttc 1920

gtgaatggtg aaaaggctag ccacacagtc gacaaaaacg gcatctggag cagtgaggtc 1980

aagtacgcgg ctccagagat caagctcccc ggtttgaagg atttggactg gaagtatctg 2040

gacacgcttc ccgaaattaa gtcttcctat gatgactcgg cctgggtttc ggcagacctt 2100

ccaaagacaa agaacactca ccgtcctctt gacacaccaa catcgctata ctcctctgac 2160

tatggcttcc acactggcta cctgatctac aggggtcact tcgttgccaa cggcaaggaa 2220

agcgaatttt ttattcgcac acaaggcggt agcgcattcg gaagttccgt atggctgaac 2280

gagacgtatc tgggctcttg gactggtgcc gattatgcga tggacggtaa ctctacctac 2340

aagctatctc agctggagtc gggcaagaat tacgtcatca ctgtggttat tgataacctg 2400

ggtctcgacg agaattggac ggtcggcgag gaaaccatga agaatcctcg tggtattctt 2460

agctacaagc tgagcggaca agacgccagc gcaatcacct ggaagctcac tggtaacctc 2520

ggaggagaag actaccagga taaggttaga ggacctctca acgaaggtgg actgtacgca 2580

gagcgccagg gcttccatca gcctcagcct ccaagcgaat cctgggagtc gggcagtccc 2640

cttgaaggcc tgtcgaagcc gggtatcgga ttctacactg cccagttcga ccttgacctc 2700

ccgaagggct gggatgtgcc gctgtacttc aactttggca acaacaccca ggcggctcgg 2760

gcccagctct acgtcaacgg ttaccagtat ggcaagttca ctggaaacgt tgggccacag 2820

accagcttcc ctgttcccga agggatcctg aactaccgcg gaaccaacta tgtggcactg 2880

agtctttggg cattggagtc ggacggtgct aagctgggta gcttcgaact gtcctacacc 2940

accccagtgc tgaccggata cgggaatgtt gagtcacctg agcagcccaa gtatgagcag 3000

cggaagggag catactaa 3018

Claims

1.一种热稳定性酸性乳糖酶AoGAL，其特征在于，所述乳糖酶AoGAL的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

2.一种乳糖酶基因aogal，用于编码权利要求1所述的乳糖酶，其特征在于，所述乳糖酶基因aogal的碱基序列与SEQ ID NO：2所示的碱基序列具有95％以上的同一性。

3.根据权利要求2所述的乳糖酶基因aogal，其特征在于，所述乳糖酶基因aogal的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

4.权利要求2或3所述的乳糖酶基因aogal的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：通过定点突变的方法将原始乳糖酶基因第166位苯丙氨酸突变为酪氨酸，第249位苏氨酸突变为赖氨酸，第296位亮氨酸突变为异亮氨酸，第337位丝氨酸突变为苏氨酸，第671位甘氨酸突变为天冬氨酸，第771位天冬氨酸突变为脯氨酸，第774位甲硫氨酸突变为丝氨酸，第811位谷氨酸突变为天冬酰胺。

5.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的乳糖酶基因aogal。

6.权利要求5所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

将乳糖酶基因aogal分别用限制性内切酶EcoR I和Not I酶切，获得具有粘性末端的乳糖酶基因aogal片段；

将毕赤酵母表达载体pPICZαA分别用限制性内切酶EcoR I和Not I酶切，获得具有粘性末端的载体pPICZαA片段；

将所述具有粘性末端的乳糖酶基因aogal片段和所述具有粘性末端的的载体pPICZαA片段通过T4 DNA连接酶连接，获得pPIC-aogal重组表达质粒。

7.一种重组表达菌株，其特征在于，包括如权利要求5所述的重组表达载体。

8.根据权利要求7所述的重组表达菌株，其中，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。

9.权利要求7或8所述的重组表达菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求5所述的重组表达载体通过酶切位点将其线性化；

将线性化的重组表达载体导入宿主细胞中，获得重组表达菌株。

10.权利要求1所述的乳糖酶的生产方法，其特征在于，培养权利要求7或8所述的重组表达菌株，从培养物中获得乳糖酶。

11.权利要求1所述的乳糖酶的应用，其特征在于，将权利要求1中所述的乳糖酶与含乳糖的物料接触。