CN113493799B

CN113493799B - 一株高产酸性乳糖酶的黑曲霉菌株

Info

Publication number: CN113493799B
Application number: CN202010253116.1A
Authority: CN
Inventors: 徐晓东; 陆娜; 吴佳鹏; 张金祥
Original assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; QINGDAO VLAND BIOTECH Inc; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; QINGDAO VLAND BIOTECH Inc; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2020-04-02
Filing date: 2020-04-02
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2040-04-02
Also published as: CN113493799A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一株高产酸性乳糖酶的黑曲霉菌株。申请人首先将来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的酸性乳糖酶基因在黑曲霉（Aspergillus niger）宿主中过表达，构建得到高效表达酸性乳糖酶的黑曲霉工程菌，然后进一步通过紫外诱变方法筛选获得一株酸性乳糖酶产量显著提高的突变菌株，保藏编号为CGMCC No.19280，可广泛应用于酸性乳糖酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。

Description

一株高产酸性乳糖酶的黑曲霉菌株

技术领域

本发明属于基因工程和微生物改造技术领域，具体内容涉及一株高产酸性乳糖酶的黑曲霉突变菌株。

技术背景

乳糖酶能水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖，还可以通过半乳糖苷转移作用生成功能性低聚半乳糖，又称β-D-半乳糖苷酶（β-D-galactoside-galactohydrolaseE.C.3.2.1.23）。通常在乳制品行业中用来降低乳制品中乳糖含量，解决乳糖不耐症；除了水解乳糖外，乳糖酶还具有转苷能力，可以利用乳糖合成低聚半乳糖。乳糖酶在自然界中广泛存在，不仅存在于细菌、真菌、霉菌等常见微生物中，而且在动物的皮肤和肠道组织、植物的叶茎种子也广泛存在。其中，对微生物来源的乳糖酶研究最为广泛。

不同来源的乳糖酶性质各异，正是这种性质的多样性大大提高了其在食品工业的应用。目前，商品化的乳糖酶主要来源于微生物。以大肠杆菌（Escherichia coli）、黑曲霉（Aspergillus niger）、乳糖发酵酵母（Kluyveromyces lactis）以及臭曲霉（A.foetidus）的变异株为适宜。其中，作为食品安全菌的曲霉以及克鲁维酵母属来源的乳糖酶的研究最为广泛。例如，Frezel等比较了米曲霉、棘孢曲霉以及克鲁维乳酸菌来源的乳糖酶的转苷能力。除了具有食品安全菌的优良特性外，反应pH偏酸性也是真菌来源乳糖酶的优势。例如，Kluyveromyces fragilis和A. niger来源的乳糖酶最适pH为4.0-4.5，并且在pH 3.0-7.0之间稳定性都比较好，最适温度为55℃，比较适用于酸性乳酪中乳糖的水解。Isobe等从温泉中分离出Teratosphaeria acidotherma AIU BGA-1，发现其来源的乳糖酶能够在酸性到中性pH范围内均保持很高的活性。

目前，细菌来源的乳糖酶很少被应用于生产低聚半乳糖，但随着越来越多的基因被挖掘，其生产低聚半乳糖的优势也逐渐体现出来。例如，很多嗜冷菌、嗜热菌等从极端环境分离的菌株来源的乳糖酶往往具有特殊的优良性质。Goodman等对嗜热脂肪芽杆菌（Bacillus stearothermophilus AT-3）来源的乳糖酶进行了克隆表达，其最适作用温度为65℃，最适pH 为6.0-6.4。除了嗜热嗜冷菌外，乳酸菌来源的乳糖酶也受到广泛研究。乳酸菌作为益生菌，在食品生产中具有重要应用价值。因此，目前对乳酸菌来源的乳糖酶研究也比较多。

食物进入消化道后，在消化过程中需要经过不同的pH过程，从pH 1.8-5.5的大范围变化，在胃里还要忍受胃蛋白酶的降解作用。因此，为了能够在消化道中更加有效的水解奶制品中的乳糖，理想中的乳糖酶应具有耐酸、抗蛋白酶的特性，还要在生理温度和低pH具有高活性。

但目前常用的乳糖酶生产菌株的产量普遍偏低，导致乳糖酶的成本居高不下，严重限制了其在食品等工业领域的广泛应用。因此，现在急需开发一种乳糖酶产量高且乳糖酶性质优异的生产菌种。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产酸性乳糖酶的黑曲霉菌株。申请人首先将来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的酸性乳糖酶基因在黑曲霉（Aspergillus niger）宿主中过表达，构建得到高效表达酸性乳糖酶的黑曲霉工程菌，然后进一步通过紫外诱变方法筛选获得一株酸性乳糖酶产量显著提高的突变菌株，可广泛应用于酸性乳糖酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。

本发明一方面提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有酸性乳糖酶基因。

所述酸性乳糖酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQID NO:2。

本发明一方面提供了一种黑曲霉工程菌株，所述菌株携带有上述重组质粒。

本发明还提供了一种突变菌株黑曲霉Su-ZN25（Aspergillus niger Su-ZN25），是以上述的黑曲霉工程菌为出发菌株通过紫外诱变获得的。

所述突变菌株已于2020年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 19280。

本发明将来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的酸性乳糖酶基因在黑曲霉宿主中过表达，构建得到重组表达酸性乳糖酶的工程菌株黑曲霉Su-ZN1。该菌株摇瓶发酵上清液中酸性乳糖酶酶活达到386U/ml，30L罐发酵酶活达到1393u/ml。

为了提高酸性乳糖酶的产量，申请人以黑曲霉Su-ZN1为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌株黑曲霉Su-ZN25。该突变菌株能大幅度提高酸性乳糖酶的产量，其摇瓶发酵上清液中酸性乳糖酶酶活达到799u/ml，30L罐发酵酶活达到2640u/ml，比出发菌分别提高了107%和89.5%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于酸性乳糖酶的生产，从而有利于降低该酶的生产成本。

所述突变菌株生产的酸性乳糖酶最适作用pH值为4.5，在pH3.5-5.5之间能保持80%以上的酶活水平；最适作用温度为55℃，在45-55℃之间能保持70%以上的酶活水平；在60℃条件下处理3min后，酶活残留率为93%，65℃条件下处理3min后，酶活残留率为58%，具有较强的耐热性，可广泛应用于食品加工等领域。

附图说明

图1为质粒pGAU图谱；

图2为30L罐发酵曲线图；

图3为pH-相对酶活曲线图；

图4为温度-相对酶活曲线图。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1酸性乳糖酶基因的获得

申请人将来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的酸性乳糖酶基因命名为ZN，其核苷酸序列为为SEQ ID NO：1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。申请人优化了合成基因的密码子并人工合成该基因。

PCR引物和反应条件如下：

引物1（F）：ATGAAGCTGCTCAGCGTCGCC

引物2（R）：TTAGTAAGCGCCCTTACGCTG

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸180s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，酸性乳糖酶ZN基因大小为3018bp。

实施例2重组载体构建

PCR扩增酸性乳糖酶ZN基因，引物两端引入XbaI位点。引物序列如下：

引物3（F）：GCTCTAGAATGAAGCTGCTCAGCGTCGCC

引物4（R）：GCTCTAGATTAGTAAGCGCCCTTACGCTG

PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸180s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，ZN基因为大小3018 bp的片段。

将上述获得的酸性乳糖酶ZN片段与表达载体pGAU（图谱如图1所示）分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：

PCR片段酶切体系（50ul）	质粒pGAU酶切体系（50ul）
		PCR片段 20ul	pGAU质粒 20ul
10*M 5ul	10*M 5ul
		BSA 5ul	BSA 5ul
XbaI 2ul	XbaI 2ul
		ddH<sub>2</sub>O 18ul	ddH<sub>2</sub>O 18ul

37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20 ul ddH₂O。用T4DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

PCR片段	2ul
		pGAU	2ul
10*Buffer	1ul
		T4 DNA ligase	1ul
ddH<sub>2</sub>O	4ul
		总体积	10ul

22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AMP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有酸性乳糖酶ZN的重组载体pGAU-ZN。

实施例3 黑曲霉工程菌株的构建

原生质体制备：接种黑曲霉宿主于PDA+U平板，30℃培养5-7d。割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U培养基中，30℃培养24h生长菌丝体，用于转化。将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬，加入0.2g溶菌酶。30℃、100rpm培养2-3h。将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体。

转化：原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸。200ul原生质体中加入10ul准备好的质粒，加入50ul 25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25%的PEG6000室温放置5min，加入4ml 山梨醇溶液颠倒混匀。倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基中发酵，32℃培养5d，每天加入适量氨水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行蛋白电泳检测，筛选出有明显蛋白条带表达的转化子。

申请人获得一株高效表达酸性乳糖酶的黑曲霉工程菌，命名为黑曲霉Su-ZN1（Aspergillus niger Su-ZN1），其在摇瓶发酵条件下酸性乳糖酶酶活能达到386 u/ml。

（1）酸性乳糖酶酶活单位的定义

在37℃、pH值为4.5的条件下，每分钟从浓度为2.96 mg/ml的邻硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷溶液中释放1μmol邻硝基苯酚所需要的酶量即为一个酶活力单位U。

（2）标准曲线的绘制

0号管：0mM邻硝基苯酚：1%碳酸钠溶液；

1号管：0.05mM邻硝基苯酚：取2.5ml 2mM邻硝基苯酚溶液于100ml容量瓶中，用1%碳酸钠溶液定容至100ml；

2号管：0.1mM邻硝基苯酚：取5ml 2mM邻硝基苯酚溶液于100ml容量瓶中，用1%碳酸钠溶液定容至100ml；

3号管：0.15mM邻硝基苯酚：取7.5ml 2mM邻硝基苯酚溶液于100ml容量瓶中，用1%碳酸钠溶液定容至100ml；

4号管：0.2mM邻硝基苯酚：取10ml 2mM邻硝基苯酚溶液于100ml容量瓶中，用1%碳酸钠溶液定容至100ml；

用0号管液体作对照在420nm波长下，用1cm比色皿进行比色测定。以吸光值为纵坐标，以邻硝基苯酚含量为横坐标绘制标准曲线A=Kx+b。R²≥0.999。

（3）酶活测定方法

底物：准确秤取0.37g邻硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷（2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside，sigma N1127）至100ml小烧杯中，加入50ml乙酸缓冲液，磁力搅拌条件下至完全溶解，调节pH至4.5，后用乙酸缓冲液定容至100ml，2h内使用有效。

酶空白：取2ml底物溶液于试管中，37℃水浴预热5min，加入2.5ml的10%的碳酸钠溶液摇匀反应15min，立即加入0.5ml待测酶液摇匀，冷却至室温后用蒸馏水定容至25ml即为酶空白。

测定：取2 ml底物溶液于试管中（每个样品3个平行），37℃水浴预热5min，加入0.5ml预热5min的待测酶液迅速摇匀，于37℃水浴中准确反应15min，反应结束后立即加入2.5ml的10%的碳酸钠溶液摇匀，冷却至室温后用蒸馏水定容至25ml，以酶空白作为对照于420nm波长测定其吸光度A。

酶活计算公式：

U=X×25×n/0.5/15

式中：U为稀释酶液中乳糖酶的活力，U/ml；X为用回归方程计算出相当的邻硝基苯酚的mM数（相当于μmol/ml）X=（A-b）/K；25为反应结束后体系总体积，ml；n为酶液的稀释倍数；0.5为加入反应的待测酶液体积，ml；15为待测酶液与底物的反应时间，min。

实施例4 诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以黑曲霉Su-ZN1为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其酸性乳糖酶的产量。

1、确定致死率：

接种黑曲霉工程菌Su-ZN1于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液（浓度为1×10⁷/ml），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为95%，选取该照射时间进行后续诱变实验。

2、第一轮诱变筛选

取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液（浓度为1×10⁷/ml），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

第一轮筛选共涂布235块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出15-25个菌落，先通过菌落形态，筛选短分枝的突变体。申请人挑取菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变菌共114个，分别接种到PDA平板，30℃培养5-7d。每个突变菌割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50 ml液体摇瓶培养基中发酵，30℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行蛋白电泳检测及酸性乳糖酶酶活力检测。同时以出发菌黑曲霉Su-ZN1作为对照组。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的114株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中酸性乳糖酶酶活高于出发菌；其中，110株突变菌的酶活与出发菌基本相当，其余4株突变菌的酶活甚至低于出发菌。

申请人按照上述方法继续进行了18轮诱变筛选，最终获得一株酸性乳糖酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为黑曲霉Su-ZN25（Aspergillus niger Su-ZN25）。该突变菌株摇瓶发酵上清液中酸性乳糖酶酶活力达到799 U/ml，比出发菌提高了107%，取得了意料不到的技术效果。

实施例5 30L罐发酵放大

将出发菌黑曲霉Su-ZN1和突变菌黑曲霉Su-ZN25分别在30升发酵罐中进行发酵，发酵使用的培养基配方为：麦芽糖2.5 g/L、硫酸铵0.9%、磷酸氢二钠0.15 g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸钾0.5 g/L、硫酸镁16.4 g/L、柠檬酸钠0.2 g/L、磷酸二氢钾0.25%、豆粉0.5%、消泡剂0.05%。补料培养基：麦芽糖浓度为400g/L，pH调至4.0-5.0之间。

发酵生产工艺：pH值4.0、温度30℃、搅拌速率300-700rpm、通风量1.0-1.5（v/v）、溶氧控制在20%以上。

整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7%比例接入种子，30℃培养15-25 h，以溶氧回升为标志；第二阶段为饥饿阶段，当底糖耗完之后，不流加任何碳源，溶氧上升至60%以上表明该阶段结束，为期约30-120 min；第三阶段为产酶阶段，流加补料培养基进行产酶培养，期间保持溶氧在20%以上且维持发酵液中还原糖浓度不低于1g/L，发酵周期在140-170 h之间。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。

通过测定不同时间发酵液中酸性乳糖酶的酶活力，可得发酵进程曲线（图2）。

结果显示：发酵160h后，出发菌黑曲霉Su-ZN1发酵上清液中酸性乳糖酶的酶活力达到1393 u/ml，而突变菌黑曲霉Su-ZN25的酶活力达到2640 u/ml，较出发菌提高了89.5%，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2020年3月17日将所述突变菌黑曲霉Su-ZN25（Aspergillus nigerSu-ZN25）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 19280。

实施例6 酸性乳糖酶ZN的酶学性质分析

1、最适作用pH

采用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，将上述突变菌黑曲霉Su-ZN25发酵粗酶液进行稀释测定，酸性乳糖酶底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在37℃下进行酸性乳糖酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图3所示，本发明所述酸性乳糖酶ZN的最适作用pH值为4.5，在pH3.5-5.5之间能保持80%以上的酶活水平。

2、最适作用温度

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH4.5条件下，测定上述突变菌黑曲霉Su-ZN25发酵粗酶液的酸性乳糖酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图4所示，本发明所述乳糖酶ZN的最适作用温度为55℃，在45-55℃之间能保持70%以上的酶活水平。

实施例8 酸性乳糖酶ZN耐热性分析

将黑曲霉Su-ZN25发酵粗酶液用pH 4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸稀释到约200 U/ml，在60℃和65℃条件下分别处理3min后，测定残余酶活，以未处理的酶活为100%，计算残留率。结果显示，乳糖酶ZN在60℃条件下处理3min后，酶活残留率为93%，65℃条件下处理3min后，酶活力残余58%，具有较强的耐热性。

综上，本发明提供的突变菌黑曲霉Su-ZN25可广泛应用于酸性乳糖酶的生产，有利于降低该酶的生产成本，从而有利于促进酸性乳糖酶在食品加工等领域中的推广和使用。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司

潍坊康地恩生物科技有限公司

青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一株高产酸性乳糖酶的黑曲霉菌株

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3018

<212> DNA

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 1

atgaagctgc tcagcgtcgc cgctgtggcc ctcctcgccg cccaggccgc cggcgcttct 60

atcaagcacc gactgaacgg tttcaccatc ctggagcacc ccgaccccgc taagcgcgac 120

ctcctccagg acatcgtcac ctgggacgac aagtctctgt tcatcaacgg tgagcgtatc 180

atgctgttca gcggcgaggt gcaccctttc cggttacccg tcccttctct gtggctcgac 240

atcttccaca agatccgcgc tctgggtttc aactgcgtgt ccttctacat cgactgggct 300

ctgttggaag gcaagcctgg tgactaccgc gccgagggca tcttcgccct ggagcctttc 360

ttcgacgctg ccaaggaggc tggtatctac ctcatcgccc gtcccggttc ttacatcaac 420

gccgaggtca gcggtggtgg tttccccggt tggttgcagc gtgtgaacgg caccctgcgt 480

agcagcgacg agcctttcct caaggccacc gacaactaca tcgctaacgc cgccgccgcc 540

gtcgctaagg ctcagatcac caacggcggc cctgtgatcc tgtaccagcc cgagaacgag 600

tactctggtg gttgctgcgg cgtcaagtac cccgacgccg actacatgca gtacgtcatg 660

gaccaggccc gtaaggccga catcgtcgtg cctttcatct ctaacgacgc ttctcctagc 720

ggccacaacg ctcccggtag cggcactggg gctgtggaca tctacggcca cgactcttac 780

cctctcggtt tcgactgcgc taaccctagc gtgtggcctg agggcaagct gcctgacaac 840

ttccgtaccc tgcacctgga gcagagccct agcacccctt actctctcct agagtttcag 900

gctggtgctt tcgacccttg gggtggtccc ggtttcgaga agtgctacgc tctcgtgaac 960

cacgagttca gccgcgtgtt ctaccgtaac gacctgtctt tcggcgtcag caccttcaac 1020

ctgtacatga ccttcggtgg aacgaactgg ggtaacctcg gccaccccgg cggttacacc 1080

tcttacgact acggtagccc tatcaccgag acccgtaacg tgacccgcga gaagtactct 1140

gacatcaagc tcctcgctaa cttcgtgaag gctagtcctt cttacctgac cgctaccccc 1200

cgtaacctga ccactggtgt gtacaccgac accagcgacc tcgccgtcac ccctctgatc 1260

ggtgactctc ccggttcttt cttcgtcgtg cgtcacaccg actactctag ccaggagtcc 1320

acctcttaca agctcaagct gcctaccagc gccggcaacc tgaccatccc ccagctggaa 1380

gggacgctca gcctgaacgg tcgcgactcc aagatccacg tcgtggacta caacgtgtcc 1440

gggactaaca tcatctactc caccgctgag gtgttcacct ggaagaagtt cgacggtaac 1500

aaggtgctcg tgctgtacgg cggtcctaag gagcaccacg agctggctat cgcttctaag 1560

agcaacgtga ccatcatcga gggctccgac tccggtatcg tgtctacccg taagggtagc 1620

agcgtgatca tcggttggga cgtgtctagc acccgtcgta tcgtgcaggt cggcgacctg 1680

cgtgtgttcc tgctcgaccg taacagcgct tacaactact gggtccccga gctgcctacc 1740

gagggcacga gccccggttt cagcaccagc aagaccaccg cttctagcat catcgtgaag 1800

gctggttacc tgctgcgtgg tgcccacctc gacggcgccg acctgcacct gaccgccgac 1860

ttcaacgcta ccacccctat cgaggtcatc ggcgctccca ccggcgccaa gaacctgttc 1920

gtgaacggcg agaaggcgtc acacaccgtg gacaagaacg gtatctggag cagcgaggtg 1980

aagtacgccg ctcctgagat caagctgccc ggtctgaagg acctggactg gaagtacctg 2040

gacaccctgc ctgagatcaa gtcttcttac gacgactccg cttgggtgtc cgctgacctg 2100

cctaagacca agaacaccca ccgtcctctg gacaccccta ccagcctgta ctctagcgac 2160

tacggcttcc acacgggcta cctgatctac cgcggtcact tcgtggctaa cggcaaggag 2220

tctgagttct tcatccgtac ccagggtggt tctgctttcg gctctagcgt gtggctcaac 2280

gagacctacc tgggttcttg gacaggtgct gactacgcta tggacggcaa cagcacctac 2340

aagctgtctc agctggagtc cggtaagaac tacgtgatca ccgtcgtgat cgacaacctc 2400

ggtctggacg agaactggac cgtgggcgag gagaccatga agaaccctcg cggtatcctc 2460

agctacaagc tgtccggcca ggacgcttcc gctatcacct ggaagctcac cggcaacctc 2520

ggtggtgagg actaccagga caaggtgcgc ggtcctctga acgagggtgg tctgtacgct 2580

gagcgtcagg gcttccacca gcctcagcct cctagcgagt cttgggagag cggtagccct 2640

ctggagggtc tgtctaagcc tggcatcggt ttctacaccg cccagttcga cctcgacctc 2700

cctaagggtt gggacgtgcc tctgtacttc aacttcggta acaacaccca ggctgctcgc 2760

gcccagctgt acgtgaacgg ttaccagtac ggcaagttca ccggcaacgt gggtccccag 2820

acctctttcc ctgtgcccga gggtatcctc aactaccgcg gcaccaacta cgtcgctctg 2880

tctctgtggg ctctggagtc tgacggcgcc aagctgggta gcttcgagct gtcttacacc 2940

acccccgtcc tgacaggtta cggcaacgtg gagtctcccg agcagcctaa gtacgagcag 3000

cgtaagggcg cttactaa 3018

<210> 2

<211> 1005

<212> PRT

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 2

Met Lys Leu Leu Ser Val Ala Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Gln Ala

1 5 10 15

Ala Gly Ala Ser Ile Lys His Arg Leu Asn Gly Phe Thr Ile Leu Glu

20 25 30

His Pro Asp Pro Ala Lys Arg Asp Leu Leu Gln Asp Ile Val Thr Trp

35 40 45

Asp Asp Lys Ser Leu Phe Ile Asn Gly Glu Arg Ile Met Leu Phe Ser

50 55 60

Gly Glu Val His Pro Phe Arg Leu Pro Val Pro Ser Leu Trp Leu Asp

65 70 75 80

Ile Phe His Lys Ile Arg Ala Leu Gly Phe Asn Cys Val Ser Phe Tyr

85 90 95

Ile Asp Trp Ala Leu Leu Glu Gly Lys Pro Gly Asp Tyr Arg Ala Glu

100 105 110

Gly Ile Phe Ala Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ala Ala Lys Glu Ala Gly

115 120 125

Ile Tyr Leu Ile Ala Arg Pro Gly Ser Tyr Ile Asn Ala Glu Val Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Phe Pro Gly Trp Leu Gln Arg Val Asn Gly Thr Leu Arg

145 150 155 160

Ser Ser Asp Glu Pro Phe Leu Lys Ala Thr Asp Asn Tyr Ile Ala Asn

165 170 175

Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Ala Gln Ile Thr Asn Gly Gly Pro Val

180 185 190

Ile Leu Tyr Gln Pro Glu Asn Glu Tyr Ser Gly Gly Cys Cys Gly Val

195 200 205

Lys Tyr Pro Asp Ala Asp Tyr Met Gln Tyr Val Met Asp Gln Ala Arg

210 215 220

Lys Ala Asp Ile Val Val Pro Phe Ile Ser Asn Asp Ala Ser Pro Ser

225 230 235 240

Gly His Asn Ala Pro Gly Ser Gly Thr Gly Ala Val Asp Ile Tyr Gly

245 250 255

His Asp Ser Tyr Pro Leu Gly Phe Asp Cys Ala Asn Pro Ser Val Trp

260 265 270

Pro Glu Gly Lys Leu Pro Asp Asn Phe Arg Thr Leu His Leu Glu Gln

275 280 285

Ser Pro Ser Thr Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Phe Gln Ala Gly Ala Phe

290 295 300

Asp Pro Trp Gly Gly Pro Gly Phe Glu Lys Cys Tyr Ala Leu Val Asn

305 310 315 320

His Glu Phe Ser Arg Val Phe Tyr Arg Asn Asp Leu Ser Phe Gly Val

325 330 335

Ser Thr Phe Asn Leu Tyr Met Thr Phe Gly Gly Thr Asn Trp Gly Asn

340 345 350

Leu Gly His Pro Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Asp Tyr Gly Ser Pro Ile

355 360 365

Thr Glu Thr Arg Asn Val Thr Arg Glu Lys Tyr Ser Asp Ile Lys Leu

370 375 380

Leu Ala Asn Phe Val Lys Ala Ser Pro Ser Tyr Leu Thr Ala Thr Pro

385 390 395 400

Arg Asn Leu Thr Thr Gly Val Tyr Thr Asp Thr Ser Asp Leu Ala Val

405 410 415

Thr Pro Leu Ile Gly Asp Ser Pro Gly Ser Phe Phe Val Val Arg His

420 425 430

Thr Asp Tyr Ser Ser Gln Glu Ser Thr Ser Tyr Lys Leu Lys Leu Pro

435 440 445

Thr Ser Ala Gly Asn Leu Thr Ile Pro Gln Leu Glu Gly Thr Leu Ser

450 455 460

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Lys Ile His Val Val Asp Tyr Asn Val Ser

465 470 475 480

Gly Thr Asn Ile Ile Tyr Ser Thr Ala Glu Val Phe Thr Trp Lys Lys

485 490 495

Phe Asp Gly Asn Lys Val Leu Val Leu Tyr Gly Gly Pro Lys Glu His

500 505 510

His Glu Leu Ala Ile Ala Ser Lys Ser Asn Val Thr Ile Ile Glu Gly

515 520 525

Ser Asp Ser Gly Ile Val Ser Thr Arg Lys Gly Ser Ser Val Ile Ile

530 535 540

Gly Trp Asp Val Ser Ser Thr Arg Arg Ile Val Gln Val Gly Asp Leu

545 550 555 560

Arg Val Phe Leu Leu Asp Arg Asn Ser Ala Tyr Asn Tyr Trp Val Pro

565 570 575

Glu Leu Pro Thr Glu Gly Thr Ser Pro Gly Phe Ser Thr Ser Lys Thr

580 585 590

Thr Ala Ser Ser Ile Ile Val Lys Ala Gly Tyr Leu Leu Arg Gly Ala

595 600 605

His Leu Asp Gly Ala Asp Leu His Leu Thr Ala Asp Phe Asn Ala Thr

610 615 620

Thr Pro Ile Glu Val Ile Gly Ala Pro Thr Gly Ala Lys Asn Leu Phe

625 630 635 640

Val Asn Gly Glu Lys Ala Ser His Thr Val Asp Lys Asn Gly Ile Trp

645 650 655

Ser Ser Glu Val Lys Tyr Ala Ala Pro Glu Ile Lys Leu Pro Gly Leu

660 665 670

Lys Asp Leu Asp Trp Lys Tyr Leu Asp Thr Leu Pro Glu Ile Lys Ser

675 680 685

Ser Tyr Asp Asp Ser Ala Trp Val Ser Ala Asp Leu Pro Lys Thr Lys

690 695 700

Asn Thr His Arg Pro Leu Asp Thr Pro Thr Ser Leu Tyr Ser Ser Asp

705 710 715 720

Tyr Gly Phe His Thr Gly Tyr Leu Ile Tyr Arg Gly His Phe Val Ala

725 730 735

Asn Gly Lys Glu Ser Glu Phe Phe Ile Arg Thr Gln Gly Gly Ser Ala

740 745 750

Phe Gly Ser Ser Val Trp Leu Asn Glu Thr Tyr Leu Gly Ser Trp Thr

755 760 765

Gly Ala Asp Tyr Ala Met Asp Gly Asn Ser Thr Tyr Lys Leu Ser Gln

770 775 780

Leu Glu Ser Gly Lys Asn Tyr Val Ile Thr Val Val Ile Asp Asn Leu

785 790 795 800

Gly Leu Asp Glu Asn Trp Thr Val Gly Glu Glu Thr Met Lys Asn Pro

805 810 815

Arg Gly Ile Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gly Gln Asp Ala Ser Ala Ile

820 825 830

Thr Trp Lys Leu Thr Gly Asn Leu Gly Gly Glu Asp Tyr Gln Asp Lys

835 840 845

Val Arg Gly Pro Leu Asn Glu Gly Gly Leu Tyr Ala Glu Arg Gln Gly

850 855 860

Phe His Gln Pro Gln Pro Pro Ser Glu Ser Trp Glu Ser Gly Ser Pro

865 870 875 880

Leu Glu Gly Leu Ser Lys Pro Gly Ile Gly Phe Tyr Thr Ala Gln Phe

885 890 895

Asp Leu Asp Leu Pro Lys Gly Trp Asp Val Pro Leu Tyr Phe Asn Phe

900 905 910

Gly Asn Asn Thr Gln Ala Ala Arg Ala Gln Leu Tyr Val Asn Gly Tyr

915 920 925

Gln Tyr Gly Lys Phe Thr Gly Asn Val Gly Pro Gln Thr Ser Phe Pro

930 935 940

Val Pro Glu Gly Ile Leu Asn Tyr Arg Gly Thr Asn Tyr Val Ala Leu

945 950 955 960

Ser Leu Trp Ala Leu Glu Ser Asp Gly Ala Lys Leu Gly Ser Phe Glu

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980 985 990

Pro Glu Gln Pro Lys Tyr Glu Gln Arg Lys Gly Ala Tyr

995 1000 1005

Claims

1.一种黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述的黑曲霉突变菌株的保藏编号为CGMCC No.19280。

2.权利要求1所述的黑曲霉突变菌株在生产酸性乳糖酶中的应用。