CN116004398B

CN116004398B - 一种可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株及其应用

Info

Publication number: CN116004398B
Application number: CN202211246417.7A
Authority: CN
Inventors: 林新月; 丁慧; 曹阳; 柳燕; 田�健; 诸辉
Original assignee: Ningbo Xinuoya Marine Biotechnology Co ltd
Current assignee: Ningbo Xinuoya Marine Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-10-12
Filing date: 2022-10-12
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2042-10-12
Also published as: CN116004398A

Abstract

本发明属于微生物领域，公开了一种可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株，该菌株为曲霉属真菌的黑曲霉（Aspergillus niger），保藏日期为2022年8月24日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 20221322，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该菌株应用于表达乳糖酶和/或蛋白酶时，所得乳糖酶稳定性较好，蛋白酶活性较高，在工业生产中有较大的优势。

Description

一种可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体讲是一种可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株及其应用。

背景技术

乳糖酶，即β-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-galactoside galactohydrolase，E.C.3.2.1.23)，具有催化乳糖水解生成半乳糖和葡萄糖并且具有一定的转糖基活性。乳糖酶在食品、医药、环境等领域都有广泛的应用，在食品和医药上主要用来解决乳糖不耐症。乳糖酶的天然来源十分丰富，广泛分布在动物、植物和微生物中，但目前研究发现，仅有微生物产生的乳糖酶在工业上具有应用价值。其中，黑曲霉、米曲霉等霉菌没有在安全性试验中出现过中毒的现象，被认为是安全菌株。

蛋白酶是一类具有重要商业应用价值的酶制剂，根据来源不同，可以分为动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶。其中，微生物蛋白酶在食品和医药等领域有着广泛的应用。微生物可以以农副产品为原料发酵生产蛋白酶，生产成本低，且容易进行人工改造。其蛋白酶具有广泛的底物特异性，并且因微生物生活环境多样，酶的适应性也十分广泛。按照反应最适pH分类，又可将蛋白酶分为酸性、中性和碱性，其中，酸性蛋白酶已被广泛应用于食品、医药、皮革等产业，在酒类、酱油酿造等生产领域和皮革处理等工艺中发挥着明显的经济效应。

因此筛选出一种即可表达高稳定性乳糖酶又可表达高活性蛋白酶的黑曲霉菌株对工业化生产乳糖酶和蛋白酶具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上现有技术的缺点：提供一种即可表达高稳定性乳糖酶又可表达高活性蛋白酶的黑曲霉菌株及其应用。

本发明的技术解决方案如下：一种可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株，该菌株为曲霉属真菌的黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏日期为2022年8月24日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M20221322。

所述可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供一种所述的可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株的应用，用于表达乳糖酶和/或蛋白酶。

所述黑曲霉菌株表达的乳糖酶酶活适应反应温度为50-80℃。

所述黑曲霉菌株表达的乳糖酶酶活最适反应温度为70℃。

所述黑曲霉菌株表达的乳糖酶在20-70℃热稳定性良好。

所述黑曲霉菌株表达的乳糖酶酶活最适反应pH为4。

所述黑曲霉菌株表达的蛋白酶酶活最适反应温度为60℃。

所述黑曲霉菌株表达的蛋白酶在20-60℃热稳定性良好。

所述黑曲霉菌株表达的蛋白酶酶活最适反应pH为3。

本发明的有益效果是：本发明分离和鉴定了一株黑曲霉菌株，其保藏编号为CCTCCNO：M 20221322，保藏日期为2022年8月24日，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。该菌株应用于表达乳糖酶和/或蛋白酶时，所得乳糖酶稳定性较好，蛋白酶活性较高，在工业生产中有较大的优势。

附图说明

图1为实施例4中黑曲霉菌株在PDA固体培养基上培养5d时的菌落形态；左图为正面，右图为反面；

图2为实施例4中黑曲霉菌株在显微镜下的形态图；

图3为实施例6中黑曲霉菌株基于序列结果构建的系统发育树；

图4为实施例7中不同温度对乳糖酶酶活的影响图；

图5为实施例8中不同pH值对乳糖酶酶活的影响图；

图6为实施例9中不同温度对蛋白酶酶活的影响图；

图7为实施例10中不同pH值对蛋白酶酶活的影响图。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。

实施例1

黑曲霉菌株的筛选和获得

1.培养基的配制

PDA培养基：土豆洗净去皮，称取200g切小块，在纯水中煮30分钟，用八层纱布过滤除去残渣，降温后加水定容至1L，pH为自然。如为固体培养基，则再加入琼脂20g，分装后于121℃灭菌20分钟。50％葡萄糖：称取50g葡萄糖，加水溶解并定容至100mL，115℃灭菌30分钟。

PDA固体平板：将灭菌后的PDA培养基冷却至60℃左右，添加20g/L葡萄糖和20mg/mL X-gal，倒注平板，凝固后备用。

2.菌株的筛选和获得

样品采集：2022年5月1日于海南省文昌市近海滩涂(E 110°49′23″,N 19°32′12″)采集的海水样本，存放于无菌瓶中。

菌株筛选和获得：样本经无菌水梯度稀释后，采用平板涂布的方式分布于PDA固体培养基上，编号并贴封口膜，于30℃生化培养箱中倒置培养3-5天。通过平板初筛，在平板上发现一株显蓝色的真菌，将其点接于PDA固体培养基上，进行富集纯化。

实施例2

黑曲霉菌株的乳糖酶酶活测定

1.缓冲液及试剂配制

醋酸盐缓冲液：吸25mL 2N乙酸，加入约300mL水，并用2N NaOH溶液调pH至4.5。将溶液转移到500mL容量瓶中，定容。10％Na₂CO₃溶液：称取50g无水碳酸钠，用少量去离子水溶解，并在500mL容量瓶中定容。底物：称取185.0mg ONPG(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)，用40mL醋酸盐缓冲液溶解，并用50mL容量瓶定容，现配现用，始终保持在阴凉避光处直到使用，并在2小时内进行检测。2mM邻硝基苯酚：称取139.0mg邻硝基苯酚到500mL容量瓶，用10mL 95％乙醇溶解，用1％Na₂CO₃溶液稀释至刻度，并充分混合。

2.邻硝基苯酚标准曲线制作

用1％Na₂CO₃溶液将2mM邻硝基苯酚分别稀释至0.10，0.14和0.18mM，在420nm下1cm比色皿中，使用合适的分光光度计测定三个浓度的邻硝基苯酚标准溶液的吸光度，并用水进行校零操作。通过三个邻硝基苯酚的标准溶液浓度(0.10,0.14和0.18mM)对各邻硝基苯酚的的吸光度数值进行的线性回归分析。

3.乳糖酶粗酶液的获得

将PDA固体平板上的黑曲霉菌接种到PDA液体培养基中，30℃，150r/min振荡培养6天，4000r/min离心并收集上清液，即为粗酶液。

4.乳糖酶活性测定

吸取2mL底物溶液加入到一系列的大试管中，在37℃水浴中平衡。在零时刻，迅速吸取0.5mL经过适当稀释的酶液加入到已经温度平衡的底物中，混合，然后立即将试管重新放入水浴锅中反应。经过15分钟反应后，在所有管中加入2.5mL的10％碳酸钠溶液，迅速混匀，从水浴中移出。同时准备一支空白管加入2mL底物，0.5ml去离子水和2.5mL，10％的碳酸钠溶液。在样品和空白管中加入20mL的水，然后彻底混匀。使用合适的分光光度计，在420nm下1cm比色皿中，测定样品各管和空白的吸光值，并用水进行校零操作。记录数据并计算。一个乳糖酶的单位(ALU)定义为在此试验条件下每分钟产生1μmolONP需要的酶的量。

实施例3

黑曲霉菌株的蛋白酶酶活测定

1.缓冲液及试剂配制

0.05M甘氨酸-盐酸缓冲液：将3.75g甘氨酸溶于约800mL水中。加入1N盐酸至溶液pH为3.0，用水定容至1000mL。TCA溶液：将18.0g三氯乙酸和11.45g无水乙酸钠溶于约800mL水中，加入21.0mL冰醋酸，用水定容至1000mL。底物溶液：将8mL 1N盐酸加入约500mL水中，在连续搅拌下将7.0g(无水基)酪蛋白分散到该溶液中。在沸水浴中加热30分钟，偶尔搅拌，冷却至室温。加入3.75g甘氨酸并溶解，用0.1N盐酸调节至pH 3.0，用水定容至1000mL。

2.酪氨酸标准曲线制作

将预先干燥至恒重的181.2mg L-酪氨酸溶于60mL 0.1N盐酸中，用水稀释溶液至1000mL。该溶液每1.0mL含有1.00μmol酪氨酸。从该储备溶液中制备稀释液，使其含有0.10,0.20,0.30,0.40和0.50μmol/mL。用水作为空白，用合适的分光光度计测量275nm处的1cm比色皿中的吸光度。绘制吸光度对酪氨酸浓度(μmol/mL)的图。

3.蛋白酶活性测定

将10.0mL底物溶液加入到一系列大试管中，将管塞住，并在37℃水浴中平衡15分钟。在零时刻，将2.0mL经甘氨酸-盐酸缓冲液适当稀释的粗酶液加入到平衡的底物中。用2mL甘氨酸-盐酸缓冲液替代酶液加入到底物中，作为底物空白。反应30分钟后，向每个试管中加入10mL TCA溶液。按10mL底物溶液，10mL TCA溶液和2mL酶液顺序制备酶空白。将所有管在水浴中加热30分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固。试管在冰浴中冷却5分钟后过滤，滤液必须非常清澈。用合适的分光光度计测定在275nm处的1cm比色皿中的吸光度。通过减去相应酶空白的吸光度来校正。

实施例4

黑曲霉菌株的形态学特征

将分离纯化的黑曲霉菌株转接到PDA固体平板上，30℃培养5天后观察菌落形态、测量菌落直径并记录菌落形状及颜色；用显微镜观察分生孢子梗及分生孢子形态。培养5天后，黑曲霉菌落直径为5.2cm，中间孢子为黑色，周边有白色菌丝，菌落背面为黄白色，菌落形态见图1。在显微镜下观察，黑曲霉分生孢子为球形，分生孢梗茎壁平滑，顶囊为球形，显微形态见图2。

实施例5

碳源对黑曲霉菌株生长的影响

分别以淀粉、蔗糖、羧甲基纤维素为碳源，等量替代PDA固体培养基中的葡萄糖，将黑曲霉菌株转接到平板上，30℃培养5天，黑曲霉在蔗糖培养基上生长良好，在羧甲基纤维素培养基上长势缓慢，在淀粉培养基上几乎不生长。

实施例6

黑曲霉菌株的分子生物学鉴定

1.真菌DNA基因组提取

取实施例2中的培养液，离心后取部分菌体置于研钵中，加液氮进行充分研磨，将磨碎后的菌体收集于离心管中，置-20℃冰箱备用。

取200mg液氮研磨后的菌体，加入3％CTAB，65℃水浴45min，13000rpm离心十分钟。取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)，13000rpm离心十分钟。取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比为24：1)，13000rpm离心十分钟。在上清液中加入两倍体积预冷的无水乙醇，-20℃静置20-30分钟，13000rpm离心十分钟。倒掉上清，加70％乙醇200μL洗涤沉淀，13000rpm离心十分钟。去上清液，室温干燥沉淀。加入30μL水使DNA完全溶解，置-20℃冰箱保存。

2.PCR扩增

取提取出的菌株DNA，利用序列如SEQ ID NO：2所示引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和序列如SEQ ID NO：3所示ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系为：2×TAQ酶25μL，ITS1引物2μL，ITS2引物2μL，模板5μL，无菌水16μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。

3.rDNA-ITS测序与分析

利用DNA凝胶快速纯化试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)对目的PCR产物回收纯化，将纯化后的PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，基因序列如SEQ ID NO：1所示。

将测得的序列通过BLAST在NCBI中进行比对，利用Mega 4.0软件对序列进行分析并以Neighbor-Joining方法构建系统发育树，如图3所示。

通过系统发育树发现该菌株与曲霉属真菌具有极高的亲缘性，结合形态特征将该菌株鉴定为曲霉属真菌的黑曲霉(Aspergillus niger)。

将菌株CY5103-2送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，其保藏编号为CCTCCNO：M 20221322，保藏日期为2022年8月24日，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

实施例7

温度对乳糖酶酶活的影响

1.乳糖酶的最适反应温度

取粗酶液适当稀释，分别在20、30、37、43、50、60、70、80℃反应温度下进行酶解，按照实施例2中的方法测定乳糖酶酶活。以最适反应温度下测定的酶活力为100％，分别计算出不同温度的相对酶活。相对酶活如下表所示：

温度/℃	20	30	37	43	50	60	70	80
									相对酶活/％	33.4	39.1	46.4	60.8	77.4	88.5	100	78.2

相对酶活变化曲线如图4所示。黑曲霉表达的乳糖酶在反应温度为70℃时活性最高，在50-80℃范围内活性在70％以上。

2.乳糖酶的热稳定性

取粗酶液适当稀释，分别在20、30、37、43、50、60、70、80℃的环境下保温处理30分钟，再立即将其置于冰浴中冷却，在最适反应条件下测定乳糖酶酶活。以不同温度下未保温处理时测定的酶活力为100％，分别计算出不同温度的相对酶活。相对酶活如下表所示：

温度/℃	20	30	37	43	50	60	70	80
									相对酶活/％	99.5	93.4	96.8	100	95.0	99.3	90.2	48.5

相对酶活变化曲线如图4所示。黑曲霉表达的乳糖酶在20-70℃范围内热稳定性良好，相对酶活均高于90％。

实施例8

pH对乳糖酶酶活的影响

1.乳糖酶的最适反应pH

取粗酶液适当稀释，在最适反应温度下分别在pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的环境下进行酶解，按照实施例2中的方法测定乳糖酶酶活。以最适反应pH下测定的酶活力为100％，分别计算出不同pH的相对酶活。相对酶活如下表所示：

pH	3.0	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0	9.0	10.0
									相对酶活/％	71.5	100	72.5	39.4	20.5	19.4	16.4	0.526

相对酶活变化曲线如图5所示。黑曲霉表达的乳糖酶在反应pH为4时活性最高，pH为3-5时活性在70％以上。

实施例9

温度对蛋白酶酶活的影响

1.蛋白酶的最适反应温度

取粗酶液适当稀释，分别在20、30、37、43、50、60、70、80℃反应温度下进行酶解，按照实施例3的方法测定蛋白酶酶活。以最适反应温度下测定的酶活力为100％，分别计算出不同温度的相对酶活。相对酶活如下表所示：

温度/℃	20	30	37	43	50	60	70	80
									相对酶活/％	29.0	45.3	51.2	54.3	74.2	100	53.0	0

相对酶活变化曲线如图6所示。黑曲霉表达的蛋白酶在反应温度为60℃时活性最高，在50-60℃范围内活性在70％以上。

2.蛋白酶的热稳定性

取粗酶液适当稀释，分别在20、30、37、43、50、60、70、80℃的环境下保温处理30分钟，再立即将其置于冰浴中冷却，在最适反应条件下测定蛋白酶酶活。以不同温度下未保温处理时测定的酶活力为100％，分别计算出不同温度的相对酶活。相对酶活如下表所示：

温度/℃	20	30	37	43	50	60	70	80
									相对酶活/％	80.3	100	93.2	96.2	97.7	79.6	51.6	3.18

相对酶活变化曲线如图6所示。黑曲霉表达的蛋白酶在20-60℃范围内热稳定性良好，相对酶活均高于79％。

实施例10

pH对蛋白酶酶活的影响

1.蛋白酶的最适反应pH

取粗酶液适当稀释，在最适反应温度下分别在pH为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的环境下进行酶解，按照实施例3的方法测定蛋白酶酶活。以最适反应pH下测定的酶活力为100％，分别计算出不同pH的相对酶活。相对酶活如下表所示：

pH	1.0	2.0	3.0	4.0	5.0	6.0	7.0
								相对酶活/％	64.7	65.9	100	59.9	31.8	25.8	20.4

相对酶活变化曲线如图7所示。黑曲霉表达的蛋白酶在反应pH为3时活性最高，pH为1-4时活性较高。

以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims

1.一种可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株，其特征在于：该菌株为曲霉属真菌的黑曲霉（Aspergillus niger），保藏日期为2022年8月24日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 20221322。

2.一种权利要求1所述的可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株的应用，其特征在于，用于表达乳糖酶和/或蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株的应用，其特征在于，所述黑曲霉菌株表达的乳糖酶酶活适应反应温度为50-80℃。

4.根据权利要求3所述的可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株的应用，其特征在于，所述黑曲霉菌株表达的乳糖酶酶活最适反应温度为70℃。

5.根据权利要求4所述的可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株的应用，其特征在于，所述黑曲霉菌株表达的乳糖酶在20-70℃热稳定性良好。

6.根据权利要求5所述的可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株的应用，其特征在于，所述黑曲霉菌株表达的乳糖酶酶活最适反应pH为4。

7.根据权利要求3所述的可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株的应用，其特征在于，所述黑曲霉菌株表达的蛋白酶酶活最适反应温度为60℃。

8.根据权利要求7所述的可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株的应用，其特征在于，所述黑曲霉菌株表达的蛋白酶在20-60℃热稳定性良好。

9.根据权利要求8所述的可表达乳糖酶与蛋白酶的黑曲霉菌株的应用，其特征在于，所述黑曲霉菌株表达的蛋白酶酶活最适反应pH为3。