KR101499138B1

KR101499138B1 - 스테비오사이드의 효소적 전환을 이용한 루부소사이드의 생산방법

Info

Publication number: KR101499138B1
Application number: KR1020120112371A
Authority: KR
Inventors: 김도만; 탄한
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2015-03-09
Also published as: KR20140046689A

Abstract

본 발명은 스테비오사이드의 효소적 전환을 이용한 루부소사이드의 생산방법에 관한 것이다.

Description

스테비오사이드의 효소적 전환을 이용한 루부소사이드의 생산방법{Method for preparing rubusoside from stevioside using enzymes}

감미료로써 가장 많이 사용되어 온 것은 설탕이지만 과다섭취에 기인하는 부작용이 널리 인식되면서, 그 수요가 선진국에서는 1970년대 말을 고비로 점차 감소하는 추세에 있고, 이를 대체할 다양한 종류의 대체 감미료가 개발되고 있다.

현재 사용되고 있는 대체 감미료는 원료에 따라 당질계와 비당질계로 나눌 수 있는데, 당질계에는 설탕을 효소와 작용시킨 팔라티노스, 프럭토올리고사카라이드, 유당에 효소 반응시킨 갈락토올리고사카라이드, 이소말토올리고사카라이드, 그리고 전분당을 수소화시킨 솔비톨, 말티톨 등의 당알코올계가 있다. 비당질계 감미료에는 아스팔탐, 사카린, 아세설팜-K와 같은 각종 합성 감미료와 타우마틴, 스테비오사이드, 글리시리진, 디하이드로칼콘, 모넬린 등과 같은 식물에서 추출한 천연 감미료가 여기에 속한다.

대부분의 합성 감미료는 pH나 열 등 외부조건에 대한 높은 안정성과 대량생산 가능성 등 많은 장점을 지니고 있으나, 감미료로써 사용할 때 독성 및 인체에 대한 안전성에 대한 논란이 항상 제기된다. 이러한 문제점 때문에 자연계에 존재하는 천연 대체 감미료의 탐색과 이용에 대한 관심이 제고되고 있다.

천연 감미료는 식물의 뿌리, 잎, 열매 등에 함유된 감미성 천연 화합물로, 인공적으로 제조된 합성 감미료가 지니는 독성 및 인체의 안전성에 대한 염려가 적고 일반적으로 감미도는 설탕에 비해 상당히 높아 그 사용이 점차 증대되고 있는 추세를 보이고 있다.

한편, 스테비오사이드(Stevioside, ST)와 루부소사이드(Rubusoside, R)는 남아메리카에 재배되는 Stevia rebaudiana와 남중국에서 재배되는 Rubus suavissimusS. Lee의 잎에서 추출되는 감미료로 스테비올의 배당체다. 스테비오사이드(13-O-β-sophorosyl-19-O-β-D-glucosyl-steviol)와 루부소사이드는 0.025%의 농도에서 설탕에 비해서 각각 143배, 114배 더 단맛이 강한 것으로 알려져 있다.

루부소사이드(13-O-β-glucosyl-19-O-β-d-glucosyl-steviol; Rubus suavissimusLee)는 중국 감미차의 성분으로 포함되어 있는 희귀 천연 감미료로 이 차 식물은 남 중국 지역에서 자라며, 기후에 많은 영향을 받는다. 루부소사이드는 또한 Stevia rebaudiana의 잎에서도 소량 얻을 수 있다.

일반적으로 재배되고 있는 스테비아 품종은 상기 감미성분 중 스테비오사이드가 주성분으로, 당뇨병과 비만을 예방할 수 있는 천연 감미료로 주목받고 있다. 뿐만 아니라, 우수한 용해성 및 안정성과 착생성으로 경제성이 있어, 근래의 식품경향과 맞물려 시장성과 잠재성이 매우 크다. 최근에는 고감미 소재로서 뿐 아니라 항당뇨, 항고혈압, 항종양(항돌연변이), 항바이러스, 장내균총 개선, 신장기능 개선 등의 역할이 보고되면서 차, 음료, 한약, 생식, 간장 등에 다양하게 사용되고 있다.

건강음료의 감미성분으로 사용이 되는 것 외에도 대부분의 스테비오사이드 분해 산물은 자연적으로 존재하고, 약학적인 특성이 있어 항-종양, 항-염증의 특성이 있다.

루부소사이드는 항-신생혈관형성(antiangiogenic)과 항-알러지 효능을 가지고 있음이 보고된 바 있으며, 우수한 천연용해제로 수용성이 매우 낮은 여러 가지 약학적으로 중요한 화학물질들, 즉 paclitaxel, curcumin, capsaicin, cyclosporine, nystatin, erythromycin 등의 수용성을 증가시킴도 보고된 바 있다.

이러한 루부소사이드는 현재까지 루부소사이드를 경제적으로 대량 생산할 수 있는 방법은 아직까지 개발이 미흡한 실정이다

단편적인 일 예로, 합성 루부소사이드에 대한 몇 가지 연구 결과가 있으며, 이는 레바우디오사이드 A(rebaudioside A)를 화학-효소적으로 합성하는 과정에서 중간물질로 얻어진다는 보고가 있으나, 크리세오박테리움(Chryseobacterium) 배양액이 스테비오사이드를 이용하여 루부소사이드를 합성하기는 하나 isomer를 제외시키지는 못하는 한계점이 있었다(Z.Y. Jiang, Y.R. Chen, H. Liu, Acta Microbiol. Sin. 51 (2011) 4349).

또한, 스테비오사이드로부터 루부소사이드를 생산하는 효소와 생산을 위한 최적화 연구들이 보고된 바 있다. 사용한 효소는 베타-글루코시다아제로서, 아스페르질루스 아쿨레아투스 비스코자임 L(Aspergillus aculeatus Viscozyme L)을 이용하여 스테비오사이드를 280 mM 사용하여 루부소사이드 193 mM을 생산하였으며 전환율은 68.9%였다(Jin-A Ko, Young-Min Kim 등 Mass Production of Rubusoside Using a Novel Stevioside-Specific β-Glucosidase from Aspergillus aculeatus J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 62106216).

또한, 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)로부터 유래한 베타-갈락토시다아제를 이용하여 스테비오사이드로부터 루부소사이드를 합성한 연구 결과에서는 8%의 스테비오사이드에 그램당 5,250 U의 베타-갈락토시다아제 효소를 이용하여 최적 반응 온도인 60℃에서 72시간을 반응하여 98.3%의 스테비오사이드 전환을 확인하였다[H. Wan, G. Tao, D. Kim, Y Xia, Enzymatic preparation of a natural sweetener rubusoside from specific hydrolysis of stevioside with beta-galactosidase from Aspergillus sp. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 82 (2012) 12 17].

이에 본 발명자들은 루부소사이드를 경제적으로 대량 생산할 수 있는 방법을 연구하던 중, 스테비오사이드로부터 루부소사이드의 전환능이 우수하고, 열안전성이 높으면서 활성이 우수한 루부소사이드 생성 효소를 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

Z.Y. Jiang, Y.R. Chen, H. Liu, Acta Microbiol. Sin. 51, 4349, 2011 Jin-A Ko., Food Chem. 60, 62106216, 2012, H. Wan et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 82, 12 17, 2012

본 발명의 목적은 스테비오사이드로부터 루부소사이드의 전환능이 우수하고, 열안전성이 높으면서 활성이 우수한 루부소사이드 생성 효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 루부소사이드 생성 효소를 포함하는 루부소사이드 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 루부소사이드 생성 효소를 이용한 루부소사이드의 생산방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스테비오사이드(Stevioside)로부터 루부소사이드(Rubusoside)로의 전환능이 우수하고, 열안전성이 높으면서 활성이 우수한 루부소사이드 생성 효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 루부소사이드 생성 효소를 포함하는 루부소사이드 생산용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 루부소사이드 생성 효소를 이용한 루부소사이드의 생산방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 포함하는 하기 화학식 2의 루부소사이드(Rubusoside) 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시 예에 따른 효소는 하기 화학식 1의 스테비오사이드(Stevioside)의 13C에 결합된 소포로오스(2-O-β-D-Glucopyranosyl-α-D-glucose)의 말단 글루코오스를 제거함으로써 루부소사이드를 합성할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 하기 공지된 34종의 탄수화물 분해 관련 효소들을 대상으로 스테비오사이드의 루부소사이드로의 전환을 확인하였다.

공지된 34종의 탄수화물 분해 관련 효소[최적 pH 범위; 최적 온도범위 ℃; 상품이름]는 노보자임사(Novozyme 사)의 Trichoderma reesei cellulase[pH 4.0-6.0; 45-55℃; Celluclast 1.5L], Aspergillus aculeatus pectinlyase[pH 4.0-5.0; 40-60℃; Pectinex Ultra Clear], Aspergillus aculeatus polygalacturonase[pH 4.0-5.0; 40-60℃; Pectinex Ultra SP-L], Aspergillus aculeatus polygalacturonase[pH 4.0-5.0; 40-60℃; Pectinex 5XL], Aspergillus niger glucoamylase[pH 4.0-6.0; 45-55℃; SAN-Extra L], Bacillus licheniformis Cyclomaltodextrin glucanotransferase[pH 5.0-5.5; 80-90℃; Toruzyme 3.0L(CGTase)], 옥전바이오텍사의 Aspergillus niger Pectinase[pH 3.0-4.5; 45-60℃; Sumizyme PX], Aspergillus niger arabinase[pH 3.5-5.0; 50-60℃; Sumizyme ARS], 비전바이오켐사의 Trichoderma reesei Pectinase[pH 3.5-5.1; 55-66℃; Crystalzyme PML MX], Aspergillus niger Pectinase, cellulase, hemicellulase와 β-glucosidase의 혼합효소[pH 2.5-5.0; 50-65℃; Cytolase PCL5], Aspergillus niger pectinase[pH 3.2-4.7; 30-60℃; SEBmash U13], Trichoderma reesei β-glucanase[pH 4.9-5.3; 50℃; Multifect B], Aspergillus niger Pectinase와 hemicellulase 혼합효소[pH 3.0-5.5; 35-45℃; Rapidase TF], 옥전바이오텍사의 Aspergillus niger cellulase와 hemicellulase의 혼합효소[pH 4.0-5.0; 45-50℃; Cellulosin PE60], 비전바이오켐사의 Trichoderma reesei cellulase와 β-glucosidase의 혼합효소[pH 3.9-4.3; 55℃; Multifect CX15L], Trichoderma reesei cellulase[pH 5.0; 55℃; Multifect GC Extra], Aspergillus niger pectinase[pH 4.0-5.0; 45-50℃; Rapidase Press L], Trichoderma reesei cellulase[pH 4.5-5.0; 60-65℃; Rohament CL], Trichoderma reesei Hemicellulase(xylanase)[pH 4.5-5.1; 60-66℃; Rohament GE], Trichoderma reesei Hemicellulase(xylanase)[pH 4.0-6.0; 45-60℃; Sumizyme X], Trichoderma reesei Hemicellulase(xylanase)[pH 4.0-5.5; 50-65℃; Optimash XL], Trichoderma reesei β-glucanase[pH 4.0-6.0; 40-70℃; Filtrase Premium L], Aspergillus niger pectinase[pH 3.0-5.0; 50-60℃; Sumizyme SPC], Trichoderma spp cellulase[pH 4.0-5.5; 50-60℃; Lumicell YX1], Trichoderma spp Xylanase[pH 4.0-5.5; 50-60℃; Lumixyl YX2], Trichoderma spp cellulase[pH 4.0-5.5; 50-60℃; Lumicellulase Super], Aspergillus niger β-galactosidase[pH 4.5-7.0; 45-55℃; Sumilact L], Aspergillus niger α-galactosidase[pH 3.5-6.5; 40-50℃; Validase AGS], Rhizopus oryzae cellulase[pH 4.0-6.0; 40-50℃; Sumizyme MC], Penicillium spp naringinase[pH 4.0-6.0; 40-50℃; Cellulase KN] 그리고 Kluyveromyces lactis[pH 7.0; 28℃], Aspergillus oryzae[pH 4.3; 50℃], Bacillus circulans[pH 6.0; 60℃] 유래 β-galactosidase와 Thermus 종 [pH 7.0; 70℃]유래 락테아제를 사용하였다.

그 결과, 특정 미생물 유래의 펙티나제(pectinase), α-갈락토시다제(α-galactosidase), 나린지나제(naringinase), β-갈락토시다제(β-galactosidase)와 내열성 락테아제(Lactase)가 스테비오사이드로부터 루부소사이드를 생산할 수 있음을 발견하였다. 보다 상세하게는 아스퍼질러스 니가(Aspergillus niger) 유래의 α-갈락토시다제(α-galactosidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), 펙티나제(pectinase); 페니실리움 속( Penicillium spp.) 유래의 나린지나제(naringinase); 및 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제(Lactase)가 스테비오사이드로부터 루부소사이드로를 전환할 수 있음을 확인하였다.

특히, 열안전성이 높으면서 활성이 우수한 루부소사이드 생성 효소로서 락타아제의 경우 써머스 속(Thermus spp.)이라는 특정 미생물 유래의 효소가 스테비오사이드로부터 루부소사이드로 전환하는 능력이 매우 우수하고, 높은 반응 온도에서도 활성이 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 실시예에 따른 루부소사이드 생산용 조성물은 효소로, α-갈락토시다제(α-galactosidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), 락테아제(Lactase), 펙티나제(pectinase) 및 나린지나제(naringinase)로부터 선택되는 1종 이상인 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 펙티나아제(EC 3.2.1.15)는 과일이나 야채에 광범위하게 분포되어 있는 펙틴기질을 가수분해하는 효소로 (1) 갈락트론산(galacturonic acid)의 α-1,4 글리코시드 결합을 가수분해하는 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase), (2) methyl ester화 된 갈락트론산(galacturonic acid)의 α-1,4 결합을 분해하는 펙틴 리아제(pectin lyase), (3) methy ester 결합을 가수분해하는 펙틴 에스터라아제(pectin esterase)의 혼합된 활성을 가지고 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 나린지나아제(EC 3.2.1.40)는 β-갈락토시다제 및 람노시다제(rhamnosidase) 활성이 있으며, α-갈락토시다제(EC 3.2.1.22)는 당지질 및 당단백질 말단에 α-1,4 결합되어있는 갈락토오스(galactose)를 유리하는 효소이며, β-갈락토시다제(EC 3.2.1.23) 또는 락테아제는 유당 등에 있는 β-갈락토사이드(β-galactoside) 결합을 가수분해하여 갈락토오스를 유리하는 효소이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 루부소사이드 생산용 조성물은 효소를 생산하는 미생물로, 아스퍼질러스 니가(Aspergillus niger), 페니실리움 속( Penicillium spp.), 및 써머스 속(Thermus spp.)으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 효소는 재조합 DNA 기술에 기초하여 생산하는 것이 바람직하다. 한 양태로서, (a) 해당 효소를 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 그의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절서열을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양물로부터 해당 효소를 분리하는 단계를 거쳐 생산할 수 있다.

상기 '벡터'로는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다.

상기 '조절서열'은 해당 효소의 발현에 필수적이거나 이로운 핵산 서열들을 의미한다. 상기 조절서열에는 프로모터, 업스트림(upstream) 활성화 서열 또는 인핸서(enhancer), 폴리아데닐화 서열 및 전사 종결인자 등을 포함한다.

상기 '숙주세포'로는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물세포, 조직배양된 인간 세포 및 식물 세포 등이 포함된다.

상기된 형질전환 또는 형질감염은 Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, 1986과 같은 기본적인 실험 지침서에 기술된 방법에 따라 수행될 수 있다. 바람직한 예로는 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection) 등이 포함된다.

숙주세포들은 적절한 배지와 해당 효소 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건하에서, 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양배지에서 진행한다. 적합한 배지는 상업적으로 입수 가능하고, 예를 들면 American Type Culture Collection 카탈로그 등에 기재된 성분 및 이들의 조성비에 따라 제조할 수도 있다.

배양물로부터 해당 효소는 당업계에 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 해당 효소는 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 의해 배양물로부터 분리될 수 있다. 더 나아가 해당 효소는 크로마토그래피 또는 전기영동을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제는 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 가장 높은 스테비오사이드(기질)의 루부소사이드로의 전환 능력을 보인 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제의 기질농도에 따른 전환 반응 특성을 확인하였다.

그 결과, 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제는 9시간까지의 반응 확인 상태에서 40%의 고농도의 스테비오사이드를 이용하여서도 루부소사이드의 생성은 동일한 효소 활성 당 지속적으로 증가하고 있음을 확인하였다. 즉, 기존에 보고된 완 등에 의해서 연구된 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)의 베타-갈락토시다아제를 이용하는 경우 보다 같은 농도의 기질에서도 8.68배 많은 루부소사이드를 단위시간 당 1000 U의 효소를 이용하여 생산할 수 있으며, 40%의 기질을 이용하는 경우는 38배 이상의 생산능력을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제(EMBL accession HB973086.1)는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진다.

본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제는 상기 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 락테아제 유전자 또는 서열번호 4에 기재된 염기서열로 이루어지는 락테아제 유전자일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제 유전자는 서열번호 4에 기재된 염기서열로 이루어짐에 있어서, 유전자 코드의 디제너러시(degeneracy)를 고려하여 서열번호 2에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 락테아제 유전자에 포함된다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제(EMBL accession HB972972.1)는 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진다.

본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제는 상기 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 락테아제 유전자 또는 서열번호 5에 기재된 염기서열로 이루어지는 락테아제 유전자일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제 유전자는 서열번호 5에 기재된 염기서열로 이루어짐에 있어서, 유전자 코드의 디제너러시(degeneracy)를 고려하여 서열번호 2에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 락테아제 유전자에 포함된다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제(EMBLl accession HB972880.1)는 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진다.

본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제는 상기 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 락테아제 유전자 또는 서열번호 6에 기재된 염기서열로 이루어지는 락테아제 유전자일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제 유전자는 서열번호 6에 기재된 염기서열로 이루어짐에 있어서, 유전자 코드의 디제너러시(degeneracy)를 고려하여 서열번호 2에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 락테아제 유전자에 포함된다.

본 발명은

스테비오사이드(Stevioside)로부터 루부소사이드(Rubusoside)를 제조함에 있어서,

효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 루보사이드(Rubusoside)의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 효소는 α-갈락토시다제(α-galactosidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), 락테아제(Lactase), 펙티나제(pectinase) 및 나린지나제(naringinase)로부터 선택되는 1종 이상인 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 효소를 생산하는 미생물은 아스퍼질러스 니가(Aspergillus niger), 페니실리움 속( Penicillium spp.), 및 써머스 속(Thermus spp.)으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제(EMBL accession HB973086.1)는 상기 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 락테아제 유전자 또는 서열번호 4에 기재된 염기서열로 이루어지는 락테아제 유전자일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제(EMBL accession HB972972.1)는 상기 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 락테아제 유전자 또는 서열번호 5에 기재된 염기서열로 이루어지는 락테아제 유전자일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 락테아제(EMBLl accession HB972880.1)는 상기 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 락테아제 유전자 또는 서열번호 6에 기재된 염기서열로 이루어지는 락테아제 유전자일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 효소는 고정화 비드에 고정화된 것을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 고정화 비드는 나트륨 알지네이트, 트리에타놀아민 알지네이트, 또는 칼슘 알지네이트를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 고정화 효소 비드는 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 보다 상세하게는 0.5 내지 10%(w/v)의 나트륨 알지네이트 비드 0.1 내지 10 g에 50 내지 500 U의 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제를 혼합하여 제조할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 자유효소는 반응 할 때마다 효소를 새로이 반응기에 첨가를 해주어야하는 번거로움이 있는 반면, 고정화 효소는 효소를 회수해서 사용 할 수 있는 장점이 있다. 또한 일반적으로 고정화 효소는 자유효소에 비해서 효소 활성의 안정성이 우수하기에 본 발명에서는 효소를 알지네이트 비드를 이용하여 고정화 효소 비드를 제작하고, 이를 이용하여 루부소사이드의 생성량을 조사하였다.

그 결과, 자유효소를 이용한 경우 시간이 길어질수록 스테비오사이드를 기질로 한 루부소사이드 전이반응에서, 생성되는 루부소사이드의 생성이 저하되는 것을 확인할 수 있었고 반면, 고정화 효소를 이용하는 경우 루부소사이드를 높은 수율로 보다 간편하게 연속적으로 생산할 수 있는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에 따른 생산방법은 스테비오사이드와 효소를 50 내지 80℃의 온도, 바람직하게는 60 내지 70℃ 온도에서, 5일 내지 15일 동안, 바람직하게는 7일 내지 12일 동안 반응시켜 스테비오사이드의 13C에 결합된 소포로오스(2-O-β-D-Glucopyranosyl-α-D-glucose)의 베타 1-2결합을 선택적으로 분해하여 1개의 말단 글루코오스를 제거함으로써 루부소사이드를 합성할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 생산방법은 효소를 이용하여 동일한 기질의 스테비오사이드로부터 루부소사이드를 생산하는 기존의 방법보다 8배 많은 루부소사이드를 단위 시간당 500 내지 1000 U의 효소를 사용하여 생산할 수 있을 뿐 아니라 스테비오사이드의 양이 40% 이상일 경우 기존의 생산량 보다 38배 이상 많은 루부소사이드를 생산할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 따른 효소, 상기 효소를 포함하는 루부소사이드(Rubusoside) 생산용 조성물, 및 상기 효소를 이용하는 루부소사이드의 생산방법은 항당뇨, 항고혈압, 항종양(항돌연변이), 항바이러스, 장내균총 개선, 신장기능 개선 및 우수한 천연용해제인 루부소사이드를 경제적으로 대량생산할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 효소, 상기 효소를 포함하는 루부소사이드(Rubusoside) 생산용 조성물, 및 상기 효소를 이용하는 루부소사이드의 생산방법으로부터 생산된 루부소사이드는 나아가 기능성 식품 및 의약품 산업 등에 유용하게 활용될 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 고정화 효소와 자유효소의 활성 지속성 및 안정성을 시간(일)의 경과에 따라 조사한 결과이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제(EMBL accession HB973086.1)의 아미노산 서열(서열번호 1)을 나타낸 것이며,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제(EMBL accession HB972972.1)의 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제(EMBLl accession HB972880.1)의 아미노산 서열(서열번호 3)을 나타낸 것이며,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제(EMBL accession HB973086.1)의 염기서열(서열번호 4)을 나타낸 것이고,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제(EMBL accession HB972972.1)의 염기서열(서열번호 5)을 나타낸 것이며,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제(EMBLl accession HB972880.1)의 염기서열(서열번호 6)을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[실시예 1]

하기 표 1의 여러 가지 미생물들로부터 생산된 탄수화물 관련 효소들을 이용하여 스테비오사이드(기질)로부터 루부소사이드를 특이적으로 생산하는 효소를 확인하기 위해서 0.5%의 스테비오사이드를 기질로 하고, 용액상태의 효소는 총 반응액의 20%, 그리고 분말형태의 효소는 총 반응액 1 mL에 0.2 g을 넣어주고, 최적의 pH를 완충용액으로 유지하면서 각 효소의 최적 반응온도에서 반응을 하였다. 그리고 그 결과는 TLC를 이용하여 확인하였으며, 이때 전개용매는 아세토니트릴:물=85:15(v/v)을 이용하여 2번 전개하여 확인하였다.

상기 스테비오사이드는 하기 화학식 1과 같다.

그 결과 상기 표 1에서도 확인할 수 있듯이, 특정 균주 유래의 효소 즉, 아스퍼질러스 니가(Aspergillus niger) 유래의 α-갈락토시다제(α-galactosidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), 펙티나제(pectinase) 및 페니실리움 속( Penicillium spp.) 유래의 나린지나제(naringinase), 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제(Lactase)에서만 특이적으로 루부소사이드가 생산되는 것을 확인할 수 있었고, 특히 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제의 경우 다른 루부소사이드 생산 효소들에 비해 3배 내지 17배 이상 많은 루부소사이드를 생산하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제는 EMBL(European Molecular Biology Laboratory)에서 accession number HB973086.1(서열번호 1의 아미노산, 서열번호 4의 염기서열), accession number HB972972.1(서열번호 2의 아미노산, 서열번호 5의 염기서열) 및 accession number HB972880.1(서열번호 3의 아미노산, 서열번호 6의 염기서열)로 확인되었다.

[실시예 2]

상기 실시예 1의 결과로부터 가장 높은 스테비오사이드(기질)의 루부소사이드로의 전환 능력을 보인 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제(EMBL accession number HB973086.1)의 기질농도에 따른 전환 반응 특성을 확인하였다.

상기 기질농도에 따른 전환 반응 특성을 조사하기 위해서, 반응액의 최종 스테비오사이드의 농도를 5% 내지 40%로 하고, 스테비오사이드 그램 당 스테비오사이드의 활성을 3000 U으로 한 후, pH는 7로 40 mM Tris-HCl을 이용하여 유지하면서 70℃에서 9시간 동안 반응을 하였다.

그 결과 상기 표 2에서도 확인할 수 있듯이, 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제는 9시간까지의 반응 확인 상태에서 40%의 고농도의 스테비오사이드를 이용하여서도 루부소사이드의 생성은 동일한 효소 활성 당 지속적으로 증가하고 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 기존에 보고된 완 등에 의해서 연구된 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)의 베타-갈락토시다아제를 이용하여 80 g/L의 스테비오사이드를 기질로 5,250 U/g 스테비오사이드를 이용하여 72시간 동안 60℃에서 반응 후 생산된 루부소사이드의 양인 0.19 g/시간/1,000 U와 비교하면, 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제를 이용할 경우, 같은 농도의 기질에서도 8.68배 많은 루부소사이드를 단위시간 당 1000 U의 효소로 사용할 수 있으며, 40%의 기질을 이용하는 경우는 38배 이상의 생산능력을 확인할 수 있다.

[실시예 3]

자유효소는 반응할 때마다 새로이 반응기에 첨가를 해주어야하는데 비해, 고정화 효소는 효소를 회수해서 사용 할 수 있는 장점이 있다. 또한 일반적으로 고정화 효소는 자유효소에 비해서 효소 활성의 안정성이 우수하기에 본 실험에서는 알지네이트 비드를 이용하여 고정화 효소 비드를 제작하고, 이를 이용하여 루부소사이드의 생성량을 확인하였다.

고정화 효소 비드는 통상의 방법으로 제조하였고, 알지네이트는 3%(w/v)를 사용하였으며, 알지네이트 비드 1 g에는 200 U의 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제가 포함되도록 제조하였고, 1%(최종농도)의 스테비오사이드를 이용하여 자유효소와 고정화효소비드의 사용 시 활성의 지속성과 안정성을 비교하였다. 열안정성 시험에 사용한 온도는 섭씨 70℃에서 실시하였다.

상기 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제는 상기 실시예 1의 결과로부터 가장 높은 스테비오사이드(기질)의 루부소사이드로의 전환 능력을 보인 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제(EMBL accession number HB973086.1)를 사용하였다.

상기 표 3의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제는 자유효소와 고정화 효소 모두 70℃의 열에 안정한 것으로 확인할 수 있었다.

그러나 루부소사이드의 생성 정도는 고정화 효소를 이용하는 경우 70℃에 인큐베이션 시키는 시간이 길어질수록 자유효소의 경우는 루부소사이드의 생성이 저하되는 것을 확인할 수 있었으나, 상대적으로 고정화비드 효소를 이용한 경우 루부소사이드가 더 많이 생성되는 확인할 수 있었다.

상기의 결과는 산업적으로 동일한 효소를 여러 번 사용할 수 있어, 효소 재사용 공정에 따른 경제적인 장점과 더불어 고효율로 다량의 루부소사이드로를 안정적이고 지속적으로 생산이 가능한 장점이 있음을 확인한 결과이다.

[ 실시예 4]

상기 실시예 1 내지 실시예 3으로부터 생산된 루부소사이드를 정제하여, NMR 분석을 이용하여 루부소사이드임은 확인하였다. 그 결과는 표 4와 같다.

그 결과 하기 화학식 2의 루부소사이드(Rubusoside)가 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과들로부터 아스퍼질러스 니가(Aspergillus niger) 유래의 α-갈락토시다제(α-galactosidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), 펙티나제(pectinase) 및 페니실리움 속(Penicillium spp.) 유래의 나린지나제(naringinase), 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제(Lactase)가 스테비오사이드의 13C에 결합된 소포로오스(2-O-β-D-Glucopyranosyl-a-D-glucose)의 말단 글루코오스를 제거함으로써 루부소사이드를 합성하는 것을 확인할 수 있었다.

특히 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제(Lactase)의 경우 스테비오사이드를 루부소사이드로의 전환하는 능력이 매우 우수하고, 적은 양의 효소 활성을 사용하여도 빠른 시간에 고효율로 다량으로 루부소사이드를 생산할 수 있으며, 알지네이트-고정화 비드로 제작시 12일간의 사용에도 효소의 활성이나 안정성에 차이가 거의 없음을 확인할 수 있어 자유효소를 사용할 때보다 효소의 재사용과 루부소사이드 생성 효율성에 있어 상업적으로 크게 기여할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for preparing rubusoside from stevioside using enzymes <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 431 <212> PRT <213> Thermus spp. <400> 1 Met Asp Asp His Ala Glu Lys Phe Leu Trp Gly Val Ala Thr Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Thr Gln Glu Asp Gly Arg Gly Pro Ser Ile 20 25 30 Trp Asp Ala Phe Ala Arg Arg Pro Gly Ala Ile Arg Asp Gly Ser Thr 35 40 45 Gly Glu Pro Ala Cys Asp His Tyr Arg Arg Tyr Glu Glu Asp Ile Ala 50 55 60 Leu Met Gln Ser Leu Gly Val Arg Ala Tyr Arg Phe Ser Val Ala Trp 65 70 75 80 Pro Arg Ile Leu Pro Glu Gly Arg Gly Arg Ile Asn Pro Lys Gly Leu 85 90 95 Ala Phe Tyr Asp Arg Leu Val Asp Arg Leu Leu Ala Ser Gly Ile Thr 100 105 110 Pro Phe Leu Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Leu Ala Leu Glu Glu 115 120 125 Arg Gly Gly Trp Arg Ser Arg Glu Thr Ala Phe Ala Phe Ala Glu Tyr 130 135 140 Ala Glu Ala Val Ala Arg Ala Leu Ala Asp Arg Val Pro Phe Phe Ala 145 150 155 160 Thr Leu Asn Glu Pro Trp Cys Ser Ala Phe Leu Gly His Trp Thr Gly 165 170 175 Glu His Ala Pro Gly Leu Arg Asn Leu Glu Ala Ala Leu Arg Ala Ala 180 185 190 His His Leu Leu Leu Gly His Gly Leu Ala Val Glu Ala Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Gly Ala Arg Arg Val Gly Ile Val Leu Asn Phe Ala Pro Ala Tyr 210 215 220 Gly Glu Asp Pro Glu Ala Val Asp Val Ala Asp Arg Tyr His Asn Arg 225 230 235 240 Tyr Phe Leu Asp Pro Ile Leu Gly Lys Gly Tyr Pro Glu Ser Pro Phe 245 250 255 Arg Asp Pro Pro Pro Val Pro Ile Leu Ser Arg Asp Leu Glu Leu Val 260 265 270 Ala Arg Pro Leu Asp Phe Leu Gly Val Asn Tyr Tyr Ala Pro Val Arg 275 280 285 Val Ala Pro Gly Thr Gly Thr Leu Pro Val Arg Tyr Leu Pro Pro Glu 290 295 300 Gly Pro Ala Thr Ala Met Gly Trp Glu Val Tyr Pro Glu Gly Leu His 305 310 315 320 His Leu Leu Lys Arg Leu Gly Arg Glu Val Pro Trp Pro Leu Tyr Val 325 330 335 Thr Glu Asn Gly Ala Ala Tyr Pro Asp Leu Trp Thr Gly Glu Ala Val 340 345 350 Val Glu Asp Pro Glu Arg Val Ala Tyr Leu Glu Ala His Val Glu Ala 355 360 365 Ala Leu Arg Ala Arg Glu Glu Gly Val Asp Leu Arg Gly Tyr Phe Val 370 375 380 Trp Ser Leu Met Asp Asn Phe Glu Trp Ala Phe Gly Tyr Thr Arg Arg 385 390 395 400 Phe Gly Leu Tyr Tyr Val Asp Phe Pro Ser Gln Arg Arg Ile Pro Lys 405 410 415 Arg Ser Ala Leu Trp Tyr Arg Glu Arg Ile Ala Arg Ala Gln Thr 420 425 430 <210> 2 <211> 431 <212> PRT <213> Thermus spp. <400> 2 Met Thr Glu Asn Ala Glu Lys Phe Leu Trp Gly Val Ala Thr Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Thr Gln Glu Asp Gly Arg Gly Pro Ser Ile 20 25 30 Trp Asp Ala Phe Ala Gln Arg Pro Gly Ala Ile Arg Asp Gly Ser Thr 35 40 45 Gly Glu Pro Ala Cys Asp His Tyr Arg Arg Tyr Glu Glu Asp Ile Ala 50 55 60 Leu Met Gln Ser Leu Gly Val Arg Ala Tyr Arg Phe Ser Val Ala Trp 65 70 75 80 Pro Arg Ile Leu Pro Glu Gly Arg Gly Arg Ile Asn Pro Lys Gly Leu 85 90 95 Ala Phe Tyr Asp Arg Leu Val Asp Arg Leu Leu Ala Ser Gly Ile Thr 100 105 110 Pro Phe Leu Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Leu Ala Leu Glu Glu 115 120 125 Arg Gly Gly Trp Arg Ser Arg Glu Thr Ala Phe Ala Phe Ala Glu Tyr 130 135 140 Ala Glu Ala Val Ala Arg Ala Leu Ala Asp Arg Val Pro Phe Phe Ala 145 150 155 160 Thr Leu Asn Glu Pro Trp Cys Ser Ala Phe Leu Gly His Trp Thr Gly 165 170 175 Glu His Ala Pro Gly Leu Arg Asn Leu Glu Ala Ala Leu Arg Ala Ala 180 185 190 His His Leu Leu Leu Gly His Gly Leu Ala Val Glu Ala Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Gly Ala Arg Arg Val Gly Ile Val Leu Asn Phe Ala Pro Ala Tyr 210 215 220 Gly Glu Asp Pro Glu Ala Val Asp Val Ala Asp Arg Tyr His Asn Arg 225 230 235 240 Phe Phe Leu Asp Pro Ile Leu Gly Lys Gly Tyr Pro Glu Ser Pro Phe 245 250 255 Arg Asp Pro Pro Pro Val Pro Ile Leu Ser Arg Asp Leu Glu Leu Val 260 265 270 Ala Arg Pro Leu Asp Phe Leu Gly Val Asn Tyr Tyr Ala Pro Val Arg 275 280 285 Val Ala Pro Gly Thr Gly Thr Leu Pro Val Arg Tyr Leu Pro Pro Glu 290 295 300 Gly Pro Ala Thr Ala Met Gly Trp Glu Val Tyr Pro Glu Gly Leu Tyr 305 310 315 320 His Leu Leu Lys Arg Leu Gly Arg Glu Val Pro Trp Pro Leu Tyr Val 325 330 335 Thr Glu Asn Gly Ala Ala Tyr Pro Asp Leu Trp Thr Gly Glu Ala Val 340 345 350 Val Glu Asp Pro Glu Arg Val Ala Tyr Leu Glu Ala His Val Glu Ala 355 360 365 Ala Leu Arg Ala Arg Glu Glu Gly Val Asp Leu Arg Gly Tyr Phe Val 370 375 380 Trp Ser Leu Met Asp Asn Phe Glu Trp Ala Phe Gly Tyr Thr Arg Arg 385 390 395 400 Phe Gly Leu Tyr Tyr Val Asp Phe Pro Ser Gln Arg Arg Ile Pro Lys 405 410 415 Arg Ser Ala Leu Trp Tyr Arg Glu Arg Ile Ala Arg Ala Gln Thr 420 425 430 <210> 3 <211> 431 <212> PRT <213> Thermus spp. <400> 3 Met Thr Glu Asn Ala Glu Lys Phe Leu Trp Gly Val Ala Thr Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Thr Gln Glu Asp Gly Arg Gly Pro Ser Ile 20 25 30 Trp Asp Ala Phe Ala Gln Arg Pro Gly Ala Ile Arg Asp Gly Ser Thr 35 40 45 Gly Glu Pro Ala Cys Asp His Tyr Arg Arg Tyr Glu Glu Asp Ile Ala 50 55 60 Leu Met Gln Ser Leu Gly Val Arg Ala Tyr Arg Phe Ser Val Ala Trp 65 70 75 80 Pro Arg Ile Leu Pro Glu Gly Arg Gly Arg Ile Asn Pro Lys Gly Leu 85 90 95 Ala Phe Tyr Asp Arg Leu Val Asp Arg Leu Leu Ala Ser Gly Ile Thr 100 105 110 Pro Phe Leu Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Leu Ala Leu Glu Glu 115 120 125 Arg Gly Gly Trp Arg Ser Arg Glu Thr Ala Phe Ala Phe Ala Glu Tyr 130 135 140 Ala Glu Ala Val Ala Arg Ala Leu Ala Asp Arg Val Pro Phe Phe Ala 145 150 155 160 Thr Leu Asn Glu Pro Trp Cys Ser Ala Phe Leu Gly His Trp Thr Gly 165 170 175 Glu His Ala Pro Gly Leu Arg Asn Leu Glu Ala Ala Leu Arg Ala Ala 180 185 190 His His Leu Leu Leu Gly His Gly Leu Ala Val Glu Ala Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Gly Ala Arg Arg Val Gly Ile Val Leu Asn Phe Ala Pro Ala Tyr 210 215 220 Gly Glu Asp Pro Glu Ala Val Asp Val Ala Asp Arg Tyr His Asn Arg 225 230 235 240 Phe Phe Leu Asp Pro Ile Leu Gly Lys Gly Tyr Pro Glu Ser Pro Phe 245 250 255 Arg Asp Pro Pro Pro Val Pro Ile Leu Ser Arg Asp Leu Glu Leu Val 260 265 270 Ala Arg Pro Leu Asp Phe Leu Gly Val Asn Tyr Tyr Ala Pro Val Arg 275 280 285 Val Ala Pro Gly Thr Gly Thr Leu Pro Val Arg Tyr Leu Pro Pro Glu 290 295 300 Gly Pro Ala Thr Ala Met Gly Trp Glu Val Tyr Pro Glu Gly Leu His 305 310 315 320 His Leu Leu Lys Arg Leu Gly Arg Glu Val Pro Trp Pro Leu Tyr Val 325 330 335 Thr Glu Asn Gly Ala Ala Tyr Pro Asp Leu Trp Thr Gly Glu Ala Val 340 345 350 Val Glu Asp Pro Glu Arg Val Ala Tyr Leu Glu Ala His Val Glu Ala 355 360 365 Ala Leu Arg Ala Arg Glu Glu Gly Val Asp Leu Arg Gly Tyr Phe Val 370 375 380 Trp Ser Leu Met Asp Asn Phe Glu Trp Ala Phe Gly Tyr Thr Arg Arg 385 390 395 400 Phe Gly Leu Tyr Tyr Val Asp Phe Pro Ser Gln Arg Arg Ile Pro Lys 405 410 415 Arg Ser Ala Leu Trp Tyr Arg Glu Arg Ile Ala Arg Ala Gln Thr 420 425 430 <210> 4 <211> 1296 <212> DNA <213> Thermus spp. <400> 4 atggatgatc atgctgaaaa atttttatgg ggtgtggcta cttccgcata ccagattgaa 60 ggtgctactc aggaggatgg tagaggtccg tctatctggg acgcattcgc tagaagacct 120 ggggctatta gagatggttc tacaggtgaa ccagcttgcg atcattatag aagatatgaa 180 gaagatattg ctttaatgca atcgcttggt gttagagctt acagattctc cgttgcttgg 240 ccaagaatat tgccagaagg tagaggtaga atcaacccta aaggtttagc tttttacgat 300 cgtttggttg acagattgtt ggctagtggt attacaccct ttttaaccct ataccactgg 360 gatcttcctt tggctttgga agagagaggt ggttggcgtt ctcgggaaac tgcttttgca 420 tttgctgagt acgccgaagc tgtagctaga gcattggctg atagagttcc tttctttgct 480 actttaaatg aaccatggtg tagcgctttt cttggtcatt ggacgggtga acacgctcca 540 ggattgagaa acctagaggc tgctctaaga gcagctcatc atttgttgtt gggacacgga 600 ttggcagtcg aggctttgag agctgcaggt gccagaagag ttggtattgt tttaaacttt 660 gctccagctt atggggaaga tccagaagct gtggatgttg ctgatcgtta ccacaataga 720 tattttcttg atccaatcct aggaaagggt tacccagaat caccatttag agaccctcca 780 cctgttccta ttttatcaag agatcttgaa ctagttgcta gacctttgga ctttttggga 840 gttaactact acgctccagt aagagttgct ccaggtactg gaacattgcc agtgagatat 900 ttgccccccg aaggaccagc aactgccatg ggttgggagg tttacccgga aggcttgcac 960 catttgttaa agagattggg tagagaagtt ccatggccat tgtatgttac tgaaaatggc 1020 gctgcttatc ctgatttgtg gactggtgag gcggtagttg aagatccaga aagagttgct 1080 tacttggaag cacatgtaga agctgcattg agagctagag aagaaggtgt tgacttgaga 1140 ggttatttcg tttggagttt gatggataat tttgaatggg catttggtta tactagaagg 1200 tttggattgt attacgttga ttttccttct caaagaagaa taccaaagag atctgcttta 1260 tggtatagag aaagaatcgc tcgtgctcaa acttaa 1296 <210> 5 <211> 1296 <212> DNA <213> Thermus spp. <400> 5 atgaccgaga acgccgaaaa attcctttgg ggagtggcca ccagcgccta ccagattgag 60 ggggccaccc aggaggacgg ccgggggcct tccatctggg acgccttcgc ccagcgcccc 120 ggggccatcc gggacgggag cacaggggag cccgcctgcg accactaccg ccgctacgag 180 gaggacatcg ccctgatgca atccctcggg gtgcgggcct accgcttctc cgtggcctgg 240 ccccggatcc tccccgaggg ccgggggcgg atcaacccca agggcctcgc cttctacgac 300 cgcctggtgg accggcttct cgcttccggg atcacgccct ttctcaccct ctaccactgg 360 gacctgcctt tggccctgga ggagcgggga ggctggcgga gccgggaaac cgccttcgcc 420 ttcgccgagt acgccgaggc ggtggcccgg gccctcgccg accgggtgcc cttcttcgcc 480 accctgaacg agccctggtg ctcggccttc ctcgggcact ggacggggga acacgccccc 540 ggcctcagga acctggaagc ggccctccgc gccgcccacc acctcctcct gggccacggc 600 ctcgccgtgg aggccttgag ggccgcgggg gcgaggcggg tggggatcgt cctcaacttc 660 gccccggcct acggcgagga ccccgaggcg gtggacgtgg ccgaccgcta ccacaaccgc 720 ttcttcctgg accccatcct gggcaagggg tatcccgaaa gccccttccg 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atcaacccca agggcctcgc cttctacgac 300 cgcctggtgg accggcttct cgcttccggg atcacgccct ttctcaccct ctaccactgg 360 gacctgcctt tggccctgga ggagcgggga ggctggcgga gccgggaaac cgccttcgcc 420 ttcgccgagt acgccgaggc ggtggcccgg gccctcgccg accgggtgcc cttcttcgcc 480 accctgaacg agccctggtg ctcggccttc ctcgggcact ggacggggga acacgccccc 540 ggcctcagga acctggaagc ggccctccgc gccgcccacc acctcctcct gggccacggc 600 ctcgccgtgg aggccttgag ggccgcgggg gcgaggcggg tggggatcgt cctcaacttc 660 gccccggcct acggcgagga ccccgaggcg gtggacgtgg ccgaccgcta ccacaaccgc 720 ttcttcctgg accccatcct gggcaagggg tatcccgaaa gccccttccg agaccccccg 780 cccgtcccca tcctctcccg cgacctggag ctcgtggcaa ggcccctgga cttcctgggg 840 gtgaactact acgcccccgt ccgcgtggcc ccggggacgg ggaccttgcc cgtgcgctac 900 cttcccccgg aagggccggc cacggccatg gggtgggagg tctaccccga ggggcttcac 960 cacctcttga agcgcctcgg ccgggaggtg ccctggcccc tttacgtcac ggaaaacggg 1020 gccgcctacc ccgacctctg gacgggagag gccgtggtgg aggaccccga gcgggtggcc 1080 tacctcgagg cccacgtgga ggccgccctc cgggcccggg aagaaggggt ggacctccgg 1140 ggctacttcg tctggagcct catggacaac tttgagtggg ccttcggcta cacccggcgc 1200 ttcggcctct actacgtgga cttccccagc cagaggcgca tccccaaaag gagcgccctc 1260 tggtaccggg agcggatcgc gcgggcccag acctaa 1296

Claims

락테아제(Lactase) 및 나린지나제(naringinase)로부터 선택되는 1종 이상인 제 1효소; 또는 상기 제 1효소에 α-갈락토시다제(α-galactosidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase) 및 펙티나제(pectinase)로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 포함하는 제 2효소; 또는 상기 제 1 또는 2 효소를 생산하는 미생물;
을 포함하되, 상기 제 1 또는 2 효소를 생산하는 미생물은
아스퍼질러스 니가(Aspergillus niger), 페니실리움 속(Penicillium spp.), 및 써머스 속(Thermus spp.)으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는
하기 화학식 2의 루부소사이드(Rubusoside) 생산용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 제 1 또는 2 효소는 스테비오사이드(Stevioside)의 13C에 결합된 소포로오스(2-O-β-D-Glucopyranosyl-a-D-glucose)의 말단 글루코오스를 제거함으로써 루부소사이드를 합성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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제 1항에 있어서,
상기 락테아제는 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 락테아제는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3의 아미노산인 것을 특징으로 하는 조성물.
스테비오사이드(Stevioside)로부터 루부소사이드(Rubusoside)의 생산방법에 있어서,
락테아제(Lactase) 및 나린지나제(naringinase)로부터 선택되는 1종 이상인 제 1 효소; 또는 상기 제 1 효소에 α-갈락토시다제(α-galactosidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase) 및 펙티나제(pectinase)로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 더 포함하는 제 2 효소; 를 스테비오사이드와 반응시켜 루부소사이드를 생산하며, 상기 제 1 또는 2 효소를 생산하는 미생물은
아스퍼질러스 니가(Aspergillus niger), 페니실리움 속(Penicillium spp.), 및 써머스 속(Thermus spp.)으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 루부소사이드의 생산방법.
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제 6항에 있어서,
상기 락테아제는 써머스 속(Thermus spp.) 유래의 락테아제인 것을 특징으로 하는 생산방법.
제 8항에 있어서,
상기 락테아제는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산인 것을 특징으로 하는 생산방법.
제 6항에 있어서,
상기 제 1 또는 2 효소는 고정화 비드에 고정화된 것을 이용하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
제 10항에 있어서,
상기 고정화 비드는 나트륨 알지네이트, 트리에타놀아민 알지네이트, 또는 칼슘 알지네이트인 것을 특징으로 생산방법.
제 6항 및 제 8항 내지 제 11항 중 선택되는 어느 한 항에 있어서,
상기 생산방법은 스테비오사이드와 제 1 또는 2 효소를 50 내지 80℃의 온도에서, 5일 내지 15일 동안 반응시켜 스테비오사이드의 13C에 결합된 소포로오스(2-O-β-D-Glucopyranosyl-a-D-glucose)의 말단 글루코오스를 제거함으로써 루부소사이드를 합성하는 것을 특징으로 하는 생산방법.