CN114107244A - 一种环糊精糖基转移酶突变体、编码基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种环糊精糖基转移酶突变体、编码基因及其应用。所述新型环糊精糖基转移酶突变体由来源于嗜碱芽孢杆菌（Bacillus sp.）的野生型环糊精糖基转移酶突变得到，野生型环糊精糖基转移酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变体为野生型环糊精糖基转移酶的第217位和第283位经单点或二点突变得到，突变体的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.4所示。本发明通过定点突变技术获得新型环糊精糖基转移酶突变体，其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的突变体酶活最高，对底物的最高转化率可达到94.8%，对于提升α‑葡萄糖基橙皮苷的生物催化合成技术，实现高产量高纯度的α‑葡萄糖基橙皮苷具有重要意义。

Description

一种环糊精糖基转移酶突变体、编码基因及其应用
技术领域
本发明涉及一种环糊精糖基转移酶突变体及其编码基因，以及其在生物催化制备α-葡萄糖基橙皮苷中的应用。
背景技术
在柑橘皮的主要功能性成分中，橙皮苷是附加值相对较高的功能性成分之一，是一种二氢黄酮，化学结构式如式（I）所示，又称为维生素P，属双氢黄酮类化合物，是柑橘 60种黄酮类化合物中重要的一种。橙皮苷主要存在于芸香科柑橘类植物的果皮、果汁和种子中，特别在果皮中含量最多，含量约为 3 %。橙皮苷呈弱酸性，难溶于水，天然无毒，在医药上具有维持血管正常渗透压、增强毛细血管韧性、缩短出血时间、降低血管脆性等作用，近段时间还发现它具有降低血压、抗过敏、降低低密度胆固醇从而起到改善血中的胆固醇效果等生理功能。尤其值得一提的是，橙皮苷具有增加外周循环和皮肤表面温度的作用。此外，还确认橙皮苷具有一定的抗癌效果。因此，橙皮苷可广泛应用于化妆品、医药、食品、保健等行业。然而，橙皮苷几乎不溶于水（水中溶解度约为0.02 g/L），导致橙皮苷的应用范围和应用方式受限。
Figure 66174DEST_PATH_IMAGE001
（I）
α-葡萄糖基橙皮苷是橙皮苷经过糖基化修饰后的化合物，α-葡萄糖基橙皮苷的水溶性是橙皮苷的10万倍，解决了橙皮苷溶解度缺陷导致的在制剂和用量上的困难。α-葡萄葡萄糖基橙皮苷（4G-α-D-吡喃α-葡萄葡萄糖基橙皮苷），其比橙皮苷更具生物可吸收性。在医疗健康领域α-葡萄糖橙皮苷可抗炎、降血压，口服能改善由亚硝酸盐引起的白内障，对肝脏、肺、骨骼和胆固醇水平有益，可减少脱发，加强血液回流，为头皮补充营养，加速毛发生长；在化妆品领域α-葡萄糖橙皮苷可强效促进毛细血管的血液循环，两周内淡化黑眼圈（0.5-1.0%），改善眼袋，可作为酪氨酸酶抑制剂，抑制黑色素生成，可改善皮肤营养，减少炎症；可重现红润的健康肤色；在食品添加剂领域α-葡萄糖橙皮苷可改善甜味剂的甜味，防止橘子罐头中水果表面橙皮苷析出，防止色素褪色（如辣椒红色素、β-胡萝卜素等）。可见，α-葡萄糖橙皮苷具有与橙皮苷相同甚至更优的生物活性，水溶性及生物利用率显著优于橙皮苷，具有更好的应用价值。
Kometani等日本科学家在1994年提出了采用环糊精糖基转移酶催化合成α-葡萄糖基橙皮苷，环糊精糖基转移酶是一种典型的非Leloir糖基转移酶，能够催化长链α-葡聚糖（淀粉或糊精）发生环化、偶联、歧化和水解共4种反应。其中，偶联和歧化反应能够将α-葡聚糖中的全部或部分糖基连接到橙皮苷结构上，实现α-葡萄糖基橙皮苷的合成，且该催化过程原料成本低、催化条件温和，以被应用于α-葡萄糖基橙皮苷的工业生产过程中。然而环糊精糖基转移酶无法实现橙皮苷的高效转化，发明人所在课题组在前期提交了申请号为201911420161 .5、名称为“一种碱性环糊精葡萄糖基转移酶在生产α葡萄糖基橙皮苷中的应用”的发明专利申请，该申请提供了一种嗜碱芽孢杆菌来源的环糊精糖基转移酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该酶在5%橙皮苷投料量时能够实现88%的底物转化率，而在15%橙皮苷投料量时转化率降低至58%，剩余的橙皮苷难以分离，严重影响最终产物的水溶性，这导致了产物产量与纯度难以两全。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明经过野生型环糊精糖基转移酶突变筛选，提供了一种新型环糊精糖基转移酶突变体，能够高效催化合成α-葡萄糖基橙皮苷，最高转化率可达94.8%。
本发明采用的技术方案是：
一种环糊精糖基转移酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的环糊精糖基转移酶经下列之一的突变所得：（1）第217位的酪氨酸突变为苯丙氨酸（得到突变体CGTase-Y217F）；（2）第283位的甘氨酸突变为缬氨酸、苏氨酸或亮氨酸（得到突变体CGTase-G283V、CGTase-G283T或CGTase-G283L）；（3）第217位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，且第283位的甘氨酸突变为缬氨酸、苏氨酸或亮氨酸（得到突变体CGTase-Y217F/G283V、CGTase-Y217F/G283T或CGTase-Y217F/G283L）。
本发明在来源于嗜碱芽孢杆菌（Bacillus sp.）的野生型环糊精糖基转移酶的基础上进行了单点和二点突变，获得了以上具有较高酶活的新型环糊精糖基转移酶突变体。优选的，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还涉及所述环糊精糖基转移酶突变体的编码基因。优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示（编码SEQ ID NO.4所示突变体）。
本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体以及含有所述编码基因的基因工程菌。
本发明还涉及所述环糊精糖基转移酶突变体在生物催化制备α-葡萄糖基橙皮苷中的应用。
具体的，所述应用为：以糊精和橙皮苷为底物，以所述环糊精糖基转移酶突变体或所述的基因工程菌为生物催化剂，进行生物催化合成反应，制得α-葡萄糖基橙皮苷。
优选的，催化液中橙皮苷初始质量浓度为5%~15%，糊精初始质量浓度为10%~30%，生物催化温度为35~45℃，pH为9.0~10.0。
本发明的有益效果主要体现在：本发明通过定点突变技术获得新型环糊精糖基转移酶突变体，其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的突变体酶活最高（为野生型酶的2.37倍），对底物的最高转化率可达到94.8%，对于提升α-葡萄糖基橙皮苷的生物催化合成技术，实现高产量高纯度的α-葡萄糖基橙皮苷具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：构建表达新型环糊精糖基转移酶突变体的重组工程菌
参考NCBI数据库报道的嗜碱芽孢杆菌（Bacillus sp .）来源的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列（NCBI登录号NO.AAV38118），加入His-tag纯化标签，交由基因合成公司（华大基因青兰生物科技有限公司），经过密码子优化，人工合成环糊精葡萄糖基转移酶编码基因 （核苷酸序列为SEQ ID NO .1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示），并克隆到表达载体pET22b的NcoI/BamHI之间，获得重组质粒pET22b-CGTase-WT。采用表1所示引物对重组质粒pET22b-CGTase-WT进行PCR扩增，获得重组质粒pET22b-CGTase-Y217F、pET22b-CGTase-G283V、pET22b-CGTase-G283T和pET22b-CGTase-G283L。PCR反应体系为：20 μLddH2O，25 μL 2 × Phanta Flash Master Mix，2 μL 上游引物，2 μL 下游引物，1 μL 模板。
表1：用于构建环糊精糖基转移酶单点突变体的PCR引物
Figure 406150DEST_PATH_IMAGE002
进一步的，采用表2所示引物对重组质粒pET22b-CGTase-Y217F进行PCR扩增，获得重组质粒pET22b-CGTase-Y217F/G283V、pET22b-CGTase-Y217F/G283T、pET22b-CGTase-Y217F/ G283L。PCR反应体系为: 20 μL ddH2O, 25 μL 2 × Phanta Flash Master Mix,2 μL 上游引物, 2 μL 下游引物，1 μL 模板。
表2：用于构建环糊精糖基转移酶二点突变体的PCR引物
Figure DEST_PATH_IMAGE003
将重组质粒转化到表达宿主E .coli RosettaTM（DE3）中，具体操作如下：取2μL重组质粒，加入到100μL的E .coli RosettaTM（DE3）感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰水浴中放置30min。42℃热激45s，冰水孵育3min。加入900μL不含抗生素的LB培养基，37℃孵育60min使其抗性复苏。5000rpm离心2min，将菌体浓缩至100μL，均匀涂布在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
阳性克隆转化子的鉴定。在长有重组子的平板上，直接挑取6个单菌落至含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基里，在37℃培养过夜。利用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式质粒提取试剂盒，提取质粒，并酶切验证和测序验证，最终得到含有的重组质粒的阳性克隆子。
实施例2：制备新型环糊精糖基转移酶突变体
将实施例1中所述的阳性克隆子接种在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上进行复苏，37℃，200rpm的摇床中过夜培养10h后，以体积浓度5％的接种量转接至新鲜的含有50μg/mL氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm的摇床中培养3h；以体积浓度5％的接种量接种到含50mg/L氨苄青霉素的发酵培养基中，35℃培养5h，然后降低发酵温度至22℃，以3g/h/L起始发酵培养基的速率补加甘油，再以5 .4g/h/L起始发酵培养基的速率补加乳糖，其中甘油共补加15小时，乳糖共补加5h，22℃继续发酵16h，得到含环糊精糖基转移酶的发酵液，其湿菌体含量为40g/L。
进一步的，将发酵液中的菌体通过高压匀浆破碎，将破碎液离心后取上清，采用镍柱对上清中的环糊精糖基转移酶进行分离纯化。纯化步骤为：将镍柱充分悬浮后，置于室温放置，用10倍柱体积的平衡缓冲液洗涤备用；将破碎液上清按5倍柱体积上样，上样后，将柱子置于4℃环境中缓慢翻转，吸附1 h；结束后将柱子竖直放置至凝胶完全沉降，之后排除上样废液至干净的收集管中。先用10倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤柱子，再用10倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集其中的一部分，并在280 nm下监测蛋白浓度，用SDS-PAGE检测目标蛋白；将洗脱的蛋白用磷酸盐缓冲溶液透析除盐；对上述洗脱结束的镍柱用10倍柱体积的再生缓冲液进行再生。
采用牛血清蛋白（BSA）标准溶液对纯化后的环糊精糖基转移酶进行定量分析，将纯化后的环糊精糖基转移酶稀释至0.1 g/L测试环糊精糖基转移酶野生型和突变体的酶活，测试方法为：反应总体积为1 ml，纯酶与底物混合液按1：20的比例混合；上述底物混合液为溶解在0.8 M NaOH溶液的1%橙皮苷与10%麦芽糊精，调节pH至10后与纯酶混合，在40℃下反应2 h；上述催化液用HPLC法检测，检测前用0.1％NaOH溶液稀释10倍。测试结果如表3所示。
表3：环糊精糖基转移酶野生型和突变体的酶活对比
Figure 451467DEST_PATH_IMAGE004
实施例3：含新型环糊精糖基转移酶突变体的发酵液在α-葡萄糖基橙皮苷合成中的应用
（1）糊精投料量10%，不同橙皮苷投料量下的催化转化
按实施例2所述方法含CGTase-Y217F/G283T环糊精糖基转移酶突变体的发酵液，催化过程如下：取50mL 水中分别加入10%、20%、30%的橙皮苷，之后加入20%的糊精得到底物溶液，滴加2 mol/L的NaOH溶液将pH调至10.0。将发酵液稀释至2%湿菌体浓度后中滴加2mol/L的NaOH溶液将pH调至10.0。将底物溶液和发酵液按1:1体积比混合，在40 ℃的恒温水浴磁力搅拌器中催化16 h，催化过程以2mol/L的NaOH水溶液滴定调节pH使之维持在10.0，最终底物转化率如表4所示。
表4：不同橙皮苷投料下，含CGTase-Y217F/G283T的发酵液催化底物的转化率
Figure DEST_PATH_IMAGE005
（2）橙皮苷投料量5%，不同糊精投料量下的催化转化
按实施例2所述方法含CGTase-Y217F/G283T环糊精糖基转移酶突变体的发酵液，催化过程如下：取50mL 水中加入10%的橙皮苷，之后加入20%-60%的糊精得到底物溶液，滴加2 mol/L的NaOH溶液将pH调至10.0。将发酵液稀释至2%湿菌体浓度后中滴加2 mol/L的NaOH溶液将pH调至10.0。将底物溶液和发酵液按1:1体积比混合，在40 ℃的恒温水浴磁力搅拌器中催化16 h，催化过程以2mol/L的NaOH水溶液滴定调节pH使之维持在10.0，最终底物转化率如表5所示。
表5：不同糊精投料下，含CGTase-Y217F/G283T的发酵液催化底物的转化率
Figure 49938DEST_PATH_IMAGE006
（3）橙皮苷投料量10%，不同糊精投料量下的催化转化
按实施例2所述方法含CGTase-Y217F/G283T环糊精糖基转移酶突变体的发酵液，催化过程如下：取50mL 水中加入20%的橙皮苷，之后加入20%-60%的糊精得到底物溶液，滴加2 mol/L的NaOH溶液将pH调至10.0。将发酵液稀释至2%湿菌体浓度后中滴加2 mol/L的NaOH溶液将pH调至10.0。将底物溶液和发酵液按1:1体积比混合，在40 ℃的恒温水浴磁力搅拌器中催化16 h，催化过程以2mol/L的NaOH水溶液滴定调节pH使之维持在10.0，最终底物转化率如表6所示。
表6：不同糊精投料下，含CGTase-Y217F/G283T的发酵液催化底物的转化率
Figure DEST_PATH_IMAGE007
（4）橙皮苷投料量15%，不同糊精投料量下的催化转化
按实施例2所述方法含CGTase-Y217F/G283T环糊精糖基转移酶突变体的发酵液，催化过程如下：取50mL 水中加入30%的橙皮苷，之后加入20%-60%的糊精得到底物溶液，滴加2 mol/L的NaOH溶液将pH调至10.0。将发酵液稀释至2%湿菌体浓度后中滴加2 mol/L的NaOH溶液将pH调至10.0。将底物溶液和发酵液按1:1体积比混合，在40 ℃的恒温水浴磁力搅拌器中催化16 h，催化过程以2mol/L的NaOH水溶液滴定调节pH使之维持在10.0，最终底物转化率如表7所示。
表7：不同糊精投料下，含CGTase-Y217F/G283T的发酵液催化底物的转化率
Figure 254524DEST_PATH_IMAGE008
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江渚隆生物科技有限公司
<120> 一种环糊精糖基转移酶突变体、编码基因及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 2109
<212> DNA
<213> Bacillus sp.
<400> 2
ttagtggtgg tggtggtggt gttgccaatc caccagaacg gtatccgtac cggtcgcagg 60
ggtggtatac gtatggttgt tgccgctttc ccacacaaca ttgccgctgc tgtctttctt 120
gatgaacttg tattccaggt tttcttccgc cggcacgcta atatcatagt accaggtcgg 180
atattgatac atcacctggt taaacatcgg gccaatcgcc tgatccgggt cccaattgcc 240
cagttcattc acgttgccaa caatatacag gttggtgccc aggctggtag tcgcgttatt 300
caccgcaaag cgaatgctca cttgatcgcc ggtcagcact tcaaatttat cataggtcgg 360
gctctgtgaa tcacccgcat tcaccacgct aatgttataa tggcccgccg taacatccgg 420
aacgctaact tcaattttgg tgttgctcca gctcagcaca tcgctgctat cgctatcaaa 480
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tttgcccatc atcgggccaa catgaccaat cagcgggctc gcatgttctt cggtaacctg 600
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gctggtgttc aggttgttaa tggtatagct cgtatcgccg ctgttcacag ccgttaacac 780
cacgctatcg ccaaacgcgc gttcataaat gtacacatcg ctgttaatcc agcgttcgct 840
ggtattgcca tagcccagtg caggattgct ctggcgtaag ctcgccagcg tgctaataat 900
ctgatagctg ttggtcgtgc gatcaaaatc gctcatcggt ttgcggtttt ccggatcatt 960
gccgcccgtc agatactgtt cggtgccata ataaatggtc ggcacgccac ggctggttaa 1020
taaaaccgcc agcgcaatat ccgtatggcg gttgctgctc tgttcaaagc taaagcggct 1080
catgtcatgg ttatcaatga acgtcacttg gtcaatcacc tcatcataat cctcttccgt 1140
gctgacaatc atctcgttga aatcatacca gttgctgctg ccatccatca gaacatcgcg 1200
aatggtctgg ccaaactgaa aatccagcag gctcatgccg ctttcgttcg caaaatgatg 1260
gttctgcgga tcaacttcgc cgctgcccag aaaccattcg ccaaaggtaa acaccggttc 1320
atgcgcataa atatcgctca tcaggctagt ctgccagcct tcgctcatgt gtttaaccgc 1380
atccacgcga atgccatcaa tgcctttgtc cagccacagt ttaatgctct ccttcagata 1440
ctggtccatc acggtgttat tcagatcgta atccgccaga tcatacagat tgcggtaaat 1500
gctatcctca tagctgctaa aatccgtgcc gccattatga tggaacagat tgttcggatc 1560
gttgctatag ttgccaatca gcacgccatc gttatacacc gcgccatttt ccgcatagct 1620
cggatcggtt tctaacgcag ggctgctatg gttcggggta aaatccatga tcaccttaat 1680
gccgttgcta tgtgcggtat ccatcaggcg atcaaaatcg ctaaagtcgc cataaaacgg 1740
gttcgtgcgt ttataatcgc gcgcccaata gccatgatag ctggtatagc cgctcggatg 1800
cagcgcatac acattttcca ccggctggct aatccaaatc gcggtaatgc ccagatcggt 1860
cagatagcca tcgttgattt tgtcaataat gccttgccaa tcgccgccgc aatatttatg 1920
cagatcgctg caatcctggc tataaatcgc gccggtagga ttgttgctcg gatcgccatc 1980
gctaaagcga tcggtgacaa tctgataaat gacatcgcgg gtataattca ctttgttggt 2040
cacatccgct tgcgcaacag tcgcaaagcc cgctaacgca accgcaatcg caatcgccgt 2100
tttcttcat 2109
<210> 1
<211> 702
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 1
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Asp Val Thr Asn Lys Val Asn Tyr Thr Arg Asp
20 25 30
Val Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asp Pro Ser
35 40 45
Asn Asn Pro Thr Gly Ala Ile Tyr Ser Gln Asp Cys Ser Asp Leu His
50 55 60
Lys Tyr Cys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp
65 70 75 80
Gly Tyr Leu Thr Asp Leu Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro
85 90 95
Val Glu Asn Val Tyr Ala Leu His Pro Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr His
100 105 110
Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Tyr Lys Arg Thr Asn Pro Phe Tyr Gly Asp
115 120 125
Phe Ser Asp Phe Asp Arg Leu Met Asp Thr Ala His Ser Asn Gly Ile
130 135 140
Lys Val Ile Met Asp Phe Thr Pro Asn His Ser Ser Pro Ala Leu Glu
145 150 155 160
Thr Asp Pro Ser Tyr Ala Glu Asn Gly Ala Val Tyr Asn Asp Gly Val
165 170 175
Leu Ile Gly Asn Tyr Ser Asn Asp Pro Asn Asn Leu Phe His His Asn
180 185 190
Gly Gly Thr Asp Phe Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Ile Tyr Arg Asn Leu
195 200 205
Tyr Asp Leu Ala Asp Tyr Asp Leu Asn Asn Thr Val Met Asp Gln Tyr
210 215 220
Leu Lys Glu Ser Ile Lys Leu Trp Leu Asp Lys Gly Ile Asp Gly Ile
225 230 235 240
Arg Val Asp Ala Val Lys His Met Ser Glu Gly Trp Gln Thr Ser Leu
245 250 255
Met Ser Asp Ile Tyr Ala His Glu Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp
260 265 270
Phe Leu Gly Ser Gly Glu Val Asp Pro Gln Asn His His Phe Ala Asn
275 280 285
Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Gln Phe Gly Gln Thr Ile Arg
290 295 300
Asp Val Leu Met Asp Gly Ser Ser Asn Trp Tyr Asp Phe Asn Glu Met
305 310 315 320
Ile Val Ser Thr Glu Glu Asp Tyr Asp Glu Val Ile Asp Gln Val Thr
325 330 335
Phe Ile Asp Asn His Asp Met Ser Arg Phe Ser Phe Glu Gln Ser Ser
340 345 350
Asn Arg His Thr Asp Ile Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly
355 360 365
Val Pro Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Gly Gly Asn
370 375 380
Asp Pro Glu Asn Arg Lys Pro Met Ser Asp Phe Asp Arg Thr Thr Asn
385 390 395 400
Ser Tyr Gln Ile Ile Ser Thr Leu Ala Ser Leu Arg Gln Ser Asn Pro
405 410 415
Ala Leu Gly Tyr Gly Asn Thr Ser Glu Arg Trp Ile Asn Ser Asp Val
420 425 430
Tyr Ile Tyr Glu Arg Ala Phe Gly Asp Ser Val Val Leu Thr Ala Val
435 440 445
Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Thr Ile Asn Asn Leu Asn Thr Ser Leu
450 455 460
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465 470 475 480
Glu Ile Thr Val Asn Ser Asn Gly Ser Val Asp Ser Phe Gln Leu Ser
485 490 495
Ala Asn Gly Val Ser Val Trp Gln Val Thr Glu Glu His Ala Ser Pro
500 505 510
Leu Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Lys His Gly Asn Thr Val
515 520 525
Thr Ile Thr Gly Glu Gly Phe Gly Asp Asn Glu Gly Ser Val Leu Phe
530 535 540
Asp Ser Asp Ser Ser Asp Val Leu Ser Trp Ser Asn Thr Lys Ile Glu
545 550 555 560
Val Ser Val Pro Asp Val Thr Ala Gly His Tyr Asn Ile Ser Val Val
565 570 575
Asn Ala Gly Asp Ser Gln Ser Pro Thr Tyr Asp Lys Phe Glu Val Leu
580 585 590
Thr Gly Asp Gln Val Ser Ile Arg Phe Ala Val Asn Asn Ala Thr Thr
595 600 605
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610 615 620
Asn Trp Asp Pro Asp Gln Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Met
625 630 635 640
Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Ile Ser Val Pro Ala Glu Glu
645 650 655
Asn Leu Glu Tyr Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Ser Gly Asn Val Val
660 665 670
Trp Glu Ser Gly Asn Asn His Thr Tyr Thr Thr Pro Ala Thr Gly Thr
675 680 685
Asp Thr Val Leu Val Asp Trp Gln His His His His His His
690 695 700
<210> 3
<211> 2109
<212> DNA
<213> Bacillus sp.
<400> 3
ttagtggtgg tggtggtggt gttgccaatc caccagaacg gtatccgtac cggtcgcagg 60
ggtggtatac gtatggttgt tgccgctttc ccacacaaca ttgccgctgc tgtctttctt 120
gatgaacttg tattccaggt tttcttccgc cggcacgcta atatcatagt accaggtcgg 180
atattgatac atcacctggt taaacatcgg gccaatcgcc tgatccgggt cccaattgcc 240
cagttcattc acgttgccaa caatatacag gttggtgccc aggctggtag tcgcgttatt 300
caccgcaaag cgaatgctca cttgatcgcc ggtcagcact tcaaatttat cataggtcgg 360
gctctgtgaa tcacccgcat tcaccacgct aatgttataa tggcccgccg taacatccgg 420
aacgctaact tcaattttgg tgttgctcca gctcagcaca tcgctgctat cgctatcaaa 480
cagcacgctg ccttcgttat cgccaaagcc ttcgccggta atggtcaccg tattgccatg 540
tttgcccatc atcgggccaa catgaccaat cagcgggctc gcatgttctt cggtaacctg 600
ccaaacgcta acaccgttcg cgctcagctg aaagctatcc acgctgccgt tgctgttaac 660
ggtaatttcg ttgccatcca gcagttgttg cagttcatcg gtatattggc cctgcggtaa 720
gctggtgttc aggttgttaa tggtatagct cgtatcgccg ctgttcacag ccgttaacac 780
cacgctatcg ccaaacgcgc gttcataaat gtacacatcg ctgttaatcc agcgttcgct 840
ggtattgcca tagcccagtg caggattgct ctggcgtaag ctcgccagcg tgctaataat 900
ctgatagctg ttggtcgtgc gatcaaaatc gctcatcggt ttgcggtttt ccggatcatt 960
gccgcccgtc agatactgtt cggtgccata ataaatggtc ggcacgccac ggctggttaa 1020
taaaaccgcc agcgcaatat ccgtatggcg gttgctgctc tgttcaaagc taaagcggct 1080
catgtcatgg ttatcaatga acgtcacttg gtcaatcacc tcatcataat cctcttccgt 1140
gctgacaatc atctcgttga aatcatacca gttgctgctg ccatccatca gaacatcgcg 1200
aatggtctgg ccaaactgaa aatccagcag gctcatgccg ctttcgttcg caaaatgatg 1260
gttctgcgga tcaacttcgc cgctggtcag aaaccattcg ccaaaggtaa acaccggttc 1320
atgcgcataa atatcgctca tcaggctagt ctgccagcct tcgctcatgt gtttaaccgc 1380
atccacgcga atgccatcaa tgcctttgtc cagccacagt ttaatgctct ccttcagata 1440
ctggtccatc acggtgttat tcagatcgta atccgccaga tcaaacagat tgcggtaaat 1500
gctatcctca tagctgctaa aatccgtgcc gccattatga tggaacagat tgttcggatc 1560
gttgctatag ttgccaatca gcacgccatc gttatacacc gcgccatttt ccgcatagct 1620
cggatcggtt tctaacgcag ggctgctatg gttcggggta aaatccatga tcaccttaat 1680
gccgttgcta tgtgcggtat ccatcaggcg atcaaaatcg ctaaagtcgc cataaaacgg 1740
gttcgtgcgt ttataatcgc gcgcccaata gccatgatag ctggtatagc cgctcggatg 1800
cagcgcatac acattttcca ccggctggct aatccaaatc gcggtaatgc ccagatcggt 1860
cagatagcca tcgttgattt tgtcaataat gccttgccaa tcgccgccgc aatatttatg 1920
cagatcgctg caatcctggc tataaatcgc gccggtagga ttgttgctcg gatcgccatc 1980
gctaaagcga tcggtgacaa tctgataaat gacatcgcgg gtataattca ctttgttggt 2040
cacatccgct tgcgcaacag tcgcaaagcc cgctaacgca accgcaatcg caatcgccgt 2100
tttcttcat 2109
<210> 4
<211> 702
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Asp Val Thr Asn Lys Val Asn Tyr Thr Arg Asp
20 25 30
Val Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asp Pro Ser
35 40 45
Asn Asn Pro Thr Gly Ala Ile Tyr Ser Gln Asp Cys Ser Asp Leu His
50 55 60
Lys Tyr Cys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp
65 70 75 80
Gly Tyr Leu Thr Asp Leu Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro
85 90 95
Val Glu Asn Val Tyr Ala Leu His Pro Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr His
100 105 110
Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Tyr Lys Arg Thr Asn Pro Phe Tyr Gly Asp
115 120 125
Phe Ser Asp Phe Asp Arg Leu Met Asp Thr Ala His Ser Asn Gly Ile
130 135 140
Lys Val Ile Met Asp Phe Thr Pro Asn His Ser Ser Pro Ala Leu Glu
145 150 155 160
Thr Asp Pro Ser Tyr Ala Glu Asn Gly Ala Val Tyr Asn Asp Gly Val
165 170 175
Leu Ile Gly Asn Tyr Ser Asn Asp Pro Asn Asn Leu Phe His His Asn
180 185 190
Gly Gly Thr Asp Phe Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Ile Tyr Arg Asn Leu
195 200 205
Tyr Asp Leu Ala Asp Tyr Asp Leu Asn Asn Thr Val Met Asp Gln Tyr
210 215 220
Leu Lys Glu Ser Ile Lys Leu Trp Leu Asp Lys Gly Ile Asp Gly Ile
225 230 235 240
Arg Val Asp Ala Val Lys His Met Ser Glu Gly Trp Gln Thr Ser Leu
245 250 255
Met Ser Asp Ile Tyr Ala His Glu Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp
260 265 270
Phe Leu Thr Ser Gly Glu Val Asp Pro Gln Asn His His Phe Ala Asn
275 280 285
Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Gln Phe Gly Gln Thr Ile Arg
290 295 300
Asp Val Leu Met Asp Gly Ser Ser Asn Trp Tyr Asp Phe Asn Glu Met
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Asp Pro Glu Asn Arg Lys Pro Met Ser Asp Phe Asp Arg Thr Thr Asn
385 390 395 400
Ser Tyr Gln Ile Ile Ser Thr Leu Ala Ser Leu Arg Gln Ser Asn Pro
405 410 415
Ala Leu Gly Tyr Gly Asn Thr Ser Glu Arg Trp Ile Asn Ser Asp Val
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Glu Ile Thr Val Asn Ser Asn Gly Ser Val Asp Ser Phe Gln Leu Ser
485 490 495
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515 520 525
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Ile Ser Val Pro Ala Glu Glu
645 650 655
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660 665 670
Trp Glu Ser Gly Asn Asn His Thr Tyr Thr Thr Pro Ala Thr Gly Thr
675 680 685
Asp Thr Val Leu Val Asp Trp Gln His His His His His His
690 695 700

Claims (9)

1.一种环糊精糖基转移酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的环糊精糖基转移酶经下列之一的突变所得：（1）第217位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；（2）第283位的甘氨酸突变为缬氨酸、苏氨酸或亮氨酸；（3）第217位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，且第283位的甘氨酸突变为缬氨酸、苏氨酸或亮氨酸。
2.如权利要求1所述的环糊精糖基转移酶突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1所述环糊精糖基转移酶突变体的编码基因。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.含有权利要求3所述编码基因的重组载体。
6.含有权利要求3所述编码基因的基因工程菌。
7.权利要求1所述环糊精糖基转移酶突变体在生物催化制备α-葡萄糖基橙皮苷中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用为：以糊精和橙皮苷为底物，以权利要求1所述环糊精糖基转移酶突变体或权利要求6所述的基因工程菌为生物催化剂，进行生物催化合成反应，制得α-葡萄糖基橙皮苷。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：催化液中橙皮苷初始质量浓度为5%~15%，糊精初始质量浓度为10%~30%，生物催化温度为35~45℃，pH为9.0~10.0。
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