CN115404226A - 一种蔗糖合成酶及其在催化糖基化反应中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蔗糖合成酶用于酶法制备糖基化天然产物的方法。该方法利用低等真核来源的蔗糖合成酶和UDP‑糖基转移酶，以底物和蔗糖为原料生产糖基化产物。本发明的方法首先利用基因挖掘技术筛选得到具有UDP底物亲和力的蔗糖合成酶，并将其用于与UDP‑葡萄糖基转移酶在同一载体上共表达，然后收集生物酶粗品直接进行底物催化反应，通过新型蔗糖合成酶催化蔗糖实现UDP‑葡萄糖的高效循环，使UDP‑葡萄糖基转移酶具有持续的UDP‑葡萄糖补给催化底物糖基化。该方法与已有的双酶催化反应系统相比，转化速率快，收率高，具有重要且广泛的应用价值。

Description

一种蔗糖合成酶及其在催化糖基化反应中的应用
技术领域
本发明利用微芒藻蔗糖合成酶和UDP-糖基转移酶，实现酶法高效催化糖基化反应，属于生物催化转化技术领域。
背景技术
蔗糖合成酶(Sucrose synthase，EC 2.4.1.13,SuSy)是一种糖基转移酶(GT),在小麦(Triticum aestivum)胚芽中首次被鉴定，最近在细菌中也被发现。近几十年的研究发现,这种酶广泛存在于植物体内，对植物的生长发育极为重要，是叶片光合作用的产物蔗糖进入下游各种代谢途径的必需关键酶之一。该酶催化单糖和二磷酸核苷(NDP)之间的葡糖基部分的可逆转移。
蔗糖合成酶对于不同的核苷二磷酸(NDP)“受体”具有广泛的底物谱。通过将SuSy与UDP-糖基转移酶结合来回收“供体”尿苷5'-二磷酸(UDP)在生物催化糖基化过程中更为重要，因为GT已知大多数缀合物的糖基化都需要UDP-葡萄糖(UDPG)的参与。在GT-SuSy级联反应中，使用蔗糖和糖基转移酶构建UDP循环。实现了从经济廉价的蔗糖和UDP向昂贵的UDP-葡萄糖转化的生产过程。植物蔗糖合成酶主要以UDP作为核苷酸受体，最适温度在40至55℃之间，在高于30℃的温度下酶的稳定性会下降【1/2】。细菌蔗糖合成酶虽然在高温(60-80℃)下能够显示出最大活性在表现出最佳温度，但其主要以ADP作为主要核苷酸受体【3】。
因此，在确定底物选择性和糖基化位置的情况下，UDP-糖基转移酶偶联原位再生UDP-葡萄糖的蔗糖合成酶以生产目标糖苷的方法主要在两种酶的活性和稳定性方面存在缺陷。大多数植物来源的蔗糖合成酶的热稳定性不能支持足够的时间来转化底物；而细菌来源的蔗糖合成酶虽有相对较高的热稳定性，但其天然底物选择性更偏向于其他几种NDP，且多数活性较低。
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发明内容
本发明所要解决的问题是提出一种低等真核来源的蔗糖合成酶及其在催化糖基化反应中的应用，该方法利用UDP-糖基转移酶和微芒藻来源的蔗糖合成酶，实现酶法高效催化糖基化反应。该应用方法转化速率快，收率高，适于多种酶法催化的糖基化产物生产。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种蔗糖合成酶，所述蔗糖合成酶来源于微芒藻(Micractinium Conductrix)，简称为McSuSy，其氨基酸序列如SEQ No.2所示。
编码所述来源于微芒藻的蔗糖合成酶的核苷酸序列如SEQ No.1所示。
一种重组载体，其携带编码所述来源于微芒藻的蔗糖合成酶的核苷酸序列SEQNo.1。
一种重组细胞，含有上述的重组载体或含有上述来源于微芒藻的蔗糖合成酶的核苷酸序列，可表达得到所述的蔗糖合成酶。
一种生产蔗糖合成酶的方法，采用上述重组细胞发酵产酶。
克隆蔗糖合成酶基因，构建表达载体，并转移到宿主菌中，获得蔗糖合成酶的工程菌，将构建好的工程菌发酵产酶，发酵得到的菌体超声破碎或高压破碎，获得蔗糖合成酶的粗酶液。所述宿主菌包括但不限于大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或谷氨酸棒杆菌等。
所述蔗糖合成酶能够广泛应用于催化糖基化反应，例如甜菊糖苷类、槲皮素、姜黄素和人参皂苷等底物的催化糖基化。
所述蔗糖合成酶具有以下酶学性质：
在55℃、pH 5.5的条件下达到最大酶活性；
在底物存在的条件下，42℃以下酶活力在15min内能够保留93％以上的酶活力；
在40和50℃下，半衰期依次为9.24h和3.52h；
酶活力可以被Mg2+和Ca2+激活，但被Ni2+，Cu2+和Zn2+抑制；
酶催化对底物UDP的动力学参数Km为0.7mM，Vmax为6.56U/mg。
来源于微芒藻的蔗糖合成酶(McSuSy)在催化糖基化反应中的应用。
在糖基化反应中，所述来源于微芒藻的蔗糖合成酶催化蔗糖与UDP反应生成UDP-葡萄糖提供糖基供体。
所述蔗糖合成酶能够广泛应用于催化糖基化反应，例如甜菊糖苷类、槲皮素、姜黄素和人参皂苷等底物的催化糖基化。所述甜菊糖苷类包括莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷D、甜菊苷、莱鲍迪苷A等。
来源于微芒藻的蔗糖合成酶在催化糖基化反应中的应用，包括以下步骤：
1)构建工程菌：克隆UDP-糖基转移酶基因与蔗糖合成酶基因，构建双酶共表达或分别表达的载体，并转移到宿主菌中，获得UDP-糖基转移酶和/或蔗糖合成酶的工程菌；
2)制备糖基化产物：将构建好的工程菌发酵产酶，发酵得到的菌体超声破碎或高压破碎，获得UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的粗酶液；由制得的粗酶液中的UDP-糖基转移酶催化底物进行转化反应制备得到糖基化产物；该过程生成的UDP再由蔗糖合成酶催化生成UDP-葡萄糖。
所述宿主菌包括但不限于大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌等。
进一步改进，所述的工程菌是导入UDP-糖基转移酶基因和蔗糖合成酶基因的大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌。
所述糖基化底物的初始反应浓度为1-20g/L，蔗糖与糖基化底物的质量比为1-200，由共表达或分别表达上述两个酶的工程菌制备的粗酶液在反应体系中的总蛋白浓度为2-10mg/mL。蔗糖合酶与糖基转移酶的粗酶活力比为1-20。
另一种改进，所述转化反应采用水相体系或双相体系，粗酶液在pH6-8的缓冲溶液中进行生物转化。
所述水相体系为pH6-8的缓冲溶液中，所述缓冲液包括但不限于磷酸钾、磷酸钠和HEPES缓冲液。
所述双相体系为有机相与缓冲液混合的双相体系，所述有机相例如可以是DMSO，缓冲液为磷酸缓冲液(pH6-8)
另一种改进，所述转化反应的反应温度为20-50℃，反应时间为1-40h。
槲皮素为底物合成槲皮素-3,4’-O-二糖苷：
所述转化反应采用双相(水相和有机相)体系，粗酶液在pH6-8的缓冲溶液中进行生物转化，反应温度为20-50℃，反应时间为1-40h，底物初始反应浓度为1-20g/L，蔗糖与槲皮素的质量比为10-150，粗酶液总蛋白浓度为2-10mg/mL,蔗糖合酶与糖基转移酶的粗酶活力比为1-20。
进一步地，粗酶液在pH 7.2的缓冲溶液中进行生物转化，反应温度为37℃，反应时间为1-40h，底物初始反应浓度为3g/L，蔗糖与槲皮素的质量比为133，粗酶液总蛋白浓度为10mg/mL。在36h时，槲皮素转化率为63.3％。
姜黄素为底物合成姜黄素-4’,4”-O-二糖苷：
所述转化反应采用双相(水相和有机相)体系，粗酶液在pH6-8(pH 7.2)的缓冲溶液中进行生物转化，反应温度为20-50℃，反应时间为1-40h底物初始反应浓度为1-20g/L，蔗糖与姜黄素的质量比为1-50，粗酶液总蛋白浓度为2-10mg/mL。
进一步地，所述转化反应采用双相(水相和有机相)体系，粗酶液在pH 7.2的缓冲溶液中进行生物转化，37℃，36h，底物初始反应浓度为9.21g/L，蔗糖与姜黄素的质量比为10，粗酶液总蛋白浓度为8mg/mL。30h时姜黄素转化率为80.2％。
莱鲍迪苷E为底物合成莱鲍迪苷D：
所述转化反应采用水相体系，粗酶液在pH6-8的缓冲溶液中进行生物转化，反应温度为20-50℃，反应时间为1-40h底物初始反应浓度为1-20g/L，蔗糖与莱鲍迪苷E的质量比为1-10，总蛋白浓度为2-10mg/mL。
进一步地，所述转化反应采用水相体系，粗酶液在pH 7.0的缓冲溶液中进行生物转化，反应温度为37℃，反应时间为30h底物初始反应浓度为10g/L，蔗糖与莱鲍迪苷E的质量比为5，总蛋白浓度为9mg/mL。10h时，莱鲍迪苷D的产率为86.21％。
甜菊苷为底物合成莱鲍迪苷A：
所述转化反应采用水相体系，粗酶液在pH6-8的缓冲溶液中进行生物转化，反应温度为20-50℃，反应时间为1-40h，底物初始反应浓度为1-20g/L，蔗糖与甜菊苷的质量比为1-10，总蛋白浓度为2-10mg/mL。
进一步地，所述转化反应采用水相体系，粗酶液在pH 7.0的缓冲溶液中进行生物转化，反应温度为37℃，反应时间为30h，底物初始反应浓度为20g/L，蔗糖与甜菊苷的质量比为5，总蛋白浓度为4mg/mL。6h时，甜菊苷的转化率为91.53％，莱鲍迪苷A(RebA)的产率为90％.
莱鲍迪苷D为底物合成莱鲍迪苷M：
所述转化反应采用水相体系，粗酶液在pH6-8的缓冲溶液中进行生物转化，反应温度为20-50℃，反应时间为1-40h，底物初始反应浓度为1-20g/L，蔗糖与莱鲍迪苷D的质量比为1-10，总蛋白浓度为2-10mg/mL。
进一步地，所述转化反应采用水相体系，粗酶液在pH7.0的缓冲溶液中进行生物转化，反应温度为37℃，反应时间为30h，底物初始反应浓度为1-20g/L，蔗糖与莱鲍迪苷D的质量比为5，总蛋白浓度为9mg/mL。在6h内1g/L的底物转化率达到了99％，莱鲍迪苷M的产率为95.23％；5g/L的底物在10h内产生了3.65g/L的莱鲍迪苷M，20g/L的底物在24h时，产生了10.89g/L的莱鲍迪苷M。
有益效果：
本发明首次通过基因挖掘技术得到低等真核来源的微芒藻中的蔗糖合成酶，该酶具有天然的高稳定性和UDP底物亲和力，能够快速转化生成UDP-葡萄糖。
本发明将来源于微芒藻的蔗糖合成酶利用基因工程技术与UDP-葡萄糖基转移酶构建得到共表达高产重组菌株，得到适合产业化的廉价易得的高活性生物酶，已酶法合成获得大量糖基化产物。
与其他UDP-葡萄糖再生系统催化合成糖基化产物的合成方法相比，本项目涉及蔗糖合成酶具有天然的高稳定性和UDP底物亲和力，能够快速转化生成UDP-葡萄糖，间接提高了糖基化反应的转化速率，进一步节约了生产成本。
附图说明
图1三种蔗糖合酶粗提取物的SDS-PAGE分析。(M：蛋白质分子量标准；1：McSuSy可溶性蛋白；2：McSuSy包涵体；3：CbSuSy1可溶性蛋白；4：CbSuSy1包涵体；5：CbSuSy2可溶性蛋白；6：CbSuSy2包涵体。箭头指示为目的蛋白)。
图2McSuSy的SDS-PAGE分析。(M：蛋白质分子量标准；1：McSuSy可溶性蛋白；2：McSuSy包涵体；3：纯化的McSuSy。箭头指示为目的蛋白)。
图3McSuSy的最适温度曲线。
图4McSuSy的最适pH曲线。
图5McSuSy在不同温度时热稳定性曲线。
图6不同二价金属离子对McSuSy催化活性的影响。
图7不同底物浓度下不同来源蔗糖合酶参与催化糖基化反应的产物生成曲线。
图8不同来源蔗糖合酶参与催化糖基化反应的反应曲线。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例中所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：表达不同来源的蔗糖合成酶基因的大肠杆菌工程菌的构建及酶活测定
本实施例考察了不同藻类来源的蔗糖合成酶的性质，使用基因挖掘技术获得三株不同来源的藻类蔗糖合成酶，一株为来源于微芒藻的蔗糖合成酶(简称为McSuSy)，其余两株(序列4，6)均来自Chara braunii(布氏轮藻)，简称为(CbSuSy1，CbSuSy2)。
将三条来源于不同藻类的蔗糖合成酶基因(序列1,3和5)两端加上NcoI和EcoRI酶切位点，通过双酶切、连接，基因片段插入表达载体pRSFDue-1相应的酶切位点中，置于T7启动子的控制下，分别构建表达蔗糖合成酶基因的重组质粒pRSF-McSuSy、pRSF-CbSuSy1和pRSF-CbSuSy2。
将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，构建工程菌E.coli BL21(pRSF-McSuSy)、E.coli BL21(pRSF-CbSuSy1)和E.coli BL21(pRSF-CbSuSy2)
挑取工程菌E.coli BL21(pRSF-McSuSy)、E.coli BL21(pRSF-CbSuSy1)和E.coliBL21(pRSF-CbSuSy2)到至少含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L)，37℃振荡培养过夜。当培养基OD600值达到0.5-0.6时，然后按2％接种量接种到含有相应抗生素的100mLLB培养基(同上)中，并在冷却后加入0.1mM IPTG，诱导表达36h后，菌液于6500rpm，4℃离心3min，弃上清，沉淀备用。
取菌体沉淀，用磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 7.2)洗涤两次，洗涤后的沉淀悬浮于磷酸钾缓冲液中，超声处理细胞(功率300W，超声1s，间歇2s，共10min)，破碎后的悬浮液于8000rpm，4℃离心20min，取上清即为粗酶液。
蔗糖合酶的酶活测定采用DNS法[4]，100μL的反应体系中包含50mM，pH 7.2的磷酸钾缓冲液，200mM蔗糖和5mM UDP。37℃下反应12min。
SDSP-PAGE分析如下(图1)，含有McSuSy和CbSuSy2的粗提物的酶活性分别约为15.5和5.5mU/mg总蛋白。但几乎没有检测到CbSuSy1的蔗糖合成酶活性。
实施例2：蔗糖合成酶McSuSy的蛋白纯化
纯化的步骤在4℃下进行。取实施例1中工程菌E.coli BL21(pRSF-McSuSy)的菌体沉淀，将其重悬于适当的裂解缓冲液(500mM NaCl和10％甘油(v/v)的20mM磷酸钠缓冲液，pH 8.0)中，随后超声处理细胞。破碎后的悬浮液以6665g离心两次，每次持续15min。将上清液通过0.2μm孔径的水系纤维膜过滤，用高亲和力的带镍树脂FF预装柱(GenScript，南京，中国)纯化带有6个His标签的蛋白。用梯度上升的咪唑梯度(以40mM、80mM、120mM、160mM和200mM的咪唑浓度梯度洗脱)从柱上洗脱重组蛋白，合并具有SuSy活性的组分，并用带有MLtracel-30膜的
Figure BDA0003086662400000061
MLtra-15离心过滤器中浓缩(爱尔兰默克密理博有限公司)，同时将缓冲液更换为50mM HEPES-NaOH(pH 7.0)。纯化目标蛋白McSuSy的SDS-PAGE分析图如下(图2)，蔗糖合成酶McSuSy蛋白的比活性为10.5U/mg。
实施例3：酶催化反应的最适温度测定
在pH 7.0HEPES缓冲液反应体系中依次加入5mM UDP、200mM蔗糖，3μg实施例2纯化后的McSuSy的单一蛋白至终体积为100μL。分别置于4、22、30、40、50、60
和70℃的反应条件下分别反应15min，在95℃下孵育5min以终止反应。反应中生成的果糖浓度通过DNS法进行吸光度测定。
通过果糖浓度的标准曲线得到实际生成的果糖含量，其中含量最高的设为100％，依次计算其他反应温度下的果糖浓度相对值。根据结果绘制最适温度曲线(图3)，最适温度为56℃。
实施例4：酶催化反应的最适pH测定
不同pH的缓冲液配制如下：
pH 4.0-6.5，40mM H3PO4,H3BO3和CH3COOH/NaOH
pH 6.5-8.5，50mM HEPES/NaOH
在反应体系中依次加入5mM UDP，200mM蔗糖，3μg实施例2所述的纯化后的McSuSy的单一蛋白以及不同pH的缓冲液至终体积为100μL。在37℃的条件下反应15min，在95℃下孵育5min以终止反应。反应中生成的果糖浓度通过DNS法进行吸光度测定。
通过果糖浓度的标准曲线得到实际生成的果糖含量，其中含量最高的设为100％，依次计算其他反应温度下的果糖浓度相对值。根据结果绘制最适pH曲线(图4)，最适pH为5.5。
实施例5：酶催化反应的热稳定性测定
在反应体系中依次加入5mM UDP，200mM蔗糖，pH 7.0HEPES缓冲液及3μg实施例2纯化后的McSuSy的单一蛋白至终体积为100μL。在没有底物存在的条件下分别置于4、22、30、37、42、56和60℃孵育15min，之后加入底物并在37℃下反应15min，在95℃下孵育5min已终止反应。反应中生成的果糖浓度通过DNS法进行吸光度测定。
通过果糖浓度的标准曲线得到实际生成的果糖含量，其中含量最高的设为100％，依次计算其他反应温度下的果糖浓度相对值，据此绘制热稳定型曲线(图5)。在没有底物存在的条件下，在42℃时15min内McSuSy仍有95％以上的活性，而在22-56℃之间，15min内其相对活力能够保持在50％以上。
实施例6：酶催化动力学参数测定
(1)果糖的标准曲线绘制
将果糖配制成不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM)，用DNS法在酶标仪下检测相应的吸光度，每个浓度的样品做3个复孔，取平均值。以标准浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标，绘制标准曲线，通过Origin 2019b进行线性回归得到标准方程。
(2)催化UDP的酶促动力学参数测定
在反应体系中依次加入200mM蔗糖，pH 7.0HEPES缓冲液，2μg实施例2所述的纯化后的McSuSy的单一蛋白以及不同浓度的UDP(0.2-5.0mM)至终体积为100μL。在37℃的反应条件下分别反应10min，在95℃下孵育5min以终止反应。反应中生成的果糖通过DNS法进行吸光度测定。每个浓度设置3个复孔，取平均值。通过果糖浓度的标准曲线得到实际生成的果糖含量，通过GraphPad Prism 5中相关程序自动计算出Km和Vmax。McSuSy催化UDP的酶促动力学参数Km为0.7mM，Vmax为6.56U/mg。McSuSy对UDP具有较高的亲和力，这与大多数优良植物蔗糖合酶的亲和力相似。
实施例7：酶催化反应的二价金属离子影响
配制2mM不同二价金属离子(Mg2+，Ca2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+)的溶液
在反应体系中依次加入5mM UDP，200mM蔗糖，pH 7.0HEPES缓冲液，3μg实施例2纯化后的McSuSy的单一蛋白以及2mM不同二价金属离子溶液至终体积为100μL。在37℃的条件下反应15min，在95℃下孵育5min以终止反应。反应中生成的果糖通过DNS法进行吸光度测定。通过果糖浓度的标准曲线得到实际生成的果糖含量，依据果糖生成含量初步推断二价金属离子对McSuSy催化的蔗糖裂解反应的影响。McSuSy被Mg2+和Ca2+激活，但被Ni2+，Cu2+和Zn2+抑制(图6)。
实施例8：酶催化反应的半衰期测定
在反应体系中依次加入200mM蔗糖，5mM UDP，pH 7.0HEPES缓冲液及3μg实施例2纯化后的McSuSy的单一蛋白至终体积为1mL。在底物蔗糖存在的条件下分别置于40和50℃孵育24h，反应过程中每次取样100μL加入底物并在37℃下反应15min，在95℃下孵育5min已终止反应。反应中生成的果糖浓度通过DNS法进行吸光度测定。
通过果糖浓度的标准曲线得到实际生成的果糖含量，其中含量最高的值设为100％，依次计算其他反应温度下的果糖浓度相对值，据此绘制催化活性半衰期曲线。在40和50℃下，半衰期依次为9.24h和3.52h。
实施例9表达双酶基因的大肠杆菌工程菌的构建
将来源于甜叶菊(UGT76G1，GenBankAGL95113)、拟南芥(UGT78D2，GenBankAED92377)和长春花(HCaUGT2，GenBank BAD29722)的UDP-糖基转移酶基因两端加上NdeI和XhoI酶切位点，通过双酶切、连接，基因片段插入表达载体pRSFDue-1相应的酶切位点中，置于T7启动子的控制下，构建表达UDP-糖基转移酶的重组质粒pRSF-UGT76G1、pRSF-UGT78D2和pRSF-HCaUGT2。
采用南京金斯瑞生物科技有限公司的
Figure BDA0003086662400000081
试剂盒，在NcoI和EcoRI酶切位点间，将来源于微芒藻的蔗糖合成酶基因(序列1)分别克隆到上述pRSF-UGT76G1、pRSF-UGT78D2和pRSF-HCaUGT2质粒载体上，构建双酶重组表达质粒pRSF-UGT76G1-McSuSy、pRSF-UGT78D2-McSuSy和pRSF-HCaUGT2-McSuSy。
采用南京金斯瑞生物科技有限公司的
Figure BDA0003086662400000082
试剂盒，在NcoI和EcoRI酶切位点间，将用于催化反应对比的来源于马铃薯(StSuSy，GenBankAAA97572)的蔗糖合成酶基因克隆到上述pRSF-UGT76G1质粒载体上，构建双酶重组表达质粒pRSF-UGT76G1-StSuSy。
将上述双酶重组表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，即得共表达双酶的工程菌E.coli BL21(pRSF-UGT76G1-McSuSy)、E.coli BL21(pRSF-UGT76G1-StSuSy)、E.coli BL21(pRSF-UGT78D2-McSuSy)和E.coli BL21(pRSF-HCaUGT2-McSuSy)。
实施例10：表达双酶基因的大肠杆菌工程菌发酵产酶
挑取实施例9构建的含有表达双酶基因的工程菌E.coli BL21(pRSF-UGT76G1-McSuSy)、E.coli BL21(pRSF-UGT76G1-StSuSy)、E.coli BL21(pRSF-UGT78D2-McSuSy)和E.coli BL21(pRSF-HCaUGT2-McSuSy)到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L)，37℃振荡培养过夜。当培养基OD600值达到0.5-0.6时，然后按2％接种量接种到含有相应抗生素的100mLLB培养基中，并在冷却后加入0.1mM IPTG，诱导表达36h后，菌液于6500rpm，4℃离心3min，弃上清，沉淀备用。
取菌体沉淀，用磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 7.2)洗涤两次，洗涤后的沉淀悬浮于磷酸钾缓冲液中，超声处理细胞(功率300W，超声1s，间歇2s，共10min)，破碎后的悬浮液于8000rpm，4℃离心20min，取上清即为粗酶液。
McSuSy的酶活测定结果为1005.9mU/mL，StSuSy的酶活测定结果为1064.6mU/mL；UGT76G1的酶活测定方法和反应体系参加文献[5]，以莱鲍迪苷D为底物的酶活测定结果为112.5mU/mL；UGT76G1以甜菊苷为底物的酶活测定结果为216.8mU/mL；UGT78D2的酶活测定方法和反应体系参加文献[6]，酶活测定结果为513.2mU/mL；HCaUGT2的酶活测定反应体系为0.2mM姜黄素，1mM UDPG，3mM氯化镁，0.01mg粗酶液，pH7.2磷酸钾缓冲液补足至200μL，30℃振荡反应20min，测定方法参加文献[7]，酶活测定结果为428.8mU/mg。
实施例11：1g/L莱鲍迪苷D为底物合成莱鲍迪苷M
在反应体系中依次加入0.005g莱鲍迪苷D(Reb D)，0.025g蔗糖，适量实施例10所述E.coli BL21(UGT76G1-McSuSy)和(UGT76G1-StSuSy)的粗酶液(9mg/mL总蛋白量)及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)至终体积5mL，混合均匀后置于37℃摇床，200rpm搅拌反应30h。分别在0、1、3、6、10、20、30h取样500μL，置于95℃水浴15min，再12,000rpm离心1min取上清液过0.45μm水系滤膜后用高效液相色谱检测(图7)。6h时，UGT76G1-McSuSy参与的反应中莱鲍迪苷D的转化率为99％，莱鲍迪苷M(RebM)的产率为95.23％，而此时UGT76G1-StSuSy组的产率只有76.34％。
HPLC法色谱分析条件如下，以下实例中产物的检测方法相同：
色谱柱：Agilent TC-C18柱(250mm×4.6mm；荷兰)；流动相A：乙腈+1‰甲酸，流动相B：水+1‰甲酸；流速：1mL·min-1；柱温：55℃；检测波长：210nm，检测时间：30min。检测条件：25-47％A相(0-15min)，47-100％A相(15-20min)，100-25％A相(25-30min)。
实施例12：5g/L莱鲍迪苷D为底物合成莱鲍迪苷M
在反应体系中依次加入0.025g莱鲍迪苷D，0.125g蔗糖，适量实施例10所述UGT76G1-McSuSy和UGT76G1-StSuSy的粗酶液(9mg/mL总蛋白量)及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)至终体积5mL，混合均匀后置于37℃摇床，200rpm搅拌反应30h。分别在0、1、3、6、10、20、30h取样500μL，置于95℃水浴15min，再12,000rpm离心1min取上清液过0.45μm水系滤膜后用高效液相色谱检测(图7)。10h时，UGT76G1-McSuSy参与的反应在10h内产生了3.65g/L的莱鲍迪苷M，对照组仅为2.46g/L。
实施例13：20g/L莱鲍迪苷D为底物合成莱鲍迪苷M
在反应体系中依次加入0.1g莱鲍迪苷D，0.5g蔗糖，适量实施例10所述UGT76G1-McSuSy的粗酶液(9mg/mL总蛋白量)及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)至终体积5mL，混合均匀后置于37℃摇床，200rpm搅拌反应30h。分别在0、1、3、6、10、20、30h取样500μL，置于95℃水浴15min，再12,000rpm离心1min取上清液过0.45μm水系滤膜后用高效液相色谱检测。24h时，产生了10.89g/L的莱鲍迪苷M。
实施例14：20g/L甜菊苷为底物合成莱鲍迪苷A
在反应体系中依次加入0.1g甜菊苷(ST)，0.5g蔗糖，适量实施例10所述UGT76G1-McSuSy和UGT76G1-StSuSy的粗酶液(4mg/mL总蛋白量)及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)至终体积5mL，混合均匀后置于37℃摇床，200rpm搅拌反应30h。分别在0、1、3、6、10、20、30h取样500μL，置于95℃水浴15min，再12,000rpm离心1min取上清液过0.45μm水系滤膜后用高效液相色谱检测(图8)。6h时，UGT76G1-McSuSy参与的反应中甜菊苷的转化率为91.53％，莱鲍迪苷A(RebA)的产率为90％；此时UGT76G1-StSuSy组的产率只有53.26％。
实施例15：10g/L莱鲍迪苷E为底物合成莱鲍迪苷D
在反应体系中依次加入0.05g莱鲍迪苷E，0.25g蔗糖，适量实施例10所述UGT76G1-McSuSy的粗酶液(9mg/mL总蛋白量)及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)至终体积5mL，混合均匀后置于37℃摇床，200rpm搅拌反应30h。分别在0、1、3、6、10、20、30h取样500μL，置于95℃水浴15min，再12,000rpm离心1min取上清液过0.45μm水系滤膜后用高效液相色谱检测。10h时，莱鲍迪苷D的产率为86.21％。
实施例16：9.21g/L姜黄素为底物合成姜黄素-4’,4”-O-二糖苷
在反应体系中依次加入终浓度为25mM姜黄素(DMSO溶解)，250mM蔗糖，适量实施例10所述HCaUGT2-McSuSy的粗酶液(8mg/mL总蛋白量)及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)至终体积5mL，混合均匀后置于37℃摇床，200rpm搅拌反应36h。分别在0、1、3、6、10、20、30h取样50μL，加入450μL甲醇(色谱纯)灭活，12,000rpm、离心10min后取上清过0.45μm有机滤膜后用高效液相色谱检测。30h时姜黄素转化率为80.2％。
HPLC法色谱分析条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18柱(250mm×4.6mm；荷兰)；流动相A：乙腈+1‰甲酸，流动相B：水+1‰甲酸；流速：1mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：425nm，检测时间：30min。检测条件：80-70％B(0-5min)，70-40％B(5-10min),40-0％B(10-25min)，0％B(25-28min),0-80％B(28-35min)。
实施例17：3g/L槲皮素为底物合成槲皮素-3,4’-O-二糖苷
在反应体系中依次加入0.03g槲皮素，4g蔗糖，10％DMSO，2mM UDP，3mM MgCl2，适量实施例10所述UGT78D2-McSuSy的粗酶液(10mg/mL总蛋白量)及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)至终体积10mL，混合均匀后置于35℃摇床，200rpm搅拌反应36h。分别在0、1、3、6、10、20、30、40h取样30μL，加入870μL甲醇(色谱纯)灭活，12,000rpm、离心10min后取上清过0.45μm有机滤膜后用高效液相色谱检测。在36h时，槲皮素转化率为63.3％。
HPLC法色谱分析条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18柱(250mm×4.6mm；荷兰)；流动相A：乙腈+1‰甲酸，流动相B：水+1‰甲酸；流速：1mL·min-1；柱温：40℃；检测波长：350nm，检测时间：30min。检测条件：10–25％B(0–8min),25％B(8–14min),25–85％B(14–24min),85–10％B(24–29min),10％B(29–31min)。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种蔗糖合成酶及其在催化糖基化反应中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2595
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atgagtgctg gggccgatag ccccagctcg cagcccttcc tggcgtcgcc acggggcgtg 60
ataacgcctc gcacgtttac caggtcgctg tcctttgctg gcggcacgcc ctcagagata 120
ctcaaggccg gcctggtgca cagccgcaat gagctggtgc tgctgttcag caggtgcatg 180
gcaaaaagca aggccgacaa gcccatcctg ctgccccaca tcataatgga cgagctgtgc 240
gctgtgtgcg acgagtgcaa caacccaatg ctgaagagcg gcgagattgc agccatcctc 300
aagacggtgc aggaggcggt ggtcattgcg ccgcgcatcg ctttcgcgct gcgccccacc 360
atgggcgagt ggtactacgt tcgcgtgagc gtggaggaca tgcgtgtcga ggagatgact 420
gccgcgcact acctggcatt caaggagaag ctggtgccac tggaccaaga ccggcatggg 480
tacgacccat tcgtgctgga gctcgacctg aagccttttg gcgcgcacca acccaagatc 540
agcctgcagt cccacatcgg caacggcgtg tccttcctca atcggaccct ctccgccaag 600
atgttctcgc aaaacgcaaa tgcagagggc agccagctga tgctcgactt cctccgggaa 660
ttcaagcacg gcggagagaa gctgctgctg agcccgcgtg tgaacagcgt gcagaagctg 720
cgccactcgc tgctgcgcgc cgaccgcctg ctggagaagc acgaggacga ggatcccctc 780
tccgttgtgc aaggcatcga cgagctcggc ttcctgcccg gctggggcaa caccgtgggg 840
cgtgtgcggg agagcttcca gctgctgctg gacatcatac aggcgcccga cgccgacacc 900
ctggagaagt ttttggcccg cctgccgctg atggtcaagg ttgtgattct ttcgccccac 960
ggctacttcg gacagaccaa cgtgcttggc atgcccgaca ctggcggaca ggttgtgtac 1020
attctggacc aagtgcgggc gatggagcgg gagatgcagc agcggctgga cgaggcggga 1080
ctgcagaacg tcaaagccga cgtcgtcgtg ctcacgcgcc tcatcccgga tgcccacggc 1140
acctcctgca acgagcgcct ggagccaatc agcggctgcc agaacgcccg catcctgcgc 1200
gtgcccttcc gcgacagcga gggccgcatc ctcaaccact gggtgtcccg cttcgacctc 1260
tggccctacc tggagcgatt cacgattgac gcaaccaagg agattctggc agagatgggg 1320
ggcaaaccag acttcatcat cggcaactac agcgacggca atcttgtggc cacgctgatg 1380
agccaccgca tgaacgtgac gcagtgcaac atcgcgcacg cgctggagaa gaccaagtac 1440
gacgacgccg acatctactg gcagaagctg gaggacaagt accacttttc gtgccagttc 1500
accgccgacc tgattgccat gaacagcgca gacttcattg tcacgtccac ctaccaggag 1560
attgccggac acgaggagat ggttgggcag tacgagtcgt acaagtcgtt caccatgcca 1620
cagctgtacc gcgtcgtgga gggcattgac atctacaacc ccaagttcaa catcgtctct 1680
cccggcgctg acctggacat ctacttcccg taccaggaga aggagcgccg cctgactggg 1740
ctgcacaaag acatcgaggc gctgctgttc gacccagact tcaaggggac agtgggccag 1800
ctggaggacc gcgacaagcc catcctgttc agcatggctc gcctggacaa ggtcaaaaac 1860
ctgacgggcc tggccgagtg gtacgccggc aaccagcgcc tgcgcggcct ggtcaacctg 1920
gtcatcgtgg gcggcgtgat cgaccctgcc gccaccatgg accgcgagga ggcggcagag 1980
tgcgagcaca tgcacgagct ggtcgagaag tacaagatgc acggcacctt ccgctggatc 2040
gtggcgcaga agaaccgggt gcgcaacggc gagctgtatc gctacatcgc cgacacgcgc 2100
ggcgcctttg cgcagccggc gctgtacgaa gcctttgggt tgacggtgat tgaggccatg 2160
acgtgcggcc tgcccacctt tgccaccaac cacggcggcc cctctgagat catcaagcac 2220
aagaagagcg gcttccacat cgatccctac cacggcgccg aggccgccga cctgatggcg 2280
gacttctttg agcgcagcca gaaggagccc tcccactgga ccaagatcag tgaggccgcg 2340
caggagcgca tcttctcgcg atacacctgg tctatctacg ccaagcgcct ggtgaccctc 2400
agccacgtct acaccttctg gaagcacgtg acctcccttg agagccgcga gactaagcgt 2460
tacctagaga tgttctacat cctgcaaatg cgcaagctgg tggccaagat gagcgaggag 2520
actgtcgaaa aggagaaggc tgccgcagag gctggccctg ccggccctcc caaggtgggc 2580
tttggcgcca tgtga 2595
<210> 2
<211> 864
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Met Ser Ala Gly Ala Asp Ser Pro Ser Ser Gln Pro Phe Leu Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Gly Val Ile Thr Pro Arg Thr Phe Thr Arg Ser Leu Ser Phe
20 25 30
Ala Gly Gly Thr Pro Ser Glu Ile Leu Lys Ala Gly Leu Val His Ser
35 40 45
Arg Asn Glu Leu Val Leu Leu Phe Ser Arg Cys Met Ala Lys Ser Lys
50 55 60
Ala Asp Lys Pro Ile Leu Leu Pro His Ile Ile Met Asp Glu Leu Cys
65 70 75 80
Ala Val Cys Asp Glu Cys Asn Asn Pro Met Leu Lys Ser Gly Glu Ile
85 90 95
Ala Ala Ile Leu Lys Thr Val Gln Glu Ala Val Val Ile Ala Pro Arg
100 105 110
Ile Ala Phe Ala Leu Arg Pro Thr Met Gly Glu Trp Tyr Tyr Val Arg
115 120 125
Val Ser Val Glu Asp Met Arg Val Glu Glu Met Thr Ala Ala His Tyr
130 135 140
Leu Ala Phe Lys Glu Lys Leu Val Pro Leu Asp Gln Asp Arg His Gly
145 150 155 160
Tyr Asp Pro Phe Val Leu Glu Leu Asp Leu Lys Pro Phe Gly Ala His
165 170 175
Gln Pro Lys Ile Ser Leu Gln Ser His Ile Gly Asn Gly Val Ser Phe
180 185 190
Leu Asn Arg Thr Leu Ser Ala Lys Met Phe Ser Gln Asn Ala Asn Ala
195 200 205
Glu Gly Ser Gln Leu Met Leu Asp Phe Leu Arg Glu Phe Lys His Gly
210 215 220
Gly Glu Lys Leu Leu Leu Ser Pro Arg Val Asn Ser Val Gln Lys Leu
225 230 235 240
Arg His Ser Leu Leu Arg Ala Asp Arg Leu Leu Glu Lys His Glu Asp
245 250 255
Glu Asp Pro Leu Ser Val Val Gln Gly Ile Asp Glu Leu Gly Phe Leu
260 265 270
Pro Gly Trp Gly Asn Thr Val Gly Arg Val Arg Glu Ser Phe Gln Leu
275 280 285
Leu Leu Asp Ile Ile Gln Ala Pro Asp Ala Asp Thr Leu Glu Lys Phe
290 295 300
Leu Ala Arg Leu Pro Leu Met Val Lys Val Val Ile Leu Ser Pro His
305 310 315 320
Gly Tyr Phe Gly Gln Thr Asn Val Leu Gly Met Pro Asp Thr Gly Gly
325 330 335
Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Met Glu Arg Glu Met
340 345 350
Gln Gln Arg Leu Asp Glu Ala Gly Leu Gln Asn Val Lys Ala Asp Val
355 360 365
Val Val Leu Thr Arg Leu Ile Pro Asp Ala His Gly Thr Ser Cys Asn
370 375 380
Glu Arg Leu Glu Pro Ile Ser Gly Cys Gln Asn Ala Arg Ile Leu Arg
385 390 395 400
Val Pro Phe Arg Asp Ser Glu Gly Arg Ile Leu Asn His Trp Val Ser
405 410 415
Arg Phe Asp Leu Trp Pro Tyr Leu Glu Arg Phe Thr Ile Asp Ala Thr
420 425 430
Lys Glu Ile Leu Ala Glu Met Gly Gly Lys Pro Asp Phe Ile Ile Gly
435 440 445
Asn Tyr Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Thr Leu Met Ser His Arg Met
450 455 460
Asn Val Thr Gln Cys Asn Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr
465 470 475 480
Asp Asp Ala Asp Ile Tyr Trp Gln Lys Leu Glu Asp Lys Tyr His Phe
485 490 495
Ser Cys Gln Phe Thr Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn Ser Ala Asp Phe
500 505 510
Ile Val Thr Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Ala Gly His Glu Glu Met Val
515 520 525
Gly Gln Tyr Glu Ser Tyr Lys Ser Phe Thr Met Pro Gln Leu Tyr Arg
530 535 540
Val Val Glu Gly Ile Asp Ile Tyr Asn Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser
545 550 555 560
Pro Gly Ala Asp Leu Asp Ile Tyr Phe Pro Tyr Gln Glu Lys Glu Arg
565 570 575
Arg Leu Thr Gly Leu His Lys Asp Ile Glu Ala Leu Leu Phe Asp Pro
580 585 590
Asp Phe Lys Gly Thr Val Gly Gln Leu Glu Asp Arg Asp Lys Pro Ile
595 600 605
Leu Phe Ser Met Ala Arg Leu Asp Lys Val Lys Asn Leu Thr Gly Leu
610 615 620
Ala Glu Trp Tyr Ala Gly Asn Gln Arg Leu Arg Gly Leu Val Asn Leu
625 630 635 640
Val Ile Val Gly Gly Val Ile Asp Pro Ala Ala Thr Met Asp Arg Glu
645 650 655
Glu Ala Ala Glu Cys Glu His Met His Glu Leu Val Glu Lys Tyr Lys
660 665 670
Met His Gly Thr Phe Arg Trp Ile Val Ala Gln Lys Asn Arg Val Arg
675 680 685
Asn Gly Glu Leu Tyr Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Arg Gly Ala Phe Ala
690 695 700
Gln Pro Ala Leu Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala Met
705 710 715 720
Thr Cys Gly Leu Pro Thr Phe Ala Thr Asn His Gly Gly Pro Ser Glu
725 730 735
Ile Ile Lys His Lys Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His Gly
740 745 750
Ala Glu Ala Ala Asp Leu Met Ala Asp Phe Phe Glu Arg Ser Gln Lys
755 760 765
Glu Pro Ser His Trp Thr Lys Ile Ser Glu Ala Ala Gln Glu Arg Ile
770 775 780
Phe Ser Arg Tyr Thr Trp Ser Ile Tyr Ala Lys Arg Leu Val Thr Leu
785 790 795 800
Ser His Val Tyr Thr Phe Trp Lys His Val Thr Ser Leu Glu Ser Arg
805 810 815
Glu Thr Lys Arg Tyr Leu Glu Met Phe Tyr Ile Leu Gln Met Arg Lys
820 825 830
Leu Val Ala Lys Met Ser Glu Glu Thr Val Glu Lys Glu Lys Ala Ala
835 840 845
Ala Glu Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Lys Val Gly Phe Gly Ala Met
850 855 860
<210> 3
<211> 2795
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
gtagcaggcc aggaactctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 60
tctcatcggg aggttggggg cacaccttag ccatggagta tgcagctgag gacgcgatga 120
cgatgaccgt cgatctggag gatggggaat tgaagcccag gccagagaag atgcctgagc 180
tgtctcgcat tgcgagtatg actgtgcgtg tcaaggactc gatccgtgat taccgtaatc 240
agatcatatt tatgctctct cgattagtgg agaaaggcaa gcatactctg cagccacatg 300
aactgcagaa gcagctggag cgcgtcggag ccatcgagtg tttctccgga actaccatca 360
aggacagcgc ttttgccact cttctgcagt ccgcgcaaga agcggtggtc ataccgcctt 420
ggatcgcgat ggcggcgcgg ccgcgtgtgg cagaatggct ctacgtgcga atcaacgtgt 480
ttgagctgtc ggtggacgag ttgaccgtgt cggagtattt ggacttcaaa gagcaattga 540
agcttgacaa gccggtggac gagttttcgc ttttggagtt cgatatgggc ccattcaacg 600
cgaatttccc gcgtatgacc cgaccgtctt cgatcggcaa cggcgtcgag tttttgaaca 660
agcacctttc cacgaagctg tttaagaacg ccaaggcatt gcaaccgctg ctggatttcc 720
tgcgcaatca caagtaccaa ggggagacgt tgatggtgaa cgaccaactt gaggatttgc 780
ccgctctgcg ggacggactg aagaaggcaa cggagtactt gtcgagtgtt ggacacgatg 840
cgcccgtctc cgccgtgcag gaccagcttc gagcgcttgg attcgaaaac ggatggggaa 900
attgcgccgg ccgcatcaag gacatgatgg aattgctgga ggacctcatg caagcgccat 960
cgccagtgtt gctcgagaaa ttcctcgcgc gcgtgcccat gatcttcaac gtcgccatca 1020
tctctccgca cgggtacttt ggtcaggcca acgttctggg gctccctgac acaggcgggc 1080
aggtggttta cattctggac caggtccgtg ctctggaacg cgagatgctg aatcatgttc 1140
agaaccaggg actccggttc aaaccacagg tgatcgtttt gacccgtctg gtccctgacg 1200
cccacgggac caactgcgat cagaggttgg agaagatcga gggcacagag tacgcgaaga 1260
tcctgcgagt gccgttccga gaccttgcga aaggcgaagg catcttgagg aaatgggtgt 1320
cccgcttcga tatctggccc tacctggaga cgtttgcaga ggactcggcg aaagcgctgg 1380
tcgaagagat gggaggaaac ccagatctta tcattggcaa ttacagcgac ggcaatcttg 1440
tggcgacgct gctatctcat agaatgcaag tgacgcagtg cacgatcgcg cacgcgctgg 1500
aaaagactaa gtacccgagc tccgatgtga actggaagga ggtggaggag aagtaccact 1560
tttcatgcca gttcactgct gatttgattg ccatgaacca cacagatttc atcgtaacca 1620
gcacctatca agaaattgcg ggcggaatcg acacggtggg gcagtacgag tcccatcagg 1680
ccttcaccat gccggggctc tacagagtgg tgaacggcat caacgtcttc gatcccaagt 1740
ttaacatcgt cgcccctgga gcagatgcgg aggtgtactt cccctacacg gccaaggaga 1800
ggcgtctgac gacgttccac tctgccatcg aagatctgct gttcgggaac atggaggagc 1860
cggcgctgtg caagtctgtg attaaaaata gacacaagcc gatcctgttc tcgatggccc 1920
gcctagacaa ggttaagaat ctcacaggcc tcgtcgagat gtttggaaag aaccagcggc 1980
tgcgtcgtct ggttaatctc gttgtcattg gggggtatat cgatccgacg ctgtccaagg 2040
accgcgagga ggtggagcag atcaatctga tgcacaaact gatcgagaag taccaactga 2100
acggcgacat gcgatggatt gttgcgcaga agaacagggt gcgcaatgga gagctataca 2160
ggtatgtggc ggacacgcgc ggagcgtttg tgcagccggc gttctacgag gcgttcggac 2220
tgacggttgt ggaggcgatg acgtgtggcc ttcctacgtt cgccacgtgt cacggtggtc 2280
cagcggagat catcgaggac ggaaagtcgg gattccatat cgacccttat cagcccgacg 2340
agacggcgaa agccctcggc gacttcttcg aggccgctgc ggccgacccc accaagtggg 2400
aggctgtatc acgtggcgga cttgagcgga ttagaagcaa gtacacgtgg gagatctacg 2460
cgcggaggtt gatgactttg tcgagggagt acgggttctg gaagtttgtc agcgatctcg 2520
accgcaggga ggccaaacgt tatcttgaga tgttctatat tctcaagtac agaccgctcg 2580
tgaagaaagt gccgttgact gtcgacgcgc ccgatcggcc catggcggga agaagatgaa 2640
aagaaaagag gcgggaaacc tgaagaaaaa gtgacggaga gcatggcggg aagaagatga 2700
aaaaacagag gcgggaaacc tgcagaaaaa gtgacggaga ggaggagaga aggggggtcc 2760
gggagggcga gaacgaatga atagatgaaa agacg 2795
<210> 4
<211> 848
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
Met Glu Tyr Ala Ala Glu Asp Ala Met Thr Met Thr Val Asp Leu Glu
1 5 10 15
Asp Gly Glu Leu Lys Pro Arg Pro Glu Lys Met Pro Glu Leu Ser Arg
20 25 30
Ile Ala Ser Met Thr Val Arg Val Lys Asp Ser Ile Arg Asp Tyr Arg
35 40 45
Asn Gln Ile Ile Phe Met Leu Ser Arg Leu Val Glu Lys Gly Lys His
50 55 60
Thr Leu Gln Pro His Glu Leu Gln Lys Gln Leu Glu Arg Val Gly Ala
65 70 75 80
Ile Glu Cys Phe Ser Gly Thr Thr Ile Lys Asp Ser Ala Phe Ala Thr
85 90 95
Leu Leu Gln Ser Ala Gln Glu Ala Val Val Ile Pro Pro Trp Ile Ala
100 105 110
Met Ala Ala Arg Pro Arg Val Ala Glu Trp Leu Tyr Val Arg Ile Asn
115 120 125
Val Phe Glu Leu Ser Val Asp Glu Leu Thr Val Ser Glu Tyr Leu Asp
130 135 140
Phe Lys Glu Gln Leu Lys Leu Asp Lys Pro Val Asp Glu Phe Ser Leu
145 150 155 160
Leu Glu Phe Asp Met Gly Pro Phe Asn Ala Asn Phe Pro Arg Met Thr
165 170 175
Arg Pro Ser Ser Ile Gly Asn Gly Val Glu Phe Leu Asn Lys His Leu
180 185 190
Ser Thr Lys Leu Phe Lys Asn Ala Lys Ala Leu Gln Pro Leu Leu Asp
195 200 205
Phe Leu Arg Asn His Lys Tyr Gln Gly Glu Thr Leu Met Val Asn Asp
210 215 220
Gln Leu Glu Asp Leu Pro Ala Leu Arg Asp Gly Leu Lys Lys Ala Thr
225 230 235 240
Glu Tyr Leu Ser Ser Val Gly His Asp Ala Pro Val Ser Ala Val Gln
245 250 255
Asp Gln Leu Arg Ala Leu Gly Phe Glu Asn Gly Trp Gly Asn Cys Ala
260 265 270
Gly Arg Ile Lys Asp Met Met Glu Leu Leu Glu Asp Leu Met Gln Ala
275 280 285
Pro Ser Pro Val Leu Leu Glu Lys Phe Leu Ala Arg Val Pro Met Ile
290 295 300
Phe Asn Val Ala Ile Ile Ser Pro His Gly Tyr Phe Gly Gln Ala Asn
305 310 315 320
Val Leu Gly Leu Pro Asp Thr Gly Gly Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp
325 330 335
Gln Val Arg Ala Leu Glu Arg Glu Met Leu Asn His Val Gln Asn Gln
340 345 350
Gly Leu Arg Phe Lys Pro Gln Val Ile Val Leu Thr Arg Leu Val Pro
355 360 365
Asp Ala His Gly Thr Asn Cys Asp Gln Arg Leu Glu Lys Ile Glu Gly
370 375 380
Thr Glu Tyr Ala Lys Ile Leu Arg Val Pro Phe Arg Asp Leu Ala Lys
385 390 395 400
Gly Glu Gly Ile Leu Arg Lys Trp Val Ser Arg Phe Asp Ile Trp Pro
405 410 415
Tyr Leu Glu Thr Phe Ala Glu Asp Ser Ala Lys Ala Leu Val Glu Glu
420 425 430
Met Gly Gly Asn Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser Asp Gly Asn
435 440 445
Leu Val Ala Thr Leu Leu Ser His Arg Met Gln Val Thr Gln Cys Thr
450 455 460
Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Ser Ser Asp Val Asn
465 470 475 480
Trp Lys Glu Val Glu Glu Lys Tyr His Phe Ser Cys Gln Phe Thr Ala
485 490 495
Asp Leu Ile Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Val Thr Ser Thr Tyr
500 505 510
Gln Glu Ile Ala Gly Gly Ile Asp Thr Val Gly Gln Tyr Glu Ser His
515 520 525
Gln Ala Phe Thr Met Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val Asn Gly Ile Asn
530 535 540
Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ala Pro Gly Ala Asp Ala Glu
545 550 555 560
Val Tyr Phe Pro Tyr Thr Ala Lys Glu Arg Arg Leu Thr Thr Phe His
565 570 575
Ser Ala Ile Glu Asp Leu Leu Phe Gly Asn Met Glu Glu Pro Ala Leu
580 585 590
Cys Lys Ser Val Ile Lys Asn Arg His Lys Pro Ile Leu Phe Ser Met
595 600 605
Ala Arg Leu Asp Lys Val Lys Asn Leu Thr Gly Leu Val Glu Met Phe
610 615 620
Gly Lys Asn Gln Arg Leu Arg Arg Leu Val Asn Leu Val Val Ile Gly
625 630 635 640
Gly Tyr Ile Asp Pro Thr Leu Ser Lys Asp Arg Glu Glu Val Glu Gln
645 650 655
Ile Asn Leu Met His Lys Leu Ile Glu Lys Tyr Gln Leu Asn Gly Asp
660 665 670
Met Arg Trp Ile Val Ala Gln Lys Asn Arg Val Arg Asn Gly Glu Leu
675 680 685
Tyr Arg Tyr Val Ala Asp Thr Arg Gly Ala Phe Val Gln Pro Ala Phe
690 695 700
Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala Met Thr Cys Gly Leu
705 710 715 720
Pro Thr Phe Ala Thr Cys His Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile Glu Asp
725 730 735
Gly Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr Gln Pro Asp Glu Thr Ala
740 745 750
Lys Ala Leu Gly Asp Phe Phe Glu Ala Ala Ala Ala Asp Pro Thr Lys
755 760 765
Trp Glu Ala Val Ser Arg Gly Gly Leu Glu Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
770 775 780
Thr Trp Glu Ile Tyr Ala Arg Arg Leu Met Thr Leu Ser Arg Glu Tyr
785 790 795 800
Gly Phe Trp Lys Phe Val Ser Asp Leu Asp Arg Arg Glu Ala Lys Arg
805 810 815
Tyr Leu Glu Met Phe Tyr Ile Leu Lys Tyr Arg Pro Leu Val Lys Lys
820 825 830
Val Pro Leu Thr Val Asp Ala Pro Asp Arg Pro Met Ala Gly Arg Arg
835 840 845
<210> 5
<211> 3949
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
ggacgaagcc gcggagcagg agagagacgt ggtaatgtgc gtgcatgcgc tccttgttta 60
gcgctttggg tgtatctggg ggctgtaggg ttcgaggttg ttctgccatc gctgctcggg 120
cttgtggaat cgggatcgaa aagagaatcg caggaaggac cacaggcaga cagcgagggt 180
gaaggattgg cgaacagcat gggtgccgac ctggttcccc ggcccgagaa gctccccgag 240
ctcactcgga tgcacagcat gacagatcga gtgaagggat ccatcgccga gtaccgcaac 300
caggtcatcc tgctgttgtc ccggtatgtg tcgaacggga agcacacgct gcagccgcac 360
gagctgaaga acgagttgga gcgtgtggcg gagctggagt gcttcgcggg tacgcagatc 420
aaggacagcg cgtttgccaa aattctccgt gcgactcagg aggctgtcgt cattcctccg 480
tatatcgcgc tggcggtgcg gccacgtgtc gcggagtggc agtatcttcg tgtgaacgcg 540
ttcgaaatga cagtcgaaga gctcagcccg tccgagtact tggagttcaa ggagcgtctg 600
aaggcggctg acgatgaggc gccgccaatt tgcagcgact tcgccacgct ggagatcgac 660
atggagccgt tcaatgcgag tttcccgagg ttgacccgcc catcgtccat cggcgacggc 720
gtgtcgtacc tgaacaagca cctctcatcg cggatgttca aggaggccgg cgggttgcag 780
ccgctgctgg acttcctgcg cactcacaag tgcgtgggcg agacgctcat gctcaatgcg 840
cgcatcgaca ctctcgagaa actccgcagc aatctcgcca aggcggagga gttcctcggc 900
gcgcttcccg ccgacacgcc ggtcgggagt gtggccaccc gattgcagga gctgggcttc 960
gagcgcgggt ggggcgacac cgccggacgc atcaaggaca tggtggacat gctgtcggac 1020
ctgatgcagg cgcctgacgc cgacctgctg gagaagtttc tcgggcgcat ccccgtcatt 1080
ttcaacgtgg cgatcatgtc gcctcacggc tacttcgggc aggcgaacgt cctaggcctc 1140
cccgacaccg gcgggcaggt ggtgtacatc ttggaccagg tcaaggcgct cgaacgggac 1200
ctcctccatc acagcaaaca gcaggggctc aacttcaaac ctcagatcat cgtgctgacg 1260
agactgatcc cggacgccca cggaacgtcc tgcaatcaga ggatcgagca tatcgacggc 1320
acgcagtact cgaagatcct ccgcgtgccg ttcaagaatc ccaaggacgg gagcgtgctg 1380
cgcaagtggg tgtcccgctt cgacgtttgg ccgtacatgg agcagttcac ggaggactcg 1440
gtgcacgagc tgcgcgccga gttcggcggc aatcccgacc tcatcatcgg caactatagc 1500
gacgggaatt tggtggcggt gctgctggcg caccggctga aggtgacgca ctgcacgatc 1560
gcccacgcgc tggagaagac caagtacccc aactccgacc tgaactggaa ggagctggac 1620
gagaagtacc acttctcctg ccagttcacc gcggacctga tcgccatgaa ccacgccgac 1680
ttcatcatca caagcacgta ccaggagata gcagggcggg cggacgccgt gggacagtac 1740
gagtcgcacc aggcgtacac catgcccggc ctgtaccgcg ttgtaaacgg aatcgacgtg 1800
ttcgacccca agttcaatat cgtctccccc ggtgcggacg cggacacgta ctacccgtac 1860
ttcatcaagg agaagaggct gacggcgttc cacccggaga tcgaggagct gctgtacggg 1920
cagaaggagg acgtcaggct ctgccgcgga gtcctccagg acaggagcaa gcccatcatc 1980
ttcacgatgg cgaggctgga caaggtgaag aacctcaccg gactggcgga gatgtacggc 2040
aaaagcgcgc gcttgcgcaa gctggtcaac ctggtcatcg tcggagggta catcgacccg 2100
tctctgtcca tggacaggga ggaggtccac cagatcaacc agttgcatgc catcatcgac 2160
aagtacgcgc tggacaaggg cgacatgcgc tggatcgtgg cgcagaagca ccgcatgcgc 2220
aacggggaga tgtaccgcta catcgccgac accaggggcg ctttcatcca gccggcgttc 2280
tacgaggcct tcggtctcac ggtcgtcgag gccatgacct cggggctgcc gacgttcgcc 2340
acctgtcacg gcggccccgc agaggtcatc aagcacggcg tgtcgggcta ccacatcgat 2400
atgtaccgac ccgacgaggt ggcagacttg atagccgact tcttcgagag gtgcaagacg 2460
gaccccggcg agtgggacgg tctgtccaag gcgggactgg agcggatata cagcaagttc 2520
acgtgggaga tctacgcgga gagactgatg actctctcgc gggtgtacac cttttggaag 2580
tttgtgtcca acctggagag gagggaggcg aggagataca tagagatgtt ctataacctc 2640
aagtatagac agtgcgtgaa gacggtgccg ctcgcagtcg agtgatggat gcacatggga 2700
ttttcgtgcg atcgcacgtg cgtagagtat gggcggcgac ggagtttcat tagctacaag 2760
ggaggtgagc agaataggcg cggggagggg gagagagggg ggggaaagag aggagggata 2820
caaggagtcg tcaagacggt gccgctcgca gtcgagtgac ggatggatat gggattttcg 2880
tgctatcgcg cgtgtgtaga gtatgaccgg cgacggagtt ctattagcta cgaggtaggt 2940
gagcagaata ggccgggggg ggaggaagcg gggggaagag agagatacaa ggagtcgtca 3000
agacggtgcc gctcgcagtc gagtgacgga tcggaaagga tatttgtgct atcgcgcgtg 3060
cgtagcgtat gggcggcgac ggagttccat tagctacaag gtaggcgagc agaataggcg 3120
cggggggaag agagagagag aaagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 3180
agagagagag agagagagag agagacggtg ccgctgggag ttgagtgagg gatgtcatga 3240
attgattggt gggaacgcac ggtgtcgaac gtggcggtga tggactctca ttagctacaa 3300
ggngagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 3360
agagagaacc tccccatcaa tggtgggatc ttgcgtgcgt cgacttcaag atgagagagg 3420
ttgcttcgtg gattcgagac gttctttttt tttttttttt ttttttgatt cgagacgttt 3480
tctttacaag aaacctgagc attttttttt tctgttcttt tttttttcct tataaaggta 3540
ctttctccca atcacctcac acactaccta cctaccacta ctcctactcc taattgtagg 3600
catacgggga accccgtagc agccagaacc gtgttcacga gagtacatgc ggggcctgct 3660
cccgacctgc aggaggctgc ttggagatct gctcagaatt caggattaga gtggtccatg 3720
ttttcactct ttttgctgat ttgcgatgtt ttcttcacca tagatctgag tttttctgtc 3780
ctaaaaaatg gcgagataat ccgcgagaac gttttcttgg caacttgaaa gaagatggga 3840
aaggaattac aaggaaatag cgcgaagctt atcttcttgg tcatcgcaat catcaccatc 3900
aacaccactt gggagtcttt ttctgcgtca acgcgtccct taacttgag 3949
<210> 6
<211> 828
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
Met Gly Ala Asp Leu Val Pro Arg Pro Glu Lys Leu Pro Glu Leu Thr
1 5 10 15
Arg Met His Ser Met Thr Asp Arg Val Lys Gly Ser Ile Ala Glu Tyr
20 25 30
Arg Asn Gln Val Ile Leu Leu Leu Ser Arg Tyr Val Ser Asn Gly Lys
35 40 45
His Thr Leu Gln Pro His Glu Leu Lys Asn Glu Leu Glu Arg Val Ala
50 55 60
Glu Leu Glu Cys Phe Ala Gly Thr Gln Ile Lys Asp Ser Ala Phe Ala
65 70 75 80
Lys Ile Leu Arg Ala Thr Gln Glu Ala Val Val Ile Pro Pro Tyr Ile
85 90 95
Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Val Ala Glu Trp Gln Tyr Leu Arg Val
100 105 110
Asn Ala Phe Glu Met Thr Val Glu Glu Leu Ser Pro Ser Glu Tyr Leu
115 120 125
Glu Phe Lys Glu Arg Leu Lys Ala Ala Asp Asp Glu Ala Pro Pro Ile
130 135 140
Cys Ser Asp Phe Ala Thr Leu Glu Ile Asp Met Glu Pro Phe Asn Ala
145 150 155 160
Ser Phe Pro Arg Leu Thr Arg Pro Ser Ser Ile Gly Asp Gly Val Ser
165 170 175
Tyr Leu Asn Lys His Leu Ser Ser Arg Met Phe Lys Glu Ala Gly Gly
180 185 190
Leu Gln Pro Leu Leu Asp Phe Leu Arg Thr His Lys Cys Val Gly Glu
195 200 205
Thr Leu Met Leu Asn Ala Arg Ile Asp Thr Leu Glu Lys Leu Arg Ser
210 215 220
Asn Leu Ala Lys Ala Glu Glu Phe Leu Gly Ala Leu Pro Ala Asp Thr
225 230 235 240
Pro Val Gly Ser Val Ala Thr Arg Leu Gln Glu Leu Gly Phe Glu Arg
245 250 255
Gly Trp Gly Asp Thr Ala Gly Arg Ile Lys Asp Met Val Asp Met Leu
260 265 270
Ser Asp Leu Met Gln Ala Pro Asp Ala Asp Leu Leu Glu Lys Phe Leu
275 280 285
Gly Arg Ile Pro Val Ile Phe Asn Val Ala Ile Met Ser Pro His Gly
290 295 300
Tyr Phe Gly Gln Ala Asn Val Leu Gly Leu Pro Asp Thr Gly Gly Gln
305 310 315 320
Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Lys Ala Leu Glu Arg Asp Leu Leu
325 330 335
His His Ser Lys Gln Gln Gly Leu Asn Phe Lys Pro Gln Ile Ile Val
340 345 350
Leu Thr Arg Leu Ile Pro Asp Ala His Gly Thr Ser Cys Asn Gln Arg
355 360 365
Ile Glu His Ile Asp Gly Thr Gln Tyr Ser Lys Ile Leu Arg Val Pro
370 375 380
Phe Lys Asn Pro Lys Asp Gly Ser Val Leu Arg Lys Trp Val Ser Arg
385 390 395 400
Phe Asp Val Trp Pro Tyr Met Glu Gln Phe Thr Glu Asp Ser Val His
405 410 415
Glu Leu Arg Ala Glu Phe Gly Gly Asn Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn
420 425 430
Tyr Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Val Leu Leu Ala His Arg Leu Lys
435 440 445
Val Thr His Cys Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro
450 455 460
Asn Ser Asp Leu Asn Trp Lys Glu Leu Asp Glu Lys Tyr His Phe Ser
465 470 475 480
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485 490 495
Ile Thr Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Ala Gly Arg Ala Asp Ala Val Gly
500 505 510
Gln Tyr Glu Ser His Gln Ala Tyr Thr Met Pro Gly Leu Tyr Arg Val
515 520 525
Val Asn Gly Ile Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro
530 535 540
Gly Ala Asp Ala Asp Thr Tyr Tyr Pro Tyr Phe Ile Lys Glu Lys Arg
545 550 555 560
Leu Thr Ala Phe His Pro Glu Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Gly Gln Lys
565 570 575
Glu Asp Val Arg Leu Cys Arg Gly Val Leu Gln Asp Arg Ser Lys Pro
580 585 590
Ile Ile Phe Thr Met Ala Arg Leu Asp Lys Val Lys Asn Leu Thr Gly
595 600 605
Leu Ala Glu Met Tyr Gly Lys Ser Ala Arg Leu Arg Lys Leu Val Asn
610 615 620
Leu Val Ile Val Gly Gly Tyr Ile Asp Pro Ser Leu Ser Met Asp Arg
625 630 635 640
Glu Glu Val His Gln Ile Asn Gln Leu His Ala Ile Ile Asp Lys Tyr
645 650 655
Ala Leu Asp Lys Gly Asp Met Arg Trp Ile Val Ala Gln Lys His Arg
660 665 670
Met Arg Asn Gly Glu Met Tyr Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Arg Gly Ala
675 680 685
Phe Ile Gln Pro Ala Phe Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu
690 695 700
Ala Met Thr Ser Gly Leu Pro Thr Phe Ala Thr Cys His Gly Gly Pro
705 710 715 720
Ala Glu Val Ile Lys His Gly Val Ser Gly Tyr His Ile Asp Met Tyr
725 730 735
Arg Pro Asp Glu Val Ala Asp Leu Ile Ala Asp Phe Phe Glu Arg Cys
740 745 750
Lys Thr Asp Pro Gly Glu Trp Asp Gly Leu Ser Lys Ala Gly Leu Glu
755 760 765
Arg Ile Tyr Ser Lys Phe Thr Trp Glu Ile Tyr Ala Glu Arg Leu Met
770 775 780
Thr Leu Ser Arg Val Tyr Thr Phe Trp Lys Phe Val Ser Asn Leu Glu
785 790 795 800
Arg Arg Glu Ala Arg Arg Tyr Ile Glu Met Phe Tyr Asn Leu Lys Tyr
805 810 815
Arg Gln Cys Val Lys Thr Val Pro Leu Ala Val Glu
820 825

Claims (10)

1.一种蔗糖合成酶，其特征在于，所述蔗糖合成酶来源于微芒藻（Micractinium Conductrix） 。
2.编码来源于微芒藻的蔗糖合成酶的核苷酸序列，所述序列如SEQ No.1所示。
3.一种重组载体，其携带编码所述蔗糖合成酶的核苷酸序列SEQ No.1。
4.权利要求1所述蔗糖合成酶在酶法催化糖基化反应中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)、构建工程菌：克隆UDP-糖基转移酶基因与蔗糖合成酶基因，构建双酶共表达或分别表达的载体，并转移到宿主菌中，获得UDP-糖基转移酶和/或蔗糖合成酶的工程菌，所述蔗糖合成酶基因序列如SEQ No.1所示；
2）、制备糖基化产物：将构建好的工程菌发酵产酶，发酵得到的菌体超声破碎或高压破碎，获得UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的粗酶液；
3）、将粗酶液、糖基化底物、蔗糖在转化体系中进行糖基化反应； UDP-糖基转移酶催化底物进行转化反应制备得到糖基化产物；蔗糖合成酶将该过程生成的UDP催化生成UDP-葡萄糖作为糖基供体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述糖基化底物包括但不限于甜菊糖苷类、槲皮素、姜黄素或者人参皂苷。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或者谷氨酸棒杆菌。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述糖基化底物的初始反应浓度为1-20g/L，蔗糖与糖基化底物的质量比为1-200，粗酶液在反应体系中的总蛋白浓度为2-10 mg/mL。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转化反应采用水相或双相体系，粗酶液在pH6-8的缓冲溶液中进行生物转化。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转化反应的反应温度为20-50℃，反应时间为1-40h。
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