CN105358705A - 用于在原核细胞中重组生产多肽的方法 - Google Patents

用于在原核细胞中重组生产多肽的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105358705A
CN105358705A CN201480038515.9A CN201480038515A CN105358705A CN 105358705 A CN105358705 A CN 105358705A CN 201480038515 A CN201480038515 A CN 201480038515A CN 105358705 A CN105358705 A CN 105358705A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
intestinal bacteria
nadh dehydrogenase
defect
ndh
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480038515.9A
Other languages
English (en)
Inventor
C·尚茨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN105358705A publication Critical patent/CN105358705A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/99—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with other acceptors (1.6.99)
    • C12Y106/99003—NADH dehydrogenase (1.6.99.3)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本申请公开用于在大肠杆菌中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：i)培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌，和ii)从细胞或培养基中回收多肽。

Description

用于在原核细胞中重组生产多肽的方法
技术领域
本发明公开通过敲除NADH脱氢酶II基因(ndh-基因)而遗传修饰的原核细胞和其在生产多肽中的用途。
背景技术
近年来蛋白质生产稳步增长，在不久的将来蛋白质可能成为可用于治疗各种疾病的疗法中的最大组。蛋白质的影响来自于其特异性，如其特异的靶标识别和结合功能。
在发酵方法中使用细胞培养物生产物质，特别是生产蛋白质。有两种不同的方法，其一是细胞培养物未被遗传修饰而形成其自身代谢产物的方法，另一是生物体被遗传修饰从而或者生产更为大量的自身物质如蛋白质或者生产外源(异源)物质。为产生物质的生物体提供营养培养基，其保证了生物体的存活并使其能生产所需的目标化合物。众多用于这些目的培养基是公知的，其允许特定宿主的最佳培养。
Riesenberg(Riesenberg,D.,等人,Curr.Opin.Biotechnol.2(1991)380-384)和Horn(Horn,U.,等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.46(1996)524-532)报道了大肠杆菌的高细胞密度培养。Riesenberg,D.和Guthke,R.(Appl.Microbiol.Biotechnol.51(1999)422-430)报道了微生物的高细胞密度培养。Shiloach,J.和Fass,R.(Biotechnol.Advances23(2005)345-357)对培养大肠杆菌到高细胞密度进行了综述。
Calhoun等人(J.Bacteriol.175(1993)3020-3025)报道了大肠杆菌的能效——在需氧呼吸链组分中突变的影响。Melo等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.68(2004)603-616)报道了对II型NAD(P)H：醌氧化还原酶的新见解。Yun等人(J.Appl.Microbiol.99(2005)1404-1412)报道了在NADH脱氢酶缺陷大肠杆菌的adhE或pta-ackA突变体中乳酸和琥珀酸形成的增强。
Trinh等人(Met.Eng.8(2006)628)报道了最高效的生物质生产大肠杆菌细菌的设计、构建和性能。
发明内容
已发现，通过缺失/失活编码酶NADH脱氢酶Ⅱ的ndh-基因，可获得遗传修饰的原核生物，相对于除ndh-基因外同基因的亲代菌株，其具有相当的摄氧率、相当的生长率、但增加的生产力(productivity)。因此，已发现，通过ndh-基因的缺失/失活，可以增加原核生物的比生产力。
如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)。
如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，
和其中所述多肽不是酶。
如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，
且其中所述多肽不是呼吸链途径酶或由抗生素抗性诱导基因编码的多肽。
如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，
和其中所述多肽不是NADH脱氢酶、SoxM型氧化酶、Sox型氧化酶、细胞色素bd型氧化酶、细胞色素bo型氧化酶或由抗生素抗性诱导基因编码的任何多肽。
如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，
和其中所述原核细胞具有基因型thi-1、ndh、pyrF、acnA、aceA、icd,其中acnA基因编码的多肽包含S68G突变，aceA基因编码的多肽包含S522G突变，和icd基因编码的多肽包含D398E和D410E突变。
如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，
和其中所述多肽是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白-毒素缀合物、免疫球蛋白片段-毒素缀合物、毒素、细胞因子或激素。
如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，
和其中所述多肽不是酶。
如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，
且其中所述多肽不是呼吸链途径酶或由抗生素抗性诱导基因编码的多肽。
如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，
和其中所述多肽不是NADH脱氢酶、SoxM型氧化酶、Sox型氧化酶、细胞色素bd型氧化酶、细胞色素bo型氧化酶或由抗生素抗性诱导基因编码的任何多肽。
如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，
和其中所述原核细胞具有基因型thi-1、ndh、pyrF、acnA、aceA、icd,其中acnA基因编码的多肽包含S68G突变，aceA基因编码的多肽包含S522G突变，和icd基因编码的多肽包含D398E和D410E突变。
如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的原核细胞(即培养包含编码多肽的核酸的细胞)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的(即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能拷贝)，
和其中所述多肽是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白-毒素缀合物、免疫球蛋白片段-毒素缀合物、毒素、细胞因子或激素。
ndh-基因的产物是NADH脱氢酶II。
在一个实施方案中，原核细胞进一步是bd-型氧化酶缺陷的。
在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。在一个实施方案中，大肠杆菌是大肠杆菌K12。
在一个实施方案中，所述方法是一种高细胞密度培养。
在一个实施方案中，ndh-基因(NADH脱氢酶Ⅱ)缺陷的原核细胞，与除具有功能性ndh-基因(NADH脱氢酶Ⅱ)外相同基因型的原核细胞比较时，具有相当的摄氧率(OUR)。即，ndh-缺陷细胞和参照细胞之间的唯一遗传差异是ndh-缺陷。
在一个实施方案中，ndh-基因(NADH脱氢酶II)缺陷的原核细胞，与除具有功能性ndh-基因(NADH脱氢酶Ⅱ)外相同基因型的原核细胞比较时，具有相当的生长率。
在一个实施方案中，ndh-基因(NADH脱氢酶II)缺陷的原核细胞，与除具有功能性ndh-基因(NADH脱氢酶Ⅱ)外相同基因型的原核细胞比较时，具有更高的生产率。在一个实施方案中，生产率是比生产率。
在一个实施方案中，该方法包括培养步骤之后的以下步骤：
-在40℃或以上的温度下孵育包含细胞的培养基至少10分钟，和
-从细胞和/或培养基中回收不溶性多肽，由此生产多肽。
在一个实施方案中，孵育在40℃和60℃之间的温度下进行。
在一个实施方案中，孵育在45℃或以上的温度下进行。在一个实施方案中，孵育在约45℃的温度下进行。
在一个实施方案中，孵育进行10分钟至180分钟。
如本文所报道的一个方面是用于在大肠杆菌中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌(即培养包含编码多肽的核酸的NADH脱氢酶II缺陷性大肠杆菌)，和
-从细胞或培养基中回收多肽。
如本文所报道的一个方面是用于在大肠杆菌中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌(即培养包含编码多肽的核酸的NADH脱氢酶II缺陷性大肠杆菌)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
和其中所述多肽不是酶。
如本文所报道的一个方面是用于在大肠杆菌中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌(即培养包含编码多肽的核酸的NADH脱氢酶II缺陷性大肠杆菌)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
和其中所述多肽不是呼吸链途径酶或由抗生素抗性诱导基因编码的多肽。
如本文所报道的一个方面是用于在大肠杆菌中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌(即培养包含编码多肽的核酸的NADH脱氢酶II缺陷性大肠杆菌)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
和其中所述多肽不是NADH脱氢酶、SoxM型氧化酶、Sox型氧化酶、细胞色素bd型氧化酶、细胞色素bo型氧化酶或由抗生素抗性诱导基因编码的任何多肽。
如本文所报道的一个方面是用于在大肠杆菌中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌(即培养包含编码多肽的核酸的NADH脱氢酶II缺陷性大肠杆菌)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
和其中所述NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有基因型thi-1、ndh、pyrF、acnA、aceA、icd,其中acnA基因编码的多肽包含S68G突变，aceA基因编码的多肽包含S522G突变，icd基因编码的多肽包含D398E和D410E突变。
如本文所报道的一个方面是用于在大肠杆菌中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌(即培养包含编码多肽的核酸的NADH脱氢酶II缺陷性大肠杆菌)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
和其中所述多肽是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白-毒素缀合物、免疫球蛋白片段-毒素缀合物、毒素、细胞因子或激素。
如本文所报道的一个方面是用于在大肠杆菌中生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌(即培养包含编码多肽的核酸的NADH脱氢酶II缺陷性大肠杆菌)，和
-从细胞或培养基中回收多肽。
如本文所报道的一个方面是用于在大肠杆菌中生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌(即培养包含编码多肽的核酸的NADH脱氢酶II缺陷性大肠杆菌)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
和其中所述多肽不是酶。
如本文所报道的一个方面是用于在大肠杆菌中生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌(即培养包含编码多肽的核酸的NADH脱氢酶II缺陷性大肠杆菌)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
和其中所述多肽不是呼吸链途径酶或由抗生素抗性诱导基因编码的多肽。
如本文所报道的一个方面是用于在大肠杆菌中生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌(即培养包含编码多肽的核酸的NADH脱氢酶II缺陷性大肠杆菌)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
和其中所述多肽不是NADH脱氢酶、SoxM型氧化酶、Sox型氧化酶、细胞色素bd型氧化酶、细胞色素bo型氧化酶或由抗生素抗性诱导基因编码的任何多肽。
如本文所报道的一个方面是用于在大肠杆菌中生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌(即培养包含编码多肽的核酸的NADH脱氢酶II缺陷性大肠杆菌)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
和其中所述NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有基因型thi-1、ndh、pyrF、acnA、aceA、icd,其中acnA基因编码的多肽包含S68G突变，aceA基因编码的多肽包含S522G突变，icd基因编码的多肽包含D398E和D410E突变。
如本文所报道的一个方面是用于在大肠杆菌中生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌(即培养包含编码多肽的核酸的NADH脱氢酶II缺陷性大肠杆菌)，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
和其中所述多肽是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白-毒素缀合物、免疫球蛋白片段-毒素缀合物、毒素、细胞因子或激素。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌，与除具有功能性NADH脱氢酶Ⅱ外相同基因型的大肠杆菌比较，具有相当的摄氧率。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌，与除具有功能性NADH脱氢酶Ⅱ外相同基因型的大肠杆菌比较，具有相当的生长率。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌，与除具有功能性NADH脱氢酶Ⅱ外相同基因型的大肠杆菌比较，具有更高的生产率。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌进一步是bd-型氧化酶缺陷的。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌是大肠杆菌K12。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有基因型thi-1、ndh、pyrF。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有基因型thi-1、ndh、pyrF、acnA、aceA、icd。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有基因型thi-1、ndh、pyrF、acnA、aceA、icd，其中acnA基因编码的多肽包含S68G突变，aceA基因编码的多肽包含S522G突变，icd基因编码的多肽包含D398E和D410E突变。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有功能性Zwf基因。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有功能性ldhA基因。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有功能性maeA基因。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有功能性maeB基因。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有功能性Zwf基因、功能性ldhA基因、功能性maeA基因和功能性maeB基因。
在一个实施方案中，该方法包括培养步骤之后的以下步骤：
-在40℃或以上的温度下孵育包含细胞的培养基至少10分钟，和
-从细胞和/或培养基中回收不溶性多肽，由此生产多肽。
在一个实施方案中，孵育在40℃和60℃之间的温度下进行。
在一个实施方案中，孵育在45℃或以上的温度下进行。在一个实施方案中，孵育在约45℃的温度下进行。
在一个实施方案中，孵育进行10分钟至180分钟。
如本文所报道的一个方面是具有基因型thi-1、ndh的大肠杆菌K12。
如本文所报道的一个方面是大肠杆菌K12，其具有基因型thi-1、ndh、pyrF、acnA、aceA、icd，其中acnA基因编码的多肽包含S68G突变，aceA基因编码的多肽包含S522G突变，icd基因编码的多肽包含D398E和D410E突变。
如本文所报道的一个方面是NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌在生产重组多肽中的用途。
如本文所报道的一个方面是NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌在生产多肽中的用途。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有基因型ndh、thi-1、pyrF。在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有基因型thi-1、ndh、pyrF、acnA、aceA、icd。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有基因型thi-1、ndh、pyrF、acnA、aceA、icd，其中acnA基因编码的多肽包含S68G突变，aceA基因编码的多肽包含S522G突变，icd基因编码的多肽包含D398E和D410E突变。
在一个实施方案中，NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌进一步是bd-型氧化酶缺陷的。
发明详述
本文报道了用于(重组)生产多肽的方法，该方法使用ndh-基因缺陷的原核细胞，其中，由于ndh-基因缺陷，i)与除了ndh-基因缺陷外同基因的亲代原核细胞比较，摄氧率和生长率是相当的，和ii)与除了ndh-基因缺陷外同基因的亲代原核细胞比较，比生产率增加。
在一个实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌属(Escherichia)细胞、或芽孢杆菌属(Bacillus)细胞、或乳杆菌属(Lactobacillus)细胞、或棒状杆菌属(Corynebacterium)细胞，或酵母细胞(酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)或毕赤酵母属(Pichia))。在进一步的实施方案中，细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞、或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞、或嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)细胞、或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium)细胞、或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞。
在一个实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌K12细胞或大肠杆菌B细胞。
在一个实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌K12细胞，其具有基因型：thi-1、ompT、pyrF、acnA、aceA、icd(亲代菌株)和基因型：thi-1、ompT、pyrF、ndh、acnA、aceA、icd(修饰菌株)，其中acnA基因编码的多肽包含S68G突变，aceA基因编码的多肽包含S522G突变，icd基因编码的多肽包含D398E和D410E突变。此外，亲代和修饰的菌株缺少以下e14噬菌体基因：ymfD,ymfE,lit,intE,xisE,ymfI,ymfJ,cohE,croE,ymfL,ymfM,owe,ymfR,bee,jayE,ymfQ,stfP,tfaP,tfaE,stfE,pinE,mcrA。
培养原核细胞的方法是本领域技术人员已知的(例如见Riesenberg,D.,等人,Curr.Opin.Biotechnol.2(1991)380-384)。可使用任何方法进行培养。在一个实施方案中，培养是分批培养、补料分批培养、灌流培养(perfusioncultivating)、半连续培养、或具有全部或部分细胞保留的培养。
在一个实施方案中，培养是高细胞密度培养。术语“高细胞密度培养”表示一种培养方法，其中，在培养中的一个点上培养的原核细胞的干细胞重量是至少10g/L。在一个实施方案中，在培养中的一个点上干细胞重量是至少20g/L，或至少50g/L，或至少100g/L，或100g/L以上。为了达到这样的高细胞密度状态，培养过程中添加的补料和/或调整溶液的体积必须尽可能小。测定干细胞重量的方法报道于，例如Riesenberg,D.,等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.34(1990)77-82中。
术语“亲代细胞”表示与缺陷细胞具有相同基因型的细胞，只是缺陷细胞中缺陷的基因在亲代细胞中是功能性的。因此，亲代细胞和缺陷细胞除缺陷基因外是同基因的。
术语“功能性ndh-基因”表示该ndh-基因可以被转录和翻译，并且基因产物，即NADH脱氢酶II，具有功能性和酶活性。
所生产的多肽可以是任何生物活性多肽。
术语“生物活性多肽”表示有机分子，例如生物大分子如肽，蛋白质，糖蛋白，核蛋白，黏蛋白，脂蛋白，合成多肽或蛋白，当施用于或施用至人工生物系统，如使用细胞系和病毒的生物测定系统，或施用于动物体内，包括但不限于鸟或哺乳动物(包括人)时，其导致生物效应。这种生物效应可以是但不限于，酶抑制或激活，结合受体或配体，在结合位点或者周围，信号触发或信号调节。生物活性分子是但不限于，例如免疫球蛋白、或激素、或细胞因子、或生长因子、或受体配体、或激动剂或拮抗剂、或细胞毒性剂、或抗病毒剂、或显像剂、或酶抑制剂、酶激活剂或酶活性调节剂，如变构物质。在一个实施方案中，多肽是免疫球蛋白、免疫球蛋白缀合物、或免疫球蛋白片段。
“多肽”是由肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论是天然产生的或合成的。如本文所定义的，多肽由10个或更多个氨基酸组成。多肽还可以包括非天然存在的氨基酸残基和/或非氨基酸组分，如碳水化合物基团、金属离子、或羧酸酯。非氨基酸组分可以由表达该多肽的细胞添加，并且可根据细胞的类型而变化。多肽通过其氨基酸主链结构或编码其的核酸定义。诸如碳水化合物基团的添加物通常不具体指出，但可以存在。
术语“免疫球蛋白”是指，由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及各种各样的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以多种形式存在，包括例如，Fv片段、Fab片段和F(ab)2片段以及单链片段(scFV)或双抗体(diabody)(参见例如，Huston,J.S.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)5879-5883；Bird,R.E.,等人,Science242(1988)423-426；一般而言,Hood等人,Immunology,BenjaminN.Y.,第二版(1984)；和Hunkapiller,T.及Hood,L.,Nature323(1986)15-16)。
一般而言，全长免疫球蛋白包含两个所谓的轻链多肽(轻链)和两个所谓的重链多肽(重链)。每个重链和轻链多肽包含可变结构域(可变区)(一般为多肽链的氨基端部分)，其包含能够与抗原相互作用的结合区。每个重链和轻链多肽包含恒定区(一般为羧基端部分)。重链的恒定区介导抗体结合i)带有Fcγ受体(FcγR)的细胞，如吞噬细胞，或ii)带有新生儿Fc受体(FcRn)(也被称为Brambell受体)的细胞。其也介导结合一些因子，包括经典补体系统的因子如组分(C1q)。
免疫球蛋白轻或重链的可变结构域依次包含不同的区段，即4个构架区(FR)和三个高变区(CDR)。
在一个实施方案中，生物活性多肽是免疫球蛋白片段。
术语“免疫球蛋白片段”表示全长免疫球蛋白的一部分，在一个实施方案中，表示其可变结构域或至少其抗原结合部分。免疫球蛋白片段保留亲代全长免疫球蛋白相对于其抗原的结合特征。免疫球蛋白片段的实例是例如单链抗体分子(scFv)、Fab、F(ab)2片段等，只要它们保留了亲代全长免疫球蛋白的结合特征即可。
在一个实施方案中，多肽是毒素。在一个实施方案中，多肽是免疫球蛋白-毒素缀合物。在一个实施方案中，多肽是免疫球蛋白片段-毒素缀合物。在一个实施方案中，多肽是激素。在一个实施方案中，多肽是细胞因子。
生产科学家的目的是增加重组多肽生产的产率。
使用改进的培养基组成及培养技术可以实现的生产产率增加会在将来的某个时候到头。因而，生产细胞系和株的代谢工程化将变得更为重要。
已知多种方法用于在原核生物中靶向失活基因。一个例子是Red/ET重组方法。在该方法中，通过噬菌体来源多肽介导的同源重组，修饰(即取代和缺失)靶核酸。
术语“呼吸链”或“呼吸链酶”(参与呼吸链的酶)是本领域技术人员已知的，描述在如Berg,JM等人.(Biochemistry,第5版,2002)。示例的呼吸链酶是如NADH脱氢酶、Sox型氧化酶(如SoxM型氧化酶或SoxB型氧化酶)、细胞色素bd型氧化酶或细胞色素bo型氧化酶。
NADH脱氢酶II(由ndh-基因编码)参与电子从NADH转移进入呼吸链。该转移经由醌池与质子梯度偶联，并平行使用bo型和bd型氧化酶用于电子到氧的最终转移。
NADH脱氢酶II有一个“姐妹”酶，NADH脱氢酶I。NADH脱氢酶I和II的活性在不同程度上取决于质子梯度，导致不同的H+/e-比。
已发现，通过失活ndh-基因，可以提高大肠杆菌细胞的(比)生产率，其中，令人惊讶地，摄氧率和生长率保持与亲代大肠杆菌细胞相当，其中亲代大肠杆菌细胞与ndh-缺陷大肠杆菌除ndh-基因外是同基因的。
已发现，(基因型1的)大肠杆菌细胞中ndh-基因的失活——导致ndh-缺陷性(NADH脱氢酶II-缺陷性)修饰的大肠杆菌细胞(基因型1Δndh)——对大肠杆菌细胞的(比)生产率有显著的影响，其中与亲代大肠杆菌细胞相比，(比)生产率增加。同时摄氧率和生长率在修饰大肠杆菌细胞和亲代大肠杆菌细胞之间是相当的。
术语“相当”表示，两个值彼此在50％以内。在一个实施方案中两个值彼此在30％以内。在一个实施方案中两个值彼此在10％以内。例如，当第二值不超过第一值50％以上，即不大于第一值的150％，并且当第二值不小于第一值的50％时，则两个值彼此在50％以内并由此是相当的，即，“相当”是指第二值在第一值的50％至150％之间。
ndh-基因缺失/失活导致ndh-缺陷细胞(基因型Δndh)。
在图1中可以看出，亲代大肠杆菌和修饰的大肠杆菌在相当的时间内生长至相当的细胞密度。因此，(相对于亲代大肠杆菌)，ndh-基因的缺失/失活对修饰大肠杆菌的生长特性没有负面影响。
在图2中可以看出，亲代大肠杆菌和修饰的大肠杆菌在培养期间具有相当的摄氧率。因此，(相对于亲代大肠杆菌)，ndh-基因的缺失/失活对修饰大肠杆菌的需氧量没有影响。
在图3中可以看出，修饰的大肠杆菌具有较高的(比)生产率，导致比亲代大肠杆菌更高的产物浓度。因此，ndh-基因的缺失/失活对修饰大肠杆菌的生产率具有积极作用。
附图说明
图1：亲代大肠杆菌(实心菱形，基因型1)和修饰大肠杆菌(实心方形，基因型1Δndh)的生长特性。
图2：在20小时培养时间确定的亲代大肠杆菌(下曲线，基因型1)和修饰大肠杆菌(上曲线，基因型1Δndh)的摄氧率。
图3：亲代大肠杆菌(实心菱形，基因型1)和修饰大肠杆菌(实心方形，基因型1Δndh)的生产率。
提供以下实施例和附图以帮助理解本发明，本发明真正的范围陈述在所附的权利要求书中。应该理解，可以对述及的步骤进行修改而不偏离本发明的精神实质。
实施例1
制备和描述大肠杆菌表达质粒
用重组方法制备缩短的四连蛋白(tetranectin)-载脂蛋白A-I融合蛋白。表达的融合蛋白具有N-至C-末端方向的氨基酸序列SEQIDNO：01：
PIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEXAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ.
用已知的重组方法和技术通过连接适当的核酸区段组装编码的融合基因。通过化学合成生成的核酸序列由DNA测序进行验证。用于生产SEQIDNO：01的融合蛋白的表达质粒可以如下制备：
质粒1(1-pBRori-URA3-LACI-SAC)是用于在大肠杆菌中表达核心链霉亲和素(core-streptavidin)的表达质粒。其通过连接来源于质粒2(2-pBRori-URA3-LACI-T-重复；报道在EP-B1422237中)的3142bp长的EcoRI/CelII-载体片段和435bp长的核心链霉亲和素编码EcoRI/CelII片段而生成。
该核心链霉亲和素大肠杆菌表达质粒包含下列元件：
-来自载体pBR322的复制起点，用于大肠杆菌中的复制(根据Sutcliffe,G.,等人.,Quant.Biol.43(1979)77-90，对应于bp位置2517-3160)，
-酿酒酵母的URA3基因，其编码乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶(Rose,M.,等人.,Gene29(1984)113-124)，其使得可以通过大肠杆菌pyrF突变株(尿嘧啶营养缺陷)的互补来实现质粒选择，
-核心链霉亲和素表达盒包含
-T5杂合启动子(根据Bujard,H.,等人.,Methods.Enzymol.155(1987)416-433和Stueber,D.,等人.,Immunol.MethodsIV(1990)121-152，T5-PN25/03/04杂合启动子)，包括根据Stueber,D.,等人.(见前)的合成核糖体结合位点，
-核心链霉亲和素基因，
-两个噬菌体来源的转录终止子中，λ-T0终止子(Schwarz,E.,等人.,Nature272(1978)410-414)和fd-终止子(Beck,E.andZink,B.,Gene1-3(1981)35-58)，
-来自大肠杆菌的lacI阻遏基因(Farabaugh,P.J.,Nature274(1978)765-769)。
对于表达缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的最终表达质粒可以通过如下制备：使用单侧翼EcoRI和CelII限制性内切酶切割位点从质粒1切出核心链霉亲和素结构基因，将侧翼为EcoRII/CelII限制性位点的编码融合蛋白的核酸插入3142bp长的EcoRI/CelII-1质粒片段中。
实施例2
亲代菌株和ndh-缺失突变菌株在表达重组多肽中的比较
为了评价染色体ndh基因缺失对在高细胞密度和高收率发酵中表达重组蛋白质的大肠杆菌菌株性能的影响，在相同的方法中比较了亲代菌株和修饰菌株，探讨了生长和产物形成。
大肠杆菌K12亲代菌株(基因型：thi-1，ΔompT，ΔpyrF，acnA，aceA，icd)和修饰菌株(基因型：thi-1，ΔompT，ΔpyrF，Δndh，acnA，aceA，icd)通过电穿孔转化了如实施例1中所述的最终表达质粒，以表达TN-ApoA1融合多肽。这里，acnA基因编码的多肽包含S68G突变，aceA基因编码的多肽包含S522G突变，icd基因编码的多肽包含D398E和D410E突变。此外，亲代和修饰菌株缺少以下e14原噬菌体基因：ymfD,ymfE,lit,intE,xisE,ymfI,ymfJ,cohE,croE,ymfL,ymfM,owe,ymfR,bee,jayE,ymfQ,stfP,tfaP,tfaE,stfE,pinE,mcrA。转化的大肠杆菌细胞首先在37℃下在琼脂平板上生长。将从该平板挑取的菌落转移到3mL滚动培养物中并37℃生长至光密度1-2(在578nm测量)。然后将1000μL培养物与1000μL无菌86％-甘油混合，并立即冷冻在-80℃下长期贮存。在将克隆转移到10L发酵罐中之前。首先在小规模摇瓶实验中验证并在SDS-Page中分析该克隆的正确产物表达。
在化学组成明确的培养基(CDM)中的预培养：
为了进行预发酵，使用化学组分明确的培养基：
NH4Cl1.0g/L，K2HPO4*3H2O18.3g/L，柠檬酸1.6g/L，甘氨酸0.78g/L，L-丙氨酸0.29g/L，L-精氨酸0.41g/L，L-天冬酰胺*H2O0.37g/L，L-天门冬氨酸0.05g/L，L-半胱氨酸*HCl*H2O0.05g/L，L-组氨酸0.05g/L，L-异亮氨酸0.31g/L，L-亮氨酸0.38g/L，L-赖氨酸*HCl0.40g/L，L-蛋氨酸0.27g/L，L-苯丙氨酸0.43g/L，L-脯氨酸0.36g/L，L-丝氨酸0.15g/L，L-苏氨酸0.40g/L，L-色氨酸0.07g/L，L-缬氨酸0.33g/L，L-酪氨酸0.51g/L，L-谷氨酰胺0.12g/L，Na-L-谷氨酸*H2O0.82g/L，葡萄糖*H2O6.0g/L，微量元素溶液0.5mL/L，MgSO4*7H2O0.86g/L，硫胺素*HCl17.5mg/L。微量元素溶液含有FeSO4*7H2O10.0g/L，ZnSO4*7H2O2.25g/L，MnSO4*H2O2.13g/L，H3BO30.50g/L，(NH4)6Mo7O24*4H2O0.3g/L，CoCl2*6H2O0.42g/L，CuSO4*5H2O1.0g/L溶解在0.5MHCl中。
对于预发酵，自初级种子库安瓿取0.9ml接种在具有四个挡板的1000ml锥形烧瓶中的300mlCDM-培养基。在旋转摇床上在32℃和170rpm培养8小时。
发酵方法(AP30#021和AP50#001)：
对于在10LBiostatC，DCU3发酵罐(Sartorius,Melsungen,Germany)中发酵，使用以下分批培养基：KH2PO41.58g/L，(NH4)2HPO47.47g/L，K2HPO4*3H2O13.32g/L，柠檬酸2.07g/L，L-蛋氨酸1.22g/L，NaHCO30.82g/L，微量元素溶液7.3mL/L，MgSO4*7H2O0.99g/L，硫胺素*HCl20.9mg/L，葡萄糖·H2O29.3g/L，生物素0.2mg/L，1.2mL/LSynperonic10％消泡剂。微量元素溶液含有FeSO4*7H2O10g/L，ZnSO4*7H2O2.25g/L，MnSO4*H2O2.13g/L，CuSO4*5H2O1.0g/L，CoCl2*6H2O0.42g/L，(NH4)6Mo7O24*4H2O0.3g/L，H3BO30.50g/L，溶解在0.5MHCl溶液中。
补料1溶液含有700g/L葡萄糖*H2O，7.4g/LMgSO4*7H2O和0.1g/LFeSO4*7H2O。补料2含有KH2PO452.7g/L，KH2PO4*3H2O139.9g/L和(NH4)2HPO466.0g/L。所有成分溶解于去离子水。用于pH调节的碱溶液是补充11.25g/LL-蛋氨酸的12.5％(w/v)NH3水溶液。
以4.2L无菌分批培养基开始，在31℃、pH6.9±0.2、800mbar排气回压(backpressure)和10L/min初始通气率下，进行分批发酵。整个发酵中通过增加搅拌器速度高达1500rpm，使溶解氧(pO2)的相对值保持在50％。最初补充的葡萄糖耗竭(由陡然增加的溶解氧值指示)后，温度转换至25℃，并在15分钟后发酵进入补料-分批模式，以两个补料开始(分别为60和14g/h)。补料2的速率保持恒定，补料1的速率以7小时内从60至最后的160g/h的预定补料曲线逐步增加。当二氧化碳废气浓度在2％以上时，通气速度在5小时内从10L/min不断增加至20L/min。在光密度约150时加入2.4gIPTG诱导重组四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的表达。
在发酵结束时，在收获之前使用加热步骤将发酵罐中的全部培养肉汤加热至50℃保持1小时(见例如EP-B1486571)，将细胞质中的可溶性表达的四连蛋白-载脂蛋白A-I转变为不溶性蛋白质聚集体，即所谓的包涵体。此后，将发酵罐的内容物用直流离心机(13,000rpm，13L/h)离心，将收获的生物质储存在-20℃直至进一步处理。合成的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白仅仅以不溶性蛋白质聚集体(即所谓的包涵体(IB))的形式存在于不溶性细胞碎片部分中。
分析产物形成：
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从发酵罐抽取的样本，样本之一是诱导之前抽取的样本，其它是在诱导蛋白质表达后在指定时间点抽取的样本。对于每个样本，相同量的细胞(OD目标＝5)悬浮于5mLPBS缓冲液，并在冰上通过超声处理破碎。然后分别离心100μL的各悬浮液(15000rpm，5分钟)，取各自的上清液并转移至单独的小瓶内。这是为了区分表达的可溶性和不溶性靶蛋白。向每个上清液(＝可溶性)级分加入300μLSDS样品缓冲液和向每个沉淀(＝不溶性)级分加入400μLSDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature227(1970)680-685)。样品在95℃下加热15分钟，剧烈搅拌以溶解和还原样品中的所有蛋白质。冷却到室温后，将5μL各样品转移至4-20％TGXCriterionStainFree聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)。此外，将5μL分子量标准品(PrecisionPlusProteinStandard,Bio-Rad)和3个量(0.3μL，0.6μL和0.9μL)的具有已知产品蛋白质浓度(0.1μg/μL)的定量标准品加在凝胶上。
在200V进行电泳60分钟，然后将凝胶转移至GelDOCEZ显像仪(Bio-Rad)，用UV辐射处理5分钟。使用ImageLab分析软件(Bio-Rad)分析凝胶图像。使用所述三个标准品，计算线性回归曲线，系数>0.99，计算原始样品中靶蛋白的浓度。
结果：
使用上述发酵方法，在亲代菌株和在代表ndh缺失突变的修饰菌株中表达缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。尽管修饰菌株预培养物的光密度较低，但是两种菌株的生长是相当的。47小时培养和连续加热步骤后获得285和245的光密度。
根据Calhoun等人(J.Bacteriol.175(1993)3020-3025)的描述，ndh表达的修饰应导致摄氧率(OUR)降低。令人惊奇的是，在本实验中在相同的培养条件下修饰菌株具有与亲代菌株几乎相当的OUR。在补料发酵阶段的第一段时间，修饰菌株的OUR甚至比亲代菌株更高。
在两次尝试中通过在光密度约150时加入2.4gIPTG诱导了产物形成。
尽管两个菌株在相同的化学组分明确的培养基中在相同条件下培养，但亲代菌株的产物形成率显著较低，因此，最终产率只达到27.5g/L。与其相比，修饰菌株具有显著较高的产物形成率。当仅看与亲代菌株直接比较的生长和OUR数据时，这是不能预期的。使用ndh缺陷的修饰菌株，在仅培养38小时后，就生产了相同量的靶蛋白(27.8g/L)，并且与使用亲代菌株生产多肽TN-ApoA1时相比，该发酵可早10个小时终止。另外，用ndh缺陷的修饰菌株的培养在发酵结束和加热步骤之后产生了多8.4％(29.8g/L)的融合蛋白。亲代大肠杆菌菌株在与修饰菌株的直接比较中具有显著的不足。
总结：
尽管两个菌株在化学组分明确的培养基上的发酵中表现相同的生长，但ndh缺陷的修饰菌株在该方法的分批补料阶段具有意想不到的摄氧率增加和显著较高的产物形成率。因此可以提高最终产物产率。因为在这两个实验中唯一的区别是ndh缺陷的修饰菌株的ndh基因座修饰，因此该效果可以与其直接关联。因此，在高生产性大肠杆菌菌株中缺失ndh是有用的，其不降低OUR，但却提高生产力。

Claims (11)

1.一种用于在大肠杆菌中重组生产多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养表达多肽的NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌，和
-从细胞或培养基中回收多肽，
其中，该多肽不是呼吸链途径酶或由抗生素抗性诱导基因编码的多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，NADH脱氢酶Ⅱ缺陷的大肠杆菌，与除具有功能性NADH脱氢酶Ⅱ外相同基因型的大肠杆菌相比，具有相当的摄氧率。
3.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，NADH脱氢酶Ⅱ缺陷的大肠杆菌，与除具有功能性NADH脱氢酶Ⅱ外相同基因型的大肠杆菌相比，具有相当的生长率。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，NADH脱氢酶Ⅱ缺陷的大肠杆菌，与除具有功能性NADH脱氢酶Ⅱ外相同基因型的大肠杆菌相比，具有更高的生产率。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于NADH脱氢酶Ⅱ缺陷的大肠杆菌是大肠杆菌K12。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有基因型thi-1、Δndh、ΔpyrF。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌进一步地是bd型氧化酶缺陷的。
8.大肠杆菌K12，其具有基因型thi-1、Δndh、ΔpyrF。
9.NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌在生产重组多肽中的用途，其中，多肽不是呼吸链途径酶或由抗生素抗性诱导基因编码的多肽。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌具有基因型thi-1、Δndh、ΔpyrF。
11.根据权利要求9至10任一项所述的用途，其特征在于NADH脱氢酶II缺陷的大肠杆菌进一步地是bd型氧化酶缺陷的。
CN201480038515.9A 2013-07-31 2014-07-29 用于在原核细胞中重组生产多肽的方法 Pending CN105358705A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13178739.2 2013-07-31
EP13178739 2013-07-31
PCT/EP2014/066261 WO2015014829A1 (en) 2013-07-31 2014-07-29 Method for the recombinant production of a polypeptide in prokaryotic cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105358705A true CN105358705A (zh) 2016-02-24

Family

ID=48877159

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480038515.9A Pending CN105358705A (zh) 2013-07-31 2014-07-29 用于在原核细胞中重组生产多肽的方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20160319319A1 (zh)
EP (1) EP3027777A1 (zh)
JP (1) JP2016524925A (zh)
KR (1) KR20160034320A (zh)
CN (1) CN105358705A (zh)
BR (1) BR112015032141A2 (zh)
CA (1) CA2915944A1 (zh)
HK (1) HK1221742A1 (zh)
MX (1) MX2016001187A (zh)
RU (1) RU2016106950A (zh)
SG (1) SG11201600725WA (zh)
WO (1) WO2015014829A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024103025A1 (en) * 2022-11-11 2024-05-16 Rnaissance Ag Llc Fermentation based method for double stranded rna production

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1301306A (zh) * 1997-03-17 2001-06-27 诺沃挪第克公司 在呼吸缺陷型细胞中生产多肽的方法
CN1335401A (zh) * 2000-07-05 2002-02-13 味之素株式会社 利用微生物生产物质的方法
CN103025875A (zh) * 2010-08-30 2013-04-03 霍夫曼-拉罗奇有限公司 原核表达构建体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4551725B2 (ja) * 2004-09-13 2010-09-29 Ｏｋｉセミコンダクタ株式会社 半導体装置の製造方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1301306A (zh) * 1997-03-17 2001-06-27 诺沃挪第克公司 在呼吸缺陷型细胞中生产多肽的方法
CN1335401A (zh) * 2000-07-05 2002-02-13 味之素株式会社 利用微生物生产物质的方法
CN103025875A (zh) * 2010-08-30 2013-04-03 霍夫曼-拉罗奇有限公司 原核表达构建体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAJ FRANK JENSEN: "The Escherichia coli K-12 "Wild Types" W3110 and MG1655 Have an rph Frameshift Mutation That Leads to Pyrimidine Starvation Due to Low pyrE Expression Levels", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
陈宏文 等: "工业微生物还原型辅酶Ⅱ的代谢调控研究进展", 《化工进展》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016524925A (ja) 2016-08-22
EP3027777A1 (en) 2016-06-08
KR20160034320A (ko) 2016-03-29
RU2016106950A (ru) 2017-09-04
WO2015014829A1 (en) 2015-02-05
US20160319319A1 (en) 2016-11-03
MX2016001187A (es) 2016-04-29
BR112015032141A2 (pt) 2017-08-29
CA2915944A1 (en) 2015-02-05
HK1221742A1 (zh) 2017-06-09
SG11201600725WA (en) 2016-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Schmidt Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry
CN1238490C (zh) 用于将木糖发酵为乙醇的稳定的重组酵母
CN1922326B (zh) 2μm家族质粒及其用途
CN101679992A (zh) 酵母菌表达系统
EP2256194A1 (en) Flocculent yeast and method for production thereof
CN113683667B (zh) Yh66-rs10865基因改造得到的工程菌及其在制备缬氨酸中的应用
CN115807023B (zh) 一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的分子伴侣及其组合
CN109666617B (zh) 一种l-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用
CN115806929A (zh) 一种生产l-精氨酸的基因工程菌及其应用
CN113817762B (zh) 一种产戊二胺的重组大肠杆菌及其应用
US10329592B2 (en) Signal peptide, L-glutamic acid synthesized using konjac flour and methods of using same
CN112375726B (zh) 一种生产l-高丝氨酸的基因工程菌及其应用
Kunze et al. Hansenula polymorpha (Pichia angusta): biology and applications
CN110846333B (zh) 一种deoB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用
CN105358705A (zh) 用于在原核细胞中重组生产多肽的方法
CN114854660A (zh) 一种高产麦角硫因的基因工程菌
JP2007517519A (ja) 組み換えタンパク質生産用タンパク質融合因子の超高速選別方法及びこれによって選別されたタンパク質融合因子
Gupta et al. Strategies for enhancing product yield: design of experiments (DOE) for Escherichia coli cultivation
CN114369562B (zh) 一种提高5-氨基乙酰丙酸表达量的方法
JP5006325B2 (ja) 酸素によって調節される微生物
KR102253701B1 (ko) 하이브리드형 해당 경로
EP4001417A1 (en) Yeast platform for the production of vaccines
US10155970B2 (en) Use of an amino acid auxotrophy cured prokaryotic strain for the recombinant production of a polypeptide
CN115572717A (zh) L-苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用
CN117802020A (zh) 一种提高缬氨酸产量的工程菌、生物材料及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1221742

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160224

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1221742

Country of ref document: HK