JP2016524925A - 原核細胞におけるポリペプチドの組換え生産のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
近年、タンパク質の生産は着実に増加しており、タンパク質は、近い将来、様々な疾患の処置に利用可能な最大の治療薬群になる可能性が高い。タンパク質の効果は、特異的な標的認識および結合機能などの、その特異性から生じる。
‐該ポリペプチドを発現する原核細胞を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階)、および
‐該細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該原核細胞がndh遺伝子を欠損している(すなわち、該原核細胞がndh遺伝子の機能的なコピーを含まない/含有しない)、方法である。
‐該ポリペプチドを発現する原核細胞を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階)、および
‐該細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該原核細胞がndh遺伝子を欠損しており(すなわち、該原核細胞がndh遺伝子の機能的なコピーを含まず/含有せず)、
かつ、該ポリペプチドが酵素ではない、方法である。
‐該ポリペプチドを発現する原核細胞を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階)、および
‐該細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該原核細胞がndh遺伝子を欠損しており(すなわち、該原核細胞がndh遺伝子の機能的なコピーを含まず/含有せず)、
かつ、該ポリペプチドが、呼吸鎖経路酵素、または抗生物質耐性誘導遺伝子によってコードされるポリペプチドではない、方法である。
‐該ポリペプチドを発現する原核細胞を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階)、および
‐該細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該原核細胞がndh遺伝子を欠損しており(すなわち、該原核細胞がndh遺伝子の機能的なコピーを含まず/含有せず)、
かつ、該ポリペプチドが、NADHデヒドロゲナーゼ、SoxM型オキシダーゼ、Sox型オキシダーゼ、シトクロムbd型オキシダーゼ、シトクロムbo型オキシダーゼ、または抗生物質耐性誘導遺伝子によってコードされるいかなるポリペプチドでもない、方法である。
‐該ポリペプチドを発現する原核細胞を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階)、および
‐該細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該原核細胞がndh遺伝子を欠損しており(すなわち、該原核細胞がndh遺伝子の機能的なコピーを含まず/含有せず)、
かつ、該原核細胞が、遺伝子型thi-1、Δndh、ΔpyrF、acnA、aceA、icdを有し、該acnA遺伝子にコードされるポリペプチドがS68G変異を含み、該aceA遺伝子にコードされるポリペプチドがS522G変異を含み、該icd遺伝子にコードされるポリペプチドがD398EおよびD410E変異を含む、方法である。
‐該ポリペプチドを発現する原核細胞を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階)、および
‐該細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該原核細胞がndh遺伝子を欠損しており(すなわち、該原核細胞がndh遺伝子の機能的なコピーを含まず/含有せず)、
かつ、該ポリペプチドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、免疫グロブリン-毒素結合体、免疫グロブリン断片-毒素結合体、毒素、サイトカイン、またはホルモンである、方法である。
‐該ポリペプチドを発現する原核細胞を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階)、および
‐該細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該原核細胞がndh遺伝子を欠損しており(すなわち、該原核細胞がndh遺伝子の機能的なコピーを含まず/含有せず)、
かつ、該ポリペプチドが酵素ではない、方法である。
‐該ポリペプチドを発現する原核細胞を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階)、および
‐該細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該原核細胞がndh遺伝子を欠損しており(すなわち、該原核細胞がndh遺伝子の機能的なコピーを含まず/含有せず)、
かつ、該ポリペプチドが、呼吸鎖経路酵素、または抗生物質耐性誘導遺伝子によってコードされるポリペプチドではない、方法である。
‐該ポリペプチドを発現する原核細胞を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階)、および
‐該細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該原核細胞がndh遺伝子を欠損しており(すなわち、該原核細胞がndh遺伝子の機能的なコピーを含まず/含有せず)、
かつ、該ポリペプチドが、NADHデヒドロゲナーゼ、SoxM型オキシダーゼ、Sox型オキシダーゼ、シトクロムbd型オキシダーゼ、シトクロムbo型オキシダーゼ、または抗生物質耐性誘導遺伝子によってコードされるいかなるポリペプチドでもない、方法である。
‐該ポリペプチドを発現する原核細胞を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階)、および
‐該細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該原核細胞がndh遺伝子を欠損しており(すなわち、該原核細胞がndh遺伝子の機能的なコピーを含まず/含有せず)、
かつ、該原核細胞が、遺伝子型thi-1、Δndh、ΔpyrF、acnA、aceA、icdを有し、該acnA遺伝子にコードされるポリペプチドがS68G変異を含み、該aceA遺伝子にコードされるポリペプチドがS522G変異を含み、該icd遺伝子にコードされるポリペプチドがD398EおよびD410E変異を含む、方法である。
‐該ポリペプチドを発現する原核細胞を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階)、および
‐該細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該原核細胞がndh遺伝子を欠損しており(すなわち、該原核細胞がndh遺伝子の機能的なコピーを含まず/含有せず)、
かつ、該ポリペプチドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、免疫グロブリン-毒素結合体、免疫グロブリン断片-毒素結合体、毒素、サイトカイン、またはホルモンである、方法である。
‐細胞を含む培養培地を、40℃以上の温度で少なくとも10分間インキュベートする段階、ならびに
‐該細胞および/または該培養培地から不溶性ポリペプチドを回収し、それによりポリペプチドを生産する段階
を含む。
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含むNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階)、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含む、方法である。
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含むNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階)、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該ポリペプチドが酵素ではない、方法である。
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含むNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階)、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該ポリペプチドが、呼吸鎖経路酵素、または抗生物質耐性誘導遺伝子によってコードされるポリペプチドではない、方法である。
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含むNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階)、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該ポリペプチドが、NADHデヒドロゲナーゼ、SoxM型オキシダーゼ、Sox型オキシダーゼ、シトクロムbd型オキシダーゼ、シトクロムbo型オキシダーゼ、または抗生物質耐性誘導遺伝子によってコードされるいかなるポリペプチドでもない、方法である。
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含むNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階)、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該NADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌が、遺伝子型thi-1、Δndh、ΔpyrF、acnA
、aceA、icdを有し、該acnA遺伝子にコードされるポリペプチドがS68G変異を含み、該aceA遺伝子にコードされるポリペプチドがS522G変異を含み、該icd遺伝子にコードされるポリペプチドがD398EおよびD410E変異を含む、方法である。
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含むNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階)、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該ポリペプチドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、免疫グロブリン-毒素結合体、免疫グロブリン断片-毒素結合体、毒素、サイトカイン、またはホルモンである、方法である。
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含むNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階)、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含む、方法である。
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含むNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階)、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該ポリペプチドが酵素ではない、方法である。
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含むNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階)、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該ポリペプチドが、呼吸鎖経路酵素、または抗生物質耐性誘導遺伝子によってコードされるポリペプチドではない、方法である。
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含むNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階)、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該ポリペプチドが、NADHデヒドロゲナーゼ、SoxM型オキシダーゼ、Sox型オキシダーゼ、シトクロムbd型オキシダーゼ、シトクロムbo型オキシダーゼ、または抗生物質耐性誘導遺伝子によってコードされるいかなるポリペプチドでもない、方法である。
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含むNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階)、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該NADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌が、遺伝子型thi-1、Δndh、ΔpyrF、acnA、aceA、icdを有し、該acnA遺伝子にコードされるポリペプチドがS68G変異を含み、該aceA遺伝子にコードされるポリペプチドがS522G変異を含み、該icd遺伝子にコードされるポリペプチドがD398EおよびD410E変異を含む、方法である。
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階(すなわち、該ポリペプチドをコードする核酸を含むNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階)、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該ポリペプチドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、免疫グロブリン-毒素結合体、免疫グロブリン断片-毒素結合体、毒素、サイトカイン、またはホルモンである、方法である。
‐細胞を含む培養培地を、40℃以上の温度で少なくとも10分間インキュベートする段階、ならびに
‐該細胞および/または該培養培地から不溶性ポリペプチドを回収し、それにより該ポリペプチドを生産する段階
を含む。
本明細書において、ndh遺伝子を欠損しており、ndh遺伝子の欠損に起因して、i)酸素摂取速度および増殖速度が、ndh遺伝子の欠損を除いて同質遺伝子型である親原核細胞に匹敵しており、かつii)比生産速度が、ndh遺伝子の欠損を除いて同質遺伝子型である親原核細胞と比較して増大している、原核細胞を用いる、ポリペプチドの(組換え)生産のための方法を報告する。
大腸菌発現プラスミドの作製および説明
短縮型テトラネクチン-アポリポタンパク質A-I融合タンパク質を、組換え手段によって調製した。発現される融合タンパク質は、N末端からC末端の方向に、SEQ ID NO: 01のアミノ酸配列を有する。
‐大腸菌における複製のための、ベクターpBR322由来の複製開始点(Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90によると、2517〜3160 bp位に対応する)
‐大腸菌pyrF変異株(ウラシル栄養要求性)の相補によるプラスミド選択を可能にする、オロチジン5'-リン酸デカルボキシラーゼをコードするサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のURA3遺伝子(Rose, M., et al., Gene 29 (1984) 113-124)
‐以下を含むコア-ストレプトアビジン発現カセット
‐Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152による合成リボソーム結合部位を含む、T5ハイブリッドプロモーター(Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433およびStueber, D., et al.(上記参照)によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター)
‐コア-ストレプトアビジン遺伝子
‐2種のバクテリオファージ由来の転写ターミネーター、λ-T0ターミネーター(Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414)およびfdターミネーター(Beck, E. and Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58)
‐大腸菌由来のlacIリプレッサー遺伝子(Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769)
組換えポリペプチドを発現する際の、親株とndh欠損変異株との比較
高細胞密度および高収量発酵において、組換えタンパク質を発現する大腸菌株の性能に対する染色体ndh遺伝子欠失の効果を評定するために、親株を、同じ工程内で改変株と比較し、増殖および産物形成を調査した。
前発酵のために、既知組成培地を使用した:
NH4Cl 1.0 g/L、K2HPO4*3H2O 18.3 g/L、クエン酸1.6 g/L、グリシン0.78 g/L、L-アラニン0.29 g/L、L-アルギニン0.41 g/L、L-アスパラギン*H2O 0.37 g/L、L-アスパラギン酸0.05 g/L、L-システイン*HCl*H2O 0.05 g/L、L-ヒスチジン0.05 g/L、L-イソロイシン0.31 g/L、L-ロイシン0.38 g/L、L-リジン*HCl 0.40 g/L、L-メチオニン0.27 g/L、L-フェニルアラニン0.43 g/L、L-プロリン0.36 g/L、L-セリン0.15 g/L、L-スレオニン0.40 g/L、L-トリプトファン0.07 g/L、L-バリン0.33 g/L、L-チロシン0.51 g/L、L-グルタミン0.12 g/L、Na-L-グルタミン酸*H2O 0.82 g/L、グルコース*H2O 6.0 g/L、微量元素溶液0.5 ml/L、MgSO4*7H2O 0.86 g/L、チアミン*HCl 17.5 mg/L。微量元素溶液は、0.5M HCl中に溶解された、FeSO4*7H2O 10.0 g/L、ZnSO4*7H2O 2.25 g/L、MnSO4*H20 2.13 g/L、H3BO3 0.50 g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3 g/L、CoCl2*6H2O 0.42 g/L、CuSO4*5H20 1.0 g/Lを含有する。
一つは誘導前に、他のものはタンパク質発現の誘導後の所定の時点で、発酵槽から抜き取った試料を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析する。すべての試料から、同じ量の細胞(OD標的 = 5)を5 mLのPBS緩衝液中に懸濁し、氷上で超音波処理により破壊する。次に、100μLの各懸濁液を遠心分離(15,000 rpm、5分)し、各上清を回収して、別々のバイアルに移す。これは、可溶性に発現された標的タンパク質と不溶性に発現された標的タンパク質とを識別するためである。各上清(= 可溶性)画分に300μL、および各ペレット(= 不溶性)画分に400μLの、SDS試料緩衝液 (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685) を添加する。試料を、激しい混合下で15分間、95℃で加熱して、試料中のすべてのタンパク質を可溶化しかつ還元する。室温まで冷却した後、各試料の5μLを、4〜20% TGX Criterion Stain Freeポリアクリルアミドゲル (Bio-Rad) に移す。加えて、5μLの分子量標準物質(Precision Plus Protein Standard、Bio-Rad)、ならびに既知の産物タンパク質濃度(0.1μg/μL)を有する3種の量(0.3μL、0.6μL、および0.9μL)の定量化標準物質を、ゲル上に配置する。
上述の発酵工程を用いて、親株において、およびndh欠失変異体に相当する改変株において、短縮型テトラネクチン-アポリポタンパク質A-I融合タンパク質を発現させた。改変株の前培養の光学密度はより低かったにもかかわらず、両方の株の増殖は、非常に匹敵していた。47時間の培養および連続した加熱段階後に、285および245の光学密度が得られた。
両方の株は、既知組成培地上での発酵において同じ増殖を示したにもかかわらず、ndh欠損改変株は、工程の流加相中の予想外の酸素摂取速度の増大、および有意により高い産物形成速度を有していた。従って、最終的な産物収量を増大させることができた。両方の実験における唯一の相違は、ndh欠損改変株のndh遺伝子座における改変であったため、この効果がそれと直接相関する可能性がある。従って、OURを低減させるためではなく生産性を増大させるために、高生産性大腸菌株においてndhを欠失させることが有用である。
Claims (11)
- 大腸菌(E.coli)におけるポリペプチドの組換え生産のための方法であって、
‐該ポリペプチドを発現するNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌を培養する段階、および
‐細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該ポリペプチドが、呼吸鎖経路酵素、または抗生物質耐性誘導遺伝子によってコードされるポリペプチドではない、方法。 - NADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌が、機能的なNADHデヒドロゲナーゼIIを有することを除いて同じ遺伝子型を持つ大腸菌に匹敵する酸素摂取速度を有することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- NADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌が、機能的なNADHデヒドロゲナーゼIIを有することを除いて同じ遺伝子型を持つ大腸菌に匹敵する増殖速度を有することを特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
- NADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌が、機能的なNADHデヒドロゲナーゼIIを有することを除いて同じ遺伝子型を持つ大腸菌より高い生産速度を有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- NADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌が、大腸菌K12であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- NADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌が、遺伝子型thi-1、Δndh、ΔpyrFを有することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- NADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌が、bd型オキシダーゼをさらに欠損していることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 遺伝子型thi-1、Δndh、ΔpyrFを有する、大腸菌K12。
- 組換えポリペプチドの生産におけるNADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌の使用であって、該ポリペプチドが、呼吸鎖経路酵素、または抗生物質耐性誘導遺伝子によってコードされるポリペプチドではない、使用。
- NADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌が、遺伝子型thi-1、Δndh、ΔpyrFを有することを特徴とする、請求項9記載の使用。
- NADHデヒドロゲナーゼII欠損大腸菌が、bd型オキシダーゼをさらに欠損していることを特徴とする、請求項9〜10のいずれか一項記載の使用。
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