RU2820627C1 - Генно-инженерные бактерии для продуцирования l-аргинина и способ конструирования и применения генно-инженерных бактерий - Google Patents
Генно-инженерные бактерии для продуцирования l-аргинина и способ конструирования и применения генно-инженерных бактерий Download PDFInfo
- Publication number
- RU2820627C1 RU2820627C1 RU2022115855A RU2022115855A RU2820627C1 RU 2820627 C1 RU2820627 C1 RU 2820627C1 RU 2022115855 A RU2022115855 A RU 2022115855A RU 2022115855 A RU2022115855 A RU 2022115855A RU 2820627 C1 RU2820627 C1 RU 2820627C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- arginine
- fragment
- coli
- genes
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 62
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 52
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 52
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims abstract description 52
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims abstract description 51
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims abstract description 51
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 37
- 101150029940 argJ gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 101150019517 pyrAB gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 101150070764 carB gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 101150068782 pyrAA gene Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101150014229 carA gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 101150044424 lysE gene Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101150118463 argG gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101150054318 argH gene Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 101150070427 argC gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101150050866 argD gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101150056313 argF gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 101100096227 Bacteroides fragilis (strain 638R) argF' gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101100434436 Escherichia coli (strain K12) adiA gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101100354186 Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (strain California kid / ATCC 27343 / NCTC 10154) ptcA gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101100217185 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aruC gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101100022072 Sulfolobus acidocaldarius (strain ATCC 33909 / DSM 639 / JCM 8929 / NBRC 15157 / NCIMB 11770) lysJ gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101150089042 argC2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims abstract description 10
- 101150094164 lysY gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 241001103870 Adia Species 0.000 claims abstract description 9
- 241001132374 Asta Species 0.000 claims abstract description 7
- 101000859568 Methanobrevibacter smithii (strain ATCC 35061 / DSM 861 / OCM 144 / PS) Carbamoyl-phosphate synthase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 241000370685 Arge Species 0.000 claims abstract description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 164
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 97
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 94
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 69
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 69
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 62
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 57
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 55
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 claims description 36
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 32
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 24
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 22
- 101150026435 astA gene Proteins 0.000 claims description 17
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 16
- 241000149010 Thespea Species 0.000 claims description 12
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 101150059284 adiA gene Proteins 0.000 claims description 10
- 102100032252 Antizyme inhibitor 2 Human genes 0.000 claims description 9
- 101000798222 Homo sapiens Antizyme inhibitor 2 Proteins 0.000 claims description 9
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 9
- 101150105638 argE gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150038942 speA gene Proteins 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 108010061206 arginine succinyltransferase Proteins 0.000 claims description 7
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 7
- 101150103191 yghX gene Proteins 0.000 claims description 7
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 6
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 6
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 6
- 108030006759 Acetylornithine deacetylases Proteins 0.000 claims description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 5
- 101150020087 ilvG gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150063727 yjiT gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 2
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 claims description 2
- 108010050322 glutamate acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 108050002246 Acetylornithine deacetylase ArgE Proteins 0.000 claims 1
- 241001415395 Spea Species 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 26
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 18
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 17
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 7
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000424760 Corynebacterium crenatum Species 0.000 description 3
- 101100379627 Dictyostelium discoideum argJ gene Proteins 0.000 description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 101150072425 arg7 gene Proteins 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFQKYPRQEYGKAF-UHFFFAOYSA-N carbamoyl phosphate Chemical compound NC(=O)OP(O)(O)=O FFQKYPRQEYGKAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100021723 Arginase-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100030356 Arginase-2, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 2
- 101100544116 Escherichia coli (strain K12) yghX gene Proteins 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- 101000752037 Homo sapiens Arginase-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000792835 Homo sapiens Arginase-2, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 101000800287 Homo sapiens Tubulointerstitial nephritis antigen-like Proteins 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 101100109397 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) arg-8 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- IDIDJDIHTAOVLG-VKHMYHEASA-N S-methylcysteine Chemical compound CSC[C@H](N)C(O)=O IDIDJDIHTAOVLG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 101100166068 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) arg5 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100404032 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) arg6 gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 2
- 101100004044 Vigna radiata var. radiata AUX22B gene Proteins 0.000 description 2
- 150000001483 arginine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 1
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 229930028154 D-arginine Natural products 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N L-Homoarginine Natural products OC(=O)C(N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical class O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N L-homoarginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- JRLGPAXAGHMNOL-LURJTMIESA-N N(2)-acetyl-L-ornithine Chemical compound CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC[NH3+] JRLGPAXAGHMNOL-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- IDIDJDIHTAOVLG-UHFFFAOYSA-N S-methyl-L-cysteine Natural products CSCC(N)C(O)=O IDIDJDIHTAOVLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOGRQMPFHUHIGU-UHFFFAOYSA-N Uridylic acid Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 FOGRQMPFHUHIGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150089004 argR gene Proteins 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009123 feedback regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000007849 functional defect Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 1
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 102220091420 rs149941106 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 101150022778 speF gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- BRBKOPJOKNSWSG-UHFFFAOYSA-N sulfaguanidine Chemical compound NC(=N)NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BRBKOPJOKNSWSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004257 sulfaguanidine Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 101150079095 yjhX gene Proteins 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой генно-инженерную бактерию для продуцирования L-аргинина, которая содержит два гена pyrAA и pyrAB, кодирующие карбамоилфосфат-синтетазу, и где гены pyrAA и pyrAB происходят из Bacillus subtilis; которая дополнительно содержит ген, кодирующий фермент пути биосинтеза L-аргинина, выбранный из одного или более из следующих ферментов: argC, argJ, argB, argD, argF, argG, argH; которая дополнительно содержит ген lysE, кодирующий транспортер аргинина; и для которой в качестве исходной бактерии берут Escherichia coli с одновременным нокаутом генов speA, adiA, astA и argE. Изобретение позволяет получать L-аргинин с высокой степенью эффективности. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл., 2 пр.
Description
В данной заявке заявлен приоритет патентной заявки 201911211097.Х, поданной в Управление национальной интеллектуальной собственностью Китая 2 декабря 2019 года и названной "ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ БАКТЕРИИ ДЛЯ ПРОДУЦИРОВАНИЯ L-АРГИНИНА И СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ БАКТЕРИЙ", описание которой во всей его полноте включено в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к технической области генной инженерии и относится к генно-инженерной бактерии, способной стабильно и эффективно продуцировать L-аргинин, и к способу ее конструирования и к ее применению.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
L-аргинин представляет собой частично незаменимую основную аминокислоту или, при определенных условиях, незаменимую аминокислоту у людей и животных, и обладает важными биохимическими и физиологическими функциями. В настоящее время, L-аргинин широко используют в медицине, промышленности, питании, косметике, животноводстве и других областях, и он обладает важным экономическим и социальным значением.
Способы получения L-аргинина главным образом включают способ гидролиза белка и способ микробиологической ферментации. По сравнению со способом экстракции белкового гидролизата, способ микробиологической ферментации обладает преимуществами, которые заключаются в относительно простом процессе получения, относительно небольшом воздействии на окружающую среду и высокой чистоте продукта, и пригоден для крупномасштабного промышленного производства.
В настоящее время аргинин-продуцирующие штаммы главным образом представляют собой Corynebacterium glutamicum, имеющие проблемы, заключающиеся в длительном периоде ферментации (90 ч-120 ч) и низкой интенсивности получения в процессе получения. В то же время, на существующий процесс ферментации Corynebacterium glutamicum сильно влияет качество эксципиентов, таких как жидкий кукурузный экстракт, и производство легко меняется. Кроме того, редактирование генов Corynebacterium glutamicum затруднено, что приводит к использованию плазмидных экспрессионных векторов в существующих аргинин-продуцирующих штаммах для усиления ключевых генов, связанных с синтезом аргинина. Однако в процессе ферментации множественные копии плазмид приводят к уровню нагрузки на рост бактерии, что приводит к снижению выхода в процессе поздней ферментации. Кроме того, в процессе получения плазмидный экспрессионный вектор легко утрачивается или необходимо добавлять определенное селективное давление, что приводит к проблеме высокой стоимости в процессе промышленного производства. Многие факторы затрудняют внедрение существующих в настоящее время аргинин-продуцирующих штаммов в промышленное производство.
Поскольку существует множество механизмов обратной связи в синтетическом и метаболическом путях аргинина, и множество метаболических путей аргинина и метаболическая сеть, вовлеченная в предшественники, требующиеся для синтеза аргинина, является сложной, в исходном исследовании и разработке промышленных аргинин-продуцирующих штаммов главным образом используют традиционный способ мутагенеза, комбинированный с отбором по резистентности к структурному аналогу аргинина. Выбранные исходные штаммы представляют собой, главным образом, Brevibacterium flavum, Corynebacterium crenatum и Corynebacterium glutamicum. Стратегия исследования сосредоточена на отборе мутантов структурных аналогов аргинина для облегчения механизмов обратной регуляции в процессе синтеза аргинина и улучшения внутриклеточного накопления L-аргинина. Среди них Li Shaoping и др. отобрали штамм Corynebacterium crenatum с дефицитом по гистидину, резистентностью к сульфагуанидину, резистентностью к D-аргинину, резистентностью к гомоаргинину и резистентностью к S-метилцистеину посредством пошагового мутагенеза с NTG (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин) (CN 201010610917.5), и после эксперимента по ферментации накопление L-аргинина составляло 32,8 г/л, когда штамм культивировали в ферментере объемом 5 л в течение 96 ч. Однако L-аргинин-продуцирующий штамм, полученный путем мутагенеза и отбора с использованием структурного аналога, трудно ввести в крупномасштабное промышленное производство из-за его плохой генетической стабильности и легкости возникновения обратных мутаций и других недостатков.
С быстрым развитием генно-инженерной технологии способ конструирования L-аргинин-продуцирующих штаммов с использованием технологии метаболической инженерии постепенно вытеснил традиционные методы селекции с мутагенезом. У Corynebacterium glutamicum отсутствуют гены, вовлеченные в деградацию аргинина; и метаболический поток внутриклеточной глюкозы, поглощенной Corynebacterium glutamicum, проходящий через гликолитический путь с получением глутаминовой кислоты, представляющей собой один из основных предшественников в синтезе аргинина, является сильным, так что Corynebacterium glutamicum представляет собой основной выбор для конструирования L-аргинин-продуцирующих штаммов. Xu Meijuan et al. (Xu M, Rao Z, Yang J, et al. J md Microbiol Biotechnol, 2012, 39(3): 495-502). Генный кластер argCJBDFRGH для синтеза L-аргинина лигировали в шаттл-экспрессионный вектор pJCtac и вводили в Corynebacterium crenatum. После 96 ч ферментации выход L-аргинина из штамма увеличивался до 45,6 г/л. Park et al. (Park S H, Kim H U, Kim T Y, et al. Nature Communications, 2014, 5:4618---) использовали Corynebacterium glutamicum в качестве исходного штамма для увеличения устойчивости глутамина к структурным аналогам L-аргинина посредством случайного мутагенеза, и системные технологии метаболической инженерии для облегчения обратного ингибирования в процессе синтеза аргинина, для увеличения поступления NADPH (восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата) в процессе синтеза и для увеличения поступление предшественников. Наконец, после 96 ч ферментации в ферментере объемом 5 л накопление L-аргинина составляло 92,5 г/л, скорость превращения составляла 0,35 г аргинина/г глюкозы, и максимальная интенсивность продуцирования составляла 0,9 г аргинина/л/ч. Вышеупомянутые L-аргинин-продуцирующие штаммы обычно имеют проблемы, заключающиеся в длительном цикле продуцирования и низкой интенсивности продуцирования. Кроме того, в процессе конструирования штамма ключевые гены в синтезе аргинина лигируют в экспрессионный вектор для увеличения транскрипционных количеств ключевых ферментов, таким образом усиливая метаболический поток в пути синтеза аргинина. Однако в процессе продуцирования экспрессионный вектор легко утрачивается, или необходимо добавлять определенное селективное давление, поэтому сложно ввести эти штаммы в промышленное производство.
Благодаря преимуществам короткого ферментационного периода, ясного генетического фона, удобной молекулярной манипуляции и стабильного процесса ферментации, Escherichia coli стала наилучшим выбором для конструирования L-аргинин-продуцирующих промышленных штаммов. Ginesy et al. (Ginesy M, Belotserkovsky J, Enman J, et al. Microbial Cell Factories, 2015, 14(1): 29.) использовали Escherichia coli в качестве исходного штамма, нокаутировали ген argR для облегчения подавления аргинина по типу обратной связи, интегрировали мутантный ген argA214 (H15Y) для облегчения подавления аргинина по типу обратной связи в ArgA, нокаутировали гену adiA, связанный с деградацией аргинина, и нокаутировали гены speC и speF, связанные с деградацией орнитина, так что больший поток углерода в виде промежуточных метаболитов направлялся в сторону L-аргинина. После 42 ч культивирования в ферментере объемом 1 л накопление L-аргинина достигало 11,64 г/л, скорость превращения была 0,44 г аргинина/г глюкозы, и интенсивность продуцирования составляла 0,29 г аргинина/л/ч. Хотя период ферментации этого штамма очевидным образом укорочен, его накопление аргинина и интенсивность продуцирования все еще не удовлетворяют требованиям промышленного производства.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В свете вышеупомянутых проблем задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить генно-инженерную бактерию, способную стабильно и эффективно продуцировать L-аргинин, и способ ее конструирования и ее применение. Сконструированная бактерия обладает хорошими перспективами для промышленного применения.
В настоящем изобретении предложены следующие технические решения:
В первом аспекте настоящего изобретения предложен генно-инженерный бактериальный штамм для продуцирования L-аргинина, который содержит гены pyrAA и pyrAB, кодирующие карбамоилфосфат-синтетазу.
В одном из воплощений для генно-инженерного бактериального штамма в качестве исходного штамма берут Escherichia coli или Corynebacterium glutamicum, такие как Е. coli W3110 или E. coli MG1655.
В одном из воплощений гены pyrAA и pyrAB интегрированы в локус гена yjiT в Е. coli.
В одном из воплощений гены pyrAA и pyrAB происходят из Bacillus subtilis, в частности, гены pyrAA и pyrAB происходят из генов, кодирующих карбамоилфосфат-синтетазу в В. subtilis А260.
В одном из воплощений генно-инженерный бактериальный штамм дополнительно содержит ген, кодирующий фермент пути биосинтеза L-аргинина, выбранный из одного или более следующих ферментов: argC, argJ, argB, argD, argF, argG, argH; ген, кодирующий фермент пути биосинтеза L-аргинина, происходит из Corynebacterium glutamicum АТСС13032; в одном из воплощений ген, кодирующий фермент пути биосинтеза L-аргинина, управляется промотором Ptrc; в одном из воплощений ген, кодирующий фермент пути биосинтеза L-аргинина, интегрирован в генный локус yghX в Е. coli.
В одном из воплощений генно-инженерный бактериальный штамм дополнительно содержит ген lysE, кодирующий транспортер аргинина (референсная последовательность NCBI (Национальный центр биотехнологической информации): WP_143758438.1), и ген транспортера происходит из Corynebacterium efficiens; в одном из воплощений ген lysE интегрирован в генный локус ilvG в Е. coli.
В одном из воплощений генно-инженерный бактериальный штамм не содержит ген деградации L-аргинина, который может быть получен путем нокаута одного или более следующих генов: гена, кодирующего аргинин-декарбоксилазу, гена, кодирующего аргинин-сукцинилтрансферазу, гена, кодирующего ацетилорнитин-деацетилазу. Ген, кодирующий аргинин-декарбоксилазу, включает по меньшей мере один из speA (NCBI-Gene ID: 12933352) и adiA (NCBI-Gene ID: 12934085); ген, кодирующий аргинин-сукцинилтрансферазу, представляет собой astA (NCBI-GeneID: 12933241); ген, кодирующий ацетилорнитин-де ацетил азу, представляет собой argE (NCBI-GeneID: 12930574). В одном из воплощений генно-инженерный бактериальный штамм представляет собой Е. coli, в котором гены speA, adiA и astA одновременно нокаутированы.
В одном из воплощений генно-инженерный бактериальный штамм содержит гены pyrAA, pyrAB, argC, argJ, argB, argD, argF, argG, argH и lysE. В одном из воплощений генно-инженерный бактериальный штамм не содержит гены speA, adiA, astA и argE.
В настоящем изобретении гены pyrAA, pyrAB, argC, argJ, argB, argD, argF, argG, argH, lysE, speA, adiA, astA и argE не ограничены генами дикого типа, но также могут представлять собой мутанты, кодирующие соответствующие белки или искусственно модифицированные гены, где соответствующие белки включают замену, делецию или вставку одного или более аминокислотных остатков в одном или более сайтах, пока белки, кодируемые этими мутантами или искусственно модифицированными генами, обладают соответствующими активностями и не имеют функциональных дефектов. Эти гены зарегистрированы в GenBank, и специалист в данной области техники может получить эти гены при помощи ПЦР (полимеразной цепной реакции). В качестве примера, ген pyrAA представляет собой NCBI-GeneID: 937368, ген pyrAB представляет собой NCBI-GeneID: 936608, ген argC представляет собой NCBI-GeneID: 1019370, ген argJ представляет собой NCBI-GeneID: 1019371, ген argB представляет собой NCBI-GeneID: 1019372, ген argD представляет собой NCBI-GeneID: 1019373, ген argF представляет собой NCBI-GeneID: 1019374, ген argG представляет собой NCBI-GeneID: 1019376, ген argH представляет собой NCBI-GeneID: 1019377, ген lysE имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 68 (идентификатор последовательности в NCBI: WP 143758438.1), ген speA представляет собой NCBI-GeneID: 12933352, ген adiA представляет собой NCBI-GeneID: 12934085, ген astA представляет собой NCBI-GeneID: 12933241 и ген argE представляет собой NCBI-GeneID: 12930574.
Во втором аспекте настоящего изобретения предложен способ конструирования вышеупомянутого генно-инженерного бактериального штамма, включающий следующую стадию: (1) интегрирование генов pyrAA и pyrAB в геном исходного штамма.
Например, исходный штамм представляет собой Е. coli, такой как E. coli W3110 (АТСС27325).
В одном из воплощений способ конструирования дополнительно возможно включает одну или более следующих стадий:
(2) интегрирование генов ферментов пути биосинтеза аргинина, включающих один или более из генов argC, argJ, argB, argD, argF, argG, argH; и/или интегрирование гена lysE, кодирующего транспортер аргинина;
(3) нокаутирование гена, кодирующего аргинин-декарбоксилазу, гена, кодирующего аргинин-сукцинилтрансферазу, и/или гена, кодирующего ацетилорнитин-деацетилазу; например, ген, кодирующий аргинин-декарбоксилазу, включает по меньшей мере один из генов speA и adiA; ген, кодирующий аргинин-сукцинилтрансферазу, представляет собой ген astA; ген, кодирующий ацетилорнитин-деацетилазу, представляет собой ген argE.
В одном из воплощений способ конструирования включает стадии:
(1) нокаутирование следующих трех генов в Е. coli: гена speA, кодирующего аргинин-декарбоксилазу, гена adiA, кодирующего аргинин-декарбоксилазу, и гена astA, кодирующего аргинин-сукцинилтрансферазу;
(2) нокаутирование гена argE, кодирующего ацетилорнитин-деацетилазу, в Е. coli, и, возможно, интегрирование гена argJ, кодирующего глутаматацетилтрансферазу в Е. coli;
(3) интегрирование следующего генного кластера, связанного с биосинтезом аргинина: argC, argJ, argB, argD, argF, argG и argH, который управляется промотором Ptrc;
(4) интегрирование генов pyrAA и pyrAB, кодирующих карбамоилфосфат-синтетазу;
(5) интегрирование гена lysE, кодирующего транспортер аргинина, в геном Е. coli. Специалисту в данной области техники может быть понятно, что
последовательность стадий (1)-(5) вышеприведенного способа конструирования по настоящему изобретению, не ограничена, и может быть осуществлена в любой последовательности, которая может быть реализована специалистами в данной области техники. Предпочтительно, стадии (1)-(5) осуществляют последовательно.
Любой способ нокаутирования гена или сайленсинга гена, известный в области техники, может быть использован для достижения вышеупомянутого нокаутирования генов, и любой способ, известный в области техники, также может быть использован для достижения интегрирования гена, такой как гомологичная рекомбинация, перекрывающаяся ПЦР, скрининг мутагенеза или редактирование гена и другие методы. Например, нокаутирование генов может быть достигнуто путем удаления конкретной области гена, так что он не обладает функцией экспрессии интересующего белка, или путем осуществления замены, делеции и вставки одного или более нуклеотидов в кодирующей области или в промоторной области путем сайт-специфической мутации и т.п., и химические реактивы также могут быть использованы для уменьшения или ликвидации транскрипции конкретного гена.
В одном из воплощений в способе конструирования используют опосредованную CRTSPR/Cas9 технологию редактирования генов для осуществления интегрирования и нокаутирования генов.
В одном из воплощений способ конструирования включает стадии конструирования рекомбинантного фрагмента и плазмиды pGRB.
В одном из воплощений стадия конструирования плазмиды pGRB включает: создание целевой последовательности, получение фрагмента ДНК, содержащего эту целевую последовательность, и рекомбинацию фрагмента ДНК, содержащего эту целевую последовательность, с линеаризованным фрагментом вектора; в конкретном воплощении целевая последовательность представляет собой 5'-NGG-3'.
В одном из воплощений в способе конструирования стадия конструирования рекомбинантного фрагмента включает конструирование рекомбинантного фрагмента для интегрирования генов или нокаутирования генов. Среди них стадия конструирования рекомбинантного фрагмента для интегрирования гена включает: использование генома исходного штамма в качестве матрицы, создание праймеров для расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч в соответствии с расположенными против хода транскрипции и по ходу транскрипции последовательностями предполагаемого сайта встраивания целевого гена, и создание праймеров в соответствии с целевым геномом для амплификации фрагмента целевого гена, и затем осуществление перекрывающейся ПЦР для получения рекомбинантного фрагмента. Стадия конструирования рекомбинантного фрагмента для нокаутирования генов включает: использование расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции последовательностей нокаутируемого гена в качестве матриц, создание праймеров для расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч; соответствующую амплификацию расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч при помощи ПЦР, и затем получение рекомбинантного фрагмента посредством перекрывающейся ПЦР.
В одном из воплощений способ конструирования включает: одновременную трансформацию плазмиды pGRB и вышеупомянутого рекомбинантного фрагмента в компетентные в отношении электропорации клетки, содержащие pREDCas9, и элиминацию плазмид с получением рекомбинантного генно-инженерного бактериального штамма.
В настоящем изобретении предложено применение вышеупомянутого генно-инженерного бактериального штамма в получении L-аргинина.
В настоящем изобретении также предложен способ продуцирования L-аргинина путем использования вышеупомянутого генно-инженерный бактериального штамма, включающий: приведение в контакт вышеупомянутого генно-инженерного штамма Е. coli с ферментационной средой, и проведение ферментации с получением L-аргинина.
В соответствии с настоящим изобретением ферментация включает ферментацию во встряхиваемой колбе или ферментацию в ферментере.
В одном из воплощений количество инокулята для ферментации во встряхиваемой колбе составляет 10-15%, условия ферментации составляют 37°С, 200 об./мин на встряхивающей платформе, рН поддерживают на уровне 7,0-7,2 во время ферментации, и рН может быть скорректирован путем добавления аммиачной воды. Во время ферментации также может быть добавлен раствор глюкозы для поддержания ферментации, и масс-объемная концентрация раствора глюкозы предпочтительно составляет 60% (масс./об.). Предпочтительно, время ферментации при ферментации во встряхиваемой колбе составляет 26-30 ч. В настоящем изобретении дополнительное количество раствора глюкозы не ограничено конкретным образом, и концентрация глюкозы в ферментационном бульоне может поддерживаться на уровне менее 5 г/л, например 1-5 г/л.
В одном из воплощений ферментацию во встряхиваемой колбе осуществляют в колбе Эрленмейера объемом 500 мл для ферментации. После 26-30 ч ферментации во встряхиваемой колбе концентрация L-аргинина в ферментационном бульоне может достигать 30-32 г/л.
В одном из воплощений количество инокулята для ферментации в ферментере составляет 15-20%, температура ферментации составляет 35°С, и растворенный кислород составляет 25-35%. Во время ферментации рН контролируют таким образом, чтобы он был стабилен на уровне 7,0-7,2, и рН может быть скорректирован путем добавления аммиачной воды; когда глюкоза в среде истощается, тогда осуществляют периодическое добавление 80% (масс./об.) раствор глюкозы для поддержания концентрации глюкозы в ферментационной среде на уровне 0,1-5 г/л.
В одном из воплощений ферментацию в ферментере осуществляют в ферментере объемом 5 л для ферментации. После 50-55 ч ферментации в ферментере объемом 5 л накопление L-аргинина достигает 130-135 г/л. Скорость превращения достигает 0,48 г аргинина/г глюкозы, и интенсивность продуцирования достигает 2,5 г аргинина/л/ч.
В настоящем изобретении для ферментации может быть использована ферментационная среда для Е. coli, известная в данной области техники.
В одном из воплощений ферментационная среда для ферментации во встряхиваемой колбе состоит из: 20-40 г/л глюкозы, 1-3 г/л дрожжевого экстракта, 2-3 г/л пептона, 3-6 г/л K2HPO4, 1-2 г/л MgSO4⋅7H2O, 15-20 мг/л FeSO4⋅7H2O, 15-20 мг/л MnSO4⋅7H2O, 1-3 мг/л каждого из VB1, VB3, VB5, VB12 и VH, остальное представляет собой воду, рН 7,0-7,2.
В одном из воплощений ферментационная среда для ферментации в ферментере состоит из: 10-25 г/л глюкозы, 1-5 г/л дрожжевого экстракта, 1-5 г/л пептона, 1-5 г/л K2HPO4, 1-3 г/л MgSO4⋅7H2O, 10-30 мг/л FeSO4⋅7H2O, 10-30 мг/л MnSO4⋅H2O, 1-3 мг/л каждого из VB1, VB3, VB5, VB12 и VH, остальное представляет собой воду, рН 7,0-7,2. Благоприятные эффекты:
В настоящем изобретении в качестве исходного штамма выбрали Е. coli с коротким циклом роста, ясным метаболическим путем и удобной молекулярной манипуляцией, начиная с генной инженерии синтетического и метаболического пути L-аргинина и инженерии всей метаболической сети, проанализировали и реконструировали метаболический поток, связанный с аргинином в пути синтеза L-аргинина и полной аминокислотной метаболической сети, и, наконец, получили генно-инженерный бактериальный штамм, который обладает ясным генетическим кодом, не несет плазмиды, не претерпевает мутагенез и способен стабильно и эффективно продуцировать L-аргинин.
Штамм Е. coli, полученный в соответствии с настоящим изобретением, создает путь циркуляции L-аргинина, улучшает поток L-аргинина и поступление предшественников, уменьшает деградацию L-аргинина и способствует накоплению и транспорту L-аргинина, таким образом, эффективно увеличивая выход L-аргинина.
Продуцирующий L-аргинин генно-инженерный бактериальный штамм в соответствии с настоящим изобретением может накапливать L-аргинин в концентрации 130-135 г/л после культивирования в ферментере объемом 5 л в течение 50-55 ч. Скорость превращения может достигать 0,48 г аргинина/г глюкозы и интенсивность продуцирования может достигать 2,5 г аргинина/л/ч. По сравнению со штаммом, о котором сообщалось в Park et al. (накопление L-аргинина составляет 92,5 г/л после выращивания в ферментере объемом 5 л в течение 96 ч, скорость превращения составляет 0,35 г аргинина/г глюкозы, и максимальная интенсивность продуцирования составляет 0,9 г аргинин/л/ч), штамм в соответствии с настоящим изобретением обладает преимуществами, заключающимися в более высокой производительностью в отношении L-аргинина, без подвергания мутагенной обработке, не несет плазмидные векторы, обладает коротким циклом ферментации, ясным генетическим фоном, стабильным метаболизмом, высокой интенсивностью продуцирования, и, таким образом, обладает хорошими перспективами для промышленного применения.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 блок (а) демонстрирует карту плазмиды pREDCas9, а блок (b) демонстрирует карту плазмиды pGRB.
Фиг. 2 демонстрирует электрофореграмму конструирования и верификацию фрагмента для нокаутирования гена speA, где М: маркер ДНК 1 кб; полоса 1: расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо; полоса 2: расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо; полоса 3: перекрывающийся фрагмент; полоса 4: исходный штамм (контроль); полоса 5: идентифицированный фрагмент из положительных бактерий.
Фиг. 3 демонстрирует электрофореграмму конструирования и верификации фрагмента для нокаутирования гена adiA, где М: маркер ДНК 1 кб; полоса 1: расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо; полоса 2: расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо; полоса 3: перекрывающийся фрагмент; полоса 4: исходный штамм (контроль); полоса 5: идентифицированный фрагмент из положительных бактерий.
Фиг. 4 демонстрирует электрофореграмму конструирования и верификации фрагмента для нокаутирования гена astA, где М: маркер ДНК 1 кб; полоса 1: расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо; полоса 2: расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо; полоса 3: перекрывающийся фрагмент; полоса 4: исходный штамм (контроль); полоса 5: идентифицированный фрагмент из положительных бактерий.
Фиг. 5 демонстрирует электрофореграмму конструирования и верификации фрагмента для интегрирования argJ, где М: маркер ДНК 1 кб; полоса 1: расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо; полоса 2: расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо; полоса 3: перекрывающийся фрагмент; полоса 4: исходный штамм (контроль); полоса 5: идентифицированный фрагмент из положительных бактерий.
Фиг. 6 демонстрирует электрофореграмму конструирования и верификации фрагмента для интегрирования argC-argJ, где М: маркер ДНК 1 кб; полоса 1: расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо; полоса 2: фрагмент argC-argJ; полоса 3: расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо; полоса 4: перекрывающийся фрагмент; полоса 5: исходный штамм (контроль); полоса 6: идентифицированный фрагмент из положительных бактерий.
Фиг. 7 демонстрирует электрофореграмму конструирования и верификации фрагмента для интегрирования гена argB-argD-argF, где М: маркер ДНК 1 кб; полоса 1: расположенный против хода транскрипции фрагмент argB-argD-argF-фратмет гена argB-argD-argF; полоса 2: расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо; полоса 3: перекрывающийся фрагмент; полоса 4: исходный штамм (контроль); полоса 5: идентифицированный фрагмент из положительных бактерий.
Фиг. 8 демонстрирует электрофореграмму конструирования и верификации фрагмента для интегрирования гена argG-argH, где М: маркер ДНК 1 кб; полоса 1: расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо; полоса 2: фрагмент argG-argH; полоса 3: расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо; полоса 4: перекрывающийся фрагмент; полоса 5: исходный штамм (контроль); полоса 6: идентифицированный фрагмент из положительных бактерий.
Фиг. 9 демонстрирует электрофореграмму конструирования и верификации первого фрагмента для интегрирования pyrAA-pyrAB, где М: маркер ДНК 1 кб; полоса 1: расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо; полоса 2: фрагмент 1-pyrAA-pyrAB; полоса 3: расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо; полоса 4: перекрывающийся фрагмент; полоса 5: исходный штамм (контроль); полоса 6: идентифицированный фрагмент из положительных бактерий.
Фиг. 10 демонстрирует электрофореграмму конструирования и верификации второго фрагмента для интегрирования pyrAA-pyrAB, где М: маркер ДНК 1 кб; полоса 1: расположенный против хода транскрипции фрагмент pyrAA-расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо pyrAA-pyrAB; полоса 2: расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо; полоса 3: перекрывающийся фрагмент; полоса 4: исходный штамм (контроль); полоса 5: идентифицированный фрагмент из положительных бактерий.
Фиг. 11 демонстрирует электрофореграмму конструирования и верификации фрагмента для интегрирования lysE, где М: маркер ДНК 1 кб; полоса 1: расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо; полоса 2: фрагмент lysE; полоса 3: расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо; полоса 4: перекрывающийся фрагмент; полоса 5: исходный штамм (контроль); полоса 6: идентифицированный фрагмент из положительных бактерий.
Фиг. 12 демонстрирует кривую периодической ферментации с добавлением субстрата штамма Е. coli W3110 ARG10 в ферментере объемом 5 л.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вышеприведенные и другие характеристики и преимущества настоящего изобретения раскрыты и проиллюстрированы более подробно ниже путем описания примеров в соответствии с настоящим изобретением. Следует понимать, что следующие примеры предназначены для иллюстрации технических решений в соответствии с настоящим изобретением, а не для ограничения объема патентной охраны настоящего изобретения, определяемого формулой изобретения и ее эквивалентными решениями.
Если не указано иное, то материалы и реактивы, указанные здесь, имеются в продаже или могут быть получены специалистом в данной области техники в соответствии с предшествующим уровнем техники.
Пример 1: Конструирование генно-инженерного бактериального штамма Е. coli TRP 05
1. Способ редактирования гена
Способ редактирования гена, используемый в настоящем изобретении, приведен в литературе " Li Y, Lin Z, Huang С, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genome editing. Metabolic engineering, 2015, 31:13-21" и карты двух плазмид, использованных в этом методе, представлены на Фиг. 1. Среди них вектор pREDCas9 несет систему элиминации гРНК экпрессионной плазмиды pGRB, систему рекомбинации Red фага "к и систему белковой экспрессии Cas9, устойчивость к спеномицину (рабочая концентрация: 100 мг/л), культивирование при 32°С; где в векторе pGRB используется pUC18 в качестве скелета и содержится промотор J23100, последовательность связывающегося с gRNA-Cas9 домена и терминирующая последовательность, устойчивость к ампициллину (рабочая концентрация: 100 мг/л), культивирование при 37°С.
Конкретные стадии данного способа:
1.1 Конструирование плазмиды pGRB
Задача конструирования плазмиды pGRB заключается в том, чтобы транскрибировать соответствующую гРНК с образованием комплекса с белком Cas9, и распознать целевой сайт целевого гена путем спаривания оснований и РАМ (мотив, смежный с протоспейсером) с получением двухцепочечного разрыва целевой ДНК. Плазмиду pGRB конструировали путем рекомбинации фрагмента ДНК, содержащего целевую последовательность с линеаризованным фрагментом вектора.
1.1.1 Создание целевой последовательности
Инструменты CRISPR RGEN использовали для конструирования целевой последовательности (РАМ: 5'-NGG-3').
1.1.2 Получение фрагмента ДНК, содержащего целевую последовательность Создавали праймер 5'-концевая последовательность линеаризованного вектора (15 п.о.) - сайт рестрикции - целевая последовательность (без последовательности РАМ)-концевая последовательность линеаризованного вектора (15 п. о)-3' и его обращенный комплементарный праймер, и фрагмент ДНК, содержащий целевую последовательность, получали путем отжига одноцепочечной ДНК. Условия реакции: предварительная денатурация при 95°С в течение 5 мин; отжиг при 30-50°С в течение 1 мин. Система отжига была следующей:
1.1.3 Получение линеаризованного вектора
Линеаризация вектора, используемого в способе амплификации посредством обратной ПЦР амплификации.
1.1.4 Реакция рекомбинации
Система рекомбинации представлена в таблице 2. Все используемые рекомбиназы представляли собой ферменты из наборов для одностадийного клонирования серий ClonExpress® П. Условия рекомбинации: 37°С, 30 мин.
1.1.5 Трансформация плазмиды
Десять мкл реакционного раствора добавляли к 100 мл химически компетентных клеток DH5a и осторожно смешивали. Полученную в результате смесь охлаждали в ледяной бане в течение 20 мин, подвергали тепловому шоку при 42°С в течение 45-90 с, немедленно охлаждали в ледяной бане в течение 2-3 мин, добавляли 900 мкл SOC, и поддерживали при 37°С в течение 1 ч. Смеси центрифугировали при 8000 об./мин в течение 2 мин, часть супернатанта удаляли, и оставшиеся 200 мкл супернатанта использовали для ресуспендирования клеток. Клетки затем распределяли на чашке, содержащей 100 мг/л ампициллина, и чашку помещали дном вверх и культивировали при 37°С в течение ночи. После выращивания единичных колоний на чашке положительные рекомбинанты идентифицировали посредством ПЦР и точечно отбирали.
1.1.6 Идентификация клонов
ПЦР-положительные колонии инокулировали в среду LB (Луриа-Бертани), содержащую 100 мг/л ампициллина для ночной культуры, и бактерии консервировали. Плазмиды экстрагировали и идентифицировали путем ферментативного расщепления.
1.2 Получение рекомбинантных фрагментов ДНК
Рекомбинантный фрагмент для нокаута состоит из расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч нокаутируемого гена (расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо -расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо); рекомбинантный фрагмент для интегрирования состоит из расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч сайта интегрирования и интегрируемого фрагмента гена (расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо-целевой ген -расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо). С использованием программного обеспечения для конструирования праймеров primer5 расположенные против хода транскрипции и по ходу транскрипции последовательности нокаутируемого гена или интегрируемого сайта использовали в качестве матрицы для создания праймеров для расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч (длина продукта амплификации: примерно 400-500 п.о.); интегрируемый ген использовали в качестве матрицы для создания праймеров для амплификации интегрированного гена. После амплификации, соответственно, расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч и фрагмента целевого гена при помощи ПЦР, рекомбинантный фрагмент получали посредством перекрывающейся ПЦР. Система ПЦР и способ представлены в следующей таблице 3:
Система перекрывающейся ПЦР представлена в следующей таблице 4:
Условия реакции ПЦР (фермент PrimeSTAR HS из Takara Bio): предварительная денатурация при 95°С в течение 5 мин; 30 циклов денатурации при 98°С в течение 10 с, отжиг при (Tm-3/5)°С в течение 15 с, элонгация при 72°С; и окончательная элонгация при 72°С в течение 10 мин; хранение при 4°С.
1.3 Трансформация плазмиды и рекомбинантного фрагмента ДНК
1.3.1 Трансформация pREDCas9
Плазмиду pREDCas9 подвергали электротрансформации в электропорационно-компетентные клетки W3110 посредством электротрансформации. Клетки выделяли и культивировали и затем наносили на чашку LB, содержащую спектиномицин, и культивировали при 32°С в течение ночи. Единичные колонии, выросшие на чашке с антибиотиком, подвергали ПЦР колоний с идентификацией праймеров для отбора положительных рекомбинантов.
1.3.2 Приготовление электропорационно-компетентных клеток целевого штамма, содержащих pREDCas9
Штамм выращивали при 32°С до тех пор, пока культура не достигала OD600 от 0,1 до 0,2 и затем добавляли IPTG (изопропилтиогалактозид) (до конечной концентрации 0,1 мМ). Выращивание продолжали до тех пор, пока величина OD600 не достигала от 0,6 до 0,7. Полученные клетки использовали для приготовления компетентных клеток. Цель добавления IPTG заключается в индукции экспрессии рекомбиназы в плазмиде pREDCas9. Среда и способ приготовления, требующиеся для получения компетентных клеток, относятся к обычным стандартным операциям.
1.3.3 Трансформация pGRB и рекомбинантного фрагмента ДНК
Плазмиду pGRB и рекомбинантный фрагмент ДНК подвергали одновременной электротрансформации в электропорационно-компетентные клетки, содержащие pREDCas9. После электротрансформации клетки выделяли и выращивали, и затем распределяли на чашке LB, содержащей ампициллин и спектиномицин, и культивировали при 32°С в течение ночи. Верификацию колоний при помощи ПЦР осуществляли с использованием прямого праймера для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча и обратного праймера для расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча, или с использованием специально созданных праймеров для идентификации для скрининга положительных рекомбинантов, и рекомбинанты сохраняли.
1.4 Элиминация плазмид
1.4.1 Элиминация плазмиды pGRB
Положительный рекомбинант выращивали в течение ночи в среде LB, содержащей 0,2% арабинозы, и после подходящих разведений культуру распределяли на чашке LB, содержащей спектиномицин, и культивировали при 32°С в течение ночи. Полученные рекомбинанты затем инокулировали на чашки LB, содержащие ампициллин и спектиномицин, соответственно, и единичные колонии, которые не росли на чашке, содержащей амгащиллин, но росли на чашке, содержащей спектиномицин, подвергали точечному отбору и сохраняли.
1.4.2 Элиминация плазмиды pREDCas9
Положительный рекомбинант переносили в жидкую среду LB без антибиотиков, культивировали в течение ночи при 42°С, и после соответствующих разведений культуру распределяли на чашке LB без антибиотиков и культивировали при 37°С в течение ночи. Полученные рекомбинанты затем инокулировали на чашки LB, содержащие спектиномицин, и без антибиотиков, соответственно, единичные колонии, которые не росли на чашке со спектиномицином, но росли на чашке LB без антибиотиков, подвергали точечному отбору и сохраняли.
2. Праймеры, используемые в конструировании штамма, представлены в таблице 5:
3. Конкретный процесс конструирования штамма
3.1 Нокаут трех генов speA, adiA и astA
3.1.1 Нокаут гена speA
С использованием генома Е. coli W3110 (АТСС27325) в качестве матрицы осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча (UV-speAS, UP speA-А) и праймерами для расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча (DN-speA-S, DN-speA-A), созданными в соответствии с расположенными против хода транскрипции и по ходу транскрипции последовательностями его гена speA (NCBI-GeneID: 12933352), для амплификации расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч гена speA. Способ перекрывающейся ПНР применяли для слияния вышеприведенных фрагментов с получением фрагмента для нокаутирования гена speA (расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо-расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо). Фрагмент ДНК, полученный путем отжига праймеров gECNA-speA-S и gRNA-speA-A, лигировали с плазмидой pGRB для конструирования рекомбинантной плазмиды pGRB-speA. Компетентные клетки Е. coli "W3110 готовили в соответствии со способами, описанными в разделах 1.3 и 1.4. Плазмиду pGRB-speA и фрагмент для нокаутирования гена speA одновременно подвергали электротрансформации в компетентные клетки, и наконец получали штамм, названный Е. coli W3110 ARG1. Электрофореграмма конструкции фрагмента для нокаутирования гена speA и ПЦР-верификация положительных бактерий представлена на Фиг. 2, где длина расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча должна составлять 397 п.о., длина расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча должна составлять 468 п.о., и полная длина перекрывающегося фрагмента должна составлять 865 п.о., и для ПЦР-верификации длина амплифицированного путем ПЦР фрагмента положительных бактерий должна составлять 2752 п.о., и длина амплифицированного путем ПЦР фрагмента исходных бактерий должна составлять 865 п.о.
3.1.2 Нокаут гена adiA
С использованием генома Е. coli W3110 (АТСС27325) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча (UP-adiAS, UP-adiA-A) и праймерами для расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча (DN-adiA-S, DN-adiA-A), созданными в соответствии с расположенными против хода транскрипции и по ходу транскрипции последовательностями его гена adiA (NCBI-GeneID: 12934085) для амплификации расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч гена adiA. Способ перекрывающейся ПЦР применяли для слияния вышеприведенных фрагментов с получением фрагмента для нокаутирования гена adiA (расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо-расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо). Фрагмент ДНК, полученный путем отжига праймеров gRNA-adiA-S и gRNA-adiA-A, лигировали с плазмидой pGRB для конструирования рекомбинантной плазмиды pGRB-adiA. Компетентные клетки Е. coli W3110 ARG1 получали в соответствии со способами, описанными в разделах 1.3 и 1.4. Плазмиду pGRB-adiA и фрагмент для нокаутирования гена adiA одновременно подвергали электротрансформации в компетентные клетки, и наконец получали штамм, названный Е. coli W3110 ARG2. Электрофореграмма конструкции фрагмента для нокаутирования гена adiA и ПЦР-верификация положительных бактерий представлена на Фиг. 3, где длина расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча должна составлять 806 п.о., длина расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча должна составлять 402 п.о., и полная длина перекрывающегося фрагмента должна составлять 1208 п.о., и для ПЦР-верификации длина амплифицированного путем ПЦР фрагмента положительных бактерий должна составлять 2124 п.о., и длина амплифицированного путем ПЦР фрагмента исходных бактерий должна составлять 1208 п.о.
3.1.3 Нокаут гена astA
С использованием генома Е. coli W3110 (АТСС27325) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча (UP-asL4-S, UP-astA-A) и праймерами для расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча (DN-astA-S, DN-astA-A), созданными в соответствии с расположенными против хода транскрипции и по ходу транскрипции последовательностями его гена adiA (NCBI-GeneID: 12933241) для амплификации расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч гена astA. Способ перекрывающейся ПЦР применяли для слияния вышеприведенных фрагментов с получением фрагмента для нокаутирования гена astA (расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо-расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо). Фрагмент ДНК, полученный путем отжига праймеров gRNA-ast4-S и gRNA-astA-A, лигировали с плазмидой pGRB для конструирования рекомбинантной плазмиды pGRB-astA. Компетентные клетки Е. coli W3110 ARG2 получали в соответствии со способами, описанными в разделах 1.3 и 1.4. Плазмиду pGRB-asL4 и фрагмент для нокаутирования гена astA одновременно подвергали электротрансформации в компетентные клетки, и наконец получали штамм, названный Е. coli W3110 ARG3. Электрофореграмма конструкции фрагмента для нокаутирования гена astA и ПЦР-верификация положительных бактерий представлена на Фиг. 4, где длина расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча должна составлять 443 п.о., длина расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча должна составлять 523 п.о., и полная длина перекрывающегося фрагмента должна составлять 965 п.о., и для ПЦР-верификации длина амплифицированного путем ПЦР фрагмента положительных бактерий должна составлять 1869 п.о., и длина амплифицированного путем ПЦР фрагмента исходных бактерий должна составлять 965 п.о.
3.2 Нокаут гена argE в Е. coli и интегрирование гена argJ из Corynebacterium glutamicum по этому локусу
С использованием генома Е. coli W3110 (АТСС27325) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча (UP-argE-S, UP-argE-A) и праймерами для расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча (DN-argE-S, DN-argE-A), созданными в соответствии с расположенными против хода транскрипции и по ходу транскрипции последовательностями его гена argE (NCBI-GeneID: 12930574) для амплификации расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч гена argE. С использованием генома Corynebacterium glutamicum (АТСС13032) в качестве матрицы осуществляли ПЦР с праймерами (argJ-S, argJ-A), созданными в соответствии с последовательностью его гена argJ (NCBI-GeneID: 1019371) для амплификации фрагмента argJ; промотор Ptrc конструировали в обратном праймере для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча и прямом праймере для гена argJ. Способ перекрывающейся ПЦР применяли для слияния вышеприведенных фрагментов с получением фрагмента для нокаутирования гена argE и интегрирования гена argJ (расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо-Ptrc-argJ-расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо). Фрагмент ДНК, полученный путем отжига праймеров gRNA-argZs-S и gRNA-argE-A, лигировали с плазмидой pGRB для конструирования рекомбинантной плазмиды pGRB-argE. Компетентные клетки Е. coli W3110 ARG3 получали в соответствии со способами, описанными в разделах 1.3 и 1.4. Плазмиду pGRB-argE и фрагмент для нокаутирования гена argE и интегрирования гена argJ одновременно подвергали электротрансформации в компетентные клетки, и наконец получали штамм, названный Е. coli W3110 ARG4. Электрофореграмма конструкции фрагмента для интегрирования и ПЦР-верификация положительных бактерий во время процесса интегрирования фрагмента Ptrc-argJ представлена на Фиг. 5, где длина расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча должна составлять 510 п.о., длина гена argJ должна составлять 1206 п.о., длина расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча должна составлять 668 п.о. и полная длина перекрывающегося фрагмента должна составлять 2458 п.о., и для ПЦР-верификации рекомбинантов длина амплифицированного фрагмента положительных рекомбинантов должна составлять 2458 п.о., и длина амплифицированного фрагмента исходных бактерий должна составлять 2154 п.о.
3.2 Интегрирование оперона синтеза аргинина из Corynebacterium glutamicum в локус гена yghX в Е. coli
Оператор гена синтеза аргинина из Corynebacterium glutamicum (содержащего семь генов argC, argJ, argB, argD, argF, argG и argH) успешно интегрировали в локус гена yjhX в Е. coli, и трансформацию и экспрессию этого чужеродного оперона инициировали промотором Ptrc, и наконец конструировали штамм, названный Е. coli W3110 ARG7.
Интегрирование оператора гена синтеза аргинина из Corynebacterium glutamicum разделено на три стадии.
3.2.1 Интегрирование Ptrc-argC-argJ
С использованием генома Е. coli W3110 (АТСС27325) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча (UP-yghX-S, UP-yghX-A) и праймерами для расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча (DN-yghX-S1, DN-yghX-A), созданными в соответствии с расположенными против хода транскрипции и по ходу транскрипции последовательностями его гена yghX для амплификации расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч гена yghX. С использованием генома Corynebacterium glutamicum (АТСС13032) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами (argC-argJ-S, argC-argJ-A), созданными в соответствии с последовательностями его гена argC-argJ (NCBI-GeneID: 1019370, 1019371), для амплификации фрагмента argC-argJ; промотор Ptrc конструировали в обратном праймере для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча и прямом праймере для гена argC-argJ. Способ перекрывающейся ПЦР применяли для слияния вышеприведенных фрагментов с получением фрагмента для интегрирования генов argC-argJ (расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо-Ptrc-argC-argJ-расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо). Фрагмент ДНК, содержащий целевую последовательность, получали путем отжига праймеров gRNA-yghX-S и gRNA-yghX-A, и затем лигировали с плазмидой pGRB для конструирования рекомбинантной плазмиды pGRB-yghX. Компетентные клетки Е. coli W3110 ARG4 получали в соответствии со способами, описанными в разделах 1.3 и 1.4. Плазмиду pGRB-yghX и фрагмент для интегрирования генов argC-argJ одновременно подвергали электротрансформации в компетентные клетки, и наконец получали штамм, названный Е. coli W3110 ARG5. Электрофореграмма конструкции фрагмента для интегрирования и ПЦР-верификация положительных бактерий во время процесса интегрирования фрагмента Ptrc-argC-argJ представлена на Фиг. 6, где длина расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча должна составлять 602 п.о., длина фрагмента гена argC-argJ должна составлять 2324 п.о., длина расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча должна составлять 561 п.о. и полная длина перекрывающегося фрагмента должна составлять 3650 п.о., и длина амплифицированного фрагмента с использованием праймеров для идентификации должна составлять 1068 п.о., и никакие полосы не должны амплифицироваться из исходных бактерий.
3.2.2 Интегрирование argB-argD-argF
С использованием генома Corynebacterium glutamicum (АТСС13032) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча (UP-argB-argD-argF-S, VP-argB-argD-argF-A), созданными в соответствии с генами argB-argD-argF (NCBI-GeneID: 1019372, 1019373, 1019374) и их расположенной против хода транскрипции последовательностью для амплификации расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча генов argB-argD-argF. С использованием генома Е. coli W3110 (АТСС27325) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча (DN-yghX-S2, ХУН-yghX-A), созданными в соответствии с расположенной по ходу транскрипции последовательностью его гена yghX для амплификации расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча гена yghX. Способ перекрывающейся ПЦР применяли для слияния вышеприведенных фрагментов с получением фрагмента для интегрирования генов argB-argD-argF (argB, расположенный против хода транскрипции для интегрирования генов argB-argD-argF (argB, расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо). Фрагмент ДНК, содержащий целевую последовательность, получали путем отжига праймеров gRNA-argBDF-S и gRNA-argBDF- А, и затем лигировали с плазмидой pGRB для конструирования рекомбинантной плазмиды pGRB-argBDF. Компетентные клетки Е. coli W3110 ARG5 получали в соответствии со способами, описанными в разделах 1.3 и 1.4. Плазмиду pGRB-arg5DF и фрагмент для интегрирования генов argB-argD-argF одновременно подвергали электротрансформации в компетентные клетки, и наконец получали штамм, названный Е. coli W3110 ARG6. Электрофореграмма конструкции фрагмента для интегрирования и ПЦР-верификация положительных бактерий во время процесса интегрирования фрагмента argB-argD-argF представлена на Фиг. 7, где полная длина argB расположенного против хода транскрипции фратмепта-argB-argD-argF составляла 3575 п.о., длина расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча составляла 561 п.о., и длина перекрывающегося фрагмента составляла 4219 п.о., и длина фрагмента, амплифицированного при помощи идентифицирующих праймеров, составляла 1034 п.о., и никакие полосы не должны идентифицироваться из исходных бактерий.
3.2.3 Интегрирование argG-argH
С использованием генома Corynebacterium glutamicum (АТСС13032) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча (UP-argG-argH-S, UP-argG-argH- А) и праймерами для фрагмента argG-argH (argG-argH-S, argG-argH-A), созданными в соответствии с argG-argH (NCBI-GeneID: 1019376, 1019377) и его расположенной против хода транскрипции последовательностью для амплификации расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча генов argG-argH и фрагмента argG-argH. С использованием генома Е. coli W3110 (АТСС27325) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча (DN-yghX-S3, DN-yghX-A), созданными в соответствии с расположенным по ходу транскрипции его геном yghX для амплификации расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча гена yghX. Способ перекрывающейся ПЦР применяли для слияния вышеприведенных фрагментов с получением фрагмента для интегрирования генов argG-argH {argG расположенный против хода транскрипции фрагмепт-argG-argH-расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо). Фрагмент ДНК, содержащий целевую последовательность, получали путем отжига праймеров gRNA-argG-argH-S и gRNA-argG-argH-A, и затем лигировали с плазмидой pGRB для конструирования рекомбинантной плазмиды pGRB-argG-argH. Компетентные клетки Е. coli W3110 ARG6 получали в соответствии со способами, описанными в разделах 1.3 и 1.4. Плазмиду pGRB-argG-argH и фрагмент для интегрирования генов argG-argH одновременно подвергали электротрансформации в компетентные клетки, и, наконец, получали штамм, названный Е. coli W3110 ARG7. Электрофореграмма конструкции фрагмента для интегрирования и ПЦР-верификация положительных бактерий во время процесса интегрирования фрагмента argG-argH представлена на Фиг. 8, где полная длина расположенного против хода транскрипции фрагмента argG составляла 405 п.о., полная длина фрагмента argG-argH составляла 2826 п.о., длина расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча составляла 561 п.о. и длина перекрывающегося фрагмента должна составлять 3875 п.о., и длина фрагмента, амплифицированного при помощи идентифицирующих праймеров, должна составлять 1521 п.о., и никакие полосы не должны идентифицироваться из исходных бактерий.
3.3 Интегрирование генов pyrAA-pyrAB из В. subtilis в локус reuayjiT в Е. coli
В. subtilis А260 была получена из В. subtilis 168 в качестве исходного штамма путем комбинирования мутагенеза ARTP (технология плазмы при атмосферном давлении и комнатной температуре) и высокопроизводительного скрининга (этот штамм был депонирован 2 декабря 2015 года в China General Microbiological Culture Collection Center (Главный центр коллекции микробиологических культур Китая) (Address: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, No.l West Beichen Road, Chaoyang District, Beijing, Postcode: 100101) под номером депонирования CGMCC No. 11775). Этот штамм облегчал обратную регуляцию со стороны уридиловой кислоты и аргинина в отношении карбамилфосфат-синтетазы, и путем секвенирования пиримидиново-нуклеотидного оперона гена было обнаружено, что остаток глутаминовой кислоты в положении 949 был делетирован в большой субъединице карбамилфосфата (кодируемого pyrAB) (номер публикации: CN105671007A). Гены карбамилфосфат-синтетазы (pyrAA, pyrAB) в В. subtilis А260 без обратного ингибирования аргинина интегрировали в Е. coli для улучшения поступления предшественника карбамилфосфата в процессе синтеза аргинина.
Фрагмент гена pyrAA-pyrAB длиной 4292 п.о. из В. subtilis интегрировали в Е. coli в двух сегментах, где первый сегмент составлял 2651 п.о., и второй сегмент составлял 1641 п.о.
3.3.1 Интегрирование первого сегмента Ptrc-pyrAA-pyrAB
С использованием генома Е. coli W3110 (АТСС27325) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча (UP-jj/T-S, UP-yjiT-A) и праймерами для расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча (DN-yjiT-S, DN-yjiT-A), созданными в соответствии с расположенными против хода транскрипции и по ходу транскрипции последовательностями его гена yjiT для амплификации расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч reuayjiT. С использованием генома В. subtilis (CGMCC No. 11775) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами (l-pyrAA-pyrAB-S, 1-pyrAA-pyrAB-А), созданными в соответствии с геном pyrAA (NCBI-GeneID: 937368) и геном pyrAB (NCBI-GeneID: 936608) для амплификации первого сегмента фрагмента гена pyrAA-pyrAB. Промотор Pfre создавали в обратном праймере для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча и в прямом праймере для генов pyrAA-pyrAB. Способ перекрывающейся ПЦР применяли для слияния вышеприведенных фрагментов с получением фрагмента для интегрирования первого сегмента pyrAA-pyrAB (расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо-Ptrc-pyrAA-pyrAB-расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо). Фрагмент ДНК, содержащий целевую последовательность, получали путем отжига праймеров gRNA-yjiT-S и gRNA-yjiT-A, и затем лигировали с плазмидой pGRB для конструирования рекомбинантной плазмиды pGRB-yjiT. Компетентные клетки Е. coli W3110 ARG7 получали в соответствии со способами, описанными в разделах 1.3 и 1.4. Плазмиду pGRB-yjiT и фрагмент для интегрирования первого сегмента pyrAA-pyrAB одновременно подвергали электротрансформации в компетентные клетки, и наконец получали штамм, названный Е. coli W3110 ARG8. Электрофореграмма конструкции фрагмента для интегрирования первого сегмента pyrAA-pyrAB и ПЦР-верификация положительных бактерий представлена на Фиг. 9, где длина расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча должна составлять 316 п.о., длина первого сегмента фрагмента гена pyrAA-pyrAB должна составлять 2651 п.о., длина расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча должна составлять 667 п.о. и полная длина интегрированного фрагмента должна составлять 3634 п.о., и длина фрагмента, амплифицированного при помощи идентифицирующих праймеров, должна составлять 1100 п.о., и никакие полосы не должны идентифицироваться из исходных бактерий.
3.3.2 Интегрирование второго сегмента pyrAA-pyrAB
С использованием генома5. subtilis А260 (CGMCC No. 11775) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча (2-pyrAA-pyrAB-S, 2-pyrAA-pyrAB-А), созданными в соответствии с о вторым сегментом pyrAA-pyrAB и его расположенной против хода транскрипции последовательностью для амплификации расположенного против хода транскрипции расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча (содержащего первый сегмент, расположенной против хода транскрипции последовательности pyrAA-pyrAB длиной 266 п.о., и второй последовательности pyrAA-pyrAB длиной 1641 п.о., в сумме 1907 п.о.). С использованием генома Е. coli W3110 (АТСС27325) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча (DN-yjiT-S 1, DN-yjiT-A), созданными в соответствии с расположенной по ходу транскрипции последовательностью его гена yjiT для амплификации расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча гена yjiT.
Способ перекрывающейся ПЦР применяли для слияния вышеприведенных фрагментов с получением фрагмента для интегрирования второго сегмента pyrAA-pyrAB (второй сегмент pyrAA-pyrAB-расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо). Фрагмент ДНК, содержащий целевую последовательность, получали путем отжига праймеров gRNA-pyrAA-pyrAB-S и gRNA-pyrAA-pyrAB-A, и затем лигировали с плазмидой pGRB для конструирования рекомбинантной плазмиды pGRB-pyrAA-pyrAB. Компетентные клетки Е. coli W3110 ARG8 получали в соответствии со способами, описанными в разделах 1.3 и 1.4. Плазмиду pGRB-pyrAA-pyrAB и фрагмент для интегрирования второго сегмента pyrAA-pyrAB одновременно подвергали электротрансформации в компетентные клетки, и наконец получали штамм, названный Е. coli W3110 ARG9. Электрофореграмма конструкции интегрированного фрагмента и ПЦР-верификация положительных бактерий во время процесса интеграции второго сегмента pyrAA-pyrAB представлена на Фиг. 10, где полная длина расположенной против хода транскрипции последовательности второго сегмента pyrAA-pyrAB должна составлять 1907 п.о., длина расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча должна составлять 667 п.о., и полная длина перекрывающегося фрагмента должна составлять 2574 п.о., и длина фрагмента, амплифицированного при помощи идентифицирующих праймеров, должна составлять 1135 п.о., и никакие полосы не должны идентифицироваться из исходных бактерий.
3.4 Интегрирование гена lys Е из Corynebacterium efficiens в локус гена ilvG в Е. coli
С использованием генома Е. coli W3110 (АТСС27325) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с праймерами для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча (UP-ilvG-S, UP-ilvG-A) и праймерами для расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча (DN-ilvG-S, DN-ilvG-A), созданными в соответствии с расположенными против хода транскрипции и по ходу транскрипции последовательностями его гена ilvG для амплификации расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч гена ilvG; ПЦР осуществляли с праймерами (lysE-S, lysE-A), созданными в соответствии с последовательностью гена lysE (референсная последовательность NCBI: WP 143758438.1) (SEQ ID NO: 68) для амплификации фрагмента гена lysE. Промотор Ptrc конструировали в обратном праймере для расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча и в прямом праймере для гена lysE. Способ перекрывающейся ПЦР применяли для слияния вышеприведенных фрагментов с получением фрагмента для интегрирования гена lysE (расположенное против хода транскрипции гомологичное плечо-Ptrc-lysE-расположенное по ходу транскрипции гомологичное плечо). Фрагмент ДНК, содержащий целевую последовательность, получали путем отжига праймеров gRNA-ilvG-S и gRNA-ilvG-A, и затем лигировали с плазмидой pGRB для конструирования рекомбинантной плазмиды pGRB-ilvG. Компетентные клетки Е. coli W3110 ARG9 получали в соответствии со способами, описанными в разделах 1.3 и 1.4. Плазмиду pGRB-ilvG и фрагмент для интегрирования гена lysE одновременно подвергали электротрансформации в компетентные клетки, и наконец получали штамм, названный Е. coli W3110 ARG10. Электрофореграмма конструкции интегрированного фрагмента Ptrc-lysE и ПЦР-верификация положительных бактерий представлена на Фиг. 11, где длина расположенного против хода транскрипции гомологичного плеча должна составлять 412 п.о., длина фрагмента гена Ptrc-lysE должна составлять 806 п.о., длина расположенного по ходу транскрипции гомологичного плеча должна составлять 481 п.о., и полная длина интегрированного фрагмента должна составлять 1699 п.о., и для ПЦР-верификации фрагмент, амплифицированный при помощи ПЦР из положительных бактерий, должен составлять 1699 п.о., и фрагмент, амплифицированный при помощи ПЦР из исходных бактерий, должен составлять 1426 п.о.
Пример 2:
Способ продуцирования аргинина путем ферментации генно-инженерного штамма Е. coli W3110 ARG10 был следующим:
(1) Ферментация во встряхиваемой колбе
культура на скошенном агаре: инокулируют бактериальный штамм, который хранили при -80°С, на активированный скошенный агар с использованием способа посева штрихами, культивируют при 37°С в течение 12 ч и осуществляют однократное пассирование;
посевная культура для ферментации во встряхиваемой колбе: соскребают кольцо посевов на скошенном агаре при помощи петли для инокуляции и инокулируют в коническую колбу объемом 500 мл, содержащую 30 мл среды для посева, коническую колбу закрывают девяти слоями марли, и культивируют при 37°С и 200 об./мин в течение 7-10 ч;
ферментация культуры во встряхиваемой колбе: инокулируют посевную культуру в концентрации 15% (об./об.) в коническую колбу объемом 500 мл, содержащую ферментационную среду (конечный объем: 30 мл), коническую колбу закрывают девяти слоями марли, культивируют при 37°С и 200 об./мин на встряхивающей платформе, во время ферментации добавляют аммиачную воду для поддержания рН на уровне 7,0-7,2; добавляют 60% (масс./об.) раствор глюкозы для поддержания ферментации; период ферментации длится в течение 26-30 ч.
Компоненты среды для скошенного агара: 1 г/л глюкозы, 10 г/л пептона, 10 г/л говяжьего экстракта, 5 г/л сухих дрожжей, 2,5 г/л NaCl, 20 г/л агара, остальное представляло собой воду, рН 7,0-7,2.
Компоненты посевной среды: 25 г/л глюкозы, 5 г/л дрожжевого экстракта, 3 г/л пептона, 1 г/л K2HPO4, 1 г/л MgSO4⋅7H2O, 10 мг/л FeSO4⋅7H2O, 10 мг/л MnSO4⋅7H2O, 1 мг/л каждого из VB1, VB3, VB5, VB12 и VH, остальное представляло собой воду, рН 7,0-7,2.
Компоненты ферментационной среды: 25 г/л глюкозы, 3 г/л дрожжевого экстракта, 2 г/л пептона, 3 г/л K2HPO4, 2 г/л MgSO4⋅7H2O, 10 мг/л FeSO4⋅7H2O, 10 мг/л MnSO4⋅7H2O, 1 мг/л каждого из VB1, VB3, VB5, VB12 и VH, остальное представляло собой воду, рН 7,0-7,2.
После 26-30 ч ферментации во встряхиваемой колбе выход L-аргинина в ферментационном бульоне штамма Е. coli W3110 ARGI0 составлял 30-32 г/л.
(2) Ферментация в ферментере
культура на активированном скошенном агаре: соскребают кольцо бактериального штамма, который хранили при -80°С, и однородно распределяют на активированном скошенном агаре, культивируют при 37°С в 12-16 ч и переносят в колбу в форме баклажана для продолжения культивирования в течение 12-16 ч;
посевная культура: необходимое количество стерилизованной воды добавляют в колбу в форме баклажана, инокулируют бактериальную суспензию в посевную среду, рН поддерживают на уровне приблизительно 7,0, температуру поддерживают на уровне 37°С и растворенный кислород поддерживают на уровне 25-35%, и культивируют клетки до достижения сухой массы клеток 5-6 г/л;
ферментационная культура: инокулируют посевную культуру в концентрации 15% в свежую ферментационную среду, начинают ферментацию, и во время ферментационного процесса поддерживают стабильное значение рН на уровне примерно 7,0, температуру на уровне 35°С и растворенный кислород на уровне 25-35%; когда глюкоза в среде истощалась, тогда 80% (масса/об.) раствор глюкозы добавляли для поддержания концентрации глюкозы в ферментационной среде на уровне 0,1-5 г/л.
Среда для скошенного агара, посевная среда и ферментационная среда были такими же, что среда для ферментации во встряхиваемой колбе.
Накопление L-аргинина достигало 130-135 г/л после культивирования в течение 50-55 ч в ферментере объемом 5 л. Скорость превращения составляла 0,48 г аргинина/г глюкозы, и интенсивность продуцирования составляла 2,5 г аргинина/л/ч. Ферментационная кривая представлена на Фиг. 12.
Воплощения настоящего изобретения описаны выше. Однако настоящее изобретение не ограничено вышеприведенными воплощениями. Любая модификация, эквивалентные замены, улучшения и т.п., осуществленные в пределах сущности и принципов настоящего изобретения, должны быть включены в объем защиты данного изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
--->
<110> NINGXIA EPPEN BIOTECH CO., LTD
<120> ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ БАКТЕРИИ ДЛЯ ПРОДУЦИРОВАНИЯ L-АРГИНИНА И СПОСОБ
КОНСТРУИРОВАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ БАКТЕРИЙ
<130>
<150> 201911211097.X
<151> 2019-12-02
<160> 68
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 1
ttaacctgtc tcaccgttct gg 22
<210> 2
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 2
acaaacctgc ctcgaactct tccgctgacg aaggcaaacc 40
<210> 3
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 3
ggtttgcctt cgtcagcgga agagttcgag gcaggtttgt 40
<210> 4
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 4
catataccag atcgccgcag t 21
<210> 5
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 5
cgagtttctc catcaagaca cct 23
<210> 6
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 6
cgcccataga gaacaggaac atgcggcttg gcaccatata 40
<210> 7
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 7
tatatggtgc caagccgcat gttcctgttc tctatgggcg 40
<210> 8
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 8
tatcgccgaa gttttcacca g 21
<210> 9
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 9
ggcactcatg gcaccacct 19
<210> 10
<211> 37
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 10
tgagggcatc cagttgtgcc tgcatcagcg ccgagac 37
<210> 11
<211> 37
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 11
gtctcggcgc tgatgcaggc acaactggat gccctca 37
<210> 12
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 12
tgaccaggga aattatacgg c 21
<210> 13
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 13
gcccgcttca agaaactgc 19
<210> 14
<211> 76
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 14
aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaaggcg 60
cttattgaag gtgtgg 76
<210> 15
<211> 81
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 15
tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60
atggcagaaa aaggcattac c 81
<210> 16
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 16
gttgatgagc ctgattaatt gagcgccctt ttccctgctt gttag 45
<210> 17
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 17
ctaacaagca gggaaaaggg cgctcaatta atcaggctca tcaac 45
<210> 18
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 18
ctgtatcctt cacgtcgcat tg 22
<210> 19
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 19
gcgcaacgta gaacaggaat t 21
<210> 20
<211> 79
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 20
aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaagatt 60
gaagcgcctt tactactcc 79
<210> 21
<211> 85
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 21
tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60
atgatcatgc ataacgtgta tggtg 85
<210> 22
<211> 86
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 22
gccccaaggg gttatgctag cctacaaatt gagttatgtt catttaaata tgatgttgtt 60
cagttaagag ctgtacgcgg agttga 86
<210> 23
<211> 89
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 23
ctgaacaaca tcatatttaa atgaacataa ctcaatttgt aggctagcat aaccccttgg 60
ggcgtcatag taatccagca actcttgtg 89
<210> 24
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 24
gagcaggtat ttacgtgaac cg 22
<210> 25
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 25
gtacgcagct tgttctgata tcg 23
<210> 26
<211> 81
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 26
agttgctgga ttactatgac cctagaagaa atcaaccagc gcatcagaaa gtctcctgtg 60
catttacctc ggctggttgg c 81
<210> 27
<211> 89
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 27
atgcacagga gactttctga tgcgctggtt gatttcttct agggtcatag taatccagca 60
actgtcatag taatccagca actcttgtg 89
<210> 28
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 28
gatatttcca tcatcgctcc tg 22
<210> 29
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 29
ctcgggttat accttacctg ccttacctcg gctggttggc 40
<210> 30
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 30
gccaaccagc cgaggtaagg caggtaaggt ataacccgag 40
<210> 31
<211> 81
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 31
caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60
ttgttatcga cgtacccccg c 81
<210> 32
<211> 89
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 32
aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60
aatgtcatag taatccagca actcttgtg 89
<210> 33
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 33
aatagttgtt gccgcctgag t 21
<210> 34
<211> 76
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 34
aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaaaaaa 60
caggcagcaa agtccc 76
<210> 35
<211> 87
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 35
tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60
atgaagagac gattagtact ggaaaac 87
<210> 36
<211> 86
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 36
gccccaaggg gttatgctag cctacaaatt gagttatgtt catttaaata tgatgttgtt 60
cagagaagac atcgatagcg gaaaat 86
<210> 37
<211> 86
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 37
ctgaacaaca tcatatttaa atgaacataa ctcaatttgt aggctagcat aaccccttgg 60
ggcaagcact acctgtgaag ggatgt 86
<210> 38
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 38
cagggcttcc acagtcacaa t 21
<210> 39
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 39
acccggtgac aggaaaaaca t 21
<210> 40
<211> 85
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 40
caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60
ttgtcatata gtgactgccg cctcc 85
<210> 41
<211> 86
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 41
aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60
aataagcact acctgtgaag ggatgt 86
<210> 42
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 42
accgaggagc agacaatgaa taa 23
<210> 43
<211> 76
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 43
aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaaggtg 60
atggcaacaa caggga 76
<210> 44
<211> 82
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 44
tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60
atggaaattt tcgttacggg tc 82
<210> 45
<211> 87
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 45
caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60
ttgttagccc atcagaatca gtttcac 87
<210> 46
<211> 84
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 46
aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60
aatctatcta cgcgccgttg ttgt 84
<210> 47
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 47
gcgctggcta acatgaggaa 20
<210> 48
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 48
agtcctaggt ataatactag ttgcgtactt acaatattgc cgttttagag ctagaa 56
<210> 49
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 49
ttctagctct aaaacggcaa tattgtaagt acgcaactag tattatacct aggact 56
<210> 50
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 50
agtcctaggt ataatactag ttatcgggcc aatctatccg cgttttagag ctagaa 56
<210> 51
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 51
ttctagctct aaaacgcgga tagattggcc cgataactag tattatacct aggact 56
<210> 52
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 52
agtcctaggt ataatactag ttctctgcgg caccgggcaa agttttagag ctagaa 56
<210> 53
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 53
ttctagctct aaaactttgc ccggtgccgc agagaactag tattatacct aggact 56
<210> 54
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 54
agtcctaggt ataatactag ttgcagattt aatcactctg cgttttagag ctagaa 56
<210> 55
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 55
ttctagctct aaaacgcaga gtgattaaat ctgcaactag tattatacct aggact 56
<210> 56
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 56
agtcctaggt ataatactag tggtgcctga cgaccataaa agttttagag ctagaa 56
<210> 57
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 57
ttctagctct aaaactttta tggtcgtcag gcaccactag tattatacct aggact 56
<210> 58
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 58
ctgaacaaca tcatatttaa atgaacataa ctcaatttgt aggctagcat aaccccttgg 60
ggc 63
<210> 59
<211> 86
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 59
gccccaaggg gttatgctag cctacaaatt gagttatgtt catttaaata tgatgttgtt 60
cagttaagag ctgtacgcgg agttga 86
<210> 60
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 60
atgcacagga gactttctga tgcgctggtt gatttcttct agggtcatag taatccagca 60
act 63
<210> 61
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 61
agttgctgga ttactatgac cctagaagaa atcaaccagc gcatcagaaa gtctcctgtg 60
cat 63
<210> 62
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 62
agtcctaggt ataatactag tagggattat gaacggcaat ggttttagag ctagaa 56
<210> 63
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 63
ttctagctct aaaaccattg ccgttcataa tccctactag tattatacct aggact 56
<210> 64
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 64
ctgaacaaca tcatatttaa atgaacataa ctcaatttgt aggctagcat aaccccttgg 60
ggc 63
<210> 65
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 65
gccccaaggg gttatgctag cctacaaatt gagttatgtt catttaaata tgatgttgtt 60
cag 63
<210> 66
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 66
agtcctaggt ataatactag tggaagagtt gccgcgcatc agttttagag ctagaa 56
<210> 67
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 67
ttctagctct aaaactgatg cgcggcaact cttccactag tattatacct aggact 56
<210> 68
<211> 687
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 68
atggaaattt tcgttacggg tctgctgctg ggtgccagtc tgctgctggc catcggtccg 60
cagaacgtgc tcgtgatcaa acaaggcatc aagcgcgaag gtatcaccgc ggttatcatc 120
gtgtgtctgc tgagcgacgt tgtgctgttc acgctgggca cgctgggcgt tggtctgatc 180
agcgataccg cgccgatcat tctggatatt ctgcgctggt gcggtatcgc ctatctgctg 240
tggtttgcgg ttatggccgc gcgtgatgcg ctgcgtgcgc gtaccgaagt gacgttcgtt 300
gaacacagcg aaccagttgc cgcggccagt gcgagtggtg gtggtgttac gaccaaacag 360
cgcccacgtc tgcgtatcac gagcggtacc cgccaagttt gggttcgccc gatgctgatg 420
gcgatcgttc tgacgtggct gaatccgaac gcgtatctgg atgcgttcgt tttcatcggc 480
ggtgttggcg cgcagtatgg cgaaaccggt cgctggattt ttgcggcggg tgcgtttgcc 540
gcgagtctgg tttggtttcc gctggttggt tatggtgccg ccgcgctgag tcgtccactg 600
agtagcccac gcgtgtggcg ctggatcaat atcggcgttg ccgtggttct gaccggtctg 660
gcggtgaaac tgattctgat gggctaa 687
<---
Claims (24)
1. Генно-инженерная бактерия для продуцирования L-аргинина, которая содержит два гена pyrAA и pyrAB, кодирующие карбамоилфосфат-синтетазу, и где гены pyrAA и pyrAB происходят из Bacillus subtilis; которая дополнительно содержит ген, кодирующий фермент пути биосинтеза L-аргинина, выбранный из одного или более из следующих ферментов: argC, argJ, argB, argD, argF, argG, argH; которая дополнительно содержит ген lysE, кодирующий транспортер аргинина; и для которой в качестве исходной бактерии берут Escherichia coli с одновременным нокаутом генов speA, adiA, astA и argE.
2. Генно-инженерная бактерия по п. 1, где Escherichia coli выбрана из E. Coli W3110 или E. coli MG1655.
3. Генно-инженерная бактерия по п. 1 или 2, где гены pyrAA и pyrAB интегрированы в локус гена yjiT в E. coli.
4. Генно-инженерная бактерия по п. 1 или 2, где ген, кодирующий фермент пути биосинтеза L-аргинина, управляется промотором Ptrc.
5. Генно-инженерная бактерия по п. 1 или 2, где ген, кодирующий фермент пути биосинтеза L-аргинина, интегрирован в локус гена yghX в E. coli.
6. Генно-инженерная бактерия по п. 1 или 2, где ген lysE интегрирован в локус гена ilvG в E. coli; предпочтительно, ген lysE имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 68.
7. Способ конструирования генно-инженерной бактерии, включающий следующие стадии:
(1) интегрирование генов pyrAA и pyrAB в геном исходной бактерии, где в качестве исходной бактерии для указанной генно-инженерной бактерии берут Escherichia coli и гены pyrAA и pyrAB происходят из Bacillus subtilis;
(2) интегрирование генов ферментов пути биосинтеза аргинина, включающих гены argC, argJ, argB, argD, argF, argG и argH; интегрирование гена lysE, кодирующего транспортер аргинина; (3) нокаутирование генов speA и adiA, кодирующих аргинин-декарбоксилазу, гена, кодирующего аргинин-сукцинилтрансферазу astA, и гена, кодирующего ацетилорнитин-деацетилазу argE.
8. Способ конструирования по п. 7, который включает стадии:
(1) нокаутирования следующих трех генов в E. coli: гена speA, кодирующего аргинин-декарбоксилазу, гена adiA, кодирующего аргинин-декарбоксилазу, и гена astA, кодирующего аргинин-сукцинилтрансферазу;
(2) нокаутирование гена argE, кодирующего ацетилорнитин-деацетилазу, в E.coli, и интегрирование гена argJ, кодирующего глутаматацетилтрансферазу, в E. coli;
(3) интегрирование следующего генного кластера, связанного с биосинтезом аргинина: argC, argJ, argB, argD, argF, argG и argH;
(4) интегрирование генов pyrAA и pyrAB, кодирующих карбамоилфосфат-синтетазу;
(5) интегрирование гена lysE, кодирующего транспортер аргинина, в геном E. coli.
9. Способ конструирования по п. 7 или 8, включающий применение опосредованной CRISPR/Cas9 технологии редактирования гена для осуществления интегрирования и нокаутирования гена.
10. Способ конструирования по п. 7 или 8, включающий стадии конструирования рекомбинантного фрагмента и плазмиды pGRB.
11. Способ конструирования по п. 10, где стадия конструирования плазмиды pGRB включает: создание целевой последовательности, получение фрагмента ДНК, содержащего целевую последовательность, и рекомбинацию фрагмента ДНК, содержащего целевую последовательность, с линеаризованным фрагментом вектора;
предпочтительно, в данном способе конструирования стадия конструирования рекомбинантного фрагмента включает конструирование рекомбинантного фрагмента для интегрирования гена или для нокаутирования генов.
12. Способ конструирования по п. 11, где стадия конструирования рекомбинантного фрагмента для интегрирования гена включает: использование генома исходной бактерии в качестве матрицы, создание праймеров для расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч в соответствии с расположенными против хода транскрипции и по ходу транскрипции последовательностями предполагаемого сайта встраивания целевого гена, и создание праймеров в соответствии с целевым геномом для амплификации фрагмента целевого гена, и затем осуществление перекрывающейся ПЦР (полимеразная цепная реакция) с получением рекомбинантного фрагмента; предпочтительно, стадия конструирования рекомбинантного фрагмента для нокаутирования генов включает: использование расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции последовательностей нокаутируемого гена в качестве матриц, создание праймеров для расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч; соответственно амплификацию расположенных против хода транскрипции и по ходу транскрипции гомологичных плеч посредством ПЦР, и затем получение рекомбинантного фрагмента при помощи перекрывающейся ПЦР.
13. Способ конструирования по п. 12, где данный способ конструирования включает: одновременную трансформацию плазмиды pGRB и вышеупомянутого рекомбинантного фрагмента в электропорационно-компетентные клетки, содержащие pREDCas9, и элиминацию плазмид с получением рекомбинантной генно-инженерной бактерии.
14. Способ продуцирования L-аргинина путем ферментации генно-инженерной бактерии по любому из пп. 1-6, включающий: приведение вышеупомянутой генно-инженерной бактерии в контакт с ферментационной средой и осуществление ферментации с получением L-аргинина.
15. Способ по п. 14, где ферментация включает ферментацию во встряхиваемой колбе или ферментацию в ферментере; предпочтительно, накопление L-аргинина достигает 130-135 г/л, скорость превращения достигает 0,48 г аргинина/г глюкозы, и интенсивность продуцирования
достигает 2,5 г аргинина/л/ч.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911211097.X | 2019-12-02 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2820627C1 true RU2820627C1 (ru) | 2024-06-06 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1204255C (zh) * | 1999-02-01 | 2005-06-01 | 味之素株式会社 | 棒杆菌的氨甲酰磷酸合成酶基因和生产l-精氨酸的方法 |
RU2337958C2 (ru) * | 2006-01-26 | 2008-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН bisC |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1204255C (zh) * | 1999-02-01 | 2005-06-01 | 味之素株式会社 | 棒杆菌的氨甲酰磷酸合成酶基因和生产l-精氨酸的方法 |
RU2337958C2 (ru) * | 2006-01-26 | 2008-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН bisC |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NCBI Reference Sequence: NP_389434.1, 18.09.2018, pyrimidine-specific carbamoyl-phosphate synthetase (small subunit, glutaminase subunit) [Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168] Найдено в интернет по адресу https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/16078615?sat=46&satkey=166720971. NCBI Reference Sequence: NP_389435.1, 18.09.2018, pyrimidine-specific carbamoyl-phosphate synthetase (large subunit) [Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168] Найдено в интернет по адресу https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/16078616?sat=46&satkey=166720971. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220411833A1 (en) | Gene engineering bacteria for producing l-arginine and construction method and application of gene engineering bacteria | |
RU2418069C2 (ru) | Способ конструирования рекомбинантных бактерий, принадлежащих к роду pantoea, и способ продукции l-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду pantoea | |
JP7475434B2 (ja) | L-トリプトファン産生効率を向上させるトランスポーター遺伝子の大腸菌における使用 | |
CN109777763B (zh) | 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用 | |
WO2020237701A1 (zh) | 一株高产l-组氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
CN114457123B (zh) | 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用 | |
CN113278568B (zh) | 生产l-缬氨酸的重组大肠杆菌及其应用 | |
WO2021238183A1 (zh) | 生产l-缬氨酸的重组微生物、其构建方法及应用 | |
WO2019136618A1 (zh) | 高产尿苷的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
CN115806929A (zh) | 一种生产l-精氨酸的基因工程菌及其应用 | |
CN118086167A (zh) | 一种生产l-色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
CN105980544B (zh) | 生产l-氨基酸的微生物及使用所述微生物生产l-氨基酸的方法 | |
CN112280728B (zh) | 一种生产l-瓜氨酸的基因工程菌株及其应用 | |
RU2820627C1 (ru) | Генно-инженерные бактерии для продуцирования l-аргинина и способ конструирования и применения генно-инженерных бактерий | |
CN116121160A (zh) | 过表达pyrB基因的基因工程菌及其生产L-精氨酸的方法 | |
RU2806731C1 (ru) | Применение гена транспортного переносчика, который улучшает эффективность продуцирования l-триптофана у escherichia coli | |
WO2023246071A1 (zh) | 一种mreC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用 | |
CN115948318B (zh) | 利用弱化了rhaB基因的大肠杆菌提高细胞内ATP水平的方法 | |
US20150247174A1 (en) | Engineering bacteria for producing dl-alanine and method for producing dl-alanine by using engineering bacteria |