CN1204255C

CN1204255C - 棒杆菌的氨甲酰磷酸合成酶基因和生产l－精氨酸的方法

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Publication number: CN1204255C
Application number: CNB001046977A
Authority: CN
Inventors: 桑原阳子; 桥口贤一; 中松亘; 仓桥修; 森由纪子; 伊藤久生
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-02-01
Publication date: 2005-06-01
Anticipated expiration: 2020-02-01
Also published as: US20030124685A1; EP1026247A1; US20030082775A1; US20030082774A1; CN1270223A; US20050095680A1; US7297521B2; US6908754B2

Abstract

编码在(a)或(b)和(c)或(d)中定义的多肽的DNA片段：(a)至少具有SEQ ID NO(SIN)：2的第50-393位氨基酸序列的多肽，(b)至少具有SIN：2的第50-393位的氨基酸序列，包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或倒置，并能构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性，具有SIN：3的氨基酸序列的氨甲酰磷酸合成酶的大亚单位蛋白质的多肽，(c)具有SIN：3氨基酸序列的多肽，(d)具有包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或倒置的SIN：3氨基酸序列，并能构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性，具有SIN：2的第50-393位氨基酸序列的氨甲酰磷酸合成酶的小亚单位蛋白质的多肽。

Description

棒杆菌的氨甲酰磷酸合成酶基因和生产L-精氨酸的方法

本发明涉及棒杆菌的氨甲酰磷酸合成酶，和它的编码基因。该基因可以用于氨甲酰磷酸合成酶和其亚单位的生产，繁育生产L-精氨酸的细菌和生产核酸的细菌等等。

氨甲酰磷酸合成酶是催化从碳酸，ATP，和谷氨酰胺生产氨甲酰磷酸的反应的酶。这些反应生成的氨甲酰磷酸的作用是在L-精氨酸生物合成途径中从鸟氨酸生产瓜氨酸的反应需要的氨甲酰基团的来源。另外，从天冬氨酸和氨甲酰磷酸生产的氨甲酰天冬氨酸是包括尿苷5’单磷酸的吡啶生物合成系统的一个中间产物。

氨甲酰磷酸合成酶包括两个亚单位，并且对于大肠杆菌或芽孢杆菌属的细菌，已知这些亚单位是carA和carB基因编码的。

但是，对于棒杆菌，还没有发现氨甲酰磷酸合成酶活性和其酶和其任何编码基因的阐述。

偶尔，报道了当在加入是氨甲酰磷酸合成酶的底物的谷氨酰胺的培养基中培养导入了含有基因carA，carB，argI和arg盒的质粒的大肠杆菌的转化体时，细胞内L-精氨酸的浓度相同于仅仅导入载体的对照菌株。但是，当转化体培养在加入谷氨酰胺以及是ArgI和氨甲酰磷酸的底物鸟氨酸的培养基中时，细胞内的L-精氨酸的浓度高于对照菌株的(Malamy M.等人，应用环境微生物学，63(1)，33(1997))。从这些结果表明，L-精氨酸的合成中决定速度的步骤是鸟氨酸的供应。

认为，供应鸟氨酸的速度决定步骤是N-乙酰谷氨酰胺合成酶(ArgA)是可能的。ArgA在大肠杆菌的生物合成途径中受到最后产物L-精氨酸的反馈抑制。

对于质粒扩增了编码反馈抑制脱敏ArgA的argA基因的菌株，甚至在只加入谷氨酰胺的培养基以及加入谷氨酰胺和鸟氨酸的培养基中细胞内L-精氨酸的浓度增加了。但是，在菌株培养时加入谷氨酰胺，或谷氨酰胺和鸟氨酸的情况中，同时在菌株中进一步扩增carA和carB基因的情况中没有观察到细胞内L-精氨酸的浓度的进一步增加(Malamy M.等人，应用环境微生物学，64(5)，1805(1998))。

在另一方面，还没有关于利用编码起源于棒杆菌的氨甲酰合成酶的基因增强微生物的L-精氨酸的生产能力的尝试的报道。

本发明的一个目的是提供棒杆菌的氨甲酰磷酸合成酶，编码它的基因，和利用该基因的微生物生产L-精氨酸的方法。

本发明的发明人为了达到前面提到的目的进行了扎实的研究。结果，本发明人成功地通过利用大肠杆菌的carB缺陷菌株从谷氨酸棒杆菌的野生型菌株获得含有carA基因和carB基因的DNA片段，并且完成了本发明。

即，本发明提供了下面的物质。

(1)编码下面(A)或(B)定义的多肽的DNA片段：

(A)具有至少含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第50-393位的氨基酸的氨基酸序列的多肽，

(B)具有至少含有包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或倒置的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第50-393位的氨基酸的氨基酸序列，和能够构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性，其含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨甲酰磷酸合成酶的大亚单位的蛋白质的多肽。

(2)编码在下面(C)或(D)中编码多肽的DNA片段：

(C)含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，

(D)含有包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加，或倒置的SEQID NO：3的氨基酸序列，并且能够构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性，其氨甲酰磷酸合成酶的小亚单位具有至少含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第50-393位氨基酸的氨基酸序列的多肽。

(3)编码含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中包括了一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或倒置，并且能够构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性的蛋白质的多肽的DNA片段。

(4)编码下面(a)或(b)中定义的多肽，和下面(c)或(d)中定义的多肽的DNA片段：

(a)具有至少含有SEQ ID NO：2中氨基酸第50-393位的氨基酸序列的多肽，

(b)具有至少含有在SEQ ID NO：2中包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或到置的氨基酸第50-393位的氨基酸序列，并且构成具有氨甲酰磷酸合成酶，和含有SEQ ID NO：3的氨基酸磷酸合成酶的大亚单位的蛋白质的多肽，

(c)含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，

(d)含有包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或到置的SEQ IDNO：3的氨基酸序列，并且构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性，其具有SEQ IDNO：2中的氨基酸第50-393位的氨基酸序列的氨甲酰磷酸合成酶的小亚单位的蛋白质的多肽。

(5)根据(1)所述的DNA片段，加具有至少含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的核苷酸第430-1461位的核苷酸序列。

(6)根据(2)所述的DNA片段，具有至少含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的核苷酸第1756-4809位的核苷酸序列。

(7)根据(3)所述的DNA片段，具有至少含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的核苷酸第430-4809位的核苷酸序列。

(8)含有下面(a)或(b)中定义的多肽，和下面(c)或(d)中定义的多肽的蛋白质：

(a)具有至少含有SEQ ID NO：2的氨基酸第50-393位的氨基酸序列的多肽，

(b)具有至少含有包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或倒置的SEQ ID NO：2的氨基酸第50-393位的氨基酸序列，并且构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性，和含有SEQ ID NO：3的氨基酸的氨甲酰磷酸合成酶的大亚单位蛋白质的多肽，

(c)含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，

(d)含有包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或倒置的SEQ IDNO：3的氨基酸序列，并且能够构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性，具有至少包括SEQ ID NO：3的氨基酸第50-393位的氨基酸序列的氨甲酰磷酸合成酶的小亚单位的蛋白质的多肽。

(9)利用(1)到(7)的任何一项的DNA片段转化的棒杆菌。

(10)具有增强的细胞内氨甲酰磷酸合成酶活性，并且具有L-精氨酸生产力的微生物。

(11)根据(10)所述的微生物，其中通过增加微生物的编码氨甲酰磷酸合成酶的DNA的拷贝数，或修饰表达调节序列以致在细胞中编码氨甲酰磷酸合成酶的基因的表达增强获得了增强的细胞内氨甲酰磷酸合成酶活性。

(12)根据(11)所述的微生物，其中DNA是根据(1)到(7)的任何一项所述的DNA片段。

(13)根据(12)所述的微生物，是棒杆菌细菌。

(14)生产L-精氨酸的方法，包括在培养基中培养(10)到(13)的任何一项的棒杆菌的在培养基中生产和积累L-精氨酸，并且从培养基中回收L-精氨酸的步骤。

本发明提供了编码构成氨甲酰磷酸合成酶的亚单位的基因。该基因可以用于生产氨甲酰磷酸合成酶和其亚单位，繁育生产L-精氨酸的细菌，和生产核酸的细菌等等。另外，根据本发明可以有效地生产L-精氨酸。

图1显示了含有carA基因和carB基因的质粒p19的结构。

图2显示了质粒pK1的构建过程。

图3显示了质粒pSFK6的构建过程。

在下文中，将详细说明本发明。

<1>本发明的DNA

利用缺陷carA或carB的微生物，例如大肠杆菌RC50(carA50，tsx^-273，λ^-，rpsL135(str^R)，ma1T1(λR)，xy1A7，thi^-1；Mol.Gen.Genet.，133，299(1974))，大肠杆菌JEF8(thr^-31，ΔcarB，relA^-，metB1，Mol.Gen.Genet.，133，299(1974))等等，通过选择DNA，利用载体如质粒制备的棒杆菌的染色体DNA文库中获得本发明的DNA。因为缺陷carA或carB的微生物显示了L-精氨酸和尿嘧啶营养缺陷型，利用染色体DNA文库转化这样的微生物，选择完成营养缺陷型的克隆，从选择的转化体回收重组载体可以获得DNA片段。

没有特别限制，用于制备染色体DNA文库的棒杆菌，其例子包括已经划分为短杆菌，但在目前统一划分为棒杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，并且包括属于与棒杆菌关系密切的短杆菌的细菌，更具体地说，野生型谷氨酸棒杆菌的菌株等等。通过例如Saito和Miura的方法(生物化学和生物物理通信72，619，(1963))，K.S.Kirby的方法(生物化学杂志，64，405，(1956))等等可以制备棒杆菌细菌的染色体DNA。

通过利用适当的限制酶部分消化染色体DNA，将每个获得的DNA片段连接进入在大肠杆菌细胞中可自主复制的载体DNA中制备重组DNA，并且将该DNA导入大肠杆菌中可以获得染色体DNA文库。载体不特别限制，只要它是通常用于基因克隆的载体，和可以利用质粒载体如pUC19，pUC18，pUC118，和pUC119，噬菌体载体如λ噬菌体DNA等等。另外，也可以利用在大肠杆菌细胞和棒杆菌细胞中可自主复制的载体。通过连接大肠杆菌的载体和谷氨酸棒杆菌的隐蔽性质粒的pAM330(参见日本专利未审公开号，58-67699)可以构建这样的载体。

在大肠杆菌和棒杆菌细胞中可自主复制的载体的特异例子包括pSAC4(参见下面提到的实施例)，pHK4(参见日本专利未审公开号5-7491)。将含有pHK4的大肠杆菌HB101命名为大肠杆菌AJ13136，将它于1995年8月1日保藏于国际贸易和工业部，工业科学和技术部，国家生物科学和人技术研究所(邮编，305-8566，1-3Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)，接受的登记号是FERM BP-5186。

通过例如，D.A.Morrison的方法(酶学的方法，68，326，1979)，利用氯化钙处理受体细胞以致增加DNA的渗透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物学杂志53，159(1970))等等可以进行大肠杆菌细胞的转化。对于制备染色体DNA文库，制备质粒DNA，和消化和连接DNA，以及PCR的方法，下文中提到的低聚核苷酸的制备和杂交的方法，可以利用本领域技术人员已知的常规方法。这样的方法如Sambrook，J.，Fritsch，E.F和Maniatis，T.，“分子克隆，实验室手册，第二版”，冷泉港实验室出版，(1989)等等中所述。

如上所述获得的含有carA和carB的DNA片段的核苷酸序列表示为序列表中SEQ ID NO：1。这一序列含有两个开放读码框架(ORF，核苷酸第283-1461位和核苷酸第1756到4809位)。上游ORF是carA，下游ORF是carB。这些ORF编码的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：2和3。根据本发明carA编码的肽称为小亚单位，carB编码的肽称为大亚单位。正如carA的编码区，核苷酸第283到285位的GTG表示为序列表中的起始密码。但是，核苷酸第415到417位GTG或核苷酸第430到432位的ATG可能是起始密码。在任何情况下，利用编码上游区的更长的开放读码框架可以获得活性小亚单位，上游区用于表达carA。对于每个亚单位，对应于作为起始密码GTG的氨基酸表示为缬氨酸，但它可能是甲硫氨酸，缬氨酸或甲酰甲硫氨酸。

本发明的氨甲酰磷酸合成酶的小亚单位例如是具有SEQ ID NO：2的氨基酸第50-393位的氨基酸序列的多肽，具有SEQ ID NO：2的氨基酸第45到393位的氨基酸序列的多肽，具有SEQ ID NO：2的氨基酸第1-393为的氨基酸序列的多肽和诸如此类。本发明的氨甲酰磷酸合成酶的大亚单位例如是具有SEQ ID NO：3显示的氨基酸序列的多肽。

根据本发明，编码小亚单位的DNA可以是编码含有SEQ ID NO：2中包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或倒置的氨基酸第50-393位的氨基酸序列的氨基酸序列，或编码可以构成具有大亚单位的氨甲酰磷酸合成酶活性的蛋白质的多肽的DNA。

根据本发明，编码大亚单位的DNA可以是编码含有SEQ ID NO：3的包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或倒置的氨基酸序列的氨基酸序列的，或编码可以构成含有小亚单位的具有氨甲酰磷酸合成酶活性的蛋白质的多肽的DNA。可替代地，它可以是编码具有SEQ ID NO：3的包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加，或倒置的氨基酸序列，并且具有氨甲酰磷酸合成酶活性的蛋白质的一个。

另外，编码在小亚单位或大亚单位或两者中含有一个或几个突变的氨甲酰磷酸合成酶的DNA都在本发明的DNA的范围内。

术语“几个氨基酸”优选地指1到20个氨基酸，更优选地1到10个氨基酸。

例如通过修饰编码小亚单位或大亚单位的DNA的核苷酸序列，例如通过位点特异诱变方法以致在基因的特异位点的一个或多个氨基酸残基参与取代，缺失，插入，叠加，或倒置获得了编码如上所述的小亚单位或大亚单位的基本相同的肽的DNA。通过常规已知的突变处理可以获得如上所述修饰的DNA。突变处理包括例如利用羟胺体外处理编码小亚单位或大亚单位的DNA的方法，和利用紫外辐射或突变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和通常用于突变处理的亚硝酸处理微生物例如属于含有编码小亚单位和大亚单位的大肠杆菌属的细菌。

如上所述的核苷酸的取代，缺失，插入，叠加，或倒置也包括天然存在的突变(突变体或变异体)，例如在具有小亚单位和/或大亚单位的微生物的菌株，种类或属中的差异。

通过在适当细胞中表达如上所述具有突变的DNA，研究表达产物的氨甲酰磷酸合成酶活性获得了基本编码与氨甲酰磷酸合成酶的相同蛋白质的DNA。通过已知方法可以测量氨甲酰磷酸合成酶(普通微生物学杂志，136，1177-1183(1990))。通过从编码具有突变的氨甲酰磷酸合成酶的DNA或从含有它的细胞分离在严格条件下，与具有例如对应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列第283到1461位或第1756到4809位的核苷酸序列杂交体，并且编码具有氨甲酰磷酸合成酶活性的蛋白质的DNA也获得了基本编码如氨甲酰磷酸合成酶相同的蛋白质的DNA。本文的“严格条件”指形成所谓的特异杂交体，不形成非特异杂交的条件。利用任何数值是难于清楚表达这一条件的。但是，例如严格条件包括具有高度同源性的DNA，例如具有不低于70％的同源性的DNA，优选地不低于80％，更优选地不低于90％的DNA相互杂交，具有同源性低于上面所述的DNA不相互杂交的条件。可取代地，严格条件的例子是在对应于普通Southern杂交洗涤条件即，60℃，1×SSC，0.1％SDS，优选地0.1×SSC，0.1％SDS的盐浓度下DNA相互杂交的条件。

作为探针，也可以利用SEQ ID NO：1的核苷酸序列的部分序列。利用根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列产生的寡聚核苷酸作为引物，含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA作为模板进行PCR可以制备这样的探针。当将长度约300bp的DNA片段用作探针时，杂交的洗涤条件包括例如50℃，2×SSC，和0.1％SDS。

因为已经阐明了本发明的DNA的核苷酸序列，通过利用根据作为引物的核苷酸序列制备的低聚核苷酸的聚合酶链式反应(PCR：聚合酶链式反应，参见White，T.J.等人，遗传学趋势，5，185(1989))从棒杆菌染色体DNA扩增它，或通过利用根据作为探针的核苷酸序列制备的低聚核苷酸的杂交从棒杆菌染色体DNA选择它可以获得本发明的DNA。作为用于PCR的引物的核苷酸序列，可以适当选择来自核苷酸第283位的上游区，优选地来自SEQ ID NO：1的核苷酸第185位的上游区作为5’引物，可以适当地选择来自SEQ ID NO：1的核苷酸第4809位的上游区作为3’引物。

表达本发明的DNA的寄主的例子包括各种细菌如大肠杆菌，棒杆菌，包括谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌，真核细胞如啤酒酵母的那些等等。为了在这些寄主中导入本发明的DNA，通过在根据DNA待表达的寄主的特性选择的载体中插入本发明的DNA获得的重组载体可以转化寄主细胞。通过本领域已知的方法可以进行这一方法。特异的方法的实施例包括用于上面提到的大肠杆菌的转化的方法，正如对枯草芽孢杆菌报道的(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，基因，1，153(1977))，在增殖时期从细胞制备感受态细胞以便导入DNA的方法，正如枯草芽孢杆菌，放线菌，和酵母中已知的，允许DNA受体细胞处于能够掺入重组DNA的原生质体或球状体的状态中，容易地在DNA受体细胞中导入重组DNA的方法(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen. Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，自然，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，美国科学院年报，75，1929(1978))，用于棒杆菌细菌(称为日本专利未审公开号，2-207791)的电脉冲方法等等。

待导入寄主的DNA如上面提到的那些可以是含有carA或carB的DNA，或含有他们两个的DNA。另外，为了获得这些基因的有效表达，可以将寄主细胞中起作用的启动子如lac，trp和P_L连接在carA或carB的上游位置。

在允许carA或carB的表达的条件下，通过培养如上面提到的那些转化体可以生产氨甲酰磷酸合成酶或它的亚单位。也可以利用本发明的DNA繁育生产L-精氨酸的细菌或生产核酸的细菌如尿嘧啶生产细菌。那就是，比较非转化体，利用本发明的DNA导入的转化体，特别是利用carA或carB或他们两个导入的转化体应该可以增强氨甲酰磷酸合成酶的活性。结果是，L-精氨酸或核酸如尿嘧啶的生产率提高了。

<2>生产本发明的L-精氨酸的方法

通过培养增强了细胞内氨甲酰磷酸合成酶活性，并且在培养基中具有L-精氨酸生产率以便在培养基中生产和积累L-精氨酸的微生物，并且从培养基收集L-精氨酸可以有效地生产L-精氨酸。

具有L-精氨酸生产率的微生物的特异例子包括棒状细菌，属于芽孢杆菌，沙雷氏菌和大肠杆菌属的细菌，属于啤酒酵母或假丝酵母属的酵母种类。在这些中间，棒状细菌是优选的。

特异的种类的例子包括芽孢杆菌如属于芽孢杆菌属的细菌，粘质沙雷氏菌如属于沙雷氏菌属的细菌，大肠杆菌如属于大肠杆菌属的细菌，啤酒酵母如属于啤酒酵母属的酵母种类，热带假丝酵母如属于假丝酵母属的酵母种类等等。

具有L-精氨酸生产率的微生物的例子包括抵抗5-氮尿嘧啶，6-氮尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氮胞嘧啶等等的芽孢杆菌，抵抗精氨酸异羟污酸和2-硫尿嘧啶的枯草芽孢杆菌，抵抗精氨酸异羟污酸和6-氮尿嘧啶的芽孢杆菌(参见日本专利未审公开号，49-1268191)，抵抗组氨酸类似物或色氨酸类似物的枯草芽孢杆菌(参见日本专利未审公开号，52-114092)，显示至少甲硫氨酸，组氨酸，苏氨酸，脯氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，腺嘌呤，鸟嘌呤和尿嘧啶(或尿嘧啶前体)的一个的营养缺陷型的枯草芽孢杆菌的突变体(参见日本专利未审公开号，52-99289)，抵抗精氨酸异羟污酸的枯草芽孢杆菌(参见日本专利公开号，51-6754)，显示琥铂酸营养缺陷型或抵抗核酸碱基类似物的粘质沙雷氏菌(日本专利未审公开号，58-9692)，

代谢精氨酸的能力缺陷和显示抵抗精氨酸拮抗物和刀豆氨酸和赖氨酸的营养缺陷型的粘质沙雷氏菌(参见日本专利未审公开号，52-8729)，

利用argA基因导入的大肠杆菌(参见日本专利未审公开号57-5693)，

抵抗精氨酸，精氨酸异羟污酸，高精氨酸，D-精氨酸和刀豆氨酸，或抵抗精氨酸异羟污酸和6-氮尿嘧啶的啤酒酵母(参见日本专利未审公开号，53-143288)，

抵抗刀豆氨酸的热带假丝酵母(参见日本专利未审公开号，53-3586)等等。

棒状细菌包括已经划分为短杆菌属但目前统一进棒杆菌的那些细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，并且包括与棒杆菌属关系密切的短杆菌属的细菌。这样的棒杆菌的例子在下面列出。

嗜乙酰乙酸棒杆菌

醋谷棒杆菌

Corynebacterium alkanolyticum

美棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

百合属棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)

Corynebacterium melassecola

Corynebacterium thermoaminogenes

力士棒杆菌

Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒杆菌)

Brevibacterium flavum(谷氨酸棒杆菌)

Brevibacterium immariophilum

Brevibacterium lactofermentum(谷氨酸棒杆菌)

玫瑰色短杆菌

解糖短杆菌

生硫短杆菌

白色短杆菌

蜡状短杆菌

嗜氨微杆菌

具有L-精氨酸生产率的棒杆菌没有特别限制，只要他们具有L-精氨酸生产率。他们包括，例如棒杆菌的野生型菌株；对某些试剂包括磺胺药物，2-噻唑丙氨酸，α-氨基-β-羟基戊酸和诸如此类有抗性的棒杆菌；除了抵抗2-噻唑丙氨酸显示L-组氨酸，L-脯氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-甲硫氨酸，或L-色氨酸营养缺陷型的棒杆菌(日本专利未审公开号，54-44096)；抵抗酮丙二酸，氟丙二酸或单氟乙酸的棒杆菌(日本专利未审公开号57-18989)；抵抗argininol的棒杆菌(日本专利未审公开号62-24075)；抵抗X胍(X-代表脂肪酸或脂肪链的衍生物，日本专利未审公开号，2-186995)的棒杆菌等等。

特异地，可以举证下面的细菌菌株。

黄色短杆菌AJ11169(FERM BP-6892)

谷氨酸棒杆菌AJ12092(FERM BP-6906)

黄色短杆菌AJ11336(FERM BP-6893)

黄色短杆菌AJ11345(FERM BP-6893)

谷氨酸棒杆菌AJ12430(FERM BP-2228)

AJ11169菌株和AJ12092菌株是日本专利未审公开号54-44096中提到的抵抗2-噻唑丙氨酸抗性菌株，AJ11336菌株是具有日本专利未审公开号62-24075中提到的对argininol抗性，磺胺嘧啶抗性的菌珠，AJ11345菌株是在日本专利未审公开号62-24075中提到的具有具有2-噻唑丙氨酸抗性，磺胺嘧啶抗性和显示组氨酸营养缺陷型的菌株，和AJ12430菌株是日本专利未审公开号2-186995中提到的辛基胍抗性和2-噻唑丙氨酸抗性的菌株。

通过例如增强前面提到的微生物的细胞中编码氨甲酰磷酸合成酶的基因的拷贝数可以增强如上所述的具有L-精氨酸生产率的这样的微生物的细胞内氨甲酰磷酸合成酶活性。除了上面提到的基因扩增，通过修饰编码氨甲酰磷酸合成酶的DNA的表达调节序列以便增强编码氨甲酰磷酸合成酶的DNA基因的表达也可以达到氨甲酰磷酸合成酶活性的增强。特异地，利用更强的一个可以替代表达调节序列如在染色体DNA或质粒上的编码氨甲酰磷酸合成酶的基因的启动子(参见日本专利未审公开号1-215280)。在棒杆菌细菌的细胞中起作用的强启动子包括大肠杆菌的lac启动子，tac启动子，trp启动子(Y.Morinaga，M.Tsuchiya，K.Miwa和K.Sano，生物技术杂志，5，305-312(1987))和诸如此类。另外，棒杆菌细菌的trp启动子也是优选的启动子(日本专利未审公开号62-195294)。通过利用这些启动子替代，氨甲酰磷酸合成酶活性增强了。表达调节序列的修饰可以与编码氨甲酰磷酸合成酶的DNA的拷贝数的增强相关。另外，通过在氨甲酰磷酸合成酶的酶蛋白中导入一个或多个突变以致酶的特异活性增强可以增强细胞内氨甲酰磷酸合成酶的活性。

编码氨甲酰磷酸合成酶的DNA的例子包括前面提到的谷氨酸棒杆菌的carA和carB基因和含有他们两个的一个DNA。

在微生物中导入编码氨甲酰磷酸合成酶的DNA的载体的例子包括在微生物细胞中可自主复制的载体。特异地，在大肠杆菌细胞中可自主复制的前面提到的载体，在大肠杆菌和棒杆菌细菌细胞中可自主复制的载体。

用于培养如上所述获得的具有增强的细胞内氨甲酰磷酸合成酶活性和L-精氨酸生产率的微生物的培养基是通常用于通过发酵生产氨基酸的已知培养基。那就是，它是含有碳源，氮源，无机离子和需要的其它有机成分的常用培养基。

作为碳源，可以利用糖如葡萄糖，蔗糖，乳糖，半乳糖，果糖和淀粉水解产物，乙醇如甘油和山梨醇，或有机酸如延胡索酸，柠檬酸和琥铂酸等等。

作为氮源，可能利用的是无机氨盐如硫酸铵，氯化铵，和磷酸铵，有机氮如大豆水解产物，氨气，氨水等等。

培养基优选地含有适当量的需要的物质如维生素B₁和L-高丝氨酸，酵母提取物等等作为痕量有机营养。除了这些物质，在培养基中可以加入小量的磷酸钾，硫酸镁，铁离子，镁离子等等。

优选地在好氧条件下进行培养1-7天。培养温度优选地为24-37℃，培养过程中培养基的pH优选地是5-9。可以利用无机或有机酸或碱性物质，氨气等等调节pH。通常通过已知技术如离子交换树脂方法的联合从发酵培养基回收L-精氨酸。

在下文中，参考下面的实施本发明的最好方式的实施例将更具体地解释本发明。

实施例1：谷氨酸棒杆菌的carA和carB的克隆

<1>谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA的制备

在100毫升T-Y培养基(1％细菌用蛋白胨(Difco)，0.5％细菌用酵母提取物(Difco)，0.5％NaCl(pH7.2))中接种谷氨酸棒杆菌ATCC13869，和在31.5℃培养8小时获得培养物。在3,000rpm离心培养物15分钟获得0.5克湿的细菌细胞，并且根据Saito和Miura的方法从细菌细胞获得染色体DNA(生物化学和生物物理通信72，619(1963))。然后，在10mM Tris-HCl缓冲液(含有50毫摩尔/升NaCl，10毫摩尔/升MgSO₄和1毫摩尔/升二硫苏糖醇(pH7.4))中混合60微克染色体DNA和3单位的限制酶Sau3AI，并且允许在37℃反应30分钟。将反应混合物进行酚提取，并且以常规方式乙醇沉淀以便获得50微克利用Sau3AI消化的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA片段。

<2>利用质粒载体DNA制备谷氨酸棒杆菌ATCC13869的基因文库

作为在大肠杆菌细胞和棒杆菌细胞中可自主复制的质粒载体DNA，利用的是pSAC4。如下制备了pSAC4。为了制造在棒杆菌细胞中可自主复制的大肠杆菌载体pHSG399(Takara Shuzo)，在载体(日本专利未审公开号5-7491)中导入前面获得的棒杆菌细菌细胞中可自主复制的质粒pHM1519的复制源点。特定地，利用限制酶BamHI和KpnI消化pHM1519获得了含有复制源点的基因片段，并且利用Takara Shuzo生产的末端平齐化试剂盒末端平齐化获得的片段，利用SalI接头(Takara Shuzo)插入在pHSG399的SalI位点中获得pSAC4。

在50毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液(含有100毫摩尔/升NaCl和10毫摩尔/升硫酸镁(pH7.4))中，混合20微克pSAC4和200单位的限制酶BamHI，在37℃允许反应2小时获得消化溶液。将这一溶液进行酚提取，以常规方式乙醇沉淀。然后，为了抑制起源于质粒载体的DNA片段的再连接，根据分子克隆，第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版，p.1.56(1989))中叙述的方法利用细菌碱性磷酸酶脱磷酸DNA片段，进行酚提取和以常规方法进行乙醇沉淀。

在含有66毫摩尔/升氯化镁，10毫摩尔/升二硫苏糖醇和10毫摩尔/升ATP的66mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中加入1微克BamHI消化的pSAC4，1微克实施例1获得的Sau3AI消化的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA片段，和2单位的T4 DNA连接酶(Takara Shuzo生产的)，允许在16℃反应16小时连接DNA。然后，以常规方式利用这一DNA混合物转化大肠杆菌DH5，在含有170微克/毫升的氯霉素的L-琼脂培养基上涂布，获得约20,000个菌落，将其用作基因文库。

<3>转化大肠杆菌的carB缺陷菌株(JEF8)

以常规方法利用前面提到的基因文库的重组DNA的混合物转化大肠杆菌的carB缺陷菌株JEF8(thr^-3，ΔcarB，relA^-，metB1；Mol.Gen.Genet.，133，299(1974))。如Cm抗性菌株获得了约15000个菌株的转化体。在没有含有精氨酸和尿嘧啶的基本培养基(5克/升葡萄糖，12.8克/升Na₂HPO₄，3克/升KH₂PO₄，0.5克/升NaCl，1克/升NH₄Cl，40微克/毫升L-苏氨酸，40微克/毫升L-甲硫氨酸)复制了这些转化体，基本培养基不含有L-精氨酸，但只含有50微克/毫升尿嘧啶，并且筛选恢复精氨酸营养缺陷型和尿嘧啶营养缺陷型的菌株，或恢复精氨酸营养缺陷型的菌株。恢复精氨酸营养缺陷型的菌株恢复了精氨酸营养缺陷型和尿嘧啶营养缺陷型。将在这样的菌株的一个中含有的质粒命名为p19，并且将携带它的菌株命名为JEF8/p19。在图1中表示了p19的结构。

将大肠杆菌JEF8/p19命名为大肠杆菌AJ13574，并且将它于1999年1月28日保藏在国际贸易和工业部，工业科学和技术部，国家生物科学和人技术研究所(邮编，305-8566，1-3Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)，接受的登记号是FERM P-17180，在2000年1月6日，根据布达佩斯条约从原始保藏转移到国际保藏，并且已经以保藏号FERM BP-6989保藏。

<4>补充了精氨酸和尿嘧啶营养缺陷型的质粒的获得

以常规方法从JEF8/p19制备质粒，并且用于JEF8菌株的再转化。获得的转化体可以生长在不含有L-精氨酸和尿嘧啶的基本培养基中，恢复L-精氨酸和尿嘧啶的营养缺陷型。所以，发现了质粒含有补充大肠杆菌菌株中carB的缺失引起的L-精氨酸和尿嘧啶的营养缺陷型的基因的质粒。

另外，在大肠杆菌RC50(carA50，tsx^-273，λ^-，rpsL135(str^R)，malT1(λR)，xylA7，thi^-1；Mol.Gen.Genet.，133，299(1974))的carA突变体中导入这一质粒。因为利用该质粒导入的菌株能够在不含有精氨酸和尿嘧啶的基本培养基中生长，也发现了质粒具有大肠杆菌菌株的carA突变引起的L-精氨酸和尿嘧啶的营养缺陷型的基因。

<5>p19的核苷酸序列分析

在p19的DNA序列之间，确定了约4.8kb的从该载体多克隆位点的HindIII侧到插入DNA片段中含有的HindIII位点的核苷酸序列。利用Rohdamin终止循环测序试剂盒(ABI生产)根据Sanger的方法进行核苷酸测序。在序列表中如SEQ ID NO：1显示了获得的核苷酸序列。从定位于这一基因的上游区的同感序列的分析，估计在这一序列中含有两个开放读码框架(从第283G到第1461A的开放读码框架，和从第1756G到第4809T的开放读码框架)。可以估计第162位(TGCATA)到第194位(TATAAT)，第185位(TGCATA)到第213位(TAAACT)，第203位(TTGAAT)到第230位(TATCAA)，或第224位(TTATCA)到第251位(TAAAAA)的核苷酸是调节转录的启动子区。

利用核苷酸序列表示了这些开放读码框架编码的氨基酸序列。在SEQ IDNO；2和3中也显示了氨基酸序列。寻找蛋白质数据库(GenBank CDS)中显示与这些氨基酸具有同源性的序列。结果，发现5’开放读码框架显示与大肠杆菌，枯草芽孢杆菌等等的carA基因产物高度同源(约40％)，3’开放读码框架显示与大肠杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌等等的已知carB基因产物高度同源(约40到50％)。所以，表明这些开放读码框架分别编码carA和carB。

<6>在野生型棒杆菌细菌菌株中导入carA和carB

通过电脉冲方法将p19导入黄色短杆菌野生型菌株2247(AJ14067)中(日本专利未审公开号，2-207791)。在CM2G平板培养基(在1升纯净水中含有10克聚蛋白胨，10克酵母提取物，5克葡萄糖，5克NaCl，15克琼脂，pH7.2)(含有5微克/毫升氯霉素)上选择氯霉素抗性菌株的转化体获得2247/p19。

实施例2：利用carA和carB导入的棒杆菌生产L-精氨酸

<1>制备穿梭载体

首先，新生产了在大肠杆菌细胞和棒杆菌细胞中可自主复制的质粒载体作为用于在棒杆菌中导入carA和carB基因的质粒。

首先构建含有粪链球菌的药物抗性基因的载体。从含有该基因的已知质粒通过PCR扩增粪链球菌的卡那霉素抗性基因。已经分类了粪链球菌的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列(Trieu-Cuot，P.和Courvalin，P，基因，23(3)，331-341(1983))。根据该序列合成了SEQ ID NO：4和5显示的引物，利用pDG783(Anne-Marie Guerout-Fleury等人，基因，167，335-337(1995))作为模板进行PCR扩增含有卡那霉素抗性基因和它的启动子的DNA片段。

通过Takara Shuzo生产的SUPREC02纯化获得的DNA片段，然后利用HindIII和HincII限制酶完全消化，并且末端平齐化。利用Takara Shuzo生产的末端平齐化试剂盒达到末端平齐化。将这一DNA片段与利用SEQ ID NO：6和7显示的引物和作为模板的pHSG399(参见，S.Takeshita等人，基因，61，63-74(1987))进行PCR，纯化和末端平齐化得到的扩增产物已经获得的DNA片段混合并且连接。通过Takara Shuzo生产的DNA连接试剂盒第2版进行连接反应。利用连接的DNA转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo生产)的感受态细胞，在含有10微克/毫升IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)，40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和25微克/毫升的卡那霉素的L-培养基(10克/升的细菌用胰蛋白胨，5克/升细菌用酵母提取物，5克/升的氯化钠，15克/升琼脂，pH7.2)上涂布，并且过夜培养。挑选出现的蓝色菌落，分离成单个菌落以便获得转化体菌株。

通过碱性方法从转化体菌株制备质粒(生物工程实验课本，生物科学和生物工程协会编辑，日本，第105页，Baifukan，1992)，并且制备了限制图谱。将具有等同于图2的限制图谱的一个命名为pK1。在大肠杆菌中稳定地保留了这一质粒，给予寄主卡那霉素抗性。另外，因为它含有lacZ’基因，将它适当地用作克隆载体。

利用限制酶HindIII完全消化从谷氨酸棒杆菌ATCC13869提取的质粒pAM330(参见日本专利未审公开号，58-67699)，并且末端平齐化。将这一片段连接到利用限制酶BsaAI完全消化的前面提到的pK1获得的片段。利用连接的DNA转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869。通过电脉冲方法进行转化(参见日本专利未审公开号2-207791)。在含有25微克/毫升卡那霉素的MCM2B平板(10克/升聚蛋白胨，10克/升酵母提取物，5克/升NaCl，10微克/升生物素，15克/升琼脂，pH7.2)上选择转化体。在培养2天后，挑选菌落，并且分离成单个菌落获得转化体。从转化体制备质粒DNA，制备选择图谱。将具有如图3的相同选择图谱的一个命名为pSFK6。在大肠杆菌和棒杆菌中可自主复制这一质粒，给予寄主卡那霉素抗性。

<2>在棒杆菌中导入carA和carB基因，和生产L-精氨酸

利用SmaI和HindIII消化前面提到的pSFK6。将产物连接到以常规方法利用限制酶XbaI消化从JEF8/p19F制备的质粒p19，利用Takara Shuzo生产的末端平齐化试剂盒末端平齐化产物，并且进一步利用限制酶HindIII消化产物已经获得的carA和carB基因片段，以便获得了含有carA和carB基因并且可以在棒杆菌中自主复制的质粒pcarAB。

通过电脉冲方法，在黄色短杆菌AJ11345和AJ11336中导入pcarAB(日本专利未审公开号2-207791)。在含有25微克/毫升卡那霉素的M-CM2B平板(10克/升聚蛋白胨，10克/升酵母提取物，5克/升葡萄糖，5克/升NaCl，15克/升琼脂，pH7.2)上选择转化体作为卡那霉素抗性菌株。作为对照，通过在AJ11345和AJ11336中同样导入pSFK6获得转化体。

在含有0.5克/dl葡萄糖，1克/dl聚蛋白胨，1克酵母提取物，0.5克/dlNaCl，和5微克/升氯霉素的琼脂培养基上涂布前面提到的各个转化体，在31.5℃培养20小时。在含有4克/dl葡萄糖，6.5克/dl硫酸铵，0.1克/dlKH₂PO₄，0.04克/dlMgSO₄，0.001克/dl FeSO₄，0.01克/dl MnSO₄，5微克/dl VB₁，5微克/dl生物素，45毫克/d1大豆水解产物(作为N的当量)的培养基接种获得的细胞的一个接种环，并且在31.5℃，在烧瓶中振摇培养50小时。表1显示了每个菌株生产的L-精氨酸的量。

利用carA和carB基因导入的菌株与只用载体导入的菌株比较显示了提高的L-精氨酸生产率。

表1

菌株/质粒	L-精氨酸(g/dl)
菌株/质粒	L-精氨酸(g/dl)	AJ11345/pSFK6	1.33
AJ11345/pcarAB	1.39	AJ11345/pSFK6	1.33
AJ11345/pcarAB	1.39	AJ11336/pSFK6	0.71
AJ11336/pcarAB	0.79	AJ11336/pSFK6	0.71

序列表

<110>KUWABARA，Yoko

HASHIGUCHI，Kenichi

NAKAMATSU，Tsuyoshi

KURAHASHI，Osamu

MORI，Yukiko

ITO，Hisao

<120>棒杆菌的氨甲酰磷酸合成酶基因和生产L-精氨酸的方法

<130>OP945CIP

<141>2000--

<160>7

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>4837

<212>DNA

<213>Brevibacterium lactofermentum

<220>

<221>CDS

<222>(283)..(1461)

<220>

<221>CDS

<222>(1470)..(4808)

<400>1

gatccaggaa aaacctggac agcatccggt gcagactttg cgtccaaggc tgaaaacacc 60

ccatttgagg gccaggaatt cagcgctaag gtcacacaca ccgtgcttcg tggcaaggtg 120

acttgtgcag acggagttgc gcaagacgct taacgggtgg gtgcatagta tgcacgcgcc 180

gcattgcata taatgcaatg aattgaataa actacattca gggttatcaa ccagccaatt 240

tcttttaaaa agacagacac acgaaaggcg acaacagtca cc gtg agt aaa gac 294

Val Ser Lys Asp

1

acc acc acc tac cag gga gtc acc gag atc gga tcc gtt ccg gca tac 342

Thr Thr Thr Tyr Gln Gly Val Thr Glu Ile Gly Ser Val Pro Ala Tyr

5 10 15 20

ctg gtt ctt gca gac gga cgt acc ttc acc gga ttt ggc ttt gga gct 390

Leu Val Leu Ala Asp Gly Arg Thr Phe Thr Gly Phe Gly Phe Gly Ala

25 30 35

atc ggc acc acc ctt ggt gag gca gtg ttc acc acc gcc atg acc ggt 438

Ile Gly Thr Thr Leu Gly Glu Ala Val Phe Thr Thr Ala Met Thr Gly

40 45 50

tac caa gaa acc atg acc gat cct tcc tat cac cgc cag att gtt gtg 486

Tyr Gln Glu Thr Met Thr Asp Pro Ser Tyr His Arg Gln Ile Val Val

55 60 65

gct acc gca cca cag atc ggt aac acc ggc tgg aac gat gag gac aac 534

Ala Thr Ala Pro Gln Ile Gly Asn Thr Gly Trp Asn Asp Glu Asp Asn

70 75 80

gag tcc cgc gac ggc aag att tgg gtt gca ggc ctt gtt atc cgc gac 582

Glu Ser Arg Asp Gly Lys Ile Trp Val Ala Gly Leu Val Ile Arg Asp

85 90 95 100

ctc gca gca cgt gtg tcc aac tgg cgc gcc acc acc tcc ttg cag cag 630

Leu Ala Ala Arg Val Ser Asn Trp Arg Ala Thr Thr Ser Leu Gln Gln

105 110 115

gaa atg gca gac caa ggc atc gtc ggc atc ggc gga atc gac acc cgc 678

Glu Met Ala Asp Gln Gly Ile Val Gly Ile Gly Gly Ile Asp Thr Arg

120 125 130

gca ctg gtt cgc cac ctg cgc aac gaa ggt tcc atc gca gcg ggc atc 726

Ala Leu Val Arg His Leu Arg Asn Glu Gly Ser Ile Ala Ala Gly Ile

135 140 145

ttc tcc ggc gct gac gca cag cgc cca gtt gaa gaa ctc gta gag atc 774

Phe Ser Gly Ala Asp Ala Gln Arg Pro Val Glu Glu Leu Val Glu Ile

150 155 160

gtc aag aat cag cca gca atg acc ggc gca aac ctc tcc gtt gag gtc 822

Val Lys Asn Gln Pro Ala Met Thr Gly Ala Asn Leu Ser Val Glu Val

165 170 175 180

tct gct gat gaa acc tac gtc atc gct gct gag ggc gaa gag cgc cac 870

Ser Ala Asp Glu Thr Tyr Val Ile Glu Ala Glu Gly Glu Glu Arg His

185 190 195

acc gtc gtg gcc tac gac ctg ggc att aag caa aac acc cca cgt cgt 918

Thr Val Val Ala Tyr Asp Leu Gly Ile Lys Gln Asn Thr Pro Arg Arg

200 205 210

ttc tct gca cgc ggt gtt cgc acc gtc atc gtg cct gct gaa acc cca 966

Phe Ser Ala Arg Gly Val Arg Thr Val Ile Val Pro Ala Glu Thr Pro

215 220 225

ttg gag gac atc aag cag tac aac cca tca ggc gtg ttt atc tcc aat 1014

Leu Glu Asp Ile Lys Gln Tyr Asn Pro Ser Gly Val Phe Ile Ser Asn

230 235 240

ggc cct ggc gac cct gca gca gca gac gtc atg gtt gat atc gtc cgc 1062

Gly Pro Gly Asp Pro Ala Ala Ala Asp Val Met Val Asp Ile Val Arg

245 250 255 260

gaa gtt ctg gaa gcc gac att cca ttc ttt ggc atc tgc ttc ggc aac 1110

Glu Val Leu Glu Ala Asp Ile Pro Phe Phe Gly Ile Cys Phe Gly Asn

265 270 275

cag atc ctc ggc cgc gca ttc ggc atg gag acc tac aag ctg aag ttc 1158

Gln Ile Leu Gly Arg Ala Phe Gly Met Glu Thr Tyr Lys Leu Lys Phe

280 285 290

ggc cac cgc ggc atc aac gtt cca gtg aag aac cac atc acc ggc aag 1206

Gly His Arg Gly Ile Asn Val Pro Val Lys Asn His Ile Thr Gly Lys

295 300 305

atc gac atc acc gcc cag aac cac ggc ttc gca ctc aag ggt gaa gca 1254

Ile Asp Ile Thr Ala Gln Asn His Gly Phe Ala Leu Lys Gly Glu Ala

310 315 320

ggc cag gaa ttc gag aca gat ttc ggc act gcg att gtc acc cac acc 1302

Gly Gln Glu Phe Glu Thr Asp Phe Gly Thr Ala Ile Val Thr His Thr

325 330 335 340

tgc ctt aac gac ggc gtc gtt gaa ggt gtt gcg ctg aag tcc gga cgc 1350

Cys Leu Asn Asp Gly Val Val Glu Gly Val Ala Leu Lys Ser Gly Arg

345 350 355

gca tac tcc gtt cag tac cac cca gag gcc gct gcc ggc cca aat gat 1398

Ala Tyr Ser Val Gln Tyr His Pro Glu Ala Ala Ala Gly Pro Asn Asp

360 365 370

gca agc ccc ctg ttt gac cag ttt gtt gag ctg atg gat gca gac gct 1446

Ala Ser Pro Leu Phe Asp Gln Phe Val Glu Leu Met Asp Ala Asp Ala

375 380 385

cag aag aaa ggc gca taaataac atg cca aag cgt tca gat att aac cac 1496

Gln Lys Lys Gly Ala Met Pro Lys Arg Ser Asp Ile Asn His

390 1 5

gtc ctc gtc atc ggt tcc ggc ccc atc gtc att ggc cag gca tgt gaa 1544

Val Leu Val Ile Gly Ser Gly Pro Ile Val Ile Gly Gln Ala Cys Glu

10 15 20 25

ttc gac tac tcc ggc acc cag gct tgc cgc gtg ctg aag gaa gag gga 1592

Phe Asp Tyr Ser Gly Thr Gln Ala Cys Arg Val Leu Lys Glu Glu Gly

30 35 40

ctg cgc gtc acc ctc atc aac tcc aac cca gca acg atc atg acc gac 1640

Leu Arg Val Thr Leu Ile Asn Ser Asn Pro Ala Thr Ile Met Thr Asp

45 50 55

cca gaa atg gct gac cac acc tac gtg gag cca atc gag ccg gaa tac 1688

Pro Glu Met Ala Asp His Thr Tyr Val Glu Pro Ile Glu Pro Glu Tyr

60 65 70

atc gac aag att ttc gct aag gag atc gag cag ggc cac cca atc gac 1736

Ile Asp Lys Ile Phe Ala Lys Glu Ile Glu Gln Gly His Pro Ile Asp

75 80 85

gcc gtc ctg gca acc ctt ggt ggc cag act gca ctt aac gca gct atc 1784

Ala Val Leu Ala Thr Leu Gly Gly Gln Thr Ala Leu Asn Ala Ala Ile

90 95 100 105

cag ctg gat cgc ctc ggc atc ctg gaa aag tac ggc gtt gaa ctc atc 1832

Gln Leu Asp Arg Leu Gly Ile Leu Glu Lys Tyr Gly Val Glu Leu Ile

110 115 120

ggt gca gac atc gat gcc att gag cgc ggc gaa gat cgc cag aag ttc 1880

Gly Ala Asp Ile Asp Ala Ile Glu Arg Gly Glu Asp Arg Gln Lys Phe

125 130 135

aag gat att gtc acc acc atc ggt ggc gaa tcc gcg cgt tcc cgc gtc 1928

Lys Asp Ile Val Thr Thr Ile Gly Gly Glu Ser Ala Arg Ser Arg Val

140 145 150

tgc cac aac atg gac gaa gtc cat gag act gtc gca gaa ctt ggc ctt 1976

Cys His Asn Met Asp Glu Val His Glu Thr Val Ala Glu Leu Gly Leu

155 160 165

cca gta gtc gtg cgt cca tcc ttc act atg ggt ggc ctg ggc tcc ggt 2024

Pro Val Val Val Arg Pro Ser Phe Thr Met Gly Gly Leu Gly Ser Gly

170 175 180 185

ctt gca tac aac acc gaa gac ctt gag cgc atc gca ggt ggc gga ctt 2072

Leu Ala Tyr Asn Thr Glu Asp Leu Glu Arg Ile Ala Gly Gly Gly Leu

190 195 200

gct gca tct cct gaa gca aac gtc ttg atc gaa gaa tcc atc ctt ggt 2120

Ala Ala Ser Pro Glu Ala Asn Val Leu Ile Glu Glu Ser Ile Leu Gly

205 210 215

tgg aag gaa ttc gag ctc gag ctc atg cgc gat acc gca gac aac gtt 2168

Trp Lys Glu Phe Glu Leu Glu Leu Met Arg Asp Thr Ala Asp Asn Val

220 225 230

gtg gtt atc tgc tcc att gaa aac gtc gac gca ctg ggc gtg cac acc 2216

Val Val Ile Cys Ser Ile Glu Asn Val Asp Ala Leu Gly Val His Thr

235 240 245

ggc gac tct gtc acc gtg gca cct gcc ctg acc ctg act gac cgt gaa 2264

Gly Asp Ser Val Thr Val Ala Pro Ala Leu Thr Leu Thr Asp Arg Glu

250 255 260 265

ttc cag aag atg cgc gat cag ggt atc gcc atc atc cgc gag gtc ggc 2312

Phe Gln Lys Met Arg Asp Gln Gly Ile Ala Ile Ile Arg Glu Val Gly

270 275 280

gtg gac acc ggt gga tgt aac atc cag ttc gct atc aac cca gtt gat 2360

Val Asp Thr Gly Gly Cys Asn Ile Gln Phe Ala Ile Asn Pro Val Asp

285 290 295

ggc cgc atc atc acc att gag atg aac cca cgt gtg tct cgt tcc tcc 2408

Gly Arg Ile Ile Thr Ile Glu Met Asn Pro Arg Val Ser Arg Ser Ser

300 305 3l0

gcg ctg gca tcc aag gca acg ggc ttc cca att gcc aag atg gct gcc 2456

Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Phe Pro Ile Ala Lys Met Ala Ala

315 320 325

aag ctg gct atc gga tac acc ctg gat gag atc acc aac gac atc act 2504

Lys Leu Ala Ile Gly Tyr Thr Leu Asp Glu Ile Thr Asn Asp Ile Thr

330 335 340 345

ggt gaa acc cca gct gcg ttt gag ccc acc atc gac tac gtc gtg gtc 2552

Gly Glu Thr Pro Ala Ala Phe Glu Pro Thr Ile Asp Tyr Val Val Val

350 355 360

aag gcc cca cgc ttt gct ttc gag aag ttt gtc ggc gct gat gac act 2600

Lys Ala Pro Arg Phe Ala Phe Glu Lys Phe Val Gly Ala Asp Asp Thr

365 370 375

ttg acc acc acc atg aag tcc gtc ggt gag gtc atg tcc ctg ggc cgt 2648

Leu Thr Thr Thr Met Lys Ser Val Gly Glu Val Met Ser Leu Gly Arg

380 385 390

aac tac att gca gca ctg aac aag gca ctg cgt tcc ctg gaa acc aag 2696

Asn Tyr Ile Ala Ala Leu Asn Lys Ala Leu Arg Ser Leu Glu Thr Lys

395 400 405

cag cag ggt ttc tgg acc aag cct gat gag ttc ttc gca ggg gag cgc 2744

Gln Gln Gly Phe Trp Thr Lys Pro Asp Glu Phe Phe Ala Gly Glu Arg

410 415 420 425

gct acc gat aag gca gct gtt ctg gaa gat ctc aag cgc cca acc gaa 2792

Ala Thr Asp Lys Ala Ala Val Leu Glu Asp Leu Lys Arg Pro Thr Glu

430 435 440

ggc cgc ctc tac gac gtt gag ctg gca atg cgc ctt ggc gca agc gtg 2840

Gly Arg Leu Tyr Asp Val Glu Leu Ala Met Arg Leu Gly Ala Ser Val

445 450 455

gaa gaa ctc tac gaa gca tct tct att gat cct tgg ttc ctc gcc gag 2888

Glu Glu Leu Tyr Glu Ala Ser Ser Ile Asp Pro Trp Phe Leu Ala Glu

460 465 470

ctt gaa gct ctc gtg cag ttc cgc cag aag ctc gtt gac gca cca ttc 2936

Leu Glu Ala Leu Val Gln Phe Arg Gln Lys Leu Val Asp Ala Pro Phe

475 480 485

ctc aac gaa gat ctc ctg cgc gaa gca aag ttc atg ggt ctg tcc gac 2984

Leu Asn Glu Asp Leu Leu Arg Glu Ala Lys Phe Met Gly Leu Ser Asp

490 495 500 505

ctg cag atc gca gcc ctt cgc cca gag ttc gct ggc gaa gac ggc gta 3032

Leu Gln Ile Ala Ala Leu Arg Pro Glu Phe Ala Gly Glu Asp Gly Val

510 515 520

cgc acc ttg cgt ctg tcc cta ggc atc cgc cca gta ttc aag act gtg 3080

Arg Thr Leu Arg Leu Ser Leu Gly Ile Arg Pro Val Phe Lys Thr Val

525 530 535

gat acc tgt gca gca gag ttt gaa gct aag act ccg tac cac tac tcc 3128

Asp Thr Cys Ala Ala Glu Phe Glu Ala Lys Thr Pro Tyr His Tyr Ser

540 545 550

gca tac gag ctg gat cca gca gct gag tct gag gtc gca cca cag act 3176

Ala Tyr Glu Leu Asp Pro Ala Ala Glu Ser Glu Val Ala Pro Gln Thr

555 560 565

gag cgt gaa aag gtc ctg atc ttg ggc tcc ggt cca aac cgc atc ggc 3224

Glu Arg Glu Lys Val Leu Ile Leu Gly Ser Gly Pro Asn Arg Ile Gly

570 575 580 585

cag ggc atc gag ttc gac tat tcc tgt gtt cac gca gct ctt gag ctc 3272

Gln Gly Ile Glu Phe Asp Tyr Ser Cys Val His Ala Ala Leu Glu Leu

590 595 600

tcc cgc gtc ggc tac gaa act gtc atg gtc aac tgc aac cca gag acc 3320

Ser Arg Val Gly Tyr Glu Thr Val Met Val Asn Cys Asn Pro Glu Thr

605 610 615

gtg tcc acc gac tac gac acc gct gac cgc ctg tac ttc gag cca ctg 3368

Val Ser Thr Asp Tyr Asp Thr Ala Asp Arg Leu Tyr Phe Glu Pro Leu

620 625 630

acc ttc gaa gac gtc atg gag gtc tac cac gct gag gcg cag tcc ggc 3416

Thr Phe Glu Asp Val Met Glu Val Tyr His Ala Glu Ala Gln Ser Gly

635 640 645

acc gtc gca ggt gtt atc gtc cag ctt ggt ggc cag act cct ctg ggc 3464

Thr Val Ala Gly Val Ile Val Gln Leu Gly Gly Gln Thr Pro Leu Gly

650 655 660 665

ttg gca gat cgt ttg aag aag gct ggc gtc cct gtc att ggt acc tcc 3512

Leu Ala Asp Arg Leu Lys Lys Ala Gly Val Pro Val Ile Gly Thr Ser

670 675 680

cca gag gca atc gac atg gct gag gac cgt ggc gag ttc ggt gca ctg 3560

Pro Glu Ala Ile Asp Met Ala Glu Asp Arg Gly Glu Phe Gly Ala Leu

685 690 695

ctg aac cgc gag cag ctt cct gct cca gca ttc ggc acc gca acc tct 3608

Leu Asn Arg Glu Gln Leu Pro Ala Pro Ala Phe Gly Thr Ala Thr Ser

700 705 710

ttc gaa gag gct cgc aca gta gcc gat gag atc agc tac cca gtg ctg 3656

Phe Glu Glu Ala Arg Thr Val AIa Asp Glu Ile Ser Tyr Pro Val Leu

715 720 725

gtt cgc cct tcc tac gtc ttg ggt ggc cgt ggc atg gag att gtc tac 3704

Val Arg Pro Ser Tyr Val Leu Gly Gly Arg Gly Met Glu Ile Val Tyr

730 735 740 745

gat gag gct tcc ctc gag gat tac atc aac cgc gca act gag ttg tct 3752

Asp Glu Ala Ser Leu Glu Asp Tyr Ile Asn Arg Ala Thr Glu Leu Ser

750 755 760

tct gac cac cca gtg ctg gtt gac cgc ttc ctg gac aac gct att gag 3800

Ser Asp His Pro Val Leu Val Asp Arg Phe Leu Asp Asn Ala Ile Glu

765 770 775

atc gac gtc gac gca ctg tgc gac ggc gac gaa gtc tac ctg gcg ggc 3848

Ile Asp Val Asp Ala Leu Cys Asp Gly Asp Glu Val Tyr Leu Ala Gly

780 785 790

gtc atg gaa cac atc gag gaa gcc ggc att cac tcc ggt gac tcc gca 3896

Val Met Glu His Ile Glu Glu Ala Gly Ile His Ser Gly Asp Ser Ala

795 800 805

tgt gca ctt cct cca atg act ttg ggc gca cag gac atc gag aag gtc 3944

Cys Ala Leu Pro Pro Met Thr Leu Gly Ala Gln Asp Ile Glu Lys Val

810 815 820 825

cgc gaa gca acc aag aag ctg gct ctg ggc atc ggc gta cag ggc ctg 3992

Arg Glu Ala Thr Lys Lys Leu Ala Leu Gly Ile Gly Val Gln Gly Leu

830 835 840

atg aac gtc cag tac gca ctc aag gac gac atc ctc tac gtc atc gag 4040

Met Asn Val Gln Tyr Ala Leu Lys Asp Asp Ile Leu Tyr Val Ile Glu

845 850 855

gca aac cca cgt gca tcc cgc acc gtg ccg ttc gtc tcc aag gca acg 4088

Ala Asn Pro Arg Ala Ser Arg Thr Val Pro Phe Val Ser Lys Ala Thr

860 865 870

ggc gtc aac ctg gcc aag gca gca tcc cgt atc gca gtg ggc gcc acc 4136

Gly Val Asn Leu Ala Lys Ala Ala Ser Arg Ile Ala Val Gly Ala Thr

875 880 885

atc aag gat ctc caa gat gag ggc atg att cct acc gag tac gac ggc 4184

Ile Lys Asp Leu Gln Asp Glu Gly Met Ile Pro Thr Glu Tyr Asp Gly

890 895 900 905

ggc tcc ttg cca ctg gac gct cca atc gct gtg aag gaa gca gtg ttg 4232

Gly Ser Leu Pro Leu Asp Ala Pro Ile Ala Val Lys Glu Ala Val Leu

910 915 920

ccg ttc aac cgc ttc cgt cgc cca gat gga aag acc ctg gac acc ctg 4280

Pro Phe Asn Arg Phe Arg Arg Pro Asp Gly Lys Thr Leu Asp Thr Leu

925 930 935

ctt tcc cca gag atg aag tcc act ggc gag gtc atg ggc ttg gcc aac 4328

Leu Ser Pro Glu Met Lys Ser Thr Gly Glu Val Met Gly Leu Ala Asn

940 945 950

aac ttc ggc gct gca tat gca aag gct gaa gct ggc gcg ttt ggt gca 4376

Asn Phe Gly Ala Ala Tyr Ala Lys Ala Glu Ala Gly Ala Phe Gly Ala

955 960 965

ttg cca acc gaa ggc acc gtc ttc gtg acc gtg gct aac cgc gac aag 4424

Leu Pro Thr Glu Gly Thr Val Phe Val Thr Val Ala Asn Arg Asp Lys

970 975 980 985

cgc acc ctg atc ctg cca atc cag cgc ctg gcg tcg atg ggc tac aag 4472

Arg Thr Leu Ile Leu Pro Ile Gln Arg Leu Ala Ser Met Gly Tyr Lys

990 995 1000

atc ctc gcc acc gaa ggc acc gca ggc atg ctg cgc cgc aac ggc att 4520

Ile Leu Ala Thr Glu Gly Thr Ala Gly Met Leu Arg Arg Asn Gly Ile

1005 l0l0 1015

gat tgt gaa gtt gtg ctc aag gct tcc gac atc cgc gaa ggt gta gag 4568

Asp Cys Glu Val Val Leu Lys Ala Ser Asp Ile Arg Glu Gly Val Glu

1020 1025 1030

ggc aag tcc atc gtg gat cgt atc cgc gaa ggc gaa gtt gac ctc atc 4616

Gly Lys Ser Ile Val Asp Arg Ile Arg Glu Gly Glu Val Asp Leu Ile

1035 1040 1045

ctc aac acc cca gct ggt tct gct ggc gct cgc cac gat ggc tac gat 4664

Leu Asn Thr Pro Ala Gly Ser Ala Gly Ala Arg His Asp Gly Tyr Asp

1050 1055 1060 1065

atc cgc gca gca gca gtg acc gtg ggt gtt cca ctg atc acc act gtc 4712

Ile Arg Ala Ala Ala Val Thr Val Gly Val Pro Leu Ile Thr Thr Val

1070 1075 1080

cag ggt gtc acc gca gct gtc cag ggc att gag gcc ctg cgt gag ggc 4760

Gln Gly Val Thr Ala Ala Val Gln Gly Ile Glu Ala Leu Arg Glu Gly

1085 1090 1095

gtt gtc agc gtc cgc gcg ctg cag gaa ctc gac cac gca gtc aag gct 4808

Val Val Ser Val Arg Ala Leu Gln Glu Leu Asp His Ala Val Lys Ala

1100 1105 1110

taagccctat gacattcggc gagaagctt 4837

<210>2

<211>393

<212>PRT

<213>Brevibacterium lactofermentum

<400>2

Val Ser Lys Asp Thr Thr Thr Tyr Gln Gly Val Thr Glu Ile Gly Ser

1 5 10 15

Val Pro Ala Tyr Leu Val Leu Ala Asp Gly Arg Thr Phe Thr Gly Phe

20 25 30

Gly Phe Gly Ala Ile Gly Thr Thr Leu Gly Glu Ala Val Phe Thr Thr

35 40 45

Ala Met Thr Gly Tyr Gln Glu Thr Met Thr Asp Pro Ser Tyr His Arg

50 55 60

Gln Ile Val Val Ala Thr Ala Pro Gln Ile Gly Asn Thr Gly Trp Asn

65 70 75 80

Asp Glu Asp Asn Glu Ser Arg Asp Gly Lys Ile Trp Val Ala Gly Leu

85 90 95

Val Ile Arg Asp Leu Ala Ala Arg Val Ser Asn Trp Arg Ala Thr Thr

100 105 110

Ser Leu Gln Gln Glu Met Ala Asp Gln Gly Ile Val Gly Ile Gly Gly

115 120 125

Ile Asp Thr Arg Ala Leu Val Arg His Leu Arg Asn Glu Gly Ser Ile

130 135 140

Ala Ala Gly Ile Phe Ser Gly Ala Asp Ala Gln Arg Pro Val Glu Glu

145 150 155 160

Leu Val Glu Ile Val Lys Asn Gln Pro Ala Met Thr Gly Ala Asn Leu

165 170 175

Ser Val Glu Val Ser Ala Asp Glu Thr Tyr Val Ile Glu Ala Glu Gly

180 185 190

Glu Glu Arg His Thr Val Val Ala Tyr Asp Leu Gly Ile Lys Gln Asn

195 200 205

Thr Pro Arg Arg Phe Ser Ala Arg Gly Val Arg Thr Val Ile Val Pro

210 215 220

Ala Glu Thr Pro Leu Glu Asp Ile Lys Gln Tyr Asn Pro Ser Gly Val

225 230 235 240

Phe Ile Ser Asn Gly Pro Gly Asp Pro Ala Ala Ala Asp Val Met Val

245 250 255

Asp Ile Val Arg Glu Val Leu Glu Ala Asp Ile Pro Phe Phe Gly Ile

260 265 270

Cys Phe Gly Asn Gln Ile Leu Gly Arg Ala Phe Gly Met Glu Thr Tyr

275 280 285

Lys Leu Lys Phe Gly His Arg Gly Ile Asn Val Pro Val Lys Asn His

290 295 300

Ile Thr Gly Lys Ile Asp Ile Thr Ala Gln Asn His Gly Phe Ala Leu

305 310 315 320

Lys Gly Glu Ala Gly Gln Glu Phe Glu Thr Asp Phe Gly Thr Ala Ile

325 330 335

Val Thr His Thr Cys Leu Asn Asp Gly Val Val Glu Gly Val Ala Leu

340 345 350

Lys Ser Gly Arg Ala Tyr Ser Val Gln Tyr His Pro Glu Ala Ala Ala

355 360 365

Gly Pro Asn Asp Ala Ser Pro Leu Phe Asp Gln Phe Val Glu Leu Met

370 375 380

Asp Ala Asp Ala Gln Lys Lys Gly Ala

385 390

<210>3

<211>1113

<212>PRT

<213>Brevibacterium lactofermentum

<400>3

Met Pro Lys Arg Ser Asp Ile Asn His Val Leu Val Ile Gly Ser Gly

1 5 10 15

Pro Ile Val Ile Gly Gln Ala Cys Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Thr Gln

20 25 30

Ala Cys Arg Val Leu Lys Glu Glu Gly Leu Arg Val Thr Leu Ile Asn

35 40 45

Ser Asn Pro Ala Thr Ile Met Thr Asp Pro Glu Met Ala Asp His Thr

50 55 60

Tyr Val Glu Pro Ile Glu Pro Glu Tyr Ile Asp Lys Ile Phe Ala Lys

65 70 75 80

Glu Ile Glu Gln Gly His Pro Ile Asp Ala Val Leu Ala Thr Leu Gly

85 90 95

Gly Gln Thr Ala Leu Asn Ala Ala Ile Gln Leu Asp Arg Leu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Lys Tyr Gly Val Glu Leu Ile Gly Ala Asp Ile Asp Ala Ile

115 120 125

Glu Arg Gly Glu Asp Arg Gln Lys Phe Lys Asp Ile Val Thr Thr Ile

130 135 140

Gly Gly Glu Ser Ala Arg Ser Arg Val Cys His Asn Met Asp Glu Val

145 150 155 160

His Glu Thr Val Ala Glu Leu Gly Leu Pro Val Val Val Arg Pro Ser

165 170 175

Phe Thr Met Gly Gly Leu Gly Ser Gly Leu Ala Tyr Asn Thr Glu Asp

180 185 190

Leu Glu Arg Ile Ala Gly Gly Gly Leu Ala Ala Ser Pro Glu Ala Asn

195 200 205

Val Leu Ile Glu Glu Ser Ile Leu Gly Trp Lys Glu Phe Glu Leu Glu

210 215 220

Leu Met Arg Asp Thr Ala Asp Asn Val Val Val Ile Cys Ser Ile Glu

225 230 235 240

Asn Val Asp Ala Leu Gly Val His Thr Gly Asp Ser Val Thr Val Ala

245 250 255

Pro Ala Leu Thr Leu Thr Asp Arg Glu Phe Gln Lys Met Arg Asp Gln

260 265 270

Gly Ile Ala Ile Ile Arg Glu Val Gly Val Asp Thr Gly Gly Cys Asn

275 280 285

Ile Gln Phe Ala Ile Asn Pro Val Asp Gly Arg Ile Ile Thr Ile Glu

290 295 300

Met Asn Pro Arg Val Ser Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr

305 310 315 320

Gly Phe Pro Ile Ala Lys Met Ala Ala Lys Leu Ala Ile Gly Tyr Thr

325 330 335

Leu Asp Glu Ile Thr Asn Asp Ile Thr Gly Glu Thr Pro Ala Ala Phe

340 345 350

Glu Pro Thr Ile Asp Tyr Val Val Val Lys Ala Pro Arg Phe Ala Phe

355 360 365

Glu Lys Phe Val Gly Ala Asp Asp Thr Leu Thr Thr Thr Met Lys Ser

370 375 380

Val Gly Glu Val Met Ser Leu Gly Arg Asn Tyr Ile Ala Ala Leu Asn

385 390 395 400

Lys Ala Leu Arg Ser Leu Glu Thr Lys Gln Gln Gly Phe Trp Thr Lys

405 410 415

Pro Asp Glu Phe Phe Ala Gly Glu Arg Ala Thr Asp Lys Ala Ala Val

420 425 430

Leu Glu Asp Leu Lys Arg Pro Thr Glu Gly Arg Leu Tyr Asp Val Glu

435 440 445

Leu Ala Met Arg Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Leu Tyr Glu Ala Ser

450 455 460

Ser Ile Asp Pro Trp Phe Leu Ala Glu Leu Glu Ala Leu Val Gln Phe

465 470 475 480

Arg Gln Lys Leu Val Asp Ala Pro Phe Leu Asn Glu Asp Leu Leu Arg

485 490 495

Glu Ala Lys Phe Met Gly Leu Ser Asp Leu Gln Ile Ala Ala Leu Arg

500 505 510

Pro Glu Phe Ala Gly Glu Asp Gly Val Arg Thr Leu Arg Leu Ser Leu

515 520 525

Gly Ile Arg Pro Val Phe Lys Thr Val Asp Thr Cys Ala Ala Glu Phe

530 535 540

Glu Ala Lys Thr Pro Tyr His Tyr Ser Ala Tyr Glu Leu Asp Pro Ala

545 550 555 560

Ala Glu Ser Glu Val Ala Pro Gln Thr Glu Arg Glu Lys Val Leu Ile

565 570 575

Leu Gly Ser Gly Pro Asn Arg Ile Gly Gln Gly Ile Glu Phe Asp Tyr

580 585 590

Ser Cys Val His Ala Ala Leu Glu Leu Ser Arg Val Gly Tyr Glu Thr

595 600 605

Val Met Val Asn Cys Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr Asp Tyr Asp Thr

610 615 620

Ala Asp Arg Leu Tyr Phe Glu Pro Leu Thr Phe Glu Asp Val Met Glu

625 630 635 640

Val Tyr His Ala Glu Ala Gln Ser Gly Thr Val Ala Gly Val Ile Val

645 650 655

Gln Leu Gly Gly Gln Thr Pro Leu Gly Leu Ala Asp Arg Leu Lys Lys

660 665 670

Ala Gly Val Pro Val Ile Gly Thr Ser Pro Glu Ala Ile Asp Met Ala

675 680 685

Glu Asp Arg Gly Glu Phe Gly Ala Leu Leu Asn Arg Glu Gln Leu Pro

690 695 700

Ala Pro Ala Phe Gly Thr Ala Thr Ser Phe Glu Glu Ala Arg Thr Val

705 710 715 720

Ala Asp Glu Ile Ser Tyr Pro Val Leu Val Arg Pro Ser Tyr Val Leu

725 730 735

Gly Gly Arg Gly Met Glu Ile Val Tyr Asp Glu Ala Ser Leu Glu Asp

740 745 750

Tyr Ile Asn Arg Ala Thr Glu Leu Ser Ser Asp His Pro Val Leu Val

755 760 765

Asp Arg Phe Leu Asp Asn Ala Ile Glu Ile Asp Val Asp Ala Leu Cys

770 775 780

Asp Gly Asp Glu Val Tyr Leu Ala Gly Val Met Glu His Ile Glu Glu

785 790 795 800

Ala Gly Ile His Ser Gly Asp Ser Ala Cys Ala Leu Pro Pro Met Thr

805 810 815

Leu Gly Ala Gln Asp Ile Glu Lys Val Arg Glu Ala Thr Lys Lys Leu

820 825 830

Ala Leu Gly Ile Gly Val Gln Gly Leu Met Asn Val Gln Tyr Ala Leu

835 840 845

Lys Asp Asp Ile Leu Tyr Val Ile Glu Ala Asn Pro Arg Ala Ser Arg

850 855 860

Thr Val Pro Phe Val Ser Lys Ala Thr Gly Val Asn Leu Ala Lys Ala

865 870 875 880

Ala Ser Arg Ile Ala Val Gly Ala Thr Ile Lys Asp Leu Gln Asp Glu

885 890 895

Gly Met Ile Pro Thr Glu Tyr Asp Gly Gly Ser Leu Pro Leu Asp Ala

900 905 910

Pro Ile Ala Val Lys Glu Ala Val Leu Pro Phe Asn Arg Phe Arg Arg

915 920 925

Pro Asp Gly Lys Thr Leu Asp Thr Leu Leu Ser Pro Glu Met Lys Ser

930 935 940

Thr Gly Glu Val Met Gly Leu Ala Asn Asn Phe Gly Ala Ala Tyr Ala

945 950 955 960

Lys Ala Glu Ala Gly Ala Phe Gly Ala Leu Pro Thr Glu Gly Thr Val

965 970 975

Phe Val Thr Val Ala Asn Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ile Leu Pro Ile

980 985 990

Gln Arg Leu Ala Ser Met Gly Tyr Lys Ile Leu Ala Thr Glu Gly Thr

995 1000 1005

Ala Gly Met Leu Arg Arg Asn Gly Ile Asp Cys Glu Val Val Leu Lys

1010 1015 1020

Ala Ser Asp Ile Arg Glu Gly Val Glu Gly Lys Ser Ile Val Asp Arg

1025 1030 1035 1040

Ile Arg Glu Gly Glu Val Asp Leu Ile Leu Asn Thr Pro Ala Gly Ser

1045 1050 1055

Ala Gly Ala Arg His Asp Gly Tyr Asp Ile Arg Ala Ala Ala Val Thr

1060 1065 1070

Val Gly Val Pro Leu Ile Thr Thr Val Gln Gly Val Thr Ala Ala Val

1075 1080 1085

Gln Gly Ile Glu Ala Leu Arg Glu Gly Val Val Ser Val Arg Ala Leu

1090 1095 1100

Gln Glu Leu Asp His Ala Val Lys Ala

1105 1110

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于扩增粪链球菌的卡那霉素抗性基因的引物

<400>4

cccgttaact gcttgaaacc caggacaata ac 32

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增粪链球菌的卡那霉素抗性基因的引物

<400>5

cccgttaaca tgtacttcag aaaagattag 30

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增大肠杆菌克隆载体pHSG399的引物

<400>6

gatatctacg tgccgatcaa cgtctc 26

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增大肠杆菌克隆载体pHSG399的引物

<400>7

aggccttttt ttaagggcagt tattg 25

Claims

1.编码在下面的(A)或(B)中定义的多肽的DNA片段：

(A)一种多肽，该多肽具有由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第50-393位的氨基酸组成的氨基酸序列，

(B)一种多肽，该多肽具有由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第50-393位的并包括1-20个氨基酸的取代、缺失、插入、叠加或倒置的氨基酸组成的氨基酸序列，并且可以构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性并包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨甲酰磷酸合成酶的大亚单位的蛋白质。

2.编码在下面的(C)或(D)中定义的多肽的DNA片段：

(C)一种多肽，该多肽包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，

(D)一种多肽，该多肽包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括1-20个氨基酸的取代、缺失、插入、叠加或倒置，并且该多肽可以构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性并且具有氨甲酰磷酸合成酶的小亚单位的蛋白质，所述氨甲酰磷酸合成酶的小亚单位由SEQ IDNO：2的氨基酸序列的第50-393位的氨基酸组成。

3.编码多肽的DNA片段，该多肽包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括1-20个氨基酸的取代、缺失、插入、叠加或倒置，以及所述多肽可以构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性的蛋白质。

4.编码下面(a)或(b)中定义的多肽和下面(c)或(d)中定义的多肽的DNA片段：

(a)一种多肽，该多肽具有由SEQ ID NO：2的第50-393位的氨基酸组成的氨基酸序列，

(b)一种多肽，该多肽具有由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第50-393位的并包括1-20个氨基酸的取代、缺失、插入、叠加或倒置的氨基酸组成的氨基酸序列，并且可以构成具有氨甲酰磷酸合成酶活性并包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨甲酰磷酸合成酶的大亚单位的蛋白质，

(c)一种多肽，该多肽包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，

5.包括在下面(a)或(b)中定义的多肽和下面(c)或(d)中定义的多肽的蛋白质：

(c)一种多肽，该多肽包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，

6.利用根据权利要求1-4的任何一项所述的DNA片段转化的棒杆菌。

7.一种微生物，该微生物具有L-精氨酸生产率，其中所述微生物被修饰以增加所述微生物的编码氨甲酰磷酸合成酶的基因的拷贝数，或者通过编码氨甲酰磷酸合成酶的基因的表达调节序列进行修饰，以使细胞中基因的表达获得增强，其中所述基因包括权利要求1-4任一项的DNA片段。

8.根据权利要求7所述的微生物，该微生物是棒杆菌。

9.生产L-精氨酸的方法，其中包括在培养基中培养根据权利要求8所述的棒杆菌，以便在培养基中生产和积累L-精氨酸，和从培养基中回收L-精氨酸。

10.根据权利要求1的DNA片段，其中所述取代、缺失、插入、叠加或倒置的氨基酸序列的数目为1-10。

11.根据权利要求2的DNA片段，其中所述取代、缺失、插入、叠加或倒置的氨基酸序列的数目为1-10。

12.根据权利要求3的DNA片段，其中所述取代、缺失、插入、叠加或倒置的氨基酸序列的数目为1-10。

13.根据权利要求4的DNA片段，其中所述取代、缺失、插入、叠加或倒置的氨基酸序列的数目为1-10。

14.根据权利要求5的蛋白质，其中所述取代、缺失、插入、叠加或倒置的氨基酸序列的数目为1-10。

15.编码多肽的DNA片段，该多肽包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括1-20个氨基酸的取代、缺失、插入、叠加或倒置，并且所述多肽具有氨甲酰磷酸合成酶活性。