KR20160034320A

KR20160034320A - 원핵 세포에서의 폴리펩티드의 재조합체 생성 방법

Info

Publication number: KR20160034320A
Application number: KR1020167002566A
Authority: KR
Inventors: 크리슈티안 샨츠
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2016-03-29
Also published as: HK1221742A1; BR112015032141A2; US20160319319A1; SG11201600725WA; RU2016106950A; CN105358705A; JP2016524925A; EP3027777A1; MX2016001187A; WO2015014829A1; CA2915944A1

Abstract

본 발명은 i) 폴리펩티드를 발현하는 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균을 배양하는 단계, 및 ii) 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 대장균에서의 폴리펩티드의 재조합체 생성 방법에 관한 것이다.

Description

원핵 세포에서의 폴리펩티드의 재조합체 생성 방법 {METHOD FOR THE RECOMBINANT PRODUCTION OF A POLYPEPTIDE IN PROKARYOTIC CELLS}

본 발명은 NADH 데히드로게나아제 II 유전자 (ndh-유전자) 의 녹아웃 (knockout) 에 의해 유전적으로 변형된 원핵 세포, 및 폴리펩티드 생성에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.

최근 단백질 생성은 끊임없이 증가해왔으며 단백질이 가까운 미래에 각종 질환의 치료에 이용할 수 있는 최대 치료제가 될 가능성이 크다. 단백질의 영향은 그의 특이성, 예컨대 특정 표적 인지 및 결합 기능으로부터 생기는 것이다.

세포 배양물은 물질, 특히 단백질을 생성하는 발효 공정에서 사용된다. 세포 배양물이 유전적으로 변형되지 않으며 고유의 대사 산물을 형성하는 공정과 다량의 고유 물질 예컨대 단백질을 생성하거나 외래 (이종) 물질을 생성하는 방식으로 유기체가 유전적으로 변형되는 공정은 구별된다. 물질을 생성하는 유기체에는 유기체의 생존을 보장하고 원하는 표적 화합물을 생성할 수 있게 하는 영양 배지가 공급된다. 특정 숙주의 최적 배양을 가능하게 하는 목적을 위해 수많은 배양 배지가 공지되어 있다.

Riesenberg (Riesenberg, D., et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991) 380-384) 및 Horn (Horn, U., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 46 (1996) 524-532) 에 의해 대장균 (Escherichia coli) 의 고세포 밀도 배양이 보고되어 있다. Riesenberg, D. and Guthke, R. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 51 (1999) 422-430) 은 미생물의 고세포 밀도 배양을 보고하였다. 대장균을 고세포 밀도로 성장시키는 것이 Shiloach, J. and Fass, R. (Biotechnol. Advances 23 (2005) 345-357) 에 의해 검토되어 있다.

대장균의 에너지 효율 - 호기성 호흡 사슬의 성분에서의 돌연변이의 영향이 Calhoun et al. (J. Bacteriol. 175 (1993) 3020-3025) 에 의해 보고되어 있다. Melo et al. (Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2004) 603-616) 은 유형 II NAD(P)H:퀴논 산화환원효소에 대한 새로운 통찰을 보고하고 있다. NADH 데히드로게나아제-결핍 대장균의 adhE 또는 pta-ackA 돌연변이체에서의 락테이트 및 숙시네이트 형성의 증진이 Yun et al. (J. Appl. Microbiol. 99 (2005) 1404-1412) 에 의해 보고된 바 있다.

가장 효율적인 바이오매스 생성 대장균 박테리아의 설계, 구축 및 성능이 Trinh et al. (Met. Eng. 8 (2006) 628) 에 의해 보고되어 있다.

효소 NADH 데히드로게나아제 II 를 코딩하는 ndh-유전자의 결실/불활성화에 의해, ndh-유전자를 제외하고는 동질유전자형인 모체 균주와 비교하여 비슷한 산소 소모율, 비슷한 성장 속도를 가지지만 증가한 생산성을 갖는 유전적으로 변형된 원핵 유기체가 수득될 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, ndh-유전자의 결실/불활성화에 의해 원핵 유기체의 특이적 생산성이 증가할 수 있다는 것이 발견되었다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는 원핵 세포에서의 폴리펩티드의 재조합체 생성 방법이다:

- 폴리펩티드를 발현하는 원핵 세포를 배양 (즉, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양) 하는 단계, 및

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

이때 상기 원핵 세포는 ndh-유전자가 결핍되어 있다 (즉, 원핵 세포는 ndh-유전자의 기능적 카피를 포함/함유하지 않음).

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

이때 상기 원핵 세포는 ndh-유전자가 결핍되어 있으며 (즉, 원핵 세포는 ndh-유전자의 기능적 카피를 포함/함유하지 않음),

폴리펩티드는 효소가 아니다.

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

폴리펩티드는 호흡 사슬 경로 효소 또는 항생제 내성 유도 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 아니다.

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

이때 상기 원핵 세포는 ndh-유전자가 결핍되어 있으며 (즉, 원핵세포는 ndh-유전자의 기능적 카피를 포함/함유하지 않음),

폴리펩티드는 NADH 데히드로게나아제, SoxM 유형 옥시다아제, Sox 유형 옥시다아제, 시토크롬 bd 유형 옥시다아제, 시토크롬 bo 유형 옥시다아제 또는 항생제 내성 유도 유전자에 의해 인코딩된 임의의 폴리펩티드가 아니다.

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

이때 상기 원핵 세포는 ndh-유전자가 결핍되어 있고 (즉, 원핵 세포는 ndh-유전자의 기능적 카피를 포함/함유하지 않음),

원핵 세포는 유전자형 thi-1, △ndh, △pyrF, acnA, aceA, icd 를 가지며, acnA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S68G 돌연변이를 포함하고, aceA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S522G 돌연변이를 포함하고, icd 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 D398E 및 D410E 돌연변이를 포함한다.

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

폴리펩티드는 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 면역글로불린-독소 접합체, 면역글로불린 단편-독소 접합체, 독소, 사이토카인 또는 호르몬이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는 원핵 세포에서의 폴리펩티드의 생성 방법이다:

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

폴리펩티드는 효소가 아니다.

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

ndh-유전자의 산물은 NADH 데히드로게나아제 II 이다.

한 구현예에서 원핵 세포는 또한 bd-유형 옥시다아제가 결핍되어 있다.

한 구현예에서 원핵 세포는 대장균 세포이다. 한 구현예에서 대장균은 대장균 K12 이다.

한 구현예에서 상기 방법은 고세포 밀도 배양이다.

한 구현예에서 ndh-유전자 (NADH 데히드로게나아제 II) 가 결핍되어 있는 원핵 세포는 기능적 ndh-유전자 (NADH 데히드로게나아제 II) 를 갖는 것을 제외하고는 동일한 유전자형을 갖는 원핵 세포와 비교시 비슷한 산소 소모율 (OUR) 을 갖는다. 즉, ndh-결핍 세포와 참조 세포 사이의 유일한 유전적 차이는 ndh-결핍이다.

한 구현예에서 ndh-유전자 (NADH 데히드로게나아제 II) 가 결핍되어 있는 원핵 세포는 기능적 ndh-유전자 (NADH 데히드로게나아제 II) 를 갖는 것을 제외하고는 동질유전자형을 갖는 원핵 세포와 비교시 비슷한 성장 속도를 갖는다.

한 구현예에서 ndh-유전자 (NADH 데히드로게나아제 II) 가 결핍되어 있는 원핵 세포는 기능적 ndh-유전자 (NADH 데히드로게나아제 II) 를 갖는 것을 제외하고는 동일한 유전자형을 갖는 원핵 세포와 비교시 더 높은 생산율을 갖는다. 한 구현예에서 생산율은 특이적 생산율이다.

한 구현예에서 상기 방법은 배양 단계 후 하기 단계를 포함한다:

- 40℃ 이상의 온도에서 10 분 이상 동안 세포를 포함하는 배양 배지를 인큐베이션하는 단계, 및

- 세포 및/또는 배양 배지로부터 불용성 폴리펩티드를 회수하고 그로써 폴리펩티드를 생성하는 단계.

한 구현예에서 인큐베이션하는 것은 40℃ 내지 60℃ 의 온도에서 이루어진다.

한 구현예에서 인큐베이션하는 것은 45℃ 이상의 온도에서 이루어진다. 한 구현예에서 인큐베이션하는 것은 약 45℃ 의 온도에서 이루어진다.

한 구현예에서 인큐베이션하는 것은 10 분 내지 180 분 동안 이루어진다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는 대장균에서의 폴리펩티드의 재조합체 생성 방법이다:

- 폴리펩티드를 발현하는 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균을 배양 (즉, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균을 배양) 하는 단계, 및

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계.

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

이때 상기 폴리펩티드는 효소가 아니다.

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

이때 상기 폴리펩티드는 호흡 사슬 경로 효소 또는 항생제 내성 유도 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 아니다.

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

이때 상기 폴리펩티드는 NADH 데히드로게나아제, SoxM 유형 옥시다아제, Sox 유형 옥시다아제, 시토크롬 bd 유형 옥시다아제, 시토크롬 bo 유형 옥시다아제 또는 항생제 내성 유도 유전자에 의해 인코딩된 임의의 폴리펩티드가 아니다.

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

이때 상기 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 유전자형 thi-1, △ndh, △pyrF, acnA, aceA, icd 를 가지며, acnA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S68G 돌연변이를 포함하고, aceA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S522G 돌연변이를 포함하고, icd 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 D398E 및 D410E 돌연변이를 포함한다.

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

이때 상기 폴리펩티드는 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 면역글로불린-독소 접합체, 면역글로불린 단편-독소 접합체, 독소, 사이토카인 또는 호르몬이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는 대장균에서의 폴리펩티드의 생성 방법이다:

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계.

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

이때 상기 폴리펩티드는 효소가 아니다.

- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 기능적 NADH 데히드로게나아제 II 를 갖는 것을 제외하고는 동일한 유전자형을 갖는 대장균과 비슷한 산소 소모율을 갖는다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 기능적 NADH 데히드로게나아제 II 를 갖는 것을 제외하고는 동일한 유전자형을 갖는 대장균과 비슷한 성장 속도를 갖는다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 기능적 NADH 데히드로게나아제 II 를 갖는 것을 제외하고는 동일한 유전자형을 갖는 대장균보다 더 높은 생산율을 갖는다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 또한 bd-유형 옥시다아제가 결핍되어 있다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 대장균 K12 이다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 유전자형 thi-1, △ndh, △pyrF 를 갖는다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 유전자형 thi-1, △ndh, △pyrF, acnA, aceA, icd 를 갖는다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 유전자형 thi-1, △ndh, △pyrF, acnA, aceA, icd 를 가지며, acnA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S68G 돌연변이를 포함하고, aceA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S522G 돌연변이를 포함하고, icd 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 D398E 및 D410E 돌연변이를 포함한다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 기능적 Zwf-유전자를 갖는다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 기능적 ldhA-유전자를 갖는다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 기능적 maeA-유전자를 갖는다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 기능적 maeB-유전자를 갖는다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 기능적 Zwf-유전자, 기능적 ldhA-유전자, 기능적 maeA-유전자 및 기능적 maeB-유전자를 갖는다.

- 세포를 포함하는 배양 배지를 40℃ 이상의 온도에서 10 분 이상 동안 인큐베이션하는 단계, 및

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 유전자형 thi-1, △pyrF, △ndh 를 갖는 대장균 K12 이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 유전자형 thi-1, △ndh, △pyrF, acnA, aceA, icd 를 갖는 대장균 K12 이며, 이때 acnA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S68G 돌연변이를 포함하고, aceA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S522G 돌연변이를 포함하고, icd 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 D398E 및 D410E 돌연변이를 포함한다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 재조합체 폴리펩티드의 생성에 있어서의 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균의 용도이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 폴리펩티드의 생성에 있어서의 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균의 용도이다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 유전자형 △ndh, thi-1, △pyrF 를 갖는다. 한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 유전자형 thi-1, △ndh, △pyrF, acnA, aceA, icd 를 갖는다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 유전자형 thi-1, △ndh, △pyrF, acnA, aceA, icd 를 가지며, 이때 acnA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S68G 돌연변이를 포함하고, aceA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S522G 돌연변이를 포함하고, icd 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 D398E 및 D410E 돌연변이를 포함한다.

한 구현예에서 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균은 bd-유형 옥시다아제가 또한 결핍되어 있다.

본 발명의 상세한 설명

본원에서, ndh-유전자가 결핍되어 있으며 그로써 ndh-유전자의 결핍으로 인해 i) 산소 소모율 및 성장 속도가 ndh-유전자의 결핍을 제외하고는 동질유전자형인 모체 원핵 세포와 비슷하고, ii) 특이적 생산율이 ndh-유전자의 결핍을 제외하고는 동질유전자형인 모체 원핵 세포와 비교하여 증가하는, 원핵 세포를 사용하는 폴리펩티드의 (재조합체) 생성 방법이 보고되어 있다.

한 구현예에서 원핵 세포는 대장균 또는 바실러스 (Bacillus) 세포, 또는 락토바실러스 (Lactobacillus) 세포, 또는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 세포, 또는 효모 세포 (사카로마이세스 (Saccharomyces), 칸디다 (Candida) 또는 피키아 (Pichia)) 이다. 추가 구현예에서 세포는 대장균 세포, 또는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 세포, 또는 락토바실러스 애시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) 세포, 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 세포, 또는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 효모 세포이다.

한 구현예에서 원핵 세포는 대장균 K12 세포 또는 대장균 B 세포이다.

한 구현예에서 원핵 세포는 유전자형: thi-1, △ompT, △pyrF, acnA, aceA, icd (모체 균주) 및 유전자형: thi-1, △ompT, △pyrF, △ndh, acnA, aceA, icd (변형된 균주) 를 갖는 대장균 K12 세포이며, 이때 acnA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S68G 돌연변이를 포함하고, aceA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S522G 돌연변이를 포함하고, icd 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 D398E 및 D410E 돌연변이를 포함한다. 또한, 모체 균주 및 변형된 균주는 하기 e14 프로파지 유전자가 결여되어 있다: ymfD, ymfE, lit, intE, xisE, ymfI, ymfJ, cohE, croE, ymfL, ymfM, owe, ymfR, bee, jayE, ymfQ, stfP, tfaP, tfaE, stfE, pinE, mcrA.

원핵 세포의 배양 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어 Riesenberg, D., et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991) 380-384 참조). 배양은 임의의 방법으로의 것일 수 있다. 한 구현예에서 배양은 회분 (batch) 배양, 유가 배양 (fed-batch cultivating), 관류 배양, 반연속 배양, 또는 전체 또는 일부 세포가 유지되는 배양이다.

한 구현예에서 배양은 고세포 밀도 배양이다. 용어 "고세포 밀도 배양" 은 배양된 원핵 세포의 건조 세포 중량이 배양에서의 한 시점에서 10 g/L 이상인 배양 방법을 나타낸다. 한 구현예에서 건조 세포 중량은 배양에서의 한 시점에서 20 g/L 이상, 또는 50 g/L 이상, 또는 100 g/L 이상, 또는 100 g/L 초과이다. 이러한 고세포 밀도 상태에 도달하기 위해, 배양하는 동안 첨가되는 공급물 및/또는 조정 용액의 부피는 가능한 한 작아야 한다. 건조 세포 중량의 측정 방법은 예를 들어 [Riesenberg, D., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 34 (1990) 77-82] 에 보고되어 있다.

용어 "모체 세포" 는 결핍 세포와 유전자형은 동일하나 결핍 세포에서의 유전자 결핍이 모체 세포에서는 기능을 하는 세포를 나타낸다. 따라서, 모체 세포 및 결핍 세포는 결핍되어 있는 유전자를 제외하고는 동질유전자형이다.

용어 "기능적 ndh-유전자" 는 ndh-유전자가 전사되고 번역되며 유전자 산물, 즉, NADH 데히드로게나아제 II 가 기능을 하며 효소적으로 활성이라는 것을 나타낸다.

생성된 폴리펩티드는 임의의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드일 수 있다.

용어 "생물학적으로 활성인 폴리펩티드" 는 인공 생물학적 시스템, 예컨대 세포주 및 바이러스를 사용하는 바이오검정에서 투여되거나 이에 투여시, 또는 동물, 예컨대 비제한적으로 조류 또는 포유류, 예컨대 인간에 생체내 투여시 생물학적 영향을 일으키는 유기 분자, 예를 들어 생물학적 거대분자 예컨대 펩티드, 단백질, 당단백질, 핵단백질, 무코단백질, 지방단백질, 합성 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 이러한 생물학적 영향은 비제한적으로, 효소 저해 또는 활성화, 수용체 또는 리간드에 대한 결합 부위 또는 주변부에서의 결합, 신호 촉발 또는 신호 조정일 수 있다. 생물학적으로 활성인 분자는 비제한적으로, 예를 들어 면역글로불린, 또는 호르몬, 또는 사이토카인, 또는 성장 인자, 또는 수용체 리간드, 또는 아고니스트 또는 안타고니스트, 또는 세포독성제, 또는 항바이러스제, 또는 영상화제, 또는 효소 저해제, 효소 활성화제 또는 효소 활성 조정제 예컨대 알로스테릭 (allosteric) 물질이다. 한 구현예에서 폴리펩티드는 면역글로불린, 면역글로불린 접합체 또는 면역글로불린 단편이다.

"폴리펩티드" 는 자연적으로 또는 합성적으로 생성된, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 이루어지는 중합체이다. 본원에 정의한 바와 같은 폴리펩티드는 10 개 이상의 아미노산으로 이루어진다. 폴리펩티드는 또한 비-자연발생적 아미노산 잔기 및/또는 비-아미노산 성분, 예컨대 카르복실레이트기, 금속 이온, 또는 카르복실산 에스테르를 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의해 첨가될 수 있으며, 세포의 유형에 따라 가변적일 수 있다. 폴리펩티드는 아미노산 백본 구조 또는 이를 인코딩하는 핵산 면에서 정의된다. 카르복실레이트기와 같은 부가물은 일반적으로 명시되지 않으나, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.

용어 "면역글로불린" 은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 인코딩된 하나 이상의 폴리펩티드(들) 로 이루어지는 단백질을 나타낸다. 인지된 면역글로불린 유전자는 상이한 불변부 유전자 뿐 아니라 다수의 면역글로불린 가변부 유전자를 포함한다. 면역글로불린은 예를 들어 Fv 단편, Fab 단편 및 F(ab)₂ 단편 뿐 아니라 단일 사슬 단편 (scFv) 또는 디아바디를 포함하는 다양한 포맷으로 존재할 수 있다 (예를 들어 Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; 일반적으로, Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984); 및 Hunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16).

전체 길이 면역글로불린은 일반적으로 2 개의 소위 경쇄 폴리펩티드 (경쇄) 및 2 개의 소위 중쇄 폴리펩티드 (중쇄) 를 포함한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 항원과 상호작용할 수 있는 결합부를 포함하는 가변 도메인 (가변부) (일반적으로 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 부분) 을 함유한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 불변부 (일반적으로 일반적으로 카르복실 말단 부분) 를 포함한다. 중쇄의 불변부는 i) Fc 감마 수용체 (FcγR) 를 포함하는 세포, 예컨대 식세포, 또는 ii) 브람벨 (Brambell) 수용체로도 알려져 있는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 를 포함하는 세포에 대한 항체 결합을 매개한다. 이는 또한 보체 (C1q) 와 같은 고전적 보체 시스템의 인자를 포함하는 일부 인자에 대한 결합을 매개한다.

면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인은 상이한 조각, 즉 4 개의 골격부 (FR) 및 3 개의 과가변부 (CDR) 를 포함한다.

한 구현예에서 생물학적으로 활성인 폴리펩티드는 면역글로불린 단편이다.

용어 "면역글로불린 단편" 은 전체 길이 면역글로불린의 일부, 한 구현예에서는 이의 가변 도메인 또는 적어도 이의 항원 결합 부분을 나타낸다. 면역글로불린 단편은 그의 항원(들) 에 대해서 모체 전체 길이 면역글로불린의 결합 특징을 보유한다. 면역글로불린 단편의 예는, 모체 전체 길이 면역글로불린의 결합 특징을 보유하는 것인 한, 예를 들어 단일 사슬 항체 분자 (scFv), Fab, F(ab)₂ 단편 등이다.

한 구현예에서 폴리펩티드는 독소이다. 한 구현예에서 폴리펩티드는 면역글로불린-독소 접합체이다. 한 구현예에서 폴리펩티드는 면역글로불린 단편-독소 접합체이다. 한 구현예에서 폴리펩티드는 호르몬이다. 한 구현예에서 폴리펩티드는 사이토카인이다.

생산 과학자의 목표는 재조합체 폴리펩티드 생산에서의 수율을 증가시키는 것이다.

향상된 배지 조성 및 배양 기법을 사용하여 이루어질 수 있는 생산 수율 증가가 미래에 언젠가 이루어질 것이다. 따라서 생성 세포주 및 균주의 대사 공학이 보다 중요해질 것이다.

원핵 유기체에서의 유전자의 표적화된 불활성화를 위한 다양한 방법이 공지되어 있다. 한 예는 Red/ET 재조합 방법이다. 이 방법에서 표적 핵산은 박테리오파지 유래 폴리펩티드에 의해 매개된 상동 재조합에 의해 변형된다 (즉, 대체되고 결실된다).

용어 "호흡 사슬" 또는 "호흡 사슬 효소" (호흡 사슬에서 관련되는 효소) 는 당업자에게 공지되어 있으며 예를 들어 Berg, JM et al. 에 의해 기재된다 (Biochemistry, 5^th Edition, 2002). 예시적 호흡 사슬 효소는 예를 들어 NADH 데히드로게나아제, Sox 유형 옥시다아제 (예컨대 SoxM 유형 옥시다아제 또는 SoxB 유형 옥시다아제), 시토크롬 bd 유형 옥시다아제 또는 시토크롬 bo 유형 옥시다아제이다.

NADH 데히드로게나아제 II (ndh-유전자에 의해 인코딩됨) 는 NADH 로부터 호흡 사슬로의 전자 이동에 관련된다. 이동은 퀴논 풀 (pool) 을 통해 양성자 구배와 연결되며 산소로의 최종 전자 이동을 위해 bo-유형 및 bd-유형 옥시다아제를 동시에 사용한다.

NADH 데히드로게나아제 II 는 "자매"-효소 NADH 데히드로게나아제 I 을 갖는다. NADH 데히드로게나아제 I 및 II 의 활성은 상이한 H⁺/e^- 비를 초래하는 양성자 구배에 대한 다양한 정도에 따라 좌우된다.

ndh-유전자의 불활성화에 의해, 대장균 세포의 (특이적) 생산성이 증가될 수 있으며 그로써 놀랍게도, 산소 소모율 및 성장 속도가 ndh-유전자를 제외하고는 ndh-결핍 대장균 세포와 동질유전자형인 모체 대장균 세포의 경우와 비슷하게 남아 있다는 것이 발견되었다.

(유전자형 1 △ndh 의) ndh-결핍 (NADH 데히드로게나아제 II-결핍) 변형된 대장균 세포를 초래하는 (유전자형 1 의) 대장균 세포에서의 ndh-유전자의 불활성화가, 모체 대장균 세포와 비교하여 증가한 대장균 세포의 (특이적) 생산성에 엄청난 영향을 갖는다는 것이 발견되었다. 동시에 산소 소모율 및 성장 속도는 변형된 대장균 세포와 모체 대장균 세포 간에 비슷하다.

용어 "비슷한" 은 2 개의 값이 서로의 50% 내에 있는 것을 나타낸다. 한 구현예에서 값은 서로의 30% 내에 있다. 한 구현예에서 값은 서로의 10% 내에 있다. 예를 들어, 2 개의 값은 서로의 50% 내에 있으며, 따라서 두 번째 값이 첫 번째 값을 50% 초과로 넘지 않는 경우, 즉 첫 번째 값의 150% 이하인 경우, 그리고 두 번째 값이 첫 번째 값의 50% 이상인 경우 비슷하며, 즉 비슷하다는 것은 두 번째 값이 첫 번째 값의 50% 내지 150% 인 것을 나타낸다.

ndh-유전자의 결실/불활성화는 ndh-결핍 세포 (유전자형 △ndh) 를 초래한다.

도 1 에서, 모체 대장균 및 변형된 대장균이 비슷한 시간에 비슷한 세포 밀도로 성장하는 것을 관찰할 수 있다. 따라서, ndh-유전자의 결실/불활성화는 (모체 대장균과 비교하여) 변형된 대장균의 성장 특징에 부정적 영향을 갖지 않는다.

도 2 에서, 모체 대장균 및 변형된 대장균이 배양 동안 비슷한 산소 소모율을 갖는 것을 관찰할 수 있다. 따라서, ndh-유전자의 결실/불활성화는 (모체 대장균과 비교하여) 변형된 대장균의 산소 요구량에 영향을 갖지 않는다.

도 3 에서, 변형된 대장균이 모체 대장균과 비교하여 더 높은 산물 농도를 초래하는 더 높은 (특이적) 생산율을 갖는 것을 관찰할 수 있다. 따라서, ndh-유전자의 결실/불활성화는 변형된 대장균의 생산율에 긍정적 영향을 갖는다.

도 1: 모체 대장균 (흑색 다이아몬드형, 유전자형 1) 및 변형된 대장균 (흑색 정사각형, 유전자형 1 △ndh) 의 성장 특징.
도 2: 20 시간 배양 시간에서 측정한 모체 대장균 (하위 곡선, 유전자형 1) 및 변형된 대장균 (상위 곡선, 유전자형 1 △ndh) 의 산소 소모율.
도 3: 모체 대장균 (흑색 다이아몬드형, 유전자형 1) 및 변형된 대장균 (흑색 정사각형, 유전자형 1 △ndh) 의 생산율.

하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 참된 범주는 첨부된 특허청구범위에서 설명된다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고, 나타낸 절차에 변형을 가할 수 있다는 것이 이해된다.

실시예 1

대장균 발현 플라스미드의 생성 및 설명

단축된 테트라넥틴-아포리포단백질 A-I 융합 단백질을 재조합 수단에 의해 제조하였다. 발현된 융합 단백질은 N- 에서 C-말단 방향으로 하기 SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 갖는다:

인코딩 융합 유전자는 적절한 핵산 조각의 연결에 의해, 공지된 재조합 방법 및 기법을 사용하여 어셈블리된다. 화학적 합성에 의해 만들어진 핵산 서열을 DNA 서열분석으로 확인한다. SEQ ID NO: 01 의 융합 단백질 생성을 위한 발현 플라스미드를 하기와 같이 제조할 수 있다:

플라스미드 1 (1-pBRori-URA3-LACI-SAC) 는 대장균에서의 코어-스트렙타비딘의 발현을 위한 발현 플라스미드이다. 이를 435 bp 길이 코어-스트렙타비딘 인코딩 EcoRI/CelII-단편과의 플라스미드 2 (2-pBRori-URA3-LACI-T-반복물; EP-B 1 422 237 에서 보고됨) 에서 유래한 3142 bp 길이의 EcoRI/CelII-벡터 단편의 라이게이션에 의해 생성시켰다.

코어-스트렙타비딘 대장균 발현 플라스미드는 하기의 요소를 포함한다:

- 대장균에서의 복제를 위한 벡터 pBR322 로부터의 복제 기원 (bp 위치 2517-3160 에 상응, [Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90] 에 따름),

- 대장균 pyrF 돌연변이체 균주 (우라실 영양요구성) 의 상보성 (complementation) 에 의한 플라스미드 선택이 가능하게 하는, 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라아제를 코딩하는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 의 URA3 유전자 (Rose, M., et al., Gene 29 (1984) 113-124),

- 하기를 포함하는 코어-스트렙타비딘 발현 카세트;

- Stueber, D., et al. (하기 참조) 에 따른 합성 리보솜 결합 부위를 포함하는 T5 하이브리드 프로모터 (Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433 및 Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152 에 따른 T5-PN25/03/04 하이브리드 프로모터),

- 코어-스트렙타비딘 유전자,

- 2 개 박테리오파지-유래 전사 터미네이터, λ-T0 터미네이터 (Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414) 및 fd-터미네이터 (Beck, E. and Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58),

- 대장균으로부터의 lacI 억제자 유전자 (Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769).

단축된 테트라넥틴-아포리포단백질 A-I 융합 단백질의 발현을 위한 최종 발현 플라스미드는, 코어-스트렙타비딘 구조 유전자를 단수의 측면위치 EcoRI 및 CelII 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 사용하여 플라스미드 1 로부터 잘라내고 융합 단백질을 인코딩하는 EcoRII/CelII 제한 부위 측면위치 핵산을 3142 bp 길이 EcoRI/CelII-1 플라스미드 단편에 삽입함으로써 제조될 수 있다.

실시예 2

재조합체 폴리펩티드 발현에 있어서의 ndh-결실 돌연변이체 균주와 모체 균주의 비교

고세포 밀도 및 고수율 발효에 있어서 재조합체 단백질을 발현하는 대장균 균주의 성능에 대한 염색체 ndh 유전자 결실의 영향을 평가하기 위해, 모체 균주를 동일한 공정 및 탐색된 성장 및 산물 형성 내에서 변형된 균주와 비교하였다.

대장균 K12 모체 균주 (유전자형: thi-1, △ompT, △pyrF, acnA, aceA, icd) 및 변형된 균주 (유전자형: thi-1, △ompT, △pyrF, △ndh, acnA, aceA, icd) 를 실시예 1 에서 기재한 바와 같이 최종 발현 플라스미드로 전기천공에 의해 형질전환하여, TN-ApoA1 융합 폴리펩티드를 발현시켰다. 본원에서, acnA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S68G 돌연변이를 포함하고, aceA 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 S522G 돌연변이를 포함하고, icd 유전자 인코딩된 폴리펩티드는 D398E 및 D410E 돌연변이를 포함한다. 추가로, 모체 균주 및 변형된 균주는 하기의 e14 프로파지 유전자가 결여되어 있다: ymfD, ymfE, lit, intE, xisE, ymfI, ymfJ, cohE, croE, ymfL, ymfM, owe, ymfR, bee, jayE, ymfQ, stfP, tfaP, tfaE, stfE, pinE, mcrA. 형질전환된 대장균 세포를 한천 플레이트에서 37℃ 에서 먼저 성장시켰다. 상기 플레이트로부터 골라낸 콜로니를 3　mL 롤러 배양물에 이동시키고 37℃ 에서 광학 밀도 1-2 (578nm 에서 측정) 로 성장시켰다. 이후 1000 ㎕ 배양물을 1000 ㎕ 멸균 86%-글리세롤과 혼합하고 장기간 저장을 위해 -80℃ 에서 즉시 동결하였다. 이러한 클론의 올바른 산물 발현을 소규모 진탕 플라스크 실험에서 먼저 확인하고, 10 L 발효기에 옮기기 전에 SDS-Page 로 분석하였다.

화학적으로 알려진 배지 (CDM) 에서의 사전배양:

사전발효를 위해 화학적으로 알려진 배지를 사용하였다;

NH4Cl 1.0 g/L, K2HPO4*3H2O 18.3 g/L, 시트레이트 1.6 g/L, 글리신 0.78 g/L, L-알라닌 0.29 g/L, L-아르기닌 0.41 g/L, L-아스파라긴*H2O 0.37 g/L, L-아스파르테이트 0.05 g/L, L-시스테인*HCl*H2O 0.05 g/L, L-히스티딘 0.05 g/L, L-이소류신 0.31 g/L, L-류신 0.38 g/L, L-리신*HCl 0.40 g/L, L-메티오닌 0.27 g/L, L-페닐알라닌 0.43 g/L, L-프롤린 0.36 g/L, L-세린 0.15 g/L, L-트레오닌 0.40 g/L, L-트립토판 0.07 g/L, L-발린 0.33 g/L, L-티로신 0.51 g/L, L-글루타민 0.12 g/L, Na-L-글루타메이트*H2O 0.82 g/L, 글루코오스*H2O 6.0 g/L, 미량 원소 용액 0.5 ml/L, MgSO4*7H2O 0.86 g/L, 티아민*HCl 17.5 mg/L. 미량 원소 용액은 FeSO4*7H2O 10.0 g/L, ZnSO4 * 7H2O 2.25 g/L, MnSO4 * H2O 2.13 g/L, H3BO3 0.50 g/L, (NH4)6Mo7O24 * 4H2O 0.3 g/L, CoCl2*6H2O 0.42 g/L, CuSO4 * 5H2O 1.0 g/L (0.5M HCl 에 용해) 을 함유한다.

사전발효를 위해 4 개 배플 (baffle) 을 갖는 1000 ml 삼각 플라스크 중의 300 ml 의 CDM-배지에 제 1 시드 뱅크 (seed bank) 앰플 중 0.9 ml 을 접종하였다. 8 시간 동안 32℃ 및 170 rpm 에서 회전식 진탕기에서 배양을 수행하였다.

발효 공정 (AP30#021 및 AP50#001):

10　L Biostat C, DCU3 발효기 (Sartorius, Melsungen, Germany) 에서의 발효를 위해, 하기의 회분식 배지를 사용하였다: KH₂PO₄ 1.58 g/L, (NH₄)₂HPO₄ 7.47 g/L, K2HPO4*3H2O 13.32 g/L, 시트레이트 2.07 g/L, L-메티오닌 1.22 g/L, NaHCO₃ 0.82 g/L, 미량 원소 용액 7.3 ml/L, MgSO₄*7 H₂O 0.99 g/L, 티아민*HCl 20.9 mg/L, 글루코오스*H₂O 29.3 g/L, 비오틴 0.2 mg/L, 1.2 ml/L Synperonic 10% 소포제. 미량 원소 용액은 FeSO4*7H2O 10 g/L, ZnSO4 * 7H2O 2.25 g/L, MnSO4 * H2O 2.13 g/L, CuSO4 * 5H2O 1.0 g/L, CoCl2*6H2O 0.42 g/L, (NH4)6Mo7O24 * 4H2O 0.3 g/L, H3BO3 0.50 g/L (0.5M HCl 용액 중 가용화) 을 함유한다.

공급물 1 용액은 700 g/L 글루코오스*H2O, 7.4 g/L MgSO₄*7 H₂O 및 0.1 g/L FeSO4*7H2O 를 함유하였다. 공급물 2 는 KH₂PO₄ 52.7 g/L, K2HPO4*3H2O 139.9 g/L 및 (NH4)2HPO4 66.0 g/L 을 포함한다. 모든 성분을 탈이온수에 용해하였다. pH 조절용 알칼리 용액은 11.25 g/L L-메티오닌이 보충된 12.5% (w/v) NH₃ 수용액이었다.

4.2 L 멸균 회분식 배지로 시작하여, 회분식 발효를 31℃, pH 6.9 ± 0.2, 800 mbar 배압 및 10　L/분의 초기 공기 공급량 (aeration rate) 에서 수행하였다. 교반기의 속도를 1500 rpm 까지 증가시켜, 발효 전체에 걸쳐 용존 산소 (pO2) 의 상대적 값을 50% 에서 유지시켰다. 초기 보충한 글루코오스가 고갈된 후 (용존 산소 값의 급격한 증가에 의해 표시됨), 온도를 25℃ 로 변화시키고 15 분 후 두 공급물로 시작하여 (각각 60 및 14　g/시간) 유가배양 방식으로 진입시켰다. 공급물 2 의 속도를 일정하게 유지시키면서, 공급물 1 의 속도를 7 시간 내에 60 에서 최종적으로 160 g/시간의 사전 정의된 공급 프로필로, 단계적으로 증가시킨다. 이산화탄소 오프 가스 농도가 2% 초과 수준이 될 때, 공기 공급량을 5 시간 내에 10 에서 20 L/분으로 끊임없이 증가시켰다. 약 150 의 광학 밀도에서 2.4 g IPTG 를 첨가하여, 재조합체 테트라넥틴-아포리포단백질 A-I 융합 단백질의 발현을 유도하였다.

발효 종료시 세포질 내 가용성인 발현된 테트라넥틴-아포리포단백질 A-I 을 가열 단계로 불용성 단백질 응집물 (소위 봉입체) 에 옮기는데, 이때 발효기 내 전체 배양 브로쓰를 수확 전 1 시간 동안 50℃ 로 가열한다 (예를 들어 EP-B 1 486 571 참조). 이후, 발효기의 내용물을 병류 (flow-through) 원심분리기로 원심분리하고 (13,000　rpm, 13 L/시간), 수확한 바이오매스를 추가 처리할 때까지 -20℃ 에서 보관하였다. 합성한 테트라넥틴-아포리포단백질 A-I 융합 단백질만이 불용성 단백질 응집물, 소위 봉입체 (IB) 의 형태로 불용성 세포 찌꺼기에서 발견되었다.

산물 형성의 분석:

발효기로부터 얻은 샘플 (하나는 단백질 발현 유도 전, 다른 것은 단백질 발현 유도 후 제시된 시점에) 을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한다. 모든 샘플로부터 동량의 세포 (OD_표적 = 5) 를 5 mL PBS 완충액에 현탁하고 얼음 상에서 초음파 처리를 통해 분열시켰다. 그런 다음 100 ㎕ 의 각각의 현탁액을 원심분리하고 (15,000 rpm, 5 분), 각각의 상청액을 빼내고 별도의 바이알에 옮긴다. 이는 가용성 및 불용성 발현 표적 단백질을 구별하기 위한 것이다. 각각의 상청액 (= 가용성) 분획물에 300 ㎕ 의, 및 각각의 펠렛 (= 불용성) 분획물에 400 ㎕ 의 SDS 샘플 완충액 (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685) 을 첨가한다. 샘플을 강한 혼합 하에 15 분 동안 95℃ 에서 가열하여 가용화하고 샘플 중의 모든 단백질을 환원시킨다. 실온으로 냉각한 후 5 ㎕ 의 각각의 샘플을 4-20% TGX Criterion Stain Free 폴리아크릴아미드 겔 (Bio-Rad) 에 옮긴다. 추가로, 5 ㎕ 분자량 표준물 (Precision Plus Protein Standard, Bio-Rad) 및 공지된 산물 단백질 농도 (0.1　㎍/㎕) 를 갖는 3 가지 양 (0.3 ㎕, 0.6 ㎕ 및 0.9　㎕) 의 정량 표준물을 겔 상에 배치시킨다.

전기영동을 60 분 동안 200 V 에서 실행하고 그 후 겔을 GelDOC EZ 영상화기 (Bio-Rad) 에 이동시키고 UV 방사선조사로 5 분 동안 처리하였다. 겔 영상을 Image Lab 분석 소프트웨어 (Bio-Rad) 로 분석하였다. 3 개 표준물을 사용하여 선형 회귀 곡선을 계수 >0.99 로 계산하고, 본래 샘플 중 표적 단백질의 농도를 계산하였다.

결과:

상기 언급한 발효 공정을 사용하여, 모체 균주 및 ndh 결실 돌연변이체를 나타내는 변형된 균주에서 단축된 테트라넥틴-아포리포단백질 A-I 융합 단백질을 발현시켰다. 변형된 균주의 사전-배양물의 광학 밀도가 더 낮았으나 두 균주 모두의 성장은 매우 비슷하였다. 47 시간 배양 및 연이은 가열 단계 후 285 및 245 의 광학 밀도를 수득하였다.

ndh 발현의 변형은 Calhoun et al. (J. Bacteriol. 175 (1993) 3020-3025) 에 의해 기재된 바와 같이 산소 소모율 (OUR) 감소를 초래하였다. 놀랍게도, 변형된 균주는 동일한 배양 조건 하에 상기 실험에서 모체 균주와 거의 비슷한 OUR 을 가졌다. 발효 공급 단계의 첫 번째 기간에서, 변형된 균주의 OUR 은 모체 균주와 비교시 더 높았다.

두 시도 모두에 있어서 약 150 의 광학 밀도에서 2.4 g IPTG 를 첨가하여 산물 형성을 유도하였다.

두 균주 모두 동일한 화학적으로 알려진 배지에서 동일한 조건 하에 배양하였으나 모체 균주의 산물 형성률은 상당히 더 낮았으며 따라서 최종 수율은 단지 27.5 g/L 에 이르렀다. 이와 비교하여, 변형된 균주는 상당히 더 높은 산물 형성률을 가졌다. 이는 모체 균주와 직접 비교하여 성장 및 OUR 의 데이터만을 관찰하는 경우에는 예측되지 않는다. 동량의 표적 단백질이 단지 38 시간 배양 후 ndh-결핍 변형 균주에 의해 생성되었으며 (27.8 g/L), 발효는 폴리펩티드 TN-ApoA1 을 생성시키기 위해 모체 균주 사용시보다 10 시간 더 이르게 종료될 수 있었다. 또한 ndh-결핍 변형 균주로의 배양은 발효 종료시 및 가열 단계 후 융합 단백질을 8.4% 더 산출하였다 (29.8 g/L). 모체 대장균 균주는 변형된 균주와 직접 비교하여 상당한 결손을 갖는다.

요약:

두 균주 모두가 화학적으로 알려진 배지에서의 발효시 동일한 성장을 나타내었으나, ndh-결핍 변형 균주는 공정의 유가배양 단계 동안 산소 소모율에 있어서 예기치 못한 증가 및 상당히 더 높은 산물 형성률을 가졌다. 따라서, 최종 산물 수율이 증가될 수 있었다. 두 실험에서의 유일한 차이가 ndh-결핍 변형 균주의 ndh 유전자 자리에 있어서의 변형이었으므로, 이러한 영향은 그와 직접적으로 상관관계가 있을 수 있다. 따라서, OUR 를 감소시키기 위해서가 아니라 생산성을 증가시키기 위해서 매우 생산적인 대장균 균주에서 ndh 를 결실시키는 것이 유용하다.

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Claims

하기 단계를 포함하는 대장균 (Escherichia coli) 에서의 폴리펩티드의 재조합체 생성 방법:
- 폴리펩티드를 발현하는 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균을 배양하는 단계, 및
- 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,
이때 상기 폴리펩티드는 호흡 사슬 경로 효소 또는 항생제 내성 유도 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 아님.
제 1 항에 있어서, NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균이 기능적 NADH 데히드로게나아제 II 를 갖는 것을 제외하고는 동일한 유전자형을 갖는 대장균과 비슷한 산소 소모율을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균이 기능적 NADH 데히드로게나아제 II 를 갖는 것을 제외하고는 동일한 유전자형을 갖는 대장균과 비슷한 성장 속도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균이 기능적 NADH 데히드로게나아제 II 를 갖는 것을 제외하고는 동일한 유전자형을 갖는 대장균보다 더 높은 생산율을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균이 대장균 K12 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균이 유전자형 thi-1, △ndh, △pyrF 를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균이 bd-유형 옥시다아제가 또한 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
유전자형 thi-1, △ndh, △pyrF 를 갖는 대장균 K12.
재조합체 폴리펩티드의 생성에 있어서의 NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균의 용도로서, 이때 상기 폴리펩티드가 호흡 사슬 경로 효소 또는 항생제 내성 유도 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 아닌 용도.
제 9 항에 있어서, NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균이 유전자형 thi-1, △ndh, △pyrF 를 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, NADH 데히드로게나아제 II-결핍 대장균이 bd-유형 옥시다아제가 또한 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는 용도.