JP2006280268A

JP2006280268A - 細胞増殖の促進によりアルコール生産効率を向上させる方法

Info

Publication number: JP2006280268A
Application number: JP2005104316A
Authority: JP
Inventors: Kazue Igarashi; 一衛五十嵐; Keiko Kashiwagi; 敬子柏木; Takeshi Uemura; 武史植村; Takeshi Tachihara; 健立原
Original assignee: Chiba University NUC
Current assignee: Chiba University NUC
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2006-10-19

Abstract

【課題】
より短期間で多くのアルコール取得量の増加を目的とし、その目的達成のために、細胞増殖速度の増大によるアルコール生産効率の向上という新規な技術的課題を設定すること。
【解決手段】
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＹＫＬ１７４ｃ遺伝子を破壊することにより、生産するアルコール量および生産速度を増大させた変異酵母とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、変異酵母に関し、更に詳細には細胞増殖速度を促進させたことにより、発酵効率を増大させた酵母の育種に関するものである。特に本発明は、当該酵母を使用することにより、酒類用、工業用等のアルコール生産の製造期間短縮、アルコール生産量の増加等アルコールの効率的製造工程に好適なものである。

これまでに、発酵速度の増大によりアルコールを高生産する高アルコール生産酵母（例えば下記特許文献１参照）や、アルコール耐性の高い酵母菌株を分離した育種例（例えば特許文献２参照）が知られているが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のポリアミン輸送タンパク質をコードする遺伝子ＹＫＬ１７４ｃの破壊による細胞増殖速度の増大を利用してアルコール生産効率の増大に成功した例は報告されていない。

また、出芽酵母ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子がコードするタンパク質（ＹＫＬ１７４ｃ）が、ポリアミンの輸送を介した細胞内ポリアミン濃度の調節により、細胞増殖を制御していることは本発明者らによって明らかとなっている（例えば下記非特許文献１参照）。
しかし、このＹＫＬ１７４ｃ遺伝子がコードするタンパク質の有するポリアミン輸送能力を変調させることによる細胞増殖速度の制御方法の実用的な応用に成功した例は知られていない。

特許３０６９６８９号明細書特許３０９４１０７号明細書

以上、本発明は酒類用、工業用等のアルコール製造において、より短期間での多くのアルコールの取得と製造期間の短縮を解決することを目的とする。

そこで本発明者らは、より短期間で多くのアルコール取得量の増加を目的とし、その目的達成のために、細胞増殖速度の増大によるアルコール生産効率の向上という新規な技術的課題を設定した。

上記目的達成のため、本発明者らが先に発明し、すでに報告した出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のポリアミン輸送タンパク質をコードする遺伝子ＹＫＬ１７４ｃの破壊による細胞増殖速度の増大に着目し、更に鋭意検討した結果、ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子の破壊による細胞増殖速度の増大が、アルコール生産効率の向上に極めて有効であることをはじめて明らかにした。

本発明は、上記した新規にして有用な知見を基にし、更に検討した結果完成されたものであって、特定の遺伝子を破壊し、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母の中から、細胞内ポリアミン量の制御による細胞増殖速度の増大に起因したアルコール生産効率の向上をもたらす酵母を分離、育種する点を基本的技術思想とするものである。そして、特定遺伝子としては出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＹＫＬ１７４ｃ遺伝子が挙げられる。

すなわち本発明は、ポリアミンの輸送による細胞内のポリアミン濃度調節に関与する遺伝子が、アルコール生産の効率化に大きく寄与していることを発見し、これら有用な新知見に基づき、更に検討の結果完成されたものであって、ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子の破壊により細胞増殖速度が増大するため、それによるアルコール生産の効率化という新規な性質を利用して、同酵母の創製を含むトータルシステムにも関与するものである。

即ち本発明に係る変異酵母は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＹＫＬ１７４ｃ遺伝子を破壊することにより、生産するアルコール量および生産速度を増大させた変異酵母である。

また、本発明に係るアルコールの製造方法は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＹＫＬ１７４ｃ遺伝子を破壊した変異酵母を使用することを特徴とする。

本発明によって、アルコール生産の効率化が可能となり、本発明によって育種された酵母を使用することによって酒類用、工業用等のアルコール製造において、より短期間での多くのアルコールの取得と製造期間の短縮が可能となった。

本発明を実施するには、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母を用い、ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子を破壊し、ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子が破壊された株を選択、分離する。このようにして、目的とする効率的アルコール生産酵母が得られる。

更に、所望するのであれば、これら酵母を用いて小仕込み試験を行い発酵力の良い酵母を分離すれば、発酵力の優れた高アルコール生産用実用酵母を選択、育種することができる。

本発明においては、目的とする効率的アルコール生産酵母は、ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子を破壊した酵母から分離すればよいため、分離作業が容易かつシンプルであり、この点においても本発明の育種方法は優れている。

本発明において、酵母としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母であればほぼすべての酵母が使用可能であり、例えば、清酒酵母（協会７号酵母、協会９号酵母、協会１０号酵母、明利小川酵母等）、ワイン酵母（ブドウ酒１号酵母（日本醸造協会ブドウ酒１号酵母）、ブドウ酒３号酵母、ブドウ酒４号酵母等）、ビール酵母、パン酵母等の実用酵母、その他アルコール発酵に常用される酵母を含めサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ）属セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母であればすべての酵母が有利に使用できる。

遺伝子破壊とは、ある遺伝子の機能が発揮できないようにするために、その遺伝子の塩基配列に変異を入れる、別のＤＮＡを挿入する、あるいは、遺伝子のある部分を欠失させることを示している。遺伝子破壊の結果、その遺伝子がｍＲＮＡへ転写できなくなり、構造遺伝子が翻訳されない、あるいは、転写されたｍＲＮＡが不完全なため、翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生じ、本来の機能の発揮が不可能になる。

ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子とは、プロモーター領域を含む５’非翻訳領域とポリアミントランスポーターをコードする領域並びにターミネーター領域を含む３’非翻訳領域からなる遺伝子断片を示す。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＹＫＬ１７４ｃ遺伝子の塩基配列はＴｈｅＥｎｔｒｅｚＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｄａｔａｂａｓｅ：Ｚ２８１７４に公開されており、配列番号１にＤＮＡ配列を示した。

（１）ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株の作製方法
ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株の作製方法に関しては、ＹＫＬ１７４ｃタンパク質が発現しない破壊株が得られればいかなる方法も用いることが可能である。遺伝子破壊の方法は種々の方法が報告されているが、ある特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相同的組換えによる遺伝子破壊が好ましい。相同的組換えの中でも、自然復帰しない破壊株が取得でき、その結果、組換え体を取り扱う上で安全性が高い菌株が得られる、という点で、１段階破壊法（ｏｎｅ−ｓｔｅｐｇｅｎｅｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）が好ましい。

１段階破壊法に使用するＹＫＬ１７４ｃＤＮＡ断片は、通常、遺伝子内部の部分ＤＮＡを除去し、残った両端部分を再度連結した形のＤＮＡ断片が用いられる。このＤＮＡ断片を作製するためには、例えば、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）や、ベクターからの制限酵素による切り出しと再連結によって調製できる。

（２）アルコール生産性（発酵能）の評価
得られたＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株におけるアルコール生産性の評価は、所定の量の発酵試験用培地（例えば、合成培地；１％ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、２％ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、２４％ｇｌｕｃｏｓｅ、及び糖蜜培地；全糖濃度２４％インドネシア産糖蜜）に所定濃度の酵母培養液を接種して、３０℃、５日間振とう培養し、経時的に培養上清中のエタノール濃度をガスクロマトグラフィーにより測定することで実施することができる。

また、発酵速度は、この培養により生じる炭酸ガスの発生量、及び培地中の糖濃度の減少量に基づいて測定することができる。

以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。

（ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株の作製）
ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株は以下の方法で作製した。
まず、組み換えＤＮＡ技術を用いて、抽出した出芽酵母細胞のゲノムＤＮＡからＹＫＬ１７４ｃＤＮＡの全長ＯＲＦおよびプロモーター領域をすべて含むフラグメントをプライマーＡ（配列番号２）及びプライマーＢ（配列番号３）を用いてＰＣＲ法にて増幅した。その後、プラスミドベクターＹＥｐ３５２及び増幅されたＹＫＬ１７４ｃ遺伝子を制限酵素ＢａｍＨIとＨｉｎｄIIIで切断し、ライゲーションを行い、ＹＥｐ３５２の中にＹＫＬ１７４ｃ遺伝子が挿入されたものを選択して、ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子を含むプラスミドＹＥｐ３５２ＹＫＬ１７４ｃを得た。

得られたプラスミドＹＥｐ３５２ＹＫＬ１７４ｃを制限酵素ＰｓｔIで切断し、切断部位にプライマーＣ（配列番号４）及びプライマーＤ（配列番号５）により増幅される約１．２ＫｂのＴＲＰ１遺伝子断片を挿入し、ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子内部にＴＲＰ１遺伝子の組み込まれたプラスミドＹＥｐ３５２ＹＫＬ１７４ｃ：：ＴＲＰ１を得た。
できあがったプラスミドＹＥｐ３５２ＹＫＬ１７４ｃ：：ＴＲＰ１のうち、制限酵素ＢａｍＨIとＨｉｎｄIIIで切り出されるＹＫＬ１７４ｃ遺伝子内部にＴＲＰ１遺伝子の組み込まれた約４Ｋｂの遺伝子断片を遺伝子破壊用ＤＮＡとして調整した。この遺伝子破壊用ＤＮＡを親株（ＹＰＨ４９９株）に酢酸リチウム法を用いて形質転換し、トリプトファンを含まない培地で生育する株を得た。この株のＹＫＬ１７４ｃ遺伝子座で遺伝子組み換えが起こっていることはゲノムＰＣＲ解析で確認し、ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株とした。

（ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株の発酵性能試験）
ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株の発酵性能を親株の発酵性能と比較することにより解析した。

発酵性能試験は、フラスコレベルのスケールで行った。発酵試験を行うに当たり、まず、ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株および親株であるＹＰＨ４９９株について前培養を行い新鮮な培養液を準備した。前培養は、試験管中のＹＰＤ培地（５ｍｌ）に、同培地で２４時間培養した酵母細胞を植菌し、３０℃で一晩振とう培養して行った。

次いで、三角フラスコに上述した２４％合成培地（１００ｍｌ）に５４０nmにおける吸光度（A₅₄₀）が０．０５になるようにそれぞれ前培養液を接種し、３０℃で５日間振とう培養を行った。アルコール生産性の評価は、前記（２）に記載の方法により分析した。すなわち、培養中の経時的な炭酸ガス放出による重量の減少量の測定、ガスクロマトグラフィーによるアルコール生成量の測定、および、アンスロン法を用いた残糖量の測定により分析した（表１、図１参照、図中○は親株を、●ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株をそれぞれ示す）。

この結果、親株に対するＹＫＬ１７４ｃ破壊株のエタノール生成量、炭酸ガス発生量、それに伴う残糖量の減少に顕著な差異を確認できた。なお図２に、ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株と親株との炭酸ガス発生量を比較した写真を示しておく。以上、ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子を欠損させた酵母を用いることにより酒類用、工業用等のアルコール製造において、より短期間での多くのアルコールの取得と製造期間の短縮が可能となった。

ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株と親株との発酵速度を比較した結果を示す図。ＹＫＬ１７４ｃ遺伝子破壊株と親株との炭酸ガス発生量を比較した写真。

Claims

出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＹＫＬ１７４ｃ遺伝子を破壊することにより、生産するアルコール量および生産速度を増大させた変異酵母。
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＹＫＬ１７４ｃ遺伝子を破壊した変異酵母を使用することを特徴とするアルコールの製造方法。