JP2009034036A - 形質転換用酵母、形質転換方法及び物質生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ホモタリック性を有してなり、複数の選択マーカーを付与した形質転換用酵母に対して目的遺伝子を導入する工程と、上記形質転換用酵母における選択マーカーに従って、目的遺伝子が導入された株を選択する工程とを含み、上記形質転換用酵母におけるホモタリック性により上記目的遺伝子を多重に導入する。
【選択図】図1
Description
(1)ホモタリック性を有する酵母に複数の選択マーカーを導入した形質転換用酵母。
(2)上記酵母は胞子形成能を有することを特徴とする(1)記載の形質転換用酵母。
(3)上記胞子形成能は0.1%以上であることを特徴とする(2)記載の形質転換用酵母。
(4)上記選択マーカーは栄養要求性であることを特徴とする(1)記載の形質転換用酵母。
(5)上記選択マーカーはウラシル要求性、ヒスチジン要求性及びトリプトファン要求性からなる群から選ばれる2腫以上の栄養要求性であることを特徴とする(1)記載の形質転換用酵母。
(6)上記酵母はSaccharomyces cerevisiae OC-2株(NBRC2260)であることを特徴とする(1)記載の形質転換用酵母。
(7)上記(1)乃至(6)いずれか一項記載の形質転換用酵母に対して目的遺伝子を導入する工程と、上記形質転換用酵母における選択マーカーに従って、目的遺伝子が導入された株を選択する工程とを含み、上記形質転換用酵母におけるホモタリック性により上記目的遺伝子を多重に導入することを特徴とする形質転換方法。
(8)導入された選択マーカーの数に応じて、目的遺伝子を導入する上記工程及び目的遺伝子が導入された株を選択する上記工程を複数回行うことを特徴とする(7)記載の形質転換方法。
(10)上記(1)乃至(6)いずれか一項記載の形質転換用酵母に対して目的遺伝子を多重に導入してなる形質転換酵母を培養する工程を含む、物質生産方法。
(11)上記目的遺伝子はβ-グルコシダーゼ遺伝子であり、生産対象がオリゴ糖を基質としたエタノールであることを特徴とする(10)記載の物質生産方法。
(12)上記目的遺伝子は乳酸脱水素酵素遺伝子であり、生産対象が乳酸であることを特徴とする(10)記載の物質生産方法。
(13)上記目的遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子(PDC1)のプロモーターの制御下に発現するものであることを特徴とする(10)記載の物質生産方法。
(14)所定の栄養成分の合成に関連する栄養要求性関連遺伝子を欠失してなり、当該栄養成分要求性を付与されたホモタリック性を有する酵母に対して、上記所定の栄養成分とは異なる他の栄養成分の合成に関連する欠失対象栄養要求性関連遺伝子の上流領域、上記栄養要求性関連遺伝子及び当該欠失対象栄養要求性関連遺伝子の下流領域をこの順で配置したDNA断片を導入する工程と、上記栄養要求性を指標として上記DNA断片が導入された株を同定する工程と、上記工程で同定された株のなかから上記栄養要求性関連遺伝子が脱落して、再度、栄養要求性が付与された株を選抜する工程と、上記工程で選抜された株を胞子形成培地に接種して胞子形成を誘導する工程と、当該胞子形成培地から分離した子嚢を発芽培地で培養する工程と、を含むホモタリック性を有する酵母に対する選択マーカーの多重付与方法。
(15)上記栄養成分はアミノ酸又は塩基であり、上記栄養成分要求性関連遺伝子はアミノ酸合成関連遺伝子又は塩基合成関連遺伝子であることを特徴とする(14)記載モタリック性を有する酵母に対する選択マーカーの多重付与方法。
(16)上記栄養成分はトリプトファン、ヒスチジン又はウラシルであることを特徴とする(14)記載のホモタリック性を有する酵母に対する選択マーカーの多重付与方法。
本発明に係る形質転換用酵母は、ホモタリック性を有する酵母に複数の選択マーカーを導入したものである。ここで、形質転換用酵母とは、目的遺伝子を導入する対象となる酵母を意味しており、目的遺伝子が導入された形質転換酵母とは異なる意味である。
〔実施例1〕
本実施例では、Saccharomyces cerevisiae OC-2株にウラシル要求性を付与したSaccharomyces cerevisiae OC-2U株(Saitoら、Journal of Ferment. Bioeng.81:98-103 (1996))を宿主として、2つ目の選択マーカーとして更にヒスチジン要求性を付与した(図1(a)〜(d)参照)。
そこで、得られた4胞子をSDプレート、SDプレート+ウラシル(20mg/L)、SDプレート+ヒスチジン(20mg/L)、SDプレート+ウラシル+ヒスチジンの4種のプレートにてそれぞれ培養を行った。その結果、SD+ウラシル+ヒスチジンプレートでのみ生育する菌株を単離することに成功した。すなわち、ウラシル要求性に加えて、ヒスチジン要求性を付与されたSaccharomyces cerevisiae OC-2U株を作製することに成功した。本実施例で作製したウラシル要求性及びヒスチジン要求性を合わせもつホモタリックな酵母をSaccharomyces cerevisiae OC-2HU株と命名した。
本実施例では、Saccharomyces cerevisiae OC-2株に由来する菌株が物質生産における生産性に優れることを検証した。すなわち、異種遺伝子を形質転換により導入して高い物質生産性を目的とした場合、高発現プロモーターを活用する必要がある。プロモーターには、恒常性プロモーター、誘導性プロモーターがあるが、いずれのプロモーターを使用する場合でも高生産性を目的とする場合には、高糖濃度でのプロモーター発現量の高いものを選択する必要がある。そこで、YPH500株(実験室酵母)、OC-2T株(Saitoら、Journal of Ferment. Bioeng.81:98-103 (1996))について、酵母の遺伝子組換え技術において一般的に使用されるTDH1プロモーター、TDH3プロモーター及びPDC1プロモーターのプロモーター活性を、それぞれのプロモーターによって転写される遺伝子の発現量を比較することで検討した。
本実施例では、実施例1で作製したOC-2HU株の胞子形成率を確認した。なお胞子形成率が0.1%以上である場合には、後述の実施例で説明するように、マイクロマニュピレーターを用いて子嚢を分離する作業を行いやすいため好ましい。実施例1で作製したOC-2HU株をグルコース2%含有するYPDプレートにて画線し、30℃で1日培養した後、胞子形成培地であるShermanプレートに培養菌体を移し、25℃で3〜4日間培養し顕微鏡にて胞子形成を確認した。OC-2HU株の胞子形成率を表2に示した。なお、胞子形成率は以下の式に従って算出した。
胞子形成率=(胞子数)×100/(計測細胞数)
本実施例では、実施例1で作製したOC-2HU株を形質転換用酵母として用い、目的遺伝子として表層提示型BGL遺伝子を4コピー導入した。
先ず、実施例1で作製したOC-2HU株に、以下のようにして構築したアーミングBGL-DNAであるpIBG13(HIS3マーカー)を制限酵素NdeIで線状化したプラスミドにより、Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research社)により形質転換を行った。選択プレートはSD+Histidineプレートを用いた。形質転換により得られたコロニーを同じプレートを用いて分離し、擬陽性株を排除した。
5′-GATCTCCATGGCTGATGAACTGGCGTTCTCTCCTCCTTTC-3′(配列番号7)
5′-TGGCGCTCGAGCCTTGCACCTTCGGGAGCGCCGCGTGAAG-3′(配列番号8)
増幅したBGL1断片は、NcoI/XhoIで処理した。また、pIHCSをNcoI/XhoIで処理し、NcoI/XhoI処理後のBGL1断片とライゲーションすることによってpIBG13を構築した。
上記(1)で作製したOC-2ABGL2を用いて、以下のようにして構築したpRS406BGL1 (URA3マーカー)を制限酵素NdeIで線状化したプラスミドにより、Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research社)により形質転換を行った。選択プレートはSDプレートを用いた。形質転換により得られたコロニーを同じプレートに分離し、擬陽性株を排除した。
次に、上記(1)で作製したOC-2ABGL2及び上記(2)で作製したOC-2ABGL4における、BGL遺伝子産物であるβ-グルコシダーゼ活性を評価した。具体的には、β-グルコシダーゼがPNPGを基質としてp-nitrophenolとD-glucoseを生成するので、p-nitrophenol量を測定(PNPG活性)して評価した。なお、下記の条件で1分間に1マイクロモルのp-nitrophenolを生成する酵素量を1Uと定義した。
・0.1M 酢酸緩衝液 pH5.0(25℃)
・20mM PNPG水溶液(603mgのPNPGを100mlの蒸留水に溶解)
・0.2M Na2CO3溶液(21.2gの無水炭酸ナトリウムを蒸留水に溶解)
本実施例では、実施例3で作製したOC-2ABGL2及びOC-2ABGL4におけるエタノール生成能を評価した。先ず、YPD培地でOD660=20となるよう培養組成を調整し、セロビオース5%、イーストエキス1%及びペプトン2%添加した培地に実施例3(1)で作製したOC-2ABGL2若しくは実施例3(2)で作製したOC-2ABGL4を接種し、30℃、60rpmの条件でしんとう培養を行った。
Claims (16)
- ホモタリック性を有する酵母に複数の選択マーカーを導入した形質転換用酵母。
- 上記酵母は胞子形成能を有することを特徴とする請求項1記載の形質転換用酵母。
- 上記胞子形成能は0.1%以上であることを特徴とする請求項2記載の形質転換用酵母。
- 上記選択マーカーは栄養要求性であることを特徴とする請求項1記載の形質転換用酵母。
- 上記選択マーカーはウラシル要求性、ヒスチジン要求性及びトリプトファン要求性からなる群から選ばれる2種以上の栄養要求性であることを特徴とする請求項1記載の形質転換用酵母。
- 上記酵母はSaccharomyces cerevisiae OC-2株(NBRC2260)であることを特徴とする請求項1記載の形質転換用酵母。
- 請求項1乃至6いずれか一項記載の形質転換用酵母に対して目的遺伝子を導入する工程と、
上記形質転換用酵母における選択マーカーに従って、目的遺伝子が導入された株を選択する工程とを含み、
上記形質転換用酵母におけるホモタリック性により上記目的遺伝子を多重に導入することを特徴とする形質転換方法。 - 導入された選択マーカーの数に応じて、目的遺伝子を導入する上記工程及び目的遺伝子が導入された株を選択する上記工程を複数回行うことを特徴とする請求項7記載の形質転換方法。
- 目的遺伝子が導入された株を選択した後、胞子形成培地において胞子形成を誘導する工程と、
当該胞子形成培地から分離した子嚢を発芽培地で培養する工程とを更に含むことを特徴とする請求項7記載の形質転換方法。 - 請求項1乃至6いずれか一項記載の形質転換用酵母に対して目的遺伝子を多重に導入してなる形質転換酵母を培養する工程を含む、物質生産方法。
- 上記目的遺伝子はβ-グルコシダーゼ遺伝子であり、生産対象がオリゴ糖を基質としたエタノールであることを特徴とする請求項10記載の物質生産方法。
- 上記目的遺伝子は乳酸脱水素酵素遺伝子であり、生産対象が乳酸であることを特徴とする請求項10記載の物質生産方法。
- 上記目的遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子(PDC1)のプロモーターの制御下に発現するものであることを特徴とする請求項10記載の物質生産方法。
- 所定の栄養成分の合成に関連する栄養要求性関連遺伝子を欠失してなり、当該栄養成分要求性を付与されたホモタリック性を有する酵母に対して、
上記所定の栄養成分とは異なる他の栄養成分の合成に関連する欠失対象栄養要求性関連遺伝子の上流領域、上記栄養要求性関連遺伝子及び当該欠失対象栄養要求性関連遺伝子の下流領域をこの順で配置したDNA断片を導入する工程と、
上記栄養要求性を指標として上記DNA断片が導入された株を同定する工程と、
上記工程で同定された株のなかから上記栄養要求性関連遺伝子が脱落して、再度、栄養要求性が付与された株を選抜する工程と、
上記工程で選抜された株を胞子形成培地に接種して胞子形成を誘導する工程と、
当該胞子形成培地から分離した子嚢を発芽培地で培養する工程と、を含むホモタリック性を有する酵母に対する選択マーカーの多重付与方法。 - 上記栄養成分はアミノ酸又は塩基であり、上記栄養成分要求性関連遺伝子はアミノ酸合成関連遺伝子又は塩基合成関連遺伝子であることを特徴とする請求項14記載のホモタリック性を有する酵母に対する選択マーカーの多重付与方法。
- 上記栄養成分はトリプトファン、ヒスチジン又はウラシルであることを特徴とする請求項14記載のホモタリック性を有する酵母に対する選択マーカーの多重付与方法。
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