CN110551643A - 通过调控脯氨酸代谢途径构建的低产高级醇酿酒酵母菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种低产高级醇的酿酒酵母菌株。本发明为了解决酿酒酵母在啤酒生产中合成过多高级醇的问题，通过调控酿酒酵母脯氨酸代谢途径，构建一种低产高级醇的酿酒酵母菌株，能够在保持良好发酵性能的前提下，达到了低产高级醇的效果，为酿造风味良好、口感独特的小麦啤酒奠定了理论基础。
Description
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种低产高级醇的酿酒酵母菌株。
背景技术：
在啤酒酿造过程中，酵母除产生主要代谢产物乙醇外，还产生高级醇类、酯类、醛类、酚类、酸类、连二酮类等风味代谢产物。其中，高级醇，俗称杂醇油，是指具有3个及3个以上碳链骨架的一类醇的统称，是形成啤酒风味和口感的重要的化学物质之一。啤酒中的高级醇类物质主要有正丙醇、正丁醇、2-甲基-1-丙醇(异丁醇)、3-甲基-1-丁醇(异戊醇)、2-甲基-1-丁醇(活性戊醇)、2-苯乙醇、色醇、对羟基苯乙醇(酪醇)等。高级醇类物质及其与乙酸反应生成的代谢衍生物，主要有乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯等，以及乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等。酯类物质的含量和比值(醇酯比，高级醇与酯类含量之比)对啤酒的风味具有极其重要的影响和贡献。
适宜的高级醇含量具有使啤酒口感和香气丰满，酒体柔和协调的作用，但高级醇含量过高，会导致啤酒形成异杂味，不仅影响啤酒的饮用口感和风味质量，而且饮用后还会产生口渴、头痛等症状，对饮用者的身体产生明显的副作用，不利于饮用者的身体健康。有研究报道，高级醇能够抑制神经中枢，对交感神经和视觉神经等产生伤害，其麻醉作用要强于乙醇，其中，丙醇的毒性是乙醇的8.5倍，异丁醇为乙醇的8倍，异戊醇是乙醇的19倍；同时高级醇在人体内分解氧化速度慢，代谢停留时间长，这些因素导致了饮用高级醇含量过高的啤酒会引起饮用者口渴、头痛等症状，这也是导致饮用啤酒醉酒较慢、醉酒后较难醒酒的主要原因。目前对于啤酒中高级醇类物质的含量要求还没有形成统一的国际标准，但大量的实验研究和调查表明，12°P下面发酵Lager啤酒中高级醇的适宜含量应小于100mg/L，优质的Lager 啤酒高级醇含量一般低于50mg/L，对于酒精度数低、口感较淡的啤酒，高级醇含量也更低些；以小麦为主要原料采用上面发酵工艺生产的Ale啤酒，由于原料中较高的蛋白质含量和较高的发酵温度(主发酵温度16-20℃)，其高级醇的含量一般高到300mg/L左右甚至更高。近年来，采用高麦芽汁浓度、高辅料比发酵酿造的Lager啤酒，高级醇类物质含量常常超过 100mg/L，有些高达200mg/L以上，饮后易造成头痛、口渴等症状，对人体伤害极大。
成品啤酒中80％左右的高级醇是在啤酒主发酵阶段由酵母的生长和繁殖活动所产生的。酿酒酵母吸收麦芽汁中游离的氨基酸，并利用氨基酸中的氨基合成自身生长繁殖所需的蛋白质。当氨基酸中的氨基被利用后，剩下的α-酮酸经过一系列的非可逆性反应最后生成一种代谢副产物，即为高级醇。这一代谢途径最初是由德国化学家费利克斯·埃尔利希(Felix Ehrlish) 于1904年提出的，因此也被成为埃尔利希途径(Ehrlish pathway)，即分解代谢途径，适用埃尔利希途径(Ehrlish pathway)的氨基酸包括：苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。此后，哈里斯研究糖代谢时发现，葡萄糖经EMP途径生成的代谢产物丙酮酸，经系列反应后可以生成α-酮酸，因此在1953年提出了高级醇的合成代谢途径，也被称为哈里斯途径(Harris pathway)。综上所述，酿酒酵母合成高级醇的代谢途径主要有两条：一条是α-酮酸分解代谢途径，即氨基酸分解代谢途径；另一条为α-酮酸合成代谢途径，即高级醇合成代谢途径。
针对啤酒中高级醇含量高的问题，科研工作者已采取多种措施来解决此问题。王国正等利用常温常压等离子体诱变技术得到一株高级醇生成量比亲本菌株降低了20％的酿酒酵母菌株；蔡洋等对经过航空诱变的上面发酵酵303进行分离筛选得到1株性能优良的低产高级醇的上面发酵啤酒酵母；朱莉娜等利用微波诱变技术获得了7株遗传性状稳定的低产高级醇的啤酒酵母；袁仲等将低能氮离子注入和超高压处理技术结合，获得一株高级醇合成量适宜的优质全小麦酿酒酵母。
近年来，有许多关于酿酒酵母高级醇代谢基因改造的研究报道。Park等以亮氨酸营养缺陷型LEU2基因缺失突变株为出发菌株，在敲除ALD6、BAT1基因的基础上过表达基因ILV2、 ILV3、ILV5、ARO10、ADH2、LEU2、LEU3、LEU4，构建的突变株异戊醇的生成量较出发菌株提高了34倍。Eden等发现，编码氨基转移酶的BAT2基因缺失突变株对异丁醇和异戊醇生成量有较大的影响。Chen等研究发现通过同时过表达酿酒酵母缬氨酸代谢途径中的ILV2、ILV3、 ILV5、BAT2基因可以提高异丁醇的生产量，而在此突变株的基础上过表达ILV6基因反而会降低异丁醇的生成量。张翠英等构建的BAT2部分缺失、ATF1过表达的酿酒酵母突变株，其高级醇的生成量分别比出发菌株降低了51％。所有这些大多是围绕下面发酵酵母进行的，而针对小麦啤酒所用的上面发酵酵母高级醇代谢相关基因的改造与育种却鲜有报道。
发明内容：
本发明的目的是解决酿酒酵母在啤酒生产中合成过多高级醇的问题，通过调控酿酒酵母的脯氨酸代谢途径，构建一种低产高级醇的酿酒酵母菌株。
本发明所提供的技术方案之一，是一株低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌，是通过在酿酒酵母宿主细胞中敲除脯氨酸脱氢酶基因所得；
进一步地，所述敲除为单敲除或双敲除；
进一步地，所述脯氨酸脱氢酶基因为PUT1，其Gene ID为：850833，核苷酸序列如序列表中SEQ NO:1所示；
进一步地，所述脯氨酸脱氢酶基因为PUT4，其Gene ID为：854530，核苷酸序列如序列表中SEQ NO:2所示；
优选地；所述宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17，编号CICC1929；
更优选地，所述基因工程菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17-DΔput1-k-p，是双敲除酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17宿主中的脯氨酸脱氢酶基因put1所得；
更优选地，所述基因工程菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17-DΔput4-k-p，是双敲除酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17宿主中的脯氨酸脱氢酶基因put4所得。
本发明还提供上述低产高级醇的酵母菌株的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)敲除脯氨酸脱氢酶基因基因的低产高级醇的酵母菌株的构建
1)以酿酒酵母基因组为模板，用引物分别PCR得到脯氨酸脱氢酶基因的上同源臂和下同源臂；以pUG6质粒为模板，用引物PCR得到KanMX表达盒；
2)将整合片段脯氨酸脱氢酶基因的上同源臂和下同源臂及KanMX表达盒，利用醋酸锂转化到酿酒酵母中，利用酵母体内同源重组的原理，筛选得到单敲除重组菌株；
(2)KanMX筛选标记的去除及pSH-Zeocin质粒的丢弃；
(3)当构建双敲除菌株时，设计新的脯氨酸脱氢酶基因的上同源臂和下同源臂引物，并重复步骤(1)、(2)。
本发明还提供上述基因工程菌在酿酒中的应用。
采用上述基因工程菌酿制啤酒的方法如下：按照10％w/v的接种量接种于12°P麦汁中， 250mL广口三角瓶装液量为150mL，带孔橡胶塞封口。发酵温度为20℃，静置发酵，每隔 12h称重一次，当12h的失重量小于0.1g时，发酵即可结束。
发酵结束后S17-DΔput1-k-p和S17-DΔput4-k-p高级醇生成的总量明显降低，较S17分别下降了19.9％和22.3％。
有益效果：
1、本发明提供的酿酒酵母S17-DΔput1-k-p和S17-DΔput4-k-p能够在保持良好发酵性能的前提下，达到了低产高级醇的效果，为酿造风味良好、口感独特的小麦啤酒奠定了理论基础。
2、本发明选育得到的酿酒酵母S17-DΔput1-k-p和S17-DΔput4-k-p高级醇生成的总量明显降低：亲本菌S17高级醇生成的总量为296.01mg/L，而重组酿酒酵母S17-DΔput1-k-p和 S17-DΔput4-k-p高级醇生成的总量分别为246.98mg/L、241.94mg/L，较S17下降了19.9％和 22.3％。
附图说明：
图1单敲除put1上下同源臂及KanMX表达盒验证
其中，M：DL5000 DNA marker；1：上游同源臂(670bp单一条带)；2：下游同源臂(528bp单一条带)；3：KanMX表达盒(1663bp单一条带)；
图2单敲除S17-Δput1验证图
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以S17-Δput1基因组为模板上游验证条带(1406bp 单一片段)；2：以S17-Δput1基因组为模板下游验证条带(1007bp单一片段)；3：以S17的基因组为模板，上游验证结果；4：以S17基因组为模板，下游验证结果。
图3剔除KanMX抗性基因重组菌株的验证
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以重组菌株S17-Δput1的基因组为模板，K-F与K-R 为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2：以S17-Δput1-k基因组为模板，K-F与 K-R为引物对PCR扩增得到的结果。
图4丢弃pSH-Zeocin质粒重组菌株的验证
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以pSH-Zeocin质粒为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2：以S17-Δput1-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果；
图5双敲除put1上下同源臂及KanMX表达盒
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以酿酒酵母S17基因组为模板，DP1A-F和DP1A-R为引物对PCR扩增的结果(415bp单一条带)；2：以酿酒酵母S17基因组为模板，DP1B-F 和DP1B-R为引物对PCR扩增的结果(378bp单一条带)；3：以质粒pUC6基因组为模板， DP1K-F和DP1K-R为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)。
图6双敲除put1验证图
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以重组菌株S17-DΔput1的基因组为模板，DP1-1-F 与DP1-1-R为引物对PCR扩增得到的片段(1014bp单一片段)；2：以S17-Δput1-k的基因组为模板，DP1-1-F与DP1-1-R为引物对PCR扩增得到的结果；3：以重组菌株S17-DΔput1的基因组为模板，DP1-2-F与DP1-2-R为引物对PCR扩增得到的片段(1788bp单一片段)；4：以S17-Δput1-k基因组为模板，DP1-2-F与DP1-2-R为引物对PCR扩增得到的结果；
图7剔除KanMX抗性基因重组菌株的验证
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以重组菌株S17-DΔput1的基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2：以S17-DΔput1-k基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的结果。
图8丢弃pSH-Zeocin质粒重组菌株的验证
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以pSH-Zeocin质粒为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2：以S17-DΔput1-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果。
图9单敲除put4上下同源臂及KanMX表达盒验证
其中，M：DL5000 DNA marker；1：上游同源臂(689bp单一条带)；2：下游同源臂(430bp 单一条带)；3：KanMX表达盒(1663bp单一条带)；
图10单敲除put4验证图
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以S17-Δput4基因组为模板上游验证条带(851bp单一片段)；2：以S17-Δput4基因组为模板下游验证条带(955bp单一片段)；3：以S17的基因组为模板，上游验证结果；4：以S17基因组为模板，下游验证结果。
图11剔除KanMX抗性基因重组菌株的验证
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以重组菌株S17-Δput4的基因组为模板，K-F与K-R 为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2：以S17-Δput4-k基因组为模板，K-F与 K-R为引物对PCR扩增得到的结果。
图12丢弃pSH-Zeocin质粒重组菌株的验证
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以pSH-Zeocin质粒为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2：以S17-Δput4-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果；
图13双敲除put4上下同源臂及KanMX表达盒
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以酿酒酵母S17基因组为模板，DP4A-F和DP4A-R为引物对PCR扩增的结果(493bp单一条带)；2：以酿酒酵母S17基因组为模板，DP4B-F 和DP4B-R为引物对PCR扩增的结果(465bp单一条带)；3：以质粒pUC6基因组为模板， DP4K-F和DP4K-R为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)。
图14双敲除put4验证图
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以重组菌株S17-DΔput4的基因组为模板，DP4-1-F 与DP4-1-R为引物对PCR扩增得到的片段(1506bp单一片段)；2：以S17-Δput4-k的基因组为模板，DP4-1-F与DP4-1-R为引物对PCR扩增得到的结果；3：以重组菌株S17-DΔput4的基因组为模板，DP4-2-F与DP4-2-R为引物对PCR扩增得到的片段(1466bp单一片段)；4：以S17-Δput4-k基因组为模板，DP4-2-F与DP4-2-R为引物对PCR扩增得到的结果；
图15剔除KanMX抗性基因重组菌株的验证
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以重组菌株S17-DΔput4的基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2：以S17-DΔput4-k基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的结果。
图16丢弃pSH-Zeocin质粒重组菌株的验证
其中，M：DL5000 DNA marker；1：以pSH-Zeocin质粒为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2：以S17-DΔput4-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果。
图17啤酒发酵实验中的高级醇测定。
图18小麦啤酒发酵工艺路线图。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所使用的酿酒酵母是可以采用任何来源的酿酒酵母菌株，以下实施例仅以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17，编号CICC1929为例作进一步的解释说明。
表1本实例的重组菌株
表2本实例所用引物
实施例1：双敲除PUT1基因的酿酒酵母菌株的构建
重组菌株主要构建过程如下：
1)敲除PUT1一个等位基因所需片段的扩增
以酿酒酵母S17基因组为模板，P1A-F和P1A-R为引物对PCR扩增出PUT1基因敲除所需的上游同源序列片段，长度为670bp；以酿酒酵母S17基因组为模板，P1B-F和P1B-R为引物对PCR扩增出下游同源序列片段，长度为528bp；以质粒pUC6基因组为模板，P1K-F 和P1K-R为引物对PCR扩增出PUT1基因敲除所需的loxP-KanMX3-loxP片段，长度为1663 bp，如图1。
2)敲除PUT1一个等位基因的重组酵母菌株的构建
将扩增得到的三个片段进行PCR纯化回收后，用醋酸锂转化法将其转化到啤酒酵母菌株 (S17)中，挑取G418抗性平板上生长较好的转化子，进行初筛。
3)敲除PUT1一个等位基因的重组酵母菌株的验证
根据啤酒酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：P1-1-F，P1-1-R，P1-2-F，P1-2-R，以生长较好转化子基因组为模板，PCR验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到1406bp条带，下游验证得到1007bp条带(验证图见图2)，说明三个片段已成功整合到啤酒酵母菌株S17中，即S17中PUT1的一个等位基因被成功敲除，命名为S17-Δput1。
4)重组菌株S17-Δput1中KanMX抗性基因的剔除
将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到步骤3)得到的重组菌株中，涂布于含100μg/mL 的Zeocin抗性YEPD平板上，30℃避光培养36h。挑取长势较好个头较大的菌落，接种于YEPD液体培养基中，用酵母质粒提取试剂盒提取质粒后，PCR验证pSH-Zeocin是否导入成功。将已成功导入pSH-Zeocin质粒的重组菌株接入到半乳糖诱导液态培养基中培养4-5h，然后稀释涂布在普通YEPD平板上。挑出单菌落点接于不含抗性的YEPD平板上，再影印到含有G418抗性的YEPD培养基上。在YEPD上生长而在含有G418的平板上不生长即为所得到的菌株。提取酵母基因组，并利用引物K-F和K-R通过PCR验证KanMX抗性基因无条带 (验证图见图3)。说明S17-Δput1菌株剔除KanMX抗性基因成功。命名为S17-Δput1-k。
5)重组菌株S17-Δput1-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃
将已剔除KanMX抗性基因的重组菌株S17-Δput1-k接种于装有新鲜YEPD液体培养基的试管中，每12h转接一次，转接次数一般为7～9次。提取转接培养后的酵母基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F和Zn-R为引物，对重组菌株进行PCR验证(验证图见图4)，与未传代转化子对照，通过PCR验证筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-Δput1-k-p。
6)敲除PUT1两个等位基因所需片段的扩增
以酿酒酵母S17基因组为模板，DP1A-F和DP1A-R为引物对PCR扩增出PUT1基因敲除所需的上游同源序列片段，长度为415bp；以酿酒酵母S17基因组为模板，DP1B-F和 DP1B-R为引物对PCR扩增出下游同源序列片段，长度为378bp；以质粒pUC6基因组为模板，DP1K-F和DP1K-R为引物对PCR扩增出PUT1基因敲除所需的loxP-KanMX3-loxP片段，长度为1663bp，见图5。
7)敲除PUT1两个等位基因的重组酵母菌株的构建
通过醋酸锂化学转化法，将PUT1基因第二个等位敲除所需的上游同源序列片段、下游同源序列片段和loxP-KanMX3-loxP片段转化重组菌株S17-Δput1-k-p中。挑取G418抗性平板上生长较好的转化子，进行初筛。
8)敲除PUT1两个等位基因的重组酵母菌株的验证
根据酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：DP1-1-F，DP1-1-R，DP1-2-F，DP1-2-R，以生长较好转化子基因组为模板，PCR验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到1014bp条带，下游验证得到1788bp条带(见图6)，说明三个片段已成功整合到重组菌株S17-Δput1-k-p中，且整合位置正确。即出发菌株S17中PUT1的两个等位基因被成功敲除，命名为S17-DΔput1。
9)重组菌株S17-DΔput1中KanMX抗性基因的剔除
利用Cre/loxP报告基因系统，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到含有KanMX抗性基因的酿酒酵母菌株阳性转化子S17-DΔput1中，按照步骤4)中方法，以K-F和K-R为引物，通过PCR验证筛选获得剔除KanMX抗性标记的转化子(见图7)，命名为S17-DΔput1-k。
10)重组菌株S17-DΔput1-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃
通过多次转接传代培养丢失游离的pSH-Zeocin质粒。提取经多次转接传代后的重组菌株 S17-DΔput1-k的基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F和Zn-R为引物，通过 PCR验证(见图8)，筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-DΔput1-k-p。重组酿酒酵母菌株见表1。构建重组酿酒酵母菌株所用引物见表2。
实施例2：双敲除PUT4基因的酿酒酵母菌株的构建
重组菌株主要构建过程如下：
1)敲除PUT4一个等位基因所需片段的扩增
以酿酒酵母S17基因组为模板，P4A-F和P4A-R为引物对PCR扩增出PUT4基因敲除所需的上游同源序列片段，长度为689bp；以酿酒酵母S17基因组为模板，P4B-F和P4B-R为引物对PCR扩增出下游同源序列片段，长度为430bp；以质粒pUC6基因组为模板，P4K-F 和P4K-R为引物对PCR扩增出PUT4基因敲除所需的loxP-KanMX3-loxP片段，长度为1663 bp(图9)。
2)敲除PUT4一个等位基因的重组酵母菌株的构建
将扩增得到的三个片段进行PCR纯化回收后，用醋酸锂转化法将其转化到啤酒酵母菌株 (S17)中，挑取G418抗性平板上生长较好的转化子，进行初筛。
3)敲除PUT4一个等位基因的重组酵母菌株的验证
根据啤酒酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：P4-1-F，P4-1-R，P4-2-F，P4-2-R，以生长较好转化子基因组为模板，PCR验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到851bp条带，下游验证得到955bp条带(图10)，说明三个片段已成功整合到啤酒酵母菌株S17中，即S17中PUT4的一个等位基因被成功敲除，命名为S17-Δput4。
4)重组菌株S17-Δput4中KanMX抗性基因的剔除
将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到步骤3)得到的重组菌株中，涂布于含100μg/mL 的Zeocin抗性YEPD平板上，30℃避光培养36h。挑取长势较好个头较大的菌落，接种于YEPD液体培养基中，用酵母质粒提取试剂盒提取质粒后，PCR验证pSH-Zeocin是否导入成功。将已成功导入pSH-Zeocin质粒的重组菌株接入到半乳糖诱导液态培养基中培养4-5h，然后稀释涂布在普通YEPD平板上。挑出单菌落点接于不含抗性的YEPD平板上，再影印到含有G418抗性的YEPD培养基上。在YEPD上生长而在含有G418的平板上不生长即为所得到的菌株。提取酵母基因组，并利用引物K-F和K-R通过PCR验证KanMX抗性基因无条带 (图11)。说明S17-Δput4菌株剔除KanMX抗性基因成功。命名为S17-Δput4-k。
5)重组菌株S17-Δput4-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃
将已剔除KanMX抗性基因的重组菌株S17-Δput1-k接种于装有新鲜YEPD液体培养基的试管中，每12h转接一次，转接次数一般为7～9次。提取转接培养后的酵母基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F和Zn-R为引物，对重组菌株进行PCR验证(图12)，与未传代转化子对照，通过PCR验证筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-Δput4-k-p。
6)敲除PUT4两个等位基因所需片段的扩增
以酿酒酵母S17基因组为模板，DP4A-F和DP4A-R为引物对PCR扩增出PUT4基因敲除所需的上游同源序列片段，长度为493bp；以酿酒酵母S17基因组为模板，DP4B-F和 DP4B-R为引物对PCR扩增出下游同源序列片段，长度为465bp；以质粒pUC6基因组为模板，DP4K-F和DP4K-R为引物对PCR扩增出PUT4基因敲除所需的loxP-KanMX3-loxP片段，长度为1663bp(图13)。
7)敲除PUT4两个等位基因的重组酵母菌株的构建
通过醋酸锂化学转化法，将PUT4基因第二个等位敲除所需的上游同源序列片段、下游同源序列片段和loxP-KanMX3-loxP片段转化重组菌株S17-Δput4-k-p中。挑取G418抗性平板上生长较好的转化子，进行初筛。
8)敲除PUT4两个等位基因的重组酵母菌株的验证
根据酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：DP4-1-F，DP4-1-R，DP4-2-F，DP4-2-R，以生长较好转化子基因组为模板，PCR验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到1506bp条带，下游验证得到1466bp条带(图14)，说明三个片段已成功整合到重组菌株S17-Δput4-k-p中，且整合位置正确。即出发菌株S17中PUT4的两个等位基因被成功敲除，命名为S17-DΔput4。
9)重组菌株S17-DΔput4中KanMX抗性基因的剔除
利用Cre/loxP报告基因系统，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到含有KanMX抗性基因的酿酒酵母菌株阳性转化子S17-DΔput4中，按照步骤4)中方法，以K-F和K-R为引物，通过PCR验证筛选获得剔除KanMX抗性标记的转化子(图15)，命名为S17-DΔput4-k。
10)重组菌株S17-DΔput4-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃
通过多次转接传代培养丢失游离的pSH-Zeocin质粒。提取经多次转接传代后的重组菌株 S17-DΔput4-k的基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F和Zn-R为引物，通过 PCR验证(图16)，筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-DΔput4-k-p。重组酿酒酵母菌株见表1。构建重组酿酒酵母菌株所用引物见表2。
实施例3：低产高级醇的重组菌株S17-DΔput1-k-p、S17-DΔput4-k-p的小麦啤酒发酵实验
1)小麦啤酒发酵工艺路线如图18所示；
2)糖化工艺：称取粉碎后的小麦麦芽以料水比1:4的比例加入30℃的温水，充分搅拌均匀后，放置于恒温水浴锅中，30℃保持30min，以2.0℃/min升温至65℃，保持90min，迅速升温至78℃，保持10min。糖化过程中每隔5min充分搅拌一次。糖化后的小麦麦芽汁趁热过滤，并用75℃的热水洗糟3次。将过滤液放置于电磁炉上蒸煮，沸腾后40min加入3‰的苦味酒花(以麦芽重量计)，煮沸时间为70min。煮沸后自然冷却至室温，4000r/min离心 5min，离心后的麦汁调整糖度为12°P，115℃灭菌20min备用(12°P麦芽汁培养基)。
3)菌种的活化：酵母菌种转接至YEPD固体培养基斜面，于30℃培养48h。
4)一级种子培养：取活化菌种一环，接种于装液量为50mL浓度为12°P麦芽汁培养基的250mL广口三角瓶中，八层纱布封口，24℃培养36h。
按上述发酵工艺对酿酒酵母出发菌株S17和本发明构建的重组菌株小麦啤酒发酵实验，按照10％w/v的接种量接种于12°P麦芽汁培养基中，250mL广口三角瓶装液量为150mL，带孔橡胶塞封口。发酵温度为20℃，静置发酵，每隔12h称重一次，当12h的失重量小于 0.1g时，发酵即可结束。
发酵结束后计算发酵时间、二氧化碳累计排放量，并测定酒精度、发酵度、发酵液中还原糖含量、糖的种类及浓度、高级醇和酯的含量等指标，结果见表3和图17(注：所示数据为三个平行试验结果的平均值)。
表3表明：小麦啤酒发酵实验时，本发明所获得的酿酒酵母菌株与初始的原菌相比，发酵性能没有太大变化。
表3重组菌株和亲本菌株基本发酵性能的比较
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值
图17表明：小麦啤酒发酵实验时，本发明所获得的重组酿酒酵母菌株S17-DΔput1-k-p 和S17-DΔput4-k-p与初始的原菌S17相比，异丁醇、异戊醇、活性戊醇、苯乙醇的含量均有显著地的下降并且高级醇生成的总量明显降低：亲本菌高级醇生成的总量为296.01mg/L，而重组酿酒酵母S17-DΔput1-k-p和S17-DΔput4-k-p高级醇生成的总量分别为246.98mg/L、 241.94mg/L，同比下降了19.9％和22.3％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 通过调控脯氨酸代谢途径构建的低产高级醇酿酒酵母菌株
<130> 1
<141> 2019-07-19
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1431
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS17)
<400> 1
atgatagctt ccaaaagctc cttattagtt actaaatcgc gcataccctc tctatgcttt 60
cctttgataa agaggtccta tgtgtcaaag actccgacac actctaacac ggctgctaat 120
ctgatggttg aaactccggc cgccaatgcc aacggcaata gtgtgatggc acctcctaac 180
tcaatcaatt ttctacagac acttcccaag aaggaactat tccaactggg attcatcggt 240
attgcgacct tgaacagctt cttcctgaac acgatcatta agttgttccc ttacatcccc 300
atcccagtaa taaaattctt cgtctcttct ttatactgtg gcggtgagaa ctttaaagag 360
gtcatcgaat gcggcaaacg tctgcagaag agaggtatat cgaacatgat gctttcatta 420
actattgaaa attccgaagg tacaaagagt ttgtccagta ctccagtaga ccaaattgtc 480
aaggaaacaa tcagctctgt ccacaacatc ctactgccca atattattgg ccagctggaa 540
tctaagccaa tcaatgacat tgctccaggt tatatcgctc taaaaccctc tgctttggtc 600
gataaccctc acgaggttct gtacaatttc agtaatcccg cctacaaggc tcaaagggat 660
cagctgatcg agaactgctc taagattaca aaagagattt ttgaactaaa tcaatctttg 720
ttaaagaagt accctgaaag aaaggcccca tttatggttt ccactattga cgctgagaag 780
tatgatttgc aggagaatgg tgtttacgaa ttacagagaa tcttatttca aaaattcaat 840
cccacttcat ctaaactgat atcatgtgtc ggtacttggc agttgtacct aagggactct 900
ggtgaccata ttttgcacga attgaagctg gcccaagaaa acggctataa gcttgggctg 960
aaactggttc gtggtgctta tattcattct gaaaaaaacc gtaaccaaat tatctttggc 1020
gataaaacgg gcactgacga aaattacgat cgtatcatca ctcaagttgt caatgattta 1080
atcatcaatg gcgaggattc ttattttggt cacttggttg tcgcctctca taattaccaa 1140
tcccaaatgc tcgttactaa tttgctaaaa tctacccaag acaactctta tgccaaatcg 1200
aacattgtgt tggggcaatt actaggtatg gcagataatg ttacctatga cctaattacc 1260
aaccatggcg ctaaaaacat aatcaagtat gtcccatggg gcccaccatt ggaaactaaa 1320
gattatcttt tgagaagatt gcaagaaaac ggggatgctg tgagatctga taatggctgg 1380
ccattaatca aggccatagc aaagtcgatt ccaaaaagag taggcctatg a 1431
<210> 2
<211> 1884
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS17)
<400> 2
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gcggacgatg ttagcggcga cggtagcggc ggcgacacca agaaggagga ggatgttgtc 120
caggtaacgg aatcaccatc gtccgggtcg cgcaataatc atcgcagcga caatgaaaaa 180
gatgacgcca tccgtatgga gaaaatatct aagaaccagt ccgcgtcgtc caacggcacc 240
atccgcgagg atttgattat ggacgtggac ttggagaaat cgccctccgt cgatggcgat 300
agcgagccgc acaaactaaa acaaggtttg cagtcgcgcc atgtgcaact gatcgcgctg 360
ggcggcgcca tcggtaccgg tttgctggtg gggacttcat ccacgcttca tacgtgcggt 420
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aagatattat gcattgtggg actgatcatt ctgtccttta ttttgttttg gggtggtggc 840
cccaaccatg accgtcttgg cttcagatac tggcaacatc cgggcgcttt tgcgcatcac 900
ctcacgggcg gatcgctggg taacttcaca gatatctaca ctgggattat caagggcgcc 960
ttcgccttca ttcttggtcc ggaactggtg tgcatgactt ccgcggaatg cgcggaccag 1020
cgtagaaata tcgctaaggc ttcgcgccgc tttgtatgga gactgatctt cttctacgtt 1080
ctggggacgc tggccatctc cgttattgtt ccatacaatg acccaacatt ggtaaatgcg 1140
ctggcgcagg gcaaaccggg agccggctcg tcaccctttg tgatcggaat tcaaaacgcc 1200
gggattaagg ttcttcccca cattatcaat gggtgtatct tgaccagcgc gtggtctgcc 1260
gccaatgcgt ttatgtttgc gagcacgaga tcactgttga ccatggcgca aacgggacag 1320
gcacccaaat gtttgggcag aatcaacaaa tggggtgttc catacgtggc tgtgggtgtt 1380
tccttcttgt gttcttgttt ggcatatctg aacgtgtctt catccacggc agacgtgttt 1440
aattggtttt ccaatatcag caccatttcc gggtttctgg gctggatgtg cggctgcatc 1500
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aagacgtggg gacagcctta caccgtgtgg ttctctctca ttgttatagg catcatcacc 1620
attaccaacg ggtatgccat tttcatccct aagtactgga gagtagcaga tttcattgct 1680
gcctacatca ccctacccat cttcctggtt ttgtggttcg gccataagct gtatactcgg 1740
acgtggagac aatggtggct ccctgtgtcc gagatcgatg ttactacagg gttagtcgag 1800
atcgaggaga aatcaagaga aattgaggag atgagattac cccccaccgg tttcaaagac 1860
aagttcttgg acgccttgtt gtaa 1884
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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cacccttctg ccttctta 18
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> 人工序列()
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actctgccta tcgccaagca taggccacta gtggatctga ta 42
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<210> 21
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cctgcagcgt acgaagcttc agctgtgggc agaatcaaca aat 43
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atttgttgat tctgcccaca gctgaagctt cgtacgctgc agg 43
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tatcagatcc actagtggcc tatgcggtga ttccgttacc tgg 43
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 46
tctcggtagt atggtgtct 19
Claims (10)
1.一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，是通过敲除酿酒酵母宿主细胞中的脯氨酸脱氢酶基因构建的。
2.如权利要求1所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述脯氨酸脱氢酶基因为单敲除或双敲除。
3.如权利要求1或2所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述脯氨酸脱氢酶基因为PUT1，其Gene ID为：850833，核苷酸序列如序列表中SEQ NO:1所示。
4.如权利要求1或2所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述脯氨酸脱氢酶基因为PUT4，其Gene ID为：854530，核苷酸序列如序列表中SEQ NO:2所示。
5.如权利要求1或2所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17，编号CICC1929。
6.如权利要求1所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酿酒酵母基因工程菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17-DΔput1-k-p，是通过双敲除酿酒酵母S17中的put1基因获得的。
7.如权利要求1所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酿酒酵母基因工程菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17-DΔput4-k-p，是通过双敲除酿酒酵母S17中的put4基因获得的。
8.权利要求1-7任意一项所述低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)敲除脯氨酸脱氢酶基因的低产高级的醇酵母菌株的构建
1)以酿酒酵母基因组为模板，分别PCR得到敲除脯氨酸脱氢酶基因的上同源臂和下同源臂；
2)将整合片段敲除脯氨酸脱氢酶基因的上同源臂和下同源臂及KanMX表达盒，利用转化到酿酒酵母宿主中，利用酵母体内同源重组的原理，筛选得到敲除重组菌株；
(2)KanMX筛选标记的去除及pSH-Zeocin质粒的丢弃
(3)当构建双敲除菌株时，设计新的脯氨酸脱氢酶基因的上同源臂和下同源臂引物，并重复步骤(1)、(2)。
9.权利要求1-7任意一项所述低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株在酿酒中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，酿制啤酒的方法如下：
将上述基因工程菌按照10％w/v的接种量接种于12°P麦汁中，在密闭条件下，20℃，静置发酵，每隔12h称重一次，当12h的失重量小于0.1g时，发酵即可结束。
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