CN116694609A - 一种檀香烯合成酶突变体、工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种檀香烯合成酶突变体、工程菌及其应用，属于蛋白质工程和基因工程技术领域。本发明的酿酒酵母工程菌株SZ‑1进行6天发酵培养，Z‑α‑檀香醇、Z‑β‑檀香醇、Z‑α‑香柠檬醇、Z‑epi‑β‑檀香醇、α‑檀香烯、β‑檀香烯、α‑香柠檬烯和epi‑β‑檀香烯的总产量可以达到1.9g/L。工程菌株SZ‑2可产生上述八种产物总产量可达0.7g/L，其中，Z‑α‑檀香醇和Z‑β‑檀香醇分别占总产物的43.4％和22％。本发明通过利用SanSynF441V突变体构建酿酒酵母工程菌株能够生产得到符合国际标准的高品质檀香精油，能够有效缓解市场上的供不应求的情况，保护野生檀香资源。

Description

一种檀香烯合成酶突变体、工程菌及其应用
技术领域
本发明属于蛋白质工程和基因工程技术领域，具体涉及一种檀香烯合成酶突变体、工程菌及其应用。
背景技术
檀香挥发油具有强烈的香气，颜色为黄色至深棕色，其主要成分为倍半萜类化合物Z-α-檀香醇(Z-α-santalol)和Z-β-檀香醇(Z-β-santalol)。檀香挥发油具有很高的药用价值和经济价值，具有镇静安神、抗菌抗病毒、抗炎镇痛、抗氧化和抗肿瘤等药理活性，此外，它也常用于食品，化妆品和香水行业。
目前檀香挥发油主要通过水蒸气蒸馏法从25年树龄的檀香木心材和根部提取，由于檀香木较长的生长周期和复杂的提取工艺，檀香精油的供应并不能满足市场的需求。随着合成生物学的发展，已经在生产重要的中药活性成分方向取得了突破性的进展，例如利用酿酒酵母工程菌株生产青蒿酸、原人参二醇等活性化合物。目前檀香精油主要成分的生物合成途径已经被阐明，在植物中，法尼基焦磷酸(FPP)在檀香烯合成酶的催化下生成α-檀香烯(α-santalene)，β-檀香烯(β-santalene)，epi-β-檀香烯(epi-β-santalene)，exo-α-香柠檬烯(exo-α-bergamotene)等产物，随后，这些化合物在细胞色素P450单氧化酶的催化下羟基化生成Z-α-檀香醇(Z-α-santalol)，Z-β-檀香醇(Z-β-santalol)，Z-epi-β-檀香醇(Z-epi-β-santalol)，Z-exo-α-香柠檬醇(Z-exo-α-bergamotol)等产物。目前已有利用酿酒酵母生产檀香烯和檀香醇的报道(ACS Synth.Biol.2020,9,2,449–456)。
依据檀香精油品质的国际标准，在檀香精油中Z-α-檀香醇的含量需要达到45％至55％，Z-β-檀香醇的含量需要达到15％至25％。而目前已报道的产檀香精油的酿酒酵母工程菌株中Z-α-檀香醇的含量还未达到国际标准。主要原因在于檀香烯合成酶(STS)在催化FPP生成檀香烯的同时还会产生大量exo-α-香柠檬烯，exo-α-香柠檬烯会进一步被细胞色素P450氧化生成Z-exo-α-香柠檬醇，从而造成所产檀香精油品质未达到国际标准。
发明内容
本申请的首要目的在于提供一种檀香烯合成酶突变体。
本申请的另一目的在于提供一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌。
本申请的再一目的在于提供上述高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法和应用。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种檀香烯合成酶突变体，为檀香烯合成酶SanSyn突变体和SaSSy突变体中的至少一种；其中，檀香烯合成酶SanSyn突变体的氨基酸序列选自下列突变序列中的任一种：
SanSynE297L突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的297位谷氨酸突变为亮氨酸得到，具体是SEQ ID NO.1的第297位氨基酸密码子由SEQ ID NO.3中的GAA突变为TTA；
SanSynF441V突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的441位苯丙氨酸突变为缬氨酸得到，具体是SEQ ID NO.1的第441位氨基酸密码子由SEQ ID NO.3中的TTT突变为GTT；
檀香烯合成酶SaSSy突变体的氨基酸序列选自下列突变序列中的任一种：
SaSSyL317C突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的317位亮氨酸突变为半胱氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第317位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的CTC突变为TGC；
SaSSyL317I突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的317位亮氨酸突变为异亮氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第317位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的CTC突变为ATC；
SaSSyL317T突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的317位亮氨酸突变为苏氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第317位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的CTC突变为ACT；
SaSSyL317V突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的317位亮氨酸突变为缬氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第317位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的CTC突变为GTT；
SaSSyS459V突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的459位丝氨酸突变为缬氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第459位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的AGT突变为GTT；
SaSSyS459A突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的459位丝氨酸突变为丙氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第459位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的AGT突变为GCT；
SaSSyS459H突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的459位丝氨酸突变为组氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第459位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的AGT突变为CAC；
SaSSyS459I突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的459位丝氨酸突变为异亮氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第459位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的AGT突变为ATC；
SaSSyS459T突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的459位丝氨酸突变为苏氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第459位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的AGT突变为ACT；
SaSSyS535C突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的535位丝氨酸突变为半胱氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第535位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的TCT突变为TGC；
SaSSyS535T突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的535位丝氨酸突变为苏氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第535位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的TCT突变为ACT；
SaSSyF538W突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的538位苯丙氨酸突变为色氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第538位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的TTC突变为TGG。
编码上述檀香烯合成酶突变体的基因。
包含上述基因的重组表达载体或高产檀香烯的酿酒酵母工程菌。
一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌，所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌，具有如下特点：以酿酒酵母出发菌株，敲除OYE2、OYE3、ATF1、ATF2、LPP1、DPP1、ROX1基因，将酿酒酵母的ERG9基因内源性启动子替换成PHXT1启动子，过表达mSTS、ADH2、ALD6、SeACSL641P、IDI1、tHMG1、UPC2-1、CYP736A167和SaCPR2基因；其中：
IDI1、UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体DPP1位点；
ADH2、ALD6、SeACSL641P基因整合到酿酒酵母染色体LPP1位点；
mSTS、tHMG1基因整合到酿酒酵母染色体PERG9位点；
CYP736A167、SaCPR2、第二个拷贝的mSTS基因整合到酿酒酵母MET17位点；
第三个拷贝的mSTS基因整合到酿酒酵母染色体ROX1位点；
第二个拷贝的CYP736A167基因、第二个拷贝的tHMG1基因或第二、第三个拷贝的CYP736A167基因整合到酿酒酵母染色体ROX1位点。
所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母CEN.PK2-1D。
所述的mSTS基因的核苷酸序列为檀香烯合成酶突变体的核苷酸序列，具体为檀香烯合成酶SanSyn突变体和SaSSy突变体的核苷酸序列中的至少一种；优选为SanSynF441V突变体的核苷酸序列。
所述的敲除OYE2、OYE3、ATF1、ATF2基因的方法，为通过CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除；优选通过如下步骤进行敲除：
S1.将重组质粒pCRCT-OYE2-OYE3转化酿酒酵母，经过培养表达筛选，得到敲除OYE2、OYE3基因的菌株；
S2.将重组质粒pCRCT-ATF1-ATF2转化敲除OYE2、OYE3基因的酿酒酵母菌株，经过培养表达筛选，得到敲除OYE2、OYE3、ATF1、ATF2基因菌株。
步骤S1中所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母CEN.PK2-1D。
步骤S1中所述的筛选所用的培养基优选为SD-URA缺陷平板培养基；所述的SD-URA缺陷平板培养基的配方为：YNB培养基6.7g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100×)10mL/L。其中，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100×)的制备方法为：分别称取缬氨酸0.9g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，酪氨酸0.18g，精氨酸0.12g，色氨酸0.24g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g，苯丙氨酸0.3g，甲硫氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，丝氨酸2.25g，组氨酸0.12g，用ddH2O定容到57mL即得。
步骤S1中所述的培养的条件优选为28～32℃、200～250rpm；更优选为30℃、220rpm。
所述的IDI1、ADH2、ALD6基因优选从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组克隆得到，其中，IDI1的核苷酸序列见GenBank:NM_001183931.1；ADH2的核苷酸序列见GenBank:NM_001182812.1；ALD6的核苷酸序列见GenBank:NM_001183875.1；
所述的CYP736A167、SaCPR2、tHMG1、UPC2-1、PHXT1为本实验室保存，其中，CYP736A167的核苷酸序列见GenBank:KU169302.1；SaCPR2的核苷酸序列见GenBank:KC842188.1；tHMG1、UPC2-1、PHXT1基因的核苷酸序列已在专利申请：CN201911180415.0一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用中公开。所述的SeACSL641P基因为以酿酒酵母为宿主通过密码子优化人工合成得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述的mSTS基因的序列为檀香烯合成酶突变体的核苷酸序列，具体为檀香烯合成酶SanSyn突变体和SaSSy突变体的核苷酸序列中的至少一种；优选为SanSynF441V突变体的核苷酸序列。
上述高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)基因敲除：通过CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除OYE2、OYE3、ATF1、ATF2基因，其中所用的OYE2、OYE3crRNA spacer的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；ATF1、ATF2crRNAspacer的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；经过培养表达筛选，得到敲除OYE2、OYE3、ATF1、ATF2基因的菌株；
(2)模块构建：分别将ADH2、ALD6、SeACSL641P、IDI1、tHMG1、UPC2-1、CYP736A167、SaCPR2、mSTS和相应的启动子、终止子顺序连接得到对应的表达模块；
(3)菌株构建：将上述相应的基因模块整合到酿酒菌株对应的染色体位点上即得高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌；
其中：IDI1、UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体DPP1位点；
ADH2、ALD6、SeACSL641P基因整合到酿酒酵母染色体LPP1位点；
mSTS、tHMG1基因整合到酿酒酵母染色体PERG9位点；
CYP736A167、SaCPR2、第二个拷贝的mSTS基因整合到酿酒酵母MET17基因位点；
第三个拷贝的mSTS基因整合到酿酒酵母染色体ROX1位点
第二个拷贝的CYP736A167基因、第二个拷贝的tHMG1基因或第二、第三个拷贝的CYP736A167基因整合到酿酒酵母染色体ROX1位点；
具体地，作为一种优选方式，所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)基因敲除：
(a)重组质粒pCRCT-OYE2-OYE3转化酿酒酵母M，经培养筛选后即得敲除OYE2、OYE3基因的酵母菌株M-1；
(b)将重组质粒pCRCT-ATF1-ATF2转化酿酒酵母M-1菌株，经培养筛选后即得敲除OYE2、OYE3、ATF1、ATF2基因的酵母菌株M-2；
(2)模块的构建：
(a)将PTEF2、UPC2-1和TFBA1顺序连接，得到模块PTEF2-UPC2-1-TFBA1，命名为模块1；
(b)将PTPI1、IDI1和TPGK1顺序连接，得到模块PTPI1-IDI1-TPGK1，命名为模块2；
(c)将PENO2、ALD6、TTDH2和PPDC1顺序连接，得到模块PENO2-ALD6-TTDH2-PPDC1，命名为模块3；
(d)将ADH2、TADH2、PTEF1、SeACSL641P和TPGI1顺序连接，得到模块ADH2-TADH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1，命名为模块4；
(e)将PTPI1、tHMG1、TPGK1、PTDH3、mSTS和TENO2顺序连接，得到模块PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-mSTS-TENO2，命名为模块5；
(f)将PPGK1、CYP736A167、TADH1、PTEF1、SaCPR2和TCYC1顺序连接，得到模块PPGK1-CYP736A167-TADH1-PTEF1-SaCPR2-TCYC1，命名为模块6；
(g)将PFBA1、CYP736A167和TPGI1顺序连接，得到模块PFBA1-CYP736A167-TPGI1，命名为模块7；
(h)将LPP1up、HIS3和LPP1down顺序连接，得到模块LPP1up-HIS3-LPP1down，命名为模块8；
(i)将DPP1up、TRP1和DPP1down顺序连接，得到模块DPP1up-TRP1-DPP1down，命名为模块9；
(j)将PERG9up、KILEU2、PHXT1和PERG9down顺序连接，得到模块PERG9up-KILEU2-PHXT1-PERG9down，命名为模块10；
(k)将MET17up、URA3和MET17down顺序连接，得到模块MET17up-URA3-MET17down，命名为模块11；
(l)将ROX1up、MET17和ROX1down顺序连接，得到模块ROX1up-MET17-ROX1down，命名为模块12；
(3)构建菌株M-6
(I)将模块1、模块2和筛选标记TRP1共同转化菌株M-2，整合位点为酿酒酵母染色体DPP1位点，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株M-3；
(II)将模块3、模块4和筛选标记HIS3共同转化菌株M-3，整合位点为酿酒酵母染色体LPP1位点，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株M-4；
(III)将模块5、PHXT1和筛选标记KILEU2共同转化菌株M-4，整合位点为酿酒酵母染色体PERG9位点，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株M-5；
(Ⅳ)将模块5中的PTDH3-mSTS-TENO2片段、模块6和模块11的筛选标记URA3共同转化菌株M-5，整合位点为酿酒酵母染色体MET17位点，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株M-6；
(4)构建菌株SZ-1
将模块5、模块6中的PPGK1-CYP736A167-TADH1片段和筛选标记MET17共同转化菌株M-6，整合位点为酿酒酵母染色体ROX1位点，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株SZ-1，即为所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌。
(5)构建菌株SZ-2
将模块5中的PTDH3-mSTS-TENO2片段、模块6中的PPGK1-CYP736A167-TADH1片段、模块7和筛选标记MET17共同转化菌株M-6，整合位点为酿酒酵母染色体ROX1位点，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株SZ-2，即为所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌。
所述的酵母菌株M优选为酿酒酵母CEN.PK2-1D。
所述的mSTS基因的序列为檀香烯合成酶突变体的核苷酸序列，具体为檀香烯合成酶SanSyn突变体和SaSSy突变体的核苷酸序列中的至少一种；优选为SanSynF441V突变体的核苷酸序列。
步骤(2)中，所述的PTEF2、PTPI1、PENO2、PPDC1、PTEF1、PTDH3、PPGK1和PFBA1可从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组克隆得到，其中，PTEF2的核苷酸序列见GenBank:CP020124.1，从第477500位到第478059位；PTPI1的核苷酸序列见GenBank:CP020126.1，从第564689位到第564189位；PENO2的核苷酸序列见GenBank:CP020130.1，从第469225位到第469824位；PPDC1的核苷酸序列见GenBank:CP020134.1，从第234920位到第234120位；PTEF1的核苷酸序列见GenBank:CP020138.1，从第700414位到第700832位；PTDH3的核苷酸序列见GenBank:CP020129.1，从第884060位到第884735位；PPGK1的核苷酸序列见GenBank:CP020125.1，从第142054位到第143036位；PFBA1的核苷酸序列见GenBank:CP020133.1，从第327996位到第327497位。
步骤(2)中，所述的TFBA1、TPGK1、TTDH2、TADH2、TPGI1、TENO2、TADH1、TCYC1为终止子，可从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组克隆得到，其中，TFBA1的核苷酸序列见GenBank:CP020133.1，从第327996位到第327497位；TPGK1的核苷酸序列见GenBank:CP020125.1，从第144287位到第144714位；TTDH2的核苷酸序列见GenBank:CP020132.1，从第459599位到第459200位；TADH2的核苷酸序列见GenBank:CP020135.1，从第879067位到第878668位；TPGI1的核苷酸序列见GenBank:CP020124.1，从第612625位到第612226位；TENO2的核苷酸序列见GenBank:CP020124.1，从第612625位到第612226位；TADH1的核苷酸序列见GenBank:CP020137.1，从第159575位到第159411位；TCYC1的核苷酸序列见GenBank:LT727633.1，从第8068位到第8257位。
步骤(2)中，所述的LPP1up的核苷酸序列见GenBank:CP020126.1，从第1462217位到第1462518位；所述的LPP1down的核苷酸序列见GenBank:CP020126.1，从第1463344位到第1463625位；所述的DPP1up的核苷酸序列见GenBank:CP020126.1，从第1037979位到第1038277位；所述的DPP1down的核苷酸序列见GenBank:CP020126.1，从第1039148位到第1039481位；所述的PERG9up的核苷酸序列见GenBank:CP020130.1，从第502815位到第503221位；所述的PERG9down的核苷酸序列见GenBank:CP020126.1，从第503341位到第503776位；所述的MET17up的核苷酸序列见GenBank:CP020134.1，从第726291位到第726591位；所述的MET17down的核苷酸序列见GenBank:CP020134.1，从第727927位到第728222位；所述的ROX1up的核苷酸序列见GenBank:CP020138.1，从第679325位到第679688位；所述的ROX1down的核苷酸序列见GenBank:CP020134.1，从第680639位到第681039位。
步骤(2)中，所述的TRP1、HIS3、KILEU2、URA3和MET17为筛选标记，为本实验室保存，其中，TRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；HIS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；KILEU2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；URA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；MET17的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
步骤(3)、(4)和(5)中，所述的整合为采用酵母转化试剂盒进行整合；优选为用超级酵母转化试剂盒进行整合。
步骤(I)中，所述的酵母缺陷型培养基的配方为：YNB培养基6.7g/L，色氨酸(TRP)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉。其中，所述的TRP(色氨酸)缺陷氨基酸(100×)配方如下：尿嘧啶0.12g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，缬氨酸0.9g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，酪氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，谷氨酸0.6g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，丝氨酸2.25g，苯丙氨酸0.3g，组氨酸0.12g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(II)中，所述的酵母缺陷型培养基的配方为：YNB培养基6.7g/L，色氨酸-组氨酸(TRP-HIS)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉；其中，所述的色氨酸-组氨酸(TRP-HIS)缺陷氨基酸(100×)配方如下：尿嘧啶0.12g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，缬氨酸0.9g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，酪氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，谷氨酸0.6g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，丝氨酸2.25g，苯丙氨酸0.3g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(III)中，所述的酵母缺陷型培养基的配方为：YNB培养基6.7g/L，色氨酸-组氨酸-亮氨酸(TRP-HIS-LEU)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉。其中，所述的色氨酸-组氨酸-亮氨酸(TRP-HIS-LEU)缺陷氨基酸(100×)配方如下：尿嘧啶0.12g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，缬氨酸0.9g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，酪氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g，丝氨酸2.25g，苯丙氨酸0.3g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(IV)中，所述的酵母缺陷型培养基的配方为：YNB培养基6.7g/L，色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶(TRP-HIS-LEU-URA)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉。其中，所述的TRP-HIS-LEU-URA(色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶)缺陷氨基酸(100×)的配方为：缬氨酸0.9g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，酪氨酸0.18g，谷氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，丝氨酸2.25g，苯丙氨酸0.3g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(4)和(5)中所述的酵母缺陷型培养基的配方如下：YNB 6.7g/L，色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶-甲硫氨酸(TRP-HIS-LEU-URA-MET)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉。其中，所述的色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶-甲硫氨酸(TRP-HIS-LEU-URA-MET)缺陷氨基酸(100×)配方如下：缬氨酸0.9g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，酪氨酸0.18g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，用ddH2O定容到57mL。
上述檀香烯合成酶突变体、重组表达载体或高产檀香烯的酿酒酵母工程菌在制备檀香挥发油中的应用。
上述高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌在制备檀香挥发油中的应用。
一种制备檀香烯和檀香醇的方法，通过将上述高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌接种于发酵培养基中培养，待溶氧值上升即补加补料培养基，补料分批发酵后，取发酵液萃取，即得檀香烯和檀香醇。
所述的补料分批发酵的发酵时间优选为至少六天；更优选为六天。
其中，所述的发酵培养基优选包括如下组分：(NH4)2SO4 15g/L，KH2PO4 8g/L，MgSO43g/L，ZnSO4.7H2O 0.72g/L，维生素溶液12ml/L，微量金属溶液10ml/L，葡萄糖25g/L；
所述的补料培养基优选包括如下组分：微量金属溶液10mL/L，维生素溶液12ml/L，KH2PO4 9g/L，无水MgSO4 2.5g/L，K2SO4 3.5g/L，Na2SO4 0.28g/L，葡萄糖150g/L，乙醇350g/L；
所述的维生素溶液优选包括如下组分：生物素0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺1g/L，盐酸吡哆醇1g/L，对氨基苯酸0.2g/L；
所述的微量金属溶液优选包括如下组分：EDTA 15g/L，ZnSO4.7H2O 10.2g/L，MnCl2.4H2O 0.5g/L，无水CuSO4 0.5g/L，CoCl2.6H2O 0.86g/L，Na2MoO4.2H2O 0.56g/L，CaCl2.2H2O 3.84g/L，FeSO4.7H2O 5.12g/L。
所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌在发酵培养基中的培养条件优选为：温度30℃，pH值5.5，溶氧值40％，搅拌速度250～800rpm，通气量2L/min，发酵时间144h。
所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的接种量优选为10％(v/v)。
所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌在接种于发酵培养基中培养前需要进行活化。
所述的活化优选为多级活化。
所述的活化方法更优选为：将高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的单菌落接种到含有5mL SD-TRP1-HIS-LEU-URA-MET缺陷培养基的试管中，于220～250rpm、30℃条件下培养10～24h；然后将培养得到的菌液接种到含有5mL SD-TRP-HIS-LEU-URA-MET缺陷培养基的250mL摇瓶中于220～250rpm、30℃条件下培养24h。
所述的SD-TRP-HIS-LEU-URA-MET缺陷培养基优选包括如下组分：YNB 6.7g/L，色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶-甲硫氨酸(TRP-HIS-LEU-URA-MET)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L；其中，所述的色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶-甲硫氨酸(TRP-HIS-LEU-URA-MET)缺陷氨基酸(100×)的组分如下：缬氨酸0.9g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，酪氨酸0.18g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，用ddH2O定容到57mL。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
本发明以突变体SanSynF441V为例构建高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌，其中，将得到的酿酒酵母工程菌株SZ-1进行6天发酵培养，Z-α-檀香醇、Z-β-檀香醇、Z-α-香柠檬醇、Z-epi-β-檀香醇、α-檀香烯、β-檀香烯、α-香柠檬烯和epi-β-檀香烯的总产量可以达到1.9g/L。将酿酒酵母工程菌株SZ-2进行6天发酵培养，可产生上述八种产物总产量可达0.7g/L，其中，Z-α-檀香醇和Z-β-檀香醇分别占总产物的43.4％和22％。本发明通过利用SanSynF441V突变体构建酿酒酵母工程菌株能够生产得到符合国际标准的高品质檀香精油，能够有效缓解市场上的供不应求的情况，保护野生檀香资源。
附图说明
图1为菌株SZ-1和SZ-2合成檀香烯和檀香醇的生物合成途径图。
图2为菌株SZ-1和SZ-2经过6天发酵培养所得发酵产物的气质总离子流图；其中，A为菌株SZ-1经过6天发酵培养所得发酵产物的气质总离子流图；B为菌株SZ-2经过6天发酵培养所得发酵产物的气质总离子流图；1代表α-檀香烯、2代表exo-α-香柠檬烯、3代表epi-β-檀香烯、4代表β-檀香烯、5代表Z-α-檀香醇、6代表Z-exo-α-香柠檬醇、7代表Z-epi-β-檀香醇、8代表Z-β-檀香醇。
图3为菌株SZ-1和SZ-2补料分批发酵过程中生物量和檀香烯和檀香醇产量结果图；其中，图A为菌株SZ-1补料分批发酵过程中生物量和檀香烯和檀香醇产量结果图；图B为菌株SZ-2补料分批发酵过程中生物量和檀香烯和檀香醇产量结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
OYE2-OYE3和ATF1-ATF2 crRNA arrarys，SeACSL641P DNA序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；基因组DNA提取试剂(DNAiso Reagent)购自宝日医生物技术有限公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京擎科生物技术有限公司；pEASY-Blunt载体购自全式金生物技术有限公司；超级酵母转化试剂盒购自北京酷来搏科技有限公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司；pCFB2988载体购自Addgene公司；pCRCT载体购自武汉淼灵生物科技有限公司；pESC-LEU载体购自Addgene公司；
IDI1、ADH2、ALD6基因从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组克隆得到，其中，IDI1的核苷酸序列见GenBank:NM_001183931.1；ADH2的核苷酸序列见GenBank:NM_001182812.1；ALD6的核苷酸序列见GenBank:NM_001183875.1；CYP736A167、SaCPR2、tHMG1、UPC2-1、PHXT1为本实验室保存，其中，CYP736A167的核苷酸序列见GenBank:KU169302.1；SaCPR2的核苷酸序列见GenBank:KC842188.1；tHMG1、UPC2-1、PHXT1基因的核苷酸序列已在专利申请：CN201911180415.0一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用中公开；SeACSL641P基因为以酿酒酵母为宿主通过密码子优化人工合成得到，其核苷酸序列如SEQID NO.5所示。
PTEF2、PTPI1、PENO2、PPDC1、PTEF1、PTDH3、PPGK1和PFBA1可从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组克隆得到，其中，PTEF2的核苷酸序列见GenBank:CP020124.1，从第477500位到第478059位；PTPI1的核苷酸序列见GenBank:CP020126.1，从第564689位到第564189位；PENO2的核苷酸序列见GenBank:CP020130.1，从第469225位到第469824位；PPDC1的核苷酸序列见GenBank:CP020134.1，从第234920位到第234120位；PTEF1的核苷酸序列见GenBank:CP020138.1，从第700414位到第700832位；PTDH3的核苷酸序列见GenBank:CP020129.1，从第884060位到第884735位；PPGK1的核苷酸序列见GenBank:CP020125.1，从第142054位到第143036位；PFBA1的核苷酸序列见GenBank:CP020133.1，从第327996位到第327497位。
TFBA1、TPGK1、TTDH2、TADH2、TPGI1、TENO2、TADH1、TCYC1为终止子，可从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组克隆得到，其中，TFBA1的核苷酸序列见GenBank:CP020133.1，从第327996位到第327497位；TPGK1的核苷酸序列见GenBank:CP020125.1，从第144287位到第144714位；TTDH2的核苷酸序列见GenBank:CP020132.1，从第459599位到第459200位；TADH2的核苷酸序列见GenBank:CP020135.1，从第879067位到第878668位；TPGI1的核苷酸序列见GenBank:CP020124.1，从第612625位到第612226位；TENO2的核苷酸序列见GenBank:CP020124.1，从第612625位到第612226位；TADH1的核苷酸序列见GenBank:CP020137.1，从第159575位到第159411位；TCYC1的核苷酸序列见GenBank:LT727633.1，从第8068位到第8257位。LPP1up的核苷酸序列见GenBank:CP020126.1，从第1462217位到第1462518位；LPP1down的核苷酸序列见GenBank:CP020126.1，从第1463344位到第1463625位；所述的DPP1up的核苷酸序列见GenBank:CP020126.1，从第1037979位到第1038277位；所述的DPP1down的核苷酸序列见GenBank:CP020126.1，从第1039148位到第1039481位；所述的PERG9up的核苷酸序列见GenBank:CP020130.1，从第502815位到第503221位；所述的PERG9down的核苷酸序列见GenBank:CP020126.1，从第503341位到第503776位；所述的MET17up的核苷酸序列见GenBank:CP020134.1，从第726291位到第726591位；所述的MET17down的核苷酸序列见GenBank:CP020134.1，从第727927位到第728222位；所述的ROX1up的核苷酸序列见GenBank:CP020138.1，从第679325位到第679688位；所述的ROX1down的核苷酸序列见GenBank:CP020134.1，从第680639位到第681039位。TRP1、HIS3、KILEU2、URA3和MET17为筛选标记，为本实验室保存，其中，TRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；HIS3的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；KILEU2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；URA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；MET17的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
实施例1：檀香烯合成酶及其变体的酿酒酵母异源表达及其产物检测
1、构建野生型檀香烯合成酶SanSyn、SaSSy、SanSyn突变体和SaSSy突变体酿酒酵母表达载体
根据檀香烯合成酶SanSyn基因(NCBI登录号为HQ452480.1)，由金斯瑞生物科技有限公司经密码子优化后合成，经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，将其定义为野生型檀香烯合成酶SanSyn(SanSyn野生型，SanSyn(wt))。
根据檀香烯合成酶SaSSy基因(NCBI登录号为HQ343276.1)，由金斯瑞生物科技有限公司经密码子优化后合成，经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，将其定义为野生型檀香烯合成酶SaSSy(SaSSy野生型，SaSSy(wt))。
克隆得到带有同源臂的野生型檀香烯合成酶SanSyn(引物：pESC-LEU-SanSyn-F/pESC-LEU-SanSyn-R)、野生型檀香烯合成酶SaSSy(引物：pESC-LEU-SaSSy-F/pESC-LEU-SaSSy-R)、SanSyn突变体(即：SanSynF441V突变体或SanSynE297L突变体)(引物：pESC-LEU-SanSyn-F/pESC-LEU-SanSyn-R)和SaSSy突变体(即SaSSyL317V或SaSSyL317T或SaSSyL317I或SaSSyL317C或SaSSyS459V或SaSSyS459T或SaSSyS459I或SaSSyL459H或SaSSyS459A或SaSSyS535T或SaSSyS535C或SaSSyF538W)(引物：pESC-LEU-SaSSy-F/pESC-LEU-SaSSy-R)，通过ClonExpressII One Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)构建到pESC-LEU载体的BamHI/XhoI位点，分别得到野生型檀香烯合成酶SanSyn表达载体、野生型檀香烯合成酶SaSSy表达载体、SanSyn突变体表达载体和SaSSy突变体表达载体，连接体系和方法见ClonExpress II One Step Cloning Kit产品说明书。
2、酿酒酵母异源表达
(1)分别将野生型檀香烯合成酶SanSyn表达载体、野生型檀香烯合成酶SaSSy表达载体、SanSyn突变体表达载体和SaSSy突变体表达载体利用超级酵母转化试剂盒转化WL07菌株(该WL07菌株已在Zha W,An T,Li T,Zhu J,Gao K,Sun Z,Xu W,Lin P,ZiJ.Reconstruction of the Biosynthetic Pathway of Santalols under Control ofthe GAL Regulatory System in Yeast.ACS Synth.Biol.2020,9,449-456.中公开)，具体转化方法参照超级酵母转化试剂盒产品说明书，筛选平板为SD-LEU平板培养基，30℃培养3天；
所述的SD-LEU平板培养基配方为：YNB 6.7g/L，LEU(亮氨酸)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉。
所述的LEU(亮氨酸)缺陷氨基酸(100×)配方为：尿嘧啶0.12g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，缬氨酸0.9g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，酪氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，谷氨酸0.6g，色氨酸0.24g，赖氨酸0.18g，丝氨酸2.25g，苯丙氨酸0.3g，组氨酸0.12g，用ddH2O定容到57mL。
(2)从平板上挑取单克隆菌株于5mL SD-LEU培养基中培养24h，得到菌液；将1mL菌液接到50mL SG-LEU培养基中表达4天；
所述的SG-LEU培养基配方为：YNB 6.7g/L，LEU(亮氨酸)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖2g/L，半乳糖18g/L。
(3)产物的萃取检测
菌株发酵4天后，取发酵菌液加入50mL的乙酸乙酯超声1h，静置3d，得到有机相，取500μL有机相进行GC-MS检测；其中，所用的仪器为安捷伦气质联用仪7890B-5977B。检测方法：进样体积1μL，溶剂延时11min，载气为氦气，流速为1mL/min。色谱柱：HP-5MS。色谱条件：50℃保持3min，20℃/min速率升温到70℃并保持1min，15℃/min升温到300℃，保持3min。
与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2相比，檀香烯合成酶突变体的氨基酸突变情况及各檀香烯合成酶突变体表达产物各组分的比例如表1所示。
表1：
a：SanSyn野生型(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。
b：SaSSy野生型(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。
c：()括号内表示野生型檀香烯合成酶SanSyn该位点氨基酸的密码子。
d：()括号内表示该位点突变为指定氨基酸时所使用的密码子。
e：()括号内表示各组分占产物的百分含量。
表1的结果表明，SanSynF441V突变体与檀香植物中的成分比例最相似。
实施例2：CRISPR-Cas9系统敲除酿酒酵母CEN.PK2-1D的OYE2、OYE3、ATF1、ATF2基因
1、pCRCT载体转化酿酒酵母敲除目的基因
(1)将pCRCT-OYE2-OYE3载体(由南京金斯瑞生物科技有限公司构建，OYE2、OYE3基因的crRNA spacer核酸序列如SEQ ID NO.6所示)利用超级酵母转化试剂盒转化酿酒酵母CEN.PK2-1D(购于Euroscarf公司，德国)，具体转化方法参照超级酵母转化试剂盒产品说明书，得到单克隆转化子。
(2)利用SD-URA缺陷平板培养基进行筛选，平板在30℃条件下培养五天。其中，SD-URA缺陷平板培养基的配方为：YNB培养基6.7g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100×)10mL/L。其中，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100×)的制备方法为：分别称取缬氨酸0.9g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，酪氨酸0.18g，精氨酸0.12g，色氨酸0.24g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g，苯丙氨酸0.3g，甲硫氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，丝氨酸2.25g，组氨酸0.12g，用ddH2O定容到57mL即得。
(3)取步骤(1)的单克隆转化子于4mL SD-URA缺陷平板培养基中，在30℃、220rpm条件下摇床培养。
(4)培养两天后取100μL菌液接于新鲜SD-URA缺陷平板培养基中继续表达两天。
(5)通过划板稀释挑选步骤(4)中的单菌落菌株提取基因组，扩增目的基因进行测序验证该基因已经被敲除。
(6)利用YPD培养基传代丢失pCRCT-OYE2-OYE3，构建菌株M-1。其中，YPD培养基的配方为：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，20g/L琼脂粉。
(7)将pCRCT-ATF1-ATF2载体(由南京金斯瑞生物科技有限公司构建，ATF1、ATF2基因的crRNA spacer核酸序列如SEQ ID NO.7所示)，利用超级酵母转化试剂盒转化M-1菌株，在M-1菌株基础上重复上述(1)-(6)步骤敲除ATF1和ATF2基因，构建酿酒酵母M-2。
实施例3：载体和模块的构建(以SanSynF441V突变体为例，其它突变体构建方法如本实施例所述)
1、重叠PCR构建模块
(1)构建模块所需的DNA片段经过第一轮PCR扩增得到，反应条件和条件见PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase克隆试剂盒说明书，通过PCR将DNA片段之间互相加上40～50bp的重叠序列用于第二轮的重叠PCR。
(2)取构建模块所需的DNA片段50-100ng进行第二轮PCR反应，反应体系和条件如(1)所述，循环数改为10个循环。
(3)取第二轮PCR反应液作为第三轮PCR反应的模板，反应体系和条件如(1)所述；
按上述重叠PCR步骤构建以下模块：
(a)将PTEF2、UPC2-1和TFBA1顺序连接，得到模块PTEF2-UPC2-1-TFBA1，命名为模块1，其中克隆PTEF2的引物为OE-PTEF2-UPC2-1-TFBA1-1F/OE-PTEF2-UPC2-1-TFBA1-1R，克隆UPC2-1的引物为OE-PTEF2-UPC2-1-TFBA1-2F/OE-PTEF2-UPC2-1-TFBA1-2R，克隆TFBA1的引物为OE-PTEF2-UPC2-1-TFBA1-3F/OE-PTEF2-UPC2-1-TFBA1-3R；
(b)将PTPI1、IDI1和TPGK1顺序连接，得到模块PTPI1-IDI1-TPGK1，命名为模块2，其中克隆PTPI1的引物为OE-PTPI1-IDI1-TPGK1-1F/OE-PTPI1-IDI1-TPGK1-1R，克隆IDI1的引物为OE-PTPI1-IDI1-TPGK1-2F/OE-PTPI1-IDI1-TPGK1-2R，克隆TPGK1的引物为OE-PTPI1-IDI1-TPGK1-3F/OE-PTPI1-IDI1-TPGK1-3R；
(c)将PENO2、ALD6、TTDH2和PPDC1顺序连接，得到模块PENO2-ALD6-TTDH2-PPDC1，命名为模块3，其中克隆PENO2的引物为OE-PENO2-ALD6-TTDH2-PPDC1-1F/OE-PENO2-ALD6-TTDH2-PPDC1-1R，克隆ALD6的引物为OE-PENO2-ALD6-TTDH2-PPDC1-2F/OE-PENO2-ALD6-TTDH2-PPDC1-2R，克隆TTDH2的引物为OE-PENO2-ALD6-TTDH2-PPDC1-3F/OE-PENO2-ALD6-TTDH2-PPDC1-3R，克隆PPDC1的引物为OE-PENO2-ALD6-TTDH2-PPDC1-4F/OE-PENO2-ALD6-TTDH2-PPDC1-4R；
(d)将ADH2、TADH2、PTEF1、SeACSL641P和TPGI1顺序连接，得到模块ADH2-TADH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1，命名为模块4，其中克隆ADH2的引物为OE-ADH2-TADH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1-1F/OE-ADH2-TADH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1-1R，克隆TADH2的引物为OE-ADH2-TADH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1-2F/OE-ADH2-TAD H2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1-2R，克隆PTEF1的引物为OE-ADH2-TADH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1-3F/OE-ADH2-TA DH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1-3R，克隆SeACSL641P的引物OE-ADH2-TADH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1-4F/OE-ADH2-TADH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1-4R，克隆TPGI1的引物OE-ADH2-TADH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1-5F/OE-ADH2-TADH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1-5R；
(e)将PTPI1、tHMG1、TPGK1、PTDH3、SanSynF441V和TENO2顺序连接，得到模块PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2，命名为模块5，其中克隆PTPI1的引物为OE-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-1F/OE-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-1R，其中克隆tHMG1的引物为OE-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-2F/OE-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-2R，其中克隆TPGK1的引物为OE-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-3F/OE-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-3R，克隆PTDH3的引物OE-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-4F/OE-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-4R，克隆SanSynF441V的引物OE-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-5F/OE-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-5R，克隆TENO2的引物OE-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-6F/OE-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-6R；
(f)将PFBA1、CYP736A167和TPGI1顺序连接，得到模块PFBA1-CYP736A167-TPGI1，命名为模块7，其中克隆PFBA1的引物为OE-PFBA1-CYP736A167-TPGI1-1F/OE-PFBA1-CYP736A167-TPGI1-1R，克隆CYP736A167的引物为OE-PFBA1-CYP736A167-TPGI1-2F/OE-PFBA1-CYP736A167-TPGI1-2R，克隆TPGI1的引物为OE-PFBA1-CYP736A167-TPGI1-3F/OE-PFBA1-CYP736A167-TPGI1-3R；
(g)将LPP1up、HIS3和LPP1down顺序连接，得到模块LPP1up-HIS3-LPP1down，命名为模块8，其中，克隆LPP1up的引物为OE-LPP1up-HIS3-LPP1down-1F/OE-LPP1up-HIS3-LPP1down-1R，克隆HIS3的引物为OE-LPP1up-HIS3-LPP1down-2F/OE-LPP1up-HIS3-LPP1down-2R，克隆LPP1down的引物为OE-LPP1up-HIS3-LPP1down-3F/OE-LPP1up-HIS3-LPP1down-3R；
(h)将DPP1up、TRP1和DPP1down顺序连接，得到模块DPP1up-TRP1-DPP1down，命名为模块9，克隆DPP1up的引物为OE-DPP1up-TRP1-DPP1down-1F/OE-DPP1up-TRP1-DPP1down-1R，克隆TRP1的引物为OE-DPP1up-TRP1-DPP1down-2F/OE-DPP1up-TRP1-DPP1down-2R，克隆DPP1down的引物为OE-DPP1up-TRP1-DPP1down-3F/OE-DPP1up-TRP1-DPP1down-3R；
(i)将PERG9up、KILEU2、PHXT1和PERG9down顺序连接，得到模块PERG9up-KILEU2-PHXT1-PERG9down，命名为模块10，其中，克隆PERG9up的引物为OE-PERG9up-KILEU2-PHXT1-PERG9down-1F/OE-PERG9up-KILEU2-PHXT1-PERG9down-1R，克隆KILEU2的引物为OE-PERG9up-KILEU2-PHXT1-PERG9down-2F/OE-PERG9up-KILEU2-PHXT1-PERG9down-2R，克隆PHXT1的引物为OE-PERG9up-KILEU2-PHXT1-PERG9down-3F/OE-PERG9up-KILEU2-PHXT1-PERG9down-3R，克隆PERG9down的引物为OE-PERG9up-KILEU2-PHXT1-PERG9down-4F/OE-PERG9up-KILEU2-PHXT1-PERG9down-4R；
(j)将MET17up、URA3和MET17down顺序连接，得到模块MET17up-URA3-MET17down，命名为模块11，其中克隆MET17up的引物为OE-MET17up-URA3-MET17down-1F/OE-MET17up-URA3-MET17down-1R，克隆URA3的引物为OE-MET17up-URA3-MET17down-2F/OE-MET17up-URA3-MET17down-2R，克隆MET17down的引物为OE-MET17up-URA3-MET17down-3F/OE-MET17up-URA3-MET17down-3R；
(k)将ROX1up、MET17和ROX1down顺序连接，得到模块ROX1up-MET17-ROX1down，命名为模块12，其中克隆ROX1up的引物为OE-ROX1up-MET17-ROX1down-1F/OE-ROX1up-MET17-ROX1down-1R，克隆MET17的引物为OE-ROX1up-MET17-ROX1down-2F/OE-ROX1up-MET17-ROX1down-2R，克隆ROX1down的引物为OE-ROX1up-MET17-ROX1down-3F/OE-ROX1up-MET17-ROX1down-3R；
本实施例中所述引物的核苷酸序列如表2所示。
表2.引物序列
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2、通过同源重组构建载体
克隆得到带有同源臂的CYP736A167基因(引物：CYP736A167-F/CYP736A167-R)，通过ClonExpress II One Step Cloning Kit(购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)构建到载体pSP-GM2(购于BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)的NotⅢ/SacI位点，连接体系和方法见产品说明书，构建pSP-GM2-CYP736A167重组载体；
如上所述，将SaCPR2(引物：SaCPR2-F/SaCPR2-R)构建到pSP-GM2-CYP736A167重组载体的BamHI/NheI位点，构建载体pSP-GM2-CYP736A167-SaCPR2，得到PPGK1-CYP736A167-TADH1-PTEF1-SaCPR2-TCYC1模块，即模块6。
3、整合载体的构建
(1)将模块9构建到pCFB2988载体(购于BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)的HindⅢ/NheI位点，构建pCFB2988-DPP1载体，继续将模块1构建到pCFB2988-DPP1载体的BamHI位点，构建载体pCFB2988-DPP1-UPC2-1，最后将模块2构建到pCFB2988-DPP1-UPC2-1的BamHI位点，构建载体pSZ-1；
(2)如上所述，依次将模块8、模块3和模块4依次连接到pCFB2988载体上，构建载体pSZ-2；
(3)依次将模块10和模块5构建到pCFB2988载体上，构建载体pSZ-3；
(4)以pSP-GM2-CYP736A167-SaCPR2载体为模板克隆模块6(引物：PPGK1-CYP736A167-TADH1-PTEF1-SaCPR2-TCYC1-F/PPGK1-CYP736A167-TADH1-PTEF1-SaCPR2-TCYC1-R)，以模块5为模板克隆PTDH3-SanSynF441V-TENO2片段(引物：pSZ13-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-F/pSZ13-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-R)，依次将模块11、模块6和PTDH3-SanSynF441V-TENO2构建到pCFB2988上，构建载体pSZ-4；
(5)以pSP-GM2-CYP736A167-SaCPR2载体为模板克隆PPGK1-CYP736A167-TADH1片段(引物：PPGK1-CYP736A167-TADH1-F/PPGK1-CYP736A167-TADH1-R)，依次将模块12，模块5和PPGK1-CYP736A167-TADH1构建到载体pCFB2988载体上，构建载体pSZ-5；
(6)以pSZ-5载体为模板克隆PTDH3-SanSynF441V-TENO2-PPGK1-CYP736A167-TADH1片段(引物：PTDH3-SanSynF441V-TENO2-PPGK1-CYP736A167-TADH1-F/PTDH3-SanSynF441V-TENO2-PPGK1-CYP736A167-TADH1-R)，依次将模块12、模块7和PTDH3-SanSynF441V-TENO2-PPGK1-CYP736A167-TADH1连接到pCFB2988载体上，构建载体pSZ-6。
实施例4：模块化构建工程酵母菌(以SanSynF441V突变体为例，其它突变体构建方法如本实施例所述)
(1)以pSZ-1载体为模板扩增DNA整合片段DPP1up-TRP1-PTEF2-UPC2-1-TFBA1-PTPI1-IDI1-TPGK1-DPP1down，扩增引物为DPP1-F/DPP1-R。将上述整合片段用超级酵母转化试剂盒转化酿酒酵母M-2，整合位点为DPP1，用SD-HIS平板培养基进行筛选，得到菌株M-3。其中，SD-TRP平板培养基的制备方法为：YNB培养基6.7g/L，色氨酸(TRP)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；其中，色氨酸(TRP)缺陷氨基酸(100×)配方如下：尿嘧啶0.12g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，缬氨酸0.9g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，酪氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，谷氨酸0.6g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，丝氨酸2.25g，苯丙氨酸0.3g，组氨酸0.12g，用ddH2O定容到57mL。
(2)以pSZ-2为模板扩增LPP1up-HIS3-PENO2-ALD6-TTDH2-PPDC1-ADH2-TADH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1-LPP1down，扩增引物为LPP1-F/LPP1-R。将上述整合片段转化M-3菌株，整合位点为LPP1,用色氨酸-组氨酸(SD-TRP-HIS)平板培养基进行筛选，得到菌株M-4。其中，色氨酸-组氨酸(SD-TRP-HIS)平板培养基的制备方法为：YNB培养基6.7g/L，色氨酸-组氨酸(TRP-HIS)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；其中，所述的色氨酸-组氨酸(TRP-HIS)缺陷氨基酸(100×)配方如下：尿嘧啶0.12g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，缬氨酸0.9g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，酪氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，谷氨酸0.6g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，丝氨酸2.25g，苯丙氨酸0.3g，用ddH2O定容到57mL。
(3)以pSZ-3为模板扩增PERG9up-KILEU2-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-PHXT1-PERG9down整合片段，扩增引物为PERG9-F/PERG9-R。将上述整合片段转化M-4菌株，整合位点为PERG9,用SD-TRP-HIS-LEU培养基平板进行筛选，得到菌株M-5。其中，SD-TRP-HIS-LEU平板培养基的制备方法为：YNB培养基6.7g/L，色氨酸-组氨酸-亮氨酸(TRP-HIS-LEU)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；其中，色氨酸-组氨酸-亮氨酸(TRP-HIS-LEU)缺陷氨基酸(100×)配方如下：尿嘧啶0.12g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，缬氨酸0.9g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，酪氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g，丝氨酸2.25g，苯丙氨酸0.3g，用ddH2O定容到57mL。
(4)以pSZ-4为模板扩增MET17up-URA3-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-PPGK1-CYP736A167-TADH1-PTEF1-SaCPR2-TCYC1-MET17down整合片段，扩增引物为MET17-F/MET17-R。将上述整合片段转化M-5菌株，整合位点为MET17，用SD-TRP-HIS-LEU-URA平板培养基进行筛选，得到菌株M-6。其中，SD-TRP-HIS-LEU-URA平板培养基的制备方法为：YNB培养基6.7g/L，色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶(TRP-HIS-LEU-URA)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；其中，SD-TRP-HIS-LEU-URA(色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶)缺陷氨基酸(100×)的配方为：缬氨酸0.9g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，酪氨酸0.18g，谷氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，丝氨酸2.25g，苯丙氨酸0.3g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，用ddH2O定容到57mL。
(5)以载体pSZ-5为模板扩增
ROX1up-MET17-PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-PPGK1-CYP736A167-TADH1-ROX1down整合片段，扩增引物为ROX1-F/ROX1-R。转化M-6菌株，整合位点为ROX1，用SD-TRP-HIS-LEU-URA-MET平板培养基进行筛选得到SZ-1菌株。其中，SD-TRP-HIS-LEU-URA-MET平板培养基的制备方法为：YNB培养基6.7g/L，TRP-HIS-LEU-URA-MET(色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶-甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；其中，TRP-HIS-LEU-URA-MET(色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶-甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100×)配方如下：缬氨酸0.9g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，酪氨酸0.18g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，用ddH2O定容到57mL。
(6)以载体pSZ-6模板扩增ROX1up-MET17-PTDH3-SanSynF441V-TENO2-PPGK1-CYP736A167-TADH1-PFBA1-CYP736A167-TPGI1-ROX1down整合片段，扩增引物为ROX1-F/ROX1-R。转化M-6菌株，整合位点为ROX1，用SD-TRP-HIS-LEU-URA-MET平板培养基进行筛选得到SZ-2菌株。其中，SD-TRP-HIS-LEU-URA-MET平板培养基的制备方法为：YNB培养基6.7g/L，TRP-HIS-LEU-URA-MET(色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶-甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；其中，TRP-HIS-LEU-URA-MET(色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶-甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100×)配方如下：缬氨酸0.9g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，酪氨酸0.18g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，用ddH2O定容到57mL。
实施例5：酵母菌株SZ-1、SZ-2发酵生产檀香烯和檀香醇
1、SZ-1、SZ-2菌株发酵培养
(1)分别挑选实施例5得到的菌株SZ-1、SZ-2的单菌落于装有5mL SD-URA-LEU-TRP-MET-HIS培养基的试管中，在摇床中培养24h，温度设置为30℃转速220～250rpm，分别得到SZ-1、SZ-2菌液。
(2)将步骤(1)得到的SZ-1、SZ-2菌液分别接到四个含有50mL SD-TRP-HIS-LEU-URA-MET培养基的250mL摇瓶中，在220～250rpm，30℃条件下培养24h。
其中，所述的SD-TRP-HIS-LEU-URA-MET培养基配置方法为：YNB 6.7g/L，TRP-HIS-LEU-URA-MET(色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶-甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100×)10mL/L，葡萄糖20g/L。所述的TRP-HIS-LEU-URA-MET(色氨酸-组氨酸-亮氨酸-尿嘧啶-甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100×)配方如下：缬氨酸0.9g，腺嘌呤硫酸盐0.25g，酪氨酸0.18g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，苏氨酸1.2g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，用ddH2O定容到57mL。
(3)将上述SZ-1、SZ-2的各4瓶菌液共200mL分别接到包含1.8L发酵培养基的5L的发酵罐中，温度控制在30℃，用氨水控制pH维持在5.5，溶氧值控制40％，转速在250～800rpm，通气量2L/min。
(4)待溶氧值开始上升时启动补料系统进行补料(即加入补料培养基)，补料速率为2-14mL/h。
发酵培养基包括如下组分：(NH4)2SO4 15g/L，KH2PO4 8g/L，MgSO4 3g/L，ZnSO4.7H2O0.72g/L，维生素溶液12ml/L，微量金属溶液10ml/L，葡萄糖25g/L；
所述的补料培养基包括如下组分：微量金属溶液10mL/L，维生素溶液12ml/L，KH2PO4 9g/L，无水MgSO4 2.5g/L，K2SO4 3.5g/L，Na2SO4 0.28g/L，葡萄糖150g/L，乙醇350g/L；
所述的维生素溶液包括如下组分：生物素0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺1g/L，盐酸吡哆醇1g/L，对氨基苯酸0.2g/L；
所述的微量金属溶液包括如下组分：EDTA 15g/L，ZnSO4.7H2O 10.2g/L，MnCl2.4H2O 0.5g/L，无水CuSO4 0.5g/L，CoCl2.6H2O 0.86g/L，Na2MoO4.2H2O 0.56g/L，CaCl2.2H2O 3.84g/L，FeSO4.7H2O 5.12g/L。
2、产物的萃取与检测
分别取20mL菌株SZ-1和SZ-2在24h、48h、72h、96h、120h、144h的发酵液，加入40mL的乙酸乙酯超声1h，静置5d，分离出乙酸乙酯有机相；取500μL有机相进行GC-MS检测；其中，所用的仪器为安捷伦气质联用仪7890B-5977B。检测方法：进样体积1μL，溶剂延时10min，载气为氦气，流速为1mL/min。色谱柱：HP-5MS。色谱条件：50℃保持3min，20℃/min速率升温到70℃并保持1min，3℃/min升温到160℃，20℃/min升温至300℃。
菌株SZ-1和SZ-2发酵培养六天发酵产物色谱图如图2所示；菌株SZ-1和SZ-2补料分批发酵第六天檀香烯和檀香醇产量示意图如图3所示。
从图3中可以看出，将得到的酿酒酵母工程菌株SZ-1进行6天发酵培养，Z-α-檀香醇、Z-β-檀香醇、Z-α-香柠檬醇、Z-epi-β-檀香醇、α-檀香烯、β-檀香烯、α-香柠檬烯和epi-β-檀香烯的总产量可以达到1.9g/L。将酿酒酵母工程菌株SZ-2进行6天发酵培养，可产生上述八种产物的总产量可达0.7g/L，Z-α-檀香醇和Z-β-檀香醇分别占总产物的43.4％和22％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种檀香烯合成酶突变体、工程菌及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 551
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> 野生型檀香烯合成酶SanSyn的氨基酸序列
<400> 1
Met Ser Thr Gln Gln Val Ser Ser Glu Asn Ile Val Arg Asn Ala Ala
1 5 10 15
Asn Phe His Pro Asn Ile Trp Gly Asn His Phe Leu Thr Cys Pro Ser
20 25 30
Gln Thr Ile Asp Ser Trp Thr Gln Gln His His Lys Glu Leu Lys Glu
35 40 45
Glu Val Arg Lys Met Met Val Ser Asp Ala Asn Lys Pro Ala Gln Arg
50 55 60
Leu Arg Leu Ile Asp Thr Val Gln Arg Leu Gly Val Ala Tyr His Phe
65 70 75 80
Glu Lys Glu Ile Asp Asp Ala Leu Glu Lys Ile Gly His Asp Pro Phe
85 90 95
Asp Asp Lys Asp Asp Leu Tyr Ile Val Ser Leu Cys Phe Arg Leu Leu
100 105 110
Arg Gln His Gly Ile Lys Ile Ser Cys Asp Val Phe Glu Lys Phe Lys
115 120 125
Asp Asp Asp Gly Lys Phe Lys Ala Ser Leu Met Asn Asp Val Gln Gly
130 135 140
Met Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ala His Leu Ala Ile His Gly Glu Asp
145 150 155 160
Ile Leu Asp Glu Ala Ile Val Phe Thr Thr Thr His Leu Lys Ser Thr
165 170 175
Val Ser Asn Ser Pro Val Asn Ser Thr Phe Ala Glu Gln Ile Arg His
180 185 190
Ser Leu Arg Val Pro Leu Arg Lys Ala Val Pro Arg Leu Glu Ser Arg
195 200 205
Tyr Phe Leu Asp Ile Tyr Ser Arg Asp Asp Leu His Asp Lys Thr Leu
210 215 220
Leu Asn Phe Ala Lys Leu Asp Phe Asn Ile Leu Gln Ala Met His Gln
225 230 235 240
Lys Glu Ala Ser Glu Met Thr Arg Trp Trp Arg Asp Phe Asp Phe Leu
245 250 255
Lys Lys Leu Pro Tyr Ile Arg Asp Arg Val Val Glu Leu Tyr Phe Trp
260 265 270
Ile Leu Val Gly Val Ser Tyr Gln Pro Lys Phe Ser Thr Gly Arg Ile
275 280 285
Phe Leu Ser Lys Ile Ile Cys Leu Glu Thr Leu Val Asp Asp Thr Phe
290 295 300
Asp Ala Tyr Gly Thr Phe Asp Glu Leu Ala Ile Phe Thr Glu Ala Val
305 310 315 320
Thr Arg Trp Asp Leu Gly His Arg Asp Ala Leu Pro Glu Tyr Met Lys
325 330 335
Phe Ile Phe Lys Thr Leu Ile Asp Val Tyr Ser Glu Ala Glu Gln Glu
340 345 350
Leu Ala Lys Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Ile His Tyr Ala Ile Arg Ser
355 360 365
Phe Gln Glu Leu Val Met Lys Tyr Phe Cys Glu Ala Lys Trp Leu Asn
370 375 380
Lys Gly Tyr Val Pro Ser Leu Asp Asp Tyr Lys Ser Val Ser Leu Arg
385 390 395 400
Ser Ile Gly Phe Leu Pro Ile Ala Val Ala Ser Phe Val Phe Met Gly
405 410 415
Asp Ile Ala Thr Lys Glu Val Phe Glu Trp Glu Met Asn Asn Pro Lys
420 425 430
Ile Ile Ile Ala Ala Glu Thr Ile Phe Arg Phe Leu Asp Asp Ile Ala
435 440 445
Gly His Arg Phe Glu Gln Lys Arg Glu His Ser Pro Ser Ala Ile Glu
450 455 460
Cys Tyr Lys Asn Gln His Gly Val Ser Glu Glu Glu Ala Val Lys Ala
465 470 475 480
Leu Ser Leu Glu Val Ala Asn Ser Trp Lys Asp Ile Asn Glu Glu Leu
485 490 495
Leu Leu Asn Pro Met Ala Ile Pro Leu Pro Leu Leu Gln Val Ile Leu
500 505 510
Asp Leu Ser Arg Ser Ala Asp Phe Met Tyr Gly Asn Ala Gln Asp Arg
515 520 525
Phe Thr His Ser Thr Met Met Lys Asp Gln Val Asp Leu Val Leu Lys
530 535 540
Asp Pro Val Lys Leu Asp Asp
545 550
<210> 2
Met Asp Ser Ser Thr Ala Thr Ala Met Thr Ala Pro Phe Ile Asp Pro
1 5 10 15
Thr Asp His Val Asn Leu Lys Thr Asp Thr Asp Ala Ser Glu Asn Arg
20 25 30
Arg Met Gly Asn Tyr Lys Pro Ser Ile Trp Asn Tyr Asp Phe Leu Gln
35 40 45
Ser Leu Ala Thr His His Asn Ile Val Glu Glu Arg His Leu Lys Leu
50 55 60
Ala Glu Lys Leu Lys Gly Gln Val Lys Phe Met Phe Gly Ala Pro Met
65 70 75 80
Glu Pro Leu Ala Lys Leu Glu Leu Val Asp Val Val Gln Arg Leu Gly
85 90 95
Leu Asn His Leu Phe Glu Thr Glu Ile Lys Glu Ala Leu Phe Ser Ile
100 105 110
Tyr Lys Asp Gly Ser Asn Gly Trp Trp Phe Gly His Leu His Ala Thr
115 120 125
Ser Leu Arg Phe Arg Leu Leu Arg Gln Cys Gly Leu Phe Ile Pro Gln
130 135 140
Asp Val Phe Lys Thr Phe Gln Asn Lys Thr Gly Glu Phe Asp Met Lys
145 150 155 160
Leu Cys Asp Asn Val Lys Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ser Tyr
165 170 175
Leu Gly Trp Lys Gly Glu Asn Ile Leu Asp Glu Ala Lys Ala Phe Thr
180 185 190
Thr Lys Cys Leu Lys Ser Ala Trp Glu Asn Ile Ser Glu Lys Trp Leu
195 200 205
Ala Lys Arg Val Lys His Ala Leu Ala Leu Pro Leu His Trp Arg Val
210 215 220
Pro Arg Ile Glu Ala Arg Trp Phe Ile Glu Ala Tyr Glu Gln Glu Ala
225 230 235 240
Asn Met Asn Pro Thr Leu Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn Met
245 250 255
Val Gln Ser Ile His Gln Lys Glu Ile Gly Glu Leu Ala Arg Trp Trp
260 265 270
Val Thr Thr Gly Leu Asp Lys Leu Ala Phe Ala Arg Asn Asn Leu Leu
275 280 285
Gln Ser Tyr Met Trp Ser Cys Ala Ile Ala Ser Asp Pro Lys Phe Lys
290 295 300
Leu Ala Arg Glu Thr Ile Val Glu Ile Gly Ser Val Leu Thr Val Val
305 310 315 320
Asp Asp Gly Tyr Asp Val Tyr Gly Ser Ile Asp Glu Leu Asp Leu Tyr
325 330 335
Thr Ser Ser Val Glu Arg Trp Ser Cys Val Glu Ile Asp Lys Leu Pro
340 345 350
Asn Thr Leu Lys Leu Ile Phe Met Ser Met Phe Asn Lys Thr Asn Glu
355 360 365
Val Gly Leu Arg Val Gln His Glu Arg Gly Tyr Asn Ser Ile Pro Thr
370 375 380
Phe Ile Lys Ala Trp Val Glu Gln Cys Lys Ser Tyr Gln Lys Glu Ala
385 390 395 400
Arg Trp Phe His Gly Gly His Thr Pro Pro Leu Glu Glu Tyr Ser Leu
405 410 415
Asn Gly Leu Val Ser Ile Gly Phe Pro Leu Leu Leu Ile Thr Gly Tyr
420 425 430
Val Ala Ile Ala Glu Asn Glu Ala Ala Leu Asp Lys Val His Pro Leu
435 440 445
Pro Asp Leu Leu His Tyr Ser Ser Leu Leu Ser Arg Leu Ile Asn Asp
450 455 460
Ile Gly Thr Ser Pro Asp Glu Met Ala Arg Gly Asp Asn Leu Lys Ser
465 470 475 480
Ile His Cys Tyr Met Asn Glu Thr Gly Ala Ser Glu Glu Val Ala Arg
485 490 495
Glu His Ile Lys Gly Val Ile Glu Glu Asn Trp Lys Ile Leu Asn Gln
500 505 510
Cys Cys Phe Asp Gln Ser Gln Phe Gln Glu Pro Phe Ile Thr Phe Asn
515 520 525
Leu Asn Ser Val Arg Gly Ser His Phe Phe Tyr Glu Phe Gly Asp Gly
530 535 540
Phe Gly Val Thr Asp Ser Trp Thr Lys Val Asp Met Lys Ser Val Leu
545 550 555 560
Ile Asp Pro Ile Pro Leu Gly Glu Glu
565
<210> 3
atgtcaacac aacaagtttc atctgaaaat attgttagaa atgctgctaa ttttcatcca 60
aatatttggg gtaatcattt tttaacttgt ccatctcaaa ctattgattc ttggactcaa 120
caacatcata aagaattgaa agaagaagtt agaaaaatga tggtttctga tgctaataaa 180
ccagcacaaa gattaagatt gattgatact gttcaaagat tgggtgttgc ttatcatttt 240
gaaaaagaaa ttgatgatgc attagaaaaa attggtcatg atccatttga tgataaagat 300
gatttatata ttgtttcttt atgttttaga ttattaagac aacatggtat taaaatttct 360
tgtgatgttt ttgaaaaatt taaagatgat gatggtaaat ttaaagctag tttaatgaat 420
gatgttcaag gtatgttatc tttgtatgaa gcagctcatt tggctattca tggtgaagat 480
attttggatg aagctattgt ttttactaca actcatttaa aatctactgt ttctaattct 540
ccagttaatt ctacttttgc agaacaaatt agacattctt taagagttcc attgagaaaa 600
gctgttccaa gattagaatc tcgttatttt ttggatattt attctcgtga tgatttacat 660
gataaaactt tattaaattt tgctaaatta gattttaata ttttacaagc tatgcatcaa 720
aaagaagcta gtgaaatgac tagatggtgg agagattttg attttttgaa aaaattgcca 780
tatattagag atagagttgt tgaattatat ttttggattt tagttggtgt ttcttatcaa 840
ccaaaatttt ctactggtag aattttttta tctaaaatta tttgtttaga aactttagtt 900
gatgatacat ttgatgctta tggtacattt gatgaattgg ctatttttac agaagctgtt 960
acaagatggg atttaggtca tagagatgca ttgccagaat atatgaaatt tatttttaaa 1020
acattaattg atgtttattc tgaagctgaa caagaattag ctaaagaagg tagatcatat 1080
tctattcatt atgctattag atcatttcaa gaattagtta tgaaatattt ttgtgaagct 1140
aaatggttaa ataaaggtta tgttccatca ttggatgatt ataaatctgt ttcattaaga 1200
tcaatcggtt ttttaccaat cgctgttgct tcttttgttt ttatgggtga tattgcaaca 1260
aaagaagttt ttgaatggga aatgaataat ccaaaaatta ttattgcagc agaaacaatt 1320
tttagatttt tggatgatat tgcaggtcat agatttgaac aaaaaagaga acattcacca 1380
tcagcaatcg aatgttataa aaatcaacat ggtgtttcag aagaagaagc agttaaagca 1440
ttgtcattgg aagttgcaaa ttcatggaaa gatattaatg aagaattgtt gttgaatcca 1500
atggcaattc cattgccatt gttgcaagtt attttggatt tgtcaagatc agcagatttt 1560
atgtatggta atgcacaaga tagatttaca cattcaacaa tgatgaaaga tcaagttgat 1620
ttggttttga aagatccagt taaattggat gattaa 1656
<210> 4
atggattctt ctactgctac tgctatgact gctcctttta ttgatccaac cgatcacgtt 60
aacttgaaaa ctgatactga tgcctccgaa aacagaagaa tgggtaatta caaaccctcc 120
atctggaact acgatttctt gcaatctttg gctacccatc acaacatcgt tgaagaaaga 180
catttgaagt tggccgaaaa gttgaagggt caagttaagt ttatgttcgg tgctccaatg 240
gaaccattgg ctaaattgga attggttgat gttgtgcaga gattgggttt gaaccatttg 300
ttcgaaaccg aaatcaaaga ggccttgttc tctatctaca aggatggttc taatggttgg 360
tggtttggtc acttgcatgc tacatctttg agattcagac tgttgagaca atgcggtttg 420
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caccaaaaag aaattggtga attggcaaga tggtgggtta ctactggttt ggataagttg 840
gcttttgcca gaaacaactt gttgcaatcc tatatgtggt cttgcgctat tgcttctgat 900
ccaaagttta agttggccag agaaaccatt gtggaaatcg gttctgtttt gaccgttgtt 960
gatgatggtt atgatgtcta cggttccata gatgaattgg acttgtacac ctcttctgtc 1020
gaaagatggt cttgtgtcga aattgataag ttgccaaaca ccttgaagct gatcttcatg 1080
tctatgttca acaagaccaa cgaagttggt ttgagagttc aacacgaaag aggttacaac 1140
tctattccaa cctttattaa ggcctgggtt gaacaatgca agtcctatca aaaagaagct 1200
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tccattggtt tccctttgtt gttgattaca ggttacgttg ctattgctga aaacgaagct 1320
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ggtgtcatcg aagaaaactg gaagattttg aatcaatgct gcttcgacca atcgcaattt 1560
caagaaccat tcatcacctt caacctgaac tctgttagag gttctcattt cttctacgaa 1620
ttcggtgatg gtttcggtgt tactgattct tggacaaaag ttgacatgaa gtccgttttg 1680
atcgacccaa ttccattggg tgaagaatga 1710
<210> 5
atgtcacaaa ctcataaaca tgctattcca gcaaacatcg ctgatagatg tttgattaat 60
ccagaacaat acgaaactaa gtacaagcaa tctattaatg atccagatac attttggggt 120
gaacaaggta aaatcttgga ttggatcact ccataccaaa aggttaaaaa tacatcattt 180
gctcctggta atgtttctat taaatggtac gaagatggta ctttgaattt ggctgcaaac 240
tgtttggata gacatttgca agaaaatggt gacagaactg caattatttg ggaaggtgac 300
gatacatcac aatctaagca tatctcttac agagaattgc atagagatgt ttgtagattc 360
gcaaacacat tgttggattt gggtattaag aaaggtgacg ttgttgctat ctatatgcca 420
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agattggtta ttacagcaga tgaaggtgtt agagctggta gatcaatccc attgaagaaa 600
aatgttgatg atgctttgaa aaatccaaac gttacttcag ttgaacatgt tatcgttttg 660
aaaagaacag gttctgatat tgattggcaa gaaggtagag atttgtggtg gagagatttg 720
attgaaaaag cttctccaga acatcaacca gaagcaatga acgctgaaga tccattgttt 780
attttgtaca cttcaggttc tacaggtaaa ccaaaaggtg ttttacatac tacaggtggt 840
tatttggttt acgctgcaac tacttttaaa tacgttttcg attaccatcc aggtgacatc 900
tattggtgta ctgctgatat gggttgggtt acaggtcatt catatttgtt atacggtcca 960
ttagcatgtg gtgctactac attgatgttt gaaggtgttc caaattggcc aactccagct 1020
agaatgtgtc aagttgttga taagcatcaa gttaacatct tgtacactgc accaacagct 1080
attagagcat tgatggctga aggtgacaaa gcaattgaag gtacagatag atcatctttg 1140
agaattttag gttctgttgg tgaaccaatt aatccagaag cttgggaatg gtactggaag 1200
aaaattggta aagaaaagtg tccagttgtt gatacttggt ggcaaactga aacaggtggt 1260
tttatgatta caccattgcc aggtgctatt gaattaaaag caggttcagc tactagacca 1320
tttttcggtg ttcaaccagc attagttgat aatgaaggtc atccacaaga aggtgctact 1380
gagggtaatt tggttattac agattcttgg ccaggtcaag caagaacatt gtttggtgac 1440
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ggtgctagaa gagatgaaga tggttattac tggatcactg gtagagttga tgatgttttg 1560
aacgtttcag gtcatagatt gggtacagca gaaattgaat ctgcattggt tgctcatcca 1620
aaaattgcag aagctgcagt tgttggtatt ccacatgcta ttaaaggtca agcaatctat 1680
gcttacgtta ctttaaatca tggtgaagaa ccatcaccag aattgtatgc agaagttaga 1740
aactgggtta gaaaggaaat tggtccattg gctacaccag atgttttaca ttggactgat 1800
tcattgccaa agacaagatc tggtaaaatc atgagaagaa tcttgagaaa gattgctgca 1860
ggtgacactt caaatttggg tgacacttct acattggctg atccaggtgt tgttgaaaaa 1920
ccattggaag aaaaacaagc tattgcaatg ccatcttaa 1959
<210> 6
ccaaaacgtt gaatactacg ctcaacgtgc tcaaagacca ggaaccttga ttatcaccct 60
ttccctctcc acaatctggg ggttacgaca atgctccagg tatctgggga accttgatta 120
tcactgagtt ttagagctat gctgttttga atggtcccaa aacgctgtgt attatggtca 180
gcgtgctcaa agacctggta ccatgatcat caccgtttat ttcccctcaa gccggcggct 240
atgacaacgc ccctgggatt tggggtacca tgatcatcac ggagttttag ag 292
<210> 7
ccaaaaccaa caagatggcc aaatcatgaa aattattatc gcagttccga atactataca 60
tccagtgcat gattatattt cagtattaca agaattgaaa ctgagtggca gttccgaata 120
ctattcagtt ttagagctat gctgttttga atggtcccaa aactcgaatt gattagccct 180
gtaatcatac ctctgggtaa tccgaagagg cctattgatt tgtttaccag gtaaggatac 240
tgatgggttt gaaacgtgga aaagtaatcc gaagaggcct aatgttttag ag 292
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aacgacatta ctatatatat aatataggaa gcatttaata gacagcatcg taatatatgt 60
gtactttgca gttatgacgc cagatggcag tagtggaaga tattctttat tgaaaaatag 120
cttgtcacct tacgtacaat cttgatccgg agcttttctt tttttgccga ttaagaatta 180
attcggtcga aaaaagaaaa ggagagggcc aagagggagg gcattggtga ctattgagca 240
cgtgagtata cgtgattaag cacacaaagg cagcttggag tatgtctgtt attaatttca 300
caggtagttc tggtccattg gtgaaagttt gcggcttgca gagcacagag gccgcagaat 360
gtgctctaga ttccgatgct gacttgctgg gtattatatg tgtgcccaat agaaagagaa 420
caattgaccc ggttattgca aggaaaattt caagtcttgt aaaagcatat aaaaatagtt 480
caggcactcc gaaatacttg gttggcgtgt ttcgtaatca acctaaggag gatgttttgg 540
ctctggtcaa tgattacggc attgatatcg tccaactgca tggagatgag tcgtggcaag 600
aataccaaga gttcctcggt ttgccagtta ttaaaagact cgtatttcca aaagactgca 660
acatactact cagtgcagct tcacagaaac ctcattcgtt tattcccttg tttgattcag 720
aagcaggtgg gacaggtgaa cttttggatt ggaactcgat ttctgactgg gttggaaggc 780
aagagagccc cgaaagctta cattttatgt tagctggtgg actgacgcca gaaaatgttg 840
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<210> 9
cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accataaatt cccgttttaa 60
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gagtgcattg gtgacttaca catagacgac catcacacca ctgaagactg cgggattgct 660
ctcggtcaag cttttaaaga ggccctactg gcgcgtggag taaaaaggtt tggatcagga 720
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cgaggcaaga atgatcatca ccgtagtgag agtgcgttca aggctcttgc ggttgccata 960
agagaagcca cctcgcccaa tggtaccaac gatgttccct ccaccaaagg tgttcttatg 1020
tagtgacacc gattatttaa agctgcagca tacgatatat atacatgtgt atatatgtat 1080
acctatgaat gtcagtaagt atgtatacga acagtatgat actgaagatg acaaggtaat 1140
gcatcattct atacgtgtca ttctgaacga ggcgcgcttt ccttttttct ttttgctttt 1200
tctttttttt tctcttgaac tcgacggatc tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 1260
aaggagaaaa taccgcatca 1280
<210> 10
agctcgctgt gaagatccca gcaaaggctt acaaagtgtt atctcttttg agacttgttg 60
agttgaacac tggtgttttc atcaaactta ccaaggacgt gtacccattg ttgaaacttg 120
tatcaccata tattgttatc ggacaacctt cacttgcatc tatccgttct ttaatccaaa 180
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cattcaaatt gaacagagaa gtcagtggat tcggtgccat ctcccgtttg aataaactga 420
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tccaagtaga tatcgactca atgatttcca agttgaattg attaactata aaaggaaaat 540
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tctattcact actgcattta gttatgttta acatttgata tagcagacta ccgccaggca 660
caatatattc cccttccctc ttgccattcg ctgtacttgt ggtggattcc aattcagcgc 720
agtcacgtgc tagtaatcac cgcatttttt tcttttcctt tcaggctaaa accggttccg 780
ggcctgatcc ctgcactcat tttctaacgg aaaaccttca gaagcataac tacccattcc 840
agtttagagt catgacaggt tcaacatcag atgcttcata tacttttata tattgaatta 900
tataaatata tctatgtact ctaagtaagt acatctgctt taacgcattc ctacatttgc 960
ttcgatttat ttttattgtt gatacctatt tgaagaagta aaaagtatcc cacactacac 1020
agattatacc atgtctaaga atatcgttgt cctaccgggt gatcacgtcg gtaaagaagt 1080
tactgacgaa gctattaagg tcttgaatgc cattgctgaa gtccgtccag aaattaagtt 1140
caatttccaa catcacttga tcgggggtgc tgccatcgat gccactggca ctcctttacc 1200
agatgaagct ctagaagcct ctaagaaagc cgatgctgtc ttactaggtg ctgttggtgg 1260
tccaaaatgg ggtacgggcg cagttagacc agaacaaggt ctattgaaga tcagaaagga 1320
attgggtcta tacgccaact taagaccatg taactttgct tctgattctt tactagatct 1380
ttctcctttg aagcctgaat atgcaaaggg taccgatttc gtcgtcgtta gagaattggt 1440
tggtggtatc tactttggtg aaagaaaaga agatgaaggt gacggagttg cttgggactc 1500
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gcaacaaaac ccaccattac caatctggtc acttgacaag gctaacgtgc ttgcctcttc 1620
cagattgtgg agaaagactg ttgaagaaac catcaagact gagttcccac aattaactgt 1680
tcagcaccaa ttgatcgact ctgctgctat gattttggtt aaatcaccaa ctaagctaaa 1740
cggtgttgtt attaccaaca acatgtttgg tgatattatc tccgatgaag cctctgttat 1800
tccaggttct ttgggtttat taccttctgc atctctagct tccctacctg acactaacaa 1860
ggcattcggt ttgtacgaac catgtcatgg ttctgcccca gatttaccag caaacaaggt 1920
taacccaatt gctaccatct tatctgcagc tatgatgttg aagttatcct tggatttggt 1980
tgaagaaggt agggctcttg aagaagctgt tagaaatgtc ttggatgcag gtgtcagaac 2040
cggtgacctt ggtggttcta actctaccac tgaggttggc gatgctatcg ccaaggctgt 2100
caaggaaatc ttggcttaat tatacaggaa acttaataga acaaatcaca tatttaatct 2160
aatagccacc tgcattggca cggtgcaaca ctcacttcaa cttcatctta caaaagatca 2220
cgtgatctgt tgtattggga tc 2242
<210> 11
gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 60
tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta 120
ctgagagtgc accataccac agcttttcaa ttcaattcat catttttttt ttattctttt 180
ttttgatttc ggtttctttg aaattttttt gattcggtaa tctccgaaca gaaggaagaa 240
cgaaggaagg agcacagact tagattggta tatatacgca tatgtagtgt tgaagaaaca 300
tgaaattgcc cagtattctt aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga 360
taaatcatgt cgaaagctac atataaggaa cgtgctgcta ctcatcctag tcctgttgct 420
gccaagctat ttaatatcat gcacgaaaag caaacaaact tgtgtgcttc attggatgtt 480
cgtaccacca aggaattact ggagttagtt gaagcattag gtcccaaaat ttgtttacta 540
aaaacacatg tggatatctt gactgatttt tccatggagg gcacagttaa gccgctaaag 600
gcattatccg ccaagtacaa ttttttactc ttcgaagaca gaaaatttgc tgacattggt 660
aatacagtca aattgcagta ctctgcgggt gtatacagaa tagcagaatg ggcagacatt 720
acgaatgcac acggtgtggt gggcccaggt attgttagcg gtttgaagca ggcggcagaa 780
gaagtaacaa aggaacctag aggccttttg atgttagcag aattgtcatg caagggctcc 840
ctatctactg gagaatatac taagggtact gttgacattg cgaagagcga caaagatttt 900
gttatcggct ttattgctca aagagacatg ggtggaagag atgaaggtta cgattggttg 960
attatgacac ccggtgtggg tttagatgac aagggagacg cattgggtca acagtataga 1020
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gcaaagggaa gggatgctaa ggtagagggt gaacgttaca gaaaagcagg ctgggaagca 1140
tatttgagaa gatgcggcca gcaaaactaa aaaactgtat tataagtaaa tgcatgtata 1200
ctaaactcac aaattagagc ttcaatttaa ttatatcagt tattacccta tgcggtgtga 1260
aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg 1300
<210> 12
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atacagggtc gtcagataca tagatacaat tctattaccc ccatccatac aatgccatct 360
catttcgata ctgttcaact acacgccggc caagagaacc ctggtgacaa tgctcacaga 420
tccagagctg taccaattta cgccaccact tcttatgttt tcgaaaactc taagcatggt 480
tcgcaattgt ttggtctaga agttccaggt tacgtctatt cccgtttcca aaacccaacc 540
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tcctccggtc aagccgctca aacccttgcc atccaaggtt tggcacacac tggtgacaac 660
atcgtttcca cttcttactt atacggtggt acttataacc agttcaaaat ctcgttcaaa 720
agatttggta tcgaggctag atttgttgaa ggtgacaatc cagaagaatt cgaaaaggtc 780
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ccggattttg aaaaaattgt tgcaattgct cacaaacacg gtattccagt tgtcgttgac 900
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ttgctactac aaggtgttga aacattatct ttgagagctg aaagacacgg tgaaaatgca 1260
ttgaagttag ccaaatggtt agaacaatcc ccatacgtat cttgggtttc ataccctggt 1320
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gtcttatctt tcggtgtaaa agacttacca aatgccgaca aggaaactga cccattcaaa 1440
ctttctggtg ctcaagttgt tgacaattta aagcttgcct ctaacttggc caatgttggt 1500
gatgccaaga ccttagtcat tgctccatac ttcactaccc acaaacaatt aaatgacaaa 1560
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attgatgaca ttattgcaga cttccagcaa tcttttgaaa ctgttttcgc tggccaaaaa 1680
ccatgagtgt gcgtaatgag ttgtaaaatt atgtataaac ctactttctc tcacaagtac 1740
tatactttta taaaacgaac tttattgaaa tgaatatcct ttttttccct tgttacatgt 1800
cgtgactcgt actttgaacc taaattgttc taacatcaaa gaacagtgtt aattcgcagt 1860
cgagaagaaa aatatggtga acaagactca tctacttcat gagactactt tacgcctcct 1920
ataaagctgt cacactggat aaatttattg taggaccaag ttacaaaaga ggatgatgga 1980
ggtttc 1986

Claims (10)

1.一种檀香烯合成酶突变体，其特征在于，为檀香烯合成酶SanSyn突变体和SaSSy突变体中的至少一种；其中，檀香烯合成酶SanSyn突变体的氨基酸序列选自下列突变序列中的任一种：
SanSynE297L突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的297位谷氨酸突变为亮氨酸得到，具体是SEQ ID NO.1的第297位氨基酸密码子由SEQ ID NO.3中的GAA突变为TTA；
SanSynF441V突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的441位苯丙氨酸突变为缬氨酸得到，具体是SEQ ID NO.1的第441位氨基酸密码子由SEQ ID NO.3中的TTT突变为GTT；
檀香烯合成酶SaSSy突变体的氨基酸序列选自下列突变序列中的任一种：
SaSSyL317C突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的317位亮氨酸突变为半胱氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第317位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的CTC突变为TGC；
SaSSyL317I突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的317位亮氨酸突变为异亮氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第317位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的CTC突变为ATC；
SaSSyL317T突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的317位亮氨酸突变为苏氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第317位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的CTC突变为ACT；
SaSSyL317V突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的317位亮氨酸突变为缬氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第317位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的CTC突变为GTT；
SaSSyS459V突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的459位丝氨酸突变为缬氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第459位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的AGT突变为GTT；
SaSSyS459A突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的459位丝氨酸突变为丙氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第459位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的AGT突变为GCT；
SaSSyS459H突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的459位丝氨酸突变为组氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第459位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的AGT突变为CAC；
SaSSyS459I突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的459位丝氨酸突变为异亮氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第459位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的AGT突变为ATC；
SaSSyS459T突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的459位丝氨酸突变为苏氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第459位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的AGT突变为ACT；
SaSSyS535C突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的535位丝氨酸突变为半胱氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第535位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的TCT突变为TGC；
SaSSyS535T突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的535位丝氨酸突变为苏氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第535位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的TCT突变为ACT；
SaSSyF538W突变体，其氨基酸序列通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的538位苯丙氨酸突变为色氨酸得到，具体是SEQ ID NO.2的第538位氨基酸密码子由SEQ ID NO.4中的TTC突变为TGG。
2.编码权利要求1所述檀香烯合成酶突变体的基因。
3.包含权利要求2所述基因的重组表达载体或高产檀香烯的酿酒酵母工程菌。
4.一种高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌，具有如下特点：以酿酒酵母出发菌株，敲除OYE2、OYE3、ATF1、ATF2、LPP1、DPP1、ROX1基因，将酿酒酵母的ERG9基因内源性启动子替换成PHXT1启动子，过表达mSTS、ADH2、ALD6、SeACSL641P、IDI1、tHMG1、UPC2-1、CYP736A167和SaCPR2基因；其中：
IDI1、UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体DPP1位点；
ADH2、ALD6、SeACSL641P基因整合到酿酒酵母染色体LPP1位点；
mSTS、tHMG1基因整合到酿酒酵母染色体PERG9位点；
CYP736A167、SaCPR2、第二个拷贝的mSTS基因整合到酿酒酵母MET17位点；
第三个拷贝的mSTS基因整合到酿酒酵母染色体ROX1位点；
第二个拷贝的CYP736A167基因、第二个拷贝的tHMG1基因或第二、第三个拷贝的CYP736A167基因整合到酿酒酵母染色体ROX1位点；
mSTS基因的序列为权利要求1所述的檀香烯合成酶突变体的核苷酸序列，具体为檀香烯合成酶SanSyn突变体和SaSSy突变体的核苷酸序列中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌，其特征在于，
OYE2、OYE3基因的crRNA spacer核酸序列如SEQ ID NO.6所示；
ATF1、ATF2基因的crRNA spacer核酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.权利要求4或5所述高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)基因敲除：通过CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除OYE2、OYE3、ATF1、ATF2基因，其中所用的OYE2、OYE3 crRNA spacer的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；ATF1、ATF2 crRNAspacer的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；经过培养表达筛选，得到敲除OYE2、OYE3、ATF1、ATF2基因的菌株；
(2)模块构建：分别将ADH2、ALD6、SeACSL641P、IDI1、tHMG1、UPC2-1、CYP736A167、SaCPR2、mSTS和相应的启动子、终止子顺序连接得到对应的表达模块；
(3)菌株构建：将上述相应的基因模块整合到酿酒菌株对应的染色体位点上即得高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌；
其中：IDI1、UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体DPP1位点；
ADH2、ALD6、SeACSL641P基因整合到酿酒酵母染色体LPP1位点；
mSTS、tHMG1基因整合到酿酒酵母染色体PERG9位点；
CYP736A167、SaCPR2、第二个拷贝的mSTS基因整合到酿酒酵母MET17基因位点；
第三个拷贝的mSTS基因整合到酿酒酵母染色体ROX1位点
第二个拷贝的CYP736A167基因、第二个拷贝的tHMG1基因或第二、第三个拷贝的CYP736A167基因整合到酿酒酵母染色体ROX1位点。
7.根据权利要求6所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)基因敲除：
(a)重组质粒pCRCT-OYE2-OYE3转化酿酒酵母M，经培养筛选后即得敲除OYE2、OYE3基因的酵母菌株M-1；
(b)将重组质粒pCRCT-ATF1-ATF2转化酿酒酵母M-1菌株，经培养筛选后即得敲除OYE2、OYE3、ATF1、ATF2基因的酵母菌株M-2；
(2)模块的构建：
(a)将PTEF2、UPC2-1和TFBA1顺序连接，得到模块PTEF2-UPC2-1-TFBA1，命名为模块1；
(b)将PTPI1、IDI1和TPGK1顺序连接，得到模块PTPI1-IDI1-TPGK1，命名为模块2；
(c)将PENO2、ALD6、TTDH2和PPDC1顺序连接，得到模块PENO2-ALD6-TTDH2-PPDC1，命名为模块3；
(d)将ADH2、TADH2、PTEF1、SeACSL641P和TPGI1顺序连接，得到模块ADH2-TADH2-PTEF1-SeACSL641P-TPGI1，命名为模块4；
(e)将PTPI1、tHMG1、TPGK1、PTDH3、mSTS和TENO2顺序连接，得到模块PTPI1-tHMG1-TPGK1-PTDH3-mSTS-TENO2，命名为模块5；
(f)将PPGK1、CYP736A167、TADH1、PTEF1、SaCPR2和TCYC1顺序连接，得到模块PPGK1-CYP736A167-TADH1-PTEF1-SaCPR2-TCYC1，命名为模块6；
(g)将PFBA1、CYP736A167和TPGI1顺序连接，得到模块PFBA1-CYP736A167-TPGI1，命名为模块7；
(h)将LPP1up、HIS3和LPP1down顺序连接，得到模块LPP1up-HIS3-LPP1down，命名为模块8；
(i)将DPP1up、TRP1和DPP1down顺序连接，得到模块DPP1up-TRP1-DPP1down，命名为模块9；
(j)将PERG9up、KILEU2、PHXT1和PERG9down顺序连接，得到模块PERG9up-KILEU2-PHXT1-PERG9down，命名为模块10；
(k)将MET17up、URA3和MET17down顺序连接，得到模块MET17up-URA3-MET17down，命名为模块11；
(l)将ROX1up、MET17和ROX1down顺序连接，得到模块ROX1up-MET17-ROX1down，命名为模块12；
(3)构建菌株M-6
(I)将模块1、模块2和筛选标记TRP1共同转化菌株M-2，整合位点为酿酒酵母染色体DPP1位点，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株M-3；
(II)将模块3、模块4和筛选标记HIS3共同转化菌株M-3，整合位点为酿酒酵母染色体LPP1位点，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株M-4；
(III)将模块5、PHXT1和筛选标记KILEU2共同转化菌株M-4，整合位点为酿酒酵母染色体PERG9位点，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株M-5；
(Ⅳ)将模块5中的PTDH3-mSTS-TENO2片段、模块6和模块11的筛选标记URA3共同转化菌株M-5，整合位点为酿酒酵母染色体MET17位点，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株M-6；
(4)构建菌株SZ-1
将模块5、模块6中的PPGK1-CYP736A167-TADH1片段和筛选标记MET17共同转化菌株M-6，整合位点为酿酒酵母染色体ROX1位点，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株SZ-1，即为所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌；
(5)构建菌株SZ-2
将模块5中的PTDH3-mSTS-TENO2片段、模块6中的PPGK1-CYP736A167-TADH1片段、模块7和筛选标记MET17共同转化菌株M-6，整合位点为酿酒酵母染色体ROX1位点，然后通过酵母缺陷型培养基筛选培养，得到菌株SZ-2，即为所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌。
8.权利要求1所述的檀香烯合成酶突变体、权利要求3所述的重组表达载体或高产檀香烯的酿酒酵母工程菌在制备檀香挥发油中的应用。
9.权利要求4或5所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌在制备檀香挥发油中的应用。
10.一种制备檀香烯和檀香醇的方法，其特征在于，通过将权利要求4或5所述的高产檀香烯和檀香醇的酿酒酵母工程菌接种于发酵培养基中培养，待溶氧值上升即补加补料培养基，补料分批发酵后，取发酵液萃取，即得檀香烯和檀香醇。
CN202210188693.6A 2022-02-28 2022-02-28 一种檀香烯合成酶突变体、工程菌及其应用 Pending CN116694609A (zh)

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