CN113416664A

CN113416664A - 酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法和在高产乙酸乙酯中的用途

Info

Publication number: CN113416664A
Application number: CN202110636049.6A
Authority: CN
Inventors: 陈叶福; 石文琪; 张果; 李蕊蕊; 陈艳芳; 王欢; 孙春虹; 肖冬光; 武晓乐; 郭学武
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-06-08
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2041-06-08
Also published as: US20220389371A1; CN113416664B; US11753615B2

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，具体涉及一种酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法和在高产乙酸乙酯中的用途。其中，该酿酒酵母基因工程菌株异源过表达乙醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1和醇酰基转移酶基因AeAT9。本发明提供的高产乙酸乙酯低产高级醇酿酒酵母菌株，在发酵过程中保持优良酒精发酵特性的同时产生基础酯香物质乙酸乙酯，同时降低对饮后舒适度有不利影响的高级醇生成，对于白酒产品风味特征维持与强化，对于质量提高与稳定，乃至发酵工艺改革，都具有重要意义。

Description

酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法和在高产乙酸乙酯中的用途

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，具体涉及一种酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法和在高产乙酸乙酯中的用途。

背景技术

白酒是我国特有的酒种，是世界七大蒸馏酒之一，备受消费者喜爱。白酒中的微量成分是决定白酒品质的主要因素，在众多微量成分中，酯类是最重要的一类风味化合物，可赋予白酒令人愉快的果香。乙酸乙酯是清香型白酒的主体香，也是酒中各种风味酯类中含量较多的一类，如何有效的提高乙酸乙酯的产量一直是酒精饮料研究的重点。

添加纯种培养的酿酒酵母进行的白酒发酵，发酵周期短、原料出酒率高，但由于酿酒酵母产酯香物质的能力极低，致使成品酒风味品质较差。清香型白酒中较高浓度的乙酸乙酯产自自然网罗或者强化添加的产酯酵母。Guangsen Fan等人从古井贡大曲中筛选了一株高产乙酸乙酯的产酯酵母Wickerhamomyces anomalus，优化发酵工艺条件下乙酸乙酯的产量可达16.92g/L。但这些非酿酒酵母的存在严重影响原料出酒率，其酒精发酵效率不到酿酒酵母的三分之一，导致我国高档白酒耗粮高、生产周期长、效率低、成本高。构建新型高产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，使其在发酵过程中保持优良酒精发酵特性的同时生产基础酯香物质乙酸乙酯，对于白酒产品风味特征维持与强化，对于质量提高与稳定，乃至发酵工艺改革，都具有重要意义。

在白酒酿造过程中，酿酒酵母吸收原料中的游离氨基酸，这些氨基酸的氨基部分用于合成酵母自身生长繁殖所需的蛋白质，剩下的部分(α-酮酸)经过非可逆性反应最终形成高级醇。如果高级醇的浓度过高会使白酒产生不良的风味，如β-苯乙醇在接近阈值时，给人以脂样的酸味，异戊醇(活性戊醇)有杂醇油味，正丙醇显醚臭、有苦味，正丁醇似溶剂味、苦涩，稍有茉莉香味。并且过量的高级醇也会给饮酒者的身体造成一定的损伤，例如饮酒后出现头痛等醇性中毒症状。目前国内很多酒厂生产的白酒正存在着高级醇含量过高的问题，尤其是在夏季，温度较高，是生产旺季，需要一定程度上缩短发酵周期，再加上有些企业为了降低成本提高辅料的使用比例，使得白酒中累积的高级醇含量远远大于标准，这是绝大部分中小型酒厂普遍存在的现象，因此必须要加强检验和控制，及时采取措施使得其含量控制在合理的范围内。

总之，构建高产乙酸乙酯低产高级醇酿酒酵母菌株，使其在发酵过程中保持优良酒精发酵特性的同时产生基础酯香物质乙酸乙酯，同时降低对饮后舒适度有不利影响的高级醇生成，对于白酒产品风味特征维持与强化，对于质量提高与稳定，乃至发酵工艺改革，都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于解决上述背景技术中的不足，提供酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法和在高产乙酸乙酯中的用途。本发明提供的高产乙酸乙酯低产高级醇酿酒酵母菌株，在发酵过程中保持优良酒精发酵特性的同时产生基础酯香物质乙酸乙酯，同时降低对饮后舒适度有不利影响的高级醇生成，对于白酒产品风味特征维持与强化，对于质量提高与稳定，乃至发酵工艺改革，都具有重要意义。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种酿酒酵母基因工程菌株，该工程菌株异源过表达醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1和醇酰基转移酶基因AeAT9。

第二方面，本发明提供如上所述的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，该方法包括：在酿酒酵母中引入醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、醇酰基转移酶基因AeAT9和可选的乙醇脱氢酶基因ADH2，并且可选的将负责胞浆丙酮酸到线粒体运输的孔蛋白基因POR2失活或敲除。

第三方面，本发明提供所述酿酒酵母基因工程菌株在高产乙酸乙酯中的用途。

有益效果：

1、使用本发明构建的酿酒酵母菌株进行玉米水解液发酵，结果表明，出发菌株产乙酸乙酯的能力较低，乙酸乙酯的产量是6.34mg/L，同时整合过表达乙醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1和醇酰基转移酶基因AeAT9后，乙酸乙酯的产量是1374.54mg/L，较出发菌株乙酸乙酯的产量提高到了216.8倍；进一步整合过表达乙醇脱氢酶ADH2基因后，乙酸乙酯的产量为1425.85mg/L，较出发菌提高到了224.9倍；继续敲除POR2基因后，乙酸乙酯的最终产量为1651.89mg/L，较出发菌提高到了260.55倍。此外，乙酸异戊酯生成量很低，未检测到乙酸异丁酯，同时高级醇的含量尤其是异戊醇的含量均有大幅度下降，与对照相比下降了66.45％。

2、使用本发明构建的酿酒酵母菌株PGA2Ae△Por2进行豉香型白酒(斋酒)发酵，在发酵第9d时乙酸乙酯产量最高，为534.43mg/L，是空白对照的8.89倍，是MY-15菌株的1.55倍。在发酵15d后，PGA2Ae△Por2发酵体系中各种高级醇的浓度均降为最低值，异丁醇、异戊醇和正丙醇的浓度分别是109.49、136.18和38.7mg/L，与空白相比分别降低了43.23％、29.39％和19.26％，与MY-15相比分别降低了12.11％、12.89％和18.39％。总体来看，本发明中构建的酿酒酵母菌株PGA2Ae△Por2在能够高产乙酸乙酯的同时，具有降低高级醇的能力。

3、使用本发明构建的酿酒酵母菌株PGA2Ae△Por2进行清香型白酒二茬发酵，同样展现出了较高的乙酸乙酯合成能力，发酵体系中的乙酸乙酯浓度为305.30mg/L，是ADY菌株的11.93倍，是MY-15菌株的2.05倍。并且MY-15与ADY相比各项高级醇及总高级醇的浓度不降反升(只有异戊醇稍显降低)，而本发明中构建的菌株PGA2Ae△Por2降低高级醇的效果更明显。此外，PGA2Ae△Por2菌株在提高乙酸乙酯的合成，降低高级醇生成量的同时，仍然维较高的酒精发酵性能。

4、本发明中，重组菌株的酒精含量和残糖含量与出发菌株相比没有明显差别，本发明中的涉及转录调节因子的编码基因Gal80、IAH1基因、POR2基因的敲除和过表达乙醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、乙醇脱氢酶基因ADH2、以及异源过表达醇酰基转移酶基因AeAT9的操作未对菌株基本发酵性能有不利影响。

5、本发明提供的菌株，在保持基本乙醇发酵性能的同时，在白酒发酵的长期高酸度不利条件下仍可维持高产乙酸乙酯性能，且可显著降低高级醇的生成。该菌株构建所涉过表达基因优选源自酿酒酵母自身或水果，且该菌株不含任何筛选标记等外源基因。该菌株在清香型白酒乃至其他酒精饮料发酵生产中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为胞内整合乙醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1以及醇酰基转移酶基因AeAT9的同源重组过程；

图2为胞内整合乙醇脱氢酶基因ADH2同源重组过程；

图3为胞内敲除孔蛋白基因POR2的同源重组过程；

图4为胞内整合乙醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1以及醇酰基转移酶基因AeAT9重组子的PCR验证：

其中：(a)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGAe的基因组为模板，以GA-S/TEF1-X为引物，PCR扩增验证片段；

(b)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGAe的基因组为模板，以ACS1-S/PGK1P-X为引物，PCR扩增验证片段；

(c)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGAe的基因组为模板，以ALD6-S/PGK1P-D为引物，PCR扩增验证片段；

(d)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGAe的基因组为模板，以PGK1T-U/KAN-X为引物，PCR扩增验证片段；

(e)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGAe的基因组为模板，以KAN-S/GB-X为引物，PCR扩增验证片段；

(f)中M为marker；1是以重组菌株1丢KanMX前的基因组为模板，2是以重组菌株PGAe丢KanMX后的基因组为模板，以Kan-U/Kan-D为引物，PCR扩增验证片段；

(g)中M为marker；1为以传代前的重组菌株1的基因组为模板，2为以传代后的重组菌株PGAe的基因组为模板，以Zeocin-U/Zeocin-D为引物，PCR扩增验证片段。

图5为胞内整合乙醇脱氢酶基因ADH2的重组子的PCR验证：

(a)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGA2Ae的基因组为模板，以IA-S/PGK1P-X为引物，PCR扩增验证片段；

(b)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGA2Ae的基因组为模板，以PGK1P-S/PGK1T-X为引物，PCR扩增验证片段；

(c)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGA2Ae的基因组为模板，以KAN-S/IA-X为引物，PCR扩增验证片段；

(d)中M为marker；1是以重组菌株2丢KanMX前的基因组为模板，2是以重组菌株PGA2Ae丢KanMX后的基因组为模板，以Kan-U/Kan-D为引物，PCR扩增验证片段；

(e)中M为marker；1为以传代前的重组菌株1的基因组为模板，2为以传代后的重组菌株PGA2Ae的基因组为模板，以Zeocin-U/Zeocin-D为引物，PCR扩增验证片段。

图6为胞内敲除孔蛋白基因Por2的重组子的PCR验证：

(a)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGA2Ae△Por2的基因组为模板，以PA-S/KAN-X为引物，PCR扩增验证片段；

(b)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGA2Ae△Por2的基因组为模板，以KAN-S/PB-X为引物，PCR扩增验证片段；

(c)中M为marker；1是以重组菌株3丢KanMX前的基因组为模板，2是以重组菌株PGA2Ae△Por2丢KanMX后的基因组为模板，以Kan-U/Kan-D为引物，PCR扩增验证片段；

(d)中M为marker；1为以传代前的重组菌株1的基因组为模板，2为以传代后的重组菌株PGA2Ae△Por2的基因组为模板，以Zeocin-U/Zeocin-D为引物，PCR扩增验证片段；

图7为对酵母菌株进行豉香型白酒发酵实验，分时间段取样后，分别测定不同发酵体系的酒精度结果；

图8为添加了PGA2Ae△Por2、MY-15和H-1菌株的斋酒发酵体系中的乙酸乙酯(A)和乳酸乙酯(B)随发酵时间的变化情况；

图9为添加了PGA2Ae△Por2、MY-15和H-1菌株的斋酒发酵体系中的各种高级醇(A：异丁醇；B：异戊醇；C：正丙醇)随发酵时间的变化规律随发酵时间的变化情况。

图10为在本发明构建的酿酒酵母基因工程菌株中生物合成乙酸乙酯的途径示意图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

第一方面，本发明提供了一种酿酒酵母基因工程菌株，该工程菌株异源过表达醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1和醇酰基转移酶基因AeAT9。

根据本发明，优选的，所述乙醛脱氢酶基因ALD6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其Gene ID为：856044。

优选的，所述乙醛脱氢酶基因ALD6连接有PGK1基因的强启动子，GIC1基因的终止子。根据本发明一种优选的实施方式，所述强启动子为PGK1_P，其Gene ID为：850370，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:7所示，所述终止子为GIC1_T，其Gene ID为856458，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:8所示。

根据本发明，优选的，所述乙酰辅酶A合成酶基因ACS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其Gene ID为：851245。

优选的，所述乙酰辅酶A合成酶基因ACS1连接有TEF1基因的强启动子，PGK1基因的终止子。根据本发明一种优选的实施方式，所述强启动子为TEF1_p，Gene ID为：856195，核苷酸序列优选如SEQ ID NO:9所示，所述终止子为PGK1_T，Gene ID为：850370，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:10所示。

根据本发明，优选的，所述醇酰基转移酶基因AeAT9的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其来自于猕猴桃，醇酰基转移酶Protein ID为AIC83789.1。

优选的，所述醇酰基转移酶基因AeAT9连接有PGK1基因的强启动子，PGK1基因的终止子。根据本发明一种优选的实施方式，所述强启动子为PGK1_P，其Gene ID为：850370，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:7所示，所述终止子PGK1_T，其Gene ID为：850370，其核苷酸序列优选如SEQ IDNO:10所示。

根据本发明一种优选的实施方式，在所述酿酒酵母基因工程菌株中，所述乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、醛脱氢酶基因ALD6和醇酰基转移酶基因AeAT9依次连接。

根据本发明，所述乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、醛脱氢酶基因ALD6和醇酰基转移酶基因AeAT9可以插入在酿酒酵母的任意位置，只要不影响酿酒酵母的发酵性能且可实现表达即可。为了进一步提高乙酸乙酯的产量，优选的，所述乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、醛脱氢酶基因ALD6和醇酰基转移酶基因AeAT9依次连接，并插入到酿酒酵母中半乳糖的转录调节因子的编码基因Gal80区，且将其替换。也即，所述酿酒酵母中半乳糖的转录调节因子的编码基因Gal80被敲除，其原有位置被所述替代。

优选的，所述半乳糖的转录调节因子的编码基因Gal80的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示，其Gene ID为：854954。

根据本发明，为了进一步提高乙酸乙酯的产量，优选的，该工程菌株还异源过表达乙醇脱氢酶基因ADH2。

优选的，所述乙醇脱氢酶基因ADH2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其Gene ID为：855349。

优选的，所述乙醇脱氢酶基因ADH2连接有HTX7基因的诱导型启动子，PGK1基因的终止子。根据本发明一种优选的实施方式，所述诱导型启动子为HTX7_P，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:11所示，所述终止子为PGK1_T，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:10所示。

根据本发明，所述乙醇脱氢酶基因ADH2可以插入在酿酒酵母的任意位置，只要不影响酿酒酵母的发酵性能且可实现表达盒的表达即可。为了进一步提高乙酸乙酯的产量，优选的，所述乙醇脱氢酶基因ADH2的插入位点为酿酒酵母中乙酸异戊酯氢化酶基因IAH1(基因Gene ID为：854293)，且将其替换。也即，所述酿酒酵母中乙酸异戊酯氢化酶基因IAH1被敲除，其原有位置被乙醇脱氢酶基因ADH2替代。

优选的，所述乙酸异戊酯氢化酶基因IAH1的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

根据本发明，为了进一步提高乙酸乙酯的产量，所述工程菌株不表达负责胞浆丙酮酸到线粒体运输的孔蛋白基因POR2。

优选的，负责胞浆丙酮酸到线粒体运输的孔蛋白基因POR2的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示，其Gene ID为：854692。

根据本发明，不表达孔蛋白基因POR2的方式可以为本领域常规的方式，例如，可以通过本领域的常规手段使得该基因失活，或者是将该基因敲除。

根据本发明，所述不表达是指所述孔蛋白基因POR2的表达量较原有表达量有显著下降，例如，可以下降至少50％、60％、70％、80％、90％、100％。

根据本发明一种优选的实施方式，所述基因工程菌株负责胞浆丙酮酸到线粒体运输的孔蛋白基因POR2被敲除。其敲除方式可以为本领域常规手段，例如，通过同源重组的方式，优选的，通过使用KanMX抗性基因与孔蛋白基因POR2进行同源重组，从而将其敲除。能够理解的是，通过该方法进行孔蛋白基因POR2敲除后，所述酿酒酵母基因工程菌株还包含KanMX抗性基因。

根据本发明，用于构建所述酿酒酵母基因工程菌株的出发菌株可以为任意的酿酒酵母，根据本发明一种优选的实施方式，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC32315。

根据本发明一种优选的实施方式，所述酿酒酵母基因工程菌株异源过表达胞浆乙酰CoA形成相关基因：乙醇脱氢酶基因ADH2、乙醛脱氢酶基因ALD6和乙酰辅酶A合成酶基因ACS1，强化胞浆乙酰辅酶A的合成；同时异源过表达来自绿色植物的醇酰基转移酶基因AeAT9基因来促进乙酸乙酯的合成；进而在以上基因过表达的基础上敲除了负责丙酮酸从胞浆到线粒体运输的孔蛋白基因POR2，部分阻断胞浆中丙酮酸向线粒体的运输，使碳代谢流尽可能多的流向胞浆乙酰CoA，进一步促进胞浆乙酸乙酯的合成。

第二方面，本发明提供了如上所述的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，该方法包括：在酿酒酵母中引入醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、醇酰基转移酶基因AeAT9和可选的乙醇脱氢酶基因ADH2，并且可选的将负责胞浆丙酮酸到线粒体运输的孔蛋白基因POR2失活或敲除。

本发明第一方面已经详细介绍了各基因的选择、启动子和终止子的选自、出发菌株的选择等，为了避免不必要的重复，此处不再赘述第一方面已经介绍过的内容。

根据本发明一种具体的实施方式，该方法包括：

首先，在酵母菌株中，将乙醛脱氢酶基因ALD6；乙酰辅酶A合成酶基因ACS1；以及醇酰基转移酶基因AeAT9，同时过表达，得到一定水平的产乙酸乙酯酵母菌株PGAe；

其次，将乙醇脱氢酶基因ADH2过表达，得到乙酸乙酯进一步提高的菌株PGA2Ae；

最后，在菌株PGA2Ae的基础上敲除孔蛋白基因POR2，得到产乙酸乙酯的酵母菌株PGA2Ae△Por2；

进一步地，所述乙醛脱氢酶基因ALD6，乙酰辅酶A合成酶基因ACS1，以及醇酰基转移酶基因AeAT9的同时过表达是通过替换酿酒酵母转录调节因子基因GAL80实现的。如第一方面所述的，在优选的情况下，乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、醛脱氢酶基因ALD6和醇酰基转移酶基因AeAT9依次连接为连锁基因，然后将所述连锁基因与转录调节因子基因GAL80进行同源重组，从而将其敲除，并将所述连锁基因插入到转录调节因子基因GAL80的位置。

进一步的，所述乙醇脱氢酶基因ADH2的过表达是通过替换酿酒酵母乙酸异戊酯氢化酶基因IAH1实现的。如第一方面所述的，在优选的情况下，乙醇脱氢酶基因ADH2与乙酸异戊酯氢化酶基因IAH1进行同源重组，从而将其敲除，并将所述连锁基因插入到乙酸异戊酯氢化酶基因IAH1的位置。

进一步的，通过将KanMX抗性基因所述孔蛋白基因POR2进行同源重组从而实现其的敲除。

根据本发明一种更为优选的实施方式，所述高产乙酸乙酯酿酒酵母基因工程菌株的构建方法包括如下步骤：

(1)同时过表达ACS1、ALD6和AeAT9基因合成产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株的构建

1)以出发酵母菌株基因组作为模板，以转录调节因子基因Gal80为整合位点，通过PCR方法分别获得含有前后基因同源序列的片段：作为启动子和基因Gal80的上游同源臂片段GA、基因Gal80的下游同源臂片段GB、启动子TEF1_P、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1以及终止子PGK1_T；

2)使用融合PCR方法将片段GA和TEF1_P融合，片段ACS1和PGK1_T融合，得到两个融合片段GA-TEF1_P和ACS1-PGK1_T；

3)使用融合PCR方法将融合片段GA-TEF1_P和ACS1-PGK1_T进行进一步的融合得到融合片段GA-TEF1_P-ACS1-PGK1_T；

4)以出发酵母菌株基因组作为模板，通过PCR扩增的方法分别获得以下片段：乙醛脱氢酶基因ALD6，带有ALD6同源序列的启动子PGK1p和终止子GIC1_T；

5)使用融合PCR的方法将三个片段ALD6、PGK1p和GIC1t融合，得到融合片段PGK1_P-ALD6-GIC1_T；

6)以pUC57-AeAT9质粒作为模板，PCR扩增AeAT9基因；

7)以出发酵母菌株基因组作为模板，通过PCR扩增的方法获得带AeAT9基因同源序列的启动子和终止子PGK1_P和PGK1_T；

8)使用融合PCR方法将片段PGK1_P、PGK1_T和AeAT9融合，得到融合片段PGK1_P-AeAT9-PGK1_T；

9)以质粒pUG6为模板，PCR扩增得到KanMX基因；

10)使用融合PCR方法将片段KanMX和GB进行融合，得到融合片段KanMX-GB；

11)将PCR得到的带有相邻片段同源区的上述片段：GA-TEF1_P-ACS1-PGK1_T、PGK1_P-ALD6-GIC1_T、PGK1_P-AeAT9-PGK1_T和KanMX-GB经过醋酸锂化学转化导入出发酿酒酵母菌株中，得到重组菌株；

12)用pGAPza质粒去除步骤11)重组菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX基因的重组菌株，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株PGAe。

(2)过表达ADH2基因合成产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的构建

1)以出发酵母菌株基因组作为模板，以基因IAH1为整合位点通过PCR方法分别获得作为基因IAH1上游同源臂IA片段和下游同源臂IB片段；

2)以出发酵母菌株基因组作为模板，通过PCR扩增的方法分别获得以下片段：乙醛脱氢酶基因ADH2，带有ADH2基因同源序列的启动子PGK1_P和终止子PGK1_T；

3)以质粒pUG6为模板，PCR扩增得到带有IB同源区的KanMX基因；

4)通过PCR融合的方法，将IA，PGK1_P和ADH2一步融合成片段IA-PGK1_P-ADH2；

5)通过PCR融合的方法，将PGK1_T、KanMX和IB融合成一个片段PGK1_T-KanMX-IB；

6)将PCR得到的带有相邻片段同源区的上述片段：IA-PGK1_P-ADH2和PGK1_T-KanMX-IB经过醋酸锂化学转化分别导入步骤(1)-12)得到的重组菌株PGAe中，同源重组后得到进一步高产乙酸乙酯的酿酒酵母重组菌株；

7)用pGAPza质粒去除步骤6)重组菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX基因的重组菌株，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株PGA2Ae。

(3)敲除孔蛋白POR2基因合成产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株的构建

1)以出发酵母菌株基因组作为模板，通过PCR方法分别获得带有KanMX同源序列的片段：基因POR2的上游同源臂片段PA、基因POR2的下游同源臂片段PB；

2)以质粒pUG6为模板，PCR扩增得到带有POR2基因上下游同源臂的同源序列的KanMX基因；

3)将PCR得到的带有相邻片段同源区的上述片段：PA、KanMX和PB经过醋酸锂化学转化分别导入步骤(2)-7)得到的重组菌株PGA2Ae中，同源重组后得到更高产乙酸乙酯的酿酒酵母重组菌株。

4)用pGAPza质粒去除步骤3)获得菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX基因的重组菌株，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株PGA2Ae△Por2。

如上构建过程中所涉及具体操作方法已有很多文献报道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。

第三方面，本发明提供所述的酿酒酵母基因工程菌株在高产乙酸乙酯中的用途。

该菌株在高酸度的白酒发酵过程中表现出较强的乙酸乙酯合成能力，同时可以显著降低高级醇的生成量，在清香型白酒乃至酒精饮料发酵生产中具有广阔的应用前景。

此外，该菌株在酒精发酵过程中，产极微量的乙酸异戊酯，不产乙酸异酯丁酯。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中：

如没有特别的说明，本发明实施例中所涉及具体操作方法参见Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。

实施例1：新型高产乙酸乙酯酿酒酵母菌株PGA2Ae△Por的构建

本实例所用的出发菌株为AY14(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315)。YPD培养基为通用的完全培养基，固体培养基含2％琼脂粉。

菌株主要构建过程如下：

以酵母菌株AY14-α的基因组为模板，Gal80作为整合位点，用引物对GA-U(SEQ IDNO:13)和GA-D(SEQ ID NO:14)PCR扩增得到大小为549bp带启动子TEF1_P同源区的上同源臂GA片段；用引物对GB-U(SEQ ID NO:15)和GB-D(SEQ ID NO:16)PCR扩增得到大小为502bp带筛选标记Kan同源区的下同源臂GB片段；用引物对TEF1P-U(SEQ ID NO:17)和TEF1P-D(SEQID NO:18)PCR扩增得到大小为1001bp的带GA和ACS1同源区的启动子TEF1p片段；用引物对PGK1_T-U(SEQ ID NO:21)和PGK1_T-D(SEQ ID NO:22)PCR扩增得到大小为258bp的带ACS1和PGK1_P同源区的终止子PGK1_T片段；用引物对ACS1-U(SEQ ID NO:19)和ACS1-D(SEQ ID NO:20)PCR扩增得到大小为2142bp的带TEF1_P和PGK1_T同源区的乙酰CoA合成酶基因ACS1；

同样以AY14-α的基因组为模板，用引物对PGK1_P-U(SEQ ID NO:23)和PGK1_P-D(SEQID NO:24)PCR扩增得到大小为1479bp的带PGK1_P和ALD6同源区的PGK1_P片段，用引物对ALD6-U(SEQ ID NO:25)和ALD6-D(SEQ ID NO:26)PCR扩增得到大小为1503bp的带PGK1_P和GIC1_T同源区的ALD6片段，用引物对GIC1T-U(SEQ ID NO:27)和GIC1T-D(SEQ ID NO:28)PCR扩增得到大小为599bp的带ALD6和PGK1_P同源区的GIC1_T片段；

以质粒pUC57-AeAT9为模板，使用引物AeAT9-U(SEQ ID NO:31)和AeAT9-D(SEQ IDNO:32)PCR扩增得到1299bp的AeAT9片段，该片段带有PGK1_P和PGK1_T的同源区，以AY14-α的基因组为模板，用引物对PGK1P(G)-U(SEQ ID NO:29)和PGK1_P(Ae)-D(SEQ ID NO:30)PCR扩增得到大小为1479bp的带AeAT9同源区的PGK1_P片段，用引物对PGK1T(Ae)-U(SEQ ID NO:33)和PGK1T(Kan)-D(SEQ ID NO:34)PCR扩增得到大小为258bp的带AeAT9和Kan同源区的终止子PGK1_T片段。

以pUG6质粒为模板，用引物对Kan-U(SEQ ID NO:35)和Kan(G)-D(SEQ ID NO:36)PCR扩增得到大小为1613bp带PGK1_T和GB同源区的Kan片段。

使用融合PCR方法，将片段GA与TEF1_P进行融合PCR得到GA-TEF1_P片段，ACS1与PGK1_T融合得到ACS1-PGK1_T片段，进一步融合片段GA-TEF1_P和ACS1-PGK1_T得到3949bp的GA-TEF1_P-ACS1-PGK1_T片段。同样使用融合PCR将片段PGK1_P，ALD6和GIC1_T融合得到3581bp的PGK1_P-ALD6-GIC1_T片段；使用融合PCR将片段PGK1_P，AeAT9和PGK1_T融合，得到3036bp的片段PGK1_P-AeAT9-PGK1_T。将Kan和GB进行融合PCR得到2115bp的Kan-GB片段。将GA-TEF1_P-ACS1-PGK1_T、PGK1_P-ALD6-GIC1_T、PGK1_P-AeAT9-PGK1_T和KanMX-GB经过醋酸锂化学转化分别导入出发酵母菌株中，同源重组后得到产乙酸乙酯的酿酒酵母重组菌株PGAe，同源重组过程如图1所示。

重组酿酒酵母菌株的验证：

根据酿酒酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计五组验证引物，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。

将醋酸锂化学转化修复培养得到的菌液水洗后得到涂布在含有300mg/L G418抗性的YEPD筛选平板上，在温度为30℃进行两天的培养，挑取较大的单菌落进行验证。分别以生长较快的转化子为模板，以出发菌株AY14-α的基因组为阴性对照，选择了五个引物对对此进行验证。第一个引物对GA-S/TEF1-X(SEQ ID NO:55/56)是用来验证同源臂GA是否与染色体GAL80基因左侧的同源序列发生同源重组，本发明采用的是上游交叉PCR验证的办法，在0.8％-1％的琼脂糖凝胶电泳下得到泳带，如图4(a)两条泳带均为1620bp，出发菌株作为阴性对照扩增不出来。第二个引物对ACS1-S(SEQ ID NO:57)和PGK1p-X(SEQ ID NO:58)是用来检测ACS1基因上的终止子与ALD6的启动子PGK1p是否发生同源重组，本发明采用的是上游交叉PCR验证的办法，在0.8％-1％的琼脂糖凝胶电泳下得到两条泳带，如图4(b)大小均为2781bp，出发菌株作为阴性对照扩增不出来。第三个引物对ALD6-S/PGK1p-X(SEQ IDNO:59/58)是用来检测ALD6基因上的终止子与AeAT9基因的启动子PGK1p是否发生同源重组，本发明采用的是上游交叉PCR验证的办法，在0.8％-1％的琼脂糖凝胶电泳下得到两条泳带，如图4(c)大小均为1400bp左右，出发菌株作为阴性对照扩增不出来。第四个引物对PGK1_T-U/KAN-X(SEQ ID NO:60/61)是用来检测AeAT9基因的终止子与KAN是否发生同源重组，本发明采用的是上游交叉PCR验证的办法，在0.8％-1％的琼脂糖凝胶电泳下得到两条泳带，如图4(d)大小均在1200bp左右，出发菌株作为阴性对照扩增不出来。第五个引物对KAN-S/GB-X(SEQ ID NO:62/63)是用来检测同源臂B是否与染色体GAL80基因右侧的同源序列发生同源重组，们采用的是下游交叉PCR验证的办法，在0.8％-1％的琼脂糖凝胶电泳下得到泳带，如图4(e)大小均为1817bp，出发菌株作为阴性对照扩增不出来，说明重组盒GA-TEF1P-ACS1-PGK1T-PGK1P-ALD6-GIC1T-PGK1P-AeAT9-PGK1T-KanMX-GB片段已成功重组到酿酒酵母AY14-ɑ基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图4所示，为重组酿酒酵母验证结果。

图4中(a)中M为5000bp DNA Ladder Marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGAe的基因组为模板，以GA-S/TEF1-X为引物，PCR扩增验证片段；

(b)中M为5000bp DNA Ladder Marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2分别以重组菌株PGAe的基因组为模板，以ACS1-S/PGK1p-X为引物，PCR扩增验证片段。

(c)中M为5000bp DNA Ladder Marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGAe的基因组为模板，以ALD6-S/PGK1p-X为引物，PCR扩增验证片段。

(d)中M为5000bp DNA Ladder Marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGAe的基因组为模板，以PGK1t-U/KAN-X为引物，PCR扩增验证片段。

(e)中M为5000bp DNA Ladder Marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGAe的基因组为模板，以KAN-S/FB-X为引物，PCR扩增验证片段。

通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于两株重组菌株获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以基因组为模板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株则能扩增得到该片段，PCR验证结果如图4f所示。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株α-A1_P-A6_G-Ae，提取酵母质粒，以Zeocin-F/Zeocin-R(SEQ ID NO:53/54)为引物进行PCR验证如图4g所示。

(2)过表达ADH2基因合成产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的构建

以酵母菌株AY14-α的基因组为模板，IAH1作为整合位点，用引物对IA-U(SEQ IDNO:37)和IA-D(SEQ ID NO:38)PCR扩增得到大小为478bp带启动子PGK1_P同源区的上同源臂IA片段；用引物对IB-U(SEQ ID NO:39)和IB-D(SEQ ID NO:40)PCR扩增得到大小为550bp带筛选标记Kan同源区的下同源臂IB片段；用引物对PGK1_P-U(SEQ ID NO:41)和PGK1_P-D(SEQID NO:42)PCR扩增得到大小为418bp的带IA和ADH2同源区的启动子PGK1_P片段；用引物对PGK1_T(A)-U(SEQ ID NO:45)和PGK1_T(Kan)-D(SEQ ID NO:34)PCR扩增得到大小为258bp的带ADH2和Kan同源区的终止子PGK1_T片段；用引物对ADH2-U(SEQ ID NO:43)和ADH2-D(SEQ IDNO:44)PCR扩增得到大小为1047bp的带PGK1p和PGK1_T同源区的乙醇脱氢酶基因ADH2；用引物对Kan-U(SEQ ID NO:35)和Kan(I)-D(SEQ ID NO:46)PCR扩增得到大小为1613bp的Kan片段；

使用融合PCR方法，将片段IA、PGK1_P和ADH2进行融合PCR，得到1943bp的IA-PGK1_P-ADH2片段，PGK1_T与Kan-IB融合得到2421bp的PGK1_T-Kan-IB片段。将IA-PGK1_P-ADH2和PGK1_T-Kan-IB经过醋酸锂化学转化分别导入出发酵母菌株中，同源重组后得到产乙酸乙酯的酿酒酵母重组菌株PGA2Ae，同源重组过程如图2所示；

重组酿酒酵母菌株的验证：

根据酿酒酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计三组上、中、下游引物，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。

将经过醋酸锂转化法得到的单菌落进行上中下游定点PCR验证。第一个引物对IA-S/PGK1_P-X(SEQ ID NO:64/65)是用来验证同源臂IA是否与染色体IAH1基因左侧的同源序列发生同源重组，本发明采用的是上游交叉PCR验证的办法，在0.8％-1％的琼脂糖凝胶电泳下得到泳带，如图5(a)得到一条958bp左右的条带，出发菌株作为阴性对照扩增不出来。第二个引物对PGK1_P-S(SEQ ID NO:66)和PGK1_T-X(SEQ ID NO:67)是用来检测ADH2基因与终止子PGK1_T是否发生同源重组，本发明采用的是上游交叉PCR验证的办法，在0.8％-1％的琼脂糖凝胶电泳下得到一条泳带，如图5(b)大小均为1723bp，出发菌株作为阴性对照扩增不出来。第三个引物对Kan-S/IA-X(SEQ ID NO:68/69)是用来检测同源臂B是否与染色体IAH1基因右侧的同源序列发生同源重组，们采用的是下游交叉PCR验证的办法，在0.8％-1％的琼脂糖凝胶电泳下得到泳带，如图5(c)大小均为2303bp，出发菌株作为阴性对照扩增不出来，说明重组盒IA-PGK1_P-ADH2-PGK1T-KanMX-IB片段已成功重组到酿酒酵母AY14-ɑ基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图5所示，为重组酿酒酵母验证结果。

图5中(a)中M为5000bp DNA Ladder Marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGA2Ae的基因组为模板，以IA-S/PGK1_P-X为引物，PCR扩增验证片段；

(b)中M为5000bp DNA Ladder Marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2分别以重组菌株PGA2Ae的基因组为模板，以PGK1_P-S/PGK1_T-X为引物，PCR扩增验证片段。

(c)中M为5000bp DNA Ladder Marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGA2Ae的基因组为模板，以Kan-S/IA-X为引物，PCR扩增验证片段。

通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于两株重组菌株获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以基因组为模板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株则能扩增得到该片段，PCR验证结果如图5(d)所示。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株PGAe，提取酵母质粒，以Zeocin-F/Zeocin-R(SEQ ID NO:53/54)为引物进行PCR验证如图5(e)所示。

(3)敲除孔蛋白POR2基因合成产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株的构建

同样以AY14-α的基因组为模板，用引物对PA-U(SEQ ID NO:47)和PA-D(SEQ IDNO:48)PCR扩增得到大小为500bp的带Kan同源区的PA片段，用引物对Kan(P)-U(SEQ ID NO:51)和Kan(P)-D(SEQ ID NO:52)PCR扩增得到大小为1613bp的带PA和PB同源区的Kan片段，用引物对PB-U(SEQ ID NO:49)和PB-D(SEQ ID NO:50)PCR扩增得到大小为572bp的带Kan同源区的PB片段；将PA、PB和Kan经过醋酸锂化学转化分别导入出发酵母菌株中，同源重组后得到产乙酸乙酯的酿酒酵母重组菌株PGA2Ae△Por，同源重组过程如图3所示。酿酒酵母重组菌株PGA2Ae△Por生物合成乙酸乙酯的途径示意图如图10所示。

重组酿酒酵母菌株的验证：

根据酿酒酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上、下游引物，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。

将经过醋酸锂转化法得到的单菌落进行上下游定点PCR验证。第一个引物对PA-S-S/KAN-X(SEQ ID NO:70/71)是用来验证同源臂PA是否与染色体POR2基因左侧的同源序列发生同源重组，本发明采用的是上游交叉PCR验证的办法，在0.8％-1％的琼脂糖凝胶电泳下得到泳带，如图6(a)得到一条1527bp左右的条带，出发菌株作为阴性对照扩增不出来。第二个引物对KAN-S(SEQ ID NO:72)和PB-X(SEQ ID NO:73)是用来检测同源臂B是否与染色体POR2基因右侧的同源序列发生同源重组，本发明采用的是上游交叉PCR验证的办法，在0.8％-1％的琼脂糖凝胶电泳下得到泳带，如图6(b)得到一条1627bp左右的条带，出发菌株作为阴性对照扩增不出来。说明重组盒PA-KanMX-PB片段已成功重组到酿酒酵母AY14-ɑ基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图6所示，为重组酿酒酵母验证结果。

图6中(a)中M为5000bp DNA Ladder Marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株PGA2Ae△Por的基因组为模板，以PA-S-S/KAN-X为引物，PCR扩增验证片段；

(b)中M为5000bp DNA Ladder Marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2分别以重组菌株PGA2Ae△Por的基因组为模板，以KAN-S/PB-X为引物，PCR扩增验证片段。

通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于两株重组菌株获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以基因组为模板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株则能扩增得到该片段，PCR验证结果如图6c所示。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株PGAe，提取酵母质粒，以Zeocin-U/Zeocin-D(SEQ ID NO:53/54)为引物进行PCR验证如图6d所示。

实施例2：PGA2Ae△Por菌株的玉米水解液发酵实验

玉米液态白酒发酵实验

1)发酵工艺路线图：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷却→过滤→接菌→发酵→蒸酒→测定指标；

2)工艺条件

浸泡条件：60～70℃，浸渍20min；液化条件：85～90℃，加入耐高温α-淀粉酶，液化90min；糖化条件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20h；

3)配料：玉米粉1500g，水4500mL，静置放置20min，耐高温α-淀粉酶2×10⁴U/mL，0.9ml，糖化酶1×10⁵U/mL，3mL。

4)培养基配置

一级种子培养基：8°Brix玉米水解液，加入0.5％的酵母浸粉，分装5mL于试管，煮沸10min以灭菌。

二级种子培养基：12°Brix玉米水解液，加入0.5％的酵母浸粉，分装45mL于150mL三角瓶，105℃灭菌15min。

发酵培养基：准备18°Brix玉米水解液，分装135mL于250mL三角瓶中，105℃灭菌15min，晾至室温后加营养盐1mL(MgSO₄ 150g/L、KH₂PO₄ 75g/L、尿素81g/L，过滤，4℃保存)。

挑取一环酵母细胞，接入装有5mL一级种子培养基的试管中，30℃静置培养24h，按10％接种量接种到装有45mL二级种子培养基的150mL三角瓶中，30℃静置培养16h至对数期的后期，按10％接种量接种到玉米水解液发酵培养基，30℃静置发酵。每隔12h称重1次，当两次失重小于1g，发酵结束。发酵结束后取100mL醪液，加100mL水，蒸出100mL酒样。

5)测定CO₂累积排放量及酒样中的酒精度和残还原糖等发酵性能指标

结果如表1所示，重组菌株PGAe、PGA2Ae和PGA2Ae△Por2发酵后的酒精含量和残糖含量与出发菌株相比没有明显差别，本例中的基因敲除和过表达的操作不会对菌株基本发酵性能有不利影响。

表1亲本菌株和重组菌株的发酵性能测定

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

6)气相色谱法测定酯和醇的产量

气相色谱仪：Agilent 7890C；色谱柱：白酒专用柱，AT.LZP-930，230℃，50m×320μm×1μm；检测器：FID检测器，检测器温度：200℃；载气：高纯氮，流速5mL/min；检测条件：程序升温，50℃保持8min，5℃/min升到120℃,保持8min；进样口温度：200℃；进样量：1.0μL；分流方式：分流，分流比为10：1。

表2亲本菌株和重组菌株的高级醇和酯产量(单位mg/L)

通过上述方法测定酒样中的酯和醇的产量，结果如表2所示，亲本菌株产乙酸乙酯的产量是6.34mg/L，同时整合过表达乙醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1和醇酰基转移酶基因AeAT9后，乙酸乙酯的产量是1374.54mg/L，较初始菌株乙酸乙酯的产量提高到了216.8倍；整合过表达乙醇脱氢酶ADH2基因后，乙酸乙酯的产量为1425.85mg/L，较出发菌提高到了224.9倍；继续敲除POR2基因后，乙酸乙酯的最终产量为1651.89mg/L，较出发菌提高到了260.55倍。此外，乙酸异戊酯的产量很少，与乙酸乙酯的比值接近0，并且以上菌株均未检测到乙酸异丁酯，同时高级醇的含量尤其是异戊醇的含量均有大幅度下降。

实施例3：PGA2Ae△Por菌株的豉香型白酒斋酒发酵实验

豉香型白酒是用大米为原料，以米饭、黄豆酒饼叶和小曲所制成的大酒饼作为糖化发酵剂发酵而成。其发酵工艺是将大米煮成饭，冷凉后拌入占原料量20～24磨成粉末的大酒饼，不经固体糖化阶段，随即加入一定比例的清水，边糖化边发酵，成熟醪酒精度达到12～l4度，经釜式蒸馏方式制成酒度为28～38度的低度白酒，俗称斋酒。斋酒存放7～10d澄清后，放入存有经老陈处理的肥猪肉大罐内浸泡，泡肉时间为一个月左右，然后抽出酒液、陈酿、勾兑、过滤即为各种规格的成品。豉香型白酒，来源于中国的珠三角，得名于其突出的豉香味，独具南国特色。该香型的白酒代表产品有玉冰烧、红米酒和九江双蒸酒。该酒种因其特有的米香和豉香味、玉洁冰清的酒体、绵软甘滑的口感，深受社会各界人士的喜爱。其独特的风味及特有的生产工艺使得豉香型白酒得到了长足的发展。豉香型白酒的酯类中占主要比例的是乳酸乙酯和乙酸乙酯，两者占总含量的95％以上。但由于豉香型白酒发酵过程中酒精发酵快、温度较高等特点，不利于酯类物质的代谢，导致豉香型白酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量较低，而使酒体风味寡淡，不利于酒质量的稳定和提高，本例致力于将构建的新型产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株应用于豉香型白酒的斋酒发酵过程中，以期进一步提高豉香型白酒中的乙酸乙酯含量，从而进一步强化产品质量的稳定性。

1.实验方法

1)菌种

PGA2Ae△Por2、MY-15(CGMCC NO.5635)和H-1(Hansenula anomala，CICCNO.1312)

2)发酵体系：在250mL的锥形瓶中，分别加入105g煮熟的大米，9g酒饼曲，实验组接入酵母菌100万个/ml，空白组不加酵母，随后将发酵体系补水至240g，用塑料膜密封，并用注射器在塑料膜上扎三个孔，分别在发酵6、9、12、15d后取样，测定基本发酵性能及酯类和高级醇的含量。

2.结果与讨论

对酵母菌株进行豉香型白酒发酵实验，分时间段取样后，分别测定不同发酵体系的酒精度，结果如图7所示，随着发酵时间的逐渐增加不同酵母菌株的酒精度有明显变化，空白组在第12d时酒精度达到最大，为13.30度；PGA2Ae△Por2菌株同样在第12d时，酒精度达到最大，为13.60度；MY-15菌株在发酵第6d时，酒精度达到最大，之后随着发酵时间的延长，逐渐降低，最大值为13.30度；H-1菌株在发酵前期，酒精度几乎没有变化，发酵第15d时，酒精度下降为11.10度。对于残余还原糖的含量，如表3所示，三株菌株的残糖在发酵第9d时均比第6d的含量有明显下降。

表3残余还原糖随发酵时间的变化情况

如图8所示，分别测定了添加了PGA2Ae△Por2、MY-15和H-1菌株的斋酒发酵体系中的乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量。对于乙酸乙酯的产量(图8(A))，PGA2Ae△Por2菌株在第9d时达到最大，产量为534.43mg/L；MY-15和H-1菌株在第6d时达到最大，产量分别为343.8mg/L和50.14mg/L；空白组的乙酸乙酯最大值为60.1mg/L，产量随时间的变化不明显；总体来看，PGA2Ae△Por2菌株具有最高的乙酸乙酯产生能力，在发酵到第9d时产量分别是空白的8.89倍，MY-15菌株的1.55倍，H-1菌株的10.66倍。

虽然发酵到第9d时，接种PGA2Ae△Por2菌株的发酵体系中乙酸乙酯产量达到最大值，然而发酵体系中乳酸乙酯的产量却相对较低，为了增加乳酸乙酯的产量，将发酵时间延长至15d，乳酸乙酯的产量随时间的变化情况如图8(B)所示，随着发酵时间的延长，各种菌的发酵体系中乳酸乙酯的产量呈现逐渐增加的趋势，这个是由乳酸的逐渐积累导致的。在第15d时，PGA2Ae△Por2的发酵体系中乳酸乙酯的浓度达到最大，产量为47.69mg/L，与空白和H-1菌株相比，分别降低了45.55％和35.43％，与MY-15菌株相比，增加了2.37倍。说明本专利构建的酵母菌株PGA2Ae△Por2相对于MY-15来说，对乳酸乙酯生成扰动相对较小，虽然较空白相比也有所下降。豉香型白酒中对于乳酸乙酯的含量通常在50-1560mg/L的范围内，本发明菌株的斋酒发酵结果中，15d时乳酸乙酯已接近豉香型白酒的浓度要求，通过进一步的发酵工艺优化可实现提升乳酸乙酯浓度水平的目的，同时保持较高的乙酸乙酯合成能力。

随后测定了各菌株在发酵体系中的各种高级醇随发酵时间的变化规律，结果如表4所示，对于PGA2Ae△Por2菌株而言，随着发酵时间的延长，异丁醇、异戊醇和正丙醇的产量均呈现先增高，后下降的趋势，其中在乙酸乙酯产生能力最高的发酵时间，即发酵9d时，这些高级醇的产量依次为139.77、180.9和51.57mg/L，与空白对照相比均有大幅的下降，分别下降了53.9％、59.37％和26.69％。

PGA2Ae△Por2、MY-15和H-1酵母菌株在发酵15d后各种高级醇的浓度均为最低值。三株酵母菌株的异丁醇产量分别为109.49、124.58和132.79mg/L，与空白相比降低了76.13％、54.80％和45.23％；异戊醇产量分别为136.18、156.33和139.29mg/L，与空白对照相比分别降低了41.61％、23.36％和38.45％；正丙醇产量分别是38.7、47.42和39.03mg/L，MY-15菌株与空白对照比几乎没有差异，PGA2Ae△Por2和H-1菌株与对照比降低了23.85％和22.80％。同样在发酵到第15d时，PGA2Ae△Por2菌株的总高级醇含量降至284.37mg/L(表4)，比空白对照减少了34.42％，比MY-15减少了13.39％，比H-1减少了8.60％。总体来看，本专利中构建的酿酒酵母菌株PGA2Ae△Por2在具有高产乙酸乙酯能力的同时，具有降低高级醇的能力。

表4高级醇总量随时间的变化情况

实施例4：PGA2Ae△Por菌株的清香型白酒二茬发酵实验

清香型白酒是中国三大香型白酒之一，具有清雅、协调的香气，入口绵甜，香味协调，醇厚爽冽，尾净香长等特点。乙酸乙酯是清香型白酒的特征香味成分之一，其含量高低很大程度上决定了清香型白酒的质量及风格。在清香型白酒生产中，为了充分利用大茬发酵酒糟中剩余的淀粉，降低高级醇的产量，提高成品酒的质量，通常要进行二茬发酵，此发酵阶段为纯醅培养，在利用淀粉产酒产香的同时，还避免了原辅料中的邪杂味带入酒中，使蒸得的酒落口爽净。本例致力于将构建的新型产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株应用于老白干的二茬发酵过程中，以期进一步提高清香型白酒中的乙酸乙酯含量，从而进一步强化产品质量的稳定性。

1.实验方法

1)菌种

PGA2Ae△Por2、活化好的安琪酵母ADY和MY-15

2)发酵体系

本例实验是以一茬酒糟作为培养基进行的二茬发酵，酒糟中的残余淀粉含量是17.72g/100g糟。发酵在600mL的小坛中进行，每瓶装料量200g糟，添加糖化酶0.04mL/100g糟或4000U/100g糟，对照菌株ADY的加入量是0.033g/100g糟或6.67亿/100g糟，实验组酵母的接种量是6.67亿/100g糟，水封，30℃发酵10d。

2.结果与讨论

表5不同酵母菌株添加后各种酯类物质的生成情况(单位mg/L)

以安琪酵母ADY和MY-15菌株作为对照，测定了PGA2Ae△Por2在二茬酒糟中的各种风味物质的含量，评估了该菌株在清香型白酒中的各种酯类物质的合成能力，结果如表5所示。PGA2Ae△Por2菌株具有最高的乙酸乙酯产生能力，产量为305.30mg/L，是ADY菌株的11.93倍，是MY-15菌株的2.05倍。添加了该菌株后，发酵体系中乳酸乙酯的产量，与ADY和MY-15菌株相比相对较低，分别减少了17.94％和29.06％，说明本专利构建的工程菌株对发酵体系中乳酸乙酯的合成的扰动程度更大，可通过进一步调整发酵工艺(如延长发酵时间)协调乙酸乙酯和乳酸乙酯的比例。此外，该菌发酵体系中的己酸乙酯的浓度与ADY和MY-15相比差别不大，不具有丁酸乙酯的合成能力，并且总酯产量相对较高(657.47mg/L)，与MY-15接近，是对照ADY的1.39倍。

表6不同酵母菌株添加后各种高级醇的生成情况(单位mg/L)

如表6所示，测定了不同酵母菌株添加后，发酵体系中各种高级醇的产量，对于PGA2Ae△Por2发酵体系，异戊醇的产量是19.40mg/L，与对照相比减少的最明显，比ADY减少了56.96％，比MY-15减少了54.03％；其次是苯二醇，产量为10.33mg/L，比对照ADY减少了28.91％，比MY-15减少了47.83％；总高级醇产量为50.97mg/L，比对照ADY减少了36.37％，比MY-15减少了41.33％。总体来看，MY-15与ADY相比各项高级醇及总高级醇的产量不降反升(只有异戊醇稍显降低)，而本专利中构建的菌株PGA2Ae△Por2降低高级醇的效果更明显。

表7发酵酒醅理化指标

随后，对酒醅中的理化指标进行了检测，结果如表7所示，PGA2Ae△Por2菌株发酵体系的酒度为7.10度，与MY-15差别不大，与ADY对照相比增加了16.9％。此外，PGA2Ae△Por2发酵体系中也具有比ADY和MY-15更高的酸度和水分。总体来看，与ADY较低的酒度相比，PGA2Ae△Por2菌株在二茬清香型白酒发酵的高酸度条件下具有与MY-15相当甚至略高的酒精发酵能力(体现在酒度和残淀粉上)，可达到在提高乙酸乙酯的合成能力，降低高级醇生成量的同时，不影响出酒率等基本发酵性能的目的。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法和在高产乙酸乙酯中的用途

<130> 1

<160> 73

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1503

<212> DNA

<213> 乙醛脱氢酶基因ALD6

<400> 1

atgactaagc tacactttga cactgctgaa ccagtcaaga tcacacttcc aaatggtttg 60

acatacgagc aaccaaccgg tctattcatt aacaacaagt ttatgaaagc tcaagacggt 120

aagacctatc ccgtcgaaga tccttccact gaaaacaccg tttgtgaggt ctcttctgcc 180

accactgaag atgttgaata tgctatcgaa tgtgccgacc gtgctttcca cgacactgaa 240

tgggctaccc aagacccaag agaaagaggc cgtctactaa gtaagttggc tgacgaattg 300

gaaagccaaa ttgacttggt ttcttccatt gaagctttgg acaatggtaa aactttggcc 360

ttagcccgtg gggatgttac cattgcaatc aactgtctaa gagatgctgc tgcctatgcc 420

gacaaagtca acggtagaac aatcaacacc ggtgacggct acatgaactt caccacctta 480

gagccaatcg gtgtctgtgg tcaaattatt ccatggaact ttccaataat gatgttggct 540

tggaagatcg ccccagcatt ggccatgggt aacgtctgta tcttgaaacc cgctgctgtc 600

acacctttaa atgccctata ctttgcttct ttatgtaaga aggttggtat tccagctggt 660

gtcgtcaaca tcgttccagg tcctggtaga actgttggtg ctgctttgac caacgaccca 720

agaatcagaa agctggcttt taccggttct acagaagtcg gtaagagtgt tgctgtcgac 780

tcttctgaat ctaacttgaa gaaaatcact ttggaactag gtggtaagtc cgcccatttg 840

gtctttgacg atgctaacat taagaagact ttaccaaatc tagtaaacgg tattttcaag 900

aacgctggtc aaatttgttc ctctggttct agaatttacg ttcaagaagg tatttacgac 960

gaactattgg ctgctttcaa ggcttacttg gaaaccgaaa tcaaagttgg taatccattt 1020

gacaaggcta acttccaagg tgctatcact aaccgtcaac aattcgacac aattatgaac 1080

tacatcgata tcggtaagaa agaaggcgcc aagatcttaa ctggtggcga aaaagttggt 1140

gacaagggtt acttcatcag accaaccgtt ttctacgatg ttaatgaaga catgagaatt 1200

gttaaggaag aaatttttgg accagttgtc actgtcgcaa agttcaagac tttagaagaa 1260

ggtgtcgaaa tggctaacag ctctgaattc ggtctaggtt ctggtatcga aacagaatct 1320

ttgagcacag gtttgaaggt ggccaagatg ttgaaggccg gtaccgtctg gatcaacaca 1380

tacaacgatt ttgactccag agttccattc ggtggtgtta agcaatctgg ttacggtaga 1440

gaaatgggtg aagaagtcta ccatgcatac actgaagtaa aagctgtcag aattaagttg 1500

taa 1503

<210> 2

<211> 2142

<212> DNA

<213> 乙酰辅酶A合成酶基因ACS1

<400> 2

atgtcgccct ctgccgtaca atcatcaaaa ctagaagaac agtcaagtga aattgacaag 60

ttgaaagcaa aaatgtccca gtctgccgcc actgcgcagc agaagaagga acatgagtat 120

gaacatttga cttcggtcaa gatcgtgcca caacggccca tctcagatag actgcagccc 180

gcaattgcta cccactattc tccacacttg gacgggttgc aggactatca gcgcttgcac 240

aaggagtcta ttgaagaccc tgctaagttc ttcggttcta aagctaccca atttttaaac 300

tggtctaagc cattcgataa ggtgttcatc ccagacccta aaacgggcag gccctccttc 360

cagaacaatg catggttcct caacggccaa ttaaacgcct gttacaactg tgttgacaga 420

catgccttga agactcctaa caagaaagcc attattttcg aaggtgacga gcctggccaa 480

ggctattcca ttacctacaa ggaactactt gaagaagttt gtcaagtggc acaagtgctg 540

acttactcta tgggcgttcg caagggcgat actgttgccg tgtacatgcc tatggtccca 600

gaagcaatca taaccttgtt ggccatttcc cgtatcggtg ccattcactc cgtagtcttt 660

gccgggtttt cttccaactc cttgagagat cgtatcaacg atggggactc taaagttgtc 720

atcactacag atgaatccaa cagaggtggt aaagtcattg agactaaaag aattgttgat 780

gacgcgctaa gagagacccc aggcgtgaga cacgtcttgg tttatagaaa gaccaacaat 840

ccatctgttg ctttccatgc ccccagagat ttggattggg caacagaaaa gaagaaatac 900

aagacctact atccatgcac acccgttgat tctgaggatc cattattctt gttgtatacg 960

tctggttcta ctggtgcccc caagggtgtt caacattcta ccgcaggtta cttgctggga 1020

gctttgttga ccatgcgcta cacttttgac actcaccaag aagacgtttt cttcacagct 1080

ggagacattg gctggattac aggccacact tatgtggttt atggtccctt actatatggt 1140

tgtgccactt tggtctttga agggactcct gcgtacccaa attactcccg ttattgggat 1200

attattgatg aacacaaagt cacccaattt tatgttgcgc caactgcttt gcgtttgttg 1260

aaaagagctg gtgattccta catcgaaaat cattccttaa aatctttgcg ttgcttgggt 1320

tcggtcggtg agccaattgc tgctgaagtt tgggagtggt actctgaaaa aataggtaaa 1380

aatgaaatcc ccattgtaga cacctactgg caaacagaat ctggttcgca tctggtcacc 1440

ccgctggctg gtggtgttac accaatgaaa ccgggttctg cctcattccc cttcttcggt 1500

attgatgcag ttgttcttga ccctaacact ggtgaagaac ttaacaccag ccacgcagag 1560

ggtgtccttg ccgtcaaagc tgcatggcca tcatttgcaa gaactatttg gaaaaatcat 1620

gataggtatc tagacactta tttgaaccct taccctggct actatttcac tggtgatggt 1680

gctgcaaagg ataaggatgg ttatatctgg attttgggtc gtgtagacga tgtggtgaac 1740

gtctctggtc accgtctgtc taccgctgaa attgaggctg ctattatcga agatccaatt 1800

gtggccgagt gtgctgttgt cggattcaac gatgacttga ctggtcaagc agttgctgca 1860

tttgtggtgt tgaaaaacaa atctagttgg tccaccgcaa cagatgatga attacaagat 1920

atcaagaagc atttggtctt tactgttaga aaagacatcg ggccatttgc cgcaccaaaa 1980

ttgatcattt tagtggatga cttgcccaag acaagatccg gcaaaattat gagacgtatt 2040

ttaagaaaaa tcctagcagg agaaagtgac caactaggcg acgtttctac attgtcaaac 2100

cctggcattg ttagacatct aattgattcg gtcaagttgt aa 2142

<210> 3

<211> 1050

<212> DNA

<213> 乙醇脱氢酶基因ADH2

<400> 3

adhatgtcta ttccagaaac tcaaaaagcc attatcttct acgaatccaa cggcaagttg 60

gagcataagg atatcccagt tccaaagcca aagcccaacg aattgttaat caacgtcaag 120

tactctggtg tctgccacac cgatttgcac gcttggcatg gtgactggcc attgccaact 180

aagttaccat tagttggtgg tcacgaaggt gccggtgtcg ttgtcggcat gggtgaaaac 240

gttaagggct ggaagatcgg tgactacgcc ggtatcaaat ggttgaacgg ttcttgtatg 300

gcctgtgaat actgtgaatt gggtaacgaa tccaactgtc ctcacgctga cttgtctggt 360

tacacccacg acggttcttt ccaagaatac gctaccgctg acgctgttca agccgctcac 420

attcctcaag gtactgactt ggctgaagtc gcgccaatct tgtgtgctgg tatcaccgta 480

tacaaggctt tgaagtctgc caacttgaga gcaggccact gggcggccat ttctggtgct 540

gctggtggtc taggttcttt ggctgttcaa tatgctaagg cgatgggtta cagagtctta 600

ggtattgatg gtggtccagg aaaggaagaa ttgtttacct cgctcggtgg tgaagtattc 660

atcgacttca ccaaagagaa ggacattgtt agcgcagtcg ttaaggctac caacggcggt 720

gcccacggta tcatcaatgt ttccgtttcc gaagccgcta tcgaagcttc taccagatac 780

tgtagggcga acggtactgt tgtcttggtt ggtttgccag ccggtgcaaa gtgctcctct 840

gatgtcttca accacgttgt caagtctatc tccattgtcg gctcttacgt ggggaacaga 900

gctgatacca gagaagcctt agatttcttt gccagaggtc tagtcaagtc tccaataaag 960

gtagttggct tatccagttt accagaaatt tacgaaaaga tggagaaggg ccaaattgct 1020

ggtagatacg ttgttgacac ttctaaataa 1050

<210> 4

<211> 1299

<212> DNA

<213> 醇酰基转移酶基因AeAT9

<400> 4

atggcttcat ctgtcaggtt ggtcaagaag ccagtcttgg tcgctccagt tgatccaact 60

ccatcaacag ttttatcttt gtcatctttg gattcacaat tgtttttgag attccctatt 120

gaatatttgt tagtctatgc ttctccacat ggtgttgata gggctgtcac tgctgctagg 180

gtcaaagctg cattggctag gtctttggtc ccttattatc cattggctgg tagggtcaag 240

actaggccag actctactgg attggacgtt gtctgccaag ctcaaggtgc tggattgttg 300

gaggctgtct ctgactacac agcttcagac tttcaaagag ctccaagatc tgttactgag 360

tggagaaaat tgttgttggt tgaggtcttc aaggtcgtcc ctccattggt cgttcagttg 420

acttggttgt cagacggttg cgtcgctttg ggtgttggtt tctctcactg cgtcattgac 480

ggtattggtt catcagagtt tttaaatttg tttgctgaat tggctactgg tagggcaagg 540

ttgtcagaat tccagccaaa accagtctgg gataggcact tgttaaactc tgcaggtagg 600

acaaacttgg gtactcaccc tgagtttgga agggtcccag acttgtctgg tttcgttaca 660

aggtttactc aagaaaggtt gtctccaact tctattactt ttgataaaac ttggttgaag 720

gaattaaaaa atattgctat gtctacatca cagcctggtg agttcccata cacttctttc 780

gaggtcttgt ctggtcacat atggaggtct tgggctaggt cattgaactt gccagctaag 840

caagttttaa aattgttatt ttctattaat attagaaaca gggttaagcc atctttgcca 900

gctggttact acggtaacgc tttcgtcttg ggttgcgctc agacatctgt caaggatttg 960

actgagaagg gtttgggtta ctgcgctgat ttggtcagag gtgcaaagga aagggtcggt 1020

gacgaatacg ctagggaagt tgtcgaatct gtctcttggc caaggagagc ttcaccagat 1080

tctgttggag ttttgattat ttctcaatgg tcaaggttgg gattggatag ggtcgacttc 1140

ggtttaggaa ggccagtcca ggttggacca atttgctgtg acagatattg tttgtttttg 1200

ccagttaggg agtctactga gtctgtcaag gtcatggtcg ctgttccaac atctgctgtt 1260

gataggtatg aatactttat tagatctcca tactcttaa 1299

<210> 5

<211> 846

<212> DNA

<213> 孔蛋白基因POR2

<400> 5

atggcactac gatttttcaa cgatatatct agagatgtca atggcctatt caatagggac 60

ttttttcaca ccaaccccct ctctttgaat atttcaacaa ccacggaaaa tggtgtgaat 120

tttactctga aggcgaagca gggcgtgaca gaaggcccca tccaaactag cgtagaagga 180

cggttttatg acaggaagga gggagtgtcg ctatctcaga gttggtcgaa ccagaacagg 240

ttaaatacaa gaatcgaatt ttccaagata gcacctggtt ggaaaggtga tgtcaacgca 300

tttttgactc cccaatccat caagaacgcc aaatttaatt tgagctacgc ccaaaaatcg 360

tttgcagcaa gaacttctat agacatcttg caacctaagg actttgtcgg aagtgttact 420

ttgggccacc gcgggtttgt tggcggcact gacatcgcat atgacacagc tgcgggttta 480

tgtgcacgct atgctatgtc aatcgggtat cttgccagag aatattcgtt tattttgtct 540

actaacaaca ggcaatgcgc aactgcttca ttttttcaaa acgttaaccg ctatttgcaa 600

gtgggaacta aagccacttt acaatcgaag acaagttcta atatgaacat tgaatttgtt 660

accagatacg taccagattc tatttcgcaa gttaaggcaa aaattgcaga ttcaggcctg 720

actacattgt cgtacaagcg aaatttgaat aaagatattt ctttgggtgt gggtatgtct 780

ttcaatgcgc tacaactgac tgaaccagtc cacaaatttg gctggtctct atcgttctcg 840

ccctga 846

<210> 6

<211> 1308

<212> DNA

<213> 半乳糖的转录调节因子的编码基因Gal80

<400> 6

atggactaca acaagagatc ttcggtctca accgtgccta atgcagctcc cataagagtc 60

ggattcgtcg gtctcaacgc agccaaagga tgggcaatca agacacatta ccccgccata 120

ctgcaactat cgtcacaatt tcaaatcact gccttataca gtccaaaaat tgagacttct 180

attgccacca ttcagcgtct aaaattgagt aatgccactg cttttcccac tttagagtca 240

tttgcatcat cttccactat agatatgata gtgatagcta tccaagtggc cagccattat 300

gaagttgtta tgcctctctt ggaattctcc aaaaataatc cgaacctcaa gtatcttttc 360

gtagaatggg cccttgcatg ttcactagat caagccgaat ccatttataa ggctgctgct 420

gaacgtgggg ttcaaaccat catctcttta caaggtcgta aatcaccata tattttgaga 480

gcaaaagaat taatatctca aggctatatc ggcgacatta attcgatcga gattgctgga 540

aatggcggtt ggtacggcta cgaaaggcct gttaaatcac caaaatacat ctatgaaatc 600

gggaacggtg tagatctggt aaccacaaca tttggtcaca caatcgatat tttacaatac 660

atgacaagtt cgtacttttc caggataaat gcaatggttt tcaataatat tccagagcaa 720

gagctgatag atgagcgtgg taaccgattg ggccagcgag tcccaaagac agtaccggat 780

catcttttat tccaaggcac attgttaaat ggcaatgttc cagtgtcatg cagtttcaaa 840

ggtggcaaac ctaccaaaaa atttaccaaa aatttggtca ttgacattca cggtaccaag 900

ggagatttga aacttgaagg cgatgccggc ttcgcagaaa tttcaaatct ggtcctttac 960

tacagtggaa ctagagcaaa cgacttcccg ctagccaatg gacaacaagc tcctttagac 1020

ccggggtatg atgcaggtaa agaaatcatg gaagtatatc atttacgaaa ttataatgcc 1080

attgtgggta atattcatcg actgtatcaa tctatctctg acttccactt caatacaaag 1140

aaaattcctg aattaccctc acaatttgta atgcaaggtt tcgatttcga aggctttccc 1200

accttgatgg atgctctgat attacacagg ttaatcgaga gcgtttataa aagtaacatg 1260

atgggctcca cattaaacgt tagcaatatc tcgcattata gtttataa 1308

<210> 7

<211> 1479

<212> DNA

<213> 强启动子PGK1P

<400> 7

tctaactgat ctatccaaaa ctgaaaatta cattcttgat taggtttatc acaggcaaat 60

gtaatttgtg gtattttgcc gttcaaaatc tgtagaattt tctcattggt cacattacaa 120

cctgaaaata ctttatctac aatcatacca ttcttataac atgtcccctt aatactagga 180

tcaggcatga acgcatcaca gacaaaatct tcttgacaaa cgtcacaatt gatccctccc 240

catccgttat cacaatgaca ggtgtcattt tgtgctctta tgggacgatc cttattaccg 300

ctttcatccg gtgatagacc gccacagagg ggcagagagc aatcatcacc tgcaaaccct 360

tctatacact cacatctacc agtgtacgaa ttgcattcag aaaactgttt gcattcaaaa 420

ataggtagca tacaattaaa acatggcggg cacgtatcat tgcccttatc ttgtgcagtt 480

agacgcgaat ttttcgaaga agtaccttca aagaatgggg tctcatcttg ttttgcaagt 540

accactgagc aggataataa tagaaatgat aatatactat agtagagata acgtcgatga 600

cttcccatac tgtaattgct tttagttgtg tatttttagt gtgcaagttt ctgtaaatcg 660

attaattttt ttttctttcc tctttttatt aaccttaatt tttattttag attcctgact 720

tcaactcaag acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc 780

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 840

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 900

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 960

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 1020

tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 1080

cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 1140

agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 1200

ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 1260

cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 1320

atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 1380

tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 1440

aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaac 1479

<210> 8

<211> 599

<212> DNA

<213> 终止子GIC1T

<400> 8

actagttttc ttctttcctc ctcttctttg aactgcttcc aaattctgtc tttaagtcca 60

tcacatggtg ttttatggga ttttgtatta ttacggtgtt cggttttctt ttgggtattg 120

agcttttatt ttggtcttaa tttttttttt tctttttcaa accatggact ttattataat 180

taatctacga caacttttaa tgattatttc tttcttcaaa tatacacgta tgtattattt 240

ctttttacta tattcttaac tctttattcc tgctcagaca acgtttcaac caacgttaat 300

atttcgttct tgtaattaat caattgggct attaagggaa tacaaccttt gaaacttgtc 360

tgcgattgtc tcaatgaaga aggaacggac agtactccac caaacatcaa aattgggtcg 420

tagtcttgtt taagtttgtg actctgagtt ttttgctttt ctggcttcgt tccttttttt 480

ctctgagtca atttattatc ttcttcctct ttcttttctt gcttatcttg agcttttctt 540

ttgacgattt cgacaactac cttggagttt ttttcttcca ctgttgccat tagttgacc 599

<210> 9

<211> 1001

<212> DNA

<213> 强启动子TEF1p

<400> 9

cttcatcggt atcttcgcta tattcttttt agtcgaattt gcggggagaa gatggatcta 60

tgctaaacta aataggcatt tgaaaaacga cgacgagtta cacgacatat cgccatcttt 120

aaatgagcaa ccacactggg acctcataga ggacgggtct cgctggagta aatttttcaa 180

cgggataatt aagacgacaa gaaggttcac gaaatcttta atgaggtctt tagtcagagg 240

caggaacagc cgtcaagggg gcataagact acggtcatcc ccatctgcct cttcgtccag 300

ccttgccaac agggagttct tcagagacat ggaggctcaa aacgaaatta ttgacagcct 360

agacatcaat agtcatacaa cagaaagcga ccacccaact ttggctgata atagcgtata 420

aacaatgcat actttgtacg ttcaaaatac aatgcagtag atatatttat gcatattaca 480

tataatacat atcacatagg aagcaacagg cgcgttggac ttttaatttt cgaggaccgc 540

gaatccttac atcacaccca atcccccaca agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa 600

tgtttctact ccttttttac tcttccagat tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac 660

ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt 720

aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg 780

tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga 840

tttttttctc tttcgatgac ctcccattga tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc 900

tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt ttttacttct tgctcattag 960

aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt taattacaaa a 1001

<210> 10

<211> 258

<212> DNA

<213> 终止子PGK1T

<400> 10

cgatagatca atttttttct tttctctttc cccatccttt acgctaaaat aatagtttat 60

tttatttttt gaatattttt tatttatata cgtatatata gactattatt tatcttttaa 120

tgattattaa gatttttatt aaaaaaaaat tcgctcctct tttaatgcct ttatgcagtt 180

tttttttccc attcgatatt tctatgttcg ggttcagcgt attttaagtt taataactcg 240

aaaattctgc gttcgtta 258

<210> 11

<211> 418

<212> DNA

<213> 诱导型启动子HTX7P

<400> 11

acttctcgta ggaacaattt cgggcccctg cgtgttcttc tgaggttcat cttttacatt 60

tgcttctgct ggataatttt cagaggcaac aaggaaaaat tagatggcaa aaagtcgtct 120

ttcaaggaaa aatccccacc atctttcgag atcccctgta acttattggc aactgaaaga 180

atgaaaagga ggaaaataca aaatatacta gaactgaaaa aaaaaaagta taaatagaga 240

cgatatatgc caatacttca caatgttcga atctattctt catttgcagc tattgtaaaa 300

taataaaaca tcaagaacaa acaagctcaa cttgtctttt ctaagaacaa agaataaaca 360

caaaaacaaa aagttttttt aattttaatc aaaaaatgtc acaagacgct gctattgc 418

<210> 12

<211> 717

<212> DNA

<213> 乙酸异戊酯氢化酶基因IAH1

<400> 12

atggattacg agaagtttct gttatttggg gattccatta ctgaatttgc ttttaatact 60

aggcccattg aagatggcaa agatcagtat gctcttggag ccgcattagt caacgaatat 120

acgagaaaaa tggatattct tcaaagaggg ttcaaagggt acacttctag atgggcgttg 180

aaaatacttc ctgagatttt aaagcatgaa tccaatattg tcatggccac aatatttttg 240

ggtgccaacg atgcatgctc agcaggtccc caaagtgtcc ccctccccga atttatcgat 300

aatattcgtc aaatggtatc tttgatgaag tcttaccata tccgtcctat tataatagga 360

ccggggctag tagatagaga gaagtgggaa aaagaaaaat ctgaagaaat agctctcgga 420

tacttccgta ccaacgagaa ctttgccatt tattccgatg ccttagcaaa actagccaat 480

gaggaaaaag ttcccttcgt ggctttgaat aaggcgtttc aacaggaagg tggtgatgct 540

tggcaacaac tgctaacaga tggactgcac ttttccggaa aagggtacaa aatttttcat 600

gacgaattat tgaaggtcat tgagacattc tacccccaat atcatcccaa aaacatgcag 660

tacaaactga aagattggag agatgtgcta gatgatggat ctaacataat gtcttga 717

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> GA-U

<400> 13

ggttggcctc tacttactc 19

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> GA-D

<400> 14

gaatatagcg aagataccga tgaaggacgg gagtggaaag aacggg 46

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> GB-U

<400> 15

tatcagatcc actagtggcc tatgcgcatc ttgccctgtg cttg 44

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> GB-D

<400> 16

ccatgctacc ttccatgg 18

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> TEF1P-U

<400> 17

gtttcccgtt ctttccactc ccgtccttca tcggtatctt cgc 43

<210> 18

<211> 44

<212> DNA

<213> TEF1P-D

<400> 18

atgattgtac ggcagagggc gacatttttg taattaaaac ttag 44

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> ACS1-U

<400> 19

tctaatctaa gttttaatta caaaaatgtc gccctctgcc gta 43

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> ACS1-D

<400> 20

gagaaaagaa aaaaattgat ctatcgttac aacttgaccg aatcaattag 50

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> PGK1T-U

<400> 21

ctaattgatt cggtcaagtt gtaacgatag atcaattttt ttcttttctc 50

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> PGK1T-D

<400> 22

cagttttgga tagatcagtt agataacgaa cgcagaattt tcgag 45

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> PGK1P-U

<400> 23

ctcgaaaatt ctgcgttcgt tatctaactg atctatccaa aactg 45

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> PGK1P-D

<400> 24

cagcagtgtc aaagtgtagc ttagtcatgt tttatatttg ttgtaaaaag 50

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> ALD6-U

<400> 25

ctttttacaa caaatataaa acatgactaa gctacacttt gacactgctg 50

<210> 26

<211> 42

<212> DNA

<213> ALD6-D

<400> 26

ggaggaaaga agaaaactag tttacaactt aattctgaca gc 42

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> GIC1T-U

<400> 27

gctgtcagaa ttaagttgta aactagtttt cttctttcct cc 42

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> GIC1T-D

<400> 28

ggaggaaaga agaaaactag tgttttatat ttgttgtaaa aag 43

<210> 29

<211> 43

<212> DNA

<213> PGK1P(G)-U

<400> 29

ctttttacaa caaatataaa acactagttt tcttctttcc tcc 43

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> PGK1P(Ae)-D

<400> 30

cctgacagat gaagccatgt tttatatttg ttgtaaaaag 40

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> AeAT9-U

<400> 31

ctttttacaa caaatataaa acatggcttc atctgtcagg 40

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> AeAT9-D

<400> 32

gagaaaagaa aaaaattgat ctatcgttaa gagtatggag atcta 45

<210> 33

<211> 45

<212> DNA

<213> PGK1T(Ae)-U

<400> 33

tagatctcca tactcttaac gatagatcaa tttttttctt ttctc 45

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> PGK1T(Kan)-D

<400> 34

gcgtacgaag cttcagctgt aacgaacgca gaattttcg 39

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> Kan-U

<400> 35

cgaaaattct gcgttcgtta cagctgaagc ttcgtacgc 39

<210> 36

<211> 50

<212> DNA

<213> Kan(G)-D

<400> 36

ggccaagcac agggcaagat gctttaaagc atcttgccct gtgcttggcc 50

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> IA-U

<400> 37

ctctccacca ctagtacc 18

<210> 38

<211> 40

<212> DNA

<213> IA-D

<400> 38

aaattgttcc tacgagaagt atttggtcac agtttaagcg 40

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<213> IB-U

<400> 39

cagatccact agtggcctat gcgatgtgct agatgatgg 39

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> IB-D

<400> 40

ctcctggtcc catatgtgc 19

<210> 41

<211> 40

<212> DNA

<213> PGK1p(I)-U

<400> 41

cgcttaaact gtgaccaaat acttctcgta ggaacaattt 40

<210> 42

<211> 42

<212> DNA

<213> PGK1p(I)-D

<400> 42

gagtttctgg aatagacatg caatagcagc gtcttgtgac at 42

<210> 43

<211> 42

<212> DNA

<213> ADH2-U

<400> 43

atgtcacaag acgctgctat tgcatgtcta ttccagaaac tc 42

<210> 44

<211> 41

<212> DNA

<213> ADH2-D

<400> 44

gaaaaaaatt gatctatcgt tatttagaag tgtcaacaac g 41

<210> 45

<211> 41

<212> DNA

<213> PGK1T(A)-U

<400> 45

cgttgttgac acttctaaat aacgatagat caattttttt c 41

<210> 46

<211> 39

<212> DNA

<213> Kan(I)-D

<400> 46

ccatcatcta gcacatcgca taggccacta gtggatctg 39

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> PA-U

<400> 47

ctgatcttgt cttactcgtt c 21

<210> 48

<211> 43

<212> DNA

<213> PA-D

<400> 48

gcgtacgaag cttcagctgc gtaggtaatt tctaacactt tcc 43

<210> 49

<211> 41

<212> DNA

<213> PB-U

<400> 49

cagatccact agtggcctat gcgggtgtgg gtatgtcttt c 41

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> PB-D

<400> 50

cttaaaaccg aagtcttcgg 20

<210> 51

<211> 43

<212> DNA

<213> Kan(P)-U

<400> 51

ggaaagtgtt agaaattacc tacgcagctg aagcttcgta cgc 43

<210> 52

<211> 41

<212> DNA

<213> Kan(P)-D

<400> 52

gaaagacata cccacacccg cataggccac tagtggatct g 41

<210> 53

<211> 28

<212> DNA

<213> Zeocin-U

<400> 53

atcgtcgacc ccacacacca tagcttca 28

<210> 54

<211> 29

<212> DNA

<213> Zeocin-D

<400> 54

gcggtcgaca gcttgcaaat taaagcctt 29

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> GA-S

<400> 55

ctgctggtct tctggtctgt 20

<210> 56

<211> 19

<212> DNA

<213> TEF1-X

<400> 56

ttttgtaatt aaaacttag 19

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> ACS1-S

<400> 57

atgtcgccct ctgccgtaca atc 23

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> PGK1p-X

<400> 58

cgatttacag aaacttgcac ac 22

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> ALD6-S

<400> 59

tcaccacctt agagccaatc 20

<210> 60

<211> 19

<212> DNA

<213> PGK1T-U

<400> 60

cgatagatca atttttttc 19

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> KAN-X

<400> 61

gttattcatt cgtgattgcg cc 22

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> KAN-S

<400> 62

cagactaaac tggctgacgg 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> GB-X

<400> 63

tgcccacaga ctaagttcca 20

<210> 64

<211> 24

<212> DNA

<213> IA-S

<400> 64

gcatcgtacg caggatggaa attg 24

<210> 65

<211> 23

<212> DNA

<213> PGK1P-X

<400> 65

gcaatagcag cgtcttgtga cat 23

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> PGK1P-S

<400> 66

acttctcgta ggaacaattt 20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> PGK1T-X

<400> 67

taacgaacgc agaattttcg 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> KAN-S

<400> 68

cagactaaac tggctgacgg 20

<210> 69

<211> 22

<212> DNA

<213> IA-X

<400> 69

caagccatag ctgcttctgg ag 22

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> PA-S

<400> 70

gatgtgtata tgttcatgcg 20

<210> 71

<211> 22

<212> DNA

<213> KAN-X

<400> 71

gttattcatt cgtgattgcg cc 22

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> KAN-S

<400> 72

cagactaaac tggctgacgg 20

<210> 73

<211> 21

<212> DNA

<213> PB-X

<400> 73

cttactacca gaggcagcaa c 21

Claims

1.一种酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，该工程菌株异源过表达乙醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1和醇酰基转移酶基因AeAT9；

优选的，该工程菌株还异源过表达乙醇脱氢酶基因ADH2；和/或

所述工程菌株不表达负责胞浆丙酮酸到线粒体运输的孔蛋白基因POR2。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌株，其中，所述乙醛脱氢酶基因ALD6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；和/或

所述乙酰辅酶A合成酶基因ACS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或

所述乙醇脱氢酶基因ADH2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和/或

所述醇酰基转移酶基因AeAT9的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；和/或

负责胞浆丙酮酸到线粒体运输的孔蛋白基因POR2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母基因工程菌株，其中，所述乙醛脱氢酶基因ALD6连接有PGK1_P强启动子(SEQ ID NO:7)，GIC1_T终止子(SEQ ID NO:8)；和/或

所述乙酰辅酶A合成酶基因ACS1连接有TEF1_P强启动子(SEQ ID NO:9)，PGK1_T终止子(SEQ ID NO:10)；和/或

所述醇酰基转移酶基因AeAT9连接有PGK1_P强启动子(SEQ ID NO:7)，PGK1_T终止子(SEQID NO:10)；和/或

所述乙醇脱氢酶基因ADH2连接有HTX7_P诱导型启动子(SEQ ID NO:11)，PGK1_T终止子(SEQ ID NO:10)。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的酿酒酵母基因工程菌株，其中，所述工程菌株的出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。

5.根据权利要求4所述的酿酒酵母基因工程菌株，其中，在所述酿酒酵母基因工程菌株中，乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、醛脱氢酶基因ALD6和醇酰基转移酶基因AeAT9依次连接，并插入到酿酒酵母中半乳糖的转录调节因子的编码基因Gal80区，且将其替换；

优选的，所述编码基因Gal80的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

6.根据权利要求4或5所述的酿酒酵母基因工程菌株，其中，乙醇脱氢酶基因ADH2的插入位点为酿酒酵母中乙酸异戊酯氢化酶基因IAH1，且将其替换；

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的酿酒酵母基因工程菌株，其中，所述基因工程菌株负责胞浆丙酮酸到线粒体运输的孔蛋白基因POR2被敲除。

8.权利要求1-7中任意一项所述的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于，该方法包括：在酿酒酵母中引入醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、醇酰基转移酶基因AeAT9和可选的乙醇脱氢酶基因ADH2，并且可选的将负责胞浆丙酮酸到线粒体运输的孔蛋白基因POR2失活或敲除。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，该方法进一步包括：

(1)在酿酒酵母中引入乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、醛脱氢酶基因ALD6和醇酰基转移酶基因AeAT9，并通过同源重组的方法替换酿酒酵母中半乳糖的转录调节因子的编码基因Gal80，得到第一重组菌株；

(2)在所述第一重组菌株中引入乙醇脱氢酶基因ADH2，并通过同源重组的方法替换酿酒酵母中乙酸异戊酯氢化酶基因IAH1，得到第二重组菌株；

(3)将所述第二重组菌株中负责胞浆丙酮酸到线粒体运输的孔蛋白基因POR2敲除，得到所述酿酒酵母基因工程菌株；

优选的，通过将KanMX抗性基因所述孔蛋白基因POR2进行同源重组从而实现其的敲除。

10.权利要求1-7中任意一项所述的酿酒酵母基因工程菌株在高产乙酸乙酯中的用途。