CN108485996A - 一种新型产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明通过在出发菌株中，以转录调节因子Gal80基因作为整合位点，同时选用强启动子PGK1p过表达绿色植物来源的醇酰基转移酶AAT，提供两株低产高级醇高产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株α‑AeAT9和α‑VAAT。玉米水解液发酵5天后，过表达醇酰基转移酶AeAT9和VAAT的改造菌株其乙酸乙酯的含量分别达883.6mg/L和228.4mg/L，分别是出发菌株的40.9倍和10.6倍；主要高级醇(异丁醇、异戊醇、正丙醇、苯乙醇)含量分别为101.1mg/L和124.9mg/L，分别较出发菌株降低了49.5％和23.5％，满足白酒相关领域对酵母的较高要求，具有广阔的应用前景。

Description

一种新型产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及构建方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种新型产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术：

白酒又名“烧酒”，在中国有着源远流长的历史，深受人民群众喜爱，经久不衰。它是以粮谷为制酒原料，以酒曲为糖化发酵剂，经过蒸馏、贮存和勾调而成含酒精的饮料，是我国特有的一大酒种，也是世界著名六大蒸馏酒之一。酯类是我国白酒中的主要香气成分，其种类较多，在白酒中大多以乙酯形式存在，具有水果样芳香和口味，是酒芳香的主要担体，使人产生喜悦感。白酒中大部分酯对酒的风味都有积极作用，提高酒中酯类物质的含量可以增进酒的风味，改善酒的品质。

传统白酒的酿造过程属于开放式操作，自然网罗了大量的环境微生物，从原料、用水、空气、曲、醅、场地、工用具、设备、窖池、乃至人手及鞋等，微生物无处不在。庞杂的微生物体系在发酵体系中互相联系、互相影响，协同共酵、拮抗竞争，进行着复杂的物质转换、能量代谢和信息传递活动。多样的微生物种类、繁复的代谢机制和种群间关系、复杂的生化反应，致使传统白酒的酿造机理尚无法解释清楚；另一方面，这些环境微生物的存在严重影响了原料的出酒率，其酒精发酵效率不到酿酒酵母的三分之一，因而导致我国高档白酒饮料酒粮耗高、生产周期长、效率低、成本高。同时，白酒工业的现代化发展，清洁生产和GMP (良好生产规范)理念逐步在白酒行业的应用，意味着一些传统工艺必然改变，酿酒功能菌的生长繁殖和代谢环境及条件亦会随之而变，这就要求白酒机械化必须与微生物的研发同步。构建新型高产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，使其在发酵过程中保持优良酒精发酵特性的同时生产基础酯香物质乙酸乙酯，对于白酒产品风味特征维持与强化，对于质量提高与稳定，乃至发酵工艺改革，都具有重要意义。

如何提高饮料酒中酯香物质的含量，能否引入外源醇酰基转移酶途径进一步提高乙酸乙酯的产量，是解决白酒生产中“增乙降乳”的一个新思路。以乙酸乙酯为主体香的白酒中乳酸乙酯含量过高或与乙酸乙酯的量比关系失调，是当前白酒生产中普遍存在的问题。这样使得蒸馏出的新酒有香气闷和苦涩感，并随着贮存年限的增长，使乳酸乙酯分解为过量的乳酸，使老酒的苦涩味愈加严重，掩盖了乙酸乙酯特有的纯正醇香。所以“增乙降乳”成为该类白酒中的一种研究趋势。国内大部分研究都是通过优化发酵工艺、蒸馏工艺和勾兑技术使白酒中高级醇和酯的构成及量比关系达到最理想的状态，导致我国高档白酒存在耗粮高、生产周期长、效率低、成本高等问题。而构建新型高产酯低产高级醇酿酒酵母工程菌株，才可以从根本上解决酯含量较低而高级醇含量较高的问题，也是工业微生物育种的发展方向。

白酒中的酯类生成途径主要有两条，一是通过一些生香酵母(如汉逊酵母、假丝酵母等) 体内的酯化酶作用产生，二是通过缓慢的酯化反应而产生，在常温条件下极为缓慢，往往需要经几年时间才能使酯化反应达平衡。酿酒酵母在白酒发酵过程中生成酒精的同时，产生了一定量的高级醇以及少量的酯类。研究表明，ATF1基因编码的醇乙酰基转移酶是乙酸乙酯、乙酸异戊酯等乙酸酯类合成的关键酶，并存在于细胞膜上，该酶催化醇类和乙酰辅酶A形成乙酸酯。Lilly等人用工业菌株过表达ATF1，用葡萄汁发酵培养基进行发酵，葡萄酒中的乙酸乙酯浓度提高了3-10倍，乙酸异戊酯浓度提高了4-12倍。但目前国内酿酒研究中，并没有引入外源无害尤其是绿色植物来源的醇酰基转移酶基因以达到大幅提高乙酸乙酯产量的研究。

发明内容：

本发明的目的是解决酿酒酵母在酿酒生产中乙酸乙酯合成不足的问题，提供一种新型的产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。

为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

本发明提供一种新的方法：将绿色植物来源的醇酰基转移酶AAT异源整合到酿酒酵母基因组上以提高乙酸乙酯生成量。本发明提供两株低产高级醇高产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株，命名为：α-AeAT9和α-VAAT。将猕猴桃的醇酰基转移酶AeAT9基因和草莓的醇酰基转移酶 VAAT基因经过密码子优化后，分别异源过表达于酿酒酵母菌株AY12(CICC32315)的单倍体ɑ型菌株。玉米水解液发酵5天后，过表达AeAT9和VAAT的改造菌株的乙酸乙酯含量分别达676.5mg/L和228.4mg/L，与出发株AY12-α相比分别提高了34倍和11倍左右；同时改造菌株的高级醇生成量显著降低，异戊醇分别降低了约47.5％和34.1％，苯乙醇分别降低了约34.3％和21.4％。

一株产乙酸乙酯的新型酿酒酵母菌株，是通过在酿酒酵母出发菌株中异源表达来自绿色植物的醇酰基转移酶AAT构建的；

进一步地，所述产乙酸乙酯的新型酿酒酵母菌株是以转录调节因子Gal80基因为整合位点，用强启动子PGK1过表达醇乙酰基转移酶基因所得；

所述Gal80基因，其Gene ID为：854954，核苷酸序列如核苷酸列表中SEQ ID NO:1所示；

优选地，所述醇酰基转移酶AAT具体为猕猴桃的醇酰基转移酶AeAT9基因，其Protein ID 为AIC83789.1，酿酒酵母密码子优化后核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ IDNO:2所示；

优选地，所述醇酰基转移酶AAT具体为草莓的醇酰基转移酶VAAT基因，其ProteinID为： CAC09062.1，酿酒酵母密码子优化后核苷酸序列如核苷酸列表中SEQ ID NO:3所示；

所述启动子PGK1其Gene ID为：850370，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AY12，编号CICC32315。

本发明所述新型产乙酸乙酯酵母菌株的构建方法概述如下：

(1)密码子优化并合成基因AeAT9，VAAT；

(2)将目的基因AeAT9与VAAT分别连接到含有PGK1强启动子和终止子的质粒上，通过PCR扩增分别获得含AeAT9与VAAT基因的表达盒；

(3)以出发酵母菌株Gal80基因作为整合位点，分别过表达含AeAT9基因的表达盒与含VAAT基因的表达盒，分别获得重组菌株。

具体包括如下步骤：

(1)过表达AeAT9，VAAT基因重组片段的构建

1)根据NCBI上提供的猕猴桃的醇酰基转移酶和草莓的醇酰基转移酶的蛋白质信息，对基因序列进行合成，并完成酿酒酵母密码子优化，分别得到包含AeAT9密码子优化的pUC57-AeAT9质粒以及VAAT密码子优化的pUC57-VAAT质粒；

2)分别以上述pUC57-AeAT9质粒和pUC57-VAAT质粒作为模板，PCR分别扩增AeAT9基因(SEQ ID NO:2)和VAAT基因(SEQ ID NO:3)；

3)对质粒Yep352-PGK进行酶切线性化，切胶回收线性化质粒，将AeAT9基因及VAAT基因分别与线性化质粒进行体外重组，构建质粒Yep352-PGK(AeAT9)和Yep352-PGK(VAAT)；

4)以质粒pUG6为模板，PCR扩增KanMX基因；以出发株酿酒酵母基因组作为模板，PCR扩增分别得到Gal80基因的上下同源臂GA和GB；

(2)过表达AeAT9及VAAT菌株的构建

1)分别以质粒Yep352-PGK(AeAT9)及Yep352-PGK(VAAT)为模板，PCR扩增获得PGK1_P-AeAT9-PGK1_T及PGK1_P-VAAT-PGK1_T片段；

2)制备出发酿酒酵母菌株AY12的单倍体，筛选出各项发酵性能综合最优的a型和α型单倍体分别作为出发菌株，以下步骤操作以α型为例；

3)将PCR得到带相邻片段同源区的上述片段：GA、PGK1_P-AeAT9-PGK1_T/ PGK1_P-VAAT-PGK1_T、KanMX和GB，经过醋酸锂化学转化分别导入出发酵母菌株α型单倍体中，同源重组后得到新型产乙酸乙酯的α型酿酒酵母重组菌株1和2；

4)用pGAPza质粒去除步骤(2)-3)获得重组菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX基因的重组菌株，传代分别得到不含pGAPza质粒的重组菌株α-AeAT9和α-VAAT；

所述重组菌株可通过上述方法构建，所涉及具体操作方法已有很多文献报道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。

有益效果：

1、本发明提供了一种新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，既克服了普通酿酒酵母生成乙酸乙酯的能力低下，同时降低了对人体有不良影响的高级醇的产量。

2、本发明提供的新型产乙酸乙酯酿酒酵母在保持良好发酵性能的前提下，以转录调节因子基因Gal80作为整合位点，分别异源高表达猕猴桃的醇酰基转移酶AeAT9基因及草莓的醇酰基转移酶VAAT基因，达到了高产乙酸乙酯的目的，为酿造出风味优良且更有利于健康的白酒奠定了理论基础，具有广阔的市场前景。

3、本发明选育得到的酵母菌株乙酸乙酯、高级醇生成量有显著变化：玉米水解液发酵5 天后，亲本α型菌株的乙酸乙酯的产量为21.6mg/L，过表达醇酰基转移酶AeAT9和VAAT的改造菌株其乙酸乙酯的含量分别达883.6mg/L和228.4mg/L，分别是出发菌株的40.9倍和10.6 倍；主要高级醇(异丁醇、异戊醇、正丙醇、苯乙醇)含量分别为101.1mg/L和124.9mg/L，分别较出发菌株降低了49.5％和23.5％。

4、本发明选育得到的酵母菌株通过Cre/LoxP系统完全剔除了KanMX抗性基因，不含外源抗性基因，可以安全的用于工业生产，有广泛的应用前景。

附图说明

图1为Yep352-PGK质粒构建过程；

图2为质粒Yep352-PGK的PCR验证：

其中：M为marker；1，2为分别以质粒Yep352-PGK为模板，PCR扩增得到的PGK1_P及PGK1_T片段。

图3为Yep352-PGK(AeAT9)质粒构建过程；

图4为质粒Yep352-PGK(AeAT9)的PCR验证：

其中：M为marker；1，2为分别以质粒Yep352-PGK(AeAT9)为模板，PCR扩增得到的AeAT9和PGK1_P-AeAT9-PGK1_T片段。

图5为Yep352-PGK(VAAT)质粒构建过程：

图6为质粒Yep352-PGK(VAAT)的PCR验证：

其中：M为marker；1，2为分别以质粒Yep352-PGK(VAAT)为模板，PCR扩增得到的VAAT和PGK1_P-VAAT-PGK1_T片段。

图7为胞内整合醇酰基转移酶AeAT9及VAAT的同源重组过程；

图8为胞内整合醇酰基转移酶AeAT9重组子的PCR验证：

其中：(a)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株1的基因组为模板，以D1-U/DA-D为引物，PCR扩增验证片段；

(b)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株1的基因组为模板，以DA-U/D2-D为引物，PCR扩增验证片段。

(c)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株1的基因组为模板，以D3-U/D3-D为引物，PCR扩增验证片段。

图9为胞内整合醇酰基转移酶VAAT重组子的PCR验证：

其中：(a)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株2的基因组为模板，以D1-U/DV-D为引物，PCR扩增验证片段；

(b)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株2的基因组为模板，以DV-U/D2-D为引物，PCR扩增验证片段。

(c)中M为marker；1为以出发菌株α的基因组为模板，2为以重组菌株2的基因组为模板，以D3-U/D3-D为引物，PCR扩增验证片段。

图10为KanMX抗性基因的丢除及pGAPza质粒的丢失验证电泳图：

其中：(a)中M为marker；1为以菌株丢KanMX前的基因组为模板，2为以丢KanMX 后的基因组为模板，以Kr-U/Kr-D为引物，PCR扩增验证片段；

(b)中M为marker；1、2为以传代前的重组菌株的基因组为模板，3为以传代后的重组菌株的基因组为模板，以Zeocin-U/Zeocin-D为引物，PCR扩增验证片段。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所使用的酿酒酵母是可以采用任何来源的酿酒酵母菌株。

实施例1：新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的构建

本实例所用的出发菌株AY12(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315)。大肠杆菌DH5a购自Takara公司。YPD培养基为通用的完全培养基，固体培养基含2％进口琼脂粉。

菌株主要构建过程如下：

(1)Yep352-PGK质粒的构建

以Yep352质粒作为基础质粒构建Yep352-PGK，构建流程如图1所示。以酿酒酵母AY12-α (酿酒酵母菌株AY12(CICC32315)的单倍体ɑ型菌株)基因组为模板，设计引物PGK1_P-U (SEQ ID NO:5)和PGK1_P-D(SEQ ID NO:6)PCR扩增得到1496bp的PGK1_P片段；设计引物PGK1_T-U(SEQ ID NO:7)和PGK1_T-D(SEQ ID NO:8)PCR扩增得到275bp的PGK1_T片段。使用融合PCR方法将PGK1_P和PGK1_T进行融合，得到片段PGK1_P-PGK1_T，大小为1771 bp；用限制性内切酶BamHI和SalI分别对Yep352和融合片段PGK1_P-PGK1_T进行酶切，对质粒Yep352切胶回收，PGK1_P-PGK1_T酶切回收后用连接酶进行连接，得到质粒Yep352-PGK。

图2为质粒Yep352-PGK的验证电泳图：其中泳道M为5000bp DNA Ladder Marker；泳道1，2分别以质粒Yep352-PGK为模板PCR扩增到的1496bp PGK1_P和275bp PGK1_T片段。

(2)Yep352-PGK(AeAT9)质粒的构建

以Yep352-PGK质粒作为基础质粒构建Yep352-PGK(AeAT9)，构建流程如图3所示。在NCBI上找到猕猴桃AeAT9蛋白序列，并交由苏州金唯智公司完成酿酒酵母的密码子优化和基因合成。合成的优化片段使用引物AeAT9-U(SEQ ID NO:9)和AeAT9-D(SEQ ID NO:10)PCR扩增得到1299bp的AeAT9片段。用限制性内切酶XhoI对质粒Yep352-PGK进行酶切，对质粒Yep352-PGK切胶回收，用诺唯赞II重组酶将AeAT9片段与线性化 Yep352-PGK质粒进行体外重组，得到质粒Yep352-PGK(AeAT9)。

图4为质粒Yep352-PGK(AeAT9)的验证电泳图：其中泳道M为5000bp DNA LadderMarker；泳道1为优化后1299bp的AeAT9片段；泳道2以质粒Yep352-PGK(AeAT9)为模板PCR扩增到的3036bp的PGK1_P-AeAT9-PGK1_T片段。

(2)Yep352-PGK(VAAT)质粒的构建

以Yep352-PGK质粒作为基础质粒构建Yep352-PGK(VAAT)，构建流程如图5所示。在NCBI上找到草莓的VAAT蛋白序列，并交由苏州金唯智公司完成酿酒酵母的密码子优化和基因合成。合成的优化片段使用引物VAAT-U(SEQ ID NO:11)和VAAT-D(SEQ ID NO:12)PCR 扩增得到1368bp的VAAT片段。用限制性内切酶XhoI对质粒Yep352-PGK进行酶切，对质粒Yep352-PGK切胶回收，用诺唯赞II重组酶将VAAT片段与线性化 Yep352-PGK质粒进行体外重组，得到质粒Yep352-PGK(VAAT)。

图6为质粒Yep352-PGK(VAAT)的验证电泳图：其中泳道M为5000bp DNA LadderMarker；泳道1为优化后1368bp的VAAT片段；泳道2以质粒Yep352-PGK(VAAT)为模板 PCR扩增到的3105bp的PGK1_P-VAAT-PGK1_T片段。

(3)猕猴桃AeAT9基因及草莓VAAT基因的过表达

以酵母AY12-α型单倍体菌株的基因组为模板，分别使用引物GA-U(SEQ ID NO:13)和 GA-D(SEQ ID NO:14)PCR扩增得到Gal80基因的563bp的上游同源臂的GA片段以及GB-U(SEQ ID NO:15)和GB-D(SEQ ID NO:16)扩增得到732bp的下游同源臂GB；以质粒pUG6 作为模板，使用引物Kr-U(SEQ ID NO:17)和Kr-D(SEQ ID NO:18)，扩增得到1613bp的 loxp-KanMX-loxp片段；分别以质粒Yep352-PGK(AeAT9)及Yep352-PGK(VAAT)作为模板，使用引物PP-U(SEQ ID NO:19)和PP-D(SEQ ID NO:20)PCR扩增得到3036bp的 PGK1_P-AeAT9-PGK1_T片段及3105bp的PGK1_P-VAAT-PGK1_T片段。整个过程所用引物的序列如表1。

表1 PCR引物

以上PCR得到的四个片段GA、PGK1_P-AeAT9-PGK1_T、loxp-KanMX-loxp和GB及GA、PGK1_P-VAAT-PGK1_T、loxp-KanMX-loxp和GB用醋酸锂转化法分别转化入出发株AY12-ɑ，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母单倍体重组菌株1和重组菌株2。同源重组过程如图7所示。

重组酿酒酵母单倍体的验证：

根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计三组上下游引物，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。引物序列为：

分别以引物D1-U/DA-D、DA-U/D2-D和D3-U/D3-D进行上中下游定点PCR验证重组菌株1，其中上游引物D1-U/DA-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条3700bp 左右的特异性条带，其大小与预期一致；中游引物DA-U/D2-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条3200bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；下游引物D3-U/D3-D 的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条2700bp的特异性条带，其大小与预期一致，出发菌ɑ的阴性对照无条带，说明重组盒GA-PGK1_P-AeAT9-PGK1_T-loxp-KanMX-loxp-GB 片段已成功重组到酿酒酵母AY12-ɑ基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图8所示，为重组酿酒酵母验证结果。

图8中(a)中M为5000bp DNA Ladder Marker，其中泳道1为出发菌株AY12-ɑ的上游定点验证阴性对照；泳道2为重组子1上游定点验证PCR产物；(b)中M为5000bp DNA LadderMarker，其中泳道1为出发菌株AY12-ɑ的中游定点验证阴性对照；泳道2为重组子1 中游定点验证PCR产物；(c)中M为5000bp DNA Ladder Marker，其中泳道1为出发菌株 AY12-ɑ的下游定点验证阴性对照；泳道2为重组子1下游定点验证PCR产物。

分别以引物D1-U/DV-D、DV-U/D2-D和D3-U/D3-D进行上中下游定点PCR验证重组菌株2，其中上游引物D1-U/DV-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条3700bp 左右的特异性条带，其大小与预期一致；中游引物DV-U/D2-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条3200bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；下游引物D3-U/D3-D 的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条2700bp的特异性条带，其大小与预期一致，出发菌ɑ的阴性对照无条带，说明重组盒GA-PGK1_P-VAAT-PGK1_T-loxp-KanMX-loxp-GB 片段已成功重组到酿酒酵母AY12-ɑ基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图9所示，为重组酿酒酵母验证结果。

图9中(a)中M为5000bp DNA Ladder Marker，其中泳道1为出发菌株AY12-ɑ的上游定点验证阴性对照；泳道2为重组子2上游定点验证PCR产物；(b)中M为5000bp DNA LadderMarker，其中泳道1为出发菌株AY12-ɑ的中游定点验证阴性对照；泳道2为重组子2 中游定点验证PCR产物；(c)中M为5000bp DNA Ladder Marker，其中泳道1为出发菌株 AY12-ɑ的下游定点验证阴性对照；泳道2为重组子2下游定点验证PCR产物。

通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株1和2获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以基因组为模板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株则能扩增得到该片段，PCR验证结果如图10(a)所示。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株ɑ-AeAT9和ɑ-VAAT，提取酵母质粒，以 Zeocin-F/Zeocin-R(SEQID NO:21/22)为引物进行PCR验证如图10(b)所示。

实施例2：新型产乙酸乙酯酵母菌株的玉米水解液发酵实验

玉米液态白酒发酵实验

1)发酵工艺路线：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷却→过滤→接菌→发酵→蒸酒→测定指标；

2)工艺条件

浸泡条件：60～70℃，浸渍20min；液化条件：85～90℃，加入耐高温α-淀粉酶，液化90 min；糖化条件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20h；

3)配料：玉米粉1500g，水4500mL，静置放置20min，耐高温α-淀粉酶2×10⁴U/mL,0.9 ml，糖化酶1×10⁵U/mL，3mL。

4)培养基配置

一级种子培养基：8°Brix玉米水解液，加入0.5％的酵母浸粉，分装5mL于试管，煮沸 10min以灭菌。

二级种子培养基：12°Brix玉米水解液，加入0.5％的酵母浸粉，分装45mL于150mL三角瓶，105℃灭菌15min。

发酵培养基：准备18°Brix玉米水解液，分装135mL于250mL三角瓶中，105℃灭菌15min，晾至室温后加营养盐1mL(MgSO₄ 150g/L、KH₂PO₄ 75g/L、尿素81g/L，过滤，4℃保存)。

挑取一环酵母细胞，接入装有5mL一级种子培养基的试管中，30℃静置培养24h，按10％接种量接种到装有45mL二级种子培养基的150mL三角瓶中，30℃静置培养16h至对数期的后期，按10％接种量接种到玉米水解液发酵培养基，30℃静置发酵。每隔12h称重1 次，当两次失重小于1g，发酵结束。发酵结束后取100mL醪液，加100mL水，蒸出100mL 酒样。

5)测定CO₂累积排放量及酒样中的酒精度和残还原糖等发酵性能指标

结果如表2，重组菌株α-AeAT9和α-VAAT发酵后的酒精含量和残糖含量与出发菌株相比没有明显差别，本例中的基因敲除和过表达的操作不会对菌株基本发酵性能有不利影响。

表2亲本菌株和重组菌株的发酵性能测定

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

6)气相色谱法测定酯和醇的产量

气相色谱仪：Agilent 7890C；色谱柱：白酒专用柱，AT.LZP-930，230℃，50m×320μm×1 μm；检测器：FID检测器，检测器温度：200℃；载气：高纯氮，流速5mL/min；检测条件：程序升温，50℃保持8min，5℃/min升到120℃,保持8min；进样口温度：200℃；进样量：1.0μL；分流方式：分流，分流比为10：1。

通过上述方法测定酒样中的酯和醇的产量，结果如表3所示，重组菌株α-AeAT9和α-VAAT 的乙酸乙酯含量达883.6mg/L和228.4mg/L，分别为出发菌株AY12-α的40.9倍和10.6倍；主要高级醇(异丁醇、异戊醇、正丙醇、苯乙醇)含量分别为101.1mg/L和124.9mg/L，分别较出发菌株降低了49.5％和23.5％。

表3亲本菌株和重组菌株的高级醇和酯产量(单位mg/L)

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种新型产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及构建方法

<130> 1

<141> 2018-05-18

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1308

<212> DNA

<213> 酿酒酵母()

<400> 1

atggactaca acaagagatc ttcggtctca accgtgccta atgcagctcc cataagagtc 60

ggattcgtcg gtctcaacgc agccaaagga tgggcaatca agacacatta ccccgccata 120

ctgcaactat cgtcacaatt tcaaatcact gccttataca gtccaaaaat tgagacttct 180

attgccacca ttcagcgtct aaaattgagt aatgccactg cttttcccac tttagagtca 240

tttgcatcat cttccactat agatatgata gtgatagcta tccaagtggc cagccattat 300

gaagttgtta tgcctctctt ggaattctcc aaaaataatc cgaacctcaa gtatcttttc 360

gtagaatggg cccttgcatg ttcactagat caagccgaat ccatttataa ggctgctgct 420

gaacgtgggg ttcaaaccat catctcttta caaggtcgta aatcaccata tattttgaga 480

gcaaaagaat taatatctca aggctatatc ggcgacatta attcgatcga gattgctgga 540

aatggcggtt ggtacggcta cgaaaggcct gttaaatcac caaaatacat ctatgaaatc 600

gggaacggtg tagatctggt aaccacaaca tttggtcaca caatcgatat tttacaatac 660

atgacaagtt cgtacttttc caggataaat gcaatggttt tcaataatat tccagagcaa 720

gagctgatag atgagcgtgg taaccgattg ggccagcgag tcccaaagac agtaccggat 780

catcttttat tccaaggcac attgttaaat ggcaatgttc cagtgtcatg cagtttcaaa 840

ggtggcaaac ctaccaaaaa atttaccaaa aatttggtca ttgacattca cggtaccaag 900

ggagatttga aacttgaagg cgatgccggc ttcgcagaaa tttcaaatct ggtcctttac 960

tacagtggaa ctagagcaaa cgacttcccg ctagccaatg gacaacaagc tcctttagac 1020

ccggggtatg atgcaggtaa agaaatcatg gaagtatatc atttacgaaa ttataatgcc 1080

attgtgggta atattcatcg actgtatcaa tctatctctg acttccactt caatacaaag 1140

aaaattcctg aattaccctc acaatttgta atgcaaggtt tcgatttcga aggctttccc 1200

accttgatgg atgctctgat attacacagg ttaatcgaga gcgtttataa aagtaacatg 1260

atgggctcca cattaaacgt tagcaatatc tcgcattata gtttataa 1308

<210> 2

<211> 1299

<212> DNA

<213> 猕猴桃()

<400> 2

atggcttcat ctgtcaggtt ggtcaagaag ccagtcttgg tcgctccagt tgatccaact 60

ccatcaacag ttttatcttt gtcatctttg gattcacaat tgtttttgag attccctatt 120

gaatatttgt tagtctatgc ttctccacat ggtgttgata gggctgtcac tgctgctagg 180

gtcaaagctg cattggctag gtctttggtc ccttattatc cattggctgg tagggtcaag 240

actaggccag actctactgg attggacgtt gtctgccaag ctcaaggtgc tggattgttg 300

gaggctgtct ctgactacac agcttcagac tttcaaagag ctccaagatc tgttactgag 360

tggagaaaat tgttgttggt tgaggtcttc aaggtcgtcc ctccattggt cgttcagttg 420

acttggttgt cagacggttg cgtcgctttg ggtgttggtt tctctcactg cgtcattgac 480

ggtattggtt catcagagtt tttaaatttg tttgctgaat tggctactgg tagggcaagg 540

ttgtcagaat tccagccaaa accagtctgg gataggcact tgttaaactc tgcaggtagg 600

acaaacttgg gtactcaccc tgagtttgga agggtcccag acttgtctgg tttcgttaca 660

aggtttactc aagaaaggtt gtctccaact tctattactt ttgataaaac ttggttgaag 720

gaattaaaaa atattgctat gtctacatca cagcctggtg agttcccata cacttctttc 780

gaggtcttgt ctggtcacat atggaggtct tgggctaggt cattgaactt gccagctaag 840

caagttttaa aattgttatt ttctattaat attagaaaca gggttaagcc atctttgcca 900

gctggttact acggtaacgc tttcgtcttg ggttgcgctc agacatctgt caaggatttg 960

actgagaagg gtttgggtta ctgcgctgat ttggtcagag gtgcaaagga aagggtcggt 1020

gacgaatacg ctagggaagt tgtcgaatct gtctcttggc caaggagagc ttcaccagat 1080

tctgttggag ttttgattat ttctcaatgg tcaaggttgg gattggatag ggtcgacttc 1140

ggtttaggaa ggccagtcca ggttggacca atttgctgtg acagatattg tttgtttttg 1200

ccagttaggg agtctactga gtctgtcaag gtcatggtcg ctgttccaac atctgctgtt 1260

gataggtatg aatactttat tagatctcca tactcttaa 1299

<210> 3

<211> 1368

<212> DNA

<213> 草莓()

<400> 3

atgaacaaaa ttgaagtttc aattatttct aagcatacaa ttaaaccatc tacatcttct 60

tcaccattac agccatataa attgacattg ttggatcaat tgactccacc atcttacgtc 120

ccaatggtct tcttctatcc aataactggt ccagctgttt tcaatttgca aactttggca 180

gatttaaggc atgcattgtc tgaaacttta acattgtatt atccattatc tggtagagtc 240

aaaaataatt tgtatattga cgacttcgag gagggtgtcc catatttaga agctagggtt 300

aactgtgata tgaacgattt tttaagattg cctaaaatag aatgtttaaa tgaatttgtt 360

ccaattaagc cattttctat ggaagctatt tctgatgaaa gatacccatt gttgggtgtt 420

caagttaata ttttcaactc tggtatagca attggtgttt cagtttcaca taaattgatt 480

gatggaagaa cttctgattg ttttttaaag tcttggtgcg ctgttttcag gggttctaga 540

gataaaatta ttcatccaaa cttgtctcaa gcagctttgt tgtttccacc aagagatgat 600

ttaccagaaa agtatgcaag acagatggaa ggtttgtggt tcgtcggtaa gaaggtcgct 660

actaggaggt tcgtcttcgg tgctaaggct atatctgtca ttcaggatga ggctaagtct 720

gagtctgtcc caaagccatc tagggtccag gctgtcacat ctttcttatg gaaacatttg 780

attgctactt ctagagcttt gacttcaggt actacatcta ctagattgtc tattgcaaca 840

caagtcgtta atattagatc aagaagaaat atggaaactg tttgggataa cgcaattggt 900

aacttgattt ggttcgctcc agctattttg gaattatctc acacaacttt agaaatatct 960

gatttgaagt tatgtgattt agttaactta ttgaatggtt ctgttaaaca atgtaacggt 1020

gattacttcg aaactttcat gggtaaggaa ggttatggat ctatgtgcga atatttggat 1080

tttcaaagga caatgtcatc tatggaacca gctccagaaa tttacttgtt tacttcatgg 1140

actaacttct ttaatcaatt ggattttggt tggggtagga catcttggat tggtgttgct 1200

ggtaaaattg aatctgcttt ttgcaattta acaactttgg tcccaactcc atgcgacaca 1260

ggtattgagg cttgggtcaa tttggaggag gagaagatgg ctatgttgga gcaggaccca 1320

cagtttttgg ctttggcttc tcctaagact ttgatatcta gatattaa 1368

<210> 4

<211> 1479

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeCICC32315)

<400> 4

tctaactgat ctatccaaaa ctgaaaatta cattcttgat taggtttatc acaggcaaat 60

gtaatttgtg gtattttgcc gttcaaaatc tgtagaattt tctcattggt cacattacaa 120

cctgaaaata ctttatctac aatcatacca ttcttataac atgtcccctt aatactagga 180

tcaggcatga acgcatcaca gacaaaatct tcttgacaaa cgtcacaatt gatccctccc 240

catccgttat cacaatgaca ggtgtcattt tgtgctctta tgggacgatc cttattaccg 300

ctttcatccg gtgatagacc gccacagagg ggcagagagc aatcatcacc tgcaaaccct 360

tctatacact cacatctacc agtgtacgaa ttgcattcag aaaactgttt gcattcaaaa 420

ataggtagca tacaattaaa acatggcggg cacgtatcat tgcccttatc ttgtgcagtt 480

agacgcgaat ttttcgaaga agtaccttca aagaatgggg tctcatcttg ttttgcaagt 540

accactgagc aggataataa tagaaatgat aatatactat agtagagata acgtcgatga 600

cttcccatac tgtaattgct tttagttgtg tatttttagt gtgcaagttt ctgtaaatcg 660

attaattttt ttttctttcc tctttttatt aaccttaatt tttattttag attcctgact 720

tcaactcaag acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc 780

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 840

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 900

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 960

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 1020

tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 1080

cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 1140

agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 1200

ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 1260

cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 1320

atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 1380

tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 1440

aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaac 1479

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cgggatcctc taactgatct atccaaaact ga 32

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gagatctgga attccgatct tgttttatat ttgttg 36

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gaattccaga tctcctcgag ggatctgcga tagatcaat 39

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

acgcgtcgac gtaacgaacg cagaattttc 30

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

atcggaattc cagatctcct cgagatggct tcatctgtca gg 42

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

ttgatctatc gcagatccct cgagttaaga gtatggagat cta 43

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ggaattccag atctcctcga gatgaacaaa attgaagttt c 41

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

atctatcgca gatccctcga gttaatatct agatatcaa 39

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

tcaagataca gaacctcctc 20

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

ttcagttttg gatagatcag ttagacatta ggcacggttg a 41

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

tatcagatcc actagtggcc tatgcaaatg gcggttggta c 41

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

gtggagccca tcatgttac 19

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

taactcgaaa attctgcgtt cgttacagct gaagcttcgt acgctgc 47

<210> 18

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

ttcgtagccg taccaaccgc catttgcata ggccactagt ggat 44

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

tcttcggtct caaccgtgcc taatgtctaa ctgatctatc caaaac 46

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

cctgcagcgt acgaagcttc agctgtaacg aacgcagaat tttc 44

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

atcgtcgacc ccacacacca tagcttca 28

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

gcggtcgaca gcttgcaaat taaagcctt 29

Claims (8)

1.一种新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，是通过在酿酒酵母出发菌株中异源表达来自绿色植物的醇酰基转移酶AAT构建的。

2.如权利要求1所述的一种新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，是以转录调节因子Gal80基因为整合位点，用强启动子PGK1过表达醇乙酰基转移酶基因所得。

3.如权利要求2所述的一种新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述Gal80基因，其Gene ID为：854954，核苷酸序列如核苷酸列表中SEQ ID NO:1所示。

4.如权利要求1所述的一种新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述醇酰基转移酶AAT具体为猕猴桃的醇酰基转移酶AeAT9基因，其Protein ID为AIC83789.1，酿酒酵母密码子优化后核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:2所示。

5.如权利要求1所述的一种新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述醇酰基转移酶AAT具体为草莓的醇酰基转移酶VAAT基因，其Protein ID为：CAC09062.1，酿酒酵母密码子优化后核苷酸序列如核苷酸列表中SEQ ID NO:3所示。

6.如权利要求1所述的一种新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AY12，编号CICC32315。

7.权利要求1所述一种新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(1)密码子优化并合成基因AeAT9，VAAT；

(2)将目的基因AeAT9与VAAT分别连接到含有PGK1强启动子和终止子的质粒上，通过PCR扩增分别获得含AeAT9与VAAT基因的表达盒；

(3)以出发酵母菌株Gal80基因作为整合位点，分别过表达含AeAT9基因的表达盒与含VAAT基因的表达盒，分别获得重组菌株。

8.如权利要求1所述新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株在酒类生产中的应用。