CN114231429B - 一种表达产甘油假丝酵母rna解旋酶的重组菌及其应用 - Google Patents

一种表达产甘油假丝酵母rna解旋酶的重组菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达产甘油假丝酵母RNA解旋酶的重组菌及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种源于产甘油假丝酵母CCTCC M93018的RNA解旋酶基因CgSPB4，在Saccharomyces cerevisiae CEN PK2‑1c中过表达该基因，可显著提高S.cerevisiae的乙酸耐受性和抗氧化能力。方法是，利用引物扩增产甘油假丝酵母基因组DNA片段得到RNA解旋酶基因CgSPB4，在酿酒酵母中表达该基因，提高菌株的耐受性能。本发明在利用基因工程技术提高S.cerevisiae乙酸耐受性和抗氧化能力上有重要作用，为其它微生物及高等真核生物的抗逆性改良提供了新的研究思路。

Description

一种表达产甘油假丝酵母RNA解旋酶的重组菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种表达产甘油假丝酵母RNA解旋酶的重组菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
工业发酵情况下，微生物都面临着不同的环境胁迫，如高温、低pH、渗透压、过氧化等，产甘油假丝酵母是从自然界筛选到的一株高产甘油的工业抗逆菌株，可耐渗透压、耐高温、耐有机酸、氧化压力等，是一株潜在的优秀工业生物技术宿主。
而RNA解旋酶是一类能解开双链RNA的酶，在核转录、前体mRNA剪接、核糖体生物发生、核质转运、翻译、RNA降解以及结构基因表达等过程中都发挥了重要的作用。近几年其在逆境方面的作用被发现，并且与传统耐受途径相比，它可能直接作用于胁迫相关的遗传信息转录翻译等过程中。
在工业发酵过程当中，工业原料或者微生物自身代谢会产生一定的乙酸，其较强的毒性会限制微生物发酵及工业生产，并且乙酸还会诱导酵母细胞内产生氧化应激反应，产生大量ROS，导致细胞的损伤。目前对于酵母乙酸应答机制的研究主要是分解代谢乙酸、阻止乙酸进入胞内、将胞内的氢离子及醋酸根阴离子转运至胞外这三种。通过改变细胞壁结构，降低孔隙率减小乙酸的扩散速率、改变细胞膜组分减少乙酸分子的吸收是阻止乙酸扩散进入胞内的有效作用。同时，在乙酸胁迫下，酿酒酵母细胞壁功能相关的蛋白被表达，细胞壁结构发生改变，多孔结构减少，从而阻止乙酸进入细胞。此外，酿酒酵母的细胞膜中含有与乙酸转运有关的蛋白Fps1p，乙酸胁迫下Fps1p蛋白被磷酸化并发生内吞作用，减少了乙酸通过该蛋白扩散进入细胞内部的作用，进而降低了乙酸对细胞的毒害。酿酒酵母的氧化防御应答主要是非酶防御系统、酶防御系统以及基因表达水平上的表达调控。非酶防御和酶防御系统相互协同应答氧化应激。此外，一些特定的转录因子会迅速做出响应，上调或下调特定基因的转录，应对氧化胁迫，如Yap转录因子、Skn7转录因子、锌指型转录因子Msn2/Msn4等。
因此，目前亟需得到一种提高酿酒酵母的乙酸耐受性和抗氧化能力的方法，以满足工业生产的需求。
发明内容
本发明首先克隆了产甘油假丝酵母中的SPB4同源基因，将其命名为CgSPB4基因，通过在亮氨酸、组氨酸、色氨酸和尿嘧啶四种缺陷型酿酒酵母CEN PK2-1c中过表达CgSPB4基因，使得酿酒酵母对高温、乙酸和过氧化的耐受能力得到提高。
本发明提供了一种重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母表达了来源于产甘油假丝酵母的CgSPB4酶，所述CgSPB4酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述来源于产甘油假丝酵母的CgSPB4核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组酿酒酵母以S.cerevisiae CEN PK2-1c为表达宿主，以pYX212质粒为表达载体。
本发明还提供了一种构建上述重组酿酒酵母的方法，所述方法为：
(1)以产甘油假丝酵母基因组为模板，利用上下游引物CgSPB4F和CgSPB4R PCR扩增CgSPB4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；引物序列(5'-3')如下所示：
CgSPB4F：AACACATACAGGAATTCACCATGGATCCATGTCTCGTGTCATGATGCGGCCT；
CgSPB4R：GGATACCCGGGTCGACGCGTAAGCTTAGCGAGAGGAACGCTTTCGT。
(2)构建CgSPB4基因过表达载体，并将该载体转化到S.cerevisiae CEN PK2-1c中；
(3)采用基因组PCR检测方法对步骤(2)得到的重组S.cerevisiae进行鉴定；
(4)进一步通过梯度稀释点板生长，液体培养基培养下的生长情况分析鉴定重组S.cerevisiae的乙酸耐受和抗氧化能力。
本发明还提供了一种提高酿酒酵母乙酸耐受性及抗氧化能力的方法，所述方法为，过表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示来源于产甘油假丝酵母的CgSPB4酶。
在本发明的一种实施方式中，编码所述来源于产甘油假丝酵母的CgSPB4酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母为S.cerevisiae CEN PK2-1c。
本发明还提供了上述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CgSPB4酶，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示CgSPB4的酶的基因的重组载体，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示CgSPB4酶的基因的重组细胞在制备提高酿酒酵母乙酸耐受性及抗氧化能力的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
本发明还提供了一种利用重组酿酒酵母高温发酵制备乙醇的方法，将上述重组酿酒酵母发酵制备得到。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵条件为：38～42℃，90～110r/min。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵条件为：将上述重组酿酒酵母种子液接种至发酵培养基中，转速为100r/min，发酵温度为40℃。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
有益效果
(1)本发明利用来源于C.glycerinogenes CCTCC M93018的基因CgSPB4来提高酿酒酵母对高温、乙酸和过氧化胁迫的耐受力，采用本发明提供的方法，在S.cerevisiae CENPK2-1c中过表达CgSPB4基因，可以提高S.cerevisiae在胁迫条件下的生长能力，从而提高S.cerevisiae对高温、乙酸和过氧化的耐受性。
(2)采用本发明提供的方法，在S.cerevisiae CEN PK2-1c中过表达基因CgSPB4后能够使重组菌株在90mM乙酸胁迫下，其生物量提高了35％；在6mM过氧化氢胁迫下，重组菌株的生物量提高了16％；在40℃高温胁迫下，重组菌株的生物量提高了23％；高温发酵时24h乙醇产量比对照提高了11.1％，且在乙酸胁迫和高温胁迫下，重组菌株脂质过氧化水平分别降低了15％和10％。
附图说明
图1：过表达产甘油假丝酵母基因CgSPB4的重组S.cerevisiae CEN PK2-1c在不同浓度乙酸(0mM、30mM、60mM、90mM、120mM)条件下重组酿酒酵母和对照菌株的生长情况。
图2：CgSPB4基因的克隆中的电泳图谱。
图3：过表达产甘油假丝酵母基因CgSPB4的重组S.cerevisiae CEN PK2-1c在不同过氧化氢浓度(0mM、3mM、6mM、9mM)条件下重组酿酒酵母和对照菌株的生长情况。
图4：过表达产甘油假丝酵母基因CgSPB4的重组S.cerevisiae CEN PK2-1c在40℃下的生长情况。
图5：过表达产甘油假丝酵母基因CgSPB4的重组S.cerevisiae CEN PK2-1c在90mM乙酸和40℃高温胁迫时脂质过氧化水平。
图6：过表达产甘油假丝酵母基因CgSPB4的重组S.cerevisiae CEN PK2-1c在不同NaCl浓度(0M、0.5M、1M)条件下的生长情况。
图7：过表达产甘油假丝酵母基因CgSPB4的重组S.cerevisiae CEN PK2-1c在30％葡萄糖浓度下的生长情况。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的培养基如下：
YNB液体培养基(g/L)：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，亮氨酸60mg/L、组氨酸20mg/L、色氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L，pH＝6.2～6.5
尿嘧啶缺陷型YNB液体培养基(g/L)：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，亮氨酸60mg/L、组氨酸20mg/L、色氨酸20mg/L，pH＝6.2～6.5
尿嘧啶缺陷型YNB固体培养基(g/L)：在尿嘧啶缺陷型YNB液体培养基的基础之上添加20g/L的琼脂。
YPD培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
发酵培养基：葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
耐受性能测定：
培养基中添加不同浓度的乙酸或过氧化氢，通过30℃(或40℃高温)，200r/min条件下，每隔6h，用紫外分光光度计测定其在波长为600nm的吸光值。
脂质过氧化实验：
采用硫代巴比妥酸TBA 测定，具体操作为：对数生长期酵母细胞用90mM乙酸或42℃高温胁迫处理4h后离心收集，以未处理菌株为对照。酵母细胞用无菌水洗2遍后，加入1mLTBA试剂(0.25M HCl，15％三氯乙酸，和0.375％TBA)，100℃煮沸15min后10,000×g，4℃离心20min收集上清，用紫外分光光度计测定其在波长为532nm的吸光值，TBA试剂为空白对照；脂质过氧化水平通过每克菌体蛋白所占硫代巴比妥酸值TBARS表示。
下述实施例中所涉及的感受态的转化方法如下：
转化方法采用醋酸锂转化法，步骤如下：
S.cerevisiae接入添加了组氨酸、色氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的YNB液体培养基中30℃摇瓶培养(200r/min)，当OD600值达到3～4后，离心收集菌体，无菌双蒸水洗涤2次。重悬于转化体系：240μL 50％PEG 3350，36μL 1mol/l LiAc，20μL 5mg/mL鱼精DNA(使用前煮沸10min)，20μL质粒，补足无菌双蒸水至360μL。充分混匀后，42℃热激60min，离心收集菌体，重悬浮于1mL YEPD液体培养基，培养2小时(30℃，200r/min)。离心收集菌体，无菌双蒸水洗涤1次，加入100μL双蒸水，混匀后涂布尿嘧啶缺陷型YNB固体培养基，获得重组S.cerevisiae。
实施例中，对菌株的培养使用YNB培养基，培养酿酒酵母时添加亮氨酸60mg/L、组氨酸20mg/L、色氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L，培养重组酿酒酵母菌株时添加亮氨酸60mg/L、组氨酸20mg/L、色氨酸20mg/L，乙酸胁迫条件为添加90mM乙酸，过氧化胁迫条件为添加6mM过氧化氢。
实施例1：携带产甘油假丝酵母CgSPB4的基因的重组酿酒酵母的制备
具体步骤如下：
(1)以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)基因组为模板，利用上下游引物CgSPB4F和CgSPB4R PCR扩增CgSPB4基因片段，PCR反应体系如下(50μL)：25μL Prime STAR Max Premix(2×)，15pmol引物，150ng模板，加双蒸水至50μL(引物为上海生工生物工程有限公司合成，其余购自TaKaRa公司)，扩增反应条件如下：98℃，10s；60℃，15s，72℃，1kb/min，30个循环。扩增产物电泳完毕后(如图2所示)进行切胶回收，回收程序按照试剂盒说明，获得了CgSPB4基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
引物序列(5'-3')如下所示：
CgSPB4F：AACACATACAGGAATTCACCATGGATCCATGTCTCGTGTCATGATGCGGCCT；
CgSPB4R：GGATACCCGGGTCGACGCGTAAGCTTAGCGAGAGGAACGCTTTCGT
(2)将步骤(1)获得的CgSPB4基因酶切后连接至pMD-19T载体，送至上海生工测序。
(3)测序成功后，即得到核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的CgSPB4基因；将获得的CgSPB4基因与pYX212表达载体，通过同源重组技术完成连接，制备得到重组载体：pYX212-CgSPB4，并将连接产物转化至大肠杆菌，收集平板上菌体，提取质粒(质粒抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)，并转化酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c中，制备得到重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212-CgSPB4。
对照菌株：
按照上述方法，将空载质粒pYX212转化至酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c中，制备得到对照菌株：重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212。
实施例2：重组酿酒酵母乙酸耐受性及抗氧化性的检测
1、乙酸耐受性的检测
(1)将实施例1制备得到的重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212-CgSPB4添加至尿嘧啶缺陷型YNB液体培养基中，在30℃、200r/min条件下培养12小时，制备得到种子液；
(2)将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量，接种至添加了不同浓度乙酸的YPD液体培养基中；
所述培养基中，乙酸的终浓度分别为：30mM、60mM、90mM、120mM；
将上述体系在30℃、200r/min的条件下进行摇瓶培养，每隔6h，测定重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212-CgSPB4胁迫生长情况；将酿酒酵母S.cerevisiae CENPK2-1c/pYX212按照上述方式进行培养，作为对照1，结果如表1及图1所示：
表1：不同乙酸浓度胁迫条件下菌株生长情况(OD600表示)
/表示未进行检测。
由以上结果可知，与对照1相比，在添加了不同浓度乙酸的情况下，可以看到重组菌株的生长情况均高于对照菌株，添加30mM乙酸时重组菌株最终OD600比对照高10％；添加60mM乙酸时对比最为明显，重组菌株的最终OD600比对照菌株高31％；添加90mM乙酸时，可以看出重组菌株的生长更为迅速，且最终OD600比对照菌株高35％；在添加120mM乙酸时，菌株生长受到严重抑制，但重组菌株仍表现出了优于对照的生长，最终OD600比对照菌株高21％。
将酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212接种至不含有乙酸的培养基中进行培养，作为对照2，与对照2相比，重组菌株与对照菌株的生长情况无差别。
2、过氧化氢耐受性的检测
(1)将实施例1制备得到的重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212-CgSPB4添加至尿嘧啶缺陷型YNB液体培养基中，在30℃、200r/min条件下培养12小时，制备得到种子液；
将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量，接种至添加了步骤(1)配置的不同浓度过氧化氢的YPD液体培养基中；
所述培养基中，过氧化氢的终浓度分别为：3mM、6mM、9mM；
将上述体系在30℃、200r/min的条件下摇瓶培养，每隔6h，测定重组S.cerevisiae胁迫生长情况；将酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212按照上述方式进行培养，作为对照；结果如表2及图3所示：
表2：不同过氧化氢胁迫条件下菌株生长情况(OD600表示)
/表示未进行检测。
从实验结果可知，添加不同浓度过氧化氢时，添加浓度为6mM时，影响最为显著。当添加过氧化氢含量为3mM时，其生长趋势在前中期几乎一致，但在生长后期，重组菌株的生物量依然比对照菌株增加5％；过氧化氢添加量为6mM时，重组菌株的生长延滞期明显减少，对照菌株在54h后才开始生长，而重组菌株在24h时就已经开始进入对数生长期，并且最终生物量OD600比对照增加了16％；而在过氧化氢添加量为9mM时，菌株生长均受到完全抑制。
实施例3：重组酿酒酵母对温度的耐受性实验
具体步骤如下：
(1)将实施例1制备得到的重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212-CgSPB4添加至尿嘧啶缺陷型YNB液体培养基中，在30℃、200r/min条件下培养12小时，制备得到种子液；
(2)将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量，接种至YPD培养基中；
将上述体系在40℃、200r/min的条件下摇瓶培养，每隔6h，测定重组S.cerevisiae胁迫生长情况；
对照：将酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212菌株按照上述进行培养，作为对照，结果图4所示。
结果显示，在40℃高温条件下，菌株的生长都收到了抑制，但重组菌株在对数期的生长速率(为0.077OD600·h-1)和最终生物量(OD600为2.67)上都显示出了其作用，而此时，对照菌株的生长速率为：0.063OD600·h-1，最终生物量OD600为2.17；可见，重组菌株的生长速率比对照菌株提高了22％，OD600比对照菌株增加了23％。
实施例4：重组酿酒酵母的脂质过氧化实验
具体实施方式同实施例2的步骤1、实施例3。
(1)按照实施例2的步骤1的方式，分别将对照菌株：酿酒酵母S.cerevisiae CENPK2-1c/pYX212、重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212-CgSPB4的种子液按照2％(v/v)的接种量，接种至添加了浓度为：90mM的乙酸的尿嘧啶缺陷型液体培养基中；在30℃、200r/min的条件下培养12h；
采用硫代巴比妥酸TBA测定脂质过氧化水平，结果显示，重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212-CgSPB4的脂质氧化水平为：38.22；对照菌株：酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212的脂质氧化水平为：45.05；
(2)按照实施例3的方式，分别将对照菌株：酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212、重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212-CgSPB4的种子液按照2％(v/v)的接种量，接种至YPD培养基中；在30℃、200r/min的条件下培养12h；
采用硫代巴比妥酸TBA测定脂质过氧化水平，结果显示，高温胁迫下，重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212-CgSPB4的脂质氧化水平为：36.66；对照菌株：酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212的脂质氧化水平为：39.94；
可见，在乙酸或高温胁迫情况下，会造成菌株细胞膜损伤及脂质过氧化，从图5中可以看出，在酸胁迫和高温处理时，细胞膜的损伤导致菌株脂质过氧化水平增高，而重组菌株可以降低其脂质过氧化水平，其中，乙酸胁迫下重组菌株脂质过氧化水平降低了15％，高温胁迫下重组菌株脂质过氧化水平降低了10％。
实施例5：重组酿酒酵母的应用
重组酿酒酵母的应用以40℃时发酵乙醇产量来衡定，具体步骤如下：
分别将对照菌株：酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212、重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212-CgSPB4接种于10mL YNB液体培养基中，30℃，200r·min-1培养12h，分别得到种子液；
将制备得到的种子液按1％(v/v)的接种量接到含50mL发酵培养基中，分别进行40℃摇瓶100r·min-1培养，定时取样，培养时间为：24h。通过高效液相色谱法定量测定乙醇发酵产量。使用5mmol·L-1H2SO4作为流动相，以0.6mL·min-1的流速和20μL注射体积在60℃下操作HPLC装置，测定24h时菌株的乙醇产量。
表3：重组酿酒酵母的乙醇产量
乙醇产量(g/L)
对照菌株 28.0±0.32
重组菌株 31.1±0.21
结果显示，24h时，对照菌株乙醇产量为28g/L，而重组菌株的乙醇产量为31.1g/L，与对照相比，产量提高了11.1％。
实施例6重组酿酒酵母菌株对渗透压的耐受性实验
1、NaCl耐受性测定
(1)将实施例1制备得到的重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212-CgSPB4添加至尿嘧啶缺陷型YNB液体培养基中，在30℃、200r/min条件下培养12小时，制备得到种子液；
将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量，接种至添加了步骤(1)配置的不同浓度NaCl的YPD液体培养基中；
所述培养基中，NaCl的终浓度分别为：0.5M、1M；
将上述体系在30℃、200r/min的条件下摇瓶培养，每隔6h，测定重组S.cerevisiae胁迫生长情况；
对照：将酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212菌株按照上述方式进行培养，作为对照，结果如表4及图6所示：
表4：重组酿酒酵母菌株对渗透压的耐受性
/表示未进行检测。
结果显示，NaCl浓度在0.5M时，重组菌株和对照菌株的生长都没有收到影响，未呈现明显差异；当NaCl浓度为1M时，菌株的生长均受到较为严重的抑制，生长至96h时OD600也仅为3，并且生长情况无差异。
2、葡萄糖耐受性测定
(1)将实施例1制备得到的重组酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212-CgSPB4添加至尿嘧啶缺陷型YNB液体培养基中，在30℃、200r/min条件下培养12小时，制备得到种子液；
(2)将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量，接种至添加了30％葡萄糖的YPD液体培养基中，所述葡萄糖的终浓度为300g/L，在30℃、200r/min的条件下摇瓶培养，每隔6h，测定重组S.cerevisiae胁迫生长情况；
对照：将酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1c/pYX212菌株按照上述步骤的方式进行培养，作为对照，结果如图7所示。
从图中结果可以看出，当培养基葡萄糖浓度为300g/L时，重组菌株和对照菌株的生长未呈现明显差异。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种表达产甘油假丝酵母RNA解旋酶的重组菌及其应用
<130> BAA211439A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Arg Val Met Met Arg Pro Val Arg Ala Phe Trp Asn Val Arg
1 5 10 15
Leu Phe Ser Arg Arg Ala Cys Leu Arg Asn Ser Thr Thr Lys Ser Pro
20 25 30
Gln Gln Pro Leu Glu Thr Asn Pro Ile Asn Phe Thr Met Gly Lys Met
35 40 45
Pro Ile Gly Leu Pro Met Gly Gly Glu Asp Val Phe Ile Ser Asp Thr
50 55 60
Ser Ser Ser Lys Arg Lys Glu Glu Trp Ile Lys Glu Lys Gln Lys Gln
65 70 75 80
Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Gln Asn Ala Glu Ile Val Glu Asp Val
85 90 95
Arg Ile Asp Asp Tyr Val Ile Gln Val Glu Ser Phe Phe Asp Thr Tyr
100 105 110
Arg Val Val Gln Glu Phe Lys Arg Ser Gly Phe Thr Glu Ala Glu Ser
115 120 125
Lys Ile Leu Thr Arg Tyr Met Tyr Asp Val Leu Lys Glu Lys Met Asn
130 135 140
Trp Ile Asn Lys Thr Tyr Ala Pro Lys Val Asp Leu Glu Asn Glu Thr
145 150 155 160
Tyr Leu Phe Glu Ala Ala His Ser Glu Leu Leu Phe Glu Val Thr Asn
165 170 175
Ser Arg Glu Ile Ser Ile Met Asn Leu Thr Asn Asp Ser Ile Ile Leu
180 185 190
Lys Arg Trp Phe Asn Gly Leu Asn Asp Glu Thr Ile Ala Glu Ile Lys
195 200 205
Leu Asn Asp Asp Leu Ile Lys Leu Glu Leu Asn Gln Phe Lys His Glu
210 215 220
Asn Asn Leu Gln Gln Arg Glu Leu Asn Leu Lys Asn Ser Asp Leu Asn
225 230 235 240
Ser Arg Ile Ile Ser Asp Met Val Ser Gly Leu Lys Ser Asp Ile Glu
245 250 255
Thr Tyr Arg Trp Gln Leu Thr Arg Ala Gly Ile Val Thr Ile Leu Thr
260 265 270
Met Ala Val Cys Ile Leu Ser Val Trp Asn Val Ala Lys Arg Val Asn
275 280 285
Glu Glu His Ser Asn Glu Lys Trp Pro Arg Leu Val Pro Val His Glu
290 295 300
Gln Thr Asp Glu Glu Ser His Asp Tyr Glu Ala Asp Trp Asp Glu Ser
305 310 315 320
Val Pro Leu Ala
<210> 2
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtctcgtg tcatgatgcg gcctgttcgt gctttttgga atgttaggtt gttttcaagg 60
agggcgtgtt tgaggaattc cacaacaaag agcccacagc aaccattaga gacgaatcca 120
attaatttta caatggggaa gatgcctatc ggtttgccga tggggggcga agatgttttc 180
attagcgata caagttccag taaaaggaaa gaagagtgga taaaggaaaa acaaaaacaa 240
aaggagaagg aaaagcagaa acaaaatgcc gaaattgttg aagatgtacg aatagatgat 300
tatgtgattc aagtagagag tttttttgac acatatcgtg ttgttcaaga gtttaaaaga 360
agcgggttta ctgaagccga atcaaagatc ttgaccaggt atatgtacga tgtattaaag 420
gaaaaaatga attggattaa caaaacgtat gctccaaaag ttgacctgga aaacgaaaca 480
tatttatttg aggctgcaca ttcggaacta ttgtttgaag ttaccaattc aagagaaata 540
tctattatga atttaacaaa tgattctatt atattgaaaa ggtggtttaa tgggttgaac 600
gacgaaacca ttgcagaaat caaattaaat gatgatttga tcaaactaga actaaatcaa 660
ttcaaacatg aaaataacct acaacaacga gaactaaatt tgaagaattc tgatttaaat 720
tctagaatta taagtgatat ggtgagtggc ctcaagtccg atattgaaac ttatcgctgg 780
cagcttacgc gtgcgggtat tgttacaatc ctcaccatgg cagtatgcat tctctctgta 840
tggaacgttg ccaaacgtgt caatgaggaa cacagcaatg agaaatggcc tcgtcttgtt 900
ccagtccacg aacagactga tgaggaatcc catgattacg aagctgattg ggacgaaagc 960
gttcctctcg ct 972

Claims (7)

1.一种重组酿酒酵母，其特征在于，表达了来源于产甘油假丝酵母的CgSPB4酶，所述CgSPB4酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组酿酒酵母以酿酒酵母(S .cerevisiae) CEN PK2-1c为表达宿主。
2.如权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，编码所述来源于产甘油假丝酵母的CgSPB4酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1或2所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母以PYX212质粒为表达载体。
4.一种提高酿酒酵母(S .cerevisiae) CEN PK2-1c乙酸耐受性及抗氧化能力的方法，其特征在于，所述方法为，过表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CgSPB4酶。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，编码所述来源于产甘油假丝酵母的CgSPB4酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CgSPB4酶，或含有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示CgSPB4酶的基因的重组载体在制备提高酿酒酵母(S .cerevisiae) CEN PK2-1c乙酸耐受性及抗氧化能力的产品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为化学品。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107723302A (zh) * 2017-11-30 2018-02-23 江南大学 一种过表达产甘油假丝酵母CgGAD1提高渗透压耐受性的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107723302A (zh) * 2017-11-30 2018-02-23 江南大学 一种过表达产甘油假丝酵母CgGAD1提高渗透压耐受性的方法

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