CN108913614B - 一种调节酿酒酵母氧胁迫的方法 - Google Patents

一种调节酿酒酵母氧胁迫的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种调节酿酒酵母氧胁迫的方法，属于生物工程领域。本发明通过过量表达本源的Polη来增强酿酒酵母的氧胁迫抗性。本发明鉴定了一种调控酿酒酵母氧胁迫的Y家族DNA聚合酶Polη的功能，发现酿酒酵母缺失Rad30基因后，与野生型菌株相比，在氧胁迫条件下生长能力降低，存活率下降，DNA损伤程度提高。

Description

一种调节酿酒酵母氧胁迫的方法
技术领域
本发明涉及一种调节酿酒酵母氧胁迫的方法，属于生物工程领域。
背景技术
微生物在生长和代谢过程中容易受到各种外源和内源环境的攻击，外源环境主要包括电离辐射、紫外辐射以及各种化学试剂，内源环境主要包括细胞在代谢过程中产生的一些次级代谢产物。大部分这些因素都会造成细胞内活性氧的堆积，对胞内的DNA造成氧化损伤，阻碍细胞的生长和代谢。在工业应用中，酿酒酵母不仅可以用来生产酒精，还可以用来生产有机酸、蛋白质等。在生命科学领域，酿酒酵母和人类高度同源，通过对酿酒酵母基因进行分析，能够提高人类疾病的诊断和治疗水平。目前国内外主要通过外源添加辅助底物、诱变育种、基因工程、适应性进化等策略提高菌株的氧胁迫抗性。对酿酒酵母进行耐氧机制的研究可从根本上解决这一问题。
Y家族DNA聚合酶是一类特殊的DNA聚合酶，它能够跨越DNA上的损伤位点，使细胞免于因复制停滞造成的细胞周期延迟和细胞死亡。在酿酒酵母中，Y家族DNA聚合酶包括Polη和Rev1，分别由Rad30和Rev1基因编码，其中Polη起主要作用。有研究表明，细胞缺乏Polη对紫外线敏感。此外，在酵母中过表达克氏锥虫来源的Polη能够增强酵母对过氧化氢的抗性，但其提高效果有限。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过过量表达本源的Polη来增强酿酒酵母的氧胁迫抗性。本发明鉴定了一种调控酿酒酵母氧胁迫的Y家族DNA聚合酶Polη的功能，发现酿酒酵母缺失Rad30基因后，与野生型菌株相比，在氧胁迫条件下生长能力降低，存活率下降，DNA损伤程度提高。
本发明提供一种改变酿酒酵母氧胁迫抗性的方法，是缺失突变Rad30基因以降低菌株氧胁迫抗性，或者过表达Rad30基因以提高菌株的氧胁迫抗性。
所述Rad30基因的核苷酸序列是NCBI上的gene ID:852028的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母菌株是Saccharomyces cerevisiaeBY4741，(https://www.yeastgenome.org/strain/S000203456)。基因型为MATαHis3Δ1Leu2Δ0Met15Δ0Ura3Δ0。
在本发明的一种实施方式中，所述缺失突变具体是：将标记基因Leu2同基因Rad30的左右臂连接起来，构建敲除框，将测序正确的敲除框导入酿酒酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因Rad30替换成Leu2，利用重组后的菌株含有Leu2基因而能合成亮氨酸这一特征筛选缺失Rad30基因的的突变菌株，经基因组PCR和测序验证正确的菌株即为缺失突变Rad30基因的菌株Rad30Δ。
在本发明的一种实施方式中，所述过表达具体是将Rad30基因连接到质粒PY26上，由强启动子启动转录翻译，得到重组质粒PY26-Rad30，然后将重组质粒转化到酵母中，利用重组质粒上的Ura3基因来筛选阳性转化子。
本发明还要求保护所述酿酒酵母在食品、化工、制备药物方面的应用。
本发明还提供一种改变酿酒酵母DNA损伤的方法，所述方法是敲除或过表达基因Rad30，敲除Rad30能够提高酿酒酵母DNA损伤，过表达Rad30能降低酿酒酵母DNA损伤。
附图说明
图1：基因缺失菌株的构建；A是目的基因左右臂及标记基因的扩增；B是融合框的构建。
图2：各菌株在正常条件和2mM H2O2条件下的平板生长实验。
图3：各菌株在正常条件和2mM H2O2条件下的的生长曲线；A:正常条件下各菌株的生长曲线；B：2mM H2O2条件下各菌株的生长曲线。
图4：各菌株在不同浓度H2O2下的存活率。
图5：各菌株在正常条件和2mM H2O2条件下的DNA损伤程度的测定。
具体实施方式
以下是酿酒酵母菌株构建及验证、生长性能分析、存活率分析及细胞DNA损伤测定的实施例。
实施例1：缺失突变菌株的构建
以野生型酿酒酵母基因组为模板，分别以P1/P2、P3/P4、P5/P6为引物(序列如SEQID NO:1至SEQ ID NO:6所示)，扩增出待敲除基因的左臂(L)、亮氨酸基因(M)和右臂(R)，经融合PCR构建敲除框Rad30-LMR(图1)。将测序正确的敲除框用化学转化法导入出发菌株Saccharomyces cerevisiae BY4741，利用亮氨酸标记基因来筛选阳性转化子，并提取基因组PCR测序验证。
P1：GTTCAGGCTCTGCAACTGG
P2：GATCTTCTTAGGGGCAGACATGCTTTGTCTTGTTTTATCAAAGC
P3：GCTTTGATAAAACAAGACAAAGCATGTCTGCCCCTAAGAAGATC
P4：CCATATAATTGTCTATTTGGAATAGGTTAAGCAAGGATTTTCTTAACTTC
P5：GAAGTTAAGAAAATCCTTGCTTAACCTATTCCAAATAGACAATTATATGG
P6：GGTCTTCAGAAGAGTAATGATAGTG
实施例2：过表达菌株的构建
以BY4741基因组为模板，以P7/P8(序列如SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:8所示)为引物扩增目的基因Rad30，将扩增产物与质粒PY26用相同的限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ消化，通过T4连接酶将基因Rad30连接到PY26，由强启动子GPD1启动转录翻译，利用重组质粒上的Ura3基因来筛选阳性转化子，最后提取质粒验证得到过表达菌株Rad30Δ/Rad30。
P7：CCCAAGCTTATGTCAAAATTTACTTGGAAGGAG
P8：CCGCTCGAGTCATTTTTTTCTTGTAAAAAATGAT
实施例3：各菌株生长性能的测定
(1)平板生长实验：将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB(0.67％YeastNitrogen Base without Amino Acids,2％Glucose)液体培养基中过夜活化，再转接到YNB培养基中培养至对数期，测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD600＝1.0，以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将3μL菌液点种在相应的固体YNB培养基上，30℃培养2-3天，观察菌体的生长情况并拍照(图2)。
(2)生长曲线测性：将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB(0.67％YeastNitrogen Base without Amino Acids,2％Glucose)液体培养基中过夜活化，再转接到相应的YNB液体培养基中，控制起始OD600＝0.1，30℃200rpm摇床培养，每隔2小时取样测定OD值，绘制生长曲线(图3)。
平板生长实验和生长曲线分析H2O2对菌株BY4741、Rad30Δ、Rad30Δ/Rad30生长的影响。正常条件下，敲除或过表达Rad30并不影响菌株的生长；在浓度为2mM的H2O2条件下，敲除Rad30抑制菌株的生长，而过表达Rad30则促进了菌株的生长。以上结果表明，基因Rad30能够调节细胞对氧环境的耐受能力。
实施例4：各菌株突变频率的测定
将菌株BY4741、Rad30Δ和Rad30Δ/Rad30单菌落接种于YNB液体培养基过夜培养，各取1mL菌液离心，用无菌水清洗两次后将各菌株稀释到10-4，然后用不同浓度H2O2于30℃处理30min，离心后弃去上清，用无菌水清洗两遍后，用200μL无菌水重悬，涂布于相应的营养缺陷平板上30℃培养2-3天，对形成的菌落计数并计算存活率。如图4所示，Rad30Δ菌株存活率在各H2O2浓度下较BY4741都有所降低，而Rad30Δ/Rad30菌株存活率在各H2O2浓度下较BY4741都有所提高，表明基因Rad30有利于酿酒酵母在H2O2条件下存活。
实施例5：各菌株DNA损伤程度的测定
(1)挑取固体YNB培养基中的酵母细胞制备5mL YNB的预接种物。在30℃、200rpm条件下孵育过夜；
(2)用新鲜的YNB培养基稀释预接种物至OD600为0.1，转接在装有50mL YNB液体培养基的100mL锥形瓶中，并在30℃、200rpm条件下孵育至OD600为0.4-0.8；
(3)在5000g、4℃条件下离心2min，收集沉淀的细胞，并于4℃条件下用相同体积的去离子水洗涤两次；
(4)在5000g、4℃条件下离心2min，收集1mL悬浮液，重悬于S缓冲液中，并且在30℃、200rpm条件下孵育30min以获得原生质球；
(5)在5000g、4℃条件下离心2min，收集原生质球，用相同体积的冰的S缓冲液洗涤，重悬于1mL 2mM H2O2(在S缓冲液中)，在4℃条件下孵育20min；
(6)在5000g、4℃条件下离心2min，收集原生质球，用相同体积的冰的S缓冲液洗涤两次；
(7)离心后，收集具有约106个细胞的该悬浮液的等分试样，并与含有约2mg/mL的裂解酶的1.5％低熔点琼脂糖(在S缓冲液中)混合，重悬沉淀；
(8)立即吸取40μL的样品铺在涂有0.5％正常熔点琼脂糖的载玻片上，盖上盖玻片并在30℃温育20min以用于促进细胞壁酶降解，之后移除盖玻片。将载玻片放在冰上，以凝固琼脂糖并保存原生质球；
(9)从微凝胶中取出盖玻片，将载玻片置于裂解缓冲液中，并在4℃条件下孵育2h以裂解原生质球；
(10)取出载玻片，排出多余的裂解缓冲液，将载玻片在电泳缓冲液中漂洗三次，每次20min以除去裂解液；
(11)将载玻片置于装有电泳缓冲液的电泳槽中，于4℃条件下，施加0.7V/cm的电场，电泳25min；
(12)将载玻片置于中和缓冲液中于室温下孵育10min；
(13)排出过量的中和缓冲液并于室温下将样品在76％乙醇孵育10min，随后以96％乙醇孵育10min；
(14)让载玻片在室温下干燥，用2μg/mL的溴化乙锭于暗处染色5-10min，蒸馏水漂洗两次后晾干，用滤纸吸取多余的水分，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察，在微凝胶的不同部位记录50个随机彗星的尾部长度；
(15)使用CASP软件处理图像。
其中所用到的溶液配制方法如下：
(1)S缓冲液：1M山梨醇，25mM KH2PO4，PH6.5
(2)裂解液：30mM NaOH，1M NaCl，0.05％月桂酰肌氨酸钠，50mM EDTA,10mM Tris-HCl，PH10
(3)电泳缓冲液：30mM NaOH，10mM EDTA，10mM Tris-HCl，PH10
(4)中性液：10mM Tris-HCl，PH7.4
结果如图5所示：(1)在正常条件下，出发菌株BY4741、过表达菌株Rad30Δ/Rad30以及敲除菌株Rad30Δ拖尾长度较小并且相差不大，说明DNA损伤程度轻；(2)在2mM H2O2条件下，出发菌株BY4741、过表达菌株Rad30Δ/Rad30以及敲除菌株Rad30Δ的DNA损伤程度均有提高，说明H2O2能够导致酿酒酵母的DNA损伤。其中出发菌株BY4741的DNA损伤程度提高了178％，过表达菌株Rad30Δ/Rad30的DNA损伤程度提高了128％，敲除菌株Rad30Δ的DNA损伤程度提高了622％。实验结果说明Rad30基因可能对H2O2导致的DNA损伤有重要的修复作用。
实施例6：
在酵母中过表达其他来源的Polη同系物：大肠杆菌PolⅣ或者硫化叶细菌Dpo4，检测能否增强酵母的抗氧化性。结果表明过表达PolⅣ和Dpo4并不能影响酵母细胞的抗氧化能力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种调节酿酒酵母氧胁迫的方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gttcaggctc tgcaactgg 19
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gatcttctta ggggcagaca tgctttgtct tgttttatca aagc 44
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gctttgataa aacaagacaa agcatgtctg cccctaagaa gatc 44
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ccatataatt gtctatttgg aataggttaa gcaaggattt tcttaacttc 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gaagttaaga aaatccttgc ttaacctatt ccaaatagac aattatatgg 50
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ggtcttcaga agagtaatga tagtg 25
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cccaagctta tgtcaaaatt tacttggaag gag 33
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ccgctcgagt catttttttc ttgtaaaaaa tgat 34

Claims (3)

1.一种改变酿酒酵母氧胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是缺失突变Rad30基因以降低菌株氧胁迫抗性或者过表达Rad30基因以增强菌株的氧胁迫抗性；所述Rad30基因的核苷酸序列如NCBI上GeneID: 852028的核苷酸序列；所述菌株是Saccharomyces cerevisiaeBY4741，基因型为MATα His3Δ1 Leu2Δ0 Met15Δ0 Ura3Δ0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缺失突变具体是：将标记基因Leu2同基因Rad30的左右臂连接起来，构建敲除框，将测序正确的敲除框导入酿酒酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因Rad30替换成Leu2，利用重组后的菌株含有Leu2基因而能合成亮氨酸这一特征筛选缺失Rad30基因的的突变菌株，经基因组PCR和测序验证正确的菌株即为缺失突变Rad30基因的菌株Rad30Δ。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达具体是将Rad30基因连接到质粒PY26上，由强启动子启动转录翻译，得到重组质粒PY26-Rad30，然后将重组质粒转化到酵母中，利用重组质粒上的Ura3基因来筛选阳性转化子，最后提取质粒验证得到过表达菌株Rad30Δ/Rad30。
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