ES2521316T3

ES2521316T3 - Método de modificación de una célula de levadura para la producción de etanol

Info

Publication number: ES2521316T3
Application number: ES08843807.2T
Authority: ES
Inventors: Elke Nevoigt; Stephane Guillouet; Carine Bideaux; Sandrine Alfenore; Georg Hubmann
Original assignee: Jacobs University gGmbH
Current assignee: Jacobs University gGmbH
Priority date: 2007-10-29
Filing date: 2008-10-29
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2028-10-29
Also published as: EP2060632A1; US20160153009A1; US9175270B2; EP2222860A1; WO2009056984A1; EP2222860B1; BRPI0817154B8; BRPI0817154A2; US20120295319A1; BRPI0817154B1; EP2222860B8; CA2703856A1

Abstract

Método de modificación de una célula de levadura para la producción de etanol, caracterizado por reducir la actividad de la proteína glicerol 3-fosfato deshidrogenasa-1, Gpd1, y reducir la actividad de la proteína glicerol 3-fosfato deshidrogenasa-2, Gpd2, por reducir, pero no eliminar, la actividad de la proteína Gpd1 y eliminar la actividad de la proteína Gpd2; o por eliminar la actividad de la proteína Gpd1 y reducir, pero no eliminar, la actividad de la proteína Gpd2; o por reducir, pero no eliminar, la actividad tanto de la proteína Gpd1 como de la proteína Gpd2, en el que la reducción de la actividad de la proteína Gpd1 y/o la proteína Gpd2 se consigue reduciendo la expresión del gen GPD1 y/o el gen GPD2, caracterizado porque la expresión del gen GPD1 y/o el gen GPD2 se reduce en al menos un 50% en comparación con la expresión en una célula de levadura silvestre.

Description

Método de modificación de una célula de levadura para la producción de etanol

La invención se refiere a un método de modificación de una célula de levadura para la producción de etanol, a una célula de levadura modificada y a un uso de la misma para producir etanol. La invención se refiere además a un método para producir etanol a partir de biomasa.

El bioetanol es una alternativa prometedora a los combustibles fósiles. El creciente interés por los biocombustibles renovables resulta principalmente del hecho de que los combustibles fósiles en el mundo son limitados. Además, existe la tendencia a disminuir la dependencia de la importación de petróleo. La Comisión Europea ha planeado sustituir progresivamente el 20% de los combustibles fósiles convencionales por combustibles alternativos en el sector del transporte para el 2020 (el 5,75% para el 2010). Una ruta técnica es producir bioetanol mediante fermentación microbiana a partir de diversos cultivos domésticos (biomasa).

En Brasil y en los Estados Unidos es común la producción de bioetanol a partir de biomasa que contiene azúcar y almidón. La levadura Saccharomyces (S.) cerevisiae se ha usado tradicionalmente en este procedimiento. De hecho, la levadura S. cerevisiae tiene propiedades excepcionales para la producción de bioetanol. En particular, su alta tolerancia a las condiciones que se producen durante la producción de etanol industrial apenas permitirá que otros microorganismos desplacen a la levadura en este campo.

S. cerevisiae forma glicerol como subproducto durante el catabolismo de glucosa además de los productos de fermentación principales: etanol, dióxido de carbono y biomasa. El flujo de carbono hacia glicerol es bastante sustancial y puede ascender a hasta 0,1 g de glicerol por gramo de glucosa (Alfenore et al., 2004; Aldiguier et al., 2004).

La biosíntesis de glicerol a partir del producto intermedio glicolítico dihidroxiacetona fosfato (DHAP) en S. cerevisiae se realiza mediante dos etapas enzimáticas catalizadas por la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPDH) y la glicerol 3-fosfatasa (GPP) (véase también la figura 1). Cada enzima se codifica por dos isogenes GPD1/GPD2 y GPP1/GPP2, respectivamente.

La biosíntesis de glicerol tiene papeles esenciales en S. cerevisiae. Una de las funciones más importantes es mantener un equilibrio redox citosólico, especialmente en condiciones anaerobias, y probablemente también en condiciones aerobias cuando la concentración de azúcar es alta (efecto Crabtree) (Ansell et al., 1997; Bakker et al., 2001; Rigoulet et al., 2004; Valadi et al., 2004). La ruta de biosíntesis de glicerol también está implicada en la biosíntesis de glicerofosfolípidos y triacilgliceroles que se forman a partir de L-glicerol 3-fosfato (Kohlwein et al., 1996; Mullner y Daum, 2004). Además, el glicerol intracelular está implicado en osmoadaptación (Hohmann, 2002), protección frente a estrés oxidativo (Pahlman et al., 2001) y respuesta a choque térmico (Siderius et al., 2000). Respuestas a elevadas temperaturas y alta osmolaridad implican varias rutas de señalización incluyendo la ruta de proteína cinasa C y la ruta de HOG, que regulan los niveles intracelulares de glicerol (Hohmann, 2002; Wojda et al., 2003).

En teoría, la redirección del flujo de carbono en S. cerevisiae hacia la ruta de síntesis de etanol eliminando la formación de glicerol podría aumentar el rendimiento de etanol en al menos un 10%. Además, una reducción del glicerol en el caldo de fermentación conduciría a una disminución en los costes de extracción de etanol, puesto que el glicerol ha provocado problemas en las unidades de destilación y procedimientos de separación tras la fase de fermentación. Además, se reducirían los volúmenes de residuos. Sin embargo, desde el punto de vista de los aspectos prácticos, reducir la formación de glicerol sin afectar negativamente a la aptitud biológica de las células es extremadamente desafiante debido a las diversas funciones biológicas de la ruta de biosíntesis de glicerol, tal como se explicará resumidamente ahora con referencia a estudios anteriores.

Hace pocos años, se notificó el primer enfoque de ingeniería metabólica para reducir el glicerol (Nissen et al., 2000a). Se aumentó el rendimiento de etanol en fermentaciones discontinuas aerobias en un 12% cuando la formación de glicerol se suprimió completamente mediante la deleción de GPD1 y GPD2. El crecimiento de este mutante doble se veía gravemente afectado incluso en presencia de oxígeno. Por tanto, la productividad volumétrica de etanol obtenida con este enfoque distaba mucho de tener relevancia industrial. El hecho de que el crecimiento del mutante doble gpd1 gpd2 se viese afectado considerablemente, se ha explicado por una capacidad limitada de reoxidación de NADH respiratoria (mediante las NADH deshidrogenasas externas Nde1p, Nde2p y el transportador L-G3P/DHAP mitocondrial) (Nissen et al., 2000a) que son las únicas rutas para reoxidar el exceso de NADH citosólico cuando GPD está ausente.

Otros intentos de reducir la formación de glicerol se basaron en la introducción de transhidrogenasas bacterianas en la levadura. Estos enfoques no funcionaron ya que, por un lado, la transhidrogenasa de Azotobacter vinelandii produjo el efecto opuesto al esperado (Nissen et al., 2001), y por otro lado, la transhidrogenasa unida a membrana de Escherichia coli permaneció localizada en la membrana del retículo endoplásmico (Anderlund et al., 1999).

Una estrategia bastante satisfactoria para mejorar el rendimiento de etanol ha sido la modificación mediante ingeniería metabólica de la asimilación de amonio, que reduce la producción de NADH durante la biosíntesis de

aminoácidos (Nissen et al., 2000b). El rendimiento de glicerol se redujo en un 38% y el rendimiento de etanol aumentó en un 10%. Sin embargo, para una función apropiada, este enfoque requiere que la levadura utilice amonio como fuente de nitrógeno. Medios industriales contienen a menudo aminoácidos, un hecho que reducirá considerablemente el éxito de este enfoque en condiciones industriales pertinentes.

Recientemente, se llevó a cabo un estudio in silico usando un modelo metabólico de S. cerevisiae a escala de genoma con el fin de evaluar posibles estrategias de ingeniería metabólica para mejorar el rendimiento de etanol en

S. cerevisiae (Bro et al., 2005). Estos enfoques se han diseñado para impedir la producción de NADH en exceso a través de síntesis de biomasa, y por tanto, reducir la necesidad de producir glicerol. Basándose en las predicciones de los autores, varios enfoques deberían aumentar el rendimiento de etanol en hasta un 10,4%. Se sometió a prueba in vivo una de las estrategias predichas, pero a diferencia de la teoría, sólo dio como resultado un aumento del 3% del rendimiento de etanol.

Lin H. et al. han descrito el papel de fosfolipasa C para la expresión de Gpd 1 en Saccharomyces cerevisiae (Lin et al., 2002).

Por tanto, los enfoques de ingeniería metabólica mencionados anteriormente no tienen o sólo tienen un impacto mínimo sobre la productividad de etanol en condiciones pertinentes a nivel industrial debido a las limitaciones en el rendimiento de etanol, crecimiento o dependencia del medio. Además, sigue siendo cuestionable si los enfoques actuales y predichos demostrarían ser satisfactorios a un estrés térmico y de etanol elevado de fermentaciones industriales, puesto que no tienen en cuenta la necesidad de las células de glicerol intracelular.

Descripción de la invención

Por tanto, el problema subyacente de la presente invención era aumentar el rendimiento de conversión de constituyentes de biomasa que puede fermentarse para dar etanol mediante levadura y, de hecho, aumentar la rentabilidad de plantas de bioetanol. Una manera de lograr este objetivo es reducir la producción del subproducto glicerol.

Un desafío particular en la resolución de este problema radica en el hecho de que se ha demostrado que la eliminación completa de la formación de glicerol no es satisfactoria, puesto que la ruta de biosíntesis de glicerol tiene varias funciones importantes para el crecimiento celular y la tolerancia al estrés.

En su lugar, los inventores encontraron sorprendentemente una estrategia para modificar una célula de levadura silvestre que conduce a un rendimiento aumentado de etanol a partir de azúcares, es decir azúcares que pueden fermentarse presentes en hidrolizados de biomasa vegetal, pero que al mismo tiempo no tiene una influencia negativa sobre la velocidad de crecimiento de las células de levadura o el rendimiento de biomasa. Según la invención, esto se consigue reduciendo (pero no eliminando) la actividad de la proteína Gpd1 y/o la proteína Gpd2 en comparación con la actividad de estas proteínas en una célula silvestre.

De hecho, a través de la invención se consigue un mayor rendimiento de etanol, título y productividad específica en comparación con la cepa silvestre isogénica. Además, la modificación de la ruta metabólica tiene la ventaja adicional de reducir los costes de la recuperación de productos y reduce los volúmenes de residuos.

La expresión “reduciendo la actividad” pretende no incluir la eliminación de la actividad de la proteína. Además, el término “actividad” se refiere al flujo metabólico in vivo a través de la proteína particular, que, según la definición de la expresión “reduciendo la actividad”, no pretende incluir la obstrucción completa de este flujo metabólico. En su lugar, el quid de la invención radica en la reducción de la actividad de la proteína Gpd1 y/o la proteína Gpd2, pero proporcionando al mismo tiempo una actividad mínima de la proteína Gpd1 y/o la proteína Gpd2 con el fin de permitir la producción de sustancias posteriormente a estas enzimas (tal como glicerol) que son necesarias para mantener una velocidad de crecimiento normal.

Este resultado puede conseguirse de diferentes maneras: En primer lugar, es posible reducir la actividad de la proteína Gpd1 y eliminar la actividad de la proteína Gpd2. En segundo lugar, puede eliminarse la actividad de la proteína Gpd1 y puede reducirse la actividad de la proteína Gpd2. En tercer lugar, puede reducirse la actividad tanto de la proteína Gpd1 como de la proteína Gpd2. Un experto en la técnica puede determinar sin excesivos problemas cuál de las tres opciones conduce a los mejores resultados dependiendo, por ejemplo, del tipo de cepa de levadura usada o las condiciones de crecimiento.

Las células de levadura según la invención son útiles para cualquier aplicación en la que la producción de glicerol en la célula necesita minimizarse hasta un nivel que no influya negativamente en la velocidad de crecimiento de la célula.

La reducción de la actividad de la proteína Gpd1 y/o la proteína Gpd2 se consigue tal como sigue.

Se reduce la expresión del gen GPD1 y/o el gen GPD2, lo que conduce a una reducción de la proteína en la célula.

Esto puede conseguirse en una realización de la invención expresando el gen GPD1 y/o el gen GPD2 mediante un

promotor débil que está ligado de manera funcional al gen GPD1 y/o ligado de manera funcional al gen GPD2. Un promotor es débil cuando la tasa de transcripción del gen se reduce hasta al menos un 20% o un 15%, preferiblemente hasta al menos un 10%, lo más preferiblemente hasta al menos un 7% o un 5% de la tasa de transcripción de ese gen expresado en el promotor silvestre TEF1 (SEQ ID NO 11). Un experto en la técnica conoce maneras de medir la fuerza de un promotor, tales como el uso de un gen indicador como luciferasa o proteína verde fluorescente (GFP), medición de los niveles de ARNm, por ejemplo usando transferencia de tipo Northern o PCR con transcriptasa inversa en tiempo real; en el nivel de proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western; o a través de mediciones de la actividad enzimática específica.

La expresión del gen GPD1 y/o el gen GPD2 se reduce en al menos un 50%, al menos un 60% o al menos un 70% en comparación con su expresión en una célula silvestre en su promotor silvestre. Es particularmente ventajoso reducir la expresión en al menos un 80% o al menos un 90%, y lo más preferido es reducir la expresión en al menos un 95% o al menos un 99%, en comparación con la expresión del gen particular en una célula de levadura silvestre, es decir una célula de levadura con un promotor nativo.

En una realización preferida, el promotor débil es un promotor según SEQ ID NO 5 ó 6. El promotor según SEQ ID NO 5 conduce a una tasa de transcripción del 7% y el promotor según SEQ ID NO 6 conduce a una tasa de transcripción del 16% de la tasa de transcripción provocada por el promotor silvestre TEF1 (SEQ ID NO 11) (Nevoigt et al., 2006).

Las secuencias de aminoácidos de la proteína Gpd1, la proteína Gpd2, la proteína Gpp1 y la proteína Gpp2 de S. cerevisiae pueden encontrarse como SEQ ID NO 26, 27, 28 y 29, respectivamente. Un experto en la técnica puede identificar la secuencia de aminoácidos respectiva para otras especies de levadura.

En una realización preferida del método según la invención, también se reduce la actividad de la proteína Gpp1 y/o la proteína Gpp2, es decir otra enzima clave de la ruta de glicerol, además de la reducción de la actividad de la proteína Gpd1 y/o la proteína Gpd2.

Es posible o bien reducir la actividad de la proteína Gpp1 y eliminar la actividad de la Gpp2, o bien eliminar la actividad de la proteína Gpp1 y reducir la actividad de la Gpp2 o bien reducir la actividad tanto de la proteína Gpp1 como de la Gpp2. Además, en una realización también es posible eliminar la actividad tanto de la proteína Gpp1 como de la Gpp2, tal como se mostrará en los ejemplos.

Los medios que pueden usarse para reducir la actividad de la proteína Gpd1 y/o la proteína Gpd2 son equivalentes a los medios explicados anteriormente y se aplican de un modo equivalente también para la reducción de la actividad de Gpp1 y/o Gpp2, tal como comprenderá un experto en la técnica. Por consiguiente, la actividad de GPP puede reducirse reduciendo la expresión de la proteína Gpp1 y/o la Gpp2, proporcionando una molécula antisentido al ARNm de GPP1 (SEQ ID NO 3) y/o al de GPP2 (SEQ ID NO 4), proporcionando un antagonista a la proteína Gpp1 y/o la Gpp2, proporcionando una forma mutada de la proteína Gpp1 y/o la proteína Gpp2 o proporcionando una molécula inhibidora pequeña tal como fluoruro, que se ha descrito como un inhibidor no específico de fosfatasas, para inhibir la proteína Gpp1 y/o la proteína Gpp2. Se hace referencia a la descripción facilitada anteriormente para detalles en cuanto a estos medios de reducción.

La presente invención puede usarse en general con cualquier cepa de levadura, tal como S. cerevisiae y especies estrechamente relacionadas (es decir otras especies del género Saccharomyces). También se prefieren otras especies de levadura distintas de Saccharomyces, especialmente aquéllas que muestran fermentación etanólica y tienen la capacidad de fermentar pentosas tales como Pichia (P.) stipitis. Se prefiere particularmente el uso de cepas que son ventajosas en aplicaciones industriales, tales como la cepa de levadura S. cerevisiae prototrófica CEN.PK113-7D. Un experto en la técnica conoce otras cepas adecuadas.

Un experto en la técnica entenderá que cuando se usa una cepa diploide o poliploide, se vuelve necesario reducir las actividades de la Gpp1p y/o Gpp2p así como posiblemente Gpd1p y/o Gpd2p en todos los alelos presentes con el fin de conseguir la reducción necesaria en la actividad de las proteínas.

El problema subyacente también se soluciona mediante una célula de levadura modificada que puede obtenerse a través de un método tal como se describió anteriormente.

Específicamente, en una célula de levadura de este tipo, la actividad de la proteína Gpd1p y/o Gpd2p se reduce en comparación con la actividad de dichas proteínas en una célula de levadura silvestre, es decir en una célula de levadura con una actividad proteica normal (flujo normal) y una velocidad de crecimiento normal o, expresado de manera diferente, en comparación con una célula de levadura en la que no están presentes las modificaciones presentes en la célula de levadura modificada genéticamente según la invención que conducen a la actividad reducida de la proteína Gpd1 y/o Gpd2.

Para la cantidad preferida de reducción de la actividad de las proteínas, se hace referencia a la descripción anterior.

Se describieron anteriormente medios para reducir la actividad de dichas proteínas, cuya aplicación conduce a una célula de levadura en la que

-: se reduce la expresión del gen GPD1 y/o gen gpd2.

Se describieron anteriormente características adicionales de una célula de levadura de este tipo según la invención, en relación con el método según la invención.

El problema subyacente también se soluciona a través del uso de una célula de levadura modificada genéticamente tal como se describió anteriormente, para producir etanol a partir de biomasa. Esto puede conseguirse proporcionando una célula de levadura modificada tal como se describió anteriormente, proporcionando biomasa y haciendo crecer la célula de levadura en presencia de la biomasa, así como obteniendo el etanol. En general, las células de levadura según la invención pueden usarse en cualquier aplicación en la que deba evitarse una alta producción de glicerol en la célula, ya que la reducción de glicerol según el método descrito en el presente documento no conduce a velocidades de crecimiento menores.

El término biomasa cuando se usa junto con un método de producción de etanol, pretende hacer referencia a materiales vegetales y derivados de plantas, tales como almidón, azúcar, celulosa, hemicelulosa, en particular de caña de azúcar, remolacha azucarera, maíz, cereales, etc.

El problema subyacente se soluciona además mediante un método para la producción de etanol que comprende las siguientes etapas:

-: proporcionar una célula de levadura tal como se describió anteriormente,

-: proporcionar biomasa, y

-: hacer crecer la célula de levadura en presencia de la biomasa en condiciones que permiten la producción de etanol.

Tal como resultará evidente para un experto en la técnica, podría ser necesario o ventajoso tratar la biomasa química, enzimática o mecánicamente antes de hacer crecer la levadura junto con la biomasa, con el fin de facilitar la fermentación. Un experto en la técnica conoce métodos para tales tratamientos.

Tal como se mostró por Alfenore et al., 2004, también puede reducirse la producción de glicerol adaptando las condiciones de crecimiento de la célula de levadura. Particularmente las condiciones de aireación y la composición del medio pueden tener una gran influencia sobre la producción de glicerol y por tanto sobre la producción de etanol.

Figuras

Figura 1

Se muestran las rutas implicadas en el metabolismo de glicerol en Saccharomyces cerevisiae. Se forma glicerol a partir de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) glicolítica mediante la acción tanto de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD codificada por GPD1 y GPD2) como de glicerol 3-fosfatasa (G3Pasa codificada por GPP1 y GPP2). Gut1p y Gut2p son responsables de la utilización de glicerol. Nevoigt y Stahl (1997) han revisado las rutas para la biosíntesis y metabolización de glicerol en S. cerevisiae. El canal Fps1p es el mediador de la mayor parte de la difusión pasiva de glicerol (Oliveira et al., 2003). Las células de levadura captan el glicerol mediante el transportador Stl1p y probablemente también mediante Gup1p y Gup2p (Ferreira et al., 2005). El glicerol se convierte en dihidroxiacetona (DHA) mediante glicerol deshidrogenasa (GDH) dependiente de NADP+. Se sugiere que los genes ARA1, GCY1, GRE3, YPR1 contribuyen a esta actividad (Izawa et al., 2004); sin embargo, otros notificaron que no se detecta ninguna actividad de esta enzima en absoluto, resultado que ha puesto en duda la relevancia de la ruta de DHA para

S. cerevisiae (Norbeck y Blomberg, 1997). DAK1 y DAK2 codifican para dihidroxiacetona cinasa (Molin et al., 2003). NDE1 y NDE2 codifican para la NADH deshidrogenasa externa en levadura que puede reoxidar directamente NADH citosólico transfiriendo los electrones a la cadena respiratoria. DHAP: dihidroxiacetona fosfato, GAP: gliceraldehído 3-fosfato, L-G3P: L-glicerol 3-fosfato, DHA: dihidroxiacetona, FBP: 1,6-fructosa bisfosfato y el TPI1: gen que codifica para triosa fosfato isomerasa.

Figura 2

La figura 2 muestra la alineación de secuencias del promotor TEF1 no mutado de Saccharomyces cerevisiae y el mutante 2 del promotor TEF1. Se muestra la fuerza del promotor normalizada.

Figura 3

Actividad específica de la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa de la cepa de Saccharomyces cerevisiae modificada mediante ingeniería relacionada con la silvestre isogénica. Se define 1 unidad como la conversión de 1 mol de sustrato por minuto y mg de proteína.

Figura 4

Rendimientos de etanol, biomasa y glicerol en gramos por glucosa consumida de la cepa de Saccharomyces

cerevisiae modificada mediante ingeniería y la silvestre isogénica tras un agotamiento de glucosa en fermentaciones de medio YEPD en condiciones limitadas de oxígeno.

Figura 5 Se muestra el resultado de un experimento de crecimiento de la cepa de Saccharomyces cerevisiae modificada mediante ingeniería y la silvestre isogénica en un medio YEPD (placas de agar) en condiciones aerobias y anaerobias.

Figura 6

Se muestra el resultado de un experimento de crecimiento de la cepa de Saccharomyces cerevisiae modificada mediante ingeniería y la silvestre isogénica en medio YEPD líquido en condiciones aerobias. Figura 7 Producción de etanol, glicerol y consumo de azúcar tras una fermentación discontinua en condiciones limitadas de

oxígeno a 30ºC en malta de trigo. Se sacarificó completamente la malta de trigo y se centrifugó antes de que comenzara la fermentación. El hidrolizado contenía aproximadamente 143 g/l de azúcar total, es decir glucosa y fructosa. Se obtuvieron las condiciones limitadas de oxígeno cerrando los matraces Erlenmeyer con cierres tipo airlock que permitían la liberación de gases. Se llevó a cabo un mezclado usando un agitador magnético fijado a 200 rpm. Para este experimento, se usó la cepa de levadura S. cerevisiae prototrófica CEN.PK113-7D y un derivado con deleción en GPD2 y que porta modificaciones del promotor GPD1 (una versión mutante del promotor TEF1 (promotor mutante 2, SEQ ID NO 5) y la secuencia loxP-KmR-loxP como marcador seleccionable). En esta cepa no se modificaron los genes que codificaban para GPP1 y GPP2.

En todos los paneles A a F de la figura 7, la barra izquierda muestra: CEN.PK113-7D, el 100% de actividad de GPD, y la barra derecha muestra: CEN.PK113-7D, el 6% de actividad de GPD. El eje y de los paneles es como sigue: 7A Concentración de glicerol final (g/l) 7B Concentración de etanol final (g/l) 7C Rendimiento de glicerol (g/g de glucosa, fructosa consumida) 7D Rendimiento de etanol (g/g glucosa, fructosa consumida) 7E Razón: glicerol/etanol (g/g) 7F Azúcar (glucosa, fructosa) consumida (g/l)

Ejemplos

Material y métodos: Medios: Medio YEPD (el 1% extracto de levadura, el 2% de peptona, el 2% de glucosa) Cepas de levadura: Se originaron las cepas de levadura generadas en este estudio a partir de la cepa de laboratorio de S. cerevisiae

W303-1A (tabla 1). Se ha publicado la cepa YA103 correspondiente a una cepa con deleción doble gpp1 gpp2 por Pahlman et al. (2001). Modificaciones genéticas adicionales de la cepa de S. cerevisiae YA103:

1.: Deleción del gen GPD2/supresión de la expresión de GPD2

Se alteró el gen GPD2 en la cepa YA103 mediante el método descrito por (Güldener et al., 1996) usando pUG72 (Gueldener et al., 2002) como molde y los cebadores P29 y P30 (tabla 2). Se controló la alteración de GPD2 mediante PCR de diagnóstico usando el par de cebadores P33/P34 (tabla 2). Se llevó a cabo una selección de transformantes positivos sobre placas de agar que contenían medio CSM que carecía de uracilo. La cepa resultante se ha denominado EN-GGG (tabla 1).

2.: Regulación por disminución de la expresión de GPD1 Se reemplazó el promotor GPD1 cromosómico nativo en la cepa EN-GGG por el casete de reemplazo de promotor

amplificado a partir de ADN genómico de una cepa de levadura derivada de levadura de laboratorio BY4741 que portaba el promotor TEF mutado con la actividad más baja (Nevoigt et al., 2006) en lugar del promotor GPD1 nativo. Se usaron los cebadores P9 (SEQ ID NO 7) y P10 (SEQ ID NO 8) para una amplificación por PCR del casete de reemplazo de promotor (incluyendo la secuencia loxP-K.l.LEU2-loxP como marcador seleccionable). Las condiciones de PCR eran tal como se publicaron anteriormente (Nevoigt et al., 2006). Se combinaron dos alícuotas de PCR de 100 l, se precipitaron y se usaron para una transformación tal como se describe por Güldener et al. (1996). Se llevó a cabo una selección de transformantes positivos sobre placas de agar que contenían medio CSM que carecía de leucina.

Se comprobó la integración correcta del casete de reemplazo de promotor mediante PCR de diagnóstico usando una combinación de cebadores P9 (SEQ ID NO 7)/P12 (SEQ ID NO 10) y P11 (SEQ ID NO 9)/P12 (SEQ ID NO 10) (tabla 2). La cepa resultante se ha denominado EN-G46a (tabla 1).

Tabla 1. Cepas de S. cerevisiae usadas en los ejemplos

Cepa Genotipo Referencia W303-1A* MATa Thomas y Rothstein (1989) YA103* MATa gpp1::kanMX4 gpp2::HIS3 Påhlman et al.

(2001) EN-GGG* MATa gpp1::kanMX4 gpp2::HIS3 gpd2::K.l.URA3 EN-G46a* MATa gpp1::kanMX4 gpp2::HIS3 gpd2::K.l.URA3

gpd1p::TEFmut2::K.l.LEU2

* Estas cepas albergan mutaciones adicionales tal como sigue: leu2-3/112 ura3-1 trp1-1 his311/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 mal0

Tabla 2. Cebadores usados

Uso/nombre Secuencia SEQ ID NO

Amplificación del casete de reemplazo de promotor incluyendo la versión mutante del promotor TEF1 (promotor mutante 2 descrito en Nevoigt et al., 2006) y la secuencia loxP-K. l. LEU2-loxP como marcador seleccionable:

P9 (se une al prom. GPD1 en el cccaaggcaggacagttacc SEQ ID NO 7 sentido de 5’) P10 (se une en la sec. cod. de GPD1) agcaccagatagagcaccaca SEQ ID NO 8

PCR de diagnóstico para comprobar la integración correcta del casete de reemplazo de promotor:

P11 (se une en K.l.LEU2) ggaccaccaacagcacctagt SEQ ID NO 9 P12 (se une al sitio de integración en el gtaagcaactgttgtttcaga SEQ ID NO 10 sentido de 3’ en la secuencia codificante de GPD1)

Deleción de GPD2 usando loxP-K.l. URA3-loxP como marcador seleccionable:

P29 atgcttgctgtcagaagattaacaagatacacattccttagatcccaatacaacagatcacg SEQ ID NO 12 P30 cgatgtctagctcttcaatcatctccggtaggtcttccatgttttatttaggttctatcg SEQ ID NO 13

PCR de diagnóstico para controlar la alteración de GPD2:

P33 ggtagattcaattctctttccc SEQ ID NO 14 P34 aggcaacaggaaagatcagagg SEQ ID NO 15

Fermentaciones discontinuas con oxígeno limitado y determinación de rendimientos de productos

1er día:

-: 1er precultivo: inocular 20 ml de YEPD con 500 l de disolución madre de glicerol

-: Incubar durante la noche a 30ºC en un agitador (170 rpm) durante 20 horas

2o día:

-: 2o precultivo: inocular 150 ml de YEPD con 1,5 ml del primer precultivo

3er día:

-: Centrifugar el 2o precultivo (10 min, 5000 rpm, 4ºC) y lavar las células una vez con agua destilada

-: Inoculación del cultivo principal: inocular 100 ml de YEPD en matraces Schott de 100 ml ajustando una DO de 0,2

-: Inmediatamente, se tomaron muestras para la determinación de las concentraciones iniciales de glicerol, etanol, glucosa y biomasa

-: Añadir un agitador magnético y cerrar los matraces con cierres tipo airlock para garantizar una liberación de gases pero impedir la entrada de oxígeno

-: Agitar el cultivo durante 24 h a 28ºC y 300 rpm

4o día:

-: Se tomaron muestras (2 x 1 ml), se centrifugaron (10 min, 12000 rpm, 4ºC) y se almacenaron los sobrenadantes a -20ºC hasta que se midieron las concentraciones de glicerol, etanol y glucosa. Se llevaron a cabo las mediciones de glucosa y productos de fermentación tal como se describió anteriormente (Nevoigt y Stahl, 1996). Se determinó el peso seco de levadura (biomasa) al final de la fermentación filtrando 30 ml del cultivo usando filtros de nitrocelulosa pesados previamente (tamaño de poro de 0,45 mm). Se lavaron los filtros con las células con agua destilada y se secaron hasta que el peso alcanzó un valor estable.

Determinación de la actividad específica de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa

En general, se determinaron actividades enzimáticas in vitro durante el crecimiento logarítmico, es decir cuando la densidad celular era aproximadamente 1 durante las fermentaciones discontinuas. Se rompieron células de levadura mediante agitación con vórtices con perlas de vidrio (0,5 mm de diámetro) durante 15 min a 4ºC según un método descrito previamente (Ciriacy, 1975). Con el fin de someter a ensayo GPD, se recogieron aproximadamente 3 x 109 células y se homogeneizaron en 3 ml de tampón trietanolamina (Blomberg y Adler, 1989; Andre et al., 1991) que contenía 0,2 mmol/l de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y 2 g de perlas de vidrio. Se centrifugó el homogeneizado en cada caso a 12000 g y 4ºC durante 15 min. Se usó el sobrenadante tras la desalación mediante paso a través de una columna Sephadex G-25. (Pharmacia PD-10, Pharmacia Fine Chemicals, Suecia). Se sometió a ensayo GPD en tampón imidazol a pH 7,0 según Gancedo et al. (1968). Se midió la concentración de proteínas mediante el método con azul de Coomassie (Bradford, 1976), usando albúmina sérica bovina A 3350 (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) como patrón (Nevoigt y Stahl, 1996).

Crecimiento sobre placas de agar en condiciones aerobias y anaerobias

Se diluyeron cultivos de fase estacionaria de las dos cepas en medio YEPD (diluciones de diez veces) y se transfirió una alícuota a placas de agar con YEPD usando un sello. Se incubaron las placas durante 3 días. Se obtuvieron condiciones libres de oxígeno aplicando Anaerocult A (MERCK) en un incubador hermético.

Deleciones de GPP1 y GPP2

Puede efectuarse deleción del gen GPP1 mediante la técnica de selección como diana mediante PCR de regiones de homología flanqueantes largas (Pahlman et al, 2001). En la primera etapa, se usaron un conjunto de cebadores (TGTGTGAGTTCCTCTTTTCTT (SEQ ID NO 16) y TCAAAGGCATTGCGATGGTT (SEQ ID NO 17)) para amplificar una porción de 263 pares de bases (pb) de longitud de ADN genómico de S. cerevisiae W303, en el sentido de 5’ del tercer codón en el ORF de GPP1. Se usó un segundo conjunto (CGCTAAGGATGACTTGTTGA (SEQ ID NO 18) y CTCTAACTTCTCGTCGTACT (SEQ ID NO 19)) para amplificar un fragmento de 358 pb del noveno codón en el ORF de GPP1 en el sentido de 5’ del codón de terminación. El extremo 59 de los cebadores adyacentes al sitio de inserción portaba 25 extensiones de nucleótidos homólogas a las regiones 59 y 39 del casete de alteración hisGMX6

o kanMX4 de los plásmidos pFA6a-hisGMX6 y pFA6-kanMX4. En la segunda reacción PCR, se usaron pFA6ahisGMX6 y pFA6-kanMX4 como moldes y se fusionaron las regiones homólogas a 59 y 39 de la primera reacción PCR al casete de alteración sirviendo como cebadores junto con los cebadores directo en el sentido de 5’ e inverso en el sentido de 3’ de las regiones flanqueantes, produciendo así el casete de selección como diana del ORF. Se transformó este casete en una cepa W303 de S. cerevisiae haploide, y se seleccionaron transformantes independientes para la verificación del reemplazo de GPP1. Usando un conjunto de cebadores (directo: CAAGCAGGAAATCCGTATCA (SEQ ID NO 20) e inverso TCATATGGAGCAATCCCACT (SEQ ID NO 21)) que se hibridaban en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’, respectivamente, del casete de disrupción, se amplificó ADN cromosómico. Se verificó la longitud de los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Se alteró el ORF de GPP2 de una manera similar usando un conjunto de cebadores (CAAGTGAGGACTTTTCGGAT (SEQ ID NO 22) y GTAGTCAATCCCATTCCGAA (SEQ ID NO 23)) para amplificar un fragmento de 346 pb en el sentido de 5’ del cuarto codón en el ORF. Se usó el segundo conjunto (GGACGATCTGTTGAAATGGT (SEQ ID NO 24) y CCTGTCCACTTTCAAGTTGCT (SEQ ID NO 25)) para amplificar un fragmento de 287 pb del séptimo codón en el ORF de GPP2 en el sentido de 3’ del codón de terminación. Se verificó la integración correcta de los módulos de alteración en los alelos de GPP1 y GPP2 mediante PCR usando cebadores apropiados.

Basándose en esta cepa, se introdujeron deleciones adicionales tal como se describe en el presente documento.

Experimentos preliminares

En estudios iniciales, los inventores sometieron a prueba cepas con deleciones en GPP para determinar su capacidad de impedir la formación de glicerol en la producción de bioetanol combustible. La eliminación completa de GPD, una enzima clave en la biosíntesis de glicerol, no era sencilla. Se han observado las ventajas principales de la supresión de la actividad de GPP, en lugar de GPD, en i) la conservación de la etapa de reoxidación de NADH de la biosíntesis de glicerol (realizada mediante productos génicos de GPD1/2) y ii) la provisión de L-G3P con fines anabólicos (figura 1).

Se estudiaron tanto cepas con deleción individual (gpp1 y gpp2) como una cepa con deleción doble (gpp1gpp2) de la cepa de levadura de laboratorio W301-1A. Se caracterizaron los fenotipos de las diferentes cepas durante procedimientos de fermentación de etanol dinámica en un biorreactor altamente dotado de instrumentos de medida en un medio mineral en condiciones aerobias. Un análisis comparativo de la cepa silvestre y las diferentes cepas mutantes condujo a las siguientes conclusiones:

•: una deleción individual de uno de los dos genes GPP no condujo a cambios fenotípicos importantes (crecimiento, producción de etanol y glicerol)

•: sólo se disminuyó la concentración de glicerol en un 65% en el mutante con deleción doble gpp1 gpp2 pero no se suprimió

•: el mutante doble gpp1 gpp2 mostró una velocidad de crecimiento que se vio afectada negativamente (disminuida en un 65%) y una menor tolerancia al etanol

Se desconoce la ruta de formación de glicerol en un mutante gpp1 gpp2. Además, los motivos del crecimiento que se vio afectado negativamente y la menor tolerancia al etanol en el mutante con deleción doble gpp1 gpp2 siguen siendo poco claros. No obstante, los datos muestran que una deleción completa de GPP tampoco es sencilla para mejorar considerablemente la productividad de etanol. Probablemente GPP tiene otra función que se desconoce pero importante en la célula.

Los experimentos muestran que puede recuperarse el crecimiento de un mutante gpp1 gpp2 a nivel silvestre tras reducir la actividad de GPD en esta cepa. Por tanto, se supone, sin querer restringirse a la teoría, que una alta acumulación intracelular de L-glicerol 3-fosfato es responsable del defecto de crecimiento de un mutante gpp1 gpp2. Se reduce este alto nivel cuando se reduce la actividad de GPD en la célula.

Por tanto, los inventores encontraron sorprendentemente que se mantiene una aptitud biológica celular (en GPP silvestre) o se restablece (en células con actividad de GPP suprimida) si no se suprime completamente la actividad de GPD, una enzima clave en la ruta de biosíntesis de glicerol, pero que en su lugar se mantiene un flujo mínimo a través de la enzima clave requerido por la célula. Esto está en contraposición con una supresión completa de GPD o GPP, puesto que ambas demostraron ser perjudiciales para la aptitud biológica celular.

Generación de promotores de actividades clasificadas para ajustar de manera precisa actividades enzimáticas

Es de crucial importancia tener herramientas para ajustar de manera precisa actividades enzimáticas con el fin de determinar los requisitos mínimos de las células con respecto al flujo a través de la ruta de biosíntesis de glicerol. Recientemente, se desarrolló una colección robusta y bien caracterizada de mutantes de promotor de levadura de fuerzas clasificadas de manera precisa (Alper et al., 2005; Nevoigt et al., 2006). Usando estos mutantes de promotor, se crearon casetes de reemplazo de promotor, qua ahora están disponibles en combinación con dos marcadores seleccionables genéticamente diferentes. Para mostrar la utilidad de estos casetes de promotor, se han usado para ajustar la expresión de GPD1 en S. cerevisiae y analizar el impacto sobre la formación de glicerol y el rendimiento de biomasa (Nevoigt et al., 2006).

Resultados

Se generó una cepa de laboratorio de S. cerevisiae que portaba deleciones en los genes GPP1, GPP2 y GPD2 y que tenía una expresión muy baja de GPD1 debido al hecho de que el promotor GPD1 nativo en el genoma de levadura se reemplazó por un promotor débil. Este promotor débil (SEQ ID NO 5) se obtuvo de la colección de mutantes del promotor TEF1 (mutante 2 TEFp) creada por Nevoigt et al. (2007) y se muestra junto con el promotor silvestre TEF1 (SEQ ID NO 11) en la figura 2.

Esta cepa denominada gpp1 gpp2 gpd2 TEF1pmut2-GPD1 (EN-G46a; tabla 1) mostró una actividad de GPD que era aproximadamente el 7% de la de la silvestre isogénica (figura 3). La cepa gpp1 gpp2 gpd2 TEF1pmut2-GPD1 y la silvestre correspondiente se usaron para fermentar el 2% de glucosa en un medio complejo (YEPD) en condiciones limitantes de oxígeno (véanse los métodos anteriores). La cepa modificada mediante ingeniería mostró un rendimiento de glicerol por gramo de glucosa consumida que era sólo el 14,5% del de la silvestre (figura 4). El rendimiento de etanol (gramos de etanol por gramo de glucosa consumida) era un 6,7% mayor que el rendimiento de la silvestre (figura 4). Sorprendentemente, el rendimiento de biomasa final (figura 4) no se vio influido por la modificación mediante ingeniería de la ruta de glicerol aún cuando las condiciones durante la fermentación

discontinua eran casi anaerobias (100 ml de cultivo en matraces de 100 ml cerrados con cierres tipo airlock). También se investigó el crecimiento de ambas cepas en condiciones aerobias y anaerobias usando placas de agar con YEPD y prácticamente no hubo ninguna diferencia (figura 5). También se mostró que el crecimiento en el medio YEPD líquido en condiciones aerobias era el mismo (figura 6). Ambas cepas mostraron una velocidad de crecimiento promedio de 0,27 h-1 durante la fase de crecimiento exponencial.

Experimentos preliminares han mostrado que puede obtenerse el mismo resultado regulando por disminución la actividad de GPD sola, es decir sin deleciones de GPP1 y GPP2. Por tanto, parece que las deleciones de GPP1 y GPP2 no son necesarias para la invención.

Relevancia industrial de los resultados

Los resultados obtenidos tienen un gran impacto sobre la producción de bioetanol (incluyendo biocombustibles de primera generación) puesto que puede producirse más etanol a partir de la misma cantidad de sustrato (hidratos de carbono tales como hidrolizados de almidón, celulosa o hemicelulosa). Además, se reduce considerablemente la producción de glicerol. Esto también es importante porque el glicerol participa en la incrustación de las unidades de destilación en el procedimiento de producción de bioetanol.

Ésta es la primera vez que se redujo considerablemente la producción de glicerol sin influir negativamente en el crecimiento en condiciones limitantes de oxígeno. El aumento en la productividad de etanol es mayor que el descrito en la técnica anterior debido a la velocidad de crecimiento normal de las células junto con una producción aumentada de etanol a expensas de la formación de glicerol.

Bibliografía

•: Alfenore, S., Cameleyre, X., Benbadis, L., Bideaux, C., Uribelarrea, J. L., Goma, G., Molina-Jouve, C. y Guillouet,

S.: E. (2004). Aeration strategy: a need for very high ethanol performance in Saccharomyces cerevisiae fed-batch process. Appl Microbiol Biotechnol 63, 537-42.

•: Alper, H., Fischer, C., Nevoigt, E. y Stephanopoulos, G. (2005). Tuning genetic control through promoter engineering. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 12678-83.

•: Anderlund, M., Nissen, T. L., Nielsen, J., Villadsen, J., Rydstrom, J., Hahn-Hagerdal, B. y Kielland-Brandt, M. C. (1999). Expression of the Escherichia coli pntA and pntB genes, encoding nicotinamide nucleotide transhydrogenase, in Saccharomyces cerevisiae and its effect on product formation during anaerobic glucose fermentation. Appl Environ Microbiol 65, 2333-40.

•: Andre L, Hemming A, Adler L. 1991. Osmoregulation in Saccharomyces cerevisiae. Studies on the osmotic induction of glycerol production and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD+). FEBS Lett 286 (1-2): 13-7.

•: Ansell, R., Granath, K., Hohmann, S., Thevelein, J. M. y Adler, L. (1997). The two isoenzymes for yeast NAD+dependent glycerol 3-phosphate dehydrogenase encoded by GPD1 and GPD2 have distinct roles in osmoadaptation and redox regulation. Embo J 16, 2179-87.

•: Bakker, B. M., Overkamp, K. M., van Maris, A. J., Kotter, P., Luttik, M. A., van Dijken, J. P. y Pronk, J. T. (2001). Stoichiometry and compartmentation of NADH metabolism in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Rev 25, 15-37.

•: Blomberg A, Adler L. 1989. Roles of glycerol and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD+) in acquired osmotolerance of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 171 (2), 1087-92.

•: Bothast, R. J. y Schlicher, M. A. (2005). Biotechnological processes for conversion of corn into ethanol. Appl Microbial Biotechnol 67, 19-25.

•: Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72, 248-54.

•: Bro, C., Regenberg, B., Forster, J. y Nielsen, J. (2005). In silico aided metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for improved bioethanol production. Metab Eng.

•: Ciriacy M. 1975. Genetics of alcohol dehydrogenase in Saccharomyces cerevisiae. II. Two loci controlling synthesis of the glucose-repressible ADH II. Mol Gen Genet 138 (2), 157-64.

•: Ferreira, C., van Voorst, F., Martins, A., Neves, L., Oliveira, R., Kielland-Brandt, M. C., Lucas, C. y Brandt, A. (2005). A member of the sugar transporter family, Stl1p is the glycerol/H+ symporter in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell 16, 2068-76.

•: Gancedo C, Gancedo JM, Sols A. 1968. Glycerol metabolism in yeasts. Pathways of utilization and production. Eur J Biochem 5 (2), 165-72.

•: Granath K, Modig T, Forsmark A, Adler L, Lidén G. (2005) The YIG1 (YPL201c) encoded protein is involved in regulating anaerobic glycerol metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 22 (16), 1257-68.

•: Gueldener, U., Heinisch, J., Koehler, G. J., Voss, D. y Hegemann, J. H. (2002). A second set of loxP marker cassettes for Cre-mediated multiple gene knockouts in budding yeast. Nucleic Acids Res 30, e23.

•: Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J. y Hegemann, J. H. (1996). A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res 24, 2519-24.

•: Hohmann, S. (2002). Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts. Microbiol Mol Biol Rev 66, 300-72.

•: Izawa, S., Sato, M., Yokoigawa, K. e Inoue, Y. (2004). Intracellular glycerol influences resistance to freeze stress in Saccharomyces cerevisiae: analysis of a quadruple mutant in glycerol dehydrogenase genes and glycerol-enriched cells. Appl Microbiol Biotechnol 66, 108-14.

•: Jeffries, T. W. (2006). Engineering yeasts for xylose metabolism. Curr Opin Biotechnol 17, 320-6.

•: Karhumaa, K., Wiedemann, B., Hahn-Hagerdal, B., Boles, E. y Gorwa-Grauslund, M. F. (2006). Co-utilization of Larabinose and D-xylose by laboratory and industrial Saccharomyces cerevisiae strains. Microb Cell Fact 5, 18.

•: Kohlwein, S. D., Daum, G., Schneiter, R. y Paltauf, F. (1996). Phospholipids: synthesis, sorting, subcellular traffic the yeast approach. Trends Cell Biol 6, 260-6.

•: Lin, Y. y Tanaka, S. (2006). Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. Appl Microbiol Biotechnol 69, 627-42.

•: Lynd, L. R., van Zyl, W. H., McBride, J. E. y Laser, M. (2005). Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass: an update. Curr Opin Biotechnol 16, 577-83.

•: Molin, M., Norbeck, J. y Blomberg, A. (2003). Dihydroxyacetone kinases in Saccharomyces cerevisiae are involved in detoxification of dihydroxyacetone. J Biol Chem 278, 1415-23.

•: Mullner, H. y Daum, G. (2004). Dynamics of neutral lipid storage in yeast. Acta Biochim Pol 51, 323-47.

•: Nevoigt, E., Fischer, C., Mucha, O., Matthaus, F., Stahl, U. y Stephanopoulos, G. (2007). Engineering promoter regulation. Biotechnol Bioeng 96, 550-8.

•: Nevoigt, E., Kohnke, J., Fischer, C. R., Alper, H., Stahl, U. y Stephanopoulos, G. (2006). Engineering of Promoter Replacement Cassettes for Fine-Tuning of Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol 72, 5266-73.

•: Nevoigt, E., Pilger, R., Mast-Gerlach, E., Schmidt, U., Freihammer, S., Eschenbrenner, M., Garbe, L. y Stahl, U. (2002). Genetic engineering of brewing yeast to reduce the content of ethanol in beer. FEMS Yeast Res 2, 225-32.

•: Nevoigt, E. y Stahl, U. (1996). Reduced pyruvate decarboxylase and increased glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD+] levels enhance glycerol production in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 12, 1331-7.

•: Nevoigt, E. y Stahl, U. (1997). Osmoregulation and glycerol metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Rev 21, 231-41.

•: Nguyen, H. T., Dieterich, A., Athenstaedt, K., Truong, N. H., Stahl, U. y Nevoigt, E. (2004). Engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of L-glycerol 3-phosphate. Metab Eng 6, 155-63.

•: Nissen, T. L., Anderlund, M., Nielsen, J., Villadsen, J. y Kielland-Brandt, M. C. (2001). Expression of a cytoplasmic transhydrogenase in Saccharomyces cerevisiae results in formation of 2-oxoglutarate due to depletion of the NADPH pool. Yeast 18, 19-32.

•: Nissen, T. L., Hamann, C. W., Kielland-Brandt, M. C., Nielsen, J. y Villadsen, J. (2000a). Anaerobic and aerobic batch cultivations of Saccharomyces cerevisiae mutants impaired in glycerol synthesis. Yeast 16, 463-74.

•: Nissen, T. L., Kielland-Brandt, M. C., Nielsen, J. y Villadsen, J. (2000b). Optimization of ethanol production in Saccharomyces cerevisiae by metabolic engineering of the ammonium assimilation. Metab Eng 2, 69-77.

•: Norbeck, J. y Blomberg, A. (1997). Metabolic and regulatory changes associated with growth of Saccharomyces cerevisiae in 1,4 M NaCl. Evidence for osmotic induction of glycerol dissimilation via the dihydroxyacetone pathway. J Biol Chem 272, 5544-54.

•: Oliveira, R, Lages, F., Silva-Graca, M. y Lucas, C. (2003). Fps1p channel is the mediator of the major part of glycerol passive diffusion in Saccharomyces cerevisiae: artefacts and re-definitions. Biochim Biophys Acta 1613, 57

71.

•: Pahlman, A. K., Granath, K., Ansell, R, Hohmann, S. y Adler, L. (2001). The yeast glycerol 3-phosphatases Gpp1p and Gpp2p are required for glycerol biosynthesis and differentially involved in the cellular responses to osmotic, anaerobic, and oxidative stress. J Biol Chem 276, 3555-63.

•: Rigoulet, M., Aguilaniu, H., Averet, N., Bunoust, O., Camougrand, N., Grandier-Vazeille, X., Larsson, C., Pahlman,

I.: L., Manon, S. y Gustafsson, L. (2004). Organization and regulation of the cytosolic NADH metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biochem 256-257, 73-81.

•: Siderius, M., Van Wuytswinkel, O., Reijenga, K. A., Kelders, M. y Mager, W. H. (2000). The control of intracellular glycerol in Saccharomyces cerevisiae influences osmotic stress response and resistance to increased temperature. Mol Microbiol 36, 1381-90.

•: Valadi, A., Granath, K., Gustafsson, L. y Adler, L. (2004). Distinct intracellular localization of Gpd1p and Gpd2p, the two yeast isoforms of NAD+-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase, explains their different contributions to redox-driven glycerol production. J Biol Chem 279, 39677-85.

•: Wojda, L, Alonso-Monge, R., Bebelman, J. P., Mager, W. H. y Siderius, M. (2003). Response to high osmotic conditions and elevated temperature in Saccharomyces cerevisiae is controlled by intracellular glycerol and involves coordinate activity of MAP kinase pathways. Microbiology 149, 1193-204.

•: Lin H. et al. (2002). Phospholipase C interacts with Sgd1p and is required for expression of GDP1 and osmoresistance in Saccharomyces cerevisiae. MGG Molecular Genetics and Genomics, vol. 267, n.º 3, 313-320

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Technische Universität Berlin

<120> Método de modificación de una célula de levadura para la producción de etanol

<130> U60040PCT

<150> EP 07021129.7

<151>

<160> 29

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 2176

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

<210> 2

<211> 2323

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2

<210> 3

<211> 1753

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 3

<210> 4

<211> 1753

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 4

<210> 5

<211> 401

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> mutante 2 del promotor TEF1

10 <400> 5

<210> 6

<211> 401 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> mutante 7 del promotor TEF1 10

<400> 6

<210> 7

<211> 20 15 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> P9 20

<400> 7

<210> 8

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> P10

<400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> P11

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> P12

<400> 10

<210> 11

<211> 401

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 11

<210> 12

<211> 62 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> P29 10

<400> 12

<210> 13

<211> 60 15 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> P30 20

<400> 13

<210> 14

<211> 22 25 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> P33

<400> 14

<210> 15

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> P34

<400> 15

<210> 16

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de deleción de GPP

<400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de deleción de GPP

<400> 17

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de deleción de GPP

<400> 18

10 <210> 19

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

15 <220>

<223> Cebador de deleción de GPP

<400> 19

20 <210> 20

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

25 <220>

<223> Cebador de deleción de GPP

<400> 20

<210> 21 30 <211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 35 <223> Cebador de deleción de GPP

<400> 21

<210> 22

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de deleción de GPP

<400> 22

<210> 23

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de deleción de GPP

<400> 23

<210> 24

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de deleción de GPP

<400> 24

<210> 25

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de deleción de GPP

<400> 25

<210> 26 10 <211> 391

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 26

<210> 27

<211> 440

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 27

<210> 28

<211> 250

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 28

<210> 29

<211> 250

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 29

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de modificación de una célula de levadura para la producción de etanol, caracterizado por reducir la actividad de la proteína glicerol 3-fosfato deshidrogenasa-1, Gpd1, y reducir la actividad de la proteína glicerol 3-fosfato deshidrogenasa-2, Gpd2,

5 por reducir, pero no eliminar, la actividad de la proteína Gpd1 y eliminar la actividad de la proteína Gpd2; o por eliminar la actividad de la proteína Gpd1 y reducir, pero no eliminar, la actividad de la proteína Gpd2; o por reducir, pero no eliminar, la actividad tanto de la proteína Gpd1 como de la proteína Gpd2, en el que la reducción de la actividad de la proteína Gpd1 y/o la proteína Gpd2 se consigue reduciendo la

expresión del gen GPD1 y/o el gen GPD2, 10 caracterizado porque la expresión del gen GPD1 y/o el gen GPD2 se reduce en al menos un 50% en comparación con la expresión en una célula de levadura silvestre.
2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el gen GPD1 y/o el gen GPD2 se expresa mediante un promotor que está ligado de manera funcional al gen GPD1 o al gen GPD2, en el que el promotor provoca menos de o igual al 20% de transcripción del promotor TEF1 ligado de manera funcional al gen

15 GPD1 o al gen GPD2.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el promotor es un promotor según SEQ ID NO 5

o SEQ ID NO 6.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por reducir adicionalmente la actividad de la proteína glicerol 3-fosfatasa-1, Gpp1, y/o la proteína glicerol 3-fosfatasa-2, Gpp2, 20 y por reducir la actividad de la proteína Gpp1 y eliminar la actividad de la Gpp2, o por eliminar la actividad de la proteína Gpp1 y reducir la actividad de la Gpp2, o

por reducir la actividad de la proteína Gpp1 y reducir la actividad de la Gpp2, en el que la reducción de la actividad de la proteína Gpp1 y/o la proteína Gpp2 se consigue reduciendo la expresión de la proteína Gpp1 y/o la Gpp2,

25 caracterizado porque la expresión del gen GPP1 y/o el gen GPP2 se reduce en al menos un 50% en comparación con la expresión en una célula de levadura silvestre.
5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque el gen GPP1 y/o el gen GPP2 se expresa mediante un promotor que está ligado de manera funcional al gen GPP1 o al gen GPP2, en el que el promotor provoca menos de o igual al 20% de transcripción del promotor TEF1 ligado de manera funcional al gen

30 GPP1 o al gen GPP2.
6. Método según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque el promotor es un promotor según SEQ ID NO 5

o SEQ ID NO 6.
7. Célula de levadura modificada, en la que la actividad de la proteína Gpd1 y Gpd2 se reduce en comparación con una célula de levadura silvestre, 35 en la que se reduce, pero no se elimina, la actividad de la proteína Gpd1 y se elimina la actividad de la

proteína Gpd2; o se elimina la actividad de la proteína Gpd1 y se reduce, pero no se elimina, la actividad de la proteína Gpd2; o

se reduce, pero no se elimina, la actividad tanto de la proteína Gpd1 como de la proteína Gpd2, 40 en la que la actividad reducida se consigue mediante una expresión reducida del gen GPD1 y/o gen GPD2, caracterizada porque la expresión del gen GPD1 y/o el gen GPD2 se reduce en al menos un 50% en comparación con la expresión del gen silvestre.
8. Célula de levadura modificada según la reivindicación 7, caracterizada porque el gen GPD1 y/o el GPD2 se

expresa mediante un promotor que está ligado de manera funcional al gen GPD1 o al gen GPD2, en la que 45 el promotor es débil en comparación con el promotor en la célula de levadura silvestre.
9.

Célula de levadura modificada según la reivindicación 7 u 8, caracterizada porque el promotor es un promotor según SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 6.
10.

Uso de una célula de levadura modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, para producir etanol.

5 11. Método para la producción de etanol, que comprende las siguientes etapas: -proporcionar una célula de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, -proporcionar biomasa, -hacer crecer la célula de levadura en presencia de la biomasa en condiciones que permiten la producción

de etanol. 10