CN101589146A - 在毕赤酵母属中由甲醇诱导型启动子进行不依赖甲醇的诱导的方法 - Google Patents

在毕赤酵母属中由甲醇诱导型启动子进行不依赖甲醇的诱导的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在甲基营养型酵母宿主细胞中产生多肽的方法，其中多肽的表达受甲醇诱导型启动子的控制，所述方法包含：i)由非天然启动子表达正调控子，所述正调控子激活由甲醇诱导型启动子的转录，和ii)不加入甲醇。

Description

在毕赤酵母属中由甲醇诱导型启动子进行不依赖甲醇的诱导的方法
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发明领域
本发明涉及在甲基营养型(methylotrophic)酵母宿主细胞中产生多肽的方法，其中多肽的表达受甲醇诱导型启动子的控制。
发明背景
在工业中，真核生物广泛用作产生多肽的宿主细胞，所述多肽用于，例如，医药和工业应用。操作基因转录和表达的能力给出了提供更高的生产产率(production yield)的基础。
通常，通过在染色体中扩增表达盒而实现真核生物中基因的最大表达，所述表达盒包含与编码目的多肽的基因可操作连接的单一启动子和扩增物选择性标记(amplifier selective marker)。
受控表达常常是期望的。在甲基营养型酵母中，长久以来就已知某些启动子依赖于生长培养基中诱导转录的甲醇的存在。这种通过甲醇的诱导要求其他因子的存在，然而，这些因子确切的作用机制尚未阐明。已知来自酵母的正因子(positive factor)的实例包括Mxr1p，其被描述为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中甲醇利用所需的关键正调控子(Lin-Cereghino等，2006，MolCell Biol 26(3)：883-897)。
已经在几种酵母细胞中描述了这些甲醇依赖型启动子的实例，所述酵母细胞属于已知为甲基营养型酵母的酵母组。控制与这些生物中甲醇代谢有关的酶的表达的启动子是特别强的，并且这些启动子通常用于控制酵母中蛋白质的异源表达。然而，培养这些宿主细胞所用的特定碳源对甲醇代谢启动子的调控有很大影响。甲醇和甘油被认为是甲基营养型酵母表达系统的适当底物，而认为葡萄糖是不适当的(EP 299108)。因此期望的是，是否能够使得由已知甲醇代谢启动子的表达较少依赖于底物。
发明概述
本发明提供在甲基营养型酵母宿主细胞中产生多肽的方法，其中多肽的表达受甲醇诱导型启动子控制，所述方法包括：i)从非天然启动子表达正调控子，所述正调控子激活由甲醇诱导型启动子的转录，和ii)不添加甲醇。本发明进一步公开了增加异源多肽在甲醇诱导型启动子的控制下的表达水平的方法，其包括提供prm1基因的组成型表达。
发明详述
本发明涉及由甲醇诱导型启动子进行多肽的受控表达。这些启动子的实例已经在属于已知为甲基营养型酵母的酵母组的几种酵母细胞中描述。在本发明的上下文中，将甲基营养型酵母定义为能够利用甲醇作为唯一碳源用于它们的生长的一组酵母。在这些生物中与甲醇代谢有关的酶的启动子是特别强的，并且这些启动子(甲醇代谢启动子)通常用于控制酵母中蛋白质的异源表达。
甲基营养型酵母宿主细胞的已知成员属于选自下组的属：毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)。根据本发明，一个实施方案中的毕赤酵母属宿主细胞可以选自下组：巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、嗜热甲醇毕赤酵母(Pichia thermomethanolica)。汉逊酵母属或假丝酵母属宿主细胞可以选自下组：多态汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)。
先前已经分离并在文献中描述了几种启动子，通过向生长培养基中添加甲醇，可以控制异源多肽由所述启动子的表达。这些启动子包括但不限于例如AOX1启动子(醇氧化酶启动子)、DHAS启动子(或DAS启动子)(二羟基丙酮合酶启动子)、FDH启动子(或FMDH启动子)(甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase)启动子)、MOX启动子(甲醇氧化酶启动子)、AOX2启动子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-启动子。具体地，本发明中有用的启动子是与甲醇代谢有关的酶的启动子。这些启动子可以由技术人员使用常规技术从酵母分离。所有上述启动子都已经从甲基营养型酵母组的特定成员分离，并通过同源性搜索能够容易地鉴定来自其他成员的相应启动子。这进一步通过本文所包括的实施例说明。更具体地，启动子选自下组：甲酸脱氢酶(FMD或FMDH)启动子、甲醇氧化酶(MOX)启动子、二羟基丙酮合酶(DAS或DHAS)启动子或醇氧化酶(AOX1)启动子。
通常地，所有上述启动子都要求存在甲醇用于它们的诱导。这种甲醇诱导要求存在其他因子(如转录因子)，然而，这些因子的确切作用机制尚未阐明。在酵母中，例如Mxr1p，已经被描述为巴斯德毕赤酵母中甲醇利用所需的关键正调控子(Lin-Cereghino等，2006，Mol Cell Biol 26(3)：883-897)。
本发明的发明人已经发现，由来自巴斯德毕赤酵母的Prm1基因编码的单一正因子的受控表达，如本文所述，足以在生长培养基中无需甲醇而诱导由几种甲醇诱导型启动子的转录。如本文所公开的，这一原理已经使用Prm1蛋白质作为正活化子的模式蛋白(model protein)，和使用AOX1或DAS启动子用于报告子多肽(reporter polypeptide)的受控表达而证明。获得的结果显示，仅通过控制prm1基因的表达，而在生长培养基中不存在甲醇的情况下诱导AOX1或DAS启动子是可能的。
在本发明的一个实施方案中，从合适的启动子组成型表达正调控子。优选地，启动子不是天然启动子，意思是控制正调控子表达的启动子与通常控制表达的启动子不同。在本发明的上下文中，将这些优选的启动子称为“非天然的”。启动子可以对宿主生物仍然是天然的，但是在所研究基因，例如prm1基因的背景中是外源的。在一个具体实施方案中，启动子选自下组：GAP启动子(3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子)、TEF1启动子(翻译延长因子EF-1α启动子)和PGK启动子(磷酸甘油酸激酶启动子)。除了由如上所述的非天然启动子进行受控表达之外，根据本发明的宿主细胞通常从存在于染色体上的内源基因表达正调控子。在另一个实施方案中，可将编码正调控子的基因的内源拷贝失活，例如通过缺失失活，或者控制基因的内源拷贝的正常启动子可以被选择的非天然启动子所代替。
在另一个的实施方案中，正调控子的表达受控于并非甲醇诱导型的诱导型启动子。
根据本发明的正调控子在一个实施方案中是如本文所述的Prm1。在一个具体的实施方案中，Prm1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其等位变体；或其具有调控子活性的片段。
在另一个具体实施方案中，Prm1由如下组成：SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其等位变体，或其片段；或取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并具有调控子活性的氨基酸序列。
术语“多肽片段”在本文中定义为从SEQ ID NO：1的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有调控子活性。
术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
两个氨基酸序列例如两个功能同源物之间的相关性用参数“同一性”描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的比对通过使用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)2.8.0版本的Needle程序来测定，Needle程序执行Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中所述的全局比对算法。使用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口开放罚分(gap openingpenalty)为10，和缺口延伸罚分(gap extension penalty)是0.5。
本发明氨基酸序列(“发明序列”，例如SEQ ID NO：1的氨基酸1至989)和不同的氨基酸序列(“外源序列”)之间的同一性程度如下所述计算：两个序列比对中精确匹配的数目，除以“发明序列”的长度或“外源序列”的长度，取两者中最短的。结果用百分比同一性表示。
当“发明序列”和“外源序列”在重叠的相同位置有相同的氨基酸残基时，发生精确匹配(在下面的比对实例中用“|”表示)。序列长度为序列中氨基酸残基的数目。
在下述纯假设的比对实例中，重叠为序列1的氨基酸序列“HTWGER-NL”；或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在实例中，缺口用“-”表示。
假设的比对实例：
序列1：ACMSHTWGER-NL
           | |||  ||
序列2：HGWGEDANLAMNPS
在根据本发明的一个实施方案中，Prm1的功能同源物与SEQ ID NO：1至少70％相同，特别地与SEQ ID NO：1至少80％相同，特别地与SEQ ID NO：1至少85％相同，特别地至少90％，更特别地至少95％，最特别地与SEQ IDNO：1至少98％相同。
在另一个实施方案中，Prm1的功能同源物由在至少低严紧条件下与下述序列杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO：2的核苷酸1至2970，或(ii)(i)的互补链。
在另一个实施方案中，Prm1的功能同源物由在至少中严紧条件下与下述序列杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO：2的核苷酸1至2970，或(ii)(i)的互补链。
在另一个实施方案中，Prm1的功能同源物由在至少高严紧条件下与下述序列杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO：2的核苷酸1至2970，或(ii)(i)的互补链。
在另一个实施方案中，Prm1的功能同源物由在非常高严紧条件下与下述序列杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO：2的核苷酸1至2970，或(ii)(i)的互补链。
根据本发明的正调控子还可以是分离自其他酵母细胞的Prm1的功能同源物。这些功能同源物可以如下所述分离：由SEQ ID NO：2所示序列开始，例如通过使用SEQ ID NO：2或其片段，设计核酸探针以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有调控子活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针长度上为至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针长度上可为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。可以使用甚至更长的探针，例如，长度为至少600个核苷酸，至少优选至少700个核苷酸，更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记用于探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。
因而，可从由这些其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码具有调控子活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其它分离技术分离来自这些其它生物体的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO：2或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。
就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列、它的互补链或其亚序列。可使用X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严紧条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严紧性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严紧性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严紧性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选至少在45℃(非常低严紧性)，更优选至少在50℃(低严紧性)，更优选至少在55℃(中严紧性)，更优选至少在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选至少在65℃(高严紧性)，并且最优选至少在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
在具体实施方案中，使用0.2X SSC、0.2％SDS优选至少在45℃(非常低严紧性)，更优选至少在50℃(低严紧性)，更优选至少在55℃(中严紧性)，更优选至少在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选至少在65℃(高严紧性)，并且最优选至少在70℃(非常高严紧性)进行洗涤。在另一个具体实施方案中，使用0.1X SSC、0.2％SDS优选至少在45℃(非常低严紧性)，更优选至少在50℃(低严紧性)，更优选至少在55℃(中严紧性)，更优选至少在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选至少在65℃(高严紧性)，并且最优选至少在70℃(非常高严紧性)进行洗涤。
如上所述，根据本发明的正调控子还可以是分离自其他酵母细胞的Prm1的功能同源物。根据本发明的一个实施方案，一个这样的候选者可以是由来自多态汉逊酵母(同物异名(syn.)：安格斯毕赤酵母)的mut3基因编码的Mut3。在本文提供的实施例中，已在巴斯德毕赤酵母中过量产生Prm1。然而，通过在毕赤酵母属中过量产生Mut3或在汉逊酵母中过量产生Prm1或在汉逊酵母中过量产生Mut3，可能可以获得同样的效果。尚未对此进行测试。
因此在本发明另一个实施方案中，正调控子是Mut3。
也可以通过仅具有编码宿主细胞中存在的调控子的基因的多个拷贝而提供宿主细胞中存在的正调控子水平的增加。
虽然正调控子Prm1的确切作用机制尚未阐明，但是最有可能的是调控子与甲醇诱导型启动子的启动子区域结合。因此在本发明的一个具体实施方案中，控制异源多肽表达的甲醇诱导型启动子具有正调控子的其他结合位点，从而增加调控子的正效果(positive effect)。
通过增加细胞中正调控子的水平提供的正效果可依赖于其他因子的存在或者可为独立的。一个这样的其他因子可以是Mxr1蛋白质(Lin-Cereghino等，2006，Mol Cell Biol 26(3)：883-897)。因此在根据本发明的另一个实施方案中，mxr1基因的表达还受非天然启动子的控制，特别是选自下组的启动子：GAP启动子、TEF1启动子和PGK启动子。
在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公布的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明产生的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。
在一个具体实施方案中，由宿主细胞产生的多肽对于宿主细胞是异源的。在另一个实施方案中，多肽对于宿主细胞是同源的。
通过下述实施例阐述本发明中观察到的效果，所述实施例显示可以在不向生长培养基中加入甲醇的情况下观察到由选择的启动子的表达。加入甲醇可能进一步增强观察到的在宿主细胞中增加Prm1水平的效果。因此本发明的另一个实施方案是如上述所有实施方案中所述的用于增加异源多肽在甲醇诱导型启动子的控制下的表达水平的方法，其中培养基中存在甲醇，并且与野生型细胞相比，Prm1的表达水平增加。优选地，Prm1基因的表达是组成型的。
实施例
材料与方法
菌株与质粒
将巴斯德毕赤酵母GS115(基因型：his4，InvitrogenTM)用作蛋白质表达的宿主菌株。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α(InvitrogenTM)、TOP 10(InvitrogenTM)或XL10(StratageneTM)用作表达载体构建中的克隆宿主。质粒pPIC9K和pGAPZα(InvitrogenTM)用于构建表达质粒，而pCR2.1-TOPO(InvitrogenTM)、pT7Blue(NovagenTM)用于PCR片段的亚克隆。
巴斯德毕赤酵母的转化：
根据生产商的规程(Invitrogen，目录号K1710-01)，通过电穿孔转化巴斯德毕赤酵母菌株。如所述制备感受态细胞，并以40μl等分试样储存于-70℃。将线性化的质粒DNA(500ng)与40μl感受态细胞混合，并在冰上保存5分钟。将细胞转移至冰冷的0.2cm电穿孔杯中。使用BioRadTM GenePulser II进行转化。使用的参数为1500V、25μF和200Ω。加脉冲后立即将细胞悬浮于1ml冰冷的1M山梨醇中。将混合物涂布于相关的筛选平板上。
培养基与测定法
RD培养基(1M山梨醇，2％右旋糖，1.34％酵母氮源(yeast nitrogen base)，4×10-5％生物素，0.005％L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸，2％纯化琼脂(agar noble))用于再生用his4选择的来自巴斯德毕赤酵母GS115的转化子。在用博莱霉素(zeocin)抗性选择的情况中，将补加1M山梨醇和100微克/ml博莱霉素的YPD琼脂(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％细菌用琼脂)用于再生。YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖)、YPGly(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％甘油)用于用巴斯德毕赤酵母表达蛋白质。必要时，在1天和2天培养后，向培养液(culture broth)加入终浓度为1％或2％(体积百分比)的甲醇。用LB培养基(1.0％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％NaCl)及相关抗生素培育大肠杆菌菌株。
肌醇六磷酸酶测定方法：
将溶于乙酸缓冲液pH 5.5的7.5mM肌醇六磷酸钠与包含0.01％Tween20的相同乙酸缓冲液中1/2体积的酶样品溶液混合。在37℃培育30分钟后，加入包含溶于10.8％硝酸中的20mM七钼酸铵和0.06％钒酸铵的终止试剂，从而与释放的无机磷酸盐产生黄色复合物。用光度计测量405nm处的吸光度作为释放的磷酸盐的量。一个肌醇六磷酸酶单位定义为每分钟释放1μmol无机磷酸盐的酶量。
肌醇六磷酸酶平板测定：
将来自培育转化子2-5天之后的培养液的20μL上清加入下述平板中打出的4mm孔中：包含0.1M乙酸钠(pH 4.5)和0.1％肌醇六磷酸的1％琼脂糖平板。37℃过夜培育平板，并将由1M CaCl2和0.2M乙酸钠(pH 4.5)组成的缓冲液倾倒于平板上。将平板在室温放置1h，并根据澄清区(clear zone)鉴定肌醇六磷酸酶活性。
PCR条件
通常在下述或相当的条件下进行PCR反应：反应化合物包含2mMdNTP、10pmol正向和反向引物，2.8单位Expand高保真混合物(Roche)，1×Expand高保真缓冲液(Roche)，和100μg模板DNA。反应条件为，例如：
  温度(℃)   时间   循环
  95   5分钟   1
  954868   15秒钟30秒钟3.5分钟 35
  68   10分钟   1
实施例1：在DAS1启动子控制下表达肌醇六磷酸酶基因的菌株中Prm1的组成型表达
TEF1启动子的克隆与pNo-TP10的构建
通过下述步骤从巴斯德毕赤酵母克隆TEF1(翻译延长因子1)启动子。通过来自酵母酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)、白色假丝酵母(Candidaalbicans)和葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)的TEF 1蛋白质的同源区域的比对，设计下述简并引物。
TEF1(f)：5’-ttyaartaygcntgggt-3’(蛋白质：FKYAWV)SEQ ID N0：6和7
TEF5(r)：5’-arytgytcrtgrtgcatytc-3’(蛋白质：EMHHEQL)SEQ ID NO：8和9
使用50微升反应液进行PCR，所述反应液包括4mM dNTP、10μM每条引物，1单位Taq聚合酶(Roche)，1×Taq缓冲液(Roche)，和100ng GS115DNA的基因组DNA。PCR条件如下所示。
  温度   时间   循环
  94℃55℃72℃   1分钟1分钟3分钟 30
将扩增的0.7kbp片段纯化并亚克隆进TA克隆载体pTBlue7。得到的质粒用于序列测定。获得的DNA序列和假设的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中所示。由于获得的序列与已知的TEF1蛋白质具有相似性，所以使用DNA步移Speed Up预混试剂盒(Seegene，K1501)与下述特定引物一起克隆包含启动子序列的上游区域(SEQ ID NO：5)。
TEF-TSP 1：5’-tgacggtaacgtggtacttt-3’SEQ ID NO：10
TEF-TSP2：5’-ggagtctcgaacttccacaa-3’SEQ ID NO：11
TEF-TSP3：5’-agcgatgtcgatggtgatac-3’SEQ ID NO：12
使用50微升反应混合物进行PCR，所述混合物包括4mM dNTP、10μMTEF-TSP1引物，2.5μM试剂盒中的DW-ACP2引物，1单位Taq聚合酶(Roche)，1×Taq缓冲液(Roche)，和100ng基因组DNA。PCR程序如下所示。
  温度   时间   循环
  94℃42℃72℃   5分钟1分钟2分钟 1
  94℃55℃72℃   30秒钟30秒钟100秒钟 20
  72℃   7分钟   1
使用20微升反应混合物进行第二次PCR，所述混合物包括2mM dNTP、10μM TEF-TSP2引物，10μM来自试剂盒的DW-ACPN引物，0.4单位Taq聚合酶(Roche)，1×Taq缓冲液(Roche)，和5μl来自第一轮的纯化PCR产物，以下述程序进行：
  温度   时间   循环
  94℃   3分钟   1
  94℃58℃72℃   30秒钟30秒钟100秒钟 30
  72℃   7分钟   1
使用50微升反应液进行第三次PCR，所述反应液包括2mM dNTP、10μMTEF-TSP3引物，10μM来自试剂盒的通用引物，1单位Taq聚合酶(Roche)，1×Taq缓冲液(Roche)，和1μl稀释10倍的来自第二轮的PCR产物，以下述程序进行：
  温度   时间   循环
  94℃   3分钟   1
  94℃65℃72℃   30秒钟30秒钟100秒钟 30
  72℃   7分钟   1
在三次巢式PCR后，扩增出1.2kbp片段。将这个片段亚克隆进pT7Blue并测定序列。获得的序列示于SEQ ID NO：5中。使用TEF 1ORF上游的1.2kbp区域作为TEF1启动子用于进一步实验。
质粒pNo-TP10是细菌肌醇六磷酸酶在TEF1启动子下的表达质粒，并携带博莱霉素抗性标记基因。如下所述构建pNo-TP10。使用下述引物从巴斯德毕赤酵母A94的基因组DNA克隆TEF 1启动子和密码子优化的肌醇六磷酸酶基因(参见实施例2)。引物1和2用于扩增TEF1启动子，而引物3和4用于扩增肌醇六磷酸酶基因。
引物1：5’tacagggcgcgtggggatatcggatccagctcatctaggga-3’(BamHI加下划线)(SEQ ID NO：13)
引物2：5’-tgaagatggatgggaatctcatatggttggcgaataactaaaatgtatgt-3’(SEQ ID NO：14)
引物3：5’-acatacattttagttattcgccaaccatatgagattcccatccatcttca-3’(SEQ ID NO：15)引物4：5’-taattcgcggccgccctagggaattcttactcggtgacagcgcactcggg-3’(EcoRI加下划线)(SEQ ID NO：16)
使用50微升反应液进行PCR，所述混合物包括2mM dNTP、10μM每条引物，2.8单位Expand高保真(Roche)，1×Expand高保真缓冲液(Roche)，和100ng基因组DNA。PCR程序如下所示。
  温度   时间   循环
  94℃   2分钟   1
  94℃50℃68℃   10秒钟30秒钟3分钟 11
  94℃50℃68℃   10秒钟30秒钟3分钟+20秒钟/循环 20
  68℃   7分钟   1
使用凝胶提取纯化扩增的TEF1启动子的1.2kbp片段和包含肌醇六磷酸酶基因(包括分泌信号)的1.5kbp片段，用引物1和引物4对它们进行第二轮PCR，使用第一次PCR中产生的重叠将这些片段融合。使用50微升反应液进行PCR，所述反应液包括2mM dNTP、10μM每条引物，2.8单位Expand高保真(Roche)，1×Expand高保真缓冲液(Roche)，和1μl纯化的TEF1启动子与1μl纯化的肌醇六磷酸酶基因。PCR程序如下所示。
  温度   时间   循环
  94℃   2分钟   1
  94℃58℃68℃   10秒钟30秒钟3分钟 11
  94℃58℃68℃   10秒钟30秒钟3分钟+20秒钟/循环 20
  68℃   7分钟   1
将扩增的2.7kbp片段亚克隆进pT7Blue，得到的质粒命名为pT12-8。将来自pT12-8的包括TEF1启动子和肌醇六磷酸酶基因的BamHI-EcoRI片段与用BglII和EcoRI切割的pGAPZα连接，得到pNo-TP10。
DAS1启动子的克隆与pNo-DP3的构建
已知DAS1启动子在博伊丁假丝酵母中受到甲醇的强诱导(Yurimoto，H.Komeda，T.Lim，C.R.Nakagawa，T.Kondo，K.Kato，N.Sakai，Y.；Biochim.Biophys.Acta 1493(1-2)：56-63(2000))。通过blast搜索在巴斯德毕赤酵母的基因组序列中发现了编码二羟基丙酮合酶的DAS1基因作为博伊丁假丝酵母DAS1基因(EMBL：AF086822)的同源物。使用如下所示引物，通过PCR从巴斯德毕赤酵母的基因组DNA分离出DAS1基因的约1kb的5’-未翻译区域作为启动子区域：
引物43：5’-ttttggtcatgcatgacgtcatagggagaaaaaccgagac-3’(NsiI位点加下划线)(SEQ ID NO：17)
引物44：5’-ctcatatgttttgatgtttgatagtttga-3’(NdeI位点加下划线)(SEQ ID NO：18)
将扩增的1kb片段亚克隆进pCR2.1-TOPO的NsiI/NdeI位点，用于这个片段的序列测定(SEQ ID NO：19)。从pCR2.1-TOPO切除1kb的DAS1启动子区域作为NsiI/NdeI片段，并与用NsiI/NdeI消化的pNo-TP10连接，产生pNo-DP2。为了将标记基因从博莱霉素抗性基因改为His4基因，将包含DAS1启动子的1.4kb AatII片段和来自pNo-DP2的细菌肌醇六磷酸酶基因的部分，与来自pPICNoT-G01651的包含其余肌醇六磷酸酶基因和His4基因的9.0kbAatII片段(参见实施例2)，以及细菌载体连接。将产生的质粒命名为pNo-DP3。
Prm1的克隆和pGPrm的构建
使用如下所示引物，通过PCR从巴斯德毕赤酵母的基因组DNA分离出我们命名为Prm1(甲醇的正调控子)的基因，其编码甲醇诱导型启动子的新型正调控子：
引物32：5’-actatttcgaaatgcctcctaaacatcggctg-3’，(BstBI位点加下划线)(SEQ IDNO：20)
引物33：5’gtcgacttaactgcaaaatttattg-3’(SalI加下划线)(SEQ ID NO：21)
使用50微升反应液进行PCR，所述反应液包括1×LA PCR缓冲液II(TAKARA)，2.5U的LA taq(TAKARA)，2.5mM MgCl2，2.5mM dNTP，1μM每条引物，100ng基因组DNA，使用如下程序：
  温度   时间   循环
  94℃55℃72℃   30秒钟30秒钟4分钟 30
将获得的1kb片段亚克隆进pCR2.1-TOPO。在验证序列后，使用BstBI和SalI限制性位点将包含Prm1基因的1kbp片段(SEQ ID NO：2)克隆进pGAPZα(Invitrogen)，得到pGPrm。质粒pGPrm携带GAP启动子控制下的Prm1基因和作为选择标记的博莱霉素抗性基因。
在DAS1启动子下表达肌醇六磷酸酶的菌株DAS40中Prm1的组成型表达
将质粒pNo-DP3转化入可以his4选择的巴斯德毕赤酵母GS115中。重新分离产生的转化子，并使用添加甲醇的YPD培养基测试肌醇六磷酸酶表达。选择出一个转化子DAS40作为在甲醇存在时显示肌醇六磷酸酶活性的菌株。
将质粒pGPrm转化进巴斯德毕赤酵母DAS40，并在博莱霉素平板上分离转化子。在YPD培养基中在30℃将产生的转化子搅拌培养2天，并通过肌醇六磷酸酶检测测量培养液上清液中的肌醇六磷酸酶活性。结果示于下表。
 菌株   相对肌醇六磷酸酶活性
 转化子A   44.2
 转化子B   13.3
 转化子C   7.6
 DAS40   1
实施例2：在AOX1启动子下表达肌醇六磷酸酶基因的菌株中Prm1的组成型表达
培养基：
MD(1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％右旋糖)
BMSY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％山梨醇)
载体：
pPIC-NoT，在AOX1启动子下的巴斯德毕赤酵母表达载体，其通过从pPIC9K(InvitrogenTM)去除α-分泌信号而获得。
为了产生pPIC-NoT载体，用BamHI和EcoRI消化质粒pPIC9K，从琼脂糖凝胶分离消化的主要片段。通过将下述两条寡核苷酸退火，产生包含BamHI和EcoRI位点的合成DNA片段：
NoT-1P-GATCCTACGTAGCTGAG  (SEQ ID NO：22)和
NoT-2P-AATTCTCAGCTACGTAG  (SEQ ID NO：23)
将上述合成DNA片段连接到消化的pPIC9K质粒中，通过测序验证得到的载体pPIC-NoT。
PCR引物：
  寡核苷酸名称   寡核苷酸序列
  OA-Na   GATCCAAACCATGAGATTCCCATCCATCTTCACTG(SEQ ID NO：24)
  OA-Nb   CAAACCATGAGATTCCCATCCATCTTCACTG(SEQ ID NO：25)
  OAPhy-R   CATTCTGTTCCTCTCTCTTTTCCAAGGAAACACCTTC(SEQ ID NO：26)
  OAPhy-F   ggaaaagagaGAGGAACAGAATGGAATGAAGTTGG(SEQ ID NO：27)
  OPhy-Ca   AATTCTTACTCGGTGACAGCGCACTC(SEQ ID NO：28)
  OPhy-Cb   CTTACTCGGTGACAGCGCACTC(SEQ ID NO：29)
质粒
pPICNoT-G01651
在pPICNoT-G01651中使用密码子优化的布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)肌醇六磷酸酶基因，以增加巴斯德毕赤酵母中cb肌醇六磷酸酶的表达量(expression yield)。基于巴斯德毕赤酵母优选的密码子选择，通过替换稀有密码子、消除重复的AT并减少GC含量的方法修饰野生型布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶基因。还分析了设计的序列以避免潜在的内含子。
基于巴斯德毕赤酵母的密码子偏好设计了与修饰的α-因子分泌信号序列融合的修饰的肌醇六磷酸酶基因(G01651)。巴斯德毕赤酵母密码子选择表来自www.kazusa.jp以及Zhao等，2000(Zhao X，Huo KK，Li YY.Synonymous condonusage in Pichia pastoris.Chinese Journal of Biotechnology，2000，16(3)：308-311)。消除了精氨酸的稀有密码子。除了取代稀有密码子之外，将总G+C含量降至50％以下，修饰富含AT的区域，避免早期终止(premature termination)。此外，如共同未决的丹麦专利申请PA 200601042/NZ10978.000-DK中所述，消除了修饰的编码区中隐含的内含子(cryptic intron)。合成的基因序列示于SEQ ID NO：30中(无信号序列的完整ORF)。
如下所述产生表达质粒pPICNoT-G01651：
通过下述重叠延伸PCR方法，生成与优化的α-因子信号肽(SEQ ID NO：31)进行框内融合的(fused in-frame)编码cb肌醇六磷酸酶成熟形式的PCR片段(SEQ ID NO：30)：从pJ2:G01468质粒(pJ2:G01468通过DNA2.0产生，并包含与α-因子分泌信号融合的菌丝霉素(plectasin)的成熟形式，其基于巴斯德毕赤酵母密码子选择进行了修饰)，用特定引物OA-Na和OAPhy-R扩增包含α-因子信号肽的片段I，而从pJ2:G01651质粒(通过DNA2.0产生，并包含编码布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶成熟形式的合成肌醇六磷酸酶基因)，用特定引物OAPhy-F和OPhy-Ca扩增编码成熟肌醇六磷酸酶的片段II。然后将片段I和II混合，用作第二步PCR扩增的模板，使用特定引物OA-Na/b和OPhy-Ca/b，获得目标PCR片段。通过凝胶提取试剂盒纯化DNA片段，然后亚克隆到pPIC-NoT的BamHI和EcoRI位点。通过测序验证得到的表达构建体。
3ml规模的表达测试：
使用24孔深孔板(Whatman，UK)，以3ml的规模进行选择的转化子的表达测试。每个转化子在BMSY培养基中在28℃以剧烈震荡(200rpm)生长2.5天；然后每天向每个孔加入300μl 0.5％甲醇，进行4天以诱导异源基因表达。在诱导过程中每天取出培养基培养物的样品，保存在-20℃用于肌醇六磷酸酶活性测定。
在AOX1启动子下表达肌醇六磷酸酶的菌株A94中Prm1的组成型表达
将表达质粒pPICNoT-G01651转化到以his4选择的巴斯德毕赤酵母GS115中，重新分离在含1M山梨醇的MD琼脂上产生的转化子，并以3ml规模测试肌醇六磷酸酶的表达。选择一个分离株A94作为在甲醇存在的情况下显示出肌醇六磷酸酶活性的菌株。然后将质粒pGPrm转化入A94，用博莱霉素抗性分离转化子。分离的转化子在YPD培养基中在30℃搅拌培养2天，通过肌醇六磷酸酶测定法测量培养物上清液中的肌醇六磷酸酶活性。结果示于下表。
  菌株   相对肌醇六磷酸酶活性
  转化子1   1.86
  转化子2   2.57
  转化子3   3.0
  A94   1
实施例3：巴斯德毕赤酵母GS115和衍生菌株中Prm1的基因破坏
使用下述引物通过PCR扩增PRM1基因的1571bp基因片段5’：
JP23/PRM1-5′-forw-NY：5’GCGCGAATTCCACAGGGCTTGCTAAGAAATC3’(SEQ ID NO：32)；和
JP26/PRM1-5′-rev-NY：5’GAAGGGAGATTAATACAGGGC 3’(SEQ ID NO：33)
使用下述引物通过PCR扩增PRM1基因的1473bp基因片段3’：
JP17/PRM1-3′-forw-NY：5’GATTGGACCACTGCGCCAGATAC 3’(SEQ IDNO：34)；和
JP19/PRM1-3′-rev-NY：5’GCGCGTCGACCCACCCGAGGATAAGAAGG 3’(SEQ ID NO：35)
使用下述引物通过PCR扩增包含HIS4基因(包括启动子和终止子)的3382bp片段(片段每个末端都包含分别与PRM15’和3’区的20bp重叠，意欲用于SOE-PCR)：
JP13/HIS4-forward-NY：5’CCCTGTATTAATCTCCCTTCATCAGAATTGGTTAATTGGTTG 3’(SEQ ID NO：36)；和
JP15/HIS4-rev-NY：5’TCTGGCGCAGTGGTCCAATCATCGATAAGCTTTAATGCGG 3’(SEQ ID NO：37)
使用SOE-PCR(通过重叠延伸PCR剪接)将上述三条基因片段以下述顺序融合：PRM1-5’+HIS4+PRM1-3’，产生prm1缺失片段，其具有两侧为(flankedby)5’prm1片段和3’prm1片段的选择性HIS4标记。
然后将prm1缺失片段转化进GS115(具有his4-负(his4-minus)突变表型)，其允许在不含组氨酸的基本培养基上选择转化子。通过PCR分析表征缺失prm1基因的菌株PFJo435。进行三次不同的PCR，以验证正确的prm1-缺失：
A)在PRM1未缺失的情况下，PCR将给出704bp的产物-使用下述引物：
JP58/PRM1-orf-forw-test7：5’CTGGAGCAGAGTATACAGCC 3’(SEQ ID NO：38)；和
JP59/PRM1-orf-rev-test8：5’CTCAATAAATGCGGGTCTGTG 3’(SEQ ID NO：39)
B)在PRM1缺失的情况下，缺失特异性PCR将给出1950bp的产物-使用引物：JP31/PRM1-5′-forw-test1：5’CCTGGTTGATCAGCTCCACC 3’(SEQ ID NO：40)；和
JP33/HIS4-rev-test3：5’CCCGTCAAGTCAGCGTAATGC 3’(SEQ ID NO：41)
C)在PRM1缺失的情况下，缺失特异性PCR将给出1550bp的产物-使用引物：JP32/PRM1-3′-rev-test2：5’CTCCCTCTCCAGCTGCTTCG 3’(SEQ ID NO：42)；和
JP34/HIS4-forw-test4：5’CGGTGCCTGACTGCGTTAGC 3’(SEQ ID NO：43)
菌株PFJo435从PCR A未产生PCR产物，但是从B和C中都得到了预计的缺失特异性PCR产物-显示PFJo435中的PRM1已经缺失。
GS 115、PFJo435的Prm1基因缺失突变体不能在MM(1.34％YNB，4×10-5％生物素、2％甲醇)上生长，而野生型菌株GS115H在30℃培养2天后显示良好的生长。在甲醇存在时由AOX或DAS启动子的表达水平，例如，根据在DAS40或A94衍生菌株中在DAS启动子或AOX启动子控制下的肌醇六磷酸酶基因表达来测量，在Prm1缺失衍生菌株中，表达水平降低。在某种程度上，活性降低归因于外源的Prm1基因。对DAS启动子的结果如下所示。
  菌株构建   用甲醇时肌醇六磷酸酶得率(相对)   用葡萄糖时肌醇六磷酸酶得率(相对)
  PFJo435/pNo-DP2(DAS-肌醇六磷酸酶)   0.015   0.9
  PFJo435/pNori12(DAS-肌醇六磷酸酶+GAP-Prm)   0.43   3.7
  DAS 40   1   1
DAS40和pNo-DP2之前在实施例1之中描述。
pNori12的构建如下所示。
pNori12的构建
为了进行由DAS启动子的肌醇六磷酸酶基因和由GAP启动子的Prm1基因的共表达，构建pNori12。
为了替换终止子部分，使用下述引物克隆Prm的原始终止子：
pr136：5’-ataaattttgacagttaagtcgacctctgtaaattaattgataatttcaa-3’(SEQ ID NO：44)
pr137：5’-caatgatgatgatgatgatggtcgacgtttaaacttaattaaaagggaaatttacaagcc-3’(SEQID NO：45)
使用总体积50微升的反应混合物进行PCR，所述混合物包括2mMdNTP，10μM每条引物，2.8单位Expand高保真plus(Rosche)，1×Expand高保真缓冲液(Rosche)，和100ng GS115的基因组DNA。PCR程序如下所述。
  温度   时间   循环
  94℃   2分钟   1
  94℃55℃68℃   10秒钟30秒钟3分钟 11
  94℃55℃68℃   10秒钟30秒钟3分钟+20秒钟/循环 20
  68℃   7分钟   1
使用In-Fusion PCR克隆试剂盒(Clontech)，将扩增的500bp片段插入pGPrm的SalI位点，以将其与Prm的ORF融合，得到pNori11。为了制备具有GAP-Prm和DAS-肌醇六磷酸酶的表达质粒，从pNo-DP2分离携带包含DAS启动子的肌醇六磷酸酶表达盒的3354bp SnaBI-XmaI片段，并与pNori11的5323bp Xmal-PmeI片段连接，得到pNori12。质粒pNori12携带GAP启动子控制下的Prm1基因，DAS启动子控制下的肌醇六磷酸酶基因，和作为筛选标记的博莱霉素抗性基因。
实施例4：Mxr1的组成型表达
使用引物Mxr-F和Mxr-R通过PCR从巴斯德毕赤酵母的基因组DNA中分离来自巴斯德毕赤酵母的基因Mxr1，其据报道是用于甲醇诱导的正调控子(G.P.Lin-Cereghino等；MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，2006年2月，p.883-897Vol.26，No.3)。引物序列和PCR条件如下所示。
PCR引物：
  寡核苷酸名称   寡核苷酸序列
  Mxr-F   ATTGAACAACTATTTCGAAACCATGAGCAATCTACCCCC(SEQ ID NO：46)
  Mxr-R   GAGTTTTTGTTCTAGAATGACACCACCATCTAGTCGG(SEQ ID NO：47)
PCR条件
  温度(℃)   时间   循环
  95   5分钟   1
  954868   15秒钟30秒钟3.5分钟 35
  68   10分钟   1
将用BstBI和XbaI消化的3.5kbp PCR片段与用同样酶消化的pGAPZα混合，然后连接。得到的质粒pGMxr携带GAP启动子控制下的Mxr1基因和作为转化标记的博莱霉素抗性基因。将质粒pGMxr转化入巴斯德毕赤酵母DAS40和/或A94。在博莱霉素平板上分离转化子。在YPD培养基中在30℃将产生的转化子搅拌培养2天，并测定培养液的上清液中的肌醇六磷酸酶活性。观察Mxr1基因的组成型表达的效果，即诱导pGMxr后，YPD培养基中转化子的肌醇六磷酸酶活性增加。
  转化子   pGMxr   平板试验中的肌醇六磷酸酶活性
  Mxr#23/DAS40   有   +
  DAS40   无   -
  转化子   pGMxr   肌醇六磷酸酶收率(相对)
  AMxr2/A94   有   7.6
  A94   无   1
对质粒pGMxr进行修饰，用例如ura3、ade2、arg4、潮霉素抗性基因替换筛选标记基因，获得pGMxr-m。此外，可以用另一种启动子如PGK1启动子或TEF1启动子替换启动子区域，得到pPMxr-m或pTMxr-m。将质粒pGMxr-m、pPMxr-m或pTMxr-m转化入为转化而进行了必要修饰的巴斯德毕赤酵母转化子A或转化子3。在YPD培养基中在30℃将新产生的转化子搅拌培养2天，并测量培养液的上清液中的肌醇六磷酸酶活性。
序列表
<110>诺维信公司(Novozymes A/S)
<120>在毕赤酵母属中由甲醇诱导型启动子进行不依赖甲醇的诱导的方法
<130>11012.204-WO
<160>49
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>989
<212>PRT
<213>巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400>1
Met Pro Pro Lys His Arg Leu Glu Gln Ser Ile Gln Pro Met Ala Ser
1               5                   10                  15
Gln Gln Ile Val Pro Gly Asn Lys Val Ile Leu Pro Asn Pro Lys Val
            20                  25                  30
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Asn Ile Ser Val Gln Lys Arg Arg Arg Val
        35                  40                  45
Thr Arg Ala Cys Asp Glu Cys Arg Lys Lys Lys Val Lys Cys Asp Gly
    50                  55                  60
Gln Gln Pro Cys Ile His Cys Thr Val Tyr Ser Tyr Glu Cys Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Ser Gln Pro Ser Ser Lys Lys Arg Gln Gly Gln Ser Leu Ser Leu Ser
                85                  90                  95
Ala Pro Ser Asn Ile Asn Ala Thr Ser Ser Val Gln Lys Ser Val Lys
            100                 105                 110
Pro Pro Glu Ile Asp Phe Gln Arg Met Arg Asp Ala Leu Lys Tyr Tyr
        115                 120                 125
Glu Asp Leu Leu Asn Gln Leu Ile Tyr Pro Asn Ser Ala Pro Thr Val
    130                 135                 140
Arg Val Asn Pro Ile Arg Leu Ala Ser Ile Leu Lys Gln Leu Arg Ala
145                 150                 155                 160
Asp Lys Ser Ser Asp Glu Leu Ile Ser Val Lys Ala Leu Ser Asp Asn
                165                 170                 175
Tyr Ile Glu Met Leu His Lys Thr Met Gln Gln Pro Val Gln Gln Pro
            180                 185                 190
Ala Pro Pro Ser Leu Gly Gln Gly Gly Ser Phe Ser Asn His Ser Pro
        195                 200                 205
Asn His Asn Asn Ala Ser Ile Asp Gly Ser Ile Gln Ser Asn Leu Gly
    210                 215                 220
Arg Glu Ile Arg Ile Ile Leu Pro Pro Arg Asp Ile Ala Leu Lys Leu
225                 230                 235                 240
Ile Tyr Lys Thr Trp Asp Asn Ala Cys Val Leu Phe Arg Phe Tyr His
                245                 250                 255
Arg Pro Ala Phe Ile Glu Asp Leu Asn Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Leu
            260                 265                 270
Ala Asn Tyr Thr Asn Lys Gln Gln Arg Phe Leu Pro Leu Val Tyr Ser
        275                 280                 285
Val Met Ala Cys Gly Ala Leu Phe Cys Lys Thr Asp Gly Ile Asn His
    290                 295                 300
Gly Gln Lys Ser Ser Lys Pro Lys Asp Ser Ser Asp Glu Ser Leu Ile
305                 310                 315                 320
Asp Asp Glu Gly Tyr Lys Tyr Phe Ile Ala Ala Arg Lys Leu Ile Asp
                325                 330                 335
Ile Thr Asp Thr Arg Asp Thr Tyr Gly Ile Gln Thr Ile Val Met Leu
            340                 345                 350
Ile Ile Phe Leu Gln Cys Ser Ala Arg Leu Ser Thr Cys Tyr Ser Tyr
        355                 360                 365
Ile Gly Ile Ala Leu Arg Ala Ala Leu Arg Glu Gly Leu His Arg Gln
    370                 375                 380
Leu Asn Tyr Pro Phe Asn Pro Ile Glu Leu Glu Thr Arg Lys Arg Leu
385                 390                 395                 400
Phe Trp Thr Ile Tyr Lys Met Asp Ile Tyr Val Asn Thr Met Leu Gly
                 405                 410                 415
Leu Pro Arg Thr Ile Ser Glu Glu Asp Phe Asp Gln Glu Met Pro Ile
            420                 425                 430
Glu Leu Asp Asp Glu Asn Ile Ser Glu Thr Gly Tyr Arg Phe Asp Leu
        435                 440                 445
Gln Gly Thr Lys Leu Ser Ser Ser Gly Ile Ala Asn Ala His Thr Arg
    450                 455                 460
Leu Ile Phe Ile Met Lys Lys Ile Val Lys Lys Leu Tyr Pro Val Lys
465                 470                 475                 480
Leu Gln Lys Pro Thr Ser Asn Ser Gly Asp Thr Pro Leu Glu Asn Asn
                485                 490                 495
Asp Leu Leu Ala His Glu Ile Val His Glu Leu Glu Met Asp Leu Gln
            500                 505                 510
Asn Trp Val Asn Ser Leu Pro Ala Glu Leu Lys Pro Gly Ile Glu Pro
        515                 520                 525
Pro Thr Glu Tyr Phe Lys Ala Asn Arg Leu Leu His Leu Ala Tyr Leu
    530                 535                 540
His Val Lys Ile Ile Leu Tyr Arg Pro Phe Ile His Tyr Ile Ser Glu
545                 550                 555                 560
Lys Asp Lys Val Gly Asn Ser Ser Ile Pro Pro Ser Pro Glu Glu Ile
                565                 570                 575
Thr Ser Ile Glu Lys Ala Lys Asn Cys Val Asn Val Ala Arg Ile Val
             580                 585                 590
Val Lys Leu Ala Glu Asp Met Ile Asn Arg Lys Met Leu Ser Gly Ser
        595                 600                 605
Tyr Trp Phe Ser Ile Tyr Thr Ile Phe Phe Ser Val Ala Cys Leu Val
    610                 615                 620
Tyr Tyr Val His Phe Ala Pro Pro Lys Lys Asp Asn Gly Glu Leu Asp
625                 630                 635                 640
Pro Gln Tyr Met Glu Ile Lys Lys Asp Thr Glu Ser Gly Arg Glu Val
                645                 650                 655
Leu Asn Ile Leu Lys Asp Ser Ser Met Ala Ala Arg Arg Thr Tyr Asn
            660                 665                 670
Ile Leu Asn Ser Leu Phe Glu Gln Leu Asn Arg Arg Thr Ala Lys Val
        675                 680                 685
Asn Leu Ala Lys Ala Gln Gln Pro Pro Ser Gly Leu Asn Asn Pro Ala
    690                 695                 700
Ala Thr Gln Tyr Gln Lys Gln Gly Glu His Arg Gln Leu Gln Pro Ser
705                 710                 715                 720
Asn Tyr Ser Gly Thr Val Lys Ser Val Asp Pro Glu Asn Ile Asp Tyr
                725                 730                 735
Ser Ser Phe Gly Ser Gln Phe Glu Asn Thr Asn Ile Glu Asp Gly Ser
            740                 745                 750
Ser Asn Thr Lys Ile Asp Gln Lys Val Asn Gly Val Asn Tyr Ile Asp
        755                 760                 765
Gly Val Phe Thr Gly Ile Asn Leu Asn Met Pro Asn Leu Ser Glu Thr
    770                 775                 780
Ser Asn Thr Gln Gly Ile Asp Asn Pro Ala Phe Gln Ser Ile Asn Asn
785                 790                 795                 800
Ser Asn Leu Asn Asn Asn Phe Val Gln Thr Lys Tyr Ile Pro Gly Met
                805                 810                 815
Met Asp Gln Leu Asp Met Lys Ile Phe Gly Arg Phe Leu Pro Pro Tyr
            820                 825                 830
Met Leu Asn Ser Asn Lys Val Glu Gln Gly Gln Asn Glu Arg Asn Leu
        835                 840                 845
Ser Gly Gln Pro Ser Ser Ser Asn Thr Pro Asp Gly Ser Gln Pro Val
    850                 855                 860
Thr Val Leu Asp Gly Leu Tyr Pro Leu Gln Asn Asp Asn Asn Asn Asn
865                 870                 875                 880
His Asp Pro Gly Asn Ser Lys Ser Val Val Asn Asn Ser Asn Ser Val
                885                 890                 895
Glu Asn Leu Leu Gln Asn Phe Thr Met Val Pro Ser Gly Leu Ser Ser
            900                 905                 910
Thr Val Gln Asn Pro Glu Ala Ala Gln Lys Phe Asn Asn His Met Ser
        915                 920                 925
Asn Ile Ser Asn Met Asn Asp Pro Arg Arg Ala Ser Val Ala Thr Ser
    930                 935                 940
Asp Gly Ser Asn Asp Met Asp His His Ser Gln Gly Pro Ile Asn Lys
945                 950                 955                 960
Asp Leu Lys Pro Leu Ser Asn Tyr Glu Phe Asp Asp Leu Phe Phe Asn
                965                 970                 975
Asp Trp Thr Thr Ala Pro Asp Thr Ile Asn Phe Asp Ser
              980                 985
<210>2
<211>2970
<212>DNA
<213>巴斯德毕赤酵母
<400>2
atgcctccta aacatcggct ggagcagagt atacagccca tggcttctca acaaatagta     60
cccggtaata aggttattct gccgaatcca aaagtagatg caaaatctac cccaaacatt    120
tcagttcaga agagaagaag agtcaccaga gcttgtgatg aatgtcggaa aaagaaggtc    180
aaatgtgatg gtcaacaacc atgcattcat tgtaccgttt attcctatga gtgcacttac    240
agccaacctt ccagtaagaa gagacaggga caatctctga gtctgagtgc tccgtcaaac    300
attaatgcaa caagttccgt acaaaaatct gtaaaacctc ctgaaatcga tttccaaagg    360
atgagagacg cactcaaata ttacgaagat cttttaaacc agttgatata ccccaacagt    420
gctccaactg ttcgagttaa tccgattcgt ctagcatcga tcttaaaaca attgagagcc    480
gataaatcaa gtgatgaatt aatttcagtc aaggctcttt ctgacaatta cattgagatg    540
cttcacaaaa cgatgcaaca acctgtacag cagccagctc ctccttcatt ggggcaagga    600
gggtccttct ctaatcacag tcccaatcat aataatgctt ctattgatgg ttccatagaa    660
tctaatctag ggagggaaat acgtatcata ttacctccga gagatattgc gctgaagctt    720
atctacaaga cttgggacaa cgcgtgtgta cttttccgct tttatcacag acccgcattt    780
attgaggacc tgaatgagtt atatgaaaca gatttggcaa actacaccaa taaacaacaa    840
aggtttttac ctcttgtata ttcggtgatg gcttgtggtg ctcttttttg caagactgat    900
gggattaatc acggccaaaa gagctccaag cccaaagact cttctgatga aagtctcata    960
gacgatgagg gttacaagta ttttattgcc gcaagaaaac taatagatat cacggatacc   1020
agggatacct acggaattca gactattgtt atgctgatca tttttttaca atgttcggct   1080
cgtctttcaa catgctattc ttatattggc attgctctaa gagctgcatt gagagaaggt   1140
ttgcatcgtc agttgaacta tcctttcaat ccaattgagt tagaaacaag aaagcgtctt   1200
ttttggacta tctataaaat ggacatctat gtcaatacaa tgctggggct tccaagaacc   1260
atttctgaag aggatttcga ccaggaaatg cctatcgaac ttgatgatga gaacattagt   1320
gaaaccggat ataggttcga tttacaaggt acaaagttat ccagttcagg aatagccaat   1380
gctcacacta gattgatatt cataatgaag aaaattgtga aaaaattata tcctgtcaaa   1440
ctacagaaac caacctcaaa cagtggcgat accccacttg agaacaatga tttattggct   1500
catgaaatcg ttcatgaact tgagatggat ctccaaaatt gggtcaatag tctacctgca   1560
gaactaaaac cggggataga accaccgacc gagtatttta aagctaacag attgcttcat   1620
ttggcatacc tgcatgtcaa gattattctc tacaggccat ttattcatta catctcagaa   1680
aaggataagg ttggaaatag ttctatccct ccgtcgcccg aagagatcac ttctatcgag   1740
aaagccaaga attgtgtcaa tgttgccaga attgttgtta aactagccga agacatgatt   1800
aataggaaaa tgttaagtgg ttcatattgg ttttccattt ataccatttt tttttccgtg   1860
gcatgtctgg tgtactatgt tcatttcgct ccaccgaaga aagacaatgg agaactggat   1920
ccccaataca tggaaatcaa gaaagataca gagagtggaa gagaggtctt aaatatcctc    1980
aaagatagta gtatggcggc aagaagaacg tataatattc tcaactcttt gtttgagcag    2040
ttaaacagaa gaactgcaaa ggtcaaccta gcaaaggcac agcaaccacc atcagggttg    2100
aataacccag ctgctaccca gtatcagaaa cagggtgaac acaggcagtt acaaccaagt    2160
aactattctg gaactgtgaa atctgtggac ccagagaata tcgattactc ttcctttggt    2220
tctcagtttg aaaacactaa catcgaagat ggttcctcaa atacaaagat tgatcagaaa    2280
gtgaatgggg tgaactacat cgatggtgtg tttacaggga tcaacctaaa tatgcctaat    2340
ctctcagaaa cttctaacac tcaaggtatc gataatccag catttcaaag tataaacaat    2400
tctaatttga acaataattt tgtacaaaca aagtacattc ccggcatgat ggaccagcta    2460
gatatgaaaa ttttcggaag attccttcca ccttacatgc tgaactccaa caaggttgaa    2520
cagggacaaa atgaaaggaa cctatcaggc caaccatcct cgtcgaatac tcctgatgga    2580
tcacaacctg tgacagttct ggatggatta tacccgttgc agaatgataa taataataac    2640
cacgacccag gaaattcaaa gtctgttgta aataacagta actcggtaga aaacttacta    2700
cagaacttta caatggtgcc ctcggggttg tcatcaacag tgcaaaatcc tgaagcggcc    2760
caaaaattca ataatcatat gtcaaacata tcgaatatga atgatccaag aagagctagc    2820
gtagctacat cagatggatc caatgacatg gatcatcata gccaaggccc gataaacaaa    2880
gatttgaaac cgttgagcaa ctacgagttt gacgatctct tctttaatga ttggaccact    2940
gcgccagata caataaattt tgacagttaa                                     2970
<210>3
<211>640
<212>DNA
<213>巴斯德毕赤酵母
<400>3
gcttaaggct gagagagaga gaggtatcac catcgacatc gctttgtgga agttcgagac     60
tccaaagtac cacgttaccg tcattgacgc tccaggtcac agagatttca ttaagaacat    120
gattaccggt acttcccaag ccgactgtgc cattttggtc attgcttccg gtattggtga    180
gttcgaggct ggtatctcca aggatggtca aaccagagag cacgctcttt tggctttcac    240
cctgggtgtc aagcaattga ttgttgccat caacaagatg gactccgtca aatggtctca    300
aaagagatac gaggagattg tcaaggaaac ttccaacttc atcaagaagg ttggttacaa    360
ccctaagact gtcccattcg tcccaatttc cggatggaac ggtgacaaca tgattgagcc    420
atcttccaac tgtgactggt acaagggatg ggagaaggag accaaggctg gtggtgctac    480
caagggtaag accttgttgg aggctattga ctccattgac ccaccatcca gaccaactga    540
caagcctctg agattgcctt tgcaggatgt ctacaagatt ggtggtatcg gaactgtgcc    600
agtcggtaga gttgagaccg gtgtcatcaa ggctggtatg                          640
<210>4
<211>213
<212>PRT
<213>巴斯德毕赤酵母
<400>4
Leu Lys Ala Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Asp Ile Ala Leu Trp
1               5                   10                  15
Lys Phe Glu Thr Pro Lys Tyr His Val Thr Val Ile Asp Ala Pro Gly
            20                  25                  30
His Arg Asp Phe Ile Lys Asn Met Ile Thr Gly Thr Ser Gln Ala Asp
        35                  40                  45
Cys Ala Ile Leu Val Ile Ala Ser Gly Ile Gly Glu Phe Glu Ala Gly
    50                  55                  60
Ile Ser Lys Asp Gly Gln Thr Arg Glu His Ala Leu Leu Ala Phe Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gly Val Lys Gln Leu Ile Val Ala Ile Asn Lys Met Asp Ser Val
                85                  90                  95
Lys Trp Ser Gln Lys Arg Tyr Glu Glu Ile Val Lys Glu Thr Ser Asn
            100                 105                 110
Phc Ile Lys Lys Val Gly Tyr Asn Pro Lys Thr Val Pro Phe Val Pro
        115                 120                 125
Ile Ser Gly Trp Asn Gly Asp Asn Met Ile Glu Pro Ser Ser Asn Cys
    130                 135                 140
Asp Trp Tyr Lys Gly Trp Glu Lys Glu Thr Lys Ala Gly Gly Ala Thr
145                 150                 155                 160
Lys Gly Lys Thr Leu Leu Glu Ala Ile Asp Ser Ile Asp Pro Pro Ser
                165                 170                 175
Arg Pro Thr Asp Lys Pro Leu Arg Leu Pro Leu Gln Asp Val Tyr Lys
            180                 185                 190
Ile Gly Gly Ile Gly Thr Val Pro Val Gly Arg Val Glu Thr Gly Val
        195                 200                 205
Ile Lys Ala Gly Met
    210
<210>5
<211>1467
<212>DNA
<213>巴斯德毕赤酵母
<400>5
agtactagga ggatccagct catctaggga gtggaattga gtactgacac tcattactgg     60
aagaagtaga aagagtactg gttttgtggt agttccatat ttcagatgtc tgtagatggt    120
cgagcgaggt gaacatttca taggagattt cagaggagtt ggactttgaa aatggtgaca    180
aaaggtagac agaagaaagg ttagagagtg tcagtgattc aaggtggttg cagagtacga    240
ccttgaacat tggtgggtat ttgacaggtt ggggagcaaa taagtgatga tgtcccatga    300
aagtagaaaa tggctagtag aaggcaaaaa tttgaaattc ttagagtcaa atagttagac    360
tccaagttct aatccacatt tggtcagttt catagcatcc agagcttttg ccactggtga    420
acatatctac ccattgcgat gcaacaagtc actgaaagcc taaaacggag attcccctat    480
cttacagcct cgttcaaaaa aactgctacc gtttatctgc tatggccgat gtgaggatgc    540
gctcatgccc aagagtccaa ctttatcaaa aacttgaccc gtcatacagg ctctagatca    600
agaagcaaac ttaatctcag catctggtta cgtaactctg gcaaccagta acacgcttaa    660
ggtttggaac aacactaaac taccttgcgg tactaccatt gacactacac atccttaatt    720
ccaatcctgt ctggcctcct tcacctttta accatcttgc ccattccaac tcgtgtcaga    780
ttgcgtatca agtgaaaaaa aaaaaatttt aaatctttaa cccaatcagg taataactgt    840
cgcctctttt atctgccgca ctgcatgagg tgtcccctta gtgggaaaga gtactgagcc    900
aaccctggag gacagcaagg gaaaaatacc tacaacttgc ttcataatgg tcgtaaaaac    960
aatccttgtc ggatataagt gttgtagact gtcccttatc ctctgcgatg ttcttcctct   1020
caaagtttgc gatttctctc tatcagaatt gccatcaaga gactcaggac taatttcgca   1080
gtcccacacg cactcgtaca tgattggctg aaatttccct aaagaatttc tttttcacga   1140
aaattttttt tttacacaag attttcagca gatataaaat ggagagcagg acctccgctg   1200
tgactcttct tttttttctt ttattctcac tacatacatt ttagttattc gccaacatgg   1260
gtaaggaaaa gttgcacgtt aacgtcgttg ttattggaca cgtcgatgct ggtaaatcta   1320
ccaccaccgg tcacttgatc tacaagtgtg gtggtattga caagcgtacc atcgagaagt   1380
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<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>n是a、c、g或t
<400>6
ttyaartaygcnt gggt             17
<210>7
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>引物ORF
<400>7
Phe Lys Tyr Ala Trp Val
1               5
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>8
arytgytcrt grtgcatytc     20
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>引物ORF
<400>9
Glu Met His His Glu Gln Leu
1               5
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>10
tgacggtaac gtggtacttt     20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>11
ggagtctcga acttccacaa     20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>12
agcgatgtcg atggtgatac     20
<210>13
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>13
tacagggcgc gtggggatat cggatccagc tcatctaggg a              41
<210>14
<211>50
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>14
tgaagatgga tgggaatctc atatggttgg cgaataacta aaatgtatgt     50
<210>15
<211>50
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>15
acatacattt tagttattcg ccaaccatat gagattccca tccatcttca      50
<210>16
<211>50
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>16
taattcgcgg ccgccctagg gaattcttac tcggtgacag cgcactcggg      50
<210>17
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>17
ttttggtcat gcatgacgtc atagggagaa aaaccgagac                 40
<210>18
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>18
ctcatatgtt ttgatgtttg atagtttga                             29
<210>19
<211>1055
<212>DNA
<213>巴斯德毕赤酵母
<400>19
atagggagaa aaaccgagac aacgatggaa ctcccatgta gattccaccg ccccaattac     60
tgttttgggc aatcctgttg ataagacgca ttctagagtt gtttcatgaa agggttacgg    120
gtgttgattg gtttgagata tgccagagga cagatcaatc tgtggtttgc taaactggaa    180
gtctggtaag gactctagca agtccgttac tcaaaaagtc ataccaagta agattacgta    240
acacctgggc atgactttct aagttagcaa gtcaccaaga gggtcctatt taacgtttgg    300
cggtatctga aacacaagac ttgcctatcc catagtacat catattacct gtcaagctat    360
gctaccccac agaaataccc caaaagttga agtgaaaaaa tgaaaattac tggtaacttc    420
accccataac aaacttaata atttctgtag ccaatgaaag taaaccccat tcaatgttcc    480
gagatttagt atacttgccc ctataagaaa cgaaggattt cagcttcctt accccatgaa    540
cagaaatctt ccatttaccc cccactggag agatccgccc aaacgaacag ataatagaaa    600
aaagaaattc ggacaaatag aacactttct cagccaatta aagtcattcc atgcactccc    660
tttagctgcc gttccatccc tttgttgagc aacaccatcg ttagccagta cgaaagagga    720
aacttaaccg ataccttgga gaaatctaag gcgcgaatga gtttagccta gatatcctta    780
gtgaagggtt gttccgatac ttctccacat tcagtcatag atgggcagct ttgttatcat    840
gaagagacgg aaacgggcat taagggttaa ccgccaaatt atataaagac aacatgtccc    900
cagtttaaag tttttctttc ctattcttgt atcctgagtg accgttgtgt ttaatataac    960
aagttcgttt taacttaaga ccaaaaccag ttacaacaaa ttataacccc tctaaacact   1020
aaagttcact cttatcaaac tatcaaacat caaaa                              1055
<210>20
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>20
actatttcga aatgcctcct aaacatcggc tg    32
<210>21
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>21
gtcgacttaa ctgcaaaatt tattg            25
<210>22
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>22
gatcctacgt agctgag                           17
<210>23
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>23
aattctcagc tacgtag                           17
<210>24
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>24
gatccaaacc atgagattcc catccatctt cactg       35
<210>25
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>25
caaaccatga gattcccatc catcttcact g           31
<210>26
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>26
cattctgtt cctctctcttt tccaaggaaa caccttc     37
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>27
ggaaaagaga gaggaacaga atggaatgaa gttgg       35
<210>28
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>28
aattcttact cggtgacagc gcactc    26
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>29
cttactcggt gacagcgcac tc        22
<210>30
<211>1236
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>优化用于在巴斯德毕赤酵母中表达的布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)肌醇六磷酸酶密码子
<400>30
gaggaacaga atggaatgaa gttggagaga gttgtcatcg tttctagaca cggtgttaga     60
gctcccacca aattcactcc aatcatgaag aacgtcaccc cagatcagtg gccacaatgg    120
gacgtcccac tgggctggtt gactccacgt ggtggagaac ttgtctctga attgggtcag    180
taccagagac tgtggttcac ctccaaagga cttctgaata accaaacttg cecatcccca    240
ggacaagtcg ctgttattgc cgacaccgat caaagaacca gaaaaaccgg agaggccttt    300
ttggcaggac ttgctccaaa atgccagatt caagtccact accaaaaaga cgaagagaag    360
aacgatccat tgttcaatcc cgtcaagatg ggaaaatgct cctttaacac cttgcaagtc    420
aaaaacgcca ttttggaaag agcaggtggc aatatcgagc tttacaccca gcgttaccaa    480
tcttctttta gaactttgga aaatgttttg aactttagtc agtccgagac ttgcaagacc    540
accgagaagt ctaccaagtg cactttgccc gaggctttgc cctccgagct taaggtcact    600
cccgataacg tctccttgcc aggagcatgg tctctttcct ccactttgac cgagattttc    660
ttgttgcagg aggcacaagg aatgccacag gtcgcatggg gtagaattac cggtgaaaag    720
gaatggagag acttgctgtc tcttcacaac gcccagttcg atctcttgca gagaacccca    780
gaggttgcca gatccagagc tactccactt ttggatatga tcgacaccgc tttgctgacc    840
aatggtacca ccgagaacag atacggtatt aagttgccag tctccttgct gttcattgca    900
ggtcacgaca ccaatttggc caacttgtct ggagccttgg acctgaactg gtctttgcca    960
ggacagcccg acaatacccc accaggaggc gaattggttt tcgaaaagtg gaaaagaacc   1020
tccgataaca ccgattgggt ccaagtctcc ttcgtctacc aaaccttgag agatatgcgt   1080
gacattcagc cactgtcttt ggagaagccc gctggtaagg ttgacttgaa attgatcgct   1140
tgcgaagaaa agaactccca gggaatgtgc tctttgaagt ccttttccag attgatcaag   1200
gagattagag tccccgagtg cgctgtcacc gagtaa                             1236
<210>31
<211>255
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>优化用于在巴斯德毕赤酵母中表达的酿酒酵母(S.cerevisiae)α因子信号密码子
<400>31
atgagattcc catccatctt cactgctgtt ttgttcgctg cttcctccgc tttggctgct     60
ccagttaaca ctactactga agatgaaact gctcaaatcc cagctgaagc tgttatcggt    120
tactccgact tggaaggtga tttcgacgtt gctgttttgc cattctccaa ctccaccaac    180
aacggattgt tgttcattaa caccaccatt gcttccatcg ctgctaagga agaaggtgtt    240
tccttggaaa agaga                                                     255
<210>32
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>32
gcgcgaattc cacagggctt gctaagaaat c    31
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>33
gaagggagat taatacaggg c               21
<210>34
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>34
gattggacca ctgcgccaga tac             23
<210>35
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>35
gcgcgtcgac ccacccgagg ataagaagg       29
<210>36
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>36
ccctgtatta atctcccttc atcagaattg gttaattggt tg     42
<210>37
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>37
tctggcgcag tggtccaatc atcgataagc tttaatgcgg        40
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>38
ctggagcaga gtatacagcc                              20
<210>39
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>39
ctcaataaat gcgggtctgt g                            21
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>40
cctggttgat cagctccacc                              20
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>41
cccgtcaagt cagcgtaatg c                                             21
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>42
ctccctctcc agctgcttcg                                               20
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>43
cggtgcctga ctgcgttagc                                               20
<210>44
<211>50
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>44
ataaattttg acagttaagt cgacctctgt aaattaattg ataatttcaa              50
<210>45
<211>60
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>45
caatgatgat gatgatgatg gtcgacgttt aaacttaatt aaaagggaaa tttacaagcc   60
<210>46
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>46
attgaacaac tatttcgaaa ccatgagcaa tctaccccc                          39
<210>47
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>47
gagtttttgt tctagaatga caccaccatc tagtcgg    37
<210>48
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>比对实例序列
<400>48
Ala Cys Met Ser His Thr Trp Gly Glu Arg Asn Leu
1               5                   10
<210>49
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>比对实例序列
<400>49
His Gly Trp Gly Glu Asp Ala Asn Leu Ala Met Asn Pro Ser
1               5                   10

Claims (19)

1.在甲基营养型酵母宿主细胞中产生多肽的方法，其中所述多肽的表达受甲醇诱导型启动子的控制，所述方法包括：i)由非天然启动子表达正调控子，所述正调控子激活由甲醇诱导型启动子的转录，和ii)不加入甲醇。
2.根据权利要求1的方法，其中甲基营养型酵母宿主细胞选自下组：毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)和球拟酵母属(Torulopsis)。
3.根据权利要求1或2的方法，其中甲醇诱导型启动子选自下组：AOX1启动子、DHAS启动子、FDH启动子、FMDH启动子、MOX启动子、AOX2启动子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-启动子。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中正调控子的表达是组成型的。
5.根据权利要求1的方法，其中正调控子为SEQ ID NO：1中所示的Prm1或其功能同源物。
6.根据权利要求5的方法，其中所述功能同源物与SEQ ID NO：1至少85％相同，优选至少90％，更优选至少95％，最优选与SEQ ID NO：1至少98％相同。
7.根据权利要求4-6中任一项的方法，其中所述正调控子在GAP启动子、TEF1启动子或PGK启动子的控制下。
8.根据权利要求1的方法，其中正调控子的表达是诱导型的。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中编码正调控子的基因以多拷贝存在。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述甲醇诱导型启动子具有正调控子的其他结合位点。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中mxr1基因受非天然启动子的控制。
12.根据权利要求11的方法，其中mxr1在GAP启动子、TEF1启动子或PGK启动子的控制下。
13.根据权利要求2的方法，其中毕赤酵母属宿主细胞选自下组：巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)、安格斯毕赤酵母(P.angusta)、热甲醇毕赤酵母(P.thermomethanolica)。
14.根据权利要求2的方法，其中汉逊酵母属宿主细胞选自下组：多态汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。
15.根据权利要求2的方法，其中假丝酵母属宿主细胞选自下组：博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)。
16.根据前述权利要求中任一项的方法，其中控制正调控子的内源拷贝的启动子也被非天然的组成型启动子所代替。
17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述多肽对宿主细胞是异源的。
18.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中所述多肽对宿主细胞是同源的。
19.增加异源多肽在甲醇诱导型启动子的控制下的表达水平的方法，其包括提供prm1基因的组成型表达。
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