KR101464437B1 - 재조합 단백질의 효율적인 분비를 위한 코돈 최적화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피키아 파스토리스에 코돈 최적화된 분비 시그널인 MFLSICO, MFLScco 및 MFLSMOCO 서열 및 이를 이용한 효모에서 이종 단백질을 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 단백질의 효율적인 분비를 위한 코돈 최적화{Codon optimization for efficient secretion of recombinant proteins}
본 발명은 피키아 파스토리스에 코돈 최적화된 분비서열을 이용하여 재조합 단백질 발현 및 분비 효과를 증진시키는 것에 관한 것이다.
재조합 단백질 생산에 있어서 효모를 이용한 단백질 발현분비 시스템은 여러 가지 장점을 가진다. 효모는 단세포 진핵생물(unicellular eukaryote)로서 저렴한 비용으로 손쉽게 대량 배양이 가능하고 대장균과 같은 원핵세포 발현 (prokaryotic expression) 시스템과는 달리 글리코실레이션(glycosylation) 등 번역 후 변형(post-translational modification) 이 가능하여 특히 진핵세포 유래의 단백질 생산에 적합하다. 또한 대장균 등의 발현시스템과는 달리 거의 대부분의 경우 수용성 발현(soluble expression)이 가능하여 봉입체(inclusion body)를 형성하지 않으며 단백질 분비경로가 잘 발달하여 추후 공정(down stream processing)이 복잡하지 않으므로 산업상 이용 가치가 크다.
특히 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 안전성이 입증된 GRAS(Generally Regarded as Safe) 생물체로서 추가적인 장점을 제공하고 있다. 사카로마이세스 세레비지에는 오랜 연구의 역사로 인하여 전통적 유전학 기법이 매우 잘 발달되어 있어 유전적 조작이 용이하며 최근에는 지놈 염기서열 분석(genome sequencing)도 완료되어 마이크로어레이(microarray) 분석 등의 최신기법을 사용한 연구가 가능하므로 재조합단백질 발현에 가장 많이 사용되는 생체 발현시스템 중 하나이다.
한편 최근 각광을 받고 있는 메탄올 자화 효모인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 특히 매우 강력하며 메탄올로 유도발현이 가능한 AOX 프로모터를 이용하여 리터 당 십수 그람의 재조합 단백질을 성공적으로 발현한 사례가 있을 정도로 생산성이 우수한 생체 발현시스템이다. 또한 피키아 파스토리스는 값싼 배지를 사용하여 손쉽게 고농도 세포배양이 가능하고 평상시 분비되는 단백질의 양이 매우 적으며 특히 하이퍼-글리코실레이션(hyper-glycosylation) 문제도 다른 효모와 비교하여 커다란 문제가 되지 않는 등의 다양한 장점이 있어 재조합 단백질 생산 분야에 있어서 그 이용 가능성이 상당히 높다.
최근에는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 뿐만 아니라 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 악셀라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans) 등 다양한 효모 발현시스템도 개발되고 있다. 이러한 여러 효모 발현 시스템들은 특히 전술한 바와 같이 대장균에 비해 목표 단백질의 분비 발현에 용이한 장점을 제공한다.
다양한 효모 발현 시스템에서 목표 단백질의 분비시그널로서는 사카로마이세스 세레비지에 유래의 교배인자 알파 프리프로 리더 서열(mating factor α prepro leader sequence, MFLS)를 분비 시그널로서 가장 많이 사용하고 있다(Romanos et al., 1992; Hitzeman R. A. et al., 1990). 분비 시그널은 합성된 단백질이 합성된 장소에서 밖으로 분비되도록 자극을 주는 체계이며, 생물종 및 단백질의 종류에 따라 그 종류가 다양하다. 이러한 기능적 특성으로 인하여 단백질 분비 시그널은 재조합 단백질 생산에 있어서 최종적으로 수획되는 단백질 양을 증대시키는데 중요한 역할을 하지만, 지금까지는 재조합 단백질의 수율 증대를 위해서는 단백질 발현 부위 자체를 변형시키는 기술이 주를 이룬 반면, 단백질 분비를 향상시키는 방법에 관한 기술개발은 미미한 실정이었다.
한편, 모든 생물체는 단백질을 코딩하는 코돈을 골고루 사용하지 않고 편중되게 사용하는 경향이 있다. 따라서 단백질 코딩에 주로 사용되는 코돈인 선호코돈(preferred codon)이 존재하는 코돈치우침(codon bias) 현상이 있다. 코돈 사용 빈도(codon usage)는 특히 빨리 성장하는 미생물에서 유전자 발현 정도와 연관되어 있다는 것이 밝혀져 있다. 따라서, 코돈 최적화는 생물체 내에서 이종 단백질의 발현을 증가시키기 위한 효과적인 전략으로 고려되어 왔으며, 두 가지 대표적인 유전자 일차구조 특성이 코돈 최적화를 위한 설계 변수로 제안되어 왔다. 이 중 한 가지는 각각의 유전자에서 동의 코돈(synonymous codon)의 발생 빈도가 다른 것을 나타내는 individual codon usage (ICU) 치우침(bias)이며, 나머지 한 가지는 리보솜 내에서의 강력한 tRNA-tRNA 입체 상호작용의 결과로서 인접한 코돈이 조직되는 규칙을 보여주는 codon-pair context (CC) 치우침이다.
ICU-기반 코돈 최적화(ICO) 알고리즘은 Gene Designer 및 OPTIMIZER와 같은 많은 서열 설계 소프트웨어 툴에서 시행되어 왔다. Gustafsson et al . (Trends in Biotechnology 2004, 22:346-353.)에서 리뷰된 바와 같이, ICO는 많은 유전자의 코돈 최적화에 적용되어 왔으며, 많은 경우에 단백질 발현 정도를 향상시키는 결과를 초래했다. 또한, Coleman et al . (Science 2008, 320:1784-1787.)이 합성된 순화 바이러스 공학에서 희귀 코돈 쌍의 사용이 단백질 번역율을 감소시킨 것을 밝혀 희귀코돈(rare codon)을 사용하게 되면 번역과정(translation)이 저해되어 단백질 생산이 감소하는 것을 간접적으로 확인하였다. 따라서 재조합 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 다양한 방법 중 하나로 목표 유전자를 숙주세포의 코돈 사용법(codon usage)에 맞도록 코돈 최적화를 함으로써 번역의 효율을 높이는 코돈 최적화(codon optimization) 방법을 사용할 수 있다.
그러나, 최적 발현을 위해 이용되는 코돈 최적화를 위한 유전자 설계 변수로서의 ICU 및 CC의 상대적인 중요성을 외부 유전자의 특정 숙주 시스템에 기반하여 비교한 연구는 없었으며, 현재까지 알려진 많은 사례의 경우 분비, 발현시키고자 하는 목표유전자 자체는 코돈 최적화하는 반면 분비 시그널은 코돈 최적화하지 않는 경우가 대부분이었다. 상품화되어 있는 효모 발현벡터들, 예를 들어 피키아 파스토리스 분비 발현 벡터인 pPIC6α, pGAPZα (Invitrogen, Carlsbad, 미국) 등의 경우에도 MFLS는 코돈 최적화되지 않은 상태이며 대부분 연구에서 상품화된 발현 키트를 근간으로 사용하는 경우가 많다. 최근 보고된 칸디다 루고사(Candida rugosa) 유래의 리파제 lip1 유전자를 피키아 파스토리스 균주에서 MFαppL 서열을 이용하여 분비시키는 연구에서도 목표 단백질인 lip1 단백질 아미노 말단 부분의 일부분만 코돈 최적화하여도 분비 효율이 증가한다는 보고를 하고 있지만 분비 시그널 MFLS는 코돈 최적화하지 않은 상태로 사용하고 있다.
이에 본 발명자들은 단백질 발현을 증진시키기 위한 서열 설계에서의 ICU 및 CC의 중요성을 확인하기 위하여 이종 단백질의 분비를 위해 사용되는 S. cerevisiae-유래의 MFLS(mating factor α prepro-leader sequence)를 ICU, CC 및 MOCO(multi-objective codon optimization) 방법으로 피키아 파스토리스에 대하여 코돈-최적화한 뒤, 각각의 방법으로 코돈 최적화된 분비 서열에 의한 이종 단백질의 발현 및 분비 효과를 비교하였다.
본 발명의 목적은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 대하여 코돈 최적화된 MFLS(mating factor α prepro-leader sequence) 변이체를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 코돈 최적화된 MFLS(mating factor α prepro-leader sequence)변이체를 포함하는 벡터를 효모에 형질전환하여 효모에서 이종 단백질을 고효율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 대하여 코돈 최적화된 MFLS(mating factor α prepro-leader sequence) 변이체를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 코돈 최적화된 MFLS(mating factor α prepro-leader sequence)변이체를 포함하는 벡터를 효모에 형질전환하여 효모에서 이종 단백질을 고효율로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 코돈 최적화된 분비 시그널인 MFLSICO, MFLScco 및 MFLSMOCO 서열은 피키아 파스토리스에서 목적 단백질의 발현 및 분비를 증진시키므로, 재조합 효모 발현 시스템에서 재조합 단백질의 발현 효율을 증가시키고 생산량을 증가시키기 위해 이용할 수 있다.
도 1은 MFLS 유전자 변이체들의 ICU 및 CC 적합성을 나타낸 도이다.
도 2는 MFLS 유전자 변이체들의 코돈 사용 빈도를 나타낸 도이며, 각각의 코돈 및 코돈 쌍들의 색깔 (인접한 코돈들 사이의 작은 네모 블럭에 의해 나타내어지는)은 도 2의 상기에 기재된 변화도(gradient)에 표시한 대로 P. pastoris 숙주에 대한 코돈 사용 빈도를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서, "효모"는 단세포 진핵생물의 일종으로서, 원핵생물인 대장균과 함께 재조합 단백질의 생산에 주로 사용되는 생물을 말한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 종래에 축적된 연구를 통해 안전성이 입증된 GRAS(Generally Regarded as Safe)생물체로서 일반적으로 가장 많이 사용되는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 최근 각광을 받고 있는 메탄올 자화 효모인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 이용하였으나, 본 발명에 따르는 효모는 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서, "코돈 최적화(Codon Optimization)"란 단백질을 코딩하는 부위의 아미노산 코돈 중에서 편중되어 사용되는 코돈(prefered codon)을 부각시키고 희귀 코돈(rare codom)을 변형시켜 단백질의 생산을 증진시키는 방법을 말한다. 본 발명에서는 ICU-기반 코돈 최적화(ICO), CC-기반 코돈 최적화(CCO) 또는 ICO와 CCO를 함께 이용한 코돈 최적화 방법을 이용하였다.
본 발명에서, "피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 대하여 코돈 최적화된"이란 이종 단백질을 암호화하는 염기서열을 피키아 파스토리스에서 선호되는 코돈으로 최적화한 것을 말한다. 본 발명에서는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 MFLS를 숙주인 피키아 파스토리스에서 효과적으로 발현시키기 위해 코돈 최적화 방법을 이용하여 피키아 파스토리스에서 발현이 증가하는 코돈으로 변경하였다.
본 발명에서, "분비 시그널"은 리포좀에서 합성된 단백질이 소포체, 골지체 나아가 세포 밖으로 분비되도록 하는 작용을 하는 체계를 말하며 각 생물종들 및 발현하는 단백질에 따라 그 종류 또한 다양하다. 본 발명에서는 효모 사카로마이세스 세레비지에의 경우 가장 널리 사용되고 있는 교배 인자 알파 프리프로 리더 서열(mating factor α prepro leader sequence, MFLS)을 분비 시그널로서 사용하였다.
본 발명에서 사용된 바와 같이 유전자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드 등과 같은 유전자 생성물의 "발현"이라는 용어는 유전자가 미리 결정된 생체 내 작용에 의해 영향을 받아 또 다른 형태로 변화되는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 용어 "발현"은 유전자, 폴리뉴클레오티드 등이 전사되고 폴리펩타이드로 번역됨을 나타낸다. 본 발명의 하나의 실시태양에서 유전자는 mRNA로 전사된다. 더욱 바람직하게는 이들 폴리펩타이드는 후-번역적 처리 변형을 지닌다. 따라서 여기에 사용된 유전자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드의 "발현"의 "증가"는 본 발명의 작용제가 작용시 발현량이 작용제가 작용하지 않을 때와 비교시 유의적으로 증가됨을 나타낸다. 바람직하게는, 발현 증가는 폴리펩타이드 발현량의 증가를 포함한다. 더욱 상세하게는, 발현량의 증가는 작용제의 후-작용과 전-작용을 비교시 적어도 약 10% 이상, 바람직하게는 적어도 약 20% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 약 30% 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 40% 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 50% 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 75% 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 100% 이상, 더욱 더 바람직하게는 200%의 발현 증가 또는 작용제의 작용 전에 발현하지 않은 발현이 발생하는 것을 나타낸다.
본 발명은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 대하여 코돈 최적화된 MFLS(mating factor α prepro-leader sequence) 변이체를 제공한다.
상기 코돈 최적화된 MFLS 변이체는 ICU(Individual codon usage)에 기반한 서열번호 1로 기재되는 MFLSICO 서열, CC(Codon-pair context)에 기반한 서열번호 2로 기재되는 MFLScco 서열 또는 ICU 및 CC를 함께 이용한 다목적 최적 코돈 설계(multi-objective codon optimization)에 기반한 서열번호 3으로 기재되는 MFLSMOCO 서열로 이루어지는 변이체이다.
상기 MFLS는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 분비시그널인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 코돈 최적화된 MFLS 변이체들은 재조합 단백질 생산을 위한 숙주인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 대하여 코돈 최적화된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 코돈 최적화된 염기서열을 가지는 MFLS(mating factor α prepro-leader sequence) 변이체를 포함하는 벡터를 효모에 형질전환하여 효모에서 이종 단백질을 고효율로 생산하는 방법을 제공한다.
상기 코돈 최적화는 ICO(ICU-based codon optimization), CCO(CC-based codon optimization) 또는 MOCO(multi-objective codon optimization)에 의한 것일 수 있다.
상기 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 MFLS(mating factor α prepro-leader sequence) 변이체를 포함하는 벡터는 추가로 피키아 파스토리아 유래의 TEF 프로모터(P TEF ) 및 이종 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다.
상기 이종 단백질은 분비 발현의 리포터 유전자에 의해 발현되는 목적 단백질인 재조합 단백질이며, 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래의 리파제 B 단백질인 CalB를 암호화하는 CalB14를 P. pastoris가 선호하는 코돈 사용 빈도(codon usage)에 따라 코돈 최적화한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터는 코돈 최적화된 염기서열을 가지는 MFLS(mating factor α prepro-leader sequence) 변이체, 프로모터 및 리포터 유전자들 또는 이의 단편들을 발현용 벡터에 통상적인 클로닝 방법(Sambrook et al, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.)에 따라 삽입하여 얻을 수 있다. 특히 유전자 컨스트럭트의 클로닝을 용이하게 하기 위해 삽입 전에 적절한 어댑터를 유전자 컨스트럭트에 연결할 수도 있다.
용어 "벡터", "발현벡터" 또는 "재조합 벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 상기 벡터는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 미생물 세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 통상의 기술 분야에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pACYC184 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
발현벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터 또는 TEF 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에 더 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 염화리튬 형질전환법(lithium chloride transformation method), DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 피키아 파스토리스의 분비 시그널인 MFLS 서열을 세 가지 코돈 최적화 방법(ICU, CC, ICU/CC)을 이용하여 피키아 파스토리스에 최적화된 MFLS 서열을 결정하였다 (서열번호 1, 2 및 3). 또한, 항시발현 프로모터인 TEF 프로모터, 상기 최적화된 MFLSICO, MFLScco 및 MFLSMOCO 서열 및 목표 단백질인 리파아제 B를 암호화하는 리포터 유전자 CalB14를 연결하여 벡터에 삽입한 뒤, 이를 피키아 파스토리스에 형질도입하여 재조합 단백질의 생산 및 분비 효율을 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 코돈 최적화한 MFLSICO, MFLScco 및 MFLSMOCO 서열 모두 재조합 단백질이 리파아제 B를 대조군보다 현저하게 발현 및 분비시키는 것을 알 수 있었다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 통상의 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> ICU , CC 및 MOCO 를 이용한 S. cerevisiae 유래 MFLS 의 P. pastoris 에 대한 코돈최적화
S. cerevisiae-유래 MFLS(mating factor α prepro-leader sequence)을 모델 시스템으로 선택하여 P. pastoris에 적용하였다. 발현 숙주인 P. pastoris에서 많이 발현된 유전자의 ICU 및 CC 분포(distribution)에 대하여 각각 코돈 최적화하기 위해 "Chung BKS, Lee DY: Computational codon optimization of synthetic gene for protein expression. BMC Systems Biology 2012, 6"에 기재된 코돈 최적화 프로그램을 이용하여 ICU-최적 서열을 위한 ICO 방법, CC-최적 서열을 위한 CC 방법 및 ICU-/CC-최적 서열을 위한 MOCO(multi-objective codon optimization) 방법으로 MFLSICO (서열번호 1), MFLSCCO (서열번호 2) 및 MFLSMOCO (서열번호 3)를 결정한 뒤, 바이오니아(Bioneer corp, 대한민국)에서 유전자를 합성하였다.
< 실시예 2> MFLS ICO , MFLS CCO 및 MFLS MOCO 의 적합성( fitness ) 계산
상기 <실시예 1>의 MFLSICO, MFLSCCO 및 MFLSMOCO의 적합성을 확인하기 위하여 ICU(individual codon usage) 빈도(frequency) k 1 (
Figure 112013054777918-pat00001
) 및 코돈 쌍의 CC(codon-pair context) 빈도 k 2 (
Figure 112013054777918-pat00002
)를 하기의 수학식 1 및 2와 같이 계산하였다:
Figure 112013054777918-pat00003
Figure 112013054777918-pat00004
Figure 112013054777918-pat00005
및
Figure 112013054777918-pat00006
는 코돈 k 1 및 코돈 쌍 k 2 의 각각의 수(occurrences of)를 각각 나타낸다.
Figure 112013054777918-pat00007
및
Figure 112013054777918-pat00008
는 k 1 및 k 2 에 의해 암호화되는 각각에 상응하는 아미노산 및 아미노산 쌍의 수를 나타낸다. 상기 수학식에서, k 1 → j 1 및 k 2 → j 2 는 코돈 k 1 이 아미노산 j 1을 암호화하고, 코돈 쌍 k 2 가 아미노산 쌍 j 2 을 암호화하는 것을 나타낸다. 첨자 변수(subscript) 0은 빈도가 숙주의 야생형(wild-type) 유전자 서열 발현에 기초하여 계산된 것을 나타낸다. 반면에 첨자 변수 1은 재조합 유전자의 빈도를 나타내기 위해 사용되었다. 상기 코돈 빈도의 정량에 기초하여, ICU 및 CC 적합도(fitness values)를 하기의 수학식 3 및 4와 같이 숙주의 빈도(host's frequencies) (
Figure 112013054777918-pat00009
및
Figure 112013054777918-pat00010
) 및 재조합 유전자의 빈도 (
Figure 112013054777918-pat00011
및
Figure 112013054777918-pat00012
) 사이의 맨하탄 거리(Manhattan distance)를 정규화하여 계산하였다:
Figure 112013054777918-pat00013
Figure 112013054777918-pat00014
아울러, ICU 및 CC 적합성의 multi-objective optimization을 비지배적 구분 유전자 알고리즘(nondominated sorting genetic algorithm) (NSGA-II)을 이용하여 수행하였다.
그 결과, MFLSICO 서열이 가장 높은 ICU 적합성 및 가장 낮은 CC 적합성을 가지고 있었으며, MFLSMOCO 서열은 중간의 ICU 및 CC 적합성의 가지고 있었고, MFLSCCO 서열은 가장 높은 CC 적합성 및 가장 낮은 ICU 적합성을 가지고 있었다 (도 1). 또한, 야생형과 상기 세 코돈-최적화된 MFLS 서열의 코돈 사용 패턴을 비교하여 도 2에 나타내었다 (도 2). 아울러, 코돈 변화에 의한 부수적인 G+C 함량은 MFLSICO는 44.71%, MFLSCCO는 43.92 % 및 MFLSMOCO는 44.71%로 비슷한 정도였다.
< 실시예 3> 코돈최적화한 MFLS ICO , MFLS CCO 및 MFLS MOCO 를 포함하는 CalB 발현 벡터 제작
MFLSICO, MFLSCCO 및 MFLSMOCO의 단백질 발현 효과를 확인하기 위하여 리파아제 유전자인 Candida antarctica 유래 lipase B14 (CALB14)를 리포터로 사용하였다. CALB14 구조유전자는 P. pastoris가 선호하는 코돈 사용 빈도(codon usage)에 따라 합성되었다. 야생형 및 세 가지 코돈-최적화된 MFLS들과 항시 발현 프로모터인 TEF 프로모터 (P TEF ) 및 CALB14를 하기 표 1의 프라이머 및 주형을 사용하여 PCR로 각각 증폭하였다. 그 후, 오버랩 PCR(overlap PCRs)을 수행하여 상기 P TEF , MFLS 및 CALB14을 연속적으로 포함하는 단편을 만들었다. 각각의 유전자들이 정렬된 상기 단편을 SmaⅠ/NotⅠ로 절단된 pPIC9 벡터 (Invitrogen, USA)에 infusion kit (Clontech, USA)를 이용하여 삽입하여, P TEF 제어하에 각각의 MFLS에 결합된 구조유전자인 CALB14가 위치하는 플라스미드가 제작되었다. 클로닝 및 상기 플라스미드를 유지하기 위해 E. coli DH5a(F , endA1 , hsdR17 (rK mK ), supE44 , thi -l, λ, recA1 , gyrA96 , 80d lacZDM15) 균주를 숙주로 이용하였다.
표적
유전자		 프라이머 서열 (5'-3') 주형 서열번호
P TEF forward AGTTATTATTCG CCCGGG ATAACTGTCGCCTCTTTTATC pTEF-AM-CLLip 4
reverse GTAAAGATAGATGGGAATCTCATGTTGGCGAATAACTAAAATG
(for fusion of MFLSCCO and MFLSMOCO)		 5
GTAAAGATAGATGGGAATCTCATGTTGGCGAATAACTAAAATG
(for fusion of MFLSICU)		 6
MFLS forward CATTTTAGTTATTCGCCAACATGAGATTCCCATCTATCTTTAC
(for MFLSCCO and MFLSMOCO), 		MFLS 7
CATTTTAGTTATTCGCCAACATGAGATTCCCAAGCATATTTAC
(for MFLSICU)		 8
reverse GAAAGCTGGGTCGGAACCGGATGGCAATCTCTTGTCCAAAGAAACACC 9
CALB14 forward GTGTTTCTTTGGACAAGAGATTGCCATCCGGTTCCGACCCAGCTTTC pGAL-MFa-CALB14 10
reverse CATGTCTAAGGCGAATTAATTC GCGGCCGC TTATGGAGTAACGATACCGGA 11
< 실시예 4> MFLS ICO , MFLS CCO 및 MFLS MOCO 를 포함하는 벡터의 단백질 분비 효과 확인
상기 <실시예 3>에서 제작한 각각의 MFLSICO, MFLSCCO 및 MFLSMOCO를 포함하는 벡터의 CalB 분비 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>에서 제작한 각각의 MFLSICO, MFLSCCO 및 MFLSMOCO를 포함하는 벡터와 대조군으로 야생형 MFLS 서열 (서열번호 12)을 포함하는 벡터를 각각 HIS4 유전자에 존재하는 단일 제한자리를 절단하는 StuI를 이용하여 절단한 뒤 P. pastoris GS115 [his4] (Invitrogen, USA) 유전자에 염화리튬 형질전환 방법(lithium chloride transformation method) (Invitrogen, USA)을 이용하여 통합시켰다. His- 아가 플레이트(리터당 20 g의 글리세롤, 아미노산이 없는 6.7 g의 yeast nitrogen base, 0.77 g의 His- DO supplement (BD Biosciences, USA) 및 20 g의 아가 포함)에서 형질전환체를 선별하였다. 선별한 각각의 형질전환체를 10 mL의 YPF 배지가 포함된 baffled 플라스크에 접종한 뒤 30 ℃에서 14hr 동안 배양하였다. 배양된 배양액 5 ml를 100 mL의 YPD가 들어있는 500 ml baffled 플라스크에 옮긴 뒤 30℃에서 48 hr 동안 배양하였다.
배양한 효모 세포들의 증가는 600 nm (OD600) (UVICON930, Switzerland)에서 세포밀도를 측정하여 관찰하였으며, 각각의 MFLSICO, MFLSCCO 및 MFLSMOCO에 의해 분비된 리파아제는 리파아제 활성을 측정하여 확인하였다. 리파아제 활성은 배양 상등액을 수득하여 효소의 작용에 의해 기질인 p-nitrophenyl palmitate (pNPP)로부터 방출되는 p-nitrophenol을 측정함으로써 결정되었다. 상기와 같이 측정된 리파아제 활성의 단위는 분당 방출되는 p-nitrophenol의 μmole로 정의하여 야생형 MFLS를 포함하는 P. pastoris (MFLSWT)로부터 분비되는 CalB와 비교되었다.
그 결과, 모든 세포들이 세포 밀도에서는 차이가 없었으나, CalB 효소 활성으로 유추되는 MFLS에 의한 CalB의 분비는 MFLSICO가 대조군의 2.32 배, MFLSMOCO가 3.41 배였으며, MFLSCCO가 대조군의 3.95 배로 가장 높았다 (표 2).
서열 세포 밀도1
(A600)		 CalB 활성2
(U/mL)		 정규화된 활성
(%)
Wild-type 12.2±0.4 3.03±0.20 100
MFLSICO 11.9±0.5 7.02±0.08 232
MFLSMOCO 12.4±0.2 10.33±0.20 341
MFLSCCO 11.9±0.3 11.97±0.09 395
1, 2세포 밀도 및 CalB 활성은 배양 48h 후에 측정되었다.
이와 같은 결과는 CC 적합성이 높은 서열일수록 in vivo에서 더 높은 발현을 나타낸다는 것을 의미한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> {Codon optimization for efficient secretion of recombinant proteins <130> p130177 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 255 <212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 1 atgagattcc caagcatatt tactgccgtg ttatttgctg cttcctctgc tttggcagct 60 ccagtcaaca caacaaccga ggatgaaact gctcaaattc ctgctgaggc cgttattggt 120 tactcagatt tggaaggaga ctttgatgtt gcagtccttc ctttcagtaa ttccaccaac 180 aatggactgc tattcatcaa cactaccatc gcctctattg ctgccaaaga agagggtgtt 240 tctttggaca agaga 255 <210> 2 <211> 255 <212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 2 atgagattcc catctatctt tactgccgtt ttgtttgctg cttcctctgc tttggcagct 60 ccagttaaca caactactga ggatgaaact gctcaaattc ctgctgaggc agttattggt 120 tactctgatt tggaaggtga ctttgatgtt gctgtcttgc ctttctctaa ctccaccaac 180 aacggtttgt tgttcatcaa cactaccatt gcctctattg ctgccaagga agagggtgtt 240 tctttggaca agaga 255 <210> 3 <211> 255 <212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 3 atgagattcc catctatctt tactgccgtg ttatttgctg cttcctctgc tttggcagct 60 ccagtcaaca caacaactga ggatgaaact gctcaaattc ctgctgaggc cgttattggt 120 tactctgatt tggaaggaga ctttgatgtt gctgtcttgc ctttctctaa ttccaccaac 180 aatggactgt tgttcatcaa cactaccatc gcctctattg ctgccaagga agagggtgtt 240 tctttggaca agaga 255 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEF forward primer <400> 4 agttattatt cgcccgggat aactgtcgcc tcttttatc 39 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEFreverse primer for fusion of MFLSCCO and MFLSMOCO <400> 5 gtaaagatag atgggaatct catgttggcg aataactaaa atg 43 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEFreverse primer for fusion of MFLSICU <400> 6 gtaaagatag atgggaatct catgttggcg aataactaaa atg 43 <210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFLS forward primer for MFLSCCO and MFLSMOCO <400> 7 cattttagtt attcgccaac atgagattcc catctatctt tac 43 <210> 8 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFLS forward primer for for MFLSICU <400> 8 cattttagtt attcgccaac atgagattcc caagcatatt tac 43 <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFLS reverse primer <400> 9 gaaagctggg tcggaaccgg atggcaatct cttgtccaaa gaaacacc 48 <210> 10 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALB14 forward primer <400> 10 gtgtttcttt ggacaagaga ttgccatccg gttccgaccc agctttc 47 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALB14 reverse primer <400> 11 catgtctaag gcgaattaat tcgcggccgc ttatggagta acgataccgg a 51 <210> 12 <211> 255 <212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 12 atgagatttc cttctatttt tactgctgtt ttattcgctg cttcctccgc tttagctgct 60 ccagtcaaca ctaccactga agatgaaacg gctcaaattc cagctgaagc tgtcatcggt 120 tactctgatt tagaaggtga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa ctccaccaat 180 aacggtttat tgtttatcaa tactactatt gcctccattg ctgctaaaga agaaggtgtt 240 tctttggata aaaga 255

Claims (10)

  1. 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 대하여 코돈 최적화된 MFLS(mating factor α prepro-leader sequence) 변이체로,
    상기 코돈 최적화된 MFLS는 CC(Codon-pair context)에 기반한 서열번호 2로 기재되는 MFLScco 서열인 것을 특징으로 하는 코돈 최적화된 MFLS 변이체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 MFLS는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 분비시그널인 것을 특징으로 하는 코돈 최적화된 MFLS 변이체.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 코돈 최적화된 MFLS 변이체들은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 코돈 최적화된 것을 특징으로 하는 코돈 최적화된 MFLS 변이체.
  7. 제 1항의 코돈 최적화된 염기서열을 가지는 MFLS(mating factor α prepro-leader sequence) 변이체를 포함하는 벡터를 효모에 형질전환하여 효모에서 이종 단백질을 고효율로 생산하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 코돈 최적화는 CCO(CC-based codon optimization)에 의한 것을 특징으로 하는 효모에서 이종 단백질을 고효율로 생산하는 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 효모에서 이종 단백질을 고효율로 생산하는 방법.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 벡터는 이종 단백질을 암호화하는 유전자 및 항시 발현 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 효모에서 이종 단백질을 고효율로 생산하는 방법.
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