JP6910358B2 - 酵母細胞 - Google Patents
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Description
うであるように、H.ポリモルファにおいて厳密に抑制されない;例えば、W.c.Raschkeら、Gene 177(1996):163〜167及びL.Rodriguezら、Yeast 12(1996):815〜822を参照されたい)ことが示されている。したがって、技術業界での現在の見解は、メチロトローフ酵母細胞間で異なるタイプの制御が存在するのは、プロモーター配列のためではなく、酵母細胞における異なる制御機構のためであるというものである(例えば、F.S.Hartnerら、Microb.Cell Fact 5(2006):39〜59を参照されたい)。しかしながら、驚くべきことに、メチロトローフ酵母細胞の(例えば、H.ポリモルファの)ギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)プロモーターの、抑制解除による強力な活性化は、例えばコマガタエラ・ファフィ等の他のメチロトローフ酵母細胞に移行し得るどころか、AOX1遺伝子及びCAT1遺伝子のもの等の強力な同種プロモーターの技術的特性さえも超えることが見出された。
配列番号1(FMDプロモーター):
X1はアデニン又はヌクレオチドなしであり、X2はアデニン又はグアニンであり、X3はシトシン又はチミンであり、X4はチミン又はグアニンであり、X5はアデニン又はシトシンであり、X6はグアニン又はシトシンであり、X7はアデニン又はシトシンであり、X8はグアニン又はシトシンであり、X9はアデニン、グアニン又はシトシンであり、X10はグアニン又はシトシンであり、X11はグアニン又はシトシンであり、X12はグアニン又はシトシンであり、X13はグアニン又はシトシンであり、X14はアデニン又はシトシンであり、X15はアデニン又はシトシンであり、X16はチミン又はシトシンであり、X17はグアニン又はシトシンであり、X18はグアニン又はシトシンであり、X19は、オルソロガスなプロモーターの、好ましくはFMD及び/又はMOXプロモーターのコアプロモーターであり、特に好ましいのは、
配列番号35(v1;実施例2を参照):
配列番号57(v23):
材料及び方法
プロモーターのクローニング
オルソロガスなプロモーターをPCRで増幅し、GFPレポーター遺伝子の前にクローニングした。そうするために、レポータープラスミドpPpT4mutZeoMlyI-intARG4-eGFP-BmrIstuffer(T.Voglら、ACS Synth Biol.2015,DOI:10.1021/acssynbio.5b00199;2015年11月22日に発表)。
酵素HRP及びCalB活性は、Krainer FW(Microb Cell Fact 11(2012):22)のプロトコールに従って、基質2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩(ABTS)及び酪酸p-ニトロフェニル(p-NPB)を用いて決定した。
HpFMD、HpMOX、CbFLDl、CbAODl、PmMODl及びPmMOD2遺伝子という6個の異種プロモーターをP.パストリスにおいて試験した。プロモーターを、P.パストリスにおいてメタノール誘導可能なAOX1プロモーター、構成的GAPプロモーター及び抑制解除/メタノール誘導可能なCAT1プロモーターと比較した。すなわちオルソロガスなプロモーターをゲノムDNA PCRによって増幅し、レポーター遺伝子としてGFPを有するベクター中でクローニングした。以下のプロモーター配列を使用した。
HpFMD(配列番号1):
FMDプロモーターバリアント
1.プロモーターのクローニング
配列番号1を有するFMDプロモーターを含むpPpT4mutZeoMlyI-intArg4-EGFP-P_FMD1を、プロモーターバリアントvOl〜v22のPCR増幅のための鋳型とした。点変異、挿入又は様々なコアプロモーターをFMDプロモーター配列に導入するように、プライマーを設計した。プロモーターバリアントを2つの部分に分けて増幅し、次いで、制限エンドヌクレアーゼSailで事前に切断したpPpT4mutZeoMlyI-intArg4-eGFP-P_FMDベクターの骨格とアセンブルした。プロモーターバリアントv23〜v25を作製するために、一方の部分だけをPCR増幅し、他方の部分は合成DNAとして注文した。この場合、この2つのDNA断片を、制限エンドヌクレアーゼNheIで事前に切断したpPpT4mutZeoMlyI-intArg4-eGFP-P_FMDベクターの骨格とアセンブルした。DNA断片とベクター骨格とのアセンブリのために、配列相同性に基づくアセンブリクローニングを使用し、プロモーターからレポーター遺伝子eGFPへシームレスに移行させた。
異なるプロモーターバリアントvOl〜v25を有するベクターを酵母中に形質転換するために、P.パストリスBg11ΔKU70株を使用した。野生型株と比較して、この株は2つの遺伝子ノックアウトを有する:1つ目は、非相同末端結合機構に関与するタンパク質をコードしているKU70遺伝子。この遺伝子をノックアウトすることによって、相同組み換え現象がP.パストリスにおいて起こる可能性はより高くなる。このことにより、ゲノム中の異なる組み込み遺伝子座による予期しない作用を避けるために、ベクターを規定の遺伝子座、この場合はARG4遺伝子座に標的化することが容易になる。2つ目のノックアウト遺伝子は、AOXl遺伝子(mutS/Bg11株)である。このノックアウト株を使用することによって、メタノール誘導可能なプロモーターの支配下で異種発現タンパク質のより高い収率を達成することができる(Krainer FWら、Microb.Cell Fact.ll(2012)p.22)。
試験したHpFMDプロモーター(P_FMD)及びAOX1プロモーター(P_AOX1)野生型配列プロモーターのレポータータンパク質蛍光の結果を、図4に示す。
Claims (14)
- 抑制解除によって誘導可能なメチロトローフ酵母細胞のオルソロガスなプロモーター又はそのバリアントを含むコマガタエラ属の酵母細胞であって、オルソロガスなプロモーターが、メチロトローフ酵母細胞のオルソロガスなギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)プロモーターであり、オルソロガスなプロモーターが、核酸配列配列番号1又はそのバリアントを含み、配列番号1のバリアントが、核酸配列配列番号27:
からなる群から選択される核酸配列である)を含む、酵母細胞。 - オルソロガスなプロモーターが、メタノールで誘導可能である、請求項1に記載の酵母細胞。
- オルソロガスなプロモーターが、異種又は同種のポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結している、請求項1又は2に記載の酵母細胞。
- 異種又は同種のポリペプチドが、シグナルペプチドを含む、請求項3に記載の酵母細胞。
- シグナルペプチドが、分泌シグナルペプチドである、請求項4に記載の酵母細胞。
- オルソロガスなプロモーターが、ハンゼヌラ属、カンジダ属、コマガタエラ属及びピキア属からなる群から選択されるメチロトローフ酵母細胞に由来する、請求項1から5のいずれか一項に記載の酵母細胞。
- メチロトローフ酵母細胞が、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、ピキア・メタノリカ、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィ、コマガタエラ・ポプリ、コマガタエラ・シュードパストリス及びコマガタエラ・ウルミからなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の酵母細胞。
- オルソロガスなプロモーター及びゲノム中の異種又は同種のポリペプチドをコードし、更に前記プロモーターに作動可能に連結した核酸分子が、ゲノム中に又は染色体外の核酸構築物として存在してもよい、請求項1から7のいずれか一項に記載の酵母細胞。
- 配列番号1のバリアントが、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55及び配列番号56からなる群から選択される、核酸配列を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の酵母細胞。
- 配列番号1のバリアントが、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号44、配列番号51、配列番号52、配列番号54、配列番号55及び配列番号56からなる群から選択される、核酸配列を含む、請求項9に記載の酵母細胞。
- 配列番号1のバリアントが、配列番号35、配列番号39、配列番号44、配列番号51、配列番号52、配列番号54、配列番号55及び配列番号56からなる群から選択される、核酸配列を含む、請求項10に記載の酵母細胞。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載の酵母細胞を培養する工程を含む、異種ポリペプチドを製造するための方法。
- 培養する工程の間、抑制解除条件によって異種ポリペプチドの発現が誘導される、又はその発現率が増加する、請求項12に記載の方法。
- 培養する工程の間、抑制解除条件下でメタノール又は代替の誘導物質が添加される、請求項12に記載の方法。
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