KR20180088733A - 효모 세포 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 억제해제에 의한 유도형 메탄올자화 효모 세포의 이종상동성 프로모터 또는 그것의 변이체를 포함하는 코마가타엘라 속의 효모 세포에 관한 것으로서, 상기 이종상동성 프로모터는 메탄올자화 효모 세포의 이종상동성 포르메이트 탈수소효소(FMD) 프로모터이다.
Description
본 발명은 효모 세포에서 이종상동성 프로모터의 사용에 관한 것이다.
바이오의약품(biopharmaceuticals)이나 산업적으로 관련된 바이오촉매(bio-catalysts)와 같은 재조합 단백질은 대부분 흔히 미생물에서 이종성 유전자 발현에 의해 생성된다. 에스체리키아 콜리(Escherichia coli), 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 사상성 진균(filamentous fungi)이 재조합 단백질 생산을 위해서 오랫동안 주로 사용되었다. 지난 이십 여년 동안 메탄올자화 효모인 코마가타엘라(피치아) 파스토리스(Komagataella ( Pichia ) pastoris), 코마가타엘라(피치아) 파피(Pp)(Komagataella ( Pichia ) phaffii ( Pp )), 코마가타엘라 쿠르츠만니(Komagataella Kurtzmanii), 오가타에아(한세뉼라) 폴리모르파(Hp)(Ogataea (Hansenula) polymorpha (Hp)), 칸디다 보이디니(Cb)(Candida boidinii ( Cb )) 및 오가타에아(피치아) 메탄올리카(Pm)(Ogataea ( Pichia ) methanolica ( Pm ))이 유효한 대체 생산 균주로서 확립되었다. 이들 균주는 높은 세포 밀도로 이종성 단백질에 대해 높은 발현 비율의 달성을 가능하게 한다. 한편, 상술된 4가지 효모 종들 중 P. pastoris(코마가타엘라 파피)가 이종성 단백질 생산을 위해 가장 흔히 사용되었다.
모든 메탄올자화 효모(methylotrophic yeasts)는 메탄올 활용(methanol utilization, MUT)의 유전자 발현의 조절에 수반되는 엄격히 조절되는 강한 프로모터를 가진다. 메탄올 활용의 유전자 프로모터는 글루코오스와 같은 억제성 탄소원에서는 일반적으로 억제되고, 탄소원으로서 메탄올이 존재할 때는 상당히 상향조절된다. 억제성 탄소원이 고갈되거나 비억제성 탄소원이 존재한다면 이 프로모터는 억제해제에 의해 활성화되며, 따라서 이 효과의 강도는 종마다, 심지어 같은 유기체 안에서도 상당히 가변적이다. P . pastoris GS115에서 알코올 옥시다아제-1-유전자의 프로모터(PPpAOX1)는, 예를 들어 메탄올-유도 조건과 비교하여 억제해제 조건에서 단지 2-4%의 활성을 가진다. 반면에, H. polymorpha에서 이종상동성 유전자(메탄올 옥시다아제, MOX)의 프로모터(PHpMOX)는 메탄올-유도 조건과 비교하여 억제해제 조건에서 최대 70%의 활성을 가진다. 또한, C. boidinii(알코올 옥시다아제 1, AOD1)와 P. methanolica(메탄올 옥시다아제 1/2, MOD1/2)에서 이종상동성 유전자의 프로모터는 비슷한 거동을 가진다.
독성이며 인화성인 메탄올을 사용한 발현의 유도는 작업상 안전 문제 때문에 대규모 산업에서 특히 바람직하지 않으므로, 강하게 억제해제된 프로모터가 유력한 대체제가 된다. 따라서, 상이한 억제해제 특성을 가진 PPpAOX1 변이체, 대체 프로모터 및 신규 MUT 프로모터가 최근 개발되어 산업적 규모의 메탄올-무함유 단백질 발현을 가능하게 했다. 이러한 프로모터의 발현 비율은 메탄올-유도 프로모터와 비교하여 일반적으로 훨씬 더 낮기 때문에, 본 발명의 한 가지 목적은 P. pastoris와 같은 효모에서 재조합 단백질의 강한 유도형 메탄올-무함유 과발현의 확률을 높이기 위한 것이다.
이 목적은 억제해제에 의해 유도될 수 있는 메탄올자화 효모 세포의 이종상동성 프로모터 또는 그것의 변이체를 포함하는 코마가타엘라 속의 효모 세포에 의해 달성되며, 상기 이종상동성 프로모터는 메탄올자화 효모 세포의 이종상동성 포르메이트 탈수소효소(FMD) 또는 메탄올 옥시다아제(MOX) 프로모터이다. 이 과정에서, 메탄올자화 효모 세포에서의 이종상동성 프로모터는 억제해제 조건하에 폴리펩타이드의 발현을 제어할 수 있다.
또한, 이 목적은 메탄올자화 효모 세포의 이종상동성 포르메이트 탈수소효소(FMD) 프로모터 및/또는 메탄올 옥시다아제(MOX) 프로모터 또는 이들 두 프로모터의 변이체를 포함하는 코마가타엘라(피치아) 속의 효모 세포를 사용하여 달성되며, 상기 코마가타엘라 속의 효모 세포에서 이종상동성 프로모터의 원래 조절 프로파일이 보유된다.
놀랍게도, 바람직하게는 코마가타엘라(피치아) 속에 속하지 않는 다른 메탄올자화 효모 세포에서 억제해제 조건하에 폴리펩타이드의 발현을 제어할 수 있는 프로모터는 코마가타엘라(피치아) 속의 효모 세포에서 억제해제 조건하에 폴리펩타이드의 발현을 제어할 수 있고(예를 들어, 비억제해제 조건과 비교하여 발현을 증가시킴), 또한 비슷한 특성을 가진다는 것이 발견되었다.
또한, 놀랍게도 코마가타엘라 속의 효모 세포 및/또는 동일한 효모 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 메탄올자화 효모 세포의 포르메이트 탈수소효소(FMD) 프로모터 및/또는 메탄올 옥시다아제(MOX) 프로모터는 이러한 세포에서 특별한 특성을 가진다는 것이 판명되었다. 이종상동성 FMD 및/또는 MOX 프로모터는 메탄올 활용 ("MUT 프로모터")의 유전자 발현의 조절에 수반되며 지금까지 시험된 모든 자연 발생 프로모터 및 코마가타엘라보다 억제해제 조건과 메탄올-유도 조건하에서 코마가타엘라 세포에서 유의하게 더 강하다. 따라서, 이종상동성 FMD 및/또는 MOX 프로모터는, 예를 들어 코마가타엘라 세포에서 자연 발생한 CAT1 및 GAP 프로모터보다 억제해제 조건에서 유의하게 더 강하다. 이종상동성 FMD 및/또는 MOX는 놀랍게도 심지어 메탄올-유도 조건하에 사용된 AOX 프로모터보다 억제해제 조건하에 사용된 스크리닝 조건하의 메탄올-유도 조건에서 코마가타엘라에서 자연 발생한 AOX(AOX1 및 AOX2) 프로모터만큼이나 강하다. 이러한 효과는 일반적으로 생물반응기 실험에서 제어된 C-공급원 용량하에 강화될 수 있다. 이종상동성 FMD 및/또는 MOX 프로모터는 코마가타엘라에서 일반적으로 사용되는 AOX 프로모터를 대체할 수 있다. 이 방식에서, 종래의 메탄올-유도 발현 시스템과 비교하여 본질적으로 동일하거나 심지어 더 높은 단백질 발현 수율이 유도제로서 메탄올을 사용하지 않고 달성될 수 있다. 놀랍게도, 메탄올자화 효모 세포(예를 들어, H. polymorpha)의 포르메이트 탈수소효소(FMD)는 이 효모 세포(예를 들어, H. polymorpha)에서 또한 유의하게 억제해제되며, 다른 메탄올자화 효모 세포(예를 들어, P. pastoris)에서도 이 조절 프로파일을 보유한다. 반면에, 초기 연구들은 메탄올자화 효모들 간 프로모터의 전달시 외래 프로모터의 조절 프로파일은 전달되지 않는다는 것을 밝혀냈다(예를 들어, P. pastoris AOX1 프로모터는 그것이 P. pastoris에서 자연적으로 그런 만큼 H. polymorpha에서 엄격히 억제되지 않는다; W. C. Raschke et al. Gene 177 (1996):163-167 및 L. Rodriguez et al. Yeast 12 (1996):815-822 참조). 따라서, 당업계에서는 현재 메탄올자화 효모 세포들 간의 상이한 조절 타입은 프로모터 서열로 인해서 발생하는 것이 아니라 효모 세포에서의 상이한 조절 메커니즘으로 인한 것이라는 것이라고 한다(F. S. Hartner et al. Microb. Cell Fact 5(2006):39-59 참조). 그러나, 놀랍게도 억제해제로 인한 메탄올자화 효모 세포(예를 들어 H. polymorpha)의 포르메이트 탈수소효소(formate dehydrogenase, FMD) 프로모터의 강한 활성화는, 예를 들어 코마가타엘라 파피와 같은 다른 메탄올자화 효모세포로 전달될 수 있을 뿐만 아니라, 심지어 AOX1 유전자 및 CAT1 유전자의 경우와 같이 강한 상동성 프로모터의 기술적 특성을 초과하기도 한다는 것이 발견되었다.
이종상동성 프로모터 서열의 사용은 또한 다른 기술적 이점을 가진다. 예를 들어, 이들의 사용에 의해 상동성 재조합의 확률이 감소되고, 그 결과 발현 균주의 유전적 안정성이 더 높아진다.
"코마가타엘라 속의 효모 세포"는 코마가타엘라 쿠르츠만니, 코마가타엘라 파스토리스, 코마가타엘라 파피, 코마가타엘라 포푸리, 코마가타엘라 슈도파스토리스, 코마가타엘라 율미 및 코마가타엘라 sp. 11-1192와 같은 이 속의 모든 효모 세포를 포함한다. "코마가타엘라 속의 효모 세포"는 또한 상기 언급된 속의 특정 균주, 예컨대 코마가타엘라 파스토리스 GS115, X-33, KM71, KM71H, CBS7435 또는 NRLL Y11430, CBS704, BG10, BG11 및/또는 이들 균주의 다른 유도체로부터의 것들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "이종상동성"은 상이한 종들로부터의 핵산 또는 아미노산 분자를 말하며, 이들은 적어도 다른 종의 상응하는 핵산 및 아미노산 분자와 기능적 상동성을 가진다. "이종상동체"는 생식으로 인해 발생하며 또한 공통 조상으로부터 유래된 상이한 유기체로부터 나온다.
"이종상동체"의 서열은 서로 유의한 변화는 있을 수 있지만 그것의 생물학적 및/또는 생화학적 기능은 일반적으로 영향을 받지 않는다(예를 들어, 코마가타엘라 파스토리스로부터의 AOX는 한세뉼라 폴리모르파로부터의 MOX와 이종상동성이며 그 반대도 가능하고, 한세뉼라 폴리모르파로부터의 FMD는 코마가타엘라 파스토리스의 FDH1과 이종상동성이며 그 반대도 가능하다).
본 명세서에서 사용된 용어 "프로모터"는 핵산 중합효소 복합체와 추가의 뉴클레오타이드에 대한 결합 부위인 적어도 하나의 전사 개시 시작 부위를 포함하며, 이로써 이들 두 요소는 기능적으로 활성화될 수 있고, 코마가타엘라 속의 효모 세포에서 이종상동성 프로모터의 시작 세포의 원래 조절 프로파일을 보유할 수 있다. 이들 추가의 뉴클레오타이드는, 예를 들어 전사 인자 결합 부위를 형성할 수 있다. "억제해제에 의해 유도가능한 프로모터(promoter inducible by depression)"는 억제해제 조건하에(아래 참조) 활성화되는 프로모터이고, 이로써 그것에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자가 전사됨으로써 이종성 또는 상동성 폴리펩타이드를 코딩하게 된다.
본 발명에 따른 이종상동성 프로모터, 즉 이종상동성 FMD 및/또는 MOX 프로모터는 바람직하게 프로모터를 포함하며 단백질/폴리펩타이드를 코딩하는 상응하는 유전자의 영역, 바람직하게는 1 내지 1000, 바람직하게 1 내지 900, 더욱더 바람직하게 1 내지 800개 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는 FMD 및/또는 MOX를 코딩하는 FMD 및/또는 MOX 유전자의 영역의 (5' 단부로부터 상류에서) 시작 코돈 앞의 영역으로부터 50 내지 2000, 더욱더 바람직하게 100 내지 1000, 더욱더 바람직하게 150 내지 800개 뉴클레오타이드를 포함한다. 이종상동성 프로모터, 바람직하게 이종상동성 FMD 및/또는 MOX 프로모터는 바람직하게 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 영역, 바람직하게는 FMD 및/또는 MOX를 코딩하는 FMD 및/또는 MOX 유전자의 영역의 5' 단부로부터 상류에서 1 내지 1000, 바람직하게 1 내지 900, 더욱더 바람직하게 1 내지 800개 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 이종상동성 프로모터, 바람직하게 이종상동성 포르메이트 탈수소효소(FMD) 프로모터 및/또는 메탄올 옥시다아제(MOX) 프로모터의 "변이체(varints)"는 자연 발생 이종상동성 프로모터, 바람직하게 이종상동성 FMD 및/또는 MOX 프로모터와 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50)의 뉴클레오타이드에 차이가 있는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 프로모터 변이체는 자연 발생 프로모터의 상응하는 영역과 적어도 80%, 바람직하게 적어도 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 98% 동일하다.
본 발명에 따라서 사용될 수 있는 이종상동성 프로모터의 변이체는 자연 발생 프로모터, 바람직하게 FMD 및/또는 MOX 프로모터와 비교하여 결실, 치환 및 삽입을 포함할 수 있다. 프로모터의 변이체는 또한 억제해제 조건하에 단백질의 발현을 가능하게 하는 특성을 가진다. 자연 발생 이종상동성 프로모터, 바람직하게 이종상동성 FMD 프로모터 및/또는 이종상동성 MOX 프로모터를 포함하는 코마가타엘라 속 효모 세포에 의해 발현될 수 있는 단백질의 양의 적어도 50%, 바람직하게 적어도 60%, 더욱더 바람직하게 적어도 70%, 더욱더 바람직하게 적어도 80%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 100%, 더욱더 바람직하게 적어도 120%, 더욱더 바람직하게 적어도 150%를 억제해제 조건하에 발현할 수 있는 변이체가 바람직하게 사용된다.
프로모터 변이체를 확인하고 생성하는 방법은 충분히 잘 알려져 있다. 돌연변이가 일반적으로 프로모터에 도입된 결과, 프로모터 변이체의 특성(예를 들어, 모델 단백질의 발현 비율)이 변하는지의 여부와 어떻게 변하는지를 나타내는 시험이 수행된다.
본 발명의 이종상동성 프로모터, 바람직하게 이종상동성 포르메이트 탈수소효소(FMD) 프로모터 및/또는 이종상동성 메탄올 옥시다아제(MOX) 프로모터의 "변이체"는 또한 자연 발생 이종상동성 프로모터 또는 상기 정의된 그것의 변이체(자연 발생 서열과 하나 이상의, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 뉴클레오타이드에 차이가 있는)의 조절 요소를 포함하는 프로모터 변이체 및 대용 최소 프로모터 및/또는 코어 프로모터를 포함한다. 최소 프로모터 및/또는 코어 프로모터는 전사에 필요한 일반적인 프로모터 요소(TATA 박스 및 전사 시작부)만을 함유하는 프로모터의 일부분이다. 따라서, 본 발명에 따른 이종상동성 프로모터의 변이체의 조절 요소는 바람직하게 시작 코돈의 상류(5' 단부로부터의 상류) 영역으로부터 100 내지 1000, 바람직하게 150 내지 800개 뉴클레오타이드를 포함하고, 전사 시작점 바로 앞에서는 20 내지 200, 바람직하게 25 내지 80, 더욱더 바람직하게 30 내지 70개 뉴클레오타이드가 부재한다.
"동일성" 및 "동일한"은 각각 서열들 간 상응에 의해 결정될 수 있는 둘 이상의 핵산 및/또는 아미노산 서열 사이의 상응하는 정도를 말한다. "동일성"의 퍼센트는 갭이나 다른 서열 속성들을 고려하여 둘 이상의 서열에서 동일한 영역의 퍼센트로부터 유도된다(즉, 동일성 %는 동일 위치의 수/위치의 총수 x 100을 말한다). 동일성을 결정하는 특히 바람직한 방법은 National Centre for Biotechnology Information(NCBI)의 BLAST 프로그램이다(S. Alt-schul et al., J Mol Biol 215(1990):403-410 참조). BLOSUM62 알고리즘은 바람직하게 "갭" "이그지스턴스": 11 및 "익스텐젼": 1의 변수와 함께 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "메탄올자화 효모 세포"는 탄소원으로서 오직 하나의 탄소 원자를 가진 물질, 예를 들어 메탄올을 함유하는 배양 배지에서 성장할 수 있는 효모 세포를 포함한다.
본 발명에 따라서 효모 세포를 배양할 때 사용되는 "억제해제 조건"은 효모 세포가 먼저 억제성 탄소원(예를 들어, 글루코오스)의 존재하에 이 탄소원이 대부분 또는 완전히 소모될 때까지 배양된다는 것을 의미한다. 억제성 탄소원(예를 들어, 글루코오스)의 농도를 감소시킨 후, 세포는 억제성 탄소원 및 글루코오스에 대해 억제해제 조건에 놓인다. 억제 효과의 강도는 탄소원의 종류에 따를 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따라서, 이종상동성 FMD 및/또는 이종상동성 MOX 프로모터는 이종성 또는 상동성 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된다.
이종상동성 프로모터는 이종성(코마가타엘라로부터 기원하지 않는) 또는 상동성(코마가타엘라로부터 기원하는) 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 따라서 이 폴리펩타이드의 발현에 영향을 미치고 및/또는 그것을 제어할 수 있다. 얻어진 폴리펩타이드는 적어도 5, 바람직하게 적어도 10, 더욱더 바람직하게 적어도 50개 아미노산 잔기를 포함하며, 따라서 폴리펩타이드나 단백질 분자를 포함한다.
핵산 분자는 바람직하게 항체 또는 그것의 단편과 같은 폴리펩타이드, 효소, 구조 단백질 등을 코딩한다.
본 명세서에서 사용된 "작동 가능하게 연결된"은 이종성 또는 상동성 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자가 본 발명에 따라서 효모 세포에서의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 프로모터에 연결된다는 것을 의미한다. 따라서, 프로모터는 그것이 코딩 서열의 전사에 대해 영향력을 가질 때 코딩 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라서, 이종성 또는 상동성 폴리펩타이드는 신호 펩타이드, 특히 분비 신호 펩타이드를 포함한다.
효모 세포로부터 재조합 상동성 또는 이종성 폴리펩타이드를 분비하기 위해, 핵산 분자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드는 신호 펩타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "신호 펩타이드"는 폴리펩타이드의 분비를 제어하는, 폴리펩타이드의 C-말단 또는 N-말단에 연결된 펩타이드를 말한다. 본 발명에서 사용된 신호 서열은 소포체(ER)의 막을 통해서 단백질의 수송을 개시하는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 이들 신호 서열의 핵산 서열은 원래 숙주 세포의 천연 서열에 상응할 수 있거나, 또는 코돈-최적화될 수 있다. 신호 서열의 비제한적 예들은 MF-알파("짝짓기 인자 알파" 신호 서열), 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei)로부터의 CBH2 단백질의 신호 서열, 써모미세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus )로부터의 자일라나아제 A의 신호 서열, K1 킬러 독소 신호, 인베르타아제 분비를 위한 신호 펩타이드, 클루이베로미세스 락티스(Kluyve- romyces lactis )로부터의 킬러 독소의 신호 서열, 피치아 아카시아에(Pichia aca -ciae)로부터의 킬러 독소의 신호 서열, 한세니아스포라 유바룸(Hanseniaspora uva -rum) 및 피치아(한세뉼라) 아노말라(Pichia(Hansenula) anomala )로부터의 킬러 독소의 신호 서열 또는 이들의 변이체들을 포함하며, 이들은 예를 들어 Cereghino et al.(Gene 519 (2013):311-317)에서 설명된다. 본 발명의 바람직한 신호 서열은 MF-알파("짝짓기 인자 알파" 신호 서열)이다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 실시형태에 따라서, 이종상동성 FMD 프로모터 및/또는 이종상동성 MOX 프로모터는 한세뉼라(오가타에아), 칸디다, 코마가타엘라 및 피치아 속으로 구성되는 군으로부터 선택된 메탄올자화 효모 세포로부터 기원한다.
본 발명에 따른 다른 바람직한 실시형태에서, 메탄올자화 효모 세포는 한세뉼라 폴리모르파, 칸디다 보이디니, 피치아 메탄올리카, 코마가타엘라 파스토리스, 코마가타엘라 파피, 코마가타엘라 슈도파스토리스, 코마가타엘라 율미 및 코마가타엘라 sp. 11-1192로 구성되는 군으로부터 선택된다.
이종상동성 FMD 및/또는 MOX 프로모터 및 선택적으로 이종성 또는 상동성 폴리펩타이드를 코딩하는, 그것에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자는 자체 복제 서열(ARS)을 가진 플라스미드 상의 염색체외 핵산 구성물로서 또는 게놈에 통합된 벡터/발현 카세트로서 게놈에 존재할 수 있다.
이종상동성 FMD 및/또는 MOX 프로모터 및 선택적으로 그것에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자는 본 발명에 따라서 효모 세포의 게놈에 염색체외 존재하거나 통합될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에 따라서, 이종상동성 프로모터는 SEQ ID No. 1 또는 SEQ ID No. 2의 핵산 서열 또는 그것의 변이체를 포함하거나 그것으로 구성된다.
SEQ ID No. 1 (FMD 프로모터):
SEQ ID No. 2 (MOX 프로모터):
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에 따라서, SEQ ID No. 1의 변이체는 SEQ ID No. 27을 포함하거나 그것으로 구성된다. SEQ ID No. 27은 다음의 핵산 서열을 가진다:
여기서 X1은 아데닌이거나 뉴클레오타이드가 없고, X2는 아데닌 또는 구아닌이고, X3은 시토신 또는 티민이고, X4는 티민 또는 구아닌이고, X5는 아데닌 또는 시토신이고, X6은 구아닌 또는 시토신이고, X7은 아데닌 또는 시토신이고, X8은 구아닌 또는 시토신이고, X9는 아데닌, 구아닌 또는 시토신이고, X10은 구아닌 또는 시토신이고, X11은 구아닌 또는 시토신이고, X12는 구아닌 또는 시토신이고, X13은 구아닌 또는 시토신이고, X14는 아데닌 또는 시토신이고, X15는 아데닌 또는 시토신이고, X16은 티민 또는 시토신이고, X17은 구아닌 또는 시토신이고, X18은 구아닌 또는 시토신이고, X19는 이종상동성 프로모터, 바람직하게 FMD 및/또는 MOX 프로모터의 코어 프로모터이며, 특히 바람직한 핵산 서열은
TATAAATAC-CGCCTCCTTGCGCTCTCTGCCTTCATCAATCAAATC(SEQ ID No. 28),
TATA-TAAACTGGTGATAATTCCTTCGTTCTGAGTTCCATCTCATACTCAAACTATATTAAAAC-TACAACA(SEQ ID No. 29),
TATAAATACAAGACGAGTGCGTCCTTTTCTA-GACTCACCCATAAACAAATAATCAATAAAT(SEQ ID No. 30),
TATAAATACTGCC-TACTTGTCCTCTATTCCTTCATCAATCACATC(SEQ ID No. 31),
CGATAGGG-CAGAAATATATAAAGTAGGAGGTTGTATACCAAATATACCAACGCAGTACAAGCAACTCTT-GGTTTAAACGGAAGAAACAATTCTTCGAACATTTACAACAAAGAAGGTACCGTAACATTAA-TAATCGGAAGGGT (SEQ ID No. 32),
GTAATCTTTCGGTCAATTGTGATCTCTCTT-GTAGATATTTAATAGGACGGCCAAGGTAGAAAAAGATACATAACTAGTTAG-CAAACTTCAATTGCTTAAGTTACAAGTGCAATCCATATCTTAAAGTTATTACATTATTTATA(SEQ ID No. 33) 및
CCTCCTCTAGGTTTATCTATAAAAGCTGAAGTCGTTA-GAATTTTTCATTTAAAGCATAATCAAACATCTAGATTCGAATCGATAAAAAGCAGATA-GAAGTTATTAAGATTATAGGTTACATTCTAGAGTAGTATAGGAAGGTA(SEQ ID No. 34)로 구성되는 군으로부터 선택되고, 특히 SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30 및 SEQ ID No.31, 특히 SEQ ID No. 28이다. SEQ ID No. 27에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 SEQ ID No. 1의 상응하는 위치에서 상이하며, 그 결과 SEQ ID No. 1의 변이체가 된다.
놀랍게도, SEQ ID No. 1에서 적어도 하나의, 바람직하게 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 점 돌연변이(삽입 및/또는 치환)(SEQ ID No. 27 참조)는 SEQ ID No. 1로 구성되거나 그것을 포함하는 프로모터 영역과 비교하여 월등한 효과를 나타내는 프로모터 변이체를 야기한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 이러한 프로모터를 포함하는 효모 세포는 SEQ ID No. 1로 구성된 프로모터를 지닌 효모 세포와 비교하여 적어도 배양의 최초 24시간 내에 적어도 동일한 또는 심지어 증가된 발현 비율을 나타낸다. 따라서, X1 내지 X18 및 X1 내지 X19로서 그것의 상응하는 핵산 서열 SEQ ID No. 27에서 나타낸 위치 중 하나 이상에서 SEQ ID No. 1을 변형시키는 것이 특히 바람직하다.
SEQ ID No. 1과 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가져오는 SEQ ID No. 27의 뉴클레오타이드 X1, X3, X4, X5, X9, X16 및 X17 중 하나 이상의(2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 돌연변이는 이러한 프로모터가 또한 억제해제 조건에서 48시간 배양 후 SEQ ID No. 1의 사용과 비교하여 증가된 폴리펩타이드 및 단백질 발현을 나타내기 때문에 바람직하다.
특히 바람직한 것은 SEQ ID No. 1과 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가져오는 SEQ ID No. 27의 뉴클레오타이드 X1, X4, X9, X16 및 X17 중 하나 이상의(2, 3, 4 또는 5) 돌연변이이며, 이러한 프로모터는 또한, 예를 들어 탄소원으로서 메탄올을 사용하여 72시간 배양 후에 SEQ ID No. 1의 사용과 비교하여 증가된 폴리펩타이드 및 단백질 발현을 나타낸다.
상기 언급된 대로, SEQ ID No. 27의 X19는 SEQ ID No. 1에서 자연 발생하는 코어 프로모터(즉, TATAAATAC-CGCCTCCTTGCGCTCTCTGCCTTCATCAATCAAATC(SEQ ID No. 28)) 또는 대체 코어 프로모터일 수 있다. 특히 바람직한 코어 프로모터는 SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30 및 SEQ ID No. 31을 포함하거나 그것으로 구성된다. 이들 코어 프로모터는 모두 SEQ ID No. 1 또는 SEQ ID No. 27과 조합해서(자연 발생 코어 프로모터는 SEQ ID No. 27의 위치 X19에서 이들 대체 코어 프로모터 중 하나로 치환된다), 억제해제 조건하에 SEQ ID No. 1에 의해 암호화된 프로모터와 비교하여 유의하게 증진된 폴리펩타이드 발현 비율을 나타낸다.
SEQ ID No. 1의 특히 바람직한 변이체는 다음의 핵산 서열로 구성되는 군으로부터 선택된다:
SEQ ID NO. 35 (v1; 실시예 2 참조):
SEQ ID NO. 36 (v2):
SEQ ID NO. 37 (v3):
SEQ ID NO. 38 (v4):
SEQ ID NO. 39 (v5):
SEQ ID NO. 40 (v6):
SEQ ID NO. 41 (v7):
SEQ ID NO. 42 (v8):
SEQ ID NO. 43 (v9):
SEQ ID NO. 44 (v1O):
SEQ ID NO. 45 (v11):
SEQ ID NO. 46 (v12):
SEQ ID NO. 47 (v13):
SEQ ID NO. 48 (v14):
SEQ ID NO. 49 (v15):
SEQ ID NO. 50 (v16):
SEQ ID NO. 51 (v17):
SEQ ID NO. 52 (v18):
SEQ ID NO. 53 (v19):
SEQ ID NO. 54 (v20):
SEQ ID NO. 55 (v21):
SEQ ID NO. 56 (v22):
억제해제 하에 감소된 발현 비율을 나타내는 SEQ ID No. 1로 구성되거나 그것을 포함하는 FMD 프로모터의 변이체는 다음의 서열을 포함하거나 그것으로 구성된다:
SEQ ID NO. 57 (v23):
SEQ ID NO. 58 (v24):
SEQ ID NO. 59 (v25):
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따라서, SEQ ID No. 1의 변이체는 SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 55 및 SEQ ID No. 56로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 이종성 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다.
이종상동성 FMD 및/또는 MOX 프로모터를 포함하는 본 발명에 따른 효모 세포는 상동성 또는 이종성 폴리펩타이드의 과발현에 특히 적합하다. 이러한 뛰어난 특성으로 인해, 본 발명에 따른 효모 세포를 사용하여 억제해제 조건에서뿐만 아니라 메탄올-유도 조건 또는 적합한 다른 유도 조건에서 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 발현하고 선택적으로 세포로부터 그것을 분비시키는 것이 가능하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따라서, 배양하는 동안 이종성 폴리펩타이드의 발현은 억제해제 조건하에 유도되거나 또는 그것의 발현 비율이 증가된다.
프로모터 억제해제는 억제성 탄소원(탄소 공급원: 예를 들어, 글루코오스, 글리세롤)의 감소된 공급 비율 또는 비억제성 탄소 공급원(예를 들어, 소르비톨)의 사용에 의해 달성될 수 있다. 억제성 탄소 공급원은 직접 억제를 통해서 또는 탄소 공급원의 대사물질의 억제성 특성을 통해서 그것의 특성을 달성할 수 있다. 억제성 탄소 공급원의 공급 비율은 극단적인 경우 0에 근접할 수 있다. 지방산, 포름알데하이드 또는 포름산과 같은 다른 성분으로 인한 추가적인 유도 효과도 또한 가능하다.
배양 동안 및/또는 그것의 발현 동안 단백질 수율을 증가시키기 위해 억제해제 조건하에 배양하는 동안 메탄올이 바람직하게 첨가된다.
당업자는 온도, 배지 등과 같은 일반적인 배양 조건에 충분히 익숙하다(예를 들어, Krainer FW et al . Microbial Cell Factories 11 (2012):22 참조).
본 발명은 다음의 도면 및 실시예에 기초하여 더 상세히 설명될 것이지만 이들은 본 발명을 제한하지는 않는다.
도 1은 녹색 형광 단백질을 코딩하는 핵산이 이종상동성 및 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코마가타엘라 속의 배양한 효모 세포에서의 녹색 형광 리포터 단백질(녹색 형광 단백질(GFP)의 개선된 변이체)의 형광 강도를 나타낸다. 이종상동성 프로모터(및 참고로서 P. pastoris로부터의 내인성 프로모터)는 GFP 리포터 유전자에 작동가능하게 연결되었고 P. pastoris에서 벡터로서 형질전환되었다. 이 균주는 96개의 깊은 웰을 가진 마이크로타이터 플레이트(딥 웰 플레이트(DWP))에서 최소 배지(BMD1) 상에서 60시간 동안 배양된 다음 메탄올로 유도되었다. 글루코오스-억제 조건(16h), 억제해제 조건(60h) 및 메탄올 유도 후 다양한 시점에서 리포터 단백질의 형광 및 OD600(바이오매스의 척도로서)이 측정되었다. 형광 측정치는 OD600 값에 대해 정규화되었다. 4개의 형질전환체의 평균 및 표준편차가 도면에 각각 제시된다.
도 2는 시간에 따른 단백질 발현의 측정치를 나타낸 곡선을 도시한다. 도 1로부터 선택된 균주는 진탕 플라스크에서 배양되었다. 단백질 형광(도 2a; 비율 RFU/D600; RFU = 상대적 형광 단위)과 함께 OD600(도 2b) 및 글루코오스의 양(도 2c)이 시간에 따라 측정되었다. 측정을 시작할 때 글루코오스 농도는 55.5mM(10 g/L)였다. 3개의 형질전환체의 평균(MV) 및 표준편차가 각각 제시된다.
도 3A 내지 3C는 이종상동성 HpFMD 프로모터가 또한 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)(도 3A), 칸디다 앤타르티카(CalB)로부터의 리파아제 B(도 3B) 및 매니호트 에스큘렌타(manihot esculenta)(MeHNL)로부터의 하이드록시니트릴 리아제(도 3C)와 같은 다른 리포터 단백질의 발현을 상향조절할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 균주들은 최소 배지에서의 DWP에서 60h 후 글루코오스 고갈시까지 배양되었고, 다음에 추가로 메탄올로 유도되었다. 배양 상청액에서 HRP 및 CalB 효소 활성이 측정되었다. MeHNL의 활성은 분해된 세포를 사용하여 측정되었다. 4개의 형질전환체의 평균 및 표준편차가 각각 제시된다.
도 4는 시험된 HpFMD 프로모터(P_FMD) 및 AOX1 프로모터(P_AOX1) 야생형 서열 프로모터의 리포터 단백질 형광을 나타낸다. 바탕 균주는 P. pastoris Bgl1 KU70이다. 배양은 딥 웰 플레이트(DWP)에서 수행되었다. 리포터 단백질 형광 및 OD600이 글루코오스 억제해제 조건(24 및 48h) 및 메탄올 유도 후 두 상이한 시점(72 및 96h)에서 측정되었다. FMD 프로모터를 지닌 균주가 다양한 프로모터 변이체를 시험하기 위한 기준 균주로서 사용되었다.
도 1은 녹색 형광 단백질을 코딩하는 핵산이 이종상동성 및 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코마가타엘라 속의 배양한 효모 세포에서의 녹색 형광 리포터 단백질(녹색 형광 단백질(GFP)의 개선된 변이체)의 형광 강도를 나타낸다. 이종상동성 프로모터(및 참고로서 P. pastoris로부터의 내인성 프로모터)는 GFP 리포터 유전자에 작동가능하게 연결되었고 P. pastoris에서 벡터로서 형질전환되었다. 이 균주는 96개의 깊은 웰을 가진 마이크로타이터 플레이트(딥 웰 플레이트(DWP))에서 최소 배지(BMD1) 상에서 60시간 동안 배양된 다음 메탄올로 유도되었다. 글루코오스-억제 조건(16h), 억제해제 조건(60h) 및 메탄올 유도 후 다양한 시점에서 리포터 단백질의 형광 및 OD600(바이오매스의 척도로서)이 측정되었다. 형광 측정치는 OD600 값에 대해 정규화되었다. 4개의 형질전환체의 평균 및 표준편차가 도면에 각각 제시된다.
도 2는 시간에 따른 단백질 발현의 측정치를 나타낸 곡선을 도시한다. 도 1로부터 선택된 균주는 진탕 플라스크에서 배양되었다. 단백질 형광(도 2a; 비율 RFU/D600; RFU = 상대적 형광 단위)과 함께 OD600(도 2b) 및 글루코오스의 양(도 2c)이 시간에 따라 측정되었다. 측정을 시작할 때 글루코오스 농도는 55.5mM(10 g/L)였다. 3개의 형질전환체의 평균(MV) 및 표준편차가 각각 제시된다.
도 3A 내지 3C는 이종상동성 HpFMD 프로모터가 또한 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)(도 3A), 칸디다 앤타르티카(CalB)로부터의 리파아제 B(도 3B) 및 매니호트 에스큘렌타(manihot esculenta)(MeHNL)로부터의 하이드록시니트릴 리아제(도 3C)와 같은 다른 리포터 단백질의 발현을 상향조절할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 균주들은 최소 배지에서의 DWP에서 60h 후 글루코오스 고갈시까지 배양되었고, 다음에 추가로 메탄올로 유도되었다. 배양 상청액에서 HRP 및 CalB 효소 활성이 측정되었다. MeHNL의 활성은 분해된 세포를 사용하여 측정되었다. 4개의 형질전환체의 평균 및 표준편차가 각각 제시된다.
도 4는 시험된 HpFMD 프로모터(P_FMD) 및 AOX1 프로모터(P_AOX1) 야생형 서열 프로모터의 리포터 단백질 형광을 나타낸다. 바탕 균주는 P. pastoris Bgl1 KU70이다. 배양은 딥 웰 플레이트(DWP)에서 수행되었다. 리포터 단백질 형광 및 OD600이 글루코오스 억제해제 조건(24 및 48h) 및 메탄올 유도 후 두 상이한 시점(72 및 96h)에서 측정되었다. FMD 프로모터를 지닌 균주가 다양한 프로모터 변이체를 시험하기 위한 기준 균주로서 사용되었다.
실시예
:
실시예 1: 재료 및 방법
프로모터의 클로닝
PCR에 의해 이종상동성 프로모터를 증폭시키고 GFP 리포터 유전자 앞에 클로닝했다. 이를 위한 리포터 플라스미드 pPpT4mutZeoMlyI-intARG4-eGFP-BmrIstuffer(T. Vogl et al. ACS Synth Biol. 2015, DOI: 10.1021/acssynbio.5b00199; 2015년 11월 22일 공개).
이 플라스미드는 L. Naatsaari et al.(PLoS One 7 (2012):e39720)에 의해 제시된 pPpT4 벡터에 기초한다. 프로모터를 솔기 없이(즉, 프로모터와 시작 코돈 사이에 임의의 제한 효소 절단 부위나 링커 서열 없이) 클로닝하여 천연 구성물을 얻었다. 프라이머는 문헌을 참조하여 설계했다(HpFMD 프로모터(H. Song et al. Biotechnol Lett 25 (2003):1999-2006; A. M. Ledeboer et al. Nucleic Acids Res 13 (1985):3063-3082), CbAOD1 프로모터(H. Yurimoto et al. Biochim Biophys Acta 1493 (2000):56-63), CbFLD1 프로모터(B. Lee et al. Microbiology 148 (2000):2697-704), Pm MOD1 및 MOD2 프로모터(C. K. Raymond et al. Yeast 14 (1998): 11-23; T. Nakagawa et al. J Biosci Bioeng 91 (2001):225-7; T. Nakagawa et al. Yeast 23 (2006):15-22)). 사용된 프라이머 서열은 표 A에 제시된다.
[표 A]
이종상동성 프로모터의 증폭을 위한 프라이머
균주 Hp(한세뉼라 폴리모르파) DSM 70277, Cb(칸디다 보이디니) DSM 70026 및 Pm(피치아 메탄올리카) DSM 2147의 게놈 DNA를 분리하고 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용했다. PCR 생성물을 벡터 pPpT4mutZeoMlyI-intARG4-eGFP-BmrIstuffer에서 TA 클로닝에 의해 클로닝했다(US 2015/0011407 및 T. Vogl et al.(ACS Synth Biol. 2015, DOI:10.1021/acssynbio.5b00199; 2015년 11월 22일 공개) 참조). P . pastoris 내인성 프로모터인 AOX1, GAT1 및 GAP를 위한 대조군 벡터를 US 2015/0011407를 참조하여 얻었다.
상응하는 프로모터로부터의, 하류에 HRP(동형효소 A2A; L. Naatsaari et al. BMC Genomics 15 (2014):227), CalB 및 MeHNL을 함유하는 대체 리포터 벡터를 US 2015/0011407를 참조하여 얻거나, 상기 언급된 eGFP 벡터로부터 절단된(제한 효소 Nhel 및 Notl) eGFP 리포터 유전자를 설치함으로써 생성하였으며, HRP, CalB 및 MeHNL의 PCR 생성물을 재조합 클로닝에 의해 솔기 없이 설치하였다. 표 B에 나타낸 프라이머가 PCR 증폭을 위해 사용되었다.
[표 B]
다양한 리포터 유전자로부터 상류에 프로모터를 클로닝하기 위한 프라이머
문헌(US 2015/0011407 및 T. Vogl et al.(ACS Synth Biol. 2015, DOI:10.1021/acssynbio. 5b00199; 2015년 11월 22일 공개)에 제시된 HRP 및 CalB 벡터를 PCR 주형으로서 사용하였다. MeHNL 서열은 P. pastoris 코돈에 대해 최적화되었고 AOX1 프로모터 및 터미네이터에 오버행을 가진 합성 이중가닥 DNA 단편으로서 설계되었다(표 B 참조). 이 단편을 PCR을 위한 주형으로서 사용했다. 다음의 서열이 사용되었다:
이 단백질 코딩 서열은 크고 시작 및 중단 코돈은 볼드체로 표시했으며, 재조합 클로닝을 위한 벡터 오버행은 소문자로 표시했다. pPpT4 벡터 패밀리에서 클로닝에 전형적으로 사용되는 절단 부위인 EcoRI 및 Notl에는 밑줄이 그어져 있다.
또한, 동일한 포워드 프라이머(pHpFMD-MFalpha-Gib)가 HRP 및 CalB 유전자의 PCR 증폭에 사용되었으며, 이는 이 두 유전자가 MFalpha 신호 서열에 융합되기 때문이다. 벡터에서 클로닝된 유전자는 AOX1 터미네이터 및 각 프로모터에 결합하는 프라이머를 사용하여 서열화했다(HpFMD 프로모터에 대해 seq-pHpHMD-149..126fwd).
균주, 재료, 형광 측정 및 효소 분석
Krainer FW(Microb Cell Fact 11(2012):22)의 프로토콜에 따라서 기질 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산) 다이암모늄 염(ABTS) 및 p-니트로페닐 뷰티레이트(p-NPB)를 사용하여 효소 HRP 및 CalB 활성을 결정했다.
모든 프로모터의 형질전환과 GFP의 비교를 위해 CBS7435 야생형 균주를 사용했다. HRP 및 CalB 플라스미드를 mutS 균주(L. Naatsaari et al.(PLoS One (2012); 7:e39720)에 형질전환했는데, 이는 더 높은 단백질 발현을 갖기 때문이다(F. W. Krainer et al. Microb Cell Fact 11 (2012):22). MeHNL 활성 측정을 위해 세포를 제조자의 지시에 따라서 Y-PER 분해에 의해 용해시켰고(Thermo Fisher Scientific, Y-PER™ 효소 단백질 추출 시약), R. Wiedner et al. Comput Struct Biotech-nol J10 (2014):58-62)에 의해 설명된 대로 "만델로니트릴 시아노게나아제 분석"을 사용하여 활성을 측정했다(최종 만델로니트릴 농도 15mM).
결과
HpFMD, HpMOX, CbFLD1, CbAOD1, PmMOD1 및 PmMOD2 유전자의 6개 이종성 프로모터가 P. pastoris에서 시험되었다. 이 프로모터들은 P. pastoris에서 메탄올-유도형 AOX1 프로모터, 구성성 GAP 프로모터 및 억제해제된/메탄올-유도형 CAT1 프로모터와 비교되었는데, 즉 이종상동성 프로모터를 게놈 DNA PCR에 의해 증폭시키고 리포터 유전자로서 GFP와 함께 벡터에서 클로닝했다. 다음의 프로모터 서열이 사용되었다:
HpFMD (SEQ ID No. 1):
HpMOX (SEQ ID No. 2):
CbFLDl (SEQ ID No. 23):
CbAOD1 (SEQ ID No. 24):
PmMOD1 (SEQ ID No. 25):
PmMOD2 (SEQ ID No. 26):
CbAOD1, PmMOD1 및 PmMOD2 프로모터를 가진 플라스미드를 함유한P. pastoris 형질전환체는 리포터 단백질 형광을 갖지 않았다(도 1). CbFLD1 프로모터는 글루코오스 상에서 억제를 나타냈고, PpAOX1 프로모터의 대략 10% 정도로 메탄올에 의한 약한 유도를 나타냈다. 시험된 H. polymorpha 프로모터는 놀랍게도 피치아 파스토리스 억제, 억제해제 및 메탄올 유도 조건에서 H. polymorpha로부터의 천연 조절 프로파일을 보유했다(도 1 및 2). HpFMD 프로모터는 놀랍게도 억제해제 조건에서는 구성성 PpGAP 프로모터를 초과했고, 또한 탄소원의 공급이 추가되지 않을 때에도 메탄올-유도 PpAOX1 프로모터의 대략 75%를 달성했다. HpFMD 프로모터의 억제해제된 발현은 대략 3.5배 정도로 P. pastoris로부터의 가장 강한 내인성 MUT 프로모터(PpCAT1)의 리포터 단백질 형광을 초과했다. 메탄올 유도 후, HpFMD 프로모터는 대략 2배 정도로 PpAOX1 프로모터를 초과했다. 소규모의 이들 결과는(도 1) 진탕 플라스크(도 2)에서의 실험에 의해 확인되었는데, 여기서도 글루코오스 측정치가 억제해제된 조절 프로파일을 분명히 보여준다. 생물반응기에서의 공급 속도를 최적화시킴으로써 FMD 프로모터의 기술적 이점을 더 향상시킬 수 있다.
HpFMD 리포터의 예상치 못한 강한 발현이 GFP 외의 다른 단백질에서도 재현될 수 있는지 조사하기 위해, HpFMD 프로모터를 다음과 같이 다른 단백질의 코딩 서열로부터 상류에 클로닝했다: 분비된 단백질 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP), 칸디다 앤타르티카 리파아제 B(CalB) 및 매니호트 에스큘렌타(카사바, MeHNL)로부터의 세포내 하이드록시니트릴 리아제(도 3A 내지 3C).
진탕 플라스크 실험에서 배양 상청액 중 활성 단백질의 최종 수율과 관련하여, HpFMD 프로모터에 의한 모든 단백질의 억제해제된 발현은 GAP 프로모터에 의한 구성성 발현과 동등했으며, CAT1 프로모터에 의한 억제해제된 발현을 분명히 초과했고, HpFMD 프로모터의 메탄올-유도 효소 활성은 2.5배까지 AOX1 프로모터 활성을 초과했다.
또한, HpFMD 프로모터의 강한 발현은 4개의 상이한 분비된 리포터 단백질뿐만 아니라 세포내 리포터 단백질(eGFP, HRP, CalB 및 MeHNL)에서도 관찰될 수 있었다. 이종상동성 HpFMD 프로모터는 심지어 P. pastoris에서 내인성 프로모터도 초과했다.
흥미롭게도, 이종상동성 프로모터는 피치아에서의 프로모터와는 서열 동일성이 매우 낮거나 아예 없었다. HpFMD 프로모터의 BLAST 검색은 피치아 파스토리스 게놈에서 어떤 유의한 히트도 제공하지 않았다; PpFDH1 프로모터와 HpFMD 프로모터의 직접 정렬도 역시 어떤 유의한 유사성을 제공하지 않았다(BLASTN 2.2.32+, Blast 2개 서열, "다소 유사한 서열(blastn)"에 대해 설정; 분자 타입: 핵산).
이러한 낮은 서열 동일성은 프로모터의 바람직한 특성인데, 이는 이들 외래 서열이 피치아의 게놈에서 동일한 서열과 재조합할 수 없고, 따라서 예를 들어 게놈에 이미 존재하는 유사한 서열과의 상동성 재조합 사건으로 인해 소실될 수 없기 때문이다.
놀랍게도, 이종상동성 프로모터는 HpFMD 프로모터로 인한 2.5배 정도까지 더 높은 활성에 의해 증명된 대로, 단백질 발현을 위한 매우 유용한 도구일 수 있다. 예상외로, HpFMD 프로모터는 또한 P. pastoris에서 H. polymorpha로부터의 억제해제된 조절 프로파일을 보유했고, 따라서 P. pastoris에서 가장 강한 억제해제된 프로모터를 구성한다. 따라서, 독성이며 매우 염증성인 메탄올을 사용하지 않는 효과적인 생산 과정이 가능해질 수 있다.
실시예 2: FMD 프로모터 변이체
1. 프로모터의 클로닝
SEQ ID No. 1을 가진 FMD 프로모터를 함유하는 pPpT4mutZeoMlyI-intArg4-EGFP-P_FMD를 프로모터 변이체 v01 내지 v22의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용했다. 프라이머는 FMD 프로모터 서열에 대해 점 돌연변이, 삽입 또는 상이한 코어 프로모터를 도입하는 방식으로 설계했다. 프로모터 변이체를 두 부분으로 증폭시킨 다음, 제한 엔도뉴클레아제 Sail로 미리 절단한 pPpT4mutZeoMlyI-intArg4-eGFP-P_FMD 벡터의 백본으로 조립했다. 프로모터 변이체 v23 내지 v25의 생성에서는 단지 한 부분만 PCR 증폭시켰고, 나머지 부분은 합성 DNA로서 주문했다. 이 경우, 2개의 DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 Nhel로 미리 절단한 pPpT4mutZeoMlyI-intArg4-eGFP-P_FMD 벡터의 백본으로 조립했다. 벡터 백본 조립에 의한 DNA 단편들의 조립을 위해 서열 상동성에 기초한 클로닝을 사용했으며, 그 결과 프로모터에서 리포터 유전자 eGFP로 솔기 없는 전이가 이루어졌다.
2.
P.
pastoris
형질전환 및 스크리닝
상이한 프로모터 변이체 v01 내지 v25를 숨긴 벡터의 효모로의 형질전환을 위해 P. pastoris Bgl1 ΔKU70 균주를 사용했다. 야생형 균주와 비교하여 이 균주는 2개의 유전자 녹아웃을 가지는데, 먼저 KU70 유전자는 비상동성 단부 결합 기전에 수반되는 단백질을 암호화한다. 이 유전자의 녹아웃에 의해 P. pastoris에서 상동성 재조합 사건이 더 잘 일어날 수 있게 된다. 이것은 규정된 유전자좌, 이 경우 ARG4 유전자좌에 벡터의 표적화를 용이하게 하며, 이로써 게놈에 있는 다른 통합 유전자좌에 의한 예상치 못한 효과를 피할 수 있다. 두 번째 녹아웃 유전자는 AOX1 유전자이다(mutS/Bgl1 균주). 이 녹아웃 균주를 사용함으로써 메탄올 유도형 프로모터의 제어하에 이종성 발현되는 단백질의 더 높의 수율이 달성될 수 있다(Krainer FW et al. Microb. Cell Fact. 11 (2012) p. 22).
P. pastoris Bgl1 ΔKU70을 Lin-Cereghino et al.(Biotechniques 38 (2005): 44-48)의 축약된 프로토콜에 따라서 BalII 선형화된 플라스미드로 형질전환했다. 스크리닝을 위한 기준 균주에서도 프로모터 변이체 - 그러나 대신에 SEQ ID NR1 및 AOX1 프로모터의 비변형 FMD 프로모터로 - 에 대한 것과 동일한 벡터를 또한 형질전환했다. 다중 카피 통합을 피하기 위해 비교적 적은 양의 DNA인 약 500ng을 형질전환했다. 예를 들어, 선형화된 pPpT4_S 벡터 1μg의 사용은 전형적으로 단일 카피 형질전환체를 제공한다((Vogl T et al. ACS Synth. Biol. 3 (2014): 188-191).
9개의 구성물에 대해 42개의 형질전환체를 스크리닝하여 발현 상황의 균일성을 밝혔다. 시험된 구성물 전부에 대해 발현 상황은 균일한 것이 입증되었고, 구성물당 단지 16개의 형질전환체만 선별하여 2차 스크리닝에서 2개의 상이한 딥 웰 플레이트(DWP)에서 배양했다. DWP 배양은 Weis et al.(Weis R et al. FEMS Yeast Res. 5 (2004):179-89)에 의해 보고된 프로토콜로부터 변형되었다. 단일 콜로니를 선별하고 그것을 사용하여 96개 웰의 DWP에서 BMD(250μL)를 접종하고 48시간 동안 배양했다. 다음에, BMM2(250μL)를 첨가하여 최초로 세포를 유도했다. 세포는 DWP에서 배양한지 60, 72 및 84시간 후에 BMM10(50μL)로 3번 더 유도되었다. 샘플을 선택하고 48, 72 및 96시간 후에 측정했다. 샘플은 다음과 같이 얻었다: 10μL 세포 배양물을 마이크로타이터 플레이트(Nunc MicroWell 96-Well Optical-Bottom Plates with Polymer Base, Black; Thermo Fisher Scientific)에서 탈이온수 190μL와 혼합했다. eGFP 형광 측정을 FLUOstar® Omega 플레이트 리더(BMG LABTECH GmbH, Ortenberg, 독일)를 사용하여 수행했다. 형광은 488/507nm(여기/방출)에서 측정되었고, 데이터 평가를 위해 얻어진 상대적 형광 단위(RFU)는 OD600에 대해 정규화되었다.
[표 C]
FMD 프로모터 변이체의 생성을 위한 프라이머 및 합성 DNA
3. 결과
시험된 HpFMD 프로모터(P_FMD) 및 AOX1 프로모터(P_AOX1) 야생형 서열 프로모터의 리포터 단백질 형광의 결과가 도 4에 도시된다.
a)
FMD
프로모터
변이체
- 점 돌연변이 및 단일
뉴클레오타이드
삽입
[표 D]
점 돌연변이 및 단일 뉴클레오타이드 삽입을 함유하는 모든 프로모터 변이체의 상대적 프로모터 활성. eGFP 리포터 단백질의 상대적 형광 값(RFU)이 측정되었고, 이들 값은 OD600에 대해 정규화되었다. 이들 RFU/OD600 값은 모 HpFMD 프로모터 변이체(wt = SEQ ID No. 1) 서열의 RFU/OD600에 대해 정규화되었고, 그 결과 상대적 프로모터 활성이 얻어졌다. 균주들은 BMD1 배지 상의 DWP에서 배양된 다음 메탄올로 유도되었다(72 및 96h).
b)
FMD
프로모터
변이체
- 코어 프로모터 교환
[표 E]
교환된 코어 프로모터를 함유하는 모든 프로모터 변이체의 상대적 프로모터 활성. eGFP 리포터 단백질의 상대적 형광 값(RFU)가 측정되었고, 이들 값은 OD600에 대해 정규화되었다. 이들 RFU/OD600 값은 모 HpFMD 프로모터 변이체(wt = SEQ ID No. 1)의 RFU/OD600 값에 대해 정규화되었고, 그 결과 상대적 프로모터 활성이 얻어졌다. 균주들은 BMD1 배지 상의 DWP에서 배양된 다음(24 및 48h) 메탄올로 유도되었다(72 및 96h).
<110> Technische Universitat Graz
<120> Yeast Cell
<130> 48524
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<151> 2015-12-22
<160> 94
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 623
<212> DNA
<213> Hansenula polymorpha
<400> 1
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagagggg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 2
<211> 1510
<212> DNA
<213> Hansenula polymorpha
<400> 2
cgacgcggag aacgatctcc tcgagctgct cgcggatcag cttgtggccc ggtaatggaa 60
ccaggccgac ggcacgctcc ttgcggacca cggtggctgg cgagcccagt ttgtgaacga 120
ggtcgtttag aacgtcctgc gcaaagtcca gtgtcagatg aatgtcctcc tcggaccaat 180
tcagcatgtt ctcgagcagc catctgtctt tggagtagaa gcgtaatctc tgctcctcgt 240
tactgtaccg gaagaggtag tttgcctcgc cgcccataat gaacaggttc tctttctggt 300
ggcctgtgag cagcggggac gtctggacgg cgtcgatgag gcccttgagg cgctcgtagt 360
acttgttcgc gtcgctgtag ccggccgcgg tgacgatacc cacatagagg tccttggcca 420
ttagtttgat gaggtggggc aggatgggcg actcggcatc gaaatttttg ccgtcgtcgt 480
acagtgtgat gtcaccatcg aatgtaatga gctgcagctt gcgatctcgg atggttttgg 540
aatggaagaa ccgcgacatc tccaacagct gggccgtgtt gagaatgagc cggacgtcgt 600
tgaacgaggg ggccacaagc cggcgtttgc tgatggcgcg gcgctcgtcc tcgatgtaga 660
aggccttttc cagaggcagt ctcgtgaaga agctgccaac gctcggaacc agctgcacga 720
gccgagacaa ttcgggggtg ccggctttgg tcatttcaat gttgtcgtcg atgaggagtt 780
cgaggtcgtg gaagatttcc gcgtagcggc gttttgcctc agagtttacc atgaggtcgt 840
ccactgcaga gatgccgttg ctcttcaccg cgtacaggac gaacggcgtg gccagcaggc 900
ccttgatcca ttctatgagg ccatctcgac ggtgttcctt gagtgcgtac tccactctgt 960
agcgactgga catctcgaga ctgggcttgc tgtgctggat gcaccaatta attgttgccg 1020
catgcatcct tgcaccgcaa gtttttaaaa cccactcgct ttagccgtcg cgtaaaactt 1080
gtgaatctgg caactgaggg ggttctgcag ccgcaaccga acttttcgct tcgaggacgc 1140
agctggatgg tgtcatgtga ggctctgttt gctggcgtag cctacaacgt gaccttgcct 1200
aaccggacgg cgctacccac tgctgtctgt gcctgctacc agaaaatcac cagagcagca 1260
gagggccgat gtggcaactg gtggggtgtc ggacaggctg tttctccaca gtgcaaatgc 1320
gggtgaaccg gccagaaagt aaattcttat gctaccgtgc agtgactccg acatccccag 1380
tttttgccct acttgatcac agatggggtc agcgctgccg ctaagtgtac ccaaccgtcc 1440
ccacacggtc catctataaa tactgctgcc agtgcacggt ggtgacatca atctaaagta 1500
caaaaacaaa 1510
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 3
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctg 28
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
gatttgattg atgaaggcag agagcgcaag 30
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
tcgacgcgga gaacgatctc ctcgagct 28
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 6
tttgtttttg tactttagat tgatgtcacc accgtgcact ggcag 45
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
cgagatggta catacttaaa agctgccata ttgag 35
<210> 8
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 8
tttgagaaat taatagtaag attttttttt cgtaaaagtt ttgattgagt taattc 56
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
ggatccacta cagtttacca attgattacg ccaatag 37
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 10
tttgaatttt agttttagat agataaatat aattttcaat cctgttataa aatagtatat 60
60
<210> 11
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 11
ggagtatacg taaatatata attatatata atcatatata tgaatacaat gaaag 55
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 12
tattgaaaaa taattttgtt tttttttttt tgttttttta aaagttcgtt aaaattcg 58
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 13
ggatcccttc aacagcggag tctcaaac 28
<210> 14
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 14
ttttgtggaa taaaaaatag ataaatatga tttagtgtag ttgattcaat caattgac 58
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 15
cttgcgctct ctgccttcat caatcaaatc atgagattcc catctatttt caccgctgtc 60
60
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 16
caaatggcat tctgacatcc tcttgagcgg ccgcttatgg ggtcacgata ccggaacaag 60
60
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 17
caaatggcat tctgacatcc tcttgagcgg ccgcttagga tccgttaact ttcttgcaat 60
caagtc 66
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 18
actggtgtcc gccaataaga ggag 24
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 19
cttgcgctct ctgccttcat caatcaaatc atggttactg ctcacttcgt cttgattcac 60
60
<210> 20
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 20
caaatggcat tctgacatcc tcttgagcgg ccgcttaagc gtaagcgtcg gcaacttcct 60
g 61
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 21
cacttgctct agtcaagact tacaattaaa atggttactg ctcacttcgt cttgattcac 60
60
<210> 22
<211> 868
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 22
cgacaacttg agaagatcaa aaaacaacta attattgaaa gaattccgaa acgatggtta 60
ctgctcactt cgtcttgatt cacactatct gtcatggtgc ttggatctgg cacaagttga 120
agccagcatt ggagagagct ggacataagg ttaccgctct tgatatggct gcatctggta 180
ttgatcctcg tcaaatcgaa caaatcaatt cattcgacga gtactcagag ccactgctga 240
ccttcttgga aaagttgcct caaggtgaaa aggtgatcat cgttggtgaa tcctgtgctg 300
gattgaacat tgccattgca gctgatagat atgtcgataa gatcgctgct ggtgtcttcc 360
acaactctct gttaccagat actgttcact ctccatctta cactgtcgag aagttgttag 420
aatcattccc agattggaga gatactgaat actttacttt cactaacatc actggagaga 480
ctatcaccac catgaaactt ggattcgttt tgttgagaga aaaccttttc accaagtgta 540
ctgatggtga atacgaattg gccaagatgg ttatgagaaa gggttctttg tttcagaatg 600
ttcttgcaca aagaccaaag ttcaccgaaa agggttacgg ttctatcaag aaggtctaca 660
tctggactga tcaggacaag atcttcctgc cagacttcca aagatggcaa atcgcaaact 720
acaaaccaga taaggtctac caagtccaag gtggtgatca caagttacaa ttgaccaaga 780
ccgaagaggt cgctcacatc ttgcaggaag ttgccgacgc ttacgcttaa gcggccgctc 840
aagaggatgt cagaatgcca tttgcctg 868
<210> 23
<211> 572
<212> DNA
<213> Candida boidinii
<400> 23
ggatcccttc aacagcggag tctcaagcag tggctattat cagtgtattt aattactgat 60
gcattgtatt atagtgcata catagttaat aattactctc tgttatcatt gaaaattttg 120
aaattctcac tctcacgcag tgcaaaactt tgcctaattg agtaagtgga acgcaatatt 180
taggctacat attttggatt cccttaagta tgtaatcaaa gatcattcat actgccatct 240
tataatattg gagtattatt atgttgctat actgttctac ctgtttattc tattgtatgc 300
gtctaaatct ttccatcagt ttctatacta tctttcgttt gcaatgaaat attactccaa 360
ttcgcttgtt tcaactcgct tgccttctct cttgccttct ttttttcttt tcattttatc 420
gttgtttaaa cggtatataa atatgtaacg ttgtcgctta gttttgagaa atcacttttg 480
ttgctctcaa ttctgttttg acatcttaag gttagtcaat tgattgaatc aactacacta 540
aatcatattt atctattttt tattccacaa aa 572
<210> 24
<211> 1652
<212> DNA
<213> Candida boidinii
<400> 24
ggagtatacg taaatatata attatatata atcatatata tgaatacaat gcaatgaaag 60
tgaatatgat aagattgaaa taataacaaa cagcgataaa tatatctcaa aatggagtta 120
cacaacaaat aataataaaa tataaattat aaattataaa ttataaaaga ataaaaaata 180
aaccccacta atttatttta ttaaaagata gattggtatc tttacttaat aacaattctg 240
aaactttatt cacttaattt tatttaactt atttaattta tttttacccc agtttttcag 300
tacaatgcag ctccgaaact ttatttggct gtgatttggc tgtgatttgg ctgtgatttg 360
gcttggcttg gctggctgga attgtctcct gcaggaattg ctcggggtcc ggttctcccg 420
ctggctggct atttggcggg ctggctattt ggcgggctgg ctggctggct gctctgccat 480
ctgctgtggc caccccgcat ctctggatgc acgccgtgca gctggacgtg cgtctaccct 540
gcagccgtgt gccttatttc ccaatctccc aatctctcaa tctgccagtc agccaaaaca 600
ccggccaggc aggcaggcag gcaggcaggc aggcagtgaa gccttcccac gccccactcc 660
gcataaacat ccccagcagt ttccccagca gtttccccag cttttcaatt taataaaata 720
gcctgtttct gtttctgttt tatattatac aattttttat cctaataatt actctttcgg 780
gaattaaata ataattatat catataccca tatcacattt tactatattt actatctata 840
aataaattca tattataata ttaatttata ttcgcttaat taaaatgctc ttttccatca 900
tcatcatcat catcatcatc acgagttttc ggttatcaat actcttttca ttaatttcta 960
gaatttcatt atttattttt tattgactgg aaattttcaa tcaattttat ttatttttat 1020
ttatttattt tcatattctt agatttaaac tttttagatg accgctattt tacttactta 1080
cttactgttg ttttatatta tgataagaat taattttcat atttatgatg atgatgatgt 1140
aaatttaacc tagtatacta ttttaaagtt atcactatct tttagtgctg gcatttttta 1200
ttctattttc atatatgtat atacgtaaat taagtatcat cacgctgctt actgtacgtt 1260
taaaatgtgg agatggaaat agagatgggg atgaagatga agatgatgag aattataaac 1320
cattcattca ttaatcaatc aatataactt ataaaaaaat ttatatttaa atgaattaat 1380
ttcctttatt ttaataatat cgttaattct tttaaattct attttatttt aattctttct 1440
ttatcatagt tatcatataa caattatata acatagatac acaattatta tttcattatc 1500
atattatttt ttaaaatatt gattattttt aaaataatat cttaattaat taatttttac 1560
gaatatacaa attttaacga cttacttttt ttaacgaatt ttaacgaact tttaaaaaaa 1620
caaaaaaaaa aaaacaaaat tatttttcaa ta 1652
<210> 25
<211> 1157
<212> DNA
<213> Pichia methanolica
<400> 25
cgagatggta catacttaaa agctgccata ttgaggaact tcaaagtttt atctgttttt 60
agaattaaaa gacgattgtt gtaacaaaac gttgtgccta cataaactca aattaatgga 120
aatagcctgt tttgaaaaat acaccttctt aagtactgac aaagttttgt taaatgacta 180
tcgaacaagc catgaaatag cacatttctg ccagtcactt ttaacacttt cctgcttgct 240
ggttgactct cctcatacaa acacccaaaa gggaaacttt cagtgtgggg acacttgaca 300
tctcacatgc accccagatt aatttcccca gacgatgcgg agacaagaca aaacaaccct 360
ttgtcctgct cttttctttc tcacaccgcg tgggtgtgtg cgcaggcagg caggcaggca 420
gcgggctgcc tgccatctct aatcgctgct cctcccccct ggcttcaaat aacagcctgc 480
tgctatctgt gaccagattg ggacaccccc ctcccctccg aatgatccat caccttttgt 540
cgtactccga caatgatcct tccctgtcat cttctggcaa tcagctcctt caataattaa 600
atcaaataag cataaatagt aaaatcgcat acaaacgtca tgaaaagttt tatctctatg 660
gccaacggat agtctatctg cttaattcca tccactttgg gaaccgttct ctctttaccc 720
cagattctca aagctaatat ctgccccttg tctattgtcc tttctccgtg tacaagcgga 780
gcttttgcct cccatcctct tgctttgttt cggttatttt tttttctttt gaaactcttg 840
gtcaaatcaa atcaaacaaa accaaacctt ctattccatc agatcaacct tgttcaacat 900
tctataaatc gatataaata taaccttatc cctcccttgt tttttaccaa ttaatcaatc 960
ttcaaatttc aaatattttc tacttgcttt attactcagt attaacattt gtttaaacca 1020
actataactt ttaactggct ttagaagttt tatttaacat cagtttcaat ttacatcttt 1080
atttattaac gaaatcttta cgaattaact caatcaaaac ttttacgaaa aaaaaatctt 1140
actattaatt tctcaaa 1157
<210> 26
<211> 1662
<212> DNA
<213> Pichia methanolica
<400> 26
ggatccacta cagtttacca attgattacg ccaatgtgtt tatttcacca agtaattaca 60
aaactgagat ttggttatgt cattatgtat tttcggcaat ggctgtaatt taaactggat 120
tagggttaat taacgtttag cctacgaaag cggctagctt ttatttctgc ttttgttttg 180
agcccgtttc taattccaat ctttgcaatt tcgttccatc ttttaaaatt aagtgctctt 240
ttctaatctg ataaagataa gccatcgtag agtaagtaaa acaaaataat gtactgtata 300
ttaagcggaa aaacttggaa aagtcgtatg atgttgaagg agcaaagaat gactaatatt 360
aggagattta agcaaacaat gttgagggga acaggacgat taacccctta tagaggaagc 420
gtctttgatg ttcgaagggg gaggggtcaa aagcactgag cagtgctaat tagtaaccaa 480
tttctgtaag caatgaaact tgttgctatt ggaaatacta ttaagtaata caaggtacag 540
actaatgggg gtgagccggt agttcaggct atcttataga cagactattc cggattgtct 600
aatcattggt gcacctggtt aataattatc agtcaactct tttacggtgc tgataggtct 660
ttgcgaactt gcccttgtgg aatttggttg ttaatcaaac tgttctgtat ttcatgtcat 720
actactattg atattattaa tgttacttac tcatctggcc atttaacagg tttgaagctt 780
taatgctctt aactaacagc aatccatcac cgtcaacctt aacccccctg gtgcttgctg 840
tctttatcct tcgtatcttt ttcatgttgc accgccctgt tccttatacg gttgttcccc 900
cataggctaa cttctctgtt tccgaccatc tctgcaataa caaagaattc tatacgctta 960
cactataatc atacaatgac tctacatgcc attttcactt tacttacttg ccatcggaag 1020
atactgaatc agaaagccat agtaactaca taacttcaaa acacaccctt tttacagatt 1080
agttacaatt ttgtcaatgt ttgtttgata acccaaggtg gaacgtttcc agttagacct 1140
gtttaatcca actcacttta ccaccccaaa actttcctac cgttagacaa atactggcta 1200
aatctgacga aaacaaccaa tcaacaattg aatccactgg gaggtatctc taatccactg 1260
acaaactttg ctaaaacaag aaaaagtggg ggcctccgtt gcggagaaga cgtgcgcagg 1320
cttaaaaaca caagagaaca cttggaagta ccccagattt ttagcttcct actattctga 1380
caccccctat tcaagcacga cggtgattga ttcattcaat tttgctgctc caatgatagg 1440
ataaaccctt ttggacttca atcagacctc tgtcctccat agcaatataa ataccttcta 1500
gttgccccac ttcctctctc ctgtactgcc ccaatgagtg acttattcaa gttactttct 1560
ctcttttcct aacaattaaa caagaagctt tattataaca ttaatatact attttataac 1620
aggattgaaa ttatatttat ctatctaaaa ctaaaattca aa 1662
<210> 27
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)
<223> n is adenine or no nucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (354)
<223> n is adenine or guanine
<220>
<221> misc_feature
<222> (455)
<223> n is cytosine or thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (551)
<223> n is thymine or guanine
<220>
<221> misc_feature
<222> (563)
<223> n is adenine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (564)
<223> n is guanine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (565)
<223> n is adenine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (566)
<223> n is guanine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (567)
<223> n is adenine, guanine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (568)
<223> n is guanine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (569)
<223> n is guanine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (570)
<223> n is guanine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (571)
<223> n is guanine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (572)
<223> n is adenine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (573)
<223> n is adenine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (574)
<223> n is thymine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (575)
<223> n is guanine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (576)
<223> n is guanine or cytosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (580)
<223> X is SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 31,
SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33 or SEQ ID No. 34
<400> 27
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg antcaagaaa cacctgctgg gcgagcagtc tggagcacag tcttcgatgg 120
gcccgagatc ccaccgcgtt cctgggtacc gggacgtgag gcagcgcgac atccatcaaa 180
tataccaggc gccaaccgag tctctcggaa aacagcttct ggatatcttc cgctggcggc 240
gcaacgacga ataatagtcc ctggaggtga cggaatatat atgtgtggag ggtaaatctg 300
acagggtgta gcaaaggtaa tattttccta aaacatgcaa tcggctgccc cgcnacggga 360
aaaagaatga ctttggcact cttcaccaga gtggggtgtc ccgctcgtgt gtgcaaatag 420
gctcccactg gtcaccccgg attttgcaga aaaanagcaa gttccggggt gtctcactgg 480
tgtccgccaa taagaggagc cggcaggcac ggagtctaca tcaagctgtc tccgatacac 540
tcgactacca nccgggtctc tcnnnnnnnn nnnnnncacn 580
<210> 28
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> core promoter of an orthologous promoter
<400> 28
tataaatacc gcctccttgc gctctctgcc ttcatcaatc aaatc 45
<210> 29
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> core promoter of an orthologous promoter
<400> 29
tatataaact ggtgataatt ccttcgttct gagttccatc tcatactcaa actatattaa 60
aactacaaca 70
<210> 30
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> core promoter of an orthologous promoter
<400> 30
tataaataca agacgagtgc gtccttttct agactcaccc ataaacaaat aatcaataaa 60
t 61
<210> 31
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> core promoter of an orthologous promoter
<400> 31
tataaatact gcctacttgt cctctattcc ttcatcaatc acatc 45
<210> 32
<211> 143
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> core promoter of an orthologous promoter
<400> 32
cgatagggca gaaatatata aagtaggagg ttgtatacca aatataccaa cgcagtacaa 60
gcaactcttg gtttaaacgg aagaaacaat tcttcgaaca tttacaacaa agaaggtacc 120
gtaacattaa taatcggaag ggt 143
<210> 33
<211> 143
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> core promoter of an orthologous promoter
<400> 33
gtaatctttc ggtcaattgt gatctctctt gtagatattt aataggacgg ccaaggtaga 60
aaaagataca taactagtta gcaaacttca attgcttaag ttacaagtgc aatccatatc 120
ttaaagttat tacattattt ata 143
<210> 34
<211> 143
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> core promoter of an orthologous promoter
<400> 34
cctcctctag gtttatctat aaaagctgaa gtcgttagaa tttttcattt aaagcataat 60
caaacatcta gattcgaatc gataaaaagc agatagaagt tattaagatt ataggttaca 120
ttctagagta gtataggaag gta 143
<210> 35
<211> 624
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v1
<400> 35
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg aatcaagaaa cacctgctgg gcgagcagtc tggagcacag tcttcgatgg 120
gcccgagatc ccaccgcgtt cctgggtacc gggacgtgag gcagcgcgac atccatcaaa 180
tataccaggc gccaaccgag tctctcggaa aacagcttct ggatatcttc cgctggcggc 240
gcaacgacga ataatagtcc ctggaggtga cggaatatat atgtgtggag ggtaaatctg 300
acagggtgta gcaaaggtaa tattttccta aaacatgcaa tcggctgccc cgcaacggga 360
aaaagaatga ctttggcact cttcaccaga gtggggtgtc ccgctcgtgt gtgcaaatag 420
gctcccactg gtcaccccgg attttgcaga aaaacagcaa gttccggggt gtctcactgg 480
tgtccgccaa taagaggagc cggcaggcac ggagtctaca tcaagctgtc tccgatacac 540
tcgactacca tccgggtctc tcagagaggg gaatggcact ataaataccg cctccttgcg 600
ctctctgcct tcatcaatca aatc 624
<210> 36
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v2
<400> 36
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcgacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagagggg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 37
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v3
<400> 37
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaatagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagagggg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 38
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v4
<400> 38
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagggggg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 39
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v5
<400> 39
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccag ccgggtctct cagagagggg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 40
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v6
<400> 40
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct ccgagagggg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 41
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v7
<400> 41
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cacagagggg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 42
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v8
<400> 42
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagcgagggg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 43
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v9
<400> 43
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagacagggg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 44
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v10
<400> 44
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagcgggg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 45
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v11
<400> 45
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagacggg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 46
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v12
<400> 46
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagagcgg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 47
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v13
<400> 47
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagaggcg aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 48
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v14
<400> 48
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagagggc aatggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 49
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v15
<400> 49
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
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cgactaccat ccgggtctct cagagagggg catggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
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<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v16
<400> 50
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
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ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagagggg actggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v17
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aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
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cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
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ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
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cgactaccat ccgggtctct cagagagggg aacggcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 52
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v18
<400> 52
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
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ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
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gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagagggg aatcgcacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 53
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v19
<400> 53
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
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cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
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ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagagggg aatgccacta taaataccgc ctccttgcgc 600
tctctgcctt catcaatcaa atc 623
<210> 54
<211> 648
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v20
<400> 54
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
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cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
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ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
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<210> 55
<211> 639
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v21
<400> 55
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
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cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
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ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
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cgactaccat ccgggtctct cagagagggg aatggcacta taaatacaag acgagtgcgt 600
ccttttctag actcacccat aaacaaataa tcaataaat 639
<210> 56
<211> 623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v22
<400> 56
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
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gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagagggg aatggcacta taaatactgc ctacttgtcc 600
tctattcctt catcaatcac atc 623
<210> 57
<211> 721
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v23
<400> 57
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
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ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagagggg aatggcaccg atagggcaga aatatataaa 600
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gaaacaattc ttcgaacatt tacaacaaag aaggtaccgt aacattaata atcggaaggg 720
t 721
<210> 58
<211> 721
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v24
<400> 58
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagagggg aatggcacgt aatctttcgg tcaattgtga 600
tctctcttgt agatatttaa taggacggcc aaggtagaaa aagatacata actagttagc 660
aaacttcaat tgcttaagtt acaagtgcaa tccatatctt aaagttatta cattatttat 720
a 721
<210> 59
<211> 721
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMD variant v25
<400> 59
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg atcaagaaac acctgctggg cgagcagtct ggagcacagt cttcgatggg 120
cccgagatcc caccgcgttc ctgggtaccg ggacgtgagg cagcgcgaca tccatcaaat 180
ataccaggcg ccaaccgagt ctctcggaaa acagcttctg gatatcttcc gctggcggcg 240
caacgacgaa taatagtccc tggaggtgac ggaatatata tgtgtggagg gtaaatctga 300
cagggtgtag caaaggtaat attttcctaa aacatgcaat cggctgcccc gcaacgggaa 360
aaagaatgac tttggcactc ttcaccagag tggggtgtcc cgctcgtgtg tgcaaatagg 420
ctcccactgg tcaccccgga ttttgcagaa aaacagcaag ttccggggtg tctcactggt 480
gtccgccaat aagaggagcc ggcaggcacg gagtctacat caagctgtct ccgatacact 540
cgactaccat ccgggtctct cagagagggg aatggcaccc tcctctaggt ttatctataa 600
aagctgaagt cgttagaatt tttcatttaa agcataatca aacatctaga ttcgaatcga 660
taaaaagcag atagaagtta ttaagattat aggttacatt ctagagtagt ataggaaggt 720
a 721
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 60
gccaattctc aatttgctag agactctg 28
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 61
agaggcggcg aatcaagaaa cacc 24
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 62
ggtgtttctt gattcgccgc ctct 24
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 63
ctgccccgcg acgggaaaaa gaatg 25
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 64
cattcttttt cccgtcgcgg ggcag 25
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 65
ggattttgca gaaaaatagc aagttccggg 30
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 66
cccggaactt gctatttttc tgcaaaatcc 30
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 67
gtctctcaga ggggggaatg gc 22
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 68
gccattcccc cctctgagag ac 22
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 69
cactcgacta ccagccgggt ctctc 25
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 70
gagagacccg gctggtagtc gagtg 25
<210> 71
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 71
cactcgacta ccatccgggt ctctccgaga ggggaatggc actataaata c 51
<210> 72
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 72
cactcgacta ccatccgggt ctctcacaga ggggaatggc actataaata c 51
<210> 73
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 73
cactcgacta ccatccgggt ctctcagcga ggggaatggc actataaata c 51
<210> 74
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 74
cactcgacta ccatccgggt ctctcagaca ggggaatggc actataaata c 51
<210> 75
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 75
cactcgacta ccatccgggt ctctcagagc ggggaatggc actataaata c 51
<210> 76
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 76
cactcgacta ccatccgggt ctctcagaga cgggaatggc actataaata c 51
<210> 77
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 77
cactcgacta ccatccgggt ctctcagaga gcggaatggc actataaata c 51
<210> 78
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 78
cactcgacta ccatccgggt ctctcagaga ggcgaatggc actataaata c 51
<210> 79
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 79
cactcgacta ccatccgggt ctctcagaga gggcaatggc actataaata c 51
<210> 80
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 80
cactcgacta ccatccgggt ctctcagaga ggggcatggc actataaata c 51
<210> 81
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 81
cactcgacta ccatccgggt ctctcagaga ggggactggc actataaata c 51
<210> 82
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 82
cactcgacta ccatccgggt ctctcagaga ggggaacggc actataaata c 51
<210> 83
<211> 51
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cactcgacta ccatccgggt ctctcagaga ggggaatcgc actataaata c 51
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cactcgacta ccatccgggt ctctcagaga ggggaatgcc actataaata c 51
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gagagacccg gatggtagtc g 21
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ctcatactca aactatatta aaactacaac aatggctagc aaaggagaag aacttttcac 60
60
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tgttgtagtt ttaatatagt ttgagtatga gatggaactc agaacgaagg aattatcacc 60
agtttatata gtgccattcc cctctctgag 90
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gactcaccca taaacaaata atcaataaat atggctagca aaggagaaga acttttcac 59
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atttattgat tatttgttta tgggtgagtc tagaaaagga cgcactcgtc ttgtatttat 60
agtgccattc ccctctctga g 81
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acttgtcctc tattccttca tcaatcacat catggctagc aaaggagaag aacttttcac 60
60
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gatgtgattg atgaaggaat agaggacaag taggcagtat ttatagtgcc attcccctct 60
ctgag 65
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atcaagctgt ctccgataca ctcgactacc atccgggtct ctcagagagg ggaatggcac 60
cgatagggca gaaatatata aagtaggagg ttgtatacca aatataccaa cgcagtacaa 120
gcaactcttg gtttaaacgg aagaaacaat tcttcgaaca tttacaacaa agaaggtacc 180
gtaacattaa taatcggaag ggtatggcta gcaaaggaga agaacttttc actggagttg 240
tcccaattct 250
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atcaagctgt ctccgataca ctcgactacc atccgggtct ctcagagagg ggaatggcac 60
gtaatctttc ggtcaattgt gatctctctt gtagatattt aataggacgg ccaaggtaga 120
aaaagataca taactagtta gcaaacttca attgcttaag ttacaagtgc aatccatatc 180
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atcaagctgt ctccgataca ctcgactacc atccgggtct ctcagagagg ggaatggcac 60
cctcctctag gtttatctat aaaagctgaa gtcgttagaa tttttcattt aaagcataat 120
caaacatcta gattcgaatc gataaaaagc agatagaagt tattaagatt ataggttaca 180
ttctagagta gtataggaag gtaatggcta gcaaaggaga agaacttttc actggagttg 240
tcccaattct 250
Claims (13)
- 억제해제(derepressing)에 의한 유도형 메탄올자화(methylotrophic) 효모 세포의 이종상동성 프로모터(orthologous promoter) 또는 그것의 변이체를 포함하는 코마가타엘라(Komagataella) 속의 효모 세포로서, 상기 이종상동성 프로모터는 메탄올자화 효모 세포의 이종상동성 포르메이트 탈수소효소(formate dehydrogenase, FMD) 프로모터인, 효모 세포.
- 제 1 항에 있어서, 이종상동성 프로모터는 메탄올로 유도가능한 것을 특징으로 하는 효모 세포.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 이종상동성 프로모터는 이종성 또는 상동성 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 효모 세포.
- 제 3 항에 있어서, 이종성 또는 상동성 폴리펩타이드는 신호 펩타이드, 특히 분비 신호 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 효모 세포.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종상동성 프로모터는 한세뉼라(Hansenula), 칸디다(Candida), 코마가타엘라(Komagataella) 및 피치아(Pichia) 속으로 구성되는 군으로부터 선택된 메탄올자화 효모 세포로부터 기원하는 것을 특징으로 하는 효모 세포.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 메탄올자화 효모 세포는 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 칸디다 보이디니(Candida boidinii), 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica), 코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris), 코마가타엘라 파피(Komagataella phaffii), 코마가타엘라 포푸리(Komagataella populi), 코마가타엘라 슈도파스토리스(Komagataella pseudopastoris), 코마가타엘라 율미(Komagataella ulmi) 및 코마가타엘라 sp. 11-1192(Komagataella sp. 11-1192)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효모 세포.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종상동성 프로모터 및 선택적으로 게놈에서 이종성 또는 상동성 폴리펩타이드를 코딩하며 또한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자가 선택적으로 게놈에 존재하거나, 또는 염색체외 핵산 구성물로서 존재하는 것을 특징으로 하는 효모 세포.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종상동성 프로모터는 핵산 서열 SEQ ID No. 1 또는 그것의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 효모 세포.
- 제 8 항에 있어서, SEQ ID No. 1의 변이체는 핵산 서열 SEQ ID No. 27을 포함하는 것을 특징으로 하는 효모 세포:
여기서 X1은 아데닌이거나 뉴클레오타이드가 없고, X2는 아데닌 또는 구아닌이고, X3은 시토신 또는 티민이고, X4는 티민 또는 구아닌이고, X5는 아데닌 또는 시토신이고, X6은 구아닌 또는 시토신이고, X7은 아데닌 또는 시토신이고, X8은 구아닌 또는 시토신이고, X9는 아데닌, 구아닌 또는 시토신이고, X10은 구아닌 또는 시토신이고, X11은 구아닌 또는 시토신이고, X12는 구아닌 또는 시토신이고, X13은 구아닌 또는 시토신이고, X14는 아데닌 또는 시토신이고, X15는 아데닌 또는 시토신이고, X16은 티민 또는 시토신이고, X17은 구아닌 또는 시토신이고, X18은 구아닌 또는 시토신이고, X19는 TATAAATACCGCCTCCTTGCGCTCTCTGCCTTCATCAATCAAATC(SEQ ID No. 28), TATATAAACTGGTGATAATTCCTTCGTTCTGAGTTCCATCTCATACTCAAACTA-TATTAAAACTACAACA (SEQ ID No. 29), TATAAATACAAGACGAG-TGCGTCCTTTTCTAGACTCACCCATAAACAAATAATCAATAAAT(SEQ ID No. 30) 및 TATAAATACTGCCTACTTGTCCTCTATTCCTTCATCAATCACATC(SEQ ID No. 31)로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산 서열이다.
- 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, SEQ ID No. 1의 변이체는 SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 43, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 55 및 SEQ ID No. 56으로 구성되는 군으로부터 선택된, 바람직하게는 SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 55 및 SEQ ID No. 56으로 구성되는 군으로부터 선택된, 더 바람직하게는 SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 55 및 SEQ ID No. 56으로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 효모 세포.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하는 이종성 폴리펩타이드를 생성하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 배양하는 동안 억제해제 조건에 의해 이종성 폴리펩타이드의 발현이 유도되거나 또는 그것의 발현 비율이 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 억제해제 조건에서 배양하는 동안 메탄올 또는 대체 유도제가 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
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