UA126112C2 - Дріжджова клітина - Google Patents
Дріжджова клітина Download PDFInfo
- Publication number
- UA126112C2 UA126112C2 UAA201807012A UAA201807012A UA126112C2 UA 126112 C2 UA126112 C2 UA 126112C2 UA A201807012 A UAA201807012 A UA A201807012A UA A201807012 A UAA201807012 A UA A201807012A UA 126112 C2 UA126112 C2 UA 126112C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- promoter
- cytosine
- yeast cell
- iyu
- orthologous
- Prior art date
Links
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 56
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 claims abstract description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 107
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 88
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 44
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 41
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 19
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 19
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 19
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 5
- 230000003218 derepressive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 101000651887 Homo sapiens Neutral and basic amino acid transport protein rBAT Proteins 0.000 claims 1
- 102100027341 Neutral and basic amino acid transport protein rBAT Human genes 0.000 claims 1
- 241000468053 Obodhiang virus Species 0.000 claims 1
- 208000032411 Refractory with Excess of Blasts Anemia Diseases 0.000 claims 1
- 241000019011 Tasa Species 0.000 claims 1
- 210000004268 dentin Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241001099157 Komagataella Species 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 87
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 37
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 14
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 7
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 101710194180 Alcohol oxidase 1 Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101710096444 Killer toxin Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecyl 16-methylheptadecanoate Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC(C)C ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000764238 Isis Species 0.000 description 2
- 101710098554 Lipase B Proteins 0.000 description 2
- 101100237844 Mus musculus Mmp19 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000005417 image-selected in vivo spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000012739 integrated shape imaging system Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 108010031620 mandelonitrile lyase Proteins 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical compound O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150006240 AOX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710194173 Alcohol oxidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100412417 Arabidopsis thaliana REM5 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 101100494773 Caenorhabditis elegans ctl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 1
- 101100112369 Fasciola hepatica Cat-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 101100005271 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cat-1 gene Proteins 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N R-2-phenyl-2-hydroxyacetic acid Natural products OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000616303 Saccharomyces cerevisiae killer virus M1 M1-1 protoxin Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 101150031623 aox gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000011157 data evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 229960002510 mandelic acid Drugs 0.000 description 1
- NNICRUQPODTGRU-UHFFFAOYSA-N mandelonitrile Chemical compound N#CC(O)C1=CC=CC=C1 NNICRUQPODTGRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000012666 negative regulation of transcription by glucose Effects 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- DVDUMIQZEUTAGK-UHFFFAOYSA-N p-nitrophenyl butyrate Chemical compound CCCC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 DVDUMIQZEUTAGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0093—Oxidoreductases (1.) acting on CH or CH2 groups (1.17)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Винахід стосується дріжджової клітини роду Komagataella, яка включає ортологічний промотор метилотрофної дріжджової клітини або його варіант, індукований за допомогою дерепресії, де ортологічний промотор являє собою ортологічний форміатдегідрогеназний (FMD) промотор метилотрофної дріжджової клітини.
Description
80000 5 --е
У Кескеекей е 0000 ; ; 9 Боосю - . ! : Мейзлея : їв 40000. ж зо. ш "в вової г ел НН Й А і о - - ши Ши ЩО Й 00001 МеЕМО І Немох і сьЕЦе сБАОГИ Ремооівтносї РАХ РРОАТІ; Броде
Фіг. 1 Огійююдтюив реотоїете Епфодепоувостюв
Даний винахід стосується використання ортологічних промоторів у дріжджових клітинах.
Рекомбінантні білки, такі як біофармацевтичні препарати або промислово придатні біокаталізатори, найчастіше виробляються з допомогою засобів гетерологічної експресії генів у мікроорганізмах. Для виробництва рекомбінантного білка часто і протягом тривалого часу використовували ЕзсПегіспіа соїї, Засспаготусев5 сегемізіае і Ейатепіоиз Тїипді. Протягом останніх двох десятиліть як ефективна альтернатива виробництва штамів були встановлені метилотрофні дріжджі Котадаїаєйа (Ріспіа) равіюгіх, КотадаїаєМйа (Ріспіа) рНанйії (Рр),
КотадаїаейПа Киплтапії, Одаїаєеа (Напзепшіа) роїутогрпа (Нр), Сапаїда броіаїіпії (СБ) і Одаїава (Ріспіа) теїПапоїїса (Ріт). Ці штами роблять можливим досягнення високих рівнів експресії для гетерологічних білків із високою щільністю клітин. Із вищезгаданих чотирьох видів дріжджів для виробництва гетерологічного білка тим часом найчастіше використовували Р. равіогі5 (Котадаїаєїа рнапції).
Усі метилотрофні дріжджі мають суворо регульовані сильні промотори, які залучені до регуляції експресії генів утилізації метанолу (МОТ). Промотори генів утилізації метанолу зазвичай репресовані на репресуючому джерелі вуглецю, такому як глюкоза, та суттєво нерегульовані у присутності метанолу як джерела вуглецю. Якщо репресуюче джерело вуглецю є виснаженим або наявне нерепресуюче джерело вуглецю, то промотор активований з допомогою дерепресії, на основі чого ефективність цього впливу може дуже варіювати між видами і навіть усередині того самого організму. Промотор гена алкогольоксидази 1 у Р. равіогі5 05115 (РРрАОХІ), наприклад, має лише 2-495 активності в дерепресуючих умовах порівняно з метанол-індукованими умовами. На противагу цьому, промотор ортологічного гена (метанолоксидаза, МОХ) у Н. роїутогрпа (РНрМОХ) має активність до 7095 в дерепресуючих умовах порівняно з метанол-індукованими умовами. Промотори ортологічного гена у С. Боїаїпії (алкогольоксидаза 1, АООІ1) і Р. теїПпапоїїса (метанолоксидаза 1/2, МОБІ/2) також мають порівнянну поведінка.
Індукція експресії токсичним та займистим метанолом є небажаною, особливо у великих промислових масштабах, з огляду на техніку безпеки, так що сильні дерепресовані промотори являють собою придатну альтернативу. Відповідно останнім часом були розроблені варіанти
РРрАОХІ, альтернативні промотори та нові промотори МИОТ з різними дерепресуючими
Зо властивостями, щоб надати можливість експресії білка без метанолу в промисловому масштабі.
Оскільки рівні експресії таких промоторів зазвичай є значно нижчими порівняно з метанол- індукованими промоторами, одним об'єктом даного винаходу є створення придатних альтернативних можливостей для індукованої та сильної надекспресії рекомбінантних білків без метанолу у таких дріжджах, як Р. равіогів.
Цей об'єкт досягається дріжджовою клітиною роду КоптадаїаєЇа, що включає ортологічний промотор метилотрофної дріжджової клітини або його варіант, що може бути індукований з допомогою дерепресії де оортологічний промотор являє собою ортологічний форміатдегідрогеназний (ЕМО) або метанолоксидазний (МОХ) промотор метилотрофної дріжджової клітини; в цьому процесі ортологічний промотор у метилотрофній дріжджовій клітині здатний контролювати експресію поліпептидів в дерепресуючих умовах.
Цей об'єкт також досягається дріжджовою клітиною роду КотадаїаевїІа (Ріспіа), що включає ортологічний форміатдегідрогеназний (ЕМО) промотор і/або метанолоксидазний (МОХ) промотор метилотрофної дріжджової клітини або варіанти цих двох промоторів, де залишається вихідний профіль регуляції ортологічного промотору у дріжджових клітинах роду КотадаїаеПа.
Несподівано було виявлено, що промотори, здатні контролювати експресію поліпептидів у дерепресуючих умовах в інших метилотрофних дріжджових клітинах, які переважно не належать до роду КотадаїаеїІа (Ріспіа), є здатними контролювати експресію поліпептидів у дерепресуючих умовах (наприклад, підвищуючи експресію порівняно з недерепресуючими умовами), також мають порівнянні властивості у дріжджових клітинах роду КотадаїаеїІа (Ріспіа).
Крім того, несподівано було виявлено, що форміатдегідрогеназний (ЕМО) промотор і/або метанолоксидазний (МОХ) промотор метилотрофної дріжджової клітини, що не зустрічається в природі у дріжджовій клітині роду Котадаїаєйа і/або у тій самій дріжджовій клітині, має специфічні властивості у такій клітині. Ортологічний ЕМО і/або МОХ промотор значно сильніший у клітинах КотадаїаеєїйІа як у дерепресуючих умовах, так і в метанол-індукованих умовах, ніж усі промотори і Котадайаєйа природного походження, що залучені у регуляцію експресії генів утилізації метанолу ("МОТ промотори") і протестовані до цього часу. Таким чином, ортологічний
ЕМО і/або МОХ промотор значно сильніший в дерепресуючих умовах, ніж САТІ і САР промотори природного походження у клітинах Котадаїаеєїіа, наприклад ортологічний ЕМО і/або
МОХ промотори на диво такі ж сильні, як ЛОХ (АОХ1 і АОХ2) промотори природного походження бо у Котадаїаєйа в метанол-індукованих умовах в умовах скринінгу, що використовуються в дерепресуючих умовах, ніж АОХ промотори, використані в метанол-індукуючих умовах. Такі ефекти зазвичай можуть бути посилені під контрольованими дозами С-джерела у біореакторному експерименті. Ортологічні ЕМО і/або МОХ промотори можуть замінити АОХ промотори, що зазвичай використовуються у Котадаїаеійа. Таким способом можуть бути досягнуті по суті ідентичні або навіть вищі виходи експресії білка порівняно з традиційними метанол-індукованими системами експресії, але без використання будь-якого метанолу як агента індукції.
Це дивно, що форміатдегідрогеназний (ЕМО) промотор метилотрофної дріжджової клітини (наприклад, Н. роїутогрпа), який також значно дерепресований у цій дріжджовій клітині (наприклад, у Н. роїутогрпа), зберігає цей профіль регуляції навіть в іншій метилотрофній дріжджовій клітині (наприклад, Р. равіогії). На противагу цьому, більш ранні дослідження показали, що у переміщенні промоторів між метилотрофними дріжджами профіль регуляції чужорідного промотору не переміщується (наприклад, Р. разіогі5 АДОХ1 промотор, наприклад, не строго репресований у Н. роїутогріа, як це природно у Р. разіогі5; дивитися, наприклад, М.С.
Вазснке еї а. Сепе 177 (1996): 163-167 та І. Коагідце? еї а. Меазі 12 (1996): 815-822).
Відповідно, загальновизнана думка у промисловому світі полягає у тому, що різні типи регуляції між метилотрофними дріжджовими клітинами не відбуваються через промоторну послідовність, але натомість відбуваються через різні механізми регуляції у дріжджових клітинах (дивитися, наприклад, Е.5. Нагіпег еї аї. Місгоб. Сеї! Расії 5 (2006): 39-59). Незважаючи на це, несподівано було виявлено, що сильна активація форміатдегідрогеназного (ЕМО) промотору метилотрофної дріжджової клітини (наприклад, Н. роїутогрпа) у результаті дерепресії може бути переміщена не лише до інших метилотрофних дріжджових клітин, таких як, наприклад, Котадаїаєйа рай, але натомість навіть виходить за межі технічних властивостей сильних гомологічних промоторів, наприклад, як таких гена АОХ і гена САТ.
Використання ортологічних промоторних послідовностей також має інші технічні переваги.
Наприклад, шляхом їхнього використання зменшується можливість гомологічної рекомбінації, даючи в результаті вищу генетичну стабільність штамів експресії. "Дріжджова клітина роду КоптадаїаеєїІіа" включає усі дріжджові клітини цього роду, такі як
Котадаїаєйа Кипатапії, Котадаїаєа рабвіогіх, КотадаїаєМПйа райні, Котадаїаєїа рорцигїї,
Зо КотадагїаєїІа рзейдоравіогі5, Котадаїаеїйа шті та КотадаїаєйПа 5р. 11-1192. "Дріжджові клітини роду Котадаїаеїа" природно також включають ті від специфічних штамів роду, як зазначено вище, такі як, наприклад, Котадаїаеєїйіа равіогіє 5115, Х-33, КМ71, КМ71Н, СВ57435 або МКГ І.
У11430, СВ5704, ВО10, ВО11 і/або інші похідні цих штамів.
Термін "ортологічний", як використано тут, стосується молекул нуклеїнової кислоти або амінокислоти з різних видів, які щонайменше мають функціональну гомологію з відповідними молекулами нуклеїнової кислоти та амінокислоти інших видів. "Ортологи" походять із різних організмів, які виникають у зв'язку з генерацією і також отримані від спільного попередника.
Послідовності "ортологів" можуть значно варіювати між собою, але їхня біологічна і/або біохімічна функція зазвичай не піддаються впливу (наприклад, АОХ від КоптадаїаєїІа равіогі5 ортологічний з МОХ від Напзепшіа роїутогрпа, і навпаки: ЕМО від Напзепша роїутогрпа ортологічний до ЕОНІ у КотадаїавеїйІа равіогі5 і навпаки).
Термін "промотор", як використано тут, включає щонайменше один сайт ініціації транскрипції, зв'язувальний сайт для полімеразного комплексу нуклеїнової кислоти і додаткових нуклеотидів, так що ці два елементи можуть бути функціонально активними і можуть зберігати вихідний профіль регуляції початкової клітини ортологічного промотору у дріжджових клітинах роду КотадаїаеїІа. Ці додаткові нуклеотиди можуть утворювати зв'язувальні сайти фактору транскрипції, наприклад "промотор, індукований шляхом дерепресії" являє собою промотор, який активований у дерепресуючих умовах (дивитися нижче), так що молекули нуклеїнової кислоти, функціонально зв'язані з ним, транскрибовані так, що вони несуть інформацію про гетерологічні або гомологічні поліпептиди.
Ортологічні промотори згідно з винаходом, тобто ортологічний ЕМО і/або МОХ промотор, переважно включають між 50 і 2000, ще більш переважно між 100 і 1000, ще більш переважно між 150 і 800 нуклеотидів з ділянки перед старт-кодоном (проти ходу траскрипції з 5' кінця) ділянки відповідного гена, що включає промотор і кодує білок/поліпептид, переважно ділянки
ЕМО і/або МОХ гена, що кодує ЕМО і/або МОХ, що може включати 1-1000, переважно 1-900, ще більш переважно 1-800 нуклеотидів. Ортологічний промотор, переважно ортологічний ЕМО і/або
МОХ промотор, включає переважно 1-1000 нуклеотидів, переважно 1-900, ще більш переважно 1-800, проти ходу траскрипції з 5' кінця ділянки гена, що кодує поліпептид, переважно ділянки
ЕМО і/або МОХ гена, що кодує ЕМО і/або МОХ.
"Варіанти" ортологічного промотору за винаходом, переважно ортологічного форміатдегідрогеназного (ЕМО) промотору і/або метанолоксидазного (МОХ) промотору, включають молекули нуклеїнової кислоти, які відрізняються одним або більше (наприклад, 2, 3, 4,5, 10, 15, 20, 25, 50) нуклеотидами від ортологічних промоторів природного походження, переважно ортологічних ЕМО і/або МОХ промоторів. Такі варіанти промоторів є щонайменше на 8095, переважно щонайменше на 9095, ще більш переважно щонайменше на 9595, ще більш переважно щонайменше на 9895 ідентичні відповідним ділянкам промоторів природного походження.
Варіанти ортологічних промоторів, які можуть бути використані згідно з винаходом, можуть включати делеції, заміщення та вставки порівняно з промоторами природного походження, переважно ЕМО і/або МОХ промоторами. Варіанти промоторів також мають властивість надання можливості експресії білків в дерепресуючих умовах. Переважно використані варіанти, які здатні до експресії в дерепресуючих умовах щонайменше 5095, переважно щонайменше 6095, ще більш переважно щонайменше 7095, ще більш переважно щонайменше 8095, ще більш переважно щонайменше 9095, ще більш переважно щонайменше 10095, ще більш переважно щонайменше 12095, ще більш переважно щонайменше 15095 кількості білка, яка буде експресована з допомогою дріжджової клітини роду КотадаїаеЇйа, включаючи ортологічний промотор природного походження, переважно ортологічний ЕМО промотор і/або ортологічний
МОХ промотор.
Способи ідентифікації та виробництва варіантів промотору достатньо відомі. Мутації зазвичай вставлені в промотор, після чого виконане випробування, показуючи чи і як змінилися властивості (наприклад, рівень експресії зразкового білка) варіантів промотору. "Варіанти" ортологічного промотору даного винаходу, переважно ортологічного форміатдегідрогеназного (ЕМО) промотору і/або ортологічного метанолоксидазного (МОХ) промотору, також включають варіанти промотору, які включають регуляторні елементи ортологічного промотору природного походження або їх варіанти, як визначено вище (відрізняючись одним або більше, наприклад, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 нуклеотидами від послідовності природного походження), та альтернативний мінімальний промотор і/або основний промотор. Мінімальний промотор і/або основний промотор є частиною промотору, що
Зо містить у собі лише загальні елементи промотору, які є необхідними для транскрипції (ТАТА- бокс та сайт початку транскрипції). Через це регуляторні елементи варіантів ортологічних промоторів згідно з винаходом включають переважно між 100 ї 1000, ще більш переважно між 150 ії 800 нуклеотидів із ділянок проти ходу траскрипції від старт-кодону (проти ходу траскрипції 3 5' кінця) мінус 20-100, переважно мінус 25-80, ще більш переважно мінус 30-70 нуклеотидів прямо перед початковою точкою транскрипції. "Ідентичність" та "ідентичний", відповідно, стосується ступеня співвідношення між двома або більше послідовностями нуклеїнової кислоти і/або амінокислоти, які можуть бути визначені за співвідношенням між послідовностями. Процентний вміст "ідентичності" походить від процентного вмісту ідентичних ділянок у двох або більше послідовностях, зважаючи на пропуски або інші частинки послідовності (тобто, 95 ідентичності стосується число ідентичних позицій/загальне число позицій х 100). Особливо переважний спосіб для визначення ідентичності - це програма ВГА5Т Національного центру біотехнологічної інформації (МСВІ) (дивитися 5. Айб5сПиї еї аї., У Мої Віо! 215 (1990): 403-410 серед інших). Алгоритм В ОБОМб2 переважно використовується з параметрами "пропуск" "наявність":11 та "подовження":1.
Термін "метилотрофні дріжджові клітини", як використано тут, включає дріжджові клітини, здатні рости на культуральному середовищі, яке містить як джерело вуглецю речовини з лише одним атомом вуглецю, наприклад метанол. "Дерепресуючі умови", як використано у культивуванні дріжджових клітин згідно з винаходом, означає, що дріжджові клітини спочатку культивовані у присутності репресуючого джерела вуглецю (наприклад, глюкози), поки це джерело вуглецю значно мірою або повністю використається. Після зниження концентрації репресуючого джерела вуглецю (наприклад, глюкози) клітини знаходяться в дерепресуючих умовах відносно репресуючого джерела вуглецю і глюкози, відповідно. Ефективність впливів репресії може бути зумовлена типом джерела вуглецю.
Відповідно до переважних варіантів здійснення даного винаходу ортологічний ЕМО і/або ортологічний МОХ промотор є функціонально зв'язаним із молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує гетерологічний або гомологічний поліпептид.
Ортологічний промотор може бути функціонально зв'язаний з молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує гетерологічний (який не походить з Коптадаїаєїа) або гомологічний (який 60 походить з Котадаїаеїйа) поліпептид, і, таким чином, може впливати на експресію цього поліпептиду і/або контролювати її. Поліпептид, який отримується в результаті, включає щонайменше 5, переважно щонайменше 10, ще більш переважно щонайменше 50 залишків амінокислоти і, таким чином, включає молекули, які також називаються поліпептидами або білками.
Молекула нуклеїнової кислоти переважно кодує поліпептиди, такі як антитіла або їхні фрагменти, ензими, структурні білки тощо. "Функціонально зв'язаний", як використано тут, означає, що молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує гетерологічний або гомологічний поліпептид, зв'язана з промотором у спосіб, який допускає експресію нуклеотидної послідовності у дріжджовій клітині згідно з винаходом. Таким чином, промотор функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю нуклеїнової кислоти, коли це має вплив на транскрипцію кодуючої послідовності.
Відповідно до іншого переважного варіанта здійснення даного винаходу гетерологічний або гомологічний поліпептид включає сигнальний пептид, зокрема сигнальний пептид секреції.
Для секреції рекомбінантного гомологічного або гетерологічного поліпептиду з дріжджової клітини поліпептид, кодований молекулою нуклеїнової кислоти, включає сигнальний пептид.
Термін "сигнальний пептид", як використано тут, стосується пептиду, зв'язаного з С-кінцем або М-кінцем поліпептиду, який контролює секрецію поліпептиду. Сигнальна послідовність, використана у даному винаході, може бути полінуклеотидом, який кодує амінокислотну послідовність, що ініціює транспортування білка через мембрану ендоплазматичного ретикулума (ЕК). Нуклеотидна послідовність цих сигнальних послідовностей може відповідати природній послідовності вихідної клітини-хазяїна або може бути кодон-оптимізованою.
Необмежувальні приклади сигнальної послідовності включають МЕеЕ-альфа (сигнальна послідовність «фактор схрещування альфа»), сигнальну послідовність білка СВН2 з
Тисподепта геезеї, сигнальну послідовність ксиланази А з Тпегтотусез Іапидіпози5, К1 сигнал токсину кілера, сигнальний пептид для секреції інвертази, сигнальну послідовність токсину кілера з Кісумеготусез Іасії5, сигнальну послідовність токсину кілера з Ріспіа асасіає, сигнальну послідовність токсину кілера з Напзепіазрога имагит і з Ріспіа (Напзепшціа) апотаїа або їхні варіанти, як описано, наприклад, Сегедпіпо еї аІ. (Сепе 519 (2013): 311-317). Переважною сигнальною послідовністю за винаходом є МЕ-альфа (сигнальна послідовність «фактор
Зо схрещування альфа»).
Відповідно до особливо переважного варіанта здійснення даного винаходу, ортологічний
ЕМО промотор і/або ортологічний МОХ промотор, що походить від метилотрофної дріжджової клітини, вибраний з групи, яка складається з видів Напзепицїа (Одаїаєа), Сапаїда, Котадаїаеє!а і
Ріснпіа.
Відповідно до іншого переважного варіанта здійснення даного винаходу, метилотрофна дріжджова клітина вибрана з групи, яка складається з Напзепшіа роїутогрпа, Сапаїйада бБоіаіїпії,
Ріспіа теїпапоїїса, Котадаїає!а равзіогі5х, Котадаїаєїа ргГайії, Котадаїає!а рзеийдоравіогів,
Котадагїаеє!Іа шті та Котадаїаегйа 5р. 11-1192.
Ортологічний ЕМО і/або МОХ промотор та, необов'язково, функціонально зв'язана з ним молекула нуклеїнової кислоти, що кодує гетерологічний або гомологічний поліпептид, може бути присутній(я) у геномі, як екстрахромосомна конструкція нуклеїнової кислоти на плазміді з послідовністю, яка автономно повторюється (АКБ), або як вектор/експресійна касета, вбудованийца) у геном.
Ортологічний ЕМО і/або МОХ промотор та, необов'язково, функціонально зв'язана з ним молекула нуклеїнової кислоти може бути присутній(я) екстрахромосомно або вбудований(а) у геном дріжджової клітини згідно з винаходом.
Відповідно до особливо переважного варіанта здійснення даного винаходу, ортологічний промотор включає, або складається з, нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ Мо. 1 або 5ЕО ІО Мо. 2 або її варіант.
ЗЕО ІЮ Мо. 1 (ЕМО промотор):
ЗЕО ІЮ Мо. 2 (МОХ промотор):
ААТОТАТСТАААСИСАААСТОСОАаСТОСАААААТОСТТАССООССАТаСОСОБАСААТТТАСАО
ССппСОАТСВААСАААСАССТастапОсСОАОсСАОТСТОСАССАСАСТСТТОСАТОСОСССОАСАТ соссАоСасатТтОСтТИпатТАСССОСАСИатТаАсасСАССОСОАСАТССАТСАААТАТАССАСИСОСС
ААСОСОдатстотТСОдААААСАаСТТСТООАТАТСТТССОСТОССОпСОСААСОСАСОААТААТАЄ тТОССТОВАпОТОДСапаААТАТАТАТОТИТОСАСОССТАААТСТОАСАОСТОТАССАААОСТААТ
АТТТТОССТААААСАТОСАДТСпИСТаСоССасСААСаОСАДАААСААТОАСТТТаССАСТСТЕСА ссАсдотассстТатоссастоотТатТатТасСАААТАПОСТОССАСТОСТСАССССОСАТТТТССАС
АААААСАССАВСТТОСОСОСТатТстТоАСТОСТОТССОССААТААСАСадаССовсСАВаСьсСОоСА
СТСТАСАТСАДИСТОТСТОСаАТАСАСТОСАСТАССАТОССОСОСТСТОСТСАСАВАСООБААТОСО
АСТАТАААТАССОССТОСТТаСастотостТассттсСАТСААТОАААТО - ВКкО ІЮ Мо. 2 (МОХ ркотобсег): :
ССдСОСсОЛОААСОАТСТОСТОаАаСТаИстоасСОосАТоАасСтТТОоТасссСОСтТААТОСААССАО сесОодесосАсостестТтТасасАссАссатаастТайСсапАОсОссСАаТТТОТОААСаАсатосттт
АСААСОТОСТасСОСАААСТОССАСТОТСАСАТОААТОТССТОСТСОСАССААТТСАССАТОСТТСТ
СсоАВСАСССАТСТОТСТІТОПЧАОТАВААпОСОТААТСТСТОСТОСТОСОТТАСТОТАССИСААСАО птТАСТТТОаССсСтТоОССОсСсССАТААТСААСАОСТТІСТОСТІТОоТОасТОаЗсССстТОТадасСАОоСОаСасАс стотапАСОссотТосАТОдДОосОоССстТТвАсоСсОостТоЗТАстТАСТТОоТТОСаСОаТСасСтТатдасоо
СПОСО ТаассАТАСССАСАТАСАОСТОСТТООССАТТАСТІТОАТОДОСТООООСАСОЗАТОСЮ
СОСАСТОСООССАТСОАААТТТТТОССОТоОТООТАСАСТОТаАТОТСАССАТОСААТОТААТОАОоС тОсСАССТТОСОСАТСТООСАТОИСТТТТОСААТОСААСААССаСОАСАТСТОССААСАОсСТОсоССО таттадаААТсдаСсосадсатсаттадДАССАСПпСОССАСАЛОсССОосСосТттТтаСтТОаАтТОосСсОоСса освстоатТестеаАТОТАСААСОССТТТТОССАСАСаСАОТІСТОИТаААСААОСТОаССААСОСТОо
СОпААССАВСТОСАСОАОСССАСАСААТТОССОосСаТОсССаОсСтТІТОСТСАТТТСААтТаттстост
СОАТОдОаИсАСТТОСАСИТОСТОСААСЗАТТТОСОССТАССОСОТТТТаССТСАСАСТТТАССАТ вАсотоОТоСАСТОСАСАСАТОСССТТОСТОТТСАССОСОТАСАОАСЧААСассотТОоаЗссСАОС
АоОСССТТСАТОССАТТСТАТОАООССАТСТОСАСОСТОТІССТТОАОТОСОТАСТОСАСТСТат
АаСОАСТОСАСАТСТОСАВАСТОСОСТТаСТатасСстТОСсАТОСАССААТТААТТОТТОССОСАТО
САТССТТІССАССОСААСТТТТТААААСССАСТООСТТТАСССОТОЗСЗГТААААСТТаТОААТСТ
СОСААСТОАДОСС ТІ СТОСАаССОСААСОСЗААСТТІТТСОСТТССАОСАСОСАОСтТОСАТОСТО
ТСАТОтТОоАОоОСТОТОТТТасСтТООсстТАаСсСтТАСААССТОАССТТОССТААССОАсСОСасСтТАС
ССАСТаСТОТСтТОТтТОСсСстТОсСТАССАСААААТСАССАСАССАССАЧАапаССЧАТОТОССААСТО стобОосТаТСсОЗАСАСОСТаТІСТОСАСАСТаСАААТОСООСТаААССОСССАСАДАСТАААТ
ТСТТАТаИсСТАСССТОСАСТОАСТОСССАСАТССССАСТТІТТТОаСССТАСТІЗАТСАСАСАТОССОЯ
ТСАБСОСТОССОСТААОТОТАСССААССОТООСССАСАСССТОСАТОСТАТАААТАСТОСТОССАО тТаСсАСИСТОСТОАСАТСААТСТАААСТАСАААААСААА
Відповідно до особливо переважного варіанта здійснення даного винаходу варіант 5ЕО Мо. 1 включає, або складається з, 5ЕБЕО ІЮО Мо. 27. 5БО ІЮ Мо. 27 має наступну нуклеотидну послідовність: де
ААТОТАТСТАААСОаИСАААСТОСПАССТОАААААТОТТАССИСАТИаИасасозАСААТТТАСАО
ССООБСОАХТСААСпАААСАССтТаСтТапвасаА САТ АаСАСАСТСТТСАТОКССССАсА
ТОССАСООСОТТОСТОпОТАСССОпАСИТАОСАаСИСОАСАТОССАТСАААТАТАССАСОССОС
СААССОАОСТСТОСТСОИпААААСАОСТТСТООАТАТСТТССаСТатасСОСААСИАССААТААТА оТоССтТОпАСИТОАСОЗААТАТАТАТататапАастТАААТСТОАСАЧОЗТОТАССАААОСТАА,
ТАТТТЕТЕССТААААСАТОСААТОООСТтТОаСОСОС СХ АСОЗСАЛАДАСААТОАСТТІТОССАСТОСТТО
АССАСАСТООСОТОТОССастотатТОТасАААТАВаСТОССАСТОСТСАССССОСАТТТТасСА
СААААДАХЗАОСААОТТССа Та сСтТСАСсТаптаТтспасстААТААОДОЗАсССССАСКСАССКІ
АСТСТАСАТСААОСТОТСТОССАТАСАСТОСОАСТАССАХ ССО ТСТСТСХБХХоХаХоХіо ХХ 12Х1ізХ14Х15Х16Ха7Х18САСХ1о, петеїп
Хі являє собою аденін або не нуклеотид, Хг являє собою аденін або гуанін, Хз являє собою цитозин або тимін, Х. являє собою тимін або гуанін, Хе являє собою аденін або цитозин, Хв являє собою гуанін або цитозин, Х7 являє собою аденін або цитозин, Хв являє собою гуанін або цитозин, Хо являє собою аденін, гуанін або цитозин, Х:іо являє собою гуанін або цитозин, Х1 являє собою гуанін або цитозин, Хі» являє собою гуанін або цитозин, Хіз являє собою гуанін або цитозин, Х:і4« являє собою аденін або цитозин, Хі5 являє собою аденін або цитозин, Хіє являє собою тимін або цитозин, Хі7 являє собою гуанін або цитозин, Хів являє собою гуанін або цитозин, Хіо являє собою основний промотор ортологічного промотору, переважно ЕМО і/або
МОХ промотору, особливо переважна нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з ТАТАААТАС- і 34,
СОССТОСТТОСОСТСТСТОССТТСАТСААТСАААТО (БО ІБР МО. 28), ТАТА-
ТАААСТССТОАТААТІССТТССТІСТаАСТТОСАТСТСАТАСТСАААСТАТАТТААААС-
ТАСААСА (БО ІЮ МО. 29), ТАТАААТАСААСАСОодатасостосттТтТтстТА-
САСТСАСССАТАААСАААТААТСААТАААТ (ББО І Мо. 30), ТАТАВАТАСТОСС-
ТАСТТОТССТСТАТТССТТСАТСААТСАСАТС (Б5ЕО І оОМо. 31), СОАТАСОС-
САСАДАТАТАТААДОИТАССАИСТТОТАТАССАААТАТАССААСИСАаСТАСААССААСТОСТТ-
СОТТТААДАСССААСАААСААТТСТТОСОААСАТТТАСААСАААСААСОТАССИТААСАТТАА -
ТААТСОСАдОссСТ (КО ІВ Мо. 32), ОТААТСТТТСОСТСААТтТОТОАТСТСТОСТТ-
СТАСАТАТТТААТАООАСОСССААОпТАБАААААСАТАСАТААСТАСТТАС -
САААСТТСААТТОСТТААСТТАСААСТОСААТОССАТАТСТТАААСТТАТТАСАТТІАТТТАТА
(бо Ір Мо. 33) апа ССТОСТОСТАСОТІТАТСТАТААЛАССТОААОТСОТТА -
СААТТТТТСАТТТАААССАТААТСАААСАТСТАСАТТОСААТССАТАААААССАСАТА-
СААДОТТАТТААСАТТАТАССТТАСАТТСТАСАСТАСТАТАОСААССТА (БО ТІ Мо. зокрема 5ЕО ІЮ Мо. 28, 5ЕО ІЮ Мо. 29, 5ЕО ІО Мо. 30 ії БЕО ІЮО Мо. 31, зокрема 5ЕО ІО Мо. 28. Щонайменше один нуклеотид з 5ЕО ІО Мо. 27 відрізняється на відповідній позиції «ЕО ІЮ
МО. 1, таким чином, даючи в результаті варіант 5ЕО ІЮ Мо. 1.
Стало дивно, що щонайменше одна, переважно щонайменше 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9 або 10 точкових мутацій (вставок і/або заміщень) у ЗЕО ІО Мо. 1 (дивитися ЗЕО ІЮ Мо. 27) дають у результаті варіант промотору, який демонструє кращі ефекти порівняно з ділянкою промотору, яка складається з або включає 5ЕО ІЮ Мо. 1. Дріжджові клітини, які включають такі промотори, функціонально зв'язані з молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, показують щонайменше такий самий або навіть підвищений рівень експресії, щонайменше у перші 24 години культивування, порівняно з дріжджовими клітинами, які містять промотор, що складається з 5ЕО ІЮ Мо. 1. Отже, особливо переважно модифікувати 5ЕО ІЮ Мо. 1 на одній або більше позиціях, позначених на їхній відповідній нуклеотидній послідовності ФЕО ІЮ Мо. 27 як Хі-Хів і Хі-Хів.
Мутації одного або більше (2, 3, 4, 5, 6 або 7) нуклеотидів Хі, Хз, Ха, Х5, Хо, Хів і Хі7 БЕО ІЮ
Мо. 27, які дають у результаті нуклеотидну послідовність, яка відрізняється від БЕО ІЮ Мо. 1, є переважними, оскільки такі промотори також показують підвищену експресію поліпептиду і білка, порівняно з використанням 5ЕО ІО Мо. 1 після 48 годин культивування в дерепресуючих умовах.
Особливо переважні мутації одного або більше (2, 3, 4 або 5) нуклеотидів Хі, Ха, Хе, Хів і Х17
ЗЕО ІЮО Мо. 27, які дають у результаті нуклеотидну послідовність, що відрізняється від ЗЕО ІЮ
Мо. 1, оскільки такі промотори також показують підвищену експресію поліпептиду і білка, порівняно з використанням 5ЕО ІО Мо. 1 після 72 годин культивування з використанням метанолу, наприклад, як джерела вуглецю.
Як зазначено вище, Хіо ЗЕО ІЮ Мо. 27 може бути основним промотором природного походження у ЗЕО ІО Мо. 1 (тобто
ТАТАААТАССОССТОСТТОСОСТСТСТОССТТСАТСААТСАААТС (БО ОО Мо. 28)) або альтернативним основним промотором. Особливо переважні основні промотори включають або складаються з 5ЕБО ІЮ Мо. 29, 5ЕБО ІО Мо. 30 і 5ЕБО ІЮО Мо. 31. Усі ці основні промотори показують у поєднанні з ЗЕО ІЮ Мо. 1 або ЗЕО ІЮ Мо. 27 (основний промотор природного походження заміщений одним з цих альтернативних основних промоторів у позиції Хіо 5ЕО 10
Мо. 27) значно збільшений рівень експресії поліпептиду, порівняно з промотором, кодованим
ЗЕО ІО Мо. 1 у дерепресуючих умовах.
Особливо переважні варіанти ЗЕО ІЮ Мо. 1 вибрані з групи, яка складається з наступних послідовностей нуклеїнової кислоти:
ЗЕО ІО Мо. 35 (м; див. приклад 2):
ЗЕО І МО. 35 (71; вее ехатріє 2):
ААТОТАТСТААДАСОСАААСТОСИДОаСТОСАААААТОТТАСОСООССАТИСОСОСОсАСААТТТАСАЄ
ССООСОААТСААСАААСАССТОаСтТОСИСССсАОСАСТОСТОСАСаССАСАСТСТТОССАтТОВвасСессАсА тосСсАССасаттсстТОТАССОаОСАСИТАООСАВСОСЧАСАТССАТСАААТАТАССАСОСЯС
САДСССАСТСТСТОСОДАААСАССТТСТОИСАТАТСТТОСОСТОаВСОССОСААССАСОААТААТА
СТОССТаПАССТСАСОСААТАТАТАТОТОТОСАССОТАААТСТОАДСАСОСТОТАВСАААОСтТАА
ТАТТТТОССТААААСАТОСААТСИССТОССССОСААСООСАААААСААТоАСтТТТООсСАСТСТТо
АосАаАдстасастетТоосастоатоТОтТОсСАААТАСИСТОССАСТаСтТСАССССаОАТТТТОСА
САДАААСАССАДаИттОСасостТатТсТосАСТаСТИТССасСсСААТААСАССАсСССассАсосЯясьо
АСТСТАСАТСАДОСТОТСТОСОАТАСАСТОСАСТАССАТСССОЗТСТОТОААСАСОСаААТОЯ
САСТАТАААТАССОССТОСТТИСОСТСТСТОССТТСАТСААТСАВАТС
ББО Ір оОМО. 36 (уг2):
ААТОТАТСТААЛАСИСАААСТОСОАОСТОСАААААТОТТАССОСССАТассСсобАСААТТТАСАО апСООССАТСААСАААСАССТОСТОСИасСсАОСсАатстОвАОСАСАСТСТТОаАтТасооссСспАСАТ сесдоесасаттостасатТАСсаппАсСстТаАООсСАОСОсСспАСАТОСАТСАААТАТАССАСОСОСС
ААССОАОСТСТСТОаОДАААСАОСТТСТаСАТАТСТТОСОСТООСООСОСААССАССААТААТАС
ТОССТООАССТОАСОСААТАТАТАТОаТатаосАСастТАААТСТОАСАСастТаТАаСАААОСтТААТ
АТТТТОССТААААСАТИСААТОаайСтТОаССССассАСООСсАЛАААСААТОАСТТТОССАСТСТТСА сеАсСАсТОсСОсТатосСастоатататТасСАААТАСИсСтТоСсСАСТОСТСАССССаСАТТТТОСАС
АЛАААсдасадаттосадаатТатотсАСТаататТсСОсСсСВАТААСАсоДаСовОСАВОСАСОоСсА
СТСТАСАТСААДИСТИаТСТОСаАтТАСАСТСИАСТАССАТОСОСОТСТСТСАСАСАОссОСААТИСС
АСТАТААЛАТАССасСсСтТосСТТасостотстТОсСстТтТсСАТСААТСАААТС
БО ІЮ МО. 37 (УЗ):
ААТатТАТСТАААСОСАААСТОСОАДОСТОСАААЛАТОТТАССООССАТОСОСОСАСААТТТАаАС псппсоАТСААПАААсСАОоСТаСтТааОсСОвОСАСТСТОСАССАСАСТСТТООАТОСОССССАСАТ сесдесасаттТостапатТАСсапсАСстТОАаОСАЯСОСОАСАТССАТСАААТАТАССАСОСОСС
ААССаДаТстТСТООпААААСАОСТТСТапАТАТСТТССОСТООСОпСОСААСОСАССААТААТАС
ТОССТОапАСаТаАСасААТАТАТАТатТОТасАСааТАВАТСТОАСАсаТаТАасСАААСаИтААТ
АТТТТССТААААСАТИСАДТОааСТаССССОСААСООСААДАААСААТОАСТТТОССАСТСТТСА осАсАстТассстатоссастоатататасСАААТАЧИСТСССАСТОСТСАССССООАТТТТОСАв
АААААТАССАЛаТТОСапасТаТСтТСАСТОСТаИтссОСсСААТААСАСсАдоСсоСаСАОССАСОСА
СТОТАСАТСААИастотТотТосСапАтТАСАСТОСАСТАССАТОСОСОТСТСТСАСАОЛОосаСААТОСС
АСТАТААЛАТАССОССТОСТТОаСОСТОТоСТОСсСТЕСАТСААТСАААТО
ЗБО тр МО. 38 (у4):
ААТСТАТСТАЛАСаСАААСТОСОДастаслЛАЛААТаттТАСОпасСсАТасСОаСапАСААТТТАСАО
ПСОИСОДТСААСАААСАССТОСТОПЙИСОАоСАсСТСТавАВсСАСАСТОТТОСАтТасасСсСОАСАТ
СССАССОСОТТОСТаОСТАСОПОСАСОТСАСОСАССОСОДСАТССАТСАААТАТАССАСОСОСО
ААСССАСТСТОТССПААААСАССТТСТОСАТАТСТТССОСТООССОСОСААСОАССААТААТАС
ТОССТИаЧАСПОТОАСССААТАТАТАТОТОТИасАСОСТАААТСТаАСАВОаТОГТАССАААСИТААТ
АТТТТОССТААААСАТИСААТООССТОССССОСААСПОСАААААСААТОАСТТТООСАСТСТТСА
СсСсАпАатОосОаТаТосСсасТоаТОГТгГасСАААТАСИСТСССАСТОСТСАССССОСпАТТТТОСАС
АААААСАССААСТТОСОСОСТОТСТСАСТОСТОТОСОССААТААСАОСАСОпаСАСОСАСОСА
СТСТАСАТСААССТатсСтТОСсАТАСАСТОСАСТАССАТОСОСОТСТОТСАОАСООСаАЛАТООС
АСТАТАААТАССаСсСтТоСсТТОСсОасСтТсСтТСТаИСсСТІСАТСААТСАААТО
БКО ІЮ БО. 39 (уБ):
ААТОТАТСТАААСССАААСТОСОАССТОСАААААТаТТАССООССАТОСОСОСАСААТТТАСсАО
ССаПССАТСААСАААСАССТОСТОСОСаАОСАСТСТОСАССАСАСТОСТТОСАТОСИССССАСАтТ
СесАоСасстІостТасатАсСсаЗАСТаАСаСАСОСЧАСАТССАТСАААТАТАССАССНКТСЯ
ААСССАСТОТОСТООСААААСАССТТСТОСАТАТСТТОСОСТООСОССССААСОСАСОДАТААТАС
ТОССТОСАСОТСАСОСААТАТАТАТСТОТОСАСОСТАААТСТОАСАОСОТОТАССАААСОТААТ
АТТТТОССТААААСАТОСААТОПОСТаССССасСААСассАААААСААТОАСТТТООСАСТСТТСА,
ССАСАСТОСОасСТОТОССасСтТОсСтТОТстТОсСАААТАСОСТОССАСТОСТСАССССОСАТТТТОСАС
АААААСАССААИТТОСООпатТатТстТоАСТастатосассААТААСАСОАаССООСАСОСАСОСА
СТСТАСАТСААОСТОТСТОСОАТАСАСТООАСТАССАОССОСаТСТСТСАСАСАСИОСААТОсОС
АСТАТАААТАССОССТОСТТИСаСТОТОСТОССТТСАТСААТСАААТС 5БО Ір МО. 40 (ув):
ААТаТтТАТСТАААСССАААСТОСаЛасСтТапАдААААТОТТАСОапСаАТасОсСпзАСААТТТАСАС пОпССаАТСААСАААСАССТОСТОапОСОАССАСТОТИСАИСАСАСТСТТСОАТОСОСССОАСАТ
СССАССОСаТТОСтТасстТАССаССАССТОАСОСАОСОСОАСАТССАТСААДАТАТАССАСООСОСО
ААСССАСТСТОТСОСААААСАОСТТСТОСАТАТОТТОСССТОССОССОСААСОСАССААТААТАС
ТОССТИПАПОТОАСОСААТАТАТАТОТИТИОАСОСТАААТСТОАСАООСТОТАССАДАСОТААТ
АТТТТОСТААААСАТаСААТОСОСТаССССОСААСОСОЛАААЛОДАТСАСТТТООСАСТСТТСА сесдодатасостатсссастТсатататТасвААТАСастТИсСсСАСТОСТСАССССООАТТТТОСАС
АААЛААСАССАВСТТОСОсастТатТОтТсСАСТИИТИтоСасСсСААТАЛОАССАОСССОСАСОСАСОСА
СТСТАСАТОАЛИСТОТСТОСОАТАСАСТОСАСТАССАТОСОССТОТОТССОДОДаСОСААТоСоС
АСТАТАААТАСОСаССТОСТТасастТоТстТасстТТсАТСААТСАААТО 8ЕО ІД МО. 41 (у7):
ААТОТАТСТАААСИСАААСТОСОАССТОСАААААТСТТАССИабССАТОСОСОСАСААТТТАСАа
ПСпССВАТСААСАААСАССТОИСТОСЙИССАССАСТСТООАДОСАСАСТСТТССАТОСОССССаАСАТ
СССАССаСаТТССТаСОТАСССССАССТСАСОСАССОСОАСАТССАТСАААТАТАССАООСОСС
ААСССАСТОТСТСОСААААСАССТТСТОЗАТАТСТТОСОСТООСООСОСААСОАСОААТААТАС
ТОССТОЧАаСТаАСОСААТАТАТАТОТСТОСАСОСТАААТСТОАСАСОСТИТАОСАААССТААТ
АТТТТССТАДААСАТИСААТОСОСТОССССОСАДСОССАААААСЛАТЧАСТТТОССАСТСТТСА
ССАСдстТОссоТеТОССасСтТОСстТоТСтТасСАААТАСОСТОССАСТастТсАСССсСОобАТТтТТасАо
АВААААСАОСАДОТТОСОСОСТИТСТСАСТОСТОТОСаССААТААСАСалоССоОСАСОСАСОСА
СТОТАСАТСААССТОТОТОСОСАТАСАСТОСАСТАССАТОСОСОТСТСТСАСАСАСОССААТОСО
АСТАТАААТАССЯССТОСТТОСОСТСТСТОССТТСАТСААТСАВАТО
5БО ІРР МО. 42 (хУ8):
ААТСТАТСТАДАСОСАААСТОССОАОСТОСАААААТОТТАССОССОАТОСОСОСАСААТТТАСАС
ПСПОСОСАТСААСАААСАССТОСТОСОССАВСАСТСТОСАОСАСАСТОСТТООАТаСаСОССАСАТ соесАсоссеттТоСтТаватАССООСАССТОАСОСАССОССАСАТССАТСАААТАТАССАОСОСОСС
ААССОДОТОТСТСОСААААСАОСТТСТОСАТАТСТТОССОСТИОССОСОСААСОАСИААТААТАО
ТСОСТОСАСОТСАСОСААТАТАТАТОТИТОСАОССТАААТСТОАСАИСОТИтАССАААССТААТ
АТТТТОСТААААСАТИСААТОСОСТИССССОСААСОООАААААСААТОАСТТТОСОСАСТСТЕСА
ССАСдОТОссстТаТОоСастТостаТстТОсСАААТАСОСТОССАСТОСТСАССССОСАТТТТОСАЄ
АААААСАССААДСТТОСОССССТОТСТОСАСТОСТОТОСОССААТААСАООДаССпОСАОССАСОСА
СТОТАСАТСАДОСТОТОТОСОАтТАСАСТОСАСТАССАТОСОСОТСТОСТСАОСОЛасОсААТООССЯ
АСТАТААДАТАССОССТОСТТОСОСТОТСТаССТТСАТСААТСАААТО
КО ІЮ МО. 43 (59):
ААТСТАТСТАААСОСАЛАСТОСОДССТОСАААААТОСТТАССИапСОАТОСаСаСАСААТТТАСАО
СССОСОАТСААСАААСАССТастТапсСсаласАатстТапАпСАСАСТСТТСОАТОоСасСсСсаАсСАТ сосАсСсосстТТостТоостАССОСОАСОТаАОССАССОСОАСАТОССАТСАААТАТАССАсССССОСС
ААДСССАСТОСТСТСООААААСАССТТСТОСАТАТОТТОСОСТОССОБСОСААССАССААТААТАС
ТОССТОЕСАССТСАССОААТАТАТАТОСТИтТапАООСТАААТСТОАСАЧИСТОтТАЛОСАААОСТААТ
АТТТТОСТААААСАТОСААТССОСТаСОССОСААСООСААВААСААТОАСТТТООСАСТСТТСА
ССАСАСТООСОСТОТОСООСОТОаТатТаИтасСАААТАСССТОССАСТОСТСАССССОСАТТТтТасАє
АААААСАССААСТТССОСОСТОТСТСАСТОСТОТССОССААТААСАСадовссовсАаОосСАСасА
СТСТАСАТСААССТатТСтТОСОАТАСАСТОСАСТАССАТОСОСПОТСТСТСАПАСАСОССААТОСС
АСТАТААДАТАССОССТОСТТаСОСТОТСТОССТТСАТСААТСАААТС
БЕО Ір МО. 44 (У10):
ААТОТАТСТАААСССАААСТОСОАССТОСАААААТОТТАСССОСОАТОСИаСОсАСААТТТАСАС
ПСОССбАТСААОАААСАССТОСТОООСАССАСТСТОСАОСАСАСТОТТОСАТОаСОССССсАСАТ сссдососотТТостТовОТАССбОосАСОСтТадОСАвСССЗАСАТОССАТСАААТАТАССАССОСОСС
ААССОАОТСТСТООСААААСАССТІСТОсАТАТСТТОССОСтТОавОаСОСААСпАСОААТААТАЄ тесстаспАсОТОАсСОСААТАТАТАТОТОТОЗАООаТАААТСТОАСАСССТОТАССАДЛАСОТААТ
АТТТТССТААААСАТОСААТСОССТИаССССОСААСИСОАААЛАБСААТОАСТІТООСАСТСТТСА
ССАСАСТОСОССТОТОСССОСТоОТОТОТОСАААТАСОСТОССАСТОСТСАССССОСАТТТТОСАС
АААААСАВСААсСТТоСОосоОТОТсТСАСТастТатссСОСссААТААВАапАЧСОСОСАВОСАСОСА
ОТСТАСАТСААССТОТСТОСОАТАСАСТОСАСТАССАТОСООСОТСТСтТоАаАОоСоОООсСААТОСС
АСТАТАААТтТАССОССТоСстТТаСаСсСтТотТоТасстТТсСАТСААТСАААТО
БЕО ІЮ МО. 45 (Уу11):
ААТОТАТСТАААСИСАААСТОСОАОСТасААЛАААТОСТТАССОССЗАТОСОСОСАСААТТТАСАО
СОС АТСААВАААСАССТОСТОСООСОАССАОТСТООАССАСАаТСТТОСаАТОаВОСССОАСАТ сССсАСсССсОСоТтТоСстТеСаОтТАССООпАСОТаАпасСАаСОСсАСАТССАТСАААТАТАССАсОаСОосСо
ААССОАОТСТСТСОБААААСАССТІСТОЗАТАТСТТССОСТОССОССИСААСаАСсААТААТАС тТоССтТОопАСОТОАСОСААТАТАТАТОСТИаИТОсСсСАССОИТАААТСТОАСАСООГТОТАССАААСаТААТ
АТТТІССТААААСАТаСААТОСООСТИССОСОСААСОСОАААААПААТИаАСТТТОаОССАСТСТТСА ссАбАсСТОСОСТОоОТоеСОовСТОоСататаТтТасСАААТАВаСТОССАСТОСТСАССССОСАТТТТОасСАО
ААВААЛАСАССААОТТОСОСОоСТОТсТСАСТИТОТОСОССААТААСАсСАсССапСАСОСАСОВА
СТСТАСАТСААОССТатТСтТоссАТАСАСТОСАСТАССАТОСОООТСТОСТСАСАСАСООоспААтТасс
АСТАТАААТАССОСССТОСТТІОСаСТСТОТасСсСтТТСАТСААТСААЗАТО бБО ІП МО. 46 (Уу12):
ААТОТАТСТАААСОСАААСТОСОАССТОСАААААТОТТАССОаССпАТаСОСОЗАСААТТТАСАС
СО СОАТСААВАААСАССТОСТОСОИСОСАССАСТОСТОСАОСАСАСТСТТОСОАТОсСОССОСАСАТ
ЄсСсСАСооСОТІССТОССТАССОПпАССТОАОССАВСОСОАСАТССАТСАААТАТАССАВОСЯ СО
ААСоеСАСТСТСТСОпААААСАССТІСТаасАтТАТОСТТОСаСТОавСсОоСаСААСЗАСОСААТААТАЄ
ТОССтТОаСАООТОАСпСААТАТАТАТОТОТОСАСООТАААТСТОАСАСОСТИатАаСАААаСТААТ
АТТТТССТААААСАТОСААТСОИСТОССССОСААСОСППАЛААААСААТаАСТТТООСАСТСТТСА сСсАадстасастетоссостоатататасСАААТАСОСТОССАСТОСТСАСССсСОоСАТТТтТасАц
ААААДАСАССААСТТССоСОосСТОТСТСАСТОСТОТОССаСсСААТААпАсаАосоСсавсАвасАсСосА
СТСТАСАТСААаСТОТСТОССсАТАСАСТССАСТАССАТОСОСОТСТСТСАСАСАССОСОСААТОСО
АСТАТАААТАССОССТОСТТОаСОосСтТоТСтТОасСсСТТсСАТСААТСАААТС
БО ТО МО. 47 (УЗ):
ААТСТАТСТАААСОСАААСТОСОАОСТОСАДАААТОТТАССООСОАТОоСаСОбАСААТТТАСАО
СССОССАТСААСААДАСАССТОСТОИсаспАссСАОТСТОааАССАСАСТоТТоаАтТовасСсССАСАТ сесдосасатТТостТОсоТАССОПОСАСаИатадсайсСАССаспАсСАТССАТСАЛАТАТАССАСССОСО
ААСССАСТСТСТОСОСААААСАССТТСТОСАТАТСТТОСОСтТааВСООСОСААСОАСОААТААТАЄ
ТОССТаСАСОТОДСОПААТАТАТАТОТОТОСАСОСТАААТСТОАСАССОТОТАССААЛАССТААТ
АТТТТОССТААААСАТИаСААТОСОСТаССССОСААСИаООАААААСААТОАСТТТООСАСТСТТСА
ССАСАОотТОосаСстТаТОССастсстТагОТасСАААТАСОСТОССАСТОСТСАССССОПАТТТТОСАЄ
АААДАСАССААсСТТОССОСООТаТСТоАСТОосТОТОсСассААТААВАаССАсСсоооСАсасАСасвА
СТОТАСАТСААССТаТОтТОСОАТАСАСТОСАСТАССАТОСОССТСТСТСАСАСАСОСОААТОоОС
АСТАТАААТАССОССТОСТТОСастотТотТОсСсСтТТсСАТСААТСАААТС 5БО ІРО МО. 48 (У14):
ААТОТАТСТАААСИСАЛАСТОСОСДИСТОСАААААТОТТАССООССАТОССИСОИСАСААТТТАСАС
ССППССАТСААСАААСАССТИстасасоАасАСТОСТОСАОСАСАСТСТТСОАТОапаСССОАСАТ сесдесасстТТосСтТопстТАССОПСПАССТОАВаСАОСОСОАСАТССАТСАААТАТАССАОССЬСОСС
ААССОАСТСТСТОСаААААСАОСТТІСТапвАТАТСТТССИСТООСООСпСААСОСАСОААТААТАС
ТОССТОСАСОТаАСССААТАТАТАТОТОТаСАОСОТАААТСТИаАСАасСОТОТАВСАААССТААТ
АТТТТОССТААААСАТаСААТСЧОСТОССССОСААСапаАААААОАДАТОАСТТТООСАСТСТТСА
ССАСДОТОсОсТатТоСсастТСстТОстТаТОСАААТАЧОСТОССАСТОСТСАССССОбАТТТТОСАСИ
АААДАСАССАдсТТОСппСОТаТСтТоАСТОСТОТОСасССААТААСАСОАдОССооСАсасСАСаИааса
СТСТАСАТСАВИСТаИТОСТОСОАТАСАСТОСОСАСТАССАТОСОССТОСТОСТСАаСАЛИАОСОСААТаСС
АСТАТААЛАТАССОССТОоСТТасастосТстОсСстТтТсСАТСААТСАААТО 5КО Ір МО. 49 (У15):
ААТСТАТОТАААСИСАЛАСТОССОАДаСТОСАААААТОТТАССОССОАТИаСОСОСАСААТТТАСАС
СССОСОАТСААСАААСАССТОСТОЧИСОДОСАСТСТОСАОСАСАаТОСТТСОАТОСОСССаАдаАТ сесдоесасаТТоСтТаСстТАСССспАСОТаАСОСАОСассАСАТОСАТСАААТАТАССАВОСОССС
ААССОСАСТСТСТОИаСААААСАОСТТСТОСАТАТСТТОСОаСТОССОасСОСААССАСОААТААТАС
ТОССТОПАСОТадсасААТАТАТАТСТИТОСАСаСТАААТСТСАСАСОПТОТАССАААООСТААТ
АТТТТОССТААААСАТОСААТСааСТасСсссСОосСААССааАААААСААТаАСТТТОасЗСАСТСТТСА
ССАСАСТаСОСтТатоссастТоатТаИтТатТОсСАААТАаЙаСТОССАСТОСТСАСССОООАТТТТОСАВ
ААВААСАССААСТТОСОпастТатстсАСТаСстТатссассААТААСАаСсАОССОоСАпасАсацАа
СТСТАСАТСААДИСТаТоТОССсАТАСАСТОСИИАСТАССАТОСИВОТСТСТСАСАСАСапОасСАтТОоСе
АСТАТАААТАССаССТОоСстТтОСастотстТассттсАТСААТСАААТС
БКО ІЮОМО. 50 (х16):
ААТОТАТСТАААСОСАААСТОССАССТИСАААААТОТТАСССОСОАТОСОСОСАСААТТТАСАС
ССООСОАТСААОЛААСАССТОСТИСОСОАОСАСТСТООАОСАСАСТСТТОСАТОСОССССАСАТ
СССАССОСОТТССТОССТАССОПОСАССТОАСОСАССОСОСАСАТССАТСАЛАТАТАССДОВСОЯСС
ААССОАСТСТСТОСОААААСАССТТСТОСАТАТСТТССОСТОЙСПИСОСААССАСОЛАТААТАС тТОССТОПАОСТОАСОСААТАТАТАТОТОТОСАОССТАААТСТОАСАОССТОТАССАЛАССТААТ
АТТТТОСТААААСАТИСААТОИОСТИССССОСААСОССАААЛАСААТОАСТТТОССАСТСТТСА
ССАПАСТОСОССТОСТОССОСТОСТатТОтТОсСАААТАВОСТОССАСТОСТОАСССОССАТТТТОСАа
АААААСАОСААСТТОСОООСТОТСТСАСТОСТОТОСОССААТААСАСПАСССОССАСОСАСОСА
СТСТАСАТСАДОСТОТСТОСОАТАСАСТООАСТАССАТОСОПОТСТСТОСАСАОАССССАСТОСС
АСТАТАААТАССОССТОСТТаСасСтТОТСТОаСсСтТтТсСАТСААТСАААТО
КО ІроОМО. 51 (717):
ААТСТАТСТАААСОСАААСТССИАОСТИСАААААТСТТАССООСОАТОСОСОСАСААТТТАСАа
ПСООСОАТСАДОАААСАССТаСТОВаСОДОСАСТСТОСЛОСАСАСТСТТОССАТОСОСССОАСАТ
СССАССОСОТТОСТОИпСТАССООПАСИТОАОССАОСОССАСАТОСАТСАААТАТАССАСОВСОСС
ААССОДОТСТСТСОСААААСАОСТТСТОСАТАТСТТССОСТОпССОСОСААСОАСОААТААТАС
ТОССТОСАОСТСАССОААТАТАТАТСТОТОСАСССТАААТСТОАСЛОССТОСТАССААЛАССТААТ
АТТТТССТААААСАТОСААТСОССТаССССаСААСОССАВАААСААТИОАСТТТООСАСТСТТСА
ССАСАСТОСССТОТОССОСТССТИТСТОСАААТАСОСТОССАСТОСТСАСОССОСАТТТТОаСАС
АААААСАОСААСТТССООССТОТСТСАСТОСТОТОСОССААТАЛаЛОсАаСОВОСАпаСАСОСА
СТСТАСАТСАЛОСТОТОТОССАТАСАСТОСАСТАССАТОСООСТОТСТСАСАСАССОСАдСоОС
АСТАТАААТАССИССТОСТТОСОСТСТСТаССТТСАТСААТСАААТС 5БО ІЮ МО. 52 (у18):
ААТОТАТСТАЛАСОСАААСТОСОАОСТОСАДАААТОТТАССОССПАТИСОСОСАСААТТТАСАО
ССССССАТСААСАДАСАССТОСТОССССАССАСТОСТОПАССАСАСТСТТОСАТОСССОССАСАТ
СССАССаСсТТоСтТОСотТАССООСАСОТОАООСАССОСОАСАТССАТСАААТАТАССАВОСОСС
ААССОАСТСТСТСООААААСАИСТТСТОСАТАТСТТССО СТО СОС ОСААСОАСОДАТААТАС
ТОССТИаСАССТСАССОААТАТАТАТОТИТОЧАЧОСТАААТСТОАСАСОСТОТАОСАААССТААТ
АТТТТОСТААААСАТОСААТОСОСТОССССОСААСОСПАААААСААТОАСТТТОССАСТСТТСА
ССАСАСТОСССТОТООСОСТОСТатТстТасСАААТАСОСТОССАСТОСТСАСССССОАТТТТОаСАО
АВАААСАССАЛОСТТОСССОССТИтТСТСАСТОСТОТОСОССААТААСАСОДОССОССАПОСАСОСА
СТОТАСАТСААОСТОТСТОСОАТАСАСТОСОАСТАССАТОСОСИТСТОСТСАСАСАСООСААТСОС
АСТАТАААТАССаССтТОоСтТТОСасСтТотТСТОССТТСАТСААТСАААТС 5ЕО І МО. 53 (у19):
ААТатТАТСТАААСССАЛАСТОСОАОСТОаЧДААААТОТТАССОСССАТОСОСОБАСААТТТАСАЄ
СОСОСОСОАТСААСАААСАССТОСТОапасССАОСАСТСТОСАОСАСАСТОСТТСОАТОСОСССОСАСАТ
СеСАССОпСОТТОСтТОСТАСССОСАСОТОАОССАССОССАСАТОСАТСАААТАТАССАОСОСОСС
АДССИДИТСТСТОСОСААААСАОСТТСТОСАТАТСТТССИаСТООСОСОСОСААССАСОААТААТАС
ТОССТапДСсСТОДСССААТАТАТАТОТОТОСАСОСТАААТСТОСАСАСОСТОТАССАААОСТААТ
АТТТІТОСТААААДСАТОСААТОСИСТаССССаСААСОССАААААСААТСАСТТТООСАСТСТТСА ссАсАСстТадастТатТоОСаСстТостТататасСАААТАСОСТОССАСТОСТСАССССоСАТТТТОСАЄ
ААЛАВАСАССААСТТОСОСОСТаИтТстТсАСТОСТаИтосСасСсСААТААсСАОоСАОССООСАСВСАСОСА
СТСТАСАТСАДОСТОТСТОСОАТАСАСТООАСТАССАТОоСОаСТСТСТСАСАСАССОбААТОСС
АСТАТАААТАССИССТОСТТаСастотстТОсСстТтТсСАТСААТСАААТС
ЗЕО ІООМО. 54 (у20):
ААТОТАТСТАААСОСАААСТОСОДОСТОСАВАААТОТТАССООСОАТОСИСОБАСААТТТАСАО пСССаСаАТСсАВСАААСАССТИсТИапассдосАатТостТапласАСАСТоТТопАтТосасСсСалсяАт
СССАССОССТТОСТООСТАССОПОДСаТаА па Сас сСсАСАТССАТСАААТАТАССАсСТаТсо
ААСССАСТСТОТОпСААААСАОСТТСТаСАТАТСТТССИСТООСОССОСААСОАСОААТААТАС
ТООССТОСАССТОАСОСААТАТАТАТОТОСТОСАССИТАААТСТОАСАСООСТОТАССАААВОСТААТ
АТТТТОСТААЛАСАТОСААТОСаСТассссасААСООСАААААСААТОАСТТТООСАСТСТТСА содадстаедастатоссастоатататТОосСАААТАСОСТОССАСТастсАСсССОобАТТТТОСАС
АВАААСАССАЛОТТОСССОСТОТОСТСАСТОСТОТОССОССААТАДОДОасСАсССооСАСОСАСОовА
СТСТАСАТОСАВОСТОТСТОССОАТАСАСТООАСТАССАТОоСОСОТоСТСТоАсАОсАаООСААТОСО
АСТАТАТАААСТОСТОАТААТТОСТТОСТТСТаАСТТССАТСТСАТАСТСАААСТАТАТТАЛАВ,
СТАСААСА
КО ЖБОПОМО. 55 (У21):
ААТСТАТСТАААСОСАААСТОСИАЛаСтТОСАААААТОТТАССООССАТОСОСОБАСААТТТАСАС
СССПСаАТСААСАААСАССТОСТОпОСОАЛССАСТСТОСВОСАСАСТСТТОЗАТОСОССОСАСАТ сссдесасеттостТОсатТАССОпОАСстТОДаСсСАОСОСОАСАТССАТСААЛАТАТАССАСССОСС
ААССИДИТСТОТСОпААААСАОСТТСТОСАТАТСТТССОСТОССОССОСААСОАССААТААТАС
ТОССТаСАОСТСАСОСААТАТАТАТИаТОСТИСАСОСТАААТСТОСАСАСОСТатАОСАЛАООСТААТ
АТТТТОСТААААСАТОСААТСПОСТаССССаИсААСООпАААААСААТОАСТТТООСАСТСТТСА ссСАВБАСТОСОСТОаИТоССаСТОаТОаТаИТаСАААТАЧЙОИСТОССАСТОаСТСАСССОС,аОАТТТТаСАС
АААААСАССААСТТОССОаСТаТСТСАСТОСТИтТССассААТААВАОСАаЙССаИИСАСОСАСОСА
СТСТАСАТСААОСТОТСТОСОАТАСАСТОЧАСТАССАТОСОСОТСТСТСАПАСАСОССААТаачо
АСТАТАААТАСААСАССАОТаСОТОСТТТТСТАСАСТОСАСОССАТААЛАСАААТААТСААТАЛАТ
БЕО ІЮ МО. 56 (ху22):
ААТОТАТСТАААСОСАААСТОСАОСТОСАААААТОТТАСОСООСАТОСасСОСАСААТТТАСАС
ССПИСОАТСААСАААСАССТОСТОСОСаЛасСАСТСТОЗАаСАСАСТСТТССАТОСОССССАСАТ
СССАССОСОТТОСТОСОТАССООСАСОТОАООСАССИСОАСАТССАТСААЛАТАТАССАСОСОСО
ААССЧпАСТСТСТОИСААААСАССТТСТОЗАТАТОСТТСОССТа СО СаСААСЧАССААТААТАО
ТСССТОСАСОТОАСОСААТАТАТАТОТОТОЗАЗИСТАААТСТОАСАСОСТИаТАОСАААОСТААТ
АТТТТССТААААСАТОСААТОООСТОССССОСААССОСАААААСААТОАСТТТОССАСТСТТСА сСсСАСАстТсссстатоссастоотоТстТасСАААТАВастТОСсСАСТОЧТСАССССОСАТТТТаСАС
АВАААСАаСААСТТССОСаСТаИтстТсАСТаСТаИтосасСсСААТААСАСИАИССОССАСИсСАСОСА
СТСТАСАТСААОСТатТсСТоСаАТАСАСТОСАСТАССАТОССООССЕСТСТСАСАСАСООСААТааС
АСТАТАААТАСТООССТАСТТОТОСТОТАТТОСТТСАТСААТСАСАТО
Варіанти ЕМО промотору, що складаються з або включають 5ЕО ІЮ Мо. 1, що показують знижений рівень експресії в дерепресуючих умовах, включають або складаються з наступних послідовностей: 5ЕО ІД МО. 57 (у23):
ААТОТАТСТАЛАСОСАААСТОСЯАОСТОСАААААТИТТАССПИаССпАТОСОСОСАСААТТТАСАС всСаасСсОАТСААпВАААСАССТОСТавоспАаСАСТСТОСсАССАСАСТСТТОСЧАТИИСССОАСАТ сссАдсс)восаттоСставстТАСОВавАСОТОАОаСАасСаСаАСАТОССАТСАААТАТАССАОССОСО
ААССОАСТСТСТСОПАЛААСАССТТСТОСАТАТСТТССаСТааСООСаСААССАСОААТААТАС
ТОССТасАастОАсСаИсААТАТАТАТСТОСТИапАСОСТАААТСТОАСАСОСТИтТАССАААСОТААТ
АТТТТОСТААААСАТОСААТОСОСТОСОССОСААСОСОАЛАААСААТОАСТТТООССАСТСТТСА
ССАСдатасастатТоссастТостТатТатТасСАААТАСаСТоССАСТаСТСАССССОсАТТТТИаСсАС
ААХАААСАССААосттОеСсопсаВТатстсАСТаатТ и СассААТтТААВАСазассапсАСОСАСОПА
СТСТАСАТСААОСТОТСТОСОАТАСАСТООАСТАССАТССОСИТСТСТСАСАСАСЮСССААТОСЯ
АССОАТАОВСОСАОДААТАТАТАААСТАССАОСТТОТАТАССААДАТАТАССААСОСАСТАСАВИС
ААСТСТТОСТТТАААСОЗААСАААСААТТСТТСОААСАТТТАСААСАААПААССТАСССТААСА
ТТААТААТСОСААсОссТ
БЕО ІЮ МО. 58 (24):
ААТОТАТСТАДАСОСАААСТОССОСАОСТОСААДАААТаТТАССООСОАТОСОСОПЧАСААТТТАОАО
СОПОаССАТСААСАААСАССТОСТОСОСОаВасАСТСТОСАССАСАСТОТТОВАТОСОССОСАСАТ сессдссасстТТОСстТаСсСтТАССОООАСИТОАВОСАаСаСОАСАТССАТСАААТАТАССАСССОСС
ААСССАСТСТСТОСЧЧААААСЛОСТТСТОСАТАТСТЕССОСТОаСОССОСААСОАСОААТААТАб
ТОССТИапАССТОАСОСААТАТАТАТОТОТОСАСОСТАВЛАТСТОАСАссСататАпСАВАСОТААТ
АТТТТОССТААЛАСАТИСААТОПаСТОССССОСААСОаОАЛАЛАСААТОАСТТТООСАСТСТТСА сесАсАдтТОосостТаТОоСасСтТсататТатасСАААТАВОСТОССАСТОСТСАССССбОАТТТТОСАС
АВАААСАССААдСсТТОоСаСастИатстТсАСТаа статосСасСсСААТААСАсаАОоСсСсаСАСОСАСОСА
СТСТАСАТСАДОСТОТСТООСОАТАСАСТООАСТАССАТОСОСОТСТСТСАПСАПАОСОСААТОСО
АССТААТСТТТСаСТСААТТОТОАТСТОСТОСТТИТАСАТАТТТААТАОСАСОСССАдОСТАСААА,
ААСАТАСАТААСТАСТТАССАААСТТСААТТОСТТААСТТАСААЛИТасСААТОССАТАТСТТАВАС
ТТАТТАСАТТАТТТАТА
КО то МО. 59 (у25):
ААТСТАТСТААДАСИСАААСТОСОАОССТИаСАЛАЛАТаТТАССпСасСаАтТОосСсСООАСААТТТАСАО еспссАТСААСАААСАССТОСТОпОСОпАИСАСТСТОпАОСАСАСТСТТОСАТОСОСССОАСАТ соссдоесасаттостТасйстТАССИССАСИатаАСасСАаСОСОАСАТССАТСАААТАТАССВОССОСС
ААССЯаАСТСТСТОСОААААСАССТТСТОСАТАТСТТОССОСТОССОБССОСААСОАСОААТААТАС
ТОССТОСАССТОАСОСААТАТАТАТИатИтасАпОоСтАААТСТОАСАСОСтТИатАаСАААСОТААТ
АТТТТОСТААААСАТОСААТССОСТаССССОСААСОССАААААСААТОАСТТІТОаСАСТСТТСА оссдодстосастТогоссастТсатстатТасСАААТАСОСТОССАСТОСТСАССССОСАТТТТаСАС
АДАААСАОСААСТТССпОасТатстсАСТОИСТатосасСсСААТААСАСсСсСХаСоваСАвасАСОСА
СТОТАСАТСАЛОСТОСТСТСССАТАСАСТОСАСТАССАТОСОСатстТСтТоАСАСАСООСААТОоСС
АСОСТОСТСТАЧСТТТАТОСТАТААЛАДОСТОААОТССТТАСААТТТТТСАТТТАААССАТААТСА
АДАСАТСТАЧАТТССЛАТСЧАТААДАААОСАСАТАВААСТТАТТААСАТТАТАООТТАСАТТСТАСЄ
АСТАСТАТАССАдДОСтТА
Відповідно до додаткового переважного варіанта здійснення даного винаходу варіант 5260
ІО Мо. 1 вибраний з групи, яка складається з ЗЕО ІЮО Мо. 35, ЗЕО ІЮ Мо. 37, 5ЕО ІЮ Мо. 39, ЗЕО
ІО Мо. 40, 5ЕО ІО Мо. 44, 5ЕО ІО Мо. 51, 5ЕО ІО Мо. 52, 5ЕО ІО Мо. 54, 5ЕО ІО Мо. 55 та 5ЕО І
Мо. 56.
Інший аспект даного винаходу стосується способу виробництва гетерологічного поліпептиду, який включає стадію культивування дріжджових клітин згідно з даним винаходом.
Дріжджова клітина згідно з винаходом, яка включає ортологічний ЕМО і/або МОХ промотор, є придатною зокрема для надекспресії гомологічних або гетерологічних поліпептидів. Через чудові властивості з дріжджовими клітинами згідно з винаходом можливо експресувати поліпептид і/або білок в дерепресуючих умовах, а також в метанол-індукованих умовах або придатних альтернативних індукуючих умовах, та, необов'язково, секретувати його з клітини.
Відповідно до переважних варіантів здійснення даного винаходу, протягом культивування експресія гетерологічного поліпептиду індукується в дерепресуючих умовах або рівень його експресії підвищується.
Дерепресії промотору можна досягнути шляхом зниження інтенсивності живлення репресуючим джерелом вуглецю (С джерело: наприклад, глюкоза, гліцеролу або шляхом використання нерепресуючого С джерела (наприклад, сорбітолу). Репресуюче С джерело може досягати своїх властивостей через пряму репресію або через репресуючі властивості метаболітів С джерела. У крайньому випадку швидкість подавання репресуючих С джерел може наблизитися до нуля. Також можливі додаткові індукційні ефекти, пов'язані з іншими сполуками, такими як жирні кислоти, формальдегід або мурашина кислота.
Щоб підвищити вихід білка протягом культивування і/або протягом його експресії, під час культивування в дерепресуючих умовах переважно додають метанол.
Фахівці у даній галузі добре знайомі із загальними умовами культивування, такими як температура, середовище, та ін. (дивитися, наприклад, Кгаїпег ЕМ/ еї а. Місгобвіа! СеїЇ Расіогіе5 11 (2012): 22).
Даний винахід буде охарактеризований більш детально на основі наступних креслень і прикладів, але без обмеження ними.
Фіг. 1 показує інтенсивності флуоресценції зеленого флуоресцентного білка-репортера (покращеного варіанта зеленого флуоресцентного білка (СЕР)) у культивуванні дріжджових клітин роду КотадаїаеєїІа, у яких нуклеїнова кислота, яка кодує зелений флуоресцентний білок, функціонально зв'язана з ортологічним і ендогенним промоторами. Ортологічні промотори (Її ендогенні промотори з Р. разіогі5, як довідка) були функціонально зв'язані з геном-репортером
СЕР ї трансформовані як вектори у Р. равзіогіз. Штами культивували протягом 60 годин на мінімальному середовищі (ВМО1) у мікротитраційних планшетах із 96 глибокими ямками (планшет з глибокими ямками (ОМУР)), а потім індукували метанолом. Флуоресценцію білка- репортера та 00 600 (як міри біомаси) вимірювали у глюкозо-репресованих умовах (16 год.), дерепресованих умовах (60 год.), і виміряли у різні моменти часу після індукції метанолом.
Виміри флуоресценції були нормалізовані відносно значень ОО 600. На фігурі показані середні і допустимі відхилення кожного з чотирьох трансформантів.
Фіг. 2 показує криву вимірів експресії білка протягом часу. Вибрані штами з Фіг. 1 були культивовані у плоскодонних колбах для лабораторного шейкера. Флуоресценцію білка (Фіг. 2А; співвідношення КЕШ/-0О600; КРИ « відносна одиниця флуоресценції), а також 00600 (Фіг. 2В) і кількість глюкози (Фіг. 22) були виміряні протягом часу. Концентрація глюкози на початку вимірювання була 55,5 ммоль (10 г/л). Показані середні (ММ) і допустимі відхилення кожного з трьох трансформантів.
Фіг. ЗА-3С показує, що ортологічний НрРЕМО промотор також здатний до активування експресії інших білків-репортерів, таких як пероксидаза хрону (НЕР) (Фіг. ЗА), ліпаза В з Сапаїда апіагсіїса (Саї!ІВ) (Фіг. ЗВ) і гідроксинітрил ліази з Мапіпої Ессшепіа (Менмі) (Фіг. 3С). Штами культивували у СМУР у мінімальному середовищі до точки виснаження глюкози після 60 год., а потім додатково індукували метанолом. Ферментативні активності НЕР і СаЇІВ були виміряні у культуральному супернатанті. Активність Менмі вимірювали, використовуючи оброблені
Зо клітини. Показані середні і допустимі відхилення кожного з чотирьох трансформантів.
Фі. 4 показує флуоресценцію білка- репортера НрЕМО промотору (Р ЕМО) і АОХ!1 промотору (Р. АОХТ) послідовності дикого типу протестованих промоторів. Основа штаму являє собою Р. равіогіз Ва11 АКИи70. Культивування здійснене у планшеті з глибокими ямками (ОМУР).
Флуоресценція білка-репортера і 00600 були виміряні в умовах дерепресованої глюкози (24 і 48 год.) і двох різних моментах часу індукції метанолом (72 і 96 год.). Штам, який має ЕМО промотор, був використаний як контрольні шмати для тестування різних варіантів промотору.
ПРИКЛАДИ:
Приклад 1:
Матеріали і способи
Клонування промоторів
Ортологічні промотори були посилені з допомогою ПЛР та клоновані перед геном- репортером СЕР. З цією метою застосовується репортерна плазміда рРрТАтиї еоМіуІ-іпАВа- есЕР-Втгі5зішНег (Т. Моді еї а Абе Бупій Віої. 2015, 0Ої: 10.1021/ас55упріо.5000199; опублікований 22 листопада 2015 року).
Ця плазміда базується на векторі рРрт4, який був описаний І/. Мааїзаагі еї а. (РГо5 Опе 7 (2012): е39720). Промотори були клоновані безшовно (тобто без будь-яких сайтів розщеплення рестрикційної ендонуклеази або лінкерних послідовностей між промотором і старт-кодоном), щоб отримати природне оточення. Праймери конструювали на основі бібліографії (НРЕМО промотори) (Н. 50п9 еї а. Віотесппої І ей 25 (2003): 1999-2006; А.М. І едероег єї аї. Мисієїс Асійв5
Вез 13 (1985): 3063-3082), СБАООІ промотор (Н. Мигітоїо єї а. Віоспіт Віорпув Асіа 1493 (2000): 56-63), СЬО промотор (В. І ее еї аїІ. Місгобіоїосду 148 (2000): 2697-704), Рт МО0І1 і МО0Б2 промотори (С.К. Каутопа еї аїЇ. Уеазі 14 (1998): 11-23; Т. МаКадама еї аї. У Віозсі Віоепд 91 (2001): 225-7; Т. МаКкадама єї аї. Меаві 23 (2006): 15-22). Використані послідовності праймера надані у таблиці А:
Таблиця А: Праймери для ампліфікації ортологічних промоторів
Послідовність
Назва ооМаве | беяшепсе///////// |ББО проко.
НРЕМОжжЯа |ААТОТАТСТАААСОСАААСТОоСАОСТОа . З
САТТТОАТТОАТОААСИСАСАСАССОСАдО 4
НРМОХІйЯ 0 тТопАСаСОсАСААСсАТОТоСТОСАОСТ
ТТТОТТТТТОТАСТІРТАПАТТаАТОТСАССАССОТаСАСТОСІ нрмМохтеу
САС
РОМОБІ1Ежа | ССАСАТасТАСАТАСТТААААССТОаИССАТАТТОСАО
ТТТОАСАААТТААТАОТААСАТТТТТТТТТСОТААААОаТТТтТ
РиМОопІікех . ша САТТаАсСТТААТтТо ШО
ОСАТССАСТАСАСТТТАССААТТОАТТАСОССААТАС ши
ТТТОСААТТТТАатТТТТАСАТАЧАТАААТАТААТТТТСААТСОСС 10
РпиМОор2гех
ТатТТАТААААТАСТАТАТ
СПАСТАТАСОТАААТАТАТААТТАТАТАТААТСАТАТАТАТО 11
СрАОр1ітг та
ААТАСААТОАААО
ТАТТОАЛААААТААТТІТТОТІТІТІТТтТТІТТОТТТТТТТААА 172
СсвВАОрітеху
АСТТСОаТТААААТТСО
СЬЕПОВІ1Еша | ЗЧАТОССТТСААСАССОСАСТСТСАААС
ТТТТОТОСААТААДААААТАСАТАААТАТОСАТТТАОТОТАСТТ 14
СВРІр1тех
САТІСААТСААТТОСАС
Геномні ДНК штамів Нр (Напзепша роїутогрпа) О5М 70277, СЬ (Сапаїйда роїаіпі) О5М 70026 та Ріт (Ріспіа тейїапоїїса) О5М 2147 були виділені та використані як матриці для ПЛР реакцій.
Продукти ПЛР були клоновані з допомогою ТА клонування у векторі рРрТАтиї еоМіу!-ІАВа- есЕР-ВтгівішНег (дивитися також ОЗ 2015/0011407 і Т. Моді еї аІ. (АС5 5упійп Віо!ї. 2015, РОЇ: 10.1021/ас55упріо.5600199; опублікований 22 листопада 2015)). Контрольні вектори для Р. разіогіз ендогенних промоторів АОХ1, САТ і САР взяті з О5 2015/0011407.
Альтернативні репортерні вектори, які містять НЕР (ізофермент АЗ2А; ГЇ.. Мааїзаагї! єї аі. ВМС
Сепотісв 15 (2014): 227), СаІВ і МеНМІі. по ходу транскрипції від відповідних промоторів, були взяті з О5 2015/0011407 або створені шляхом вбудовування гена-репортера есЕР, який був вирізаний із вищезазначених векторів есЕР (рестрикційні ендонуклеази Мпеї ї Мої), і продукти
ПЛР НЕР, СаїВ та Менмі. були безшовно вбудовані з допомогою рекомбінантного клонування.
Праймери, показані у таблиці В, були використані для ПЛР ампліфікацій.
Таблиця В: Праймери для клонування промоторів проти ходу траскрипції з різних генів- репортерів
Послідовність
Праймер вшри Б дрилі
БКО Ір Ко. срсцчсЯяасссіЕСсЯДсоссссассавассяваєсясу рноЕМО-МЕа1рпа-с1Б | ачсавссосарссарь с ссассуусєс дес саваєдасаєссегчасасссссссдчачсааося 16 дОох1тт-МОосІ-Са1ї В сесасусоуссасчасассддаасаво саваєчачасаєсссчасаєсссосссчадсцчасся 17
АОХ1ТТ-МОБІ-НЕРАЗА . сЕсвадчассесЧеЕсаассссстсссаассаачсс 149..126Е»а ассаядцсцрссассвасаачачаад рнрЕМО-Менм, сЕєЕадсастесвсвдЧчесеЕссассааєсаваєсаєу 000000 |чсваскосьсасьссдсоскданксас Н саваєсчсасєсссЧдасаєссссссавЧчсячЧчосся 20 дОохІтТтТ-МОоБІ-МенНМІ, зЗ З я59 сЕсєаачецчіаачсяассадсаасскссс сасссдссстадесавчасссасаасєсаааає 751 росАТ1-Менмі-б1р чесассдсесєсассссЯгстгааєссас
Вектори НЕР та сСаїВ, згадані у літературі, де, таким чином, використовуються як матриці
ПЛР (05 2015/0011407 ї Т. Моді еї аІ. (АС5 БЗупій Віої. 2015, БО!: 10.1021/ас5зупріо. 5500199; опублікований 22 листопада 2015). Послідовність МенНМі була оптимізована для кодону Р. равіогіз і сконструйована як синтетичний двонитковий ДНК-фрагмент з виступами до АОХ1 промотору і термінатора (дивитися Таблицю В). Цей фрагмент був використаний як матриця для ПЛР. Використана наступна послідовність: счасвасссЧчачаачаєсавзаааасаассаассассдчааачааєсссуааасчЧАТОСТТАСТОС
ТСАСТТССТСТТОАТТСАСАСТАТСТОИТСАТОСТОСТТОСАТСТОССАСААСТТСААСССАССА
ТТОПСАСАпАОСтТапАСАТААООТТАССасСтТСТТОАТАТОССТОСАТСТОСТАТТСАТОСТОСТО
АААТОСААСАААТСААТТСАТЕССАСОСАСТАСТСАВАСССАСТОСТОАССТТІСТТООААААОТтТ
СССТСААССТаААААОсТаАТСАТССТТОСТИаААТССТОТОСТОСАТТОААСАТТОССАТТОСА
ССТОАТАСАТАТИТСОАТААпАТСИСТаСТтасТаИтТсСтТІСсСАСААСТСТСТОТТАССАСАТАСТО
ТІСАСТСТОСАТСТТАСАСТОТССАСААсОТТОТТАСААТСАТТСССАСПАТТОСАСАСАТАСТОА
АТАСТІТТАСТТТСАСТААСАТСАСТОТАСАСАСТАТСАССАССАТОАААСТТІОССАТТСОТТТТО
ТІВАСАСААААССТТТТСАССААОТОТАСТОАТОСТОААТАСОААТТаССсССААСБАТОаТТАТОА
СААДАСсОСТТСТТТОТТТСАСААТаТТСТТаСАСАААСАССАААОСТТСАСССАААдОопОаТТАСО
ТТСТАТСААСААСОТСТАСАТСТОСАСТИАТСАСОАСААСАТСТТССТОССАСАСТТОСАААИд
ТООСАААТСОСАААСТАСАААССАСАТААИСТСТАССААСТССААССТОСТаАТСАСААСТТАС
ААТТОАССААВАССОААЗАВОТСОСТСАСАТСТТОСАаСАДОатТтТОСсСОАСаСТТАСОСТТААЯС чуассчсЕсаададдаєдеЕсачааєдесавевєдесва (5БЕО І Мо. 272)
Тут кодуюча послідовність білка є великою, а старт- і стоп-кодон показані жирним шрифтом, тоді як виступи до вектора для рекомбінантного клонування написані малими літерами, ЕсоБІі і
МОЇ, які є сайтами розщеплення, що типово використовуються для клонування у сімействі векторів рРрта4, підкреслені.
Той самий прямий праймер (рРНРЕМО-МеЕаїрна-сір) був також використаний для ПЛР ампліфікації генів НЕР та СаїВ, тому що два гени злиті з МЕ-альфа сигнальною послідовністю.
Гени, клоновані у векторах, були секвеновані з допомогою використання праймерів, що зв'язані з АОХ1 термінатором і відповідними промоторами (зед-рРНнНРНМО-149..126ї1й74 для НрЕМО промотору).
Штами, матеріали, вимірювання флуоресценції і ферментні аналізи
Ферментативну активність НЕР і СаІВ визначали з допомогою субстратів 2,2'-азино-біс(3- етилбензотіазолін-б-сульфонова кислота) солі діамонію (АВТ) і р-нітрофенілбутирату (р-МРВ) відповідно до протоколів у Кгаіпег ЕМ (Місгоб Сеї! Расі 11 (2012):22).
Для трансформацій усіх контрольних груп промоторів з СЕР був використаний штам дикого типу СВ5743 5. Плазміди НЕР і СаІВ були трансформовані у штам ти5 (ГГ. Мааїзаагі еї аї. (РГо5 Опе (2012); 7:е39720), тому що він має вищу експресію білка (ЕМ/. Кгаїпег еї аіІ. Місгоб
Сеї! Расі 11 (2012): 22). Для вимірювань активності МеНМІ. клітини були лізовані з допомогою У-
РЕК розщеплення відповідно до інструкцій виробника (ТПпепто Ріхпег Зсіепійіс, У-РЕК"М Уеаві
Ргоївіп Ехігасіоп Кеадепі) і активність була виміряна з використанням "аналізу ціаногенази нітрил мигдалевої кислоти", як описано К. УмМедпег еї а. Сотриї 5ігисії Віотесп- пої 910 (2014): 58-62) (кінцева концентрація нітрилу мигдалевої кислоти - 15 тМ).
Результати
Шість гетерологічних промоторів генів НРЕМО, НрМОХ, СЬБЕГО1, СБАОО1, РтМО0п і
РтМмМО0р2 були протестовані у Р. равіогіх. Промотори порівняли з метанол-індукованим АОХ1 промотором, конституційним ЗАР промотором і дерепресованим/метанол-індукованим САТІ1 промотором у Р. равіогі5, зокрема ортологічні промотори були ампліфіковані з допомогою ПЛР геномної ДНК та клоновані у векторах з СЕР як геном-репортером. Використані наступні промоторні послідовності:
НрРЕМО (5ЕО ІО Мо. 1):
ААТОТАТСТАДАСССАААСТОССАОСТОСАААААТСТТАССОСССАТОСОСОБАСААТТТАСА пССаСОАТСААСАААСАССТаИСтТапОсСсСАССАСТСТООАССАСАСТСТТООАТОСОоССОсАСАТ сссассасатТтТоСстТаастАСССССАСаТаДппСАПСаСпАСАТССАТСАААТАТАССАВОСОСО
ААСССАСТОТОСТООСААААСАОСТТСТОСАТАТСТТОСЯСТОССОаСОСААССАСОААТААТАС
ТОССТОСАСОСТИАСИОААТАТАТАТОТОТССАСОСТАААТСТОАСАСаСТОИТАпСАААСаТААТ
АТТТТОСТААААСАТОСААТОИИСТассссСаСсААСООпАААААаААТОаАСТТТОПСАСТСТТСА сСАсАстосоотТатТосСсастТоатТатТатТОсСАААТАВОСТОССАСТОаСТСАССССОБАТТТТОСАВ
АААААСАССААСТТОСаСОСТОТСТСАСТОСТОТОССОССААТААСАССАСССООСАСОСАСОСА
ОТСТАСАТСАЛОСТОТСТОСОАТАСАСТООАСТАССАТОСОССОТСТСТСАСАСАВСОбААТОСО
АСТАТАААТАССОССТОСТТасСасСтТСтТсСтТаИсстТТСАТСААТСАААТС
НРМОХ (ББО І ОМо. 2):
СОАСоСОопАСААСОСАТСТОСТОовАсСстТаСтОасасАТСАсСТтТОоТОоОСосСостТААТасСААССАС асесдососвеастосттасссАссдоесатоаастТассоАасссСАстТттТатоАдссАостТостТтТт
АСААСатостТаСасСАААСТОСАСТОТСАОАТОААТаТОСТОСТОООАССААТТСАССАТОТТСТ
СВБАССАСССАТСТОТСТТТОСАСТАВААДаССТААТСТСТОСТОСТООГТАСТОСТАССОСААСАО оТАСТТТОССТООССасСссСАтТААТОААСАсОоТТСТСТТТсТостТассстатадосСАссСобоСАС стостТОопАСапСоТоОАТаАсасосттоАсоСастостТАатАСТтоТтОоСсотсостоатАосооо
ССОСООТОАСОАТАСССАСАТАСАаСТОСТТООССАТТАОТТТОАТОАооТтОовооСАасАтТасО
СаАСТОООСАТСОАААТТТТТОССОТСОТСОТАСАСТОТОАТОТСАССАТОСААТОТААТОадОС
ТОСАОСТТОССАТСТОСОАТОСТТТТОСААТОСААСААССИССАСАТСТОСААСАОСТОсСОоССЯ
ТСТТОАСААТаАСоСОСАСОТОСТТОААСОДОосОосассАСААсосСсососоттТОсСтТсАТОоССОСО всОостТСОтТСссСтТоВАТОТАЗААООССТТТТОСАСАСОСАСТСТОСТОААЧпААССТОССААСОоСТо
СОАдсСсАоСстТасАСсАосСосАЧАСААТТСОсСОосоТаССпастТТТОсСТсАТТТСААТОТТОТосТ
ССАТОАОСАСТТСИАООСТОСТОСААСАТТТОСОСОТАССОВО ТТ ТОССТСАСАСТТТАССАТ
САЗИатСОТССАСТОСАСАСАТОССОТТОСТСТТСАССОСОТАСАОСАСОААСооСоТоо ССС
АСОСССТТОАТОСАТТСТАТОАСОССАТСТОСАСООТСТТОСТТОАСТОСОТАСТОСАСТСТОТ
АСССАСТОСАСАТСТООАСАСТОСССТТасСтТатостТасАТаСАССААТТААТТОТТОССОСАТО
САТОСТТИаСАССОСААСТТТТТААААСССАСТОССТТТАСССОТСОССТААААСТТОТСААТСТ
ОСААСтТОДОосОоОТТСтТОСАСССОСААССОААСТІТТоОСТТІСОАОоОАСоСАасСтТОосАТОоСТО
ТСАТОСТОДСОСТСТСТТТОСТОСОСТАОССТАСААССТОАССТТОССТААССОСАСООСОСТАС С
ССАСТОСТОТСТИТОССТОСТАССАВААААТСАССАСАССАССАСАООССОСАТОТООСААСТОа стобозТетТСОопАСАСОСТОТТТСТОСАСАСТОСАААТассТаААСОСЗОССАСАААСТАААТ
ТСТТАТаСТАССОТасАСТОАСТОСОАСАТССССАСТТТТТОСССТАСТТОАТСАСАСАТОСИЮ тСсАссастасСсастААстТатАСССААСССТОСССАСАСООТССАТСТАТАААТАСТОСТОССАО
ТОСАСОСТОСТОАСАТСААТСТАААСТАСАААААСААА
СЬЕПР1І (ББО І Мо. 23):
СБАТСССТТСААСАОССОСАОТСТСААОСАОСТООСТАТТАТСАОТатАТТТААТТАСТОАТОСАТ
ТОаТАТТАТАСТОСАТАСАТАСТТААТААТТАСТОТОСТаТТАТСАТТОААААТТТТОАААТТСТО
АСТСТСАСОСАСТОСААААСТТТОССТААТТОАСТААСТОСААСОСААТАТТТАСОСТАСАТАТ
ТТТОСАТТОССТТААСТАТОТААТСАААСАТСАТТСАТАСТОССАТСТТАТААТАТТОССАСТАТ
ТАТТАТСТТОСТАТАСТОТТСТАССТОТТТАТТСТАТТОТАТОСОТСТАААТСТТТССАТСАСТ
ТТСТАТАСТАТСТТТОСТТТОСААТОАААТАТТАСТОСААТТООСТІСТТТСААСТоОоСТТОСС
ТТСТСТОТТОССТІСТТТТТТТСТТТТСАТТТТАТОСТТИТТТАААСОСТАТАТАААТАТОТАА
ССТТІСТСОСТТАСТТТТОАСАААТСАСТТТТОТТОСТСТСААТТСТОТІТТОАСАТСТТААССТ
ТАСТОСААТТОАТТОААТСААСТАСАСТАААТСАТАТТТАТСТАТТТТТТАТТОССАСАААА сСРАОорі (ББО Ір оМо. 24):
СОАОТАТАССТАААТАТАТААТТАТАТАТААТСАТАТАТАТОААТАСААТИСААТОАААСТОВА
ТАТОАТААСАТТОАААТААТААСАААСАСССАТААЛАТАТАТСТСААААТОСАСТТАСАСААСАА
АТААТААТААААТАТААЛАТТАТАААТТАТАААТТАТААААСААТААААААТАААССССАСТААТ
ТТАТТТТАТТААААСАТАСАТТОСТАТСТТТАСТТААТААСААТТСТОАААСТТТАТТСАСТТА
АТТТТАТТТААСТТАТТТААТТТАТТТТТАССССАСТТІТТТСАСТАСААТОСЛОаСтТоСОАААСТ
ТТАТТТООСТОТОАтТТтТоОсСтТатТОАттІтТосСтТатТоАттТТоостТтоасттТосстоОстТОасААТТО тотТостТасСАССААттТастооссотососттстТоссасСтТосстТоассСтТАТТТасСобОостТоОостТАТ ттосососостсестаастТааОТОСтТотТОсСсСАТоТаСтТОТаЧсСсСАССССОСАТСТОСТОСАТОСАС песто САасСТОосАСсТаСОТСтТАСОСТасАоссататасстТАТТТСССААТСТОССААТСТО
ТОСААТСТОССАСТОАОССААААСАСОООССАСсСаСАООСДпаСАСОСАСОСАСОСАСОССАСТОАА
СССТТСССАСОССССАСТОСаСАТАААСАТОСССАССАСТТТССССАБСАСТЕТССССАОСТТТ
ТСААТТТААТААДААТАаССТОТТТСТаттТТстТатТІТТАТАТТАТАСААТТІТТТАТОСТААТАА
ТТАСТСТТТСОСОДАТТАААТААТААТТАТАТСАТАТАСССАТАТСАСАТТТТАСТАТАТТТАС
ТАТСТАТАААТАЛАТТСАТАТТАТААТАТТААТТТАТАТТСОСТТААТТААААТОСТСТТТТОС
АТСАТСАТСАТСАТСАТСАТСАТСАСОАДОТТТТСОСТТАТСААТАСТСТТІТТСАТТААТТТСТА
СААТТТСАТТАТТТАТТТТТТАТТОАСТОСАААТТТТСААТСААТТТТАТТТАТТТТТАТТТАТ
ТТАТТТТСАТАТТСТТАСАТТТАААСТІТІТТАСАТОАССОСТАТТТТАСТТАСТТАСТТАСТОТ
ТОТТТТАТАТТАТОАТААСААТТААТІТТСАТАТТТАТОАТОАТОАТаАТОТАААТТТААССТА
СТАТАСТАТТТТАААСТТАТСАСТАТСТТТТАСТОСТООСАТТІТТТТАТТСТАТТТТСАТАТАТ
СТАТАТАСОТАААТТААСОТАТСАТСАСОСТОСТТАСТОТАССТТТААААТОТОСДСАТасСАЛАТ
АПАПАТСОССАТОААЗАТОДАСАТОАТОАСААТТАТАЛАССАТТСАТТСАТТААТСААТСААТА
ТААСТТАТАААААААТТТАТАТТТАААТОААТТААТТТОСТТТАТТТТААТААТАТОСТТААТТ
СТТТТАААТТСТАТТТТАТТТТААТТСТТТСТТТАТСАТАОТТАТСАТАТААСААТТАТАТААС
АТАСАТАСАСААТТАТТАТТТСАТТАТСАТАТТАТТТТТТААААТАТТОСАТТАТТТІТААААТА
АТАТСТІТААТТААТТААТТТТТАССААТАТАСАААТТТТААССАСТТАСТТТТТТТААСОААТТ
ТТААСОДАСТТТТАААААААСАААААВАААААААСААААТТАТТТТТСААТА
РИМО0І (5ЕО ТО Мо. 25):
ССАСАТОССТАСАТАСТТААААССТОССАТАТТИАССААСТТСАААСТТТТАТСТОТТТТТАВАА
ТТААААСАССАТТИтТТатТААСААААССТТСТаССТАСАТАААСТОАААТТААТОСАААТАСССТ
СТТТТСАДАААТАСАССТІСТТААСТАСТИАДСАААСТТГТОТТАААТОАСТАТСОААСААОССА
ТОАААТАССАСАТТТСТОССАСТСАСТТТТААСАСТТТОСТОСТТОСТастТтТОАСТоТОСтТоАТ
АСАДАСАСССАДААОСОДААСТТТСАСТОИТОСОСАСАСТТЧАСАТСТСАСАТИСАСОССАСАТТ
ААТТТССССАСАССАТИСОПАСАСААСАСААААСААСССТТТОТОСТОаИСтТоСТТтТТСТТтТСтТсАС дссасстаосототатТасосСАпаСАСОпСАСОСАСОСАпСОпОСтТОССтТассАТСТСТААТСЯСТа
СТОСТеСССоСтТаОстТТСАААТААСАОИССТОСТаСТАТСТОТОАССАСАТТОООАСАССССССТ
ССССТОСОДАТОАТССАТСАССТТТТСТООТАСТОССАСААТОАТССТТСССТОТСАтТСТТСта
ССААТСАССТОСТТСААТААТТАААТСАААТААССАТАААТАСТААААТСОСАТАСАААСОТСА
ТОААААСТТТТАТСТОТАТОСССААСССАТАСТСТАТСТОСТТААТТССАТССАСТТТаСОДАС
СОТТСТСТСТТТАССССАСАТТСТСААДОСТААТАТСТОСОССТТОТСТАТТИаТоСсТТтСТОоСа
ТСТАСААОСОСАОСТТТТОССТОССАТОСТСТТОСТТТОТТТООСТТАТТТТТТТТТСТТТТОА
ААСТСТТОСТСАААТСАВАТСАВАСААВАССАААССТТСТАТТОСАТСАСАТСААССТТОТТСА
АСАТТСТАТАААТСОАТАТАААТАТААССТТАТСССТОССТТОТТ ТТ ТТАССААТТААТОВААТО
ТТСАААТТТСАААТАТТТТСТАСТТОСТТТАТТАСТОАСТАТТААСАТТТСТТТАААССААСТА
ТААСТТТТААСТСЯСТТТАСААСТТТТАТТТААСАТСАСТТТСААТТТАСАТСТТТАТТТАТТА
АСОАААТСТТТАСОДАТТААСТОААТСААААСТТТТАССААААЛААААТСТТАСТАТТААТТТС
ТСААА
РЮМО0О (5ЕО ІЮ Мо. 26):
ССАТОСАСТАСАСТТТАССААТТСАТТАСОССААТОТОТТТАТТТСАССААСТААТТАСААВАС
ТОСАСАТТТОСТТАТОТСАТТАТОТАТТТТООССААТОССТОТААТТТАААСТОСАТТАСОСТТА
АТТААССТТТАСССТАСОААДОССОСТАССТТТТАТТТСТОСТТТТСТТТТавасссатттстТА
АТТОССААТСТТТОСААТТТСОТТССАТСТТТТААААТТААОТОСТОСТТТТСТААТСТОАТАААО
АТАВИССАТСОТАСАСТААСТААААСААААТААТОТАСТОТАТАТТААОСОСАААААСТТОСАА
ААСТОСТАТОАТОТТОДАССАОСААДОААТОАСТААТАТТАСОАОАТТТАДОСАААСААТОТТОа
ДИСОПААСАСПАСаАТТААССССТТАТАСАССААОССТОТТТОАТОТТовААсосовАососТо
АААДОСАСТИЛОСАСТОСТААТТАСТААССААТТТСТОСТААОСААТОАААСТТОТТОСТАТТОС
АААТАСТАТТААСТААТАСААСОТАСАСАСТААТаССОСТОАаССОСТАОТТСАВастАТСТТА
ТАСАСАСАСТАТТОСОСАТТОСТСТААТСАТТОСТОСАССТООТТААТААТТАТСАСТСААСТСТ
ТТТАСООТОСТОАТАСЯТСТТТОСОААСТТОСОСТТОТОСААТТТОСТТОТТААТСАААСТОТТ
СТатАТТТСАТОТСАТАСТАСТАТТОАТАТТАТТААТОТТАСТТАСТСАТСТОСССАТТТААСА
СОТТТСАЛОСТТТААТаСТОТТААСТААСАССААТОСАТСАССОТСААССТТААССССССТОСТ
ОСТТОСТОтТСТТТАТОСТТССТАТСТТТТТСАТСТТОСАССОСССТОТТОСТТАТАСОСТТОТТ
СОССССАТАСОСТААСТТСТСТОТТТСССАССАТСТСТОСААТААСАААСААТТСТАТАСОСТТА
САСТАТАВТСАТАСААТОАСТОТАСАТОССАТТТТСАСТТТАСТТАСТТОССАТООСААСАТАС
ТОААТСАСААЛОССАТАСТААСТАСАТААСТТСААААСАСАСССТТТТТАСАСАТТАОТТАСАА
ТТІТТаТСААТаТтТТатТтТТаАтТААСССААССТОСААСОТТТССАСТТАСАССТОТТТААТССААС
ТСАСТТТАССАСОСССААААСТТТОСТАССОТТАПДСАААТАСТООССТАААТСТОАСОСААААСАА
ССААТСААСААТТИаААТОСАСТИСАСИТАТСТСТААТССАСТаАСАААСТТТОСТААААСААО
АААААИтТОпИОпОСсТОоСатТИСппАпААпАСИТИСОСАЗаИСТТАААДАСАСААСАСААСАСТТО
СААСТАССССАСАТІТТТАИСТТОСТАСТАТТСТОАДСАСССССТАТТСАЛОСАСЧАСОСТОАТТ
САТТСАТТСААТТТТОСТОСТОСААТИАТАССАТАААСССТІТТОСАСТІСААТСАСАССТОСТО
ТОСТОСАТАССААТАТАААТАССТІСТАЧТТОССОССАСТТОСТСТСТОСТОТАСТаССссСААТО
АСТСОСАСТТАТТСААОТТАСТІТСТОСТСТТТТОСТААСААТТАААСААСААОСТТТАТТАТААСА
ТТААТАТАСТАТТТТАТААСАССАТТОАЛАТТАТАТТТАТСТАТСТААВАСТААААТЕСААА
Трансформанти р. рабзіогі5, які містять плазміди з СБАО0СІ, РтМОб1 і РтМОр2 промоторами, не мають будь-якої флуоресценції білка-репортера (Фіг. 1). СЬБЕГОЇ промотор проявив репресію на глюкозі та слабку індукцію метанолом на приблизно 1095 РрАОХ!1 промотору. Обидва випробовувані Н. роїутогрпа промотори несподівано залишили свій природний профіль регуляції з Н. роїутогрпа і також у репресії, дерепресії та індукції метанолом Ріспіа рабвіогіб5 (Фіг. 1 ї 2). НРЕМО промотор несподівано перевищив структурний
РрОАР промотор у дерепресуючих умовах і також досягнув приблизно 7595 метанол- індукованого РРрРАОХ1 промотору, навіть без підживлювання додатковими джерелами вуглецю.
Дерепресована експресія НРЕМО промотору перевищила таку флуоресценції білка-репортера найсильнішого ендогенного МОТ промотору з Р. разіогіз (РрСАТІ) з допомогою коефіцієнта приблизно 3,5. Після індукції метанолом НРЕМО промотор перевищив РрАОХ1 промотор з допомогою коефіцієнта приблизно 2. Ці результати у невеликому масштабі (Фіг. 1) були підтверджені експериментами у плоскодонних колбах для лабораторного шейкера (Фіг. 2), де виміри глюкози також ясно показали дерепресований профіль регуляції. Подальшого збільшення технічних переваг НРЕМО промотору можна досягнути з допомогою оптимізованої інтенсивності живлення у біореакторі.
Щоб дослідити чи неочікувано сильна експресія НрРЕМО репортеру також може бути відтворена для інших білків додатково до СЕР, НрРЕМО промотор був клонований проти ходу траскрипції з кодуючих послідовностей інших білків: пероксидази хрону секретованих білків (НЕР) і ліпази В Сапаїйда апіагсійса (Саї1ІВ), і внутрішньоклітинного гідроксинітрилу ліази з Мапійої
Ебсшепіа (маніок, МеНМІ) (Фіг. ЗА-3С).
Відносно кінцевих виходів активного білка у культуральному супернатанті в експерименті в плоскодонній колбі для лабораторного шейкера дерепресована експресія усіх білків НРЕМО промотором дорівнювала структурній експресії з допомогою СЗАР промотору і безсумнівно перевищувала дерепресовану експресію САТ1 промотором. Метанол-індуковані ферментативні активності НрЕМО промотору перевищували активність АОХІ промотору з допомогою коефіцієнта 2,5.
Сильна експресія НрЕМО промотору також може спостерігатися з чотирма різними секретованими білками-репортерами, а також з внутрішньоклітинними білками-репортерами (есгР, НЕР, СаІВ, Мменмі). Ортологічний НрРеЕМО промотор навіть перевершив ендогенні промотори у Р. равіогів.
Зо Цікаво, що ортологічні промотори мають дуже низькі або не мають ідентичностей послідовностей з промоторами у Ріспіа. Дослідження ВГА5Т НрРЕМО промотору не дали будь- яких значних потраплянь у геномі Ріспіа рабвіогіз; пряма ділянка вирівнювання НрЕМО промотору з РРЕОНІ промотором також не дала будь-яких значних схожостей (ВІ АЗТМ 2.2.32.5,
Віазі 2 послідовності, що утворюються як "трохи схожі послідовності (ріавіп)"; тип молекули: нуклеїнова кислота).
Така низька ідентичність послідовностей є бажаною властивістю промоторів, тому що ці чужорідні послідовності неможливо рекомбінувати з ідентичними послідовностями у геномі
Ріспіа, а тому неможливо втратити, наприклад, оскільки трансгенні об'єкти гомологічної рекомбінації зі схожими послідовностями вже присутні у геномі.
Ортологічні промотори несподівано можуть бути дуже корисними засобами для експресії білка, як показано з допомогою вищих активностей з допомогою коефіцієнта до 2,5 завдяки
НрРЕМО промотору. Неочікувано, НРЕМО промотор також зберіг свій дерепресований профіль регуляції з НН. роїутогрпа у Р. рабіогіз і, таким чином, являє собою найсильніший дерепресований промотор у Р. равзіогіх. Тому може бути здійснений ефективний технологічний процес без токсичного та високозаймистого метанолу.
Приклад 2: варіанти ЕМО промотору 1. Клонування промоторів рРрТАтий еоМімі-іпіАг94-ЕСЕР-Р ЕМО, яка містить ЕМО промотор, що має 5ЗЕО ІЮО Мо. 1, використана як матриця для ПЛР ампліфікації варіантів промотору м01-м22. Праймери були сконструйовані таким чином, щоб вставляти точкові мутації, вставки або різні основні промотори до ЕМО промоторної послідовності. Варіанти промотору були ампліфіковані у двох частинах, а потім зібрані за допомогою каркасу вектору рРрТ4тиїеоМіміІ-іпАг94-ейЕР-Р ЕМО, який попередньо був вирізаний рестрикційною ендонуклеазою заїІ. Для вироблення варіантів промотору м23-м25 тільки одна частина була ампліфікована ПЛР, а інша частина була упорядкована як синтетична ДНК. У цьому випадку два ДНК фрагменти були зібрані з допомогою каркасу вектору рРрТ4тийеоМмімі-іпіАг94-ейЕР-Р ЕМО, який попередньо був вирізаний рестрикційною ендонуклеазою МПеі!. Для зборки ДНК фрагментів було застосовано клонування зборки каркасу вектору на основі гомології послідовності, даючи в результаті плавний перехід від промотору до гена-репортера есгРр. бо 2. Р. разіогіз трансформації та скринінг
Для трансформацій векторів, які мають різні варіанти промотору мбІ-м25, у дріжджі був використаний штам Р. разіогі5 В911 АКИ7О. Порівняно зі штамом дикого типу цей штам має два нокаути гена: перший, ген КО7О, який кодує білок, залучений у механізм негомологічного з'єднання кінців. З допомогою нокаутування цього гена трансгенні об'єкти гомологічної рекомбінації з більшою ймовірністю відбуваються у Р. равзіогі5. Це сприяє таргетуванню векторів у визначені локуси, у цьому випадку - АКС4 локус, щоб запобігати неочікуваним впливам різних локусів інтеграції у геномі. Другий нокаутований ген являє собою ген АОХ1 (штам тиї5/Ва11).
Шляхом використання цього нокаутного штаму можна досягнути вищих виходів гетерологічних експресованих білків під контролем метанол-індукованого промотору (Кгаїпег ЕМУ еї аї. Місгорб.
Сеї! Расі. 11(2012), р. 22).
Р. равіогіє Ва11 АКО7ТО був трансформований ВО лінеаризованими плазмідами згідно зі скороченим протоколом Гіп-Сегедніпо еї аї. (Віоїесппідиез 38 (2005): 44-48). Для отримання контрольних штамів для скринінгу того ж вектору, що й для варіантів промотору - але з немодифікованим ЕМО промотором ЗЕО ІЮ МК! ї АОХ1 промотором натомість, - були також трансформовані. Близько 500 нг, які є порівняно низькими кількостями ДНК, були трансформовані, щоб запобігти багатокопійній інтеграції. Наприклад, використання 1 пг лінеаризованого вектору рРрТ4 5 типово дає лише єдину копію трансформантів (моді т еї а).
АС5 5упіп. Віої!. 3(2014): 188-191).
Для 9 конструкцій були перевірені 42 трансформанти, щоб показати стабільність ландшафту експресії. Оскільки ландшафт для усіх цих протестованих конструкцій виявився постійним, були відібрані лише 16 трансформантів на конструкцію і культивовані на двох різних планшетах з глибокими ямками (МУР) у другому циклі скринінгу. ОМУР культивації адаптовані з протоколу, описаного Ууеїб5 еї аЇ. (Муеіє М еї аї. РЕМ5 Уеаві Кев5. 5 (2004): 179-89). Окремі колонії були відібрані та використані, щоб інокулювати ВМО (250 рі) у 96 ямок ЮОМ/Р та культивували протягом 48 год. Потім додали ВММАа2 (250 рі), щоб індукувати клітини у перший час. Клітини були індуковані ще три рази з допомогою ВММТ10О (50 рі) після 60, 72 і 84 годин культивування у
РМУР. Зразки були взяті та виміряні після 48, 72 і 96 годин. Зразки були взяті, як слідують: 10 рі культуру клітин змішали з 190 рі деіонізованої води у мікротитрувальних планшетах (Мипс
Містомуєї! 96-ММеї! Оріїсаі-Вонот Ріаїєз м/йй Роїутег Вазе, Віаск; ТНепто Різпнег Зсієпійіс).
Зо Вимірювання флуоресценції есЕР представлені з використанням планшет-рідера ЕР ОО5іагю
Отеда (ВМО ГАВТЕСН Стьн, Ортенберг, Німеччина). Флуоресценцію виміряли при 488/507 нм (збудження/випромінювання), і для оцінювання даних відносні одиниці флуоресценції (КЕ), які отримують в результаті, були нормалізовані відносно 00600.
Таблиця С: Праймери і синтетична ДНК для вироблення ЕМО варіантів промотору
Послідовність
Назва
Мате Беачепсе ЗО І Мо. іпсАКОо Еша ОССААТТСТСААТТТОСТАСАСАСТОСТИ во в ЕМО-Уу01 ча ачдачасЧучесяАагсаадчааасасс зосасссссвааєтсассасоссе ссдссссасоасоддааааадаася савесеєссессссассасаоаасая в
В ЕМО-У0З тай ччассссасадааааатадсаацчі єссддаа
Р ОЕМО-уУу03 кКех сесчачдаасссдессАСЕсрЕссгдсаавассс вв аессессадаасодаанасавс
Р ЕМО-у0й4 кех чесаєсссессососСсоссгдадчадас вв
Р ЕМО-У05 Еча сасссчассассасссодаесЕсьс ва дасасасссаасьяасаяссяаася
САСТОСОАСТАССАТоСсОссатстотоссАсАСОос | 71
Р ЕМО-06 Гкй
ЩІ Що СААТИйСАСТАТАААТАС
САСТОСАСТАССАТОСОССТСТСТСАСАСАСОС | 72
Р ОЕМО-О7У Еха
Що т СЛАТОССАСТАТАААТАС
САСТОСАСТАССАТОоССОСТоТСТСАсСЯодОос8І 73
Р ЕМО-О8 ма т ЩІ ЗААТОИССАСТАТАААТАС
САСТОСОАСТАССАТОСОСОТСТСтТСАСАСАСОС | 74
Р ОЕМО-О9 Еча
ЩІ Що СААТЕССАСТАТАААТАС
САСТОСаАСТАССАТОСОССТСТСТСАСАсСОоСО | 75
Р ЕМО-10 Емо
Що Що СААТОаСАСТАТААЛАТАС
САСТСОАСТАССАТОССОСОТСТСТСАОАОАСОС | 76
Р ОЕМО-31 ха
Що Щі СААТайСАСТАТАААТАС
САСТССАСТАССАТОСОССТСТСТСАСАСАССО | 77
Р ОЕМО-12 ча
Що Що СОААтТапсСАСТАТАААТАС
САСТСОАСТАССАТОСОСОТСТСТСАСАсАСОСС 078
Р ОЕМО-13 Ечі
Що т СААТИассСАСТАТАААТАС
САСТООАСТАССАТОоСсаватстТстТосАСАсАСОосТтьь' 795 в ЕМО-14 їй т ЩІ СААТИОСАСТАТАААТАС
САСТОСОАСТАССАТОСОИВаТСТоСТСАСАСАСОоС
Р ОЕМО-15 Еча
Що ЩІ ССАТОССАСТАТАААТАС
САСТОСЧАСТАССАТОСОСОТСТСТСАСдОдОоссІ | 81.
Р ЕМО-16 Їх т ЩІ САСТОасАСТАТАААТАС
САСТСОАСТАССАТОСОССТСТСТОСАСАСАСОосС | 82
Р ОЕМО-17 Еча
Щі Що САдСсасАСТАТАААТАС
САСТОССАСТАССАТОСООСТСТСТСАСАсАсСО | ВЗ
Р ЕМО-18 Еча
Щ Щі СААТСОСАСТАТАААТАС
САСТОСАСТАССАТОСОСИТСТСТСАСАСАСаС
Р ОЕМО-19 Ешй
Щі т СААТИССАСТАТАААТАС
САСАСАССОССАТОСТАСТОС сесарасєсааасраєассавааассасаасалт
Р ОЕМО-ху20 Емма
ЩІ Що СастАасСААЛАССсАбААпААСТТТТСАС грасьусадесссаасаєсадессдадсаєдчадає | 87
Р ЕМО-Уу20 геху чааасссадаасчаачдааєсаєсассачьсса гасачсдсесаєссссоссссісесеуадч часесасссасадасааасааєсаасавасАтТо 88 в ЕМО-у21 ча то Що ССТАССАААССАСААСААСТТТТСАС агєсаєєчаєсаєсьчяьссає счЧчачесЕв
Р ОЕМО-Уу21 геуУу З З зя37989 З
Що Що аааачдасасасссЯасоєгагсаресасадсдес (синтетична ДНК) (синтетична ДНК) (синтетична ДНК)
0010000 | абессостовсєвад ц асєєавосьстасьссьсеєсаєсааєссасассАтТ
Р ЕМО-у22 Їча
ЩІ Що СОССТАССАДАССАСААСААСТТІТТСАС асчєчаєєчаєдчааачцааначаччасавацва. зі р ЕМО-у?2 геу часа часчавад чача чсаз
Що Що асачрасєеєсасачсассасссессТтеєсь Чад ассаачсрачдсссссчасбасасссуассассаєс з2 счдаагЕсьсьЕсачадлдадчавасцасасссвАТАС
СаСАПАЛАТАТАТАААСТАОСАСОТТОТАТАСС рРесоке ЕМО уУу2г3
ВИ АДАТАТАССААСаСАСТАСААОСААСТСТТОаСТ (вупспесіс
ОМА) ТТАААСОСААСАААСААТТСТТСОААСАТТТАС
ААСАААСААОСТАССОТААСАТТААТААТСОСА
АпОИТАТОИСТАССАААОСАПААСААСТТІТТСА
СТОСАСТТОТСССААТТСТ ассаачссЯасссссуасасассодастассвесс аз сяачассЕСЕСсСадачАЧаччаасуцсасагААТО
ТТІТСССТСААТТОТОАТСТСТСТТаТАСАТАТТ
Рсоке ЕМО Уу24
Ди ТААТАССАСОЗССААСОСТАСАААААСАТАСАТА (вупспебіс
ОМА) АСТАСТТАССАААСТТІСААТТОСТТААСТТАСА
АСТОСААТССАТАТСТТАААСТТАТТАСАТТАТ
ТТАТААТтТОасСТАССАААОпАСААСААСТТТТСА
СТОСАСТТОТСССААТТСТ ассаачседссЕссдчасрасасьсчастьассаєс счачеЕсЕсєсасчачАдачачаасчасассстост
СТАССТТТАТСТАТААААОСТОААСТСОТТАСсА рРсоге ЕМО 25
Ин АТІТТТСАТТТАААОСАТААТСАААСАТСТАСА (вупсБбесіс
ОМА) ТТСОСААТОСОСАТАААААССАСАТАСААОаТТАТТА
АСАТТАТАСОТТАСАТТСТАЧАСТАОаТАТАОСА
АСОТААТОССТАПСАААСПАСААСААСТТТТСА
СТОаСАСТІСТОСССААТТСТ 3. Результати
Результати флуоресценції білка-репортера НРЕМО промотору (Р. ЕМО) ії АОХ1 промотору (Р АОХ'Т) протестованих промоторів послідовностей дикого типу показані на Фіг. 4. а) ЕМО варіанти промотору - точкові мутації та одинична нуклеотидна вставка
Таблиця 0: Відносні активності промотору усіх варіантів промотору, що включають точкові мутації та одиничні нуклеотидні вставки. Відносні значення флуоресценції (КЕШ) білка- репортера еСЕР були виміряні і ці значення були нормалізовані відносно 00600. Ці значення
КЕРШОЮбОО були нормалізовані відносно значення КЕШ/ОЮбО0 послідовності варіанта батьківського НРЕМО промотору (М - 5ЕО ІЮ Мо. 1), даючи в результаті відносні активності промотору. Штами культивували у ОМУР культивуванні на середовищі ВМО (24 і 48 год.) і згодом індукували метанолом (72 і 96 год.). 96 год. індуковані метанолом 72 год. індуковані метанолом 48 год. дерепресовані
24 год. дерепресовані
ЕЛЕ у сюунн то й , 72 1 зви 211 48 іпацсей хі іпапсей піс
Зегергеввецч аегергеввей шеєпапої штеснапої 1,0 0,62 - 0,Бе в 0,56 - ж У13 УЗ Уа 0,53 0,058 0,031 0,азі 1,0 5 0,63 ж 0,56 5 0,56 к
У12 У172 ча УА 0,51 0,071 0,073 0,073 1,1 з 0,67 т 0,57 ж 0,57 ж "13 14 чУ172 12 0,58 0,088 0,028 0,028 1,2 Ж 0,70 Ж 0,58 ж 0,58 в чо Уї1 У11 У11 0,47 0,062 0,028 0,028 1,3 0,69 Ж 0,59 ж 0,59 ж
У14 чУопв У1ї3 Уу1т3 0,52 б, ова 0,029 0,029 1,3 5 0,75 - 0,69 х 0,69 я
У1І 15 У15 чУ15 0,37 0,062 0,51 0,051 1,3 - 0,83 - 0,74 0,7а - ча4 чУквчва Уа Уа 0,49 0,283 0,036 0,936 1,3 0,87 0,77 ж 0,77 -
У19 ув Ууде Уоб 0,48 0,047 0,049 0,949 1,3 х 0,81 5 0,83 Ж 0,83 ж чУ16 07 чо чУ07 0,41 0,071 0,076 0,076 1,4 5 0,91 0,83 0,83 т
У15 Уу16 чав чав 0,14 0,9в2 0,056 0,056 1,5 в 0,84 з 0,88 0,88 - чОов Уа ч16 ч16 0,46 0,10 0,024 0,024 1,5 ж 0,96 0, ж 0,9 ш чо Ума ча ча 0,49 0,053 0,066 0,066 1,5 5 1,0 ж 0,37 ж 0,97 щ-
Уа У У1т8 У19 0,6о 0,13 0,079 0,079
1,5 ж 1,1 Б 0,а ж 0,99 ж
Уї8 УЗ УОЗ 03 о,5а 0,11 о, ово 0,28 1,7 - 1,1 ж 1,0 Ж 1,0 ж
УОЗ чУо1 ж че 0,62 0,12 0,088 0,088 1,7 ж 1,1 Ж 1,04 ж 1,0 5 06 Ууоввб Усв1 От 0,73 0,069 0,066 0,066 1,8 Б 1,1 Б 1,06 х 1,1 Б чУ17 чУ18 Уу17 У17 0,63 0,11 0,05 0,056 1,8 ж 1,28 1,08 щ ; 1,1 чт У17 У1а8 18 0,6 0,15 0,12 0,19 1,9 1,3 Б 1,1 Ж 1,1 5
У10 У10 У т05 0,65 0,16 0,061 0,061 2,4 З 1,4 1,2 т 1,2
У чо чУ10 У10 0,64 0,17 0,065 0,066
Б) ЕМО варіанти промотору - заміни основного промотору
Таблиця Е: Відносні активності промотору усіх варіантів промотору, що містять замінений основний промотор. Відносні значення флуоресценції (КРОЮ) есЕР білка-репортера були виміряні і ці значення були нормалізовані відносно 00600. Ці значення КРШ/ОЮбО0 були нормалізовані відносно значення КЕШ/ОЮбОО послідовності варіанта батьківського НРЕМО промотору (ул - ЗЕО ІЮ Мо. 1), даючи в результаті відносні активності промотору. Штами були культивовані у культивуваннях ОУМУР на середовищі ВМО (24 і 48 год.) і потім індуковані метанолом (72 і 96 год.). 48 год. дерепресовані 24 год. дерепресовані 96 год. індуковані метанолом 72 год. індуковані метанолом 72 п зв п 24 ав п Й , іпайсеайа ків іпацсей «ісп аегергаввей аіекергевнвей штеспапої шщшесєрапої 0,36 ж 0,29 - 0,йа ж 0,42 Ж
У?г3 0,30 У 0,067 Уу25 0,032 ч25 0,032 0,53 Ж 0,42 х 0,41 0,58 х уг5 0,31 ча 0,056 чУ24 0,054 ура 0,022 0,59 ж 0,54 Б 0,5О Ж 0,6О ж 24 0,44 |»Уг3 0,070 у23 0,063 т23 0,074 1,0 ж 0,96 х 0,76 « 0,92 Ж ж 0,44 Ууг22 0,097 У2г1 0,074 уУуз1 0,06
Ууг2г1 1,8 х чг1 1,0 ж У» 0,78 в чай 0,99 В
0,50 0,ла 0,089 0,951 2,8 в 1,0 ж 1,0щ 1,0 ж
Уу?22 0,36 че 0,098 че 0,132 че 0,134 3,7 ж 1,6 Ж 1,4 х 1,8 в
Уу20О 0,65 Уго 0,14 чо 0,173 УДО 0,078
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
-110» ТесНнпізсне Опімегзйаї Ста 120» Дріжджова клітина -1305 48524 «1505 ЕРІ1І5202233 -1515 2015-12-22 «-160» 94 «170» РаїепіНп мегвіоп 3.5 «2105» 1 «2115 623 «2125 ДНК 213» Напзепша роїутогрна -4005 1 аашіасіа аасодсааасі ссдадсідда ааааїнас сддсдаюсд сддасааш (510) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180
Зо азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 35 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадад ддаадідісс содсісдідід дсаааїаду 420 сісссасідд ісассссдда Шосадаа ааасадсаад Нссддаодіо ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї сададачдда9 ааддсасіа іаааїассдс сісспудсодс 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105» 2 «2115 1510 «2125 ДНК «213» Напзепша роїутогрна «4005 2 сдасдсддад аасдаїйсісс ісдадсідсі сасддаїсад спаддссс ддіааддаа бо ссаддссдас ддсасдсісс НКдсодасса содіддсіда сдадсссаді Ноїдаасда 120 ддісащшад аасдіссідс дсааацдісса дідісадайд аащшіссісс ісддассааї 180 ісадсаїщції сісдадсадс саїсіцісії ддадіадаа дсоїааїсіс дсіссісді 240
Тасідтассуд даададдіад Шоссісдс сдсссаїаа! даасадднс ісшсідді /-з00 додссідщад садсддддас аісіддасд9 сдісдаїдад дссспдада сосісдіаді 360 аснойсодс дісдсідїад ссддассдсда щдасодаїасс сасаїададо сспддоса 420
Зо нпадшоаї даддіддддс адчащдаодсо асісддсаїс даааншо ссдісдісді 480 асадщюдаї дісассаїсо аашціаащда дсдсадсії дсдаїсісду азданоа 540 ааддаадаа ссдсдасаїс Іссаасадсі ддоассаїдії дадааїдадс сддасдісдаі 600
Заасдаддо дассасаадс сдасдшос щаїдодсосо одсосісдіссісдашціада 660 аддссіше сададаосадії сісдідаада адсідссаас дсісддаасс адсідсасда 720 дссдадасаа НПсоддада ссоадсщшод їсашсааї днодісдісоЯ аїдаддади 780 сдадаісдід даадацісс дсдіадсддс аішоссіс ададшасс ашюададісді 840 ссасідсада даїдссона сіснсассу сдіасаддас даасдоасаїд дссадсаддс 900 сесндаїсса йсіаїдадо ссаїсісдас даїдйссії дадідсдіас іссасісідї 960 адсдасідда саїсісдада сідддснос шіосіддаї дсассааца айдноссу 1020 саюдсаїссі їдсассдсаа дішаааа сссасісосі Падссдісд сдіаааасії 1080 дюааїсідд саасюадодо дуансідсад ссоасаассда аспшйсосіїсдаддасдс 1140 аасюдаща шщісадіюда дасісідійї дсіддсдїад ссіасаасдаі дассійдссі 1200 аассддасду сдсіасссас ідсіцдісідї дссідсіасс адааааісас сададсадса 1260 дададссдаї діддсаасія дідддащіс ддасаддсід Шсіссаса дідсаааююс 1320 ддадаассод дссадааадії ааайснаї осіассдідс адідасіссу асаїссссад 1380 пШшосссі асідаїсас адаюдадіс адсосідссу сіаадідіас ссаассдієс 1440 ссасасддіс саїсіаїааа їасідсюсс адідсасдді ддідасаїса аїсіааадіа 1500 сааааасааа 1510
Зо -2105 З «2115» 28 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 З аашіасіа аасосааасі ссдадсід 28
«210» 4 «211» 30 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 4 чанщацняо аїдааддсад ададсоасааа 30 -2105 5 «211» 28 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 5
Ісдасдсдда даасодаїсіс сісдаядсі 28 -2105» 6 «211» 45 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» Праймер «4005» 6
З5 шОНтщО їасшадаї дащдісасс ассдідсасі ддсад 45 «2105» 7 «2115» 35 «2125 ДНК
213» Штучна послідовність «223» Праймер «400» 7 сдададіа саїаснааа адсдссаїа (дад 35 -2105» 8 «2115 56 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 8 шодадааа! їааіадіаауд ації сдіаааадії Ндайдаді їаацс 56 -210» 9 «2115 37 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер
Зо «4005» 9 доааїссасіа садшасса андайцасд ссааїад 37 «210» 10 «211» 60 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер
«4005 10 пшодаації адшщтадаї адаїааацаї аашісааї ссіднНаїаа ааіадіаїаї (10) «2105 11 «2115 55 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 11 доаадіаїасд іаааїаїана анаїайаца аїсаіайана (дааіасааї дааад 55 «2105» 12 «2115 58 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 12 їайдааааа іааїтой ШНН ошщІща аааднсоії аааайсд 58
Зо «2105 13 «211» 28 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер -4005 13 ддаїссснс аасадсддад ісісааас 28
«210» 14 «2115 58 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 14
Іщо9юдаа їіааааааїа9д аїаааїтаїда Шадщіад Чайсааї саандас 58 «2105 15 «2115» 60 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 15 сндусосісі сідссіїсаї сааісаааїйс аїдадайсс саїсіїіації сассдсідіс (610) «2105 16 «2115» 60 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» Праймер «4005 16 сааащддсаї ісдасаїсс існдадсдо ссоснНадад оддісасдаїа ссддаасаад (610) «2105» 17 «2115» 66 «2125 ДНК
213» Штучна послідовність «223» Праймер «400» 17 сааащддсаї ісдасаїсс існдадс9до ссодснадда іссоНаасі ненпдсааї (610) саацдіс 66 «210» 18 «211» 24 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер -4005» 18 асіддідієс дссааіаада ддад 24 «210» 19 «2115» 60 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220»
Зо «223» Праймер «4005» 19 снусосісі сідссіїсаї сааісаааїс аїдонасід сісаснсдї сндансас (610) «210» 20 «2115» 61 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
«223» Праймер «4005» 20 сааащддсаї ісюасаїсс існдадс9дд ссоснНаадс діаадсодісд дсаасцссі (610) 9 61 «2105» 21 «2115» 60 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 21 саснаосісї адісаадасі іасаанааа аднасід сісаснедї сідайсас (610) «2105» 22 -2115» 868 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Штучна послідовність
Зо «4005 22 сдасааснод адаадаїсаа аааасаасіа апайдааа даайссдаа асдацдоана (610) сідсісасії сдіснодаї! сасасіаїсі дісаїддідс Ноддаїсіда сасаадіда 120
З5 адссадсаїї ддадададсі ддасаїаадд ЧМассдсісі даїаюасі дсаїсіддіа 180 пдаїссісо іІсаааїсдаа саааїсааїй! сайсдасда діасісадад ссасідсіда 240 сененодда аааднодссі саадаїдааа адаїдаїсаї сондаїдаа іссідідсід 300 дандаасаї дссанодса дсюдаїадаї ащдісдаїаа даїсосіосі даїдісцсс збо асаасісісї днНассадаї асідіїсасі сіссаїсна сасідісдад ааднонад 420 ааїсайссс адайддада даїасідааї асшасц сасіаасаїс асіддадада 480 сіаїсассас саюааасії ддансуцш (днНодадада ааассішс ассаацдіуїа 540 сюашдащюа аїасдаанду дссаададд нНададааа ддаунещо Шсадааюд (610)0) псндсаса аадассааад йсассдааа аддонасоод йпсіаїсаад ааддієітаса 660
Істддасіда ісаддасааяд аїсіссідс садасноса аадаїддсаа аїсдсааасі 720 асааассада їааддісіас саадіссаад діодідаїса саадйасаа Пдассаада 780 ссдаададої сдсісасаїс Пдсаддаад Ндссдасос НПасодсцаа дсддссусіс 840 аададдації садаадсса Шоссіа 868 «2105 23 «2115 572 «2125 ДНК «213» Сапаїда Броіаіпії «4005 23 додаїсссне аасадсддад ісісаадсад щдасіацаї садшщіан аапйасідаї (610)
Зо одсанодіаї! атадіосаїа саїаднааї аанасісіс дНаїсаїй даааайшяЯ 120 ааайсісас ісісасдсад ідсаааасії їдссіааця адіаадідда асосааїан 180 їадосіасаї азшодаїй! сссНаадіа юіааїсааа даїсайсаїасідссаїсї 240 їаїааїацоу дадіанай аюйцосіаї асіднстас сідшШайсіайдіас 300 дісіаааїсі Нссаїсаді Неіайасіа ІсСшсоуШш одсааюдааа ацасіссаа 360 псосНді Ісаасісосі їдссісісї спдсснсї ШШСШ ісайнаїс 420 дношШааа содаїаагаа азашіаасо пдісдсна сшідадаа аїсасішду 480 пдсісісаа йсідішО асаїснаад днНадісааї даноааїс аасіасасіа 540 ааїсаїайі аїсіаціїї їанссасаа аа 572 «210» 24 «2115 1652 «2125 ДНК «213» Сапаїда Броіаіпії «4005» 24 ддадіаїасд іаааїаїана ацнаааца аїсаїадана Юдааїасааї дсааїдааад бо дааїгаюдаї аададааа іааіаасааа садсдаїаава іааісісаа ааїддадна 120 сасаасаааї ааіааіаааа іаіїааацаї ааацагааа Наїаааада аіааааааїа 180 аассссасіа ашанна Паааадаїа даноддіаїс Шаснааі аасаайсід 240 ааасшай саснаацйі ташаасі ашааша ШШассссадшинсад 300
Тасааідсад сіссдааас!і нНашододсі дідашоас юічашода сюідашо 360 асндасна дсіддесдда айдісіссї дсаддаацо сісддудісєс дунсісссу 420 сіддсщасі ажоддсода сіддсіай! дасоддосіда сідодсідусі дсістдсосаї 480
Зо сідсщюЗюодс сассссодсаї сісіддаїс асдссдідса дсіддасоїд сдістасссі 540 дсадссаї дсснаше ссааїсіссс ааїсісісаа ісідссадієадссааааса 600 ссддссаддс аддсаддсад дсаддсаддс аддсадщаа дссИсссас дссссасісс 660 дсаїааасаї ссссадсаді Нссссадса дшссссад сіпйсаан іаайаааайа 720 дссідшеї дДшНсТа НІ таїапцатас ааштаї ссіааіаай асіснісдд 780 даайнааага аїаайцагїа! саїагассса їаїсасаш їасіаїаш асіаїстаа 840 аагааанса їайаїаата Чаашагїа нсодснааї іІаааацсісіШіссаїса 900 ісагсагсаї саїсаїсаїс асдадінс доНаїсааї асіспіса Чааціста 960 даацсаїй ашащшії їандасіа ааайшсаа ісааїйша: наншаї 1020 пашаїй ісатансії адашааас нНШада!їд ассддсіашіасцасца 1080 снасідно пШатана даїаадааї їіаайнсаї ашаїда!гз ашаїдаці 1140 ааащшаасс їадіаїасіа Шааації аїсасіаїсі Шадіосід дсашша 1200 неташіс агагащшіаї агасдіаааї! іІаадіаїсаї сасосідсі асідіасун 1260
Тааааішюа ададдаааї адададодада адаадаїцда ададатюад аацаїааас 1320 сайсанса Пааїсааїс ааїаїаасії аїаааааааї Наїашаа аїдаацааї 1380 псстшай Нааїаааї сойаансї Шааайсі айшанн аайсшсі 1440
Насаїацді їаїсаїаіаа саацаїтата асаіадатас асаацаца шсанаїс 1500 аганацші Наааатай дайацшії ааааїгаата! спаанаайіааншас 1560 дааїаїасаа аїшаасда спасіші Наасдаайц Наасдаасі Шааааааа 1620 сааааааааа аааасааааї їанцсаа їа 1652
Зо «2105» 25 «2115 1157 «2125 ДНК «213» Ріспіа теїпапоїїса «4005» 25 сдадаїддіа саїаснааа адсідссаїа НКуаддаасі ісаааднії азїсічни (10) адаанаааа дасдацоії діаасаааас ойоїдссіа саїааасіса аайааюда 120 ааїадссідії Шодаааааї асасснсїї аадіасдас ааадінаі гаааїдасіа 180
Ісдаасаадс саїдаааїад сасашсід ссадісасії Наасасцш ссідсцусі 240 дунодасісі ссісаїасаа асасссаааа дддааасц садідіддод асасндаса 300 іІсїісасаїдс ассссадаїї аашсссса дасдаїсо99 адасаадаса ааасаасссії 360 пдіссідсі сішсце їІсасассосо дідо сдсаддсадоа саддсадаса 420 дсоддасідсс ідссаїсісї ааісдсідсі ссіссссссі ддснсаааі аасадссідс 480 дсіасюі дассаданод ддасассссс сіссссіссод ааїідаїссаї сассішдаі 540 сдіасіссда саадаїссі Ісссідісаї снсідосаа іІсадсіссії сааїаайаа 600 аїсаааїаад саїаааїаді ааааїсдсаї асааасдіса Юааааціїй! іагсісіаїд 6бо дссаасоддаї адісіаїсід снаайсса іссасцоо даассонНсі сісШассос 720 садайсіса аадсіаазаї сідссссно ісіайдісс Шсіссодідіасаадсдда 780 дсішоссі сссаїссісі ДС сдонанн нНШісцшИ дааасісна 840 дісаааїсаа аїсааасааа ассааассії сіанссаїс адаїсаассііїднсаасаї 900 істагаааїйс даїаіааагїа іаассцаїс ссісссцді НШассаа Пааїсааійс 960
Зо псааашс ааагашіс їасідсій анасісаді айаасаш оШааасса 1020 асіаїаасії Наасюдсі Падаадш їашаасаї садшісаа! пасаїсш 1080 ашанаас даааїсша сдаайнаасі сааісаааас ІШасдааа ааааааїсй 1140 асіацнаай ісісааа 1157 «2105» 26 «2115 1662
«2125 ДНК «213» Ріспіа теїпапоїїса «4005» 26 додаїссасіа садшасса айданасд ссааютції їашсасса адіаацаса (10) ааасідадаї НдонНащюі санашіаї шсдодсааї ддсідіаай ааасіддаї 120 таддайааї! їІаасошад ссіасдааад содсіадсії нашсідс НЯННЯ 180 адсссаціс іаанссааї сшосааї! ісдносаїс ІШаааай аадіосісй 240 неїааїсід аїааадаїаа дссаїсдіад адіаадіааа асаааагааг діасідіата 300 пааосддаа аааснддаа аадісаїад ашдідаадод адсааадаа! дасіааїай збо аддадаша адсааасааї дзнкдадддда асаддасдаї! Ідаасссснцаїададдаадс 420 аісшодаїйд псдаадоадо даддддісаа аадсасюдаяд садіосіаайіадіаассаа 480 шсщіаад сааюааасі (юносіаїї ддааайасіа Наадіаайа сааддіасад 540 асіааддда ддадссодої адісадодсі аїсцагада садасіайс сдданаїсї 600 ааїсацдої дсассюдії ааіаанаїс адісаасісї Шасодідс їдагадаїс! 660 посдаасії дссспощда аашодоно Нааїісааас днсідіаї йсаїдісаї 720 асіасіацу аїапйайнаа юпнасйцас ісаїсіддсс ашаасадо Шдаадсни 780
Зо
Іааісісії аасіаасадс ааїссаїсас сдісаассії аассссссід дідсноусід 840 їсшаїссі Ісдіаїст псаюцнос ассдсссіді іссНайасу днуНсссс 900 саїаддсіаа снесісідн Іссдассаїс ісідсааїаа сааадаайсіаїасодсна 960 сасіаїааїс аїасааюдас ісіасаїдсс айнсасії таснцасцо ссаїсддаад 1020 азасідааїгс адааадссаї адіаасіаса іаасисааа асасасссі Шасадан 1080 аоцасаайн Паїсааі нуашоаїа асссаадаі даасушос аднадассі 1140 дшШааїсса асісасша ссассссааа асшссіас сунпадасаа аїасіддсіа 1200 ааісідасда адасаассаа іІсаасаацу ааїссасідд дадаїаїсіс іааїссасід 1260 асааасщ9 сіаааасаад аааааадідду дассіссдйї дсддадаада саїдсдсада 1320 сцаааааса саададааса спддаадіа ссссадайі падсносі асіайсіда 1380 сасссссіаї Ісаадсасда сддщданоа йсайсааї Шосідсіс сааїдааоадуд 1440 аіааасссії Пддасіїса аїісадассіс ідіссіссаї адсааіайаа аїассиста 1500 днодссссас Нссісісіс сідїасідсс ссааїдадід асцанйсаа дпасшсі 1560 сісішссі аасаацааа саадаадсії їанаіааса Пааагасіайшагаас 1620 аддандааа Чаїтатшаї сіаїсіаааа сіаааайса аа 1662 «2105» 27 «2115» 580 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО
Зо «220» «221» інша ознака «222» (72)..(72) «223» п являє собою аденін або не нуклеотид «220» «221» інша ознака «222» (354)..(354) «223» п являє собою аденін або гуанін
«221» інша ознака «222» (455)..(455) «223» п являє собою цитозин або тимін «220» «221» інша ознака «222» (551)..(551) «223» п являє собою тимін або гуанін «220» «221» інша ознака «222» (563)..(563) «223» п являє собою аденін або цитозин «220» «221» інша ознака «222» (564)..(564) «223» п являє собою гуанін або цитозин «220» «221» інша ознака «222» (565)..(565) «223» п являє собою аденін або цитозин «220» «221» інша ознака «222» (566)..(566) «223» п являє собою гуанін або цитозин
Зо «220» «221» інша ознака «222» (567)..(567) «223» п являє собою аденін, гуанін або цитозин «220» «221» інша ознака «222» (568)..(568) «223» п являє собою гуанін або цитозин
«221» інша ознака «222» (569)..(569) «223» п являє собою гуанін або цитозин «220» «221» інша ознака «222» (570)..(570) «223» п являє собою гуанін або цитозин «220» «221» інша ознака «222» (571)..(571) «223» п являє собою гуанін або цитозин «220» «221» інша ознака «222» (572).(572) «223» п являє собою аденін або цитозин «220» «221» інша ознака «222» (573)..(573) «223» п являє собою аденін або цитозин «220» «221» інша ознака «222» (574).(574) «223» п являє собою тимін або цитозин
Зо «220» «221» інша ознака «222» (575)..(575) «223» п являє собою гуанін або цитозин «220» «221» інша ознака «222» (576)..(576) «223» п являє собою гуанін або цитозин
«221» інша ознака «222» (580)..(580) «223» Х являє собою 5ЕО ІЮ Мо. 28, 5ЕО ІЮ Мо. 29, 5ЕО ІО Мо. 30, 5ЕО ІО Мо. 31, 5ЕО
ІО Мо. 32, БЕО ІЮ Мо. 33 або 5ЕО ІО Мо. 34 «4005 27 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсдосу апісаадааа сассідсіда дсдадсацдіс (ддадсасад іспсдаюад 120 дсссдадаїс ссассодсодії ссіддаїасс дддасдідад дсадсосдас аїссаїсааа 180 їаїассаддс дссаассдад ісісісддаа аасадснсї ддаїасис сосіддсддс 0240 дсаасдасода аїааіадісс сюдадоаюа содааїаїа! ашідіодад ддіаааїсд /-з00 асадддаюіа дсаааддіаа їашіссіа ааасаїсаа ісдудсідссс ссдспасддда 360 аааадааїда сподсасі снсассада діддодіціс ссусісдідї дідсааалаа 420 дсісссасід дісассссдуд аййдсада аааападсаа діїссддодаої дісісасідд 480
Ідіссодссаа іІаададдадс сддсаддсас ддадісіаса ісаадсідісіссдаїасас 540 ісдасіасса пссддлдісіс Іспппппппп ппппппсасп 580 «2105» 28
Зо «2115» 45 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» основний промотор ортологічного промотору «4005» 28 їаїаааіасс дссіссндс дсісісідсс Нсаїсааїс аааїс 45
«2105» 29 «2115» 70 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» основний промотор ортологічного промотору «4005» 29 їаїазааасі ддідаїаан ссНнеунсії даднссаїс ісаїасісаа асіаїайнаа бо аасіасааса 70 «2105 30 «2115» 61 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» основний промотор ортологічного промотору «4005 30 їаїаааіаса адасдадідс діссщцісі адасісассс аіааасаааї ааісааїааа (610)
Ї 61 «2105 31
Зо «211» 45 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» основний промотор ортологічного промотору «4005 31 їаїаааїасі дссіасної ссісіайсс Нсаїсааїс асаїс 45
«2105 32 «2115 143 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» основний промотор ортологічного промотору «-4005 32 сдаїадддса даааїацваіа аадіаддаду Поїаїасса ааіаіассаа содсадіасаа бо дсаасісну дЩааасодо аадааасааї існсдааса Шасаасаа адааддіасс 120 діаасайаа іааіїсддааз 991 143 «2105» З3 «2115 143 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» основний промотор ортологічного промотору -4005 33 діааісціс ддаісааної даїсісісії діадаїайці ааіаддасодд ссаадаїада (610) аааадаїаса іаасіадна дсаааснса апдснаад Насаадщс ааїссаїаїс 120
Зо пааадна! їасанаїйй аїа 143 «2105» 34 «2115 143 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» основний промотор ортологічного промотору
«4005 34 ссіссісіад дШаїйсіаї аааадсідаа дісуонпадаа (сані ааадсаїааї (10) сааасаїсіа дайсдааїс даїааааадс адаіадааді їайаадацйайадоцаса 120 нсіададіа діаїаддааз діа 143 «2105» 35 «2115» 624 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м! «-4005 35 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдаадсюда ааааюцнас сдоасдаїдвса сддасаацш (610) ададдсдосу ааіїсаадааа сассідсіда дсдадсацдіс (ддадсасад ісісдаїда 120 дсссдадаїс ссассодсодії ссіддаїасс дддасдідад дсадсосдас аїссаїсааа 180 їаїассаддс дссаассдад ісісісддаа аасадснсї ддаїаїснсе сдсідасЯадс 0240 дсаасдасода аїааїадісс сюдаддюа содааїаїа! аїдідіддад ддїааає!ід /-З00 асадддаюіа дсаааддіаа їашіссіа ааасаїсаа ісдудсідссс ссдсаасоддда 360
Зо аааадааїюда сщоддсасі снсассада дідддоідіс ссосісоащі дідсаааїад 420 дсісссасід дісассссду ашідсада аааасадсаа діссддоді дісісасідд 480
Ідіссодссаа іІаададдадс сддсаддсас ддадісіаса ісаадсідісіссдаїасас 540
Ісдасіасса іІссдддісіс їісадададодад даадяосасі агаааїассд ссіссйдсу бо сісісідссі іІсаїсааїса ааїс 624
«2105» 36 «2115» 623 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м2 «-4005 36 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (510) ададдсддсо аїсаадааас ассідсюда сдадсацдісї ддадсасаді снсдаюаода 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасдаа іаагадісєсс юдаддащдас доаагаага шідіддадо діааайсюа /-з00 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсдасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс дасаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї сададачд99 аадодсасіа іаааїассдс сіссцйдсодс 600
Зо Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «-2105 37 «2115» 623 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО уЗ3
«4005 37 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасудщдадо садсодсдаса Іссаїсааай 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасаїдсааї сдосідсссс дсаасяоддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шодсадаа аааіадсаад Нссдоадоід сісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї садададд9ад ааддсасіа іаааїассдс сіссйдсудс 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105» 38 «2115» 623 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
Зо «220» «223» Варіант ЕМО м4 «-4005 38 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсюда ааааюнас сддасдаюса сддасаацш (610) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсід даїаїіснНос дсідсдодсЯа 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї сададда9д99 аадодсасіа іаааїассдс сіссцйдсодс 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105» 39 «2115» 623 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м5 «-4005 39 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсдосоу аїсаадааас ассідсюда сдадсадісї ддадсасаді сісдаїд9д 120
Зо сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасдаа іаагадієсс юдаддщдас доаагаага ідіддадо діааайсюа /-з00 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс дасаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдайасасі 540 сдасіассад ссоддісісї садададчодо аадасасіа іаааїассдс сіссПдсодс 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105» 40 «2115 623 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО мб «4005» 40 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса Іссаїсааай 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасаїдсааї сдосідсссс дсаасяоддаа /-З36О0
Зо ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї ссдададо999 ааіддсасіа їааайассос сіссцдсос 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623
«2105» 41 «2115» 623 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м7 «4005 41 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсюдда ааааюднас сдасдаюдсо сддасаац бо ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсід даїаїсцсс дсіддсдосЯа 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасідуд Ісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадаї ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї сасададд9ад ааддсасіа іаааїассдс сіссйдсудс 600
Зо Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «210» 42 «2115» 623 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО мв
«4005» 42 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсдосоу аїсаадааас ассідсюдо сдадсацдісї ддадсасаді снсдаюаоад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасдаа іаагадієсс юдаддщдас доаагатага ідіддадо діааайстда /-зо00 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дадісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї садсдаддд9д ааддсасіа іаааїассдс сіссйдсудс 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105 43 «2115» 623 «212» ДНК 213» Штгтучна послідовність
Зо «220» «223» Варіант ЕМО мо «-4005 43 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї садасадд999 ааіддсасіа їааайассос сісснудсос 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105» 4А «2115» 623 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м10 «4005» 4А аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсюда ааааюдцнас сдасдаюдсо сддасаацш (610) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120
Зо сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсід даїаїсісс дсіддсдодсЯа 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасідуд Ісассссдда Шідсадаа ааасадсаад нНссдоадаї ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї сададс9ддд9 ааддсасіа іаааіассдс сіссйдсудс 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105» 45 «2115 623 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м11 «4005» 45 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсддсо аїсаадааас ассідсіддуд сдадсадісї ддадсасаді снсдадуоа 120 сссдадаїсс сассдсоунс сідддіассд ддасдщдаду садсудсдаса іссаїсаааї 180 агассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадсіїсід даїаїісцсс дсіддсяддсу 0240 саасдасдаа іаагадієсс юдаддщдас доаагатага ідіддадо діааайстда /-зо00 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360
Зо ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дадісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї сададасдд9 ааддсасіа іаааіассдс сіссйдсудс 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623
«2105» 46 «2115» 623 «212» ДНК 213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м12 «4005» 46 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (510) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї садададс99 ааддсасіа їааайассос сісснудсодс 600
Зо Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «210» 47 «2115» 623 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м13
«4005» 47 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааднас сдасдаюдсо сддасаацш (610) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсід даїаїсісс дсіддсдосЯа 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Ісассссдда Шідсадаа ааасадсаад нНссдоадаї ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї садададосоу ааддсасіа іаааіассдс сіссйдсудс 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105» 468 «2115» 623 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
Зо «220» «223» Варіант ЕМО м14 «4005» 48 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсддсо аїсаадааас ассідсідду сдадсадісї ддадсасаді снсдадуоа 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 бо саасдасдаа іаагадієсс юдаддщдас доаагатага ідіддадо діааайстда /-зо00 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дадісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї садададдас ааддсасіа іаааіассдс сіссйдсудс 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105» 49 «2115» 623 «212» ДНК 213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м15 «4005» 49 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120
Зо сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадод садсудсдаса іссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідю їдсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї сададач999 саїддсасіа їааайассос сісснудсодс 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105 50 «2115 623 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м16 -4005 50 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда аааадцнас сддсдаюдсо сддасааш (610) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсід даїаїсісс дсіддсдосЯа 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360
Зо ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Ісассссдда Шідсадаа ааасадсаад нНссдоадаї ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї садададчд99 асіддсасіа їіаааіассдс сіссйдсудс 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 в2
«2105 51 «2115» 623 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м17 «4005 51 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (510) ададдсдосоу аїсаадааас ассідсюдо сдадсадісї ддадсасаді снсдаюаоад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасдаа іаагадієсс юдаддщдас доаагатага ідіддадо діааайстда /-зо00 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсадасасод дадісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссдддісісї сададад9999 аасддсасіа іаааіассдс сіссцЦдсодс 600
Зо Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105 52 «2115» 623 -212» ДНК -213» Штгтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м18
«-4005 52 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсудсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шоддсасіс Нсассадад ададідісс содсісдідід їдсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї садада9999 ааїісдсасіа їааайассос сісснудсос 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105 53 «2115» 623 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
Зо «220» «223» Варіант ЕМО м19 -4005 53 аащіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааднас сддсдаюдс9 сддасаацш (610) ададдсддсо аїсаадааас ассідсіддуд сдадсадісї ддадсасаді сісчаю9дд 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсід даїаїсісс дсіддсддсЯ 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шодсадаа ааасадсаад посада ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї садададч999 аадссасіа іаааїассдс сіссйдсудс 600
Ісісідссії саїсааїсаа аїс 623 «2105 54 «2115» 648 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м20 «4005 54 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсдосоу аїсаадааас ассідсюдо сдадсадісї ддадсасаді снсдадюаоад 120
Зо сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасдаа іаагадієсс юдаддщдас доаагатага ідіддадо діааайсіда /З00 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсадасасяа дадісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї садададдд9 ааддсасіа іаіїааасідд даїаайсс 600 псонсіда діссаїсіс агасісааас іаїанцаааа сіасааса 648 «2105 55 «-2115» 639 «212» ДНК -213» Штгтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м21 -4005 55 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсудсдаса іІссаїсааайї (180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360
Зо ааадаадас Шоддсасіс Нсассадад ададідісс содсісдідід їдсаааїада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссдодісісї сададад9д99 ааїддсасіа іаааїасаад асдадідсоаї 600 ссійсІад асісасссаї ааасаааїаа ісааіаааї 639
«2105 56 «2115» 623 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м22 -4005 56 аащіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааднас сддсдаюдсо сддасаацш (510) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсід даїаїсісс дсіддсддсЯа 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шдсадаа ааасадсаад пссддааіа ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї садададоада ааддсасіа іаааїасідс сіасндієс 600
Зо Істайссії саїсааїсас аїс 623 «2105 57 «2115 721 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м23
«4005 57 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсддсо аїсаадааас ассідсіддуд сдадсадісї ддадсасаді снсдадаоа 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсадасасяа дадісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссддаїсісї сададач999 ааддсассо аїаддосада ааіайїаїааа 600 дадададоїй аагассааа іаіассаасд садіасаадс аасіснпдаї ааасодаа 660 дааасаанс Псдаасаї! їасаасааад ааддіассодї аасанаайа аїсддаадад 720
Ї 721 «2105 58
Зо «2115 721 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Варіант ЕМО м24 -4005 58 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасаані (610) ададдсдосу аїсаадааас ассідсюдд сдадсадісї ддадсасаді снсдащдад 120 сссдадаїсс сассдсунс сідддіассд ддасаїдадо садсодсдаса іІссаїсаааї 180 азассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадснсїд даїаїсісс дсіддсддсу 0240 саасдасдаа іаагадієсс юдаддщас доааагаата шідіддадо діаааїсіда /-З00 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шододсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісдідід дсаааада 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдддаї ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссдодісісї садададчд9д9 ааддсасодї ааіїсшсоддісааноїда 600
ІСІСІСНої адаташаа іаддасддсс ааддіадааа аадаїасатаасіаанадс 660 ааасісааї юснаацдії асаадіосаа іссаїаїсії аааднаца сабашаї 720 а 721 «2105 59 «2115 721 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
Зо «220» «223» Варіант ЕМО м25 «4005 59 аащдіаїсіа аасдсааасі ссдадсідда ааааїнас сдоасдаїдса сддасааш (10) ададдсддсо аїсаадааас ассідсіддуд сдадсадісї ддадсасаді сісчаю9дд 120 сссдадаїсс сассдсоунс сідддіассд ддасдщдаду садсудсдаса іссаїсаааї 180 агассаддсд ссаассдаді сісісддааа асадсіїсід даїаїсісс дсіддсядсу 240 саасдасодаа іаагадієсс юдаддащдас доааїаага шідіддадо діааайсіда 300 саддаідіад саааоддіааї айіссіаа аасадсааї сдосідсссс дсаасаддаа 360 ааадаадас Шоддсасіс Нсассадаяда ададідісс содсісоідід дсаааадуд 420 сісссасіду Іісассссдда Шідсадаа ааасадсаад Нссдоадоід ісісасідді 480 дссдссааї аададдадсс ддсаддсасод дацдісіасаї саадсідісі ссдаїасасі 540 сдасіассаї ссдоддісісї садададчда9 ааддсассс іссісіадаї Наїсіааа 600 аадсюдаавії сойадаан Шсацшаа адсаїааїса аасаїсіада Нсдааїсда 660
ІТІааааадсад аїадаадна Наадайцаї адоцасаїй сіададіадіааоадаадаі 720 а 721 «2105» 60 «2115» 28 «2125 ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «-4005 60
Зо дссаайсіс аашосіад адасісід 28 «2105 61 «211» 24 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер
«4005 61 ададдсддсо ааіїсаадааа сасс 24 «210» 62 «211» 24 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер -4005 62 даїднісії дайсдссос сісі 24 «2105» 63 «2115» 25 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер -4005 63 сіюдссссдсд асдддааааа дааюд 25 «210» 64
Зо «2115» 25 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 64 сансці сссдісдс99 дасад 25
«2105» 65 «211» 30 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 65 ддашоса дааааагадс ааайссада зо «2105» 66 «211» 30 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «-4005» 66 сссддаасії дасїаншс юсааааїсс 30 «210» 67 «2115 22 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
Зо «220» «223» Праймер «400» 67 дісісісада ддддоддааїйд дс 22 «2105» 68 «2115 22 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
«223» Праймер -4005» 68 дссансссс ссістадазд ас 22 «210» 69 «2115» 25 «212» ДНК 213» Штгтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 69 сасісдасіа ссадссддаї сісіс 25 «210» 70 «2115» 25 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «-4005 70
Зо дададасссо дсіддіадіє чад 25 «2105 71 «2115 51 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер
«4005 71 сасісдасіа ссаїссддої сісіссдада ддддааюддс асіагааайа с 51 «2105 72 «2115 51 «212» ДНК 213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 72 сасісдасіа ссаїссддої сісісасада ддддааюддс асіагааайа с 51 «2105 73 «2115 51 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «-4005 73 сасісдасіа ссаїссддої сісісадсда ддддаащдас асіаіаааца с 51 «210» 74
Зо «2115 51 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 74 сасісдасіа ссаїссддої сісісадаса ддддааюддс асіагааайа с 51
«2105» 75 «2115 51 «212» ДНК -213» Штгтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 75 сасісдасіа ссаїссддої сісісададс ддддааюддс асіагааайа с 51 «2105» 76 «2115 51 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «-4005 76 сасісдасіа ссаїссддої сісісадада сдддааюддс асіаіаааїа с 51 «2105 77 «2115 51 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
Зо «220» «223» Праймер «4005» 77 сасісдасіа ссаїссддої сісісадада двсддааюддс асіаїааайа с 51 «2105» 78 «2115 51 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
«223» Праймер «4005 78 сасісдасіа ссаїссддої сісісадада ддасдааюддс асіаїааайа с 51 «2105» 79 «2115 51 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 79 сасісдасіа ссаїссддої сісісадада дддсааюддс асіаїаааїа с 51 «2105» 80 «2115 51 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 80
Зо сасісдасіа ссаїссддої сісісадада ддддсаюддс асіаїааайа с 51 «2105 81 «2115 51 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер
«4005 81 сасісдасіа ссаїссддої сісісадада ддддасддс асіаїааава с 51 «2105» 82 «2115 51 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер -4005» 82 сасісдасіа ссаїссддої сісісадада ддддаасддс асіаїааайа с 51 «2105» 83 «2115 51 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер -4005» 83 сасісдасіа ссаїссддої сісісадада ддддааїсдс асіаїааайа с 51 «2105» 84
Зо «2115 51 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 84 сасісдасіа ссаїссддої сісісадада ддддаафдсс асіаїааайа с 51
«210» 85 «2115 21 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 85 дададасссод даддіаціс а 21 «2105» 86 «2115» 60 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «-4005» 86 сісаїасіса аасіаїаца ааасіасаас ааддсіадс аааддадаад аасішсас (10) «-2105» 87 «2115» 90 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
Зо «220» «223» Праймер «4005» 87 тдїасдії Нааіааді КЧадіаюа даддаасіс адаасдаадд аанаїсасс (10) адщшагїаа дідссайсс ссісісад 90 «2105» 88 «2115 59
«212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «-4005» 88 дасісассса іааасаааїйа аїсааіаааї аддсіадса ааддадаада асішсас 59 «210» 89 «211» 81 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 89 ашадаї їашуоша дадюдацвдіс іадаааадда сдсасісдіє птащшаї (510) адідссайс сссісісіда 9 81 «2105» 90 «2115» 60 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
Зо «220» «223» Праймер «4005» 90 асідіссіс іайсснса іІсааїсасаї саддсіадс аааддадаад аастшісас (610) «2105 91 «2115» 65 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
«223» Праймер «4005 91 дадюдайцяо адааддааї ададдасаад їаддсадіаї Наїадідсс апйссссісі (610) сюаа 65 «2105» 92 «2115» 250 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «-4005 92 аїсаадсіді сіссдаїаса сісдасіасс аїссддчаісі сісадададуд дааадасас бо сдагаддоса даааїаїага аадіаддадо Ноїайасса ааіаіассаа сдсадіасаа 120 дсаасісно дШааасодо аадааасааї Існсдааса Шасаасаа адааддіасс 180 діаасайаа їааісддаад ддїащдасіа дсаааддада адаасншіис асюдадну 240 їсссаайнсі 250
Зо «2105» 93 «2115» 250 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «-4005 93 аїсаадсіді сіссдаїаса сісдасіасс аїссддчаісі сісадададуд дааадасас бо діааісціс ддаісааної даїсісісії діадаїайці ааіаддасодд ссаадаїада 120 аааадаїаса іаасіадна дсаааснса апдснаад Насаадщс ааїссаїаїс 180 нааадна! тасанайй аїаашюосіа дсаааддада адаасінс асюдадну 240 їсссаайнсі 250 «2105» 94 «2115» 250 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 94 аїсаадсіді сіссдаїаса сісдасіасс аїссддчаісі сісадададу дааадасас бо ссіссісіад дШаїсіаї аааадсідаа дісднадаа ШШсаш ааадсайааї 120 сааасаїсіа дансдааїс даїааааадс адаїадааді танаадаїйї аїадонНаса 180 нстададіа діаїаддаад діаадасіа дсаааддада адаасінс асюдасцЯя 240 їсссаайнсі 250
Зо
Claims (10)
1. Дріжджова клітина роду Котадаїає/а, яка містить ортологічний промотор метилотрофної дріжджової клітини або його варіант, індукований з допомогою дерепресії, де ортологічний промотор являє собою ортологічний форміатдегідрогеназний (ЕМО) промотор метилотрофної дріжджової клітини, що містить нуклеотидну послідовність 5ЕС ІЮО МО: 1 або її варіант, який містить нуклеотидну послідовність ЗЕО ІО МО: 2: ААТатТАТСТААДАСасСАААСТОССАС,ССтТапАААААТаттАссвасавАатасраСааАСААТТТАСАС сбаасдпАХІТСААпйАААСАсСстТа,аставасСсвсАа,аСА,атотасАаСАСАатотоаАдтТавассСаА вАТСССАСССЯСЯТТОоСТаСсОСТАСсСссСасАСсстад,васА,аСассАСАТОСАТСАААТАТАССАСО басСсСААССОСАатТоТСсТосаААААСсАаастстасАТАТСТТОССЯСТОаС,СаСОаСААССАСИ,ААТА АТАСТОССТасСАСОатТаАСасААТАТАТАТОТаТаСАСОИаТтТАААТСТаАСсАасСа,ТтатАаСААдОаС ТААТАТТТТОССТААДААСАТаСсСААТОСЯССТОаССССасСхгАСЯИаАААААаААТалдстттасасАСТСТ ТсАССАСАСсСТОСвататсосастса,атататТасСАААТАЧИаСТоССАСТвИаТСАСССсСасвАТТТТа САпАААААХхзАасСААда п оСа,аса,сататстАстТаататоСасССААТААдаАас,саАхасСааСАсасА сапАаТСстТАСАТСААХаСТатстоСаАТАСАСТСВАСТАССАХССаваатоТСТоОХ»ХвХХвХ»оХ ох 1 Хі2ХізХаХі5ХівХ17ХівСАСХ о,
де Хі являє собою аденін або не нуклеотид, Хо являє собою аденін або гуанін, Хз являє собою цитозин або тимін, Х. являє собою тимін або гуанін, Хе являє собою аденін або цитозин, Хв являє собою гуанін або цитозин, Х7 являє собою аденін або цитозин, Хв являє собою гуанін або цитозин, Хо являє собою аденін, гуанін або цитозин, Хіо являє собою гуанін або цитозин, Хі: являє собою гуанін або цитозин, Хіг2 являє собою гуанін або цитозин, Хіз являє собою гуанін або цитозин, Х:і4« являє собою аденін або цитозин, Хі5 являє собою аденін або цитозин, Хіє являє собою тимін або цитозин, Хі7 являє собою гуанін або цитозин, Хів являє собою гуанін або цитозин, Хіо являє собою нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з ТАТАААТАССОЯССТОСТТаСасСтТоТсСТасСсСТСАТСААТСАААТО - 5БО ОО МО: 28, ТАТАТАААСТОСТОаАТААТТОСТТССТТСОТаАаТТССАТСТСАТАСТСАААСТАТАТТААДААСТАСА АСА - ЗЕО ІО МО: 29, ТАТАААТАСААЧАаСОаСАа Таса тс ТТотТАВАСТОСАСССАТАААСАААТААТСААТАААТ - 5ЕО ІО МО: 30, і ТАТАААТАСТаССТАСТТаТОСТСоОТАТТССТТСАТСААТСАСАТОС - БЕО ІЮ МО: 31, де ортологічний промотор функціонально зв'язаний із молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує гетерологічний або гомологічний поліпептид.
2. Дріжджова клітина за п. 1, де ортологічний промотор індукований метанолом.
З. Дріжджова клітина за п. 1 або 2, де гетерологічний або гомологічний поліпептид містить сигнальний пептид, зокрема сигнальний пептид секреції.
4. Дріжджова клітина за будь-яким із пп. 1-3, де ортологічний промотор походить із метилотрофної дріжджової клітини, вибраної з групи, яка складається з роду Напзепиа, Сапаїда, Котада!аепла і Рісніа.
5. Дріжджова клітина за будь-яким із пп. 1-4, де метилотрофна дріжджова клітина вибрана з групи, яка складається з МНапзепиа роутогрна, Сапаїда бБоіаіпії, Рісніа теїапоїса, Котада!аєла равіогі5, Котадаїаела рНанйії, Котадаїаела рориїї, Котадаїає!ла рзеидоравзіогів, Котада!ае/ла ті і Котадаїіаегла р. 11-1192.
б. Дріжджова клітина за будь-яким із пп. 1-5, де ортологічний промотор і, необов'язково, молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує гетерологічний або гомологічний поліпептид у геномі і також функціонально зв'язана з промотором, є необов'язково присутнім(и) у геномі або як екстрахромосомна конструкція нуклеїнової кислоти.
7. Дріжджова клітина за будь-яким із пп. 1-6, де варіант містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 35, 5ЕО ІЮО МО: 36, 5ЕО ІО МО: 37, 5ЕО ІО МО: 38, ЗЕО ІЮО МО: 39, 5ЕО І МО: 40, 5ЕО ІЮ МО: 41, 5ЕО ІЮО МО: 42, 5ЕО ІЮО МО: 43, 5ЕО ІЮ МО: 44, 5ЕО ІЮ МО: 45, 5ЕО ІО МО: 46, 5ЕО І МО: 47, 5ЕО ІЮ МО: 48, 5ЕО І МО: 49, 5ЕО ІЮ МО: 50, ЗЕО ІО МО: 51, ЗЕО ІЮ МО: 52, ЗЕО ІЮ МО: 53, ЗЕО ІЮО МО: 54, 5ЕО ІЮ МО: 55 і ЗЕО ІЮ МО: 56, переважно вибрану з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: 35, 5ЕО ІЮ МО: 37, 5ЕО ІЮО МО: 39, 5ЕО ІЮ МО: 40, 5ЕО ІО МО: 44, 5ЕО ІЮ МО: 51, 5ЕО ІЮ МО: 52, 5ЕО ІО МО: 54, 5ЕО ІЮ МО: 55і 5ЕО ІО МО: 56, більш переважно вибрану з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: 35, 5ЕО І МО: 39, БЕО ІЮ МО: 44, 5ЕО ІЮО МО: 51, ЗЕО ІЮО МО: 52, БЕО ІЮ МО: 54, 5ЕО ІЮ МО: 55 і БЕО ІЮ МО: 56.
8. Спосіб виробництва гетерологічного поліпептиду, який включає стадію культивування дріжджової клітини за будь-яким із пп. 1-7.
9. Спосіб за п. 8, де протягом культивування експресія гетерологічного поліпептиду індукована або рівень його експресії підвищений дерепресуючими умовами.
10. Спосіб за п. 8, де протягом культивування у дерепресуючих умовах додається метанол або альтернативний індуктор. 8о00о я Гн ШТ й | в Нереннов щрбаокю 4 | М. Мешеко ЩІ шодо. Й І дня зароо ! здо т щй ії се она нти нина нин ши А С нВЕМО І НРММЮХ ГСМЕЦОМ 1СБАОСТ ЧА МОСТРТМОЮЗ РАСА РЕСАТІ, РОАР
Фіг.1 схіююдоче рготоїее | Епрдеделацв согітоїв ооо я ! -«-НРЕМО ВЕШОрВОЮ я--НОМОХ КЕШОЮВОЮ а ВрАОХІ ВЕШОреце ою -я-РецАР НЕОЮООО «я РРОАТІ КЕШОЮВОЮ р р З0ода - й в | Ж ті р З зо ; її з й Ж ре й ше й ооо 4 ра дит КЗ тваса 4 й : дент щи ра ра ЧИ. ! Вон ТЬ, о іш в НИ В є зо зо «о за во 7 ва за о ФіГОА /-/лее. 404 яна НрЕМО ОС -« В МОХ оре м РИАОЖІ ОПОВ ї з5 Я і «ж РОД ОБОВ на РОСАТІ ООБОЮ т 2 4 я 1 - о, | тестя ї Ні ше жі я мок век сафреся пре хи де ж нт жк й ї ' по и з істо нини НИ 1 ак ни ві десни 4 Іль і ан с Оро уд чі зо а : с і Р; о ШИ і і дентин уеняв ве нин пе м ни пи пи ли р- за же ши ши ши ши г:
Фіг.2в Тісе (МІ кі Е 1 т й 54 я НЕМОВ ня б же ; у
В Є. НрРМОХ б, ж Рраюхі ою, «ве ВрОАТІ р. «ак РрАР З, і»
А. 1 хх 50 - їх Ж З їх 5; і шо за і
2. і та 4 Ве 7 плн попи пісі пив пк пи вл в нн нн . т . -) за що що я 7 во Фо 405
Фіг.2с Час(год-)
Фіг.З в ом дв в іх шу ПІДННВКОВНЙ т о Її Н я іх ветнох є - зо ВУ. а Я ойедіная о ке Щодо ги й Н Катіоднетної 5 Ма» з Я 00 В ші ши шшншннн шк : ше ШЕ ЕІ А ЗШ ШШШ з СВЙ й ' хв Б ЗБЕ з ШИ а щи а ЗО Е 1 В ча БЕЖ В М з шт Б З Зв й ноя х В В ла ОБ оо я Ше ие ШО шоб в ЩО о Я А я ве сн а МЕ с З ЗЕ АЕС ЩСЕ ЗМ ян пани МЧО РАЄМ РОЗА Вр НЕЕМО РоАШКО РБК РБАТ нео ВЕК АСК Е
ЗК .
Фіг.4 зад 4 ще АХ виж : МОВ зу - ТЕ В їх р З ши В З ЕоТя і КК КО ЗНЕВУІ ЗЕ А Бе «ВОД ОТО ОН ; 14 Сов у: ГО я АБО ОБ кЖКЮ: ЖАБУ
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15202233.1A EP3184642B1 (de) | 2015-12-22 | 2015-12-22 | Hefezelle |
| PCT/EP2016/082398 WO2017109082A1 (en) | 2015-12-22 | 2016-12-22 | Yeast cell |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA126112C2 true UA126112C2 (uk) | 2022-08-17 |
Family
ID=55068836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201807012A UA126112C2 (uk) | 2015-12-22 | 2016-12-22 | Дріжджова клітина |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11891418B2 (uk) |
| EP (2) | EP3184642B1 (uk) |
| JP (1) | JP6910358B2 (uk) |
| KR (1) | KR20180088733A (uk) |
| CN (1) | CN108603213B (uk) |
| AU (1) | AU2016378641B2 (uk) |
| CA (1) | CA3009272A1 (uk) |
| DK (2) | DK3184642T3 (uk) |
| ES (1) | ES2740449T3 (uk) |
| MX (1) | MX2018007725A (uk) |
| SG (1) | SG11201805191SA (uk) |
| UA (1) | UA126112C2 (uk) |
| WO (1) | WO2017109082A1 (uk) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220282227A1 (en) | 2019-07-05 | 2022-09-08 | Bisy Gmbh | Recombinant heme thiolate oxygenases |
| CN114375304A (zh) | 2019-07-11 | 2022-04-19 | 克莱拉食品公司 | 蛋白质组合物及其食用品 |
| US12096784B2 (en) | 2019-07-11 | 2024-09-24 | Clara Foods Co. | Protein compositions and consumable products thereof |
| US10927360B1 (en) | 2019-08-07 | 2021-02-23 | Clara Foods Co. | Compositions comprising digestive enzymes |
| EP3922726A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-15 | Erber Aktiengesellschaft | Truncated promoter for recombinant gene expression |
| CN117203323A (zh) | 2020-12-29 | 2023-12-08 | 比西有限公司 | 新型酵母菌株 |
| US11993792B2 (en) | 2021-05-27 | 2024-05-28 | New England Biolabs, Inc. | DNase I variants, compositions, methods, and kits |
| EP4116408B1 (en) * | 2021-06-24 | 2024-10-23 | BioBoost Synbio Consulting Inc. | Method for methanol free culturing of methylotrophic yeast for the biosynthesis of added value products |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE58169T1 (de) * | 1986-11-24 | 1990-11-15 | Unilever Nv | Verfahren zur herstellung einer catalasefreien, oxidase enthaltenden hefe und deren verwendung. |
| JP3794748B2 (ja) * | 1996-03-04 | 2006-07-12 | 第一アスビオファーマ株式会社 | メタノール代謝系を有する微生物の培養法 |
| AU3910000A (en) * | 1999-03-22 | 2000-10-09 | Zymogenetics Inc. | Improved methods for producing proteins in transformed (pichia) |
| WO2002085932A2 (en) * | 2001-04-24 | 2002-10-31 | Innogenetics N.V. | Constructs and methods for expression of recombinant hcv envelope proteins |
| DE10220894A1 (de) * | 2002-05-10 | 2003-11-27 | Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh | Promotoren mit veränderter Transkriptionseffizienz |
| JP5290997B2 (ja) * | 2007-01-26 | 2013-09-18 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ピキアにおけるメタノール誘導性プロモーターからのメタノール非依存的誘導の方法 |
| WO2010004042A2 (en) * | 2008-07-11 | 2010-01-14 | Novozymes A/S | Pichia pastoris das promoter variants |
| US9822357B2 (en) | 2013-07-05 | 2017-11-21 | Technische Universitat Graz | Bidirectional promoter |
-
2015
- 2015-12-22 EP EP15202233.1A patent/EP3184642B1/de active Active
- 2015-12-22 ES ES15202233T patent/ES2740449T3/es active Active
- 2015-12-22 DK DK15202233.1T patent/DK3184642T3/da active
-
2016
- 2016-12-22 WO PCT/EP2016/082398 patent/WO2017109082A1/en active Application Filing
- 2016-12-22 US US16/065,377 patent/US11891418B2/en active Active
- 2016-12-22 UA UAA201807012A patent/UA126112C2/uk unknown
- 2016-12-22 EP EP16825759.0A patent/EP3394281B1/en active Active
- 2016-12-22 JP JP2018533214A patent/JP6910358B2/ja active Active
- 2016-12-22 KR KR1020187020509A patent/KR20180088733A/ko active IP Right Grant
- 2016-12-22 CA CA3009272A patent/CA3009272A1/en active Pending
- 2016-12-22 MX MX2018007725A patent/MX2018007725A/es unknown
- 2016-12-22 SG SG11201805191SA patent/SG11201805191SA/en unknown
- 2016-12-22 DK DK16825759.0T patent/DK3394281T3/da active
- 2016-12-22 CN CN201680081026.0A patent/CN108603213B/zh active Active
- 2016-12-22 AU AU2016378641A patent/AU2016378641B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108603213A (zh) | 2018-09-28 |
| US20210355173A1 (en) | 2021-11-18 |
| EP3184642A1 (de) | 2017-06-28 |
| WO2017109082A1 (en) | 2017-06-29 |
| CN108603213B (zh) | 2022-05-03 |
| AU2016378641A1 (en) | 2018-07-05 |
| US11891418B2 (en) | 2024-02-06 |
| EP3394281B1 (en) | 2020-08-19 |
| EP3394281A1 (en) | 2018-10-31 |
| KR20180088733A (ko) | 2018-08-06 |
| DK3184642T3 (da) | 2019-08-12 |
| EP3184642B1 (de) | 2019-05-08 |
| DK3394281T3 (da) | 2020-11-09 |
| JP2019505194A (ja) | 2019-02-28 |
| SG11201805191SA (en) | 2018-07-30 |
| ES2740449T3 (es) | 2020-02-05 |
| AU2016378641B2 (en) | 2021-04-08 |
| MX2018007725A (es) | 2018-11-09 |
| JP6910358B2 (ja) | 2021-07-28 |
| CA3009272A1 (en) | 2017-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA126112C2 (uk) | Дріжджова клітина | |
| EP3858987B1 (en) | A novel isopropylmalate synthase variant and a method of producing l-leucine using the same | |
| JP6833812B2 (ja) | プロモーター変異体 | |
| KR102202606B1 (ko) | 바이오레티놀을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 바이오레티놀의 생산방법 | |
| EP2678421B1 (en) | Processes and recombinant microorganisms for the production of cadaverine | |
| EP3294762A1 (en) | Expression constructs and methods of genetically engineering methylotrophic yeast | |
| KR102400332B1 (ko) | 정제 화학약품의 개선된 생산을 위한 재조합 미생물 | |
| US20240101983A1 (en) | Programmable rna editing platform | |
| CN108473972B (zh) | 补身醇合酶iii | |
| US20210230573A1 (en) | Microorganisms and the production of fine chemicals | |
| US10280428B2 (en) | Molecular biology tools for algal engineering | |
| JP2005514001A (ja) | 酵母中での異種遺伝子発現のためのアルコールオキシダーゼ１調節ヌクレオチド配列 | |
| JPH07508166A (ja) | 改変クルイベロミセス（Ｋ１ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母，それらの作製および使用 | |
| CN113056554A (zh) | 重组酵母细胞 | |
| CN108424859B (zh) | 生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用 | |
| JP2018078883A (ja) | 新規高温耐性付与遺伝子とその利用法 | |
| KR20220098155A (ko) | 비바이러스성 전사 활성화 도메인들 및 그와 관련된 방법들 및 이용들 | |
| KR20240128158A (ko) | 바이오레티놀 생산 균주 및 이를 이용한 바이오레티놀의 생산방법 | |
| KR20240142275A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 변이 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 | |
| KR20240057506A (ko) | Atp 생합성 강화를 통한 목적 단백질 분비 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움 | |
| WO2011099243A1 (ja) | サッカロマイセス・セレビシエ由来の特定のプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いる目的遺伝子の発現方法 | |
| WO2014027995A1 (en) | Molecular biology tools for algal engineering | |
| RU2024122767A (ru) | Промотор, треонин-продуцирующий рекомбинантный микроорганизм и их применение | |
| CN113604415A (zh) | 重组枯草芽孢杆菌的应用和利用酶法合成n-乙酰神经氨酸的废水生产四氢嘧啶的方法 |