ES2740449T3

ES2740449T3 - Célula de levadura

Info

Publication number: ES2740449T3
Application number: ES15202233T
Authority: ES
Inventors: Thomas Vogl
Original assignee: Bisy E U
Current assignee: Bisy E U
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2020-02-05
Anticipated expiration: 2035-12-22
Also published as: AU2016378641B2; EP3184642A1; EP3394281B1; CN108603213A; EP3184642B1; MX2018007725A; DK3394281T3; CN108603213B; WO2017109082A1; JP2019505194A; US11891418B2; JP6910358B2; SG11201805191SA; UA126112C2; DK3184642T3; CA3009272A1; KR20180088733A; EP3394281A1; AU2016378641A1; US20210355173A1

Abstract

Célula de Pichia pastoris que comprende un promotor ortólogo, inducible por desrepresión, de una célula de levadura metilótrofa o una variante inducible por desrepresión de la misma, caracterizada por que el promotor ortólogo es un promotor ortólogo formiato deshidrogenasa (FMD) de una célula de levadura metilótrofa y la variante 5 es al menos 90% ident con el promotor, en donde el promotor ortólogo presenta una secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID Nº 1 y está unido operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo u homólogo.

Description

DESCRIPCIÓN

Célula de levadura

La presente invención se refiere al uso de promotores ortólogos en células de levadura.

Proteínas recombinantes tales como productos biofarmacéuticos o biocatalizadores industrialmente relevantes se preparan lo más frecuentemente mediante la expresión génica heteróloga en microorganismos. Escherichia coli, Sacharomyces cerevisiae y hongos filamentosos se utilizan desde tiempos inmemoriales frecuentemente para la producción recombinante de proteínas. En los dos últimos decenios, las levaduras metilótrofas Komagataella (Pichia) pastoris, Komagataella (Pichia) phaffii (Pp), Komagataella Kurtzmanii, Ogataea (Hansenula) polymorpha (Hp), Candida boidinii (Cb) y Ogataea (Pichia) methanolica (Pm) se han establecido como cepas de producción alternativas eficientes. Estas cepas hacen posible alcanzar, en el caso de una elevada densidad celular, elevadas tasas de expresión para proteínas heterólogas. De las cuatro especies de levadura precedentemente mencionadas. P. pastoris (Komagataella phaffii) se ha empleado entretanto lo más frecuentemente para la producción heteróloga de proteínas.

Todas las levaduras metilótrofas presentan promotores potentes, rigurosamente regulados, que participan en la regulación de la expresión de genes de la utilización de metanol (“metanol utilization”; MUT). Habitualmente, promotores de genes de la utilización de metanol son reprimidos en fuentes de carbono represoras, tales como glucosa, y son fuertemente regulados al alza en presencia de metanol como fuente de carbono. Si la fuente de carbono represora está agotada o en presencia de una fuente de carbono no represora, se produce la activación del promotor mediante desrepresión, pudiendo variar considerablemente la intensidad de este efecto, no obstante, entre especies e incluso dentro del mismo organismo. El promotor del gen alcoholoxidasa-1 en P. pastoris GS115 (PPpAOX1), por ejemplo, presenta, bajo condiciones desrepresoras, en comparación con condiciones inducidas por metanol, solo una actividad del 2-4%. A diferencia de ello, el promotor del gen ortólogo (metanol-oxidasa, MOX) en H. polymorpha (PHpMOX), bajo condiciones desrepresoras, una actividad en comparación con condiciones inducidas por metanol de hasta el 70%. También los promotores de los genes ortólogos en C. boidinii (alcoholoxidasa-1, “AOD1”) y P. methanolica (metanoloxidasa 1/2 “MOD1/2”) muestran un comportamiento equiparable.

En el documento EP 0242007 se describe un procedimiento para la preparación de una oxidasa o composición que comprende oxidasa mediante células de levadura. La expresión de la oxidasa puede controlarse con ayuda de un promotor de metanoloxidasa (MOX).

Hartner FS et al. (Nucleic Acids Res 36(2008) :e76) describe una colección de promotores de AOX1 en Pichia pastoris.

Weinhandl K et al. (Microb Cell Fast 13(2014) :5) es un artículo recopilatorio sobre promotores dependientes de la fuente de carbono.

Gellissen G et al. (FEMS Yeast Res 5(2005):1079-1096) se ocupan de sistemas de expresión tales como Hansenula polymorpha y PIchia pastoris y los comparan.

En el documento WO 03/095653 se describen variantes de promotores FMD que, bajo condiciones desrepresoras, presentan una actividad de la expresión de proteínas significativamente más alta en comparación con el promotor de tipo salvaje.

La inducción de la expresión con metanol tóxico y combustible no se desea particularmente a gran escala industrial por motivos de la seguridad de funcionamiento, de modo que los promotores fuertemente desreprimidos representan una alternativa favorable. De manera correspondiente, en los últimos tiempos se desarrollaron variantes de PPpAOX1, promotores alternativos y nuevos promotores de MUT con diferentes propiedades desrepresoras, con el fin de posibilitar una expresión a escala industrial de proteínas exenta de metanol. Dado que las tasas de expresión de promotores de este tipo son, por norma general, con mucho, menores en comparación con promotores inducidos con metanol, es una misión de la presente invención proporcionar posibilidades alternativas para la sobre-expresión exenta de metanol inducible y potente de proteínas recombinantes en levaduras, tales como P. pastoris.

Este objetivo se alcanza con una célula de Pichia pastoris que comprende un promotor de una célula de levadura metilótrofa ortóloga, inducible por desrepresión, o una variante inducible por desrepresión del mismo, en el que el promotor ortólogo en la célula de levadura metilótrofa está en condiciones de controlar la expresión de polipéptidos bajo condiciones desrepresoras, en donde el promotor ortólogo es un promotor ortólogo formiato deshidrogenasa (FMD) de una célula de levadura metilótrofa y la variante es al menos 90% ident con el promotor, en donde el promotor ortólogo presenta una secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID N° 1 y está unido operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo u homólogo, y se conserva el perfil de regulación original del promotor ortólogo en células de levadura del género Komagataella.

De manera sorprendente se ha demostrado que promotores que están en condiciones de controlar, en otras células de levadura metilótrofas que no pertenecen, preferiblemente, al género Komagataella (Pichia), la expresión de polipéptidos bajo condiciones desrepresoras (p. ej., aumentarla en comparación con condiciones no desrepresoras), presentan también en células de levadura del género Komagataella (Pichia) propiedades equiparables.

Además, se ha demostrado de manera sorprendente que un promotor formiato deshidrogenasa (FMD) de una célula de levadura metilótrofa, el cual de modo natural no se presenta en una célula de levadura del género Komagataella o bien en la misma célula de levadura, presenta precisamente en esta célula propiedades particulares. Un promotor FMD ortólogo es, en células de Komagataella, tanto bajo condiciones desrepresoras como bajo condiciones inducidas con metanol, significativamente más potente que todos los promotores que se presentan de forma natural en Komagataella hasta ahora sometidos a ensayo, que participan en la regulación de la expresión de genes de la utilización de metanol (“promotores MUT”). Así, un promotor FMD ortólogo es intensamente más potente bajo una condición desrepresora que los promotores CAT1 y GAP que se presentan de forma natural en células de Komagataella, por ejemplo. Sorprendentemente, promotores fMd ortólogos son ya bajo las condiciones de rastreo utilizadas bajo condiciones desrepresoras incluso similarmente potentes a los promotores AOX (AOX1 y AOX2) que se presentan de forma natural en Komagataella bajo condiciones inducidas por metanol. Efectos de este tipo se pueden potenciar habitualmente bajo dosificaciones de fuentes de C controladas en el ensayo del biorreactor. Esto significa que promotores FMD ortólogos pueden reemplazar a los promotores AOX habitualmente utilizados en Komagataella. En este caso, pueden alcanzarse rendimientos de expresión de proteínas esencialmente idénticos o incluso superiores que en el caso de sistemas de expresión inducidos por metanol habituales, sin utilizar, sin embargo, metanol como agente de inducción. En este caso, es sorprendente que un promotor formiato deshidrogenasa (FMD) de una célula de levadura metilótrofa (p. ej., de H. polymorpha), que también está significativamente desreprimido en esta célula de levadura (p. ej., en H. polymorpha), conserve este perfil de regulación también en otra célula de levadura metilótrofa (p. ej., P. pastoris). Estudios anteriores han demostrado, a diferencia de ello, que en el caso de una transferencia de promotores entre levaduras metilótrofas, el perfil de regulación del promotor extraño no es transferido (p. ej., el promotor AOX1 de P. pastoris no es reprimido de forma rigurosa en H. polymorpha como de forma natural en P. pastoris; véase, p. ej., Raschke WC et al. Gene 177 (1996): 163-167 y Rodriguez L. et al. Yeast 12 (1996): 815-822.). De manera correspondiente, la opinión general en el mundo científico es que la regulación diferente entre células de levadura metilótrofas no se produce mediante la secuencia del promotor, sino mediante mecanismos de regulación diferentes en las células de levadura (véase, p. ej., Hartner FS et al. Microb Cell Fact 5 (2006) :39-59). Sorprendentemente, se ha demostrado, sin embargo, que la fuerte activación de un promotor formiato deshidrogenasa (FMD) de una célula de levadura metilótrofa (p. ej., de H. polymorpha) mediante desrepresión no es solo transferible a otras células de levadura metilótrofas, tales como, p. ej., Komagataella phaffii, sino que incluso supera a las propiedades técnicas de los promotores fuertemente homólogos, tales como el del gen AOX1 y el del gen CAT1.

El uso de secuencias de promotor ortólogas tiene también otras ventajas técnicas. Por ejemplo, mediante su uso se reduce la posibilidad de una recombinación homóloga, con lo que resulta una mayor estabilidad genética de las cepas de expresión.

“Célula de levadura del género Komagataella” comprende todas las células de levadura de este género tales como, entre otras, Komagataella kurtzmanii, Komagataella pastoris, Komagataella phaffii, Komagataella populi, Komagataella pseudopastoris, Komagataella ulmi y Komagataella sp. 11-1192. “Células de levadura del género Komagataella” comprenden naturalmente también cepas específicas de los géneros precedentemente mencionados, tales como, p. ej., Komagataella pastoris GS115, X-33, KM71, KM71H, CBS7435 o NRLL Y11430, CBS704, BG10, BG11 o bien otros derivados de estas cepas.

El término “ortólogo”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a moléculas de ácidos nucleicos o aminoácidos de diferentes especies que presentan al menos una homología funcional con las moléculas de ácidos nucleicos y aminoácidos correspondientes de otras especies. “Ortólogos” proceden de diferentes organismos que han resultado mediante la formación de la especie y que proceden también de un gen predecesor común. Las secuencias de los “ortólogos” pueden variar significativamente entre sí, pero la función biológica o bien bioquímica de los mismos no se ve, por norma general, afectada (p. ej., AOX de Komagataella pastoris es ortólogo a MOX de Hansenula polymorpha y viceversa, FMD de Hansenula polymorpha es ortólogo a FDH1 en Komagataella pastoris, y viceversa).

“Promotor”, tal como se utiliza en esta memoria, comprende al menos un sitio de inicio de la transcripción (“transcription iniation start site”), un sitio de unión para un complejo de ácido nucleico-polimerasa y nucleótidos adicionales, de modo que estos dos elementos pueden ser funcionalmente activos y conservan el perfil de regulación original de la célula de partida del promotor ortólogo en células de levadura del género Komagataella. Estos nucleótidos adicionales pueden configurar, por ejemplo, sitios de unión del factor de transcripción (“transcription factor binding sites”). Un “promotor inducible mediante desrepresión” es un promotor que es activado bajo condiciones desrepresoras (véase más adelante), con lo cual pueden transcribirse moléculas de ácidos nucleicos operativamente unidas al mismo que codifican polipéptidos heterólógos u homólogos.

El promotor FMD ortólogo de acuerdo con la invención comprende preferiblemente entre 50 y 2000, todavía más preferiblemente entre 100 y 1000, aún más preferiblemente entre 150 y 800 nucleótidos del tramo delante del codón de iniciación (aguas arriba del extremo 5') de la región que codifica una proteína/un polipéptido del gen que comprende el promotor correspondiente, preferiblemente la región del gen FMD que codifica FMD, que puede comprender 1 a 1000, preferiblemente 1 a 900, todavía más preferiblemente 1 a 800 nucleótidos. De manera particularmente preferida, el promotor ortólogo, preferiblemente el promotor FMD ortólogo, comprende los nucleótidos 1 a 1000 preferiblemente 1 a 900, todavía más preferiblemente 1 a 800, aguas arriba del extremo 5' de la región del gen que codifica el polipéptido, preferiblemente de la región del gen FMD, MOX que codifica FMD MOX. “Variantes” del promotor ortólogo, preferiblemente del promotor formiato deshidrogenasa (FMD) ortólogo, comprenden moléculas de ácidos nucleicos que se diferencian en uno o varios (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50) nucleótidos de los promotores ortólogos que se presentan de forma natural, preferiblemente de los promotores FMD o bien MOX ortólogos. Variantes de promotores de este tipo son al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, todavía más preferiblemente al menos un 95%, aún más preferiblemente al menos un 98% idénticos con los tramos correspondientes de los promotores que se presentan de forma natural.

Las variantes empleables de acuerdo con la invención de promotores ortólogos pueden presentar, en comparación con los promotores que se presentan de forma natural, preferiblemente promotores FMD, deleciones, sustituciones e inserciones. Las variantes de los promotores presentan asimismo la propiedad de posibilitar la expresión de proteínas bajo condiciones desrepresoras. Preferiblemente, se emplean variantes que están en condiciones de expresar, bajo condiciones desrepresoras, al menos el 50%, preferiblemente al menos el 60%, todavía más preferiblemente al menos el 70%, todavía más preferiblemente al menos el 80%, aún más preferiblemente al menos el 90%, todavía más preferiblemente al menos el 100%, todavía más preferiblemente al menos el 120%, todavía más preferiblemente al menos el 150% de la cantidad de proteínas que expresaría un célula de Pichia pastoris que comprende un promotor ortólogo que se presenta de forma natural, preferiblemente un promotor FMD ortólogo. Procedimientos para la identificación y preparación de variantes de promotores son suficientemente conocidos. Habitualmente, se realizan mutaciones en el promotor, tras lo cual se examina si y cómo se han modificado las propiedades (p. ej., tasa de expresión de una proteína modelo) de la variante del promotor.

“Variantes” del promotor FMD ortólogo comprenden también variantes de promotor que comprenden los elementos reguladores del promotor ortólogo que se presenta de forma natural y de un promotor mínimo alternativo o bien un promotor del núcleo. El promotor mínimo o bien promotor del núcleo es la parte de un promotor que contiene solo aquellos elementos del promotor generales que son necesarios para la transcripción (caja TATA e inicio de la transcripción). Por lo tanto, los elementos reguladores de las variantes de acuerdo con la invención de los promotores ortólogos comprenden entre 50 y 2000, todavía más preferiblemente entre 100 y 1000, aún más preferiblemente entre 150 y 800 nucleótidos del tramo delante del codón de iniciación (aguas arriba del extremo 5') sin 20 a 100, preferiblemente sin 25 a 80, todavía más preferiblemente sin 30 a 70 nucleótidos inmediatamente delante del punto de inicio de la transcripción.

“Identidad” o bien “ident” designa el grado de coincidencia entre dos o más secuencias de ácidos nucleicos o bien aminoácidos que puede determinarse a través de la coincidencia entre las secuencias. El porcentaje de la “identidad” resulta a partir del porcentaje de los tramos idénticos en dos o más secuencias, teniendo en cuenta huecos u otras particularidades de la secuencia (es decir, % de identidad es el número de las posiciones idénticas/número total de las posiciones x 100). Un procedimiento particularmente preferido para la determinación de la identidad es el programa BLAST X del National Centre for Biotechnology Information (NCBI) (véase, entre otros, Altschul S et al. J Mol Biol 215 (1990) :403-410). En este caso, se utiliza de manera preferida el algoritmo BLOSUM62 con los parámetros “hueco”, “existencias”:11 y “extensión”: !

Por la expresión “células de levadura metilótrofas, tal como se utiliza en esta memoria, se subsuman células de levadura que están en condiciones de crecer en medios nutricios que contienen como fuente de carbono compuestos con solo un átomo de carbono, p. ej., metanol.

“Condiciones desrepresoras”, tal como se emplea en el cultivo de las células de levadura de acuerdo con la invención, significa que las células de levadura son cultivadas primeramente en presencia de una fuente de carbono represora (p. ej., glucosa), hasta que ésta se haya consumido en su mayor parte o por completo. Después de la reducción de la concentración de la fuente de carbono represora (p. ej., glucosa), las células se encuentran de nuevo en relación con la fuente de carbono represora o bien la glucosa, en condiciones desrepresoras. El poder de los efectos de represión puede ser función del tipo de la fuente de carbono.

De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, el promotor FMD ortólogo está unido operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo u homólogo.

El promotor FMD ortólogo está unido operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo (no procedente de Komagataella) u homólogo (procedente de Komagataella) y, por consiguiente, puede influir en o bien controlar la expresión de este polipéptido. El polipéptido a regular comprende al menos 5, preferiblemente al menos 10, todavía más preferiblemente al menos 50 restos aminoácidos y comprende, por consiguiente, moléculas que también se designan como péptidos o proteínas.

De manera particularmente preferida, la molécula de ácido nucleico codifica polipéptidos tales como anticuerpos o fragmentos de los mismos, enzimas, proteínas estructurales, etc.

“Unida operativamente”, tal como se utiliza en esta memoria, significa que la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo u homólogo está unida de una manera al promotor que posibilita la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula de levadura de acuerdo con la invención. Por consiguiente, el promotor está unido operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos codificante cuando ésta influye en la transcripción de la secuencia codificante.

De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, el polipéptido heterólogo u homólogo comprende un péptido señal, en particular un péptido señal de la secreción.

Con el fin de expulsar de la célula de levadura un polipéptido homólogo u heterólogo producido de forma recombinante, el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico comprende un péptido señal.

“Péptido señal”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un péptido unido en el extremo C o N del polipéptido que controla la segregación del polipéptido. La secuencia señal utilizada en la presente invención puede ser un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que inicia el transporte de una proteína a través de la membrana del retículo endoplasmático (ER). La secuencia de ácido nucleico de estas secuencias señal puede ser optimizada de manera correspondiente a la secuencia natural de la célula huésped original o en codones. Ejemplos no limitantes de la secuencia señal son MF-alfa (secuencia señal del “Mating-Faktor-Alpha” (Factor de Apareamiento Alfa)), la secuencia señal de la proteína CBH2 de Trichoderma reesei, la secuencia señal de la xilanasa A de Thermomyces lanuginosus, la señal de toxina asesina K1, el polipéptido señal para la secreción de invertasa, la secuencia señal de la toxina asesina de Kluyveromyces lactis, la secuencia señal de la toxina asesina de Pichia acaciae, la secuencia señal de la toxina asesina de Hansemiaspora uvarum y de Pichia (Hansenula) anómala o variantes de las mismas, tal como se describe, p. ej., en Cereghino et al. (Gene 519 (2013): 311-317). La secuencia señal preferida de la invención es MF-alfa (secuencia señal del “Mating-Faktor-Alpha”).

De acuerdo con una forma de realización particularmente preferida de la presente invención, el promotor FMD ortólogo procede de una célula de levadura metilótrofa, que se elige del grupo consistente en los géneros Hansenula (Ogataea), Candida, Komagataella y Pichia.

De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, la célula de levadura metilótrofa se elige del grupo consistente en Hansenula polymorpha, Candida boidinii, Pichia methanolica, Komagataella pastoris, Komagataella phaffii, Komagataella populi, Komagataella pseudopastoris, Komagataella ulmi y Komagataella sp. 11 1192.

El promotor FMD ortólogo y la molécula de ácido nucleico unida operativamente al mismo que codifica el polipéptido heterólogo u homólogo pueden presentarse en el genoma como una construcción extracromosómica de ácido nucleico sobre un plásmido con una secuencia de replicación autónoma (ARS) o integrada en el genoma como vector/casete de expresión.

El promotor FMD ortólogo y la molécula de ácido nucleico unida operativamente al mismo pueden presentarse extracromosómicamente o integrados en el genoma de la célula de levadura de acuerdo con la invención.

De acuerdo con la invención, el promotor ortólogo comprende la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID N° 1.

SEQ ID N° 1:

AATGTATCTAAACGCAAACTCCGAGCTGGAAAAATGTTACCGGCGATGCGCGGACAATTT AGAGGCGGCGATCAAGAAACACCTGCTGGGCGAGCAGTCTGGAGCACAGTCTTCGATGG GCCCGAGATCCCACCGCGTTCCTGGGTACCGGGACGTGAGGCAGCGCGACATCCATCAAA TATACCAGGCGCCAACCGAGTCTCTCGGAAAACAGCTTCTGGATATCTTCCGCTGGCGGC GCAACGACGAATAATAGTCC^{C T}GGAGGTGACGGAATATATA^{IG T G I}GGAGG^GTAAA1^{C TG}ACAGGGTGTAGCAAAGGTAATATTTTCCTAAAACATGCAATCGGCTGCCCCGCAACGGGA AAAAGAATGACTTTGGCACTCTTCACGAGAGTGGGGTGTCCCGCTCGTGTGTGCAAATAG GCTCCCACTGGTCACCCCGGATTTTGCAGAAAAACAGCAAGTTCCGGGGTGTCTCACTGG TGTCCGCCAATAAGAGGAGCCGGCAGGCACGGAGTCTACATCAAGCTGTCTCCGATACAC TCGACTACCATCCGGGTCTCTCAGAGAGGGGAATGGCACTATAAATACCGCCTCCTTGCG CTCTCTGCCTTCATCAATCAAATC

SEQ ID N° 2:

C GA CGCGGAGAACGATCI CCI CGAGC TGCTCGCGGATCAGCTTGTGGCCCGGTAATGGAACCAG GCCGACGGCACGCTCCTTGCGGACCACGGTGGCTGGCGAGCCCAGTTTGTGAACGAGGTCGTTT AGAACGTCCTGCGCAAAGTCCAGTGTCAGATGAATGTCCTCCTCGGACCAATTCAGCATGTTCT C GAG C AGC C A T € T GT G T T TGGAGIAGAAGCGTAATCTCTGCTCCTCGTTACTGTACCGGAAGAG GTAGTTTGCCTCGCCGCCCATAAIGAACAGGTTCTCTTTCTGGTGGCCTGTGAGCAGCGGGGAC GTCTGGACGGCGTCGATGAGGCCCTTGAGGCGCTCGTAGTACTTGTTCGCGTCGCTGTAGCCGG CCGCGGTGACGATACCCACATAGAGGTCCTTGGCCATTAGTTTGATGAGGTGGGGCAGGATGGG CGACTCGGCATCGAAATTTTTGCCGTCGTCGTACAGTGTGATGTCACCATCGAATGTAATGAGC TGCAGCTTGCGATCTCGGATGGTTTTGGAATGGAAGAACCGCGACATCTCCAACAGCTGGGCCG TGTTGAGAATGAGCCGGACGTCGTTGAACGAGGGGGCCACAAGCCGGCGTTTGCTGATGGCGCG GCGCTCGTCCTCGATGTAGAAGGCCTTTTCCAGAGGCAGTCTCGTGAAGAAGCTGCCAACGCTC GGAACCAGCTGCACGAGCCGAGACAATTCGGGGGTGCCGGCTTTGGTCATTTCAATGTTGTCGT CGATGAGGAGTTCGAGGTCGTGGAAGATTTCCGCGTAGCGGCGTTTTGCCTCAGAGTTTACCAT GAGGTCGTCCACTGCAGAGATGCCGTTGCTCTTCACCGCGTACAGGACGAACGGCGTGGCCAGC AGGCCCTTGATCCATTCTATGAGGCCATCTCGACGGTGTTCCTTGAGTGCGTACTCCACTCTGT AGCGACTGGACATCTCGAGACTGGGCTTGCTGTGCTGGATGCACCAATTAATTGTTGCCGCATG CATCCTTGCACCGCAAGTTTTTAAAACCCACTCGCTTTAGCCGTCGCGTAAAACTTGTGAATCT GGCAACTGAGGGGGTTCTGCAGCCGCAACCGAACTTTTCGCTTCGAGGACGCAGCTGGATGGTG TCAT GT GAGGCI € I GT T T GC T GGC GIAGCCTACAACGTGAC CTT GCCTAACCGGACGGCGCTAC CCACTGCTGTCTGTGCCTGCTACCAGAAAATCACCAGAGCAGCAGAGGGCCGATGTGGCAACTG GTGGGGTGTCGGACAGGCTGTTTCTCCACAGTGCAAATGCGGGTGAACCGGCCAGAAAGTAAAT TCTTATGCTACCGTGCAGTGACTCCGACATCCCCAGTTTTTGCCCTACTTGATCACAGATGGGG TCAGCGCTGCCGCTAAGTGTACCCAACCGTCCCCACACGGTCCATCTATAAATACTGCTGCCAG TGCACGGTGGTGACATCAATCTAAAGTACAAAAACAAA

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un polipéptido heterólogo, que comprende la etapa del cultivo de una célula de levadura de acuerdo con la presente invención. La célula de levadura de acuerdo con la invención que comprende un promotor FMD ortólogo se adecua, en particular, para la sobre-expresión de polipéptidos homólogos o heterólogos. En virtud de las extraordinarias propiedades, con la célula de levadura de acuerdo con la invención es posible expresar un polipéptido o bien una proteína, tanto bajo condiciones desrepresoras como bajo condiciones inducidas por metanol o condiciones inductoras alternativas adecuadas y, eventualmente, segregarlo de la célula.

De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, durante el cultivo se induce la expresión del polipéptido heterólogo bajo condiciones desrepresoras o se aumenta su tasa de expresión.

La desrepresión del promotor puede alcanzarse mediante una tasa de alimentación reducida con una fuente de carbono represora (fuente de C: p. ej., glucosa, glicerol) o mediante el uso de una fuente de C no represora (p. ej., sorbitol). La fuente de C represora puede alcanzar sus propiedades mediante represión directa o mediante propiedades represoras de metabolitos de la fuente de C. La tasa de alimentación con fuentes de C represoras puede desplazarse hacia cero en el caso extremo. También son posibles efectos de inducción adicionales mediante otros compuestos tales como, p. ej., mediante ácidos grasos, formaldehido o ácido fórmico.

Con el fin de aumentar el rendimiento de proteínas durante el cultivo o bien durante su expresión, durante el cultivo se añade, bajo condiciones desrepresoras, preferiblemente metanol.

Las condiciones de cultivo generales, tales como temperatura, medio, etc., son suficientemente conocidas por el experto en la materia (véase, p. ej., Krainer FW et al. Microbial Cell Factories 11 (2012): 22).

La presente invención se define con mayor detalle con ayuda de las siguientes Figuras y Ejemplos, pero sin estar limitada a estos.

La Fig. 1 muestra las intensidades de fluorescencia de una proteína informadora fluorescente verde (una variante mejorada de la proteína fluorescente verde (GFP)) en el cultivo de células de levadura del género Komagataella, en las que un ácido nucleico que codifica la proteína fluorescente verde está unido operativamente a promotores ortólogos y endógenos. Los promotores ortólogos (y promotores endógenos de P. pastoris como referencia) fueron unidos operativamente al gen informador GFP y transformados como vectores en P. pastoris. Las cepas se cultivaron en placas de microtitulación con 96 pocillos (“deep well plate” (DWP) - placa de pocillos profundos) en medio mínimo (BMD1) durante 60 h y, a continuación, se indujeron con metanol. La fluorescencia de la proteína informadora y la DO 600 (como medida de la biomasa) se midieron bajo condiciones reprimidas en glucosa (16 h), condiciones desreprimidas (60 h) y diferentes momentos después de la inducción con metanol. Las mediciones de fluorescencia se normalizaron en relación con los valores DO 600. Los valores medios y las desviaciones estándar se muestran en cada caso para cuatro transformantes.

La Fig. 2 muestra el transcurso en el tiempo de mediciones de la expresión de proteínas. Cepas elegidas de la Fig. 1 se cultivaron en matraces agitados. La fluorescencia de la proteína (Fig. 2A; relación RFU/ = D 600; “RFU”, “relative fluorescence unit”, “unidad de fluorescencia relativa”), la DO 600 (Fig. 2B) y la cantidad de glucosa (Fig. 2C) se midieron a lo largo del tiempo. La concentración de glucosa al comienzo de las mediciones ascendió a 55,5 mM (10 g/l). Se muestran los valores medios (MV) y las desviaciones estándar de en cada caso tres transformantes.

Las Figs. 3A a 3C muestran que el promotor HpFMD ortólogo está también en condiciones de regular al alza la expresión de otras proteínas informadoras, tales como peroxidasa de rábano picante (HRP) (Fig. 3A), lipasa B de Candida Antarctica (CalB) (Fig. 3B) y una hidroxinitriloliasa de Manihot esculenta (MeHNL) (Fig. 3C). Las cepas se cultivaron después de 60 h en DWP en medio mínimo hasta el consumo de glucosa (“agotamiento”) y, a continuación, se indujeron adicionalmente con metanol. Las actividades enzimáticas de HRP y CalB se midieron en el material sobrenadante del cultivo. La actividad de MeHNL se midió con las células disgregadas. Se muestran los valores medios y las desviaciones estándar de en cada caso cuatro transformantes.

EJEMPLO:

Materiales y Métodos

Clonación de los promotores

Los promotores ortólogos se amplificaron mediante PCR y se clonaron delante de un gen informador GFP. Para ello, se utilizó el plásmido informador pPpT4mutZeoMlyI-intARG4-eGFP-BmrIstuffer (Vogl T et al. ACS Synth Biol. 2015, DOI: 10.1021/acssynbio.5b00199; publicado el 22 de noviembre de 2015).

Este plásmido se basa en el vector pPpT4 que se describió por Naatsaari L et al. (PLoS One 7 (2012): e39720). Los promotores se clonaron sin costuras (es decir, sin puntos de corte de enzimas de restricción o secuencias de enlazador entre el promotor y el codón de inicio) con el fin de obtener el contexto natural. Los cebadores se diseñaron con ayuda de referencias de la bibliografía (Promotores HpFMD (Song H, et al. Biotechnol Lett 25 (2003):1999-2006; Ledeboer AM, et al. Nucleic Acids Res 13 (1985):3063-3082), Promotor CbAOD1 (Yurimoto H, et al. Biochim Biophys Acta 1493(2000):56-63), Promotor CbFLD1 (Lee B, et al. Microbiology 148(2000):2697-704), Promotores Pm MODI y MOD2 (Raymond CK, et al. Yeast 14 (1998):11-23; Nakagawa T, et al. J Biosci Bioeng 91 (2001):225-7; Nakagawa T, et al. Yeast 23 (2006):15-22). Las secuencias de cebador utilizadas están indicadas en la Tabla A:

Tabla A: Cebadores para la amplificación de los promotores ortólogos

ADN genómico de las cepas Hp (Hansenula polymorpha) DSM 70277, Cb (Candida boidinii) DSM 70026 y Pm (Pichia methanolica) DSM 2147 se aisló y se utilizó como molde para las reacciones PCR. Los productos de la PCR se clonaron mediante clonaciones TA (“TA cloning”) en el vector pPpT4mutZeoMlyI-intARG4-eGFP-BmrIstuffer (véase también el documento US 2015/0011407 y Vogl T et al. (ACS Synth Biol. 2015, DOI: 10.1021/acssynbio.5b00199; publicado el 22 de noviembre de 2015)). Los vectores de control con respecto a los promotores endógenos de P. pastoris AOX1, CAT1 y GAP se pueden deducir del documento US 2015/0011407. Los vectores informadores alternativos que contienen HRP (isoenzima A2A; Naatsaari L, et al. BMC Genomics 15 (2014): 227), CalB y MeHNL aguas abajo de los promotores correspondientes, se tomaron o construyeron del documento US 2015/0011407, recortando el gen informador eGFP de los vectores eGFP arriba mencionados (enzimas de restricción Nhel y Notl) y sin costuras se incorporaron los productos de la PCR de HRP, CalB y MeHNL mediante clonación por recombinación (“recombination cloning”). Para las amplificaciones por PRC se utilizaron los cebadores indicados en la Tabla B.

Tabla B: Cebadores para la clonación de promotores por encima (“aguas arriba”) de diferentes genes informadores

Para ello, se utilizaron como moldes de PCR los vectores HRP y CalB mencionados en la bibliografía (documento US 2015/0011407) y Vogl T. et al. (ACS Synth Biol. 2015, DOI: 10.1021/acssynbio.5b00199; publicado el 22 de noviembre de 2015). La secuencia de MeHNL se optimizó para el codón de P. pastoris y se diseñó como fragmento de ADN de doble cadena sintético con colgantes al promotor AOX1 y el terminador (véase la Tabla B). Este fragmento se utilizó como molde para las PCR. Se utilizó la secuencia:

cgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattgaaagaattccgaaacgATGGTTACTGC TCACTTCGTCTTGATTCACACTATCTGTCATGGTGCTTGGATCTGGCACAAGTTGAAGCCAGCA TTGGAGAGAGCTGGACATAAGGTTACCGCTCTTGATATGGCTGCATCTGGTATTGATCCTCGTC AAATCGAACAAATCAATTCATTCGACGAGTACTCAGAGCCACTGCTGACCTTCTTGGAAAAGTT GCCTCAAGGTGAAAAGGTGATCATCGTTGGTGAATCCTGTGCTGGATTGAACATTGCCATTGCA GCTGATAGATATGTCGATAAGATCGCTGCTGGTGTCTTCCACAACTCTCTGTTACCAGATACTG TTCACTCTCCATCTTACACTGTCGAGAAGTTGTTAGAATCATTCCCAGATTGGAGAGATACTGA ATACTTTACTTTCACTAACATCACTGGAGAGACTATCACCACCATGAAACTTGGATTCGTTTTG

TTGAGAGAAAACCTTTTCACCAAGTGTACTGATGGTGAATACGAATTGGCCAAGATGGTTATGA GAAAGGGTTCTTTGTTTCAGAATGTTCTTGCACAAAGACCAAAGTTCACCGAAAAGGGTTACGG TTCTATCAAGAAGGTCTACATCTGGACTGATCAGGACAAGATCTTCCTGCCAGACTTCCAAAGA TGGCAAATCGCAAACTACAAACCAGATAAGGTCTACCAAGTCCAAGGTGGTGATCACAAGTTAC AATTGACCAAGACCGAAGAGGTCGCTCACATCTTGCAGGAAGTTGCCGACGCTTACGCTTAAgc ggccgctcaagaggatgtcagaatgccatttgcctg (SEQ ID Nr. 22)

La secuencia que codifica la proteína está representada aquí en mayúsculas, el codón de inicio y de parada en negrillas, los colgantes respecto al vector para la clonación por recombinación están representados en minúsculas, los lugares de corte EcorI y NotI que se utilizan típicamente para clonaciones en la familia de vectores pPpT4 están subrayados.

Para la amplificación por PCR de los genes HRP y CalB pudo utilizarse el mismo cebador directo (pHpFMD-MFalfa-Gib), dado que ambos genes están fusionados con una secuencia señal MFalfa. Se secuenciaron los genes clonados en los vectores mediante cebadores que se unen en el terminador AOX1 y los promotores respectivos (seqpHpHMD-149..126fWd para el promotor HpFMD).

Cepas, Materiales, Mediciones de Fluorescencia y Ensayos Enzimáticos

La actividad enzimática de HRP y CalB se determinaron con los sustratos sal de diamonio de 2,2’-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) y butirato de p-nitrofenilo (p-NPB) según los protocolos en Krainer FW (Microb Cell Fact 11 (2012): 22.

Para las transformaciones de todas las comparaciones de promotor con GFP se utilizó la cepa de tipo salvaje CBS7435. Los plásmidos HRP y CalB se transformaron en la cepa mutS (Náátsaari et al., PLoS One 2012; 7:e39720), dado que ésta muestra una mayor expresión de proteínas (Krainer FW, et al. Microb Cell Fact 11 (2012): 22). Para las mediciones de la actividad de MeHNL las células se lisaron mediante la disgregación con Y-PER (Thermo Fischer Scientific Y-PER™ Reactivo de Extracción de Proteínas de Levadura) según los datos del fabricante y la actividad se midió con un “Ensayo de Cianogénesis de Mandelonitrilo”, tal como se describe en Wiedner R et al. (Comput Struct Biotechnol J10 (2014): 58-62) (concentración final de mandelonitrilo 15 mM).

Resultados

Seis promotores heterólogos de los genes HpFMD, HpMOX, CbFLD1, CbAOD1, PmMOD1 y PmMOD2 se sometieron a ensayo en P. pastoris, Los promotores se compararon, a saber, con el promotor AOX1 inducible con metanol, el promotor GAP constitutivo y el promotor CAT1 desreprimido/inducible con metanol en P. pastoris. Los promotores ortólogos se amplificaron mediante PCR de ADN genómico y se clonaron en el vector con GFP como gen informador. Se utilizaron las siguientes secuencias de promotor:

HpFMD (SEQ ID N° 1):

AATGTATCTAAACGCAAACTCCGAGCTGGAAAAATGTTACCGGCGATGCGCGGACAATTTAGAG GCGGCGATCAAGAAACACCTGCTGGGCGAGCAGTCTGGAGCACAGTCTTCGATGGGCCCGAGAT CCCACCGCGTTCCTGGGTACCGGGACGTGAGGCAGCGCGACATCCATCAAATATACCAGGCGCC AACCGAGTCTCTCGGAAAACAGCTTCTGGATATCTTCCGCTGGCGGCGCAACGACGAATAATAG TCCCTGGAGGTGACGGAATATATATGTGTGGAGGGTAAATCTGACAGGGTGTAGCAAAGGTAAT ATTTTCCTAAAACATGCAATCGGCTGCCCCGCAACGGGAAAAAGAATGACTTTGGCACTCTTCA CCAGAGTGGGGTGTCCCGCTCGTGTGTGCAAATAGGCTCCCACTGGTCACCCCGGATTTTGCAG AAAAACAGCAAGTTCCGGGGTGTCTCACTGGTGTCCGCCAATAAGAGGAGCCGGCAGGCACGGA GTCTACATCAAGCTGTCTCCGATACACTCGACTACCATCCGGGTCTCTCAGAGAGGGGAATGGC ACTATAAATACCGCCTCCTTGCGCTCTCTGCCTTCATCAATCAAATC

HpMOX (SEQ ID N° 2):

CGACGCGGAGAACGATCTCCTCGAGCTGCTCGCGGATCAGCTTGTGGCCCGGTAATGGAACCAG GCCGACGGCACGCTCCTTGCGGACCACGGTGGCTGGCGAGCCCAGTTTGTGAACGAGGTCGTTT AGAACGTCCTGCGCAAAGTCCAGTGTCAGATGAATGTCCTCCTCGGACCAATTCAGCATGTTCT CGAGCAGCCATCTGTCTTTGGAGTAGAAGCGTAATCTCTGCTCCTCGTTACTGTACCGGAAGAG GTAGTTTGCCTCGCCGCCCATAATGAACAGGTTCTCTTTCTGGTGGCCTGTGAGCAGCGGGGAC GTCTGGACGGCGTCGATGAGGCCCTTGAGGCGCTCGTAGTACTTGTTCGCGTCGCTGTAGCCGG CCGCGGTGACGATACCCACATAGAGGTCCTTGGCCATTAGTTTGATGAGGTGGGGCAGGATGGG CGACTCGGCATCGAAATTTTTGCCGTCGTCGTACAGTGTGATGTCACCATCGAATGTAATGAGC TGCAGCTTGCGATCTCGGATGGTTTTGGAATGGAAGAACCGCGACATCTCCAACAGCTGGGCCG TGTTGAGAATGAGCCGGACGTCGTTGAACGAGGGGGCCACAAGCCGGCGTTTGCTGATGGCGCG GCGCTCGTCCTCGATGTAGAAGGCCTTTTCCAGAGGCAGTCTCGTGAAGAAGCTGCCAACGCTC GGAACCAGCTGCACGAGCCGAGACAATTCGGGGGTGCCGGCTTTGGTCATTTCAATGTTGTCGT CGATGAGGAGTTCGAGGTCGTGGAAGATTTCCGCGTAGCGGCGTTTTGCCTCAGAGTTTACCAT GAGGTCGTCCACTGCAGAGATGCCGTTGCTCTTCACCGCGTACAGGACGAACGGCGTGGCCAGC AGGCCCTTGATCCATTCTATGAGGCCATCTCGACGGTGTTCCTTGAGTGCGTACTCCACTCTGT AGCGACTGGACATCTCGAGACTGGGCTTGCTGTGCTGGATGCACCAATTAATTGTTGCCGCATG CATCCTTGCACCGCAAGTTTTTAAAACCCACTCGCTTTAGCCGTCGCGTAAAACTTGTGAATCT GGCAACTGAGGGGGTTCTGCAGCCGCAACCGAACTTTTCGCTTCGAGGACGCAGCTGGATGGTG TCATGTGAGGCTCTGTTTGCTGGCGTAGCCTACAACGTGACCTTGCCTAACCGGACGGCGCTAC CCACTGCTGTCTGTGCCTGCTACCAGAAAATCACCAGAGCAGCAGAGGGCCGATGTGGCAACTG GTGGGGTGTCGGACAGGCTGTTTCTCCACAGTGCAAATGCGGGTGAACCGGCCAGAAAGTAAAT TCTTATGCTACCGTGCAGTGACTCCGACATCCCCAGTTTTTGCCCTACTTGATCACAGATGGGG TCAGCGCTGCCGCTAAGTGTACCCAACCGTCCCCACACGGTCCATCTATAAATACTGCTGCCAG TGCACGGTGGTGACATCAATCTAAAGTACAAAAACAAA

CbFLDI (SEQ ID N° 23):

GGATCCCTTCAACAGCGGAGTCTCAAGCAGTGGCTATTATCAGTGTATTTAATTACTGATGCAT TGTATTATAGTGCATACATAGTTAATAATTACTCTCTGTTATCATTGAAAATTTTGAAATTCTC ACTCTCACGCAGTGCAAAACTTTGCCTAATTGAGTAAGTGGAACGCAATATTTAGGCTACATAT TTTGGATTCCCTTAAGTATGTAATCAAAGATCATTCATACTGCCATCTTATAATATTGGAGTAT TATTATGTTGCTATACTGTTCTACCTGTTTATTCTATTGTATGCGTCTAAATCTTTCCATCAGT TTCTATACTATCTTTCGTTTGCAATGAAATATTACTCCAATTCGCTTGTTTCAACTCGCTTGCC TTCTCTCTTGCCTTCTTTTTTTCTTTTCATTTTATCGTTGTTTAAACGGTATATAAATATGTAA CGTTGTCGCTTAGTTTTGAGAAATCACTTTTGTTGCTCTCAATTCTGTTTTGACATCTTAAGGT TAGTCAATTGATTGAATCAACTACACTAAATCATATTTATCTATTTTTTATTCCACAAAA

CbAODI (SEQ ID N° 24):

GGAGTATACGTAAATATATAATTATATATAATCATATATATGAATACAATGCAATGAAAGTGAA TATGATAAGATTGAAATAATAACAAACAGCGATAAATATATCTCAAAATGGAGTTACACAACAA ATAATAATAAAATATAAATTATAAATTATAAATTATAAAAGAATAAAAAATAAACCCCACTAAT TTATTTTATTAAAAGATAGATTGGTATCTTTACTTAATAACAATTCTGAAACTTTATTCACTTA ATTTTATTTAACTTATTTAATTTATTTTTACCCCAGTTTTTCAGTACAATGCAGCTCCGAAACT TTATTTGGCTGTGATTTGGCTGTGATTTGGCTGTGATTTGGCTTGGCTTGGCTGGCTGGAATTG TCTCCTGCAGGAATTGCTCGGGGTCCGGTTCTCCCGCTGGCTGGCTATTTGGCGGGCTGGCTAT TTGGCGGGCTGGCTGGCTGGCTGCTCTGCCATCTGCTGTGGCCACCCCGCATCTCTGGATGCAC GCCGTGCAGCTGGACGTGCGTCTACCCTGCAGCCGTGTGCCTTATTTCCCAATCTCCCAATCTC TCAATCTGCCAGTCAGCCAAAACACCGGCCAGGCAGGCAGGCAGGCAGGCAGGCAGGCAGTGAA GCCTTCCCACGCCCCACTCCGCATAAACATCCCCAGCAGTTTCCCCAGCAGTTTCCCCAGCTTT TCAATTTAATAAAATAGCCTGTTTCTGTTTCTGTTTTATATTATACAATTTTTTATCCTAATAA TTACTCTTTCGGGAATTAAATAATAATTATATCATATACCCATATCACATTTTACTATATTTAC TATCTATAAATAAATTCATATTATAATATTAATTTATATTCGCTTAATTAAAATGCTCTTTTCC ATCATCATCATCATCATCATCATCACGAGTTTTCGGTTATCAATACTCTTTTCATTAATTTCTA GAATTTCATTATTTATTTTTTATTGACTGGAAATTTTCAATCAATTTTATTTATTTTTATTTAT TTATTTTCATATTCTTAGATTTAAACTTTTTAGATGACCGCTATTTTACTTACTTACTTACTGT TGTTTTATATTATGATAAGAATTAATTTTCATATTTATGATGATGATGATGTAAATTTAACCTA GTATACTATTTTAAAGTTATCACTATCTTTTAGTGCTGGCATTTTTTATTCTATTTTCATATAT GTATATACGTAAATTAAGTATCATCACGCTGCTTACTGTACGTTTAAAATGTGGAGATGGAAAT AGAGAT GGGGAT GAAGAT GAAGAT GATGAGAAT TATAAACCAT T CATTCAT TAATCAAT CAATA TAACTTATAAAAAAATTTATATTTAAATGAATTAATTTCCTTTATTTTAATAATATCGTTAATT CTTTTAAATTCTATTTTATTTTAATTCTTTCTTTATCATAGTTATCATATAACAATTATATAAC ATAGATACACAATTATTATTTCATTATCATATTATTTTTTAAAATATTGATTATTTTTAAAATA ATATCTTAATTAATTAATTTTTACGAATATACAAATTTTAACGACTTACTTTTTTTAACGAATT TTAAC GAAC TTTTAAAAAAAC AAAAAAAAAAAAAC AAAAT TATT TTTCAATA

PmMODI (SEQ ID N° 25):

CGAGATGGTACATACTTAAAAGCTGCCATATTGAGGAACTTCAAAGTTTTATCTGTTTTTAGAA TTAAAAGACGATTGTTGTAACAAAACGTTGTGCCTACATAAACTCAAATTAATGGAAATAGCCT GTTTTGAAAAATACACCTTCTTAAGTACTGACAAAGTTTTGTTAAATGACTATCGAACAAGCCA TGAAATAGCACATTTCTGCCAGTCACTTTTAACACTTTCCTGCTTGCTGGTTGACTCTCCTCAT ACAAACACCCAAAAGGGAAACTTTCAGTGTGGGGACACTTGACATCTCACATGCACCCCAGATT AATTTCCCCAGACGATGCGGAGACAAGACAAAACAACCCTTTGTCCTGCTCTTTTCTTTCTCAC ACCGCGTGGGTGTGTGCGCAGGCAGGCAGGCAGGCAGCGGGCTGCCTGCCATCTCTAATCGCTG CTCCTCCCCCCTGGCTTCAAATAACAGCCTGCTGCTATCTGTGACCAGATTGGGACACCCCCCT CCCCTCCGAATGATCCATCACCTTTTGTCGTACTCCGACAATGATCCTTCCCTGTCATCTTCTG GCAATCAGCTCCTTCAATAATTAAATCAAATAAGCATAAATAGTAAAATCGCATACAAACGTCA TGAAAAGTTTTATCTCTATGGCCAACGGATAGTCTATCTGCTTAATTCCATCCACTTTGGGAAC CGTTCTCTCTTTACCCCAGATTCTCAAAGCTAATATCTGCCCCTTGTCTATTGTCCTTTCTCCG TGTACAAGCGGAGCTTTTGCCTCCCATCCTCTTGCTTTGTTTCGGTTATTTTTTTTTCTTTTGA AACTCTTGGTCAAATCAAATCAAACAAAACCAAACCTTCTATTCCATCAGATCAACCTTGTTCA ACATTCTATAAATCGATATAAATATAACCTTATCCCTCCCTTGTTTTTTACCAATTAATCAATC TTCAAATTTCAAATATTTTCTACTTGCTTTATTACTCAGTATTAACATTTGTTTAAACCAACTA TAACTTTTAACTGGCTTTAGAAGTTTTATTTAACATCAGTTTCAATTTACATCTTTATTTATTA ACGAAATCTTTACGAATTAACTCAATCAAAACTTTTACGAAAAAAAAATCTTACTATTAATTTC TCAAA

PmMOD2 (SEQ ID N° 26):

GGATCCACTACAGTTTACCAATTGATTACGCCAATGTGTTTATTTCACCAAGTAATTACAAAAC TGAGATTTGGTTATGTCATTATGTATTTTCGGCAATGGCTGTAATTTAAACTGGATTAGGGTTA ATTAACGTTTAGCCTACGAAAGCGGCTAGCTTTTATTTCTGCTTTTGTTTTGAGCCCGTTTCTA ATTCCAATCTTTGCAATTTCGTTCCATCTTTTAAAATTAAGTGCTCTTTTCTAATCTGATAAAG ATAAGCCATCGTAGAGTAAGTAAAACAAAATAATGTACTGTATATTAAGCGGAAAAACTTGGAA AAGTCGTATGATGTTGAAGGAGCAAAGAATGACTAATATTAGGAGATTTAAGCAAACAATGTTG AGGGGAACAGGACGATTAACCCCTTATAGAGGAAGCGTCTTTGATGTTCGAAGGGGGAGGGGTC AAAAGCACTGAGCAGTGCTAATTAGTAACCAATTTCTGTAAGCAATGAAACTTGTTGCTATTGG AAATACTATTAAGTAATACAAGGTACAGACTAATGGGGGTGAGCCGGTAGTTCAGGCTATCTTA TAGACAGACTATTCCGGATTGTCTAATCATTGGTGCACCTGGTTAATAATTATCAGTCAACTCT TTTACGGTGCTGATAGGTCTTTGCGAACTTGCCCTTGTGGAATTTGGTTGTTAATCAAACTGTT CTGTATTTCATGTCATACTACTATTGATATTATTAATGTTACTTACTCATCTGGCCATTTAACA GGTTTGAAGCTTTAATGCTCTTAACTAACAGCAATCCATCACCGTCAACCTTAACCCCCCTGGT GCTTGCTGTCTTTATCCTTCGTATCTTTTTCATGTTGCACCGCCCTGTTCCTTATACGGTTGTT CCCCCATAGGCTAACTTCTCTGTTTCCGACCATCTCTGCAATAACAAAGAATTCTATACGCTTA CACTATAATCATACAATGACTCTACATGCCATTTTCACTTTACTTACTTGCCATCGGAAGATAC TGAATCAGAAAGCCATAGTAACTACATAACTTCAAAACACACCCTTTTTACAGATTAGTTACAA TTTTGTCAATGTTTGTTTGATAACCCAAGGTGGAACGTTTCCAGTTAGACCTGTTTAATCCAAC TCACTTTACCACCCCAAAACTTTCCTACCGTTAGACAAATACTGGCTAAATCTGACGAAAACAA CCAATCAACAATTGAATCCACTGGGAGGTATCTCTAATCCACTGACAAACTTTGCTAAAACAAG AAAAAGTGGGGGCCTCCGTTGCGGAGAAGACGTGCGCAGGCTTAAAAACACAAGAGAACACTTG GAAGTACCCCAGATTTTTAGCTTCCTACTATTCTGACACCCCCTATTCAAGCACGACGGTGATT GATTCATTCAATTTTGCTGCTCCAATGATAGGATAAACCCTTTTGGACTTCAATCAGACCTCTG TCCTCCATAGCAATATAAATACCTTCTAGTTGCCCCACTTCCTCTCTCCTGTACTGCCCCAATG AGTGACTTATTCAAGTTACTTTCTCTCTTTTCCTAACAATTAAACAAGAAGCTTTATTATAACA TTAATATACTATTTTATAACAGGATTGAAATTATATTTATCTATCTAAAACTAAAATTCAAA

Transformantes de P. pastoris que contenían plásmidos con los promotores CbAODI, PmMODI y PmMOD2 no mostraron fluorescencia de la proteína informadora (Fig. 1). El promotor CbFLD1 mostró una represión en glucosa y una débil inducción por parte de metanol de aproximadamente el 10% del promotor PpAOX1. Sorprendentemente, ambos promotores de H. polymorpha sometidos a ensayo conservaron su perfil de regulación natural de H. polymorpha y mostraron también en Pichia pastoris represión, desrepresión e inducción con metanol (Figs. 1 y 2). El promotor HpFMD superó de manera sorprendente, bajo condiciones desreprimidas, al promotor PpGAP constitutivo e incluso alcanzó, sin alimentación adicional con fuentes de C para el abastecimiento de energía, aproximadamente el 75% del promotor PpAOX1 inducido con metanol. La expresión desreprimida del promotor HpFMD superó la fluorescencia de la proteína informadora del promotor MUT endógeno más potente de P. pastoris (PpCAT1) aproximadamente en 3,5 veces. Tras la inducción con metanol, en promotor HpFMD superó incluso al promotor PpAOX1 aproximadamente dos veces. Estos resultados a pequeña escala (Fig. 1) se confirmaron mediante experimentos en matraces agitados (Fig. 2), mostrándose mediante mediciones con glucosa también claramente el perfil de regulación desreprimido. Un refuerzo adicional de las ventajas técnicas del promotor HpFMD se puede alcanzar mediante una tasa de alimentación optimizada en el biorreactor.

Con el fin de examinar si la fuerte expresión inesperada del promotor HpFMD puede ser reproducida para otras proteínas que no sean GFP, el promotor HpFMD se clonó delante de las secuencias codificantes de proteínas adicionales: las proteínas secretadas de peroxidasa de rábano picante (HRP) y lipasa B de Candida antárctica (CalB) y la hidroxinitril-liasa intracelular de Manihot esculenta (MeHNL) (Figs. 3A a 3C).

Con referencia a los rendimientos finales en proteína activa en el sobrenadante del cultivo en el experimento con matraces agitados se igualó la expresión desreprimida de todas las proteínas mediante el promotor HpFMD de la expresión constitutiva mediante el promotor GAP y superó claramente a la expresión desreprimida mediante el promotor CAT1. Las actividades enzimáticas inducidas por metanol del promotor HpFMD superaron a la actividad del promotor AOX1 en 2,5 veces.

La fuerte expresión del promotor HpFMD también se podía observar en el caso de cuatro proteínas informadoras secretadas, como también intracelulares diferentes (eGFP, HRP, CalB, MeHNL). El promotor HpFMD ortólogo superó incluso a los promotores endógenos en P. pastoris.

De manera interesante, los promotores ortólogos no muestran o bien muestran identidades de secuencia muy bajas con respecto a los promotores en Pichia. Una búsqueda según BLAST del promotor HpFMD no proporcionó resultados significativos en el genoma de Pichia pastoris, tampoco un alineamiento directo del promotor HpFMD con respecto al promotor PpFDH1 proporcionó similitudes significativas (BLASTN 2.2.32+, secuencias Blast 2, ajuste para 'Secuencias algo similares (blastn)', tipo de molécula: ácido nucleico.

Una identidad de la secuencia baja de este tipo es una propiedad deseable de los promotores, dado que estas secuencias extrañas no pueden recombinarse con secuencias idénticas en el genoma de Pichia y, de esta forma, no pueden perderse, p. ej., mediante fenómenos de recombinación homólogos con secuencias similares ya presentes en el genoma.

Sorprendentemente, promotores ortólogos pueden representar herramientas altamente aprovechables para la expresión de proteínas, tal como se muestra mediante las actividades 2,5 veces mayores por parte del promotor HpFMD. De manera inesperada, el promotor HpFMD conservó también en P. pastoris su perfil de regulación desreprimido de H. polimorpha y, por consiguiente, representa el promotor desreprimido más fuerte en P. pastoris. Con ello, pueden posibilitarse procesos de producción eficientes libres de metanol tóxico y altamente inflamatorio.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Célula de Pichia pastoris que comprende un promotor ortólogo, inducible por desrepresión, de una célula de levadura metilótrofa o una variante inducible por desrepresión de la misma, caracterizada por que el promotor ortólogo es un promotor ortólogo formiato deshidrogenasa (FMD) de una célula de levadura metilótrofa y la variante es al menos 90% ident con el promotor, en donde el promotor ortólogo presenta una secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID N° 1 y está unido operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo u homólogo.

2. Célula de Pichia pastoris según la reivindicación 1, caracterizada por que el promotor ortólogo es inducible con metanol.

3. Célula de Pichia pastoris según la reivindicación 1 o 2, caracterizada por que el polipéptido heterólogo u homólogo comprende un péptido señal, en particular un péptido señal de la secreción.

4. Célula de Pichia pastoris según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que el promotor ortólogo procede de una célula de levadura metilótrofa, que se elige del grupo consistente en los géneros Hansenula, Candida, Komagataella y Pichia.

5. Célula de Pichia pastoris según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que la célula de levadura metilótrofa se elige del grupo consistente en Hansenula polymorpha, Candida boidinii, Pichia methanolica, Komagataella pastoris, Komagataella phaffii, Komagataella populi, Komagataella pseudopastoris, Komagataella ulmi y Komagataella sp. 11-1192.

6. Célula de Pichia pastoris según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que el promotor ortólogo y, eventualmente, la molécula de ácido nucleico unida operativamente al mismo que codifica el polipéptido heterólogo u homólogo está presente en el genoma y en forma de construcción de ácido nucleico extracromosómica.

7. Procedimiento para la preparación de un polipéptido heterólogo, que comprende la etapa del cultivo de una célula de Pichia pastoris según una de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizada por que durante el cultivo se induce la expresión del polipéptido heterólogo bajo condiciones desrepresoras o se aumenta su tasa de expresión.

9. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizada por que durante el cultivo se añade, bajo condiciones desrepresoras, metanol o un inductor alternativo.