JP2023540500A - 合成発現系 - Google Patents

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Abstract

本出願は、転写単位、合成発現系、ならびに転写単位および合成発現系を含む宿主細胞を記載し、合成発現系は目的の遺伝子を発現することができる。生物的産物（限定されないが、目的の遺伝子から発現されるタンパク質またはＲＮＡを含む）の産生方法も記載される。いくつかの実施形態では、生物的産物は、メタノールを添加せずに培養条件下で宿主細胞から産生される。産業規模で既存のメタノール依存性発現系の産生能力に匹敵するかまたはそれを超える解決策が必要である。本開示は、転写単位および合成発現系、転写単位および合成発現系を含む宿主細胞、ならびにメタノール非依存性条件下を含むタンパク質および分子の高収率合成を促進する方法を記載する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年９月５日に出願された米国仮出願第６３／０７５，１３４号の優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
３７ ＣＦＲ １．５２（ｅ）（５）に従って、本明細書は、配列表（「Ｇ０９１９７００６７ＷＯ００－ＳＥＱ」という名称の．ｔｘｔファイルとして電子的に提出されたもの）を参照する。．ｔｘｔファイルは２０２１年８月２６日に生成されたものであり、サイズは４０１，０４２バイトである。配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本開示は、転写単位を含む合成発現系、合成発現系を含む宿主細胞、ならびにタンパク質および他の所望の分子のメタノール非依存性生物生産のための方法に関する。
背景
ある特定のメチロトローフ性酵母細胞は、その天然プロモーター系の強力で調節可能な特徴に部分的に起因して、生物的産物（例えば、タンパク質、核酸、小分子など）の産生に使用されてきた。例えば、多くの組換えタンパク質は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓというメチロトローフ性酵母で首尾よく産生されており、典型的には、その内因性メタノール調節ＡＯＸ１プロモーターであるＰ（ＡＯＸ１）によって駆動される。Ｐ（ＡＯＸ１）ベースの生産システムは十分に特徴付けられ、最適化され、堅牢であり、工業的使用の長い歴史を有するが、Ｐ（ＡＯＸ１）のメタノール依存性は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系の使用を制限的なプロセス条件に制限する。これは、メタノールが大規模で危険かつ望ましくない非常に毒性の高い可燃性化合物であるため、大規模生産環境において特に深刻な問題である。
概要
産業規模で既存のメタノール依存性発現系の産生能力に匹敵するかまたはそれを超える解決策が必要である。本開示は、転写単位および合成発現系、転写単位および合成発現系を含む宿主細胞、ならびにメタノール非依存性条件下を含むタンパク質および分子の高収率合成を促進する方法を記載する。
本開示の態様は、合成発現系を含む、メチロトローフ性宿主細胞に関し、合成発現系は、以下の要素：（１）上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含むインプットプロモーター、ならびに合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドであって、合成転写因子がＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含み、ＤＢＤおよびＴＡＤがメチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、ポリヌクレオチドを含む第１の転写単位と、（２）目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位であって、合成転写因子が合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、第２の転写単位と、を含み、目的の遺伝子は、外因的に提供されるメタノールの非存在下で発現される。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、合成転写因子の少なくとも１つの成分の発現を駆動する。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位のポリヌクレオチドは、転写因子のすべての成分をコードする。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは天然に存在するものである。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、天然に存在するプロモーターと少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは合成のものである。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは構成的インプットプロモーターである。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、調節可能なインプットプロモーターである。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは誘導性である。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは抑制性である。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、同族の培養プロセスに関する栄養素の添加、制限、または枯渇に応答する。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、チアミン枯渇に応答する。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、グリセロール制限に応答する。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、単糖制限に応答する。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、炭素源、糖、デンプン、ガラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、イノシトール、グリセロール、ビタミン、ステロイド、窒素源、硝酸、亜硝酸、アンモニウム、アミノ酸、メチオニン、重金属、銅、安息香酸、過酸化水素、カルシウム含有化合物および／もしくはリン酸の制限に応答する。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、外因的に提供されるメタノールの非存在に応答する。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、任意の２またはそれを超える栄養素の組み合わせの制限または枯渇に応答する。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターの活性は、外因的に提供されるギ酸の存在によって増加する。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、外因的に提供されるメタノールの非存在下で調節可能である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはメタノール誘導性でない。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）および／またはコアプロモーターエレメントは、メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、Ｐ（ＪＥＮ１）、Ｐ（ＧＱ６７０４４９９）、Ｐ（ＧＱ６７００９２６）、Ｐ（ＨＧＴ１）、Ｐ（ＦＤＨ１）、Ｐ（ＡＯＸ２）、Ｐ（ＲＧＩ２）、Ｐ（ＴＨＩ１３）＿ｓｈｏｒｔ、Ｐ（ＴＨＩ１３）＿ｌｏｎｇ、またはＰ（ＴＨＩ４）である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはＰ（ＪＥＮ１）である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはＰ（ＧＱ６７０４４９９）である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはＰ（ＧＱ６７００９２６）である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはＰ（ＨＧＴ１）である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはＰ（ＦＤＨ１）である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはＰ（ＡＯＸ２）である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはＰ（ＲＧＩ２）である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはＰ（ＴＨＩ１３）＿ｓｈｏｒｔである。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはＰ（ＴＨＩ１３）＿ｌｏｎｇである。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはＰ（ＴＨＩ４）である。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、合成転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、Ｂｍ３Ｒ１、ＴｅｔＲ、ＰｈｌＦ＿ＡＭ、またはＶａｎＲ＿ＡＭである。いくつかの実施形態では、合成転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、Ｂｍ３Ｒ１である。いくつかの実施形態では、合成転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、ＴｅｔＲである。いくつかの実施形態では、合成転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、ＰｈｌＦ＿ＡＭである。いくつかの実施形態では、合成転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、ＶａｎＲ＿ＡＭである。
いくつかの実施形態では、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）は、Ｂ１１２＿ＴＡＤ、Ｂ４２＿ＴＡＤ、ＧＡＬ４＿ＴＡＤ、ｍｉｎｉＶＰＲ＿ＴＡＤ、Ｍｘｒ１＿ＴＡＤ、ＰＨ＿ＴＡＤ、ＶＰ１６＿ＴＡＤ、ＶＰ６４＿ＴＡＤ、ＶＰ６４ｖ２＿ＴＡＤ、ＶＰＨ＿ＴＡＤ、またはＶＰＲ＿ＴＡＤである。いくつかの実施形態では、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）はＢ１１２＿ＴＡＤである。いくつかの実施形態では、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）はＢ４２＿ＴＡＤである。いくつかの実施形態では、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）はＧＡＬ４＿ＴＡＤである。いくつかの実施形態では、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）はｍｉｎｉＶＰＲ＿ＴＡＤである。いくつかの実施形態では、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）はＭｘｒ１＿ＴＡＤである。いくつかの実施形態では、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）はＰＨ＿ＴＡＤである。いくつかの実施形態では、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）はＶＰ１６＿ＴＡＤである。いくつかの実施形態では、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）はＶＰ６４＿ＴＡＤである。いくつかの実施形態では、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）はＶＰ６４ｖ２＿ＴＡＤである。いくつかの実施形態では、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）はＶＰＨ＿ＴＡＤである。いくつかの実施形態では、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）はＶＰＲ＿ＴＡＤである。
いくつかの実施形態では、合成転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、Ｂｍ３Ｒ１、ＴｅｔＲ、ＰｈｌＦ＿ＡＭ、またはＶａｎＲ＿ＡＭであり、合成転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）は、Ｂ１１２＿ＴＡＤ、Ｂ４２＿ＴＡＤ、ＧＡＬ４＿ＴＡＤ、ｍｉｎｉＶＰＲ＿ＴＡＤ、Ｍｘｒ１＿ＴＡＤ、ＰＨ＿ＴＡＤ、ＶＰ１６＿ＴＡＤ、ＶＰ６４＿ＴＡＤ、ＶＰ６４ｖ２＿ＴＡＤ、ＶＰＨ＿ＴＡＤ、またはＶＰＲ＿ＴＡＤである。
いくつかの実施形態では、合成転写因子は、インプットプロモーターの活性化因子ではない。
いくつかの実施形態では、合成転写因子は１成分合成転写因子である。いくつかの実施形態では、合成転写因子は、２成分合成転写因子である。いくつかの実施形態では、合成転写因子は、多成分の合成転写因子である。
いくつかの実施形態では、合成転写因子が核局在化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、核局在化シグナルはＳＶ４０核局在化シグナルである。
いくつかの実施形態では、合成転写因子はリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、２成分または多成分の合成転写因子は、バイオコンジュゲートタンパク質産物部分１（ＢＰＰ１）およびバイオコンジュゲートタンパク質部分２（ＢＰＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、ＢＰＰ１はＳｐｙＴａｇ００２であり、ＢＰＰ２はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２である。
いくつかの実施形態では、合成転写因子は自己切断性ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、自己切断性ポリペプチドは２Ａペプチドである。いくつかの実施形態では、自己切断性ポリペプチドはＥＲＢＶ＿１＿Ｐ２Ａである。
いくつかの実施形態では、合成転写因子はオリゴマー化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化ドメインは、Ｌｉｎｋｅｒ＿ｏｎｌｙ＿ｆｏｒ＿ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ；Ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿ｄｏｍａｉｎ；またはＨｅｐｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿ｄｏｍａｉｎである。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、配列番号２６～４０または１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、合成転写因子は、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかもしくはそれからなるか、または配列番号１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターはメタノール誘導性でない。
いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターは、上流活性化配列およびコアプロモーターエレメントを含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない。
いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターのコアプロモーターエレメントは、３００塩基対以下の長さの核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターのコアプロモーターエレメントは、約６塩基対～約３００塩基対、約２５塩基対～約２５０塩基対、約７５～約２２５塩基対、または約１００塩基対～約１７５塩基対の長さである核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターの、上流活性化配列（ＵＡＳ）の３’末端とコアプロモーターエレメントの５’末端との間の距離は、０～２００塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターの、上流活性化配列（ＵＡＳ）の３’末端とコアプロモーターエレメントの５’末端との間の距離は、約６塩基対～約２００塩基対、約６塩基対～約５３塩基対、約２０塩基対～約１５０塩基対、約５０塩基対～約１２５塩基対、または約５０塩基対～約１００塩基対の長さを有する核酸配列である。
いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターのコアプロモーターエレメントは、天然に存在するコアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるコアプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターのコアプロモーターエレメントは、Ｐ（ＡＯＸ１）（配列番号１６２）、Ｐ（ＤＡＳ２）（配列番号１６３）、Ｐ（ＨＨＦ２）（配列番号１６４）またはＰ（ＰＭＰ２０）（配列番号１６５）由来のコアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であるコアプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターのコアプロモーターエレメントは、Ｐ（ＡＯＸ１）由来のコアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であるコアプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターのコアプロモーターエレメントは、Ｐ（ＤＡＳ２）由来のコアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であるコアプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターのコアプロモーターエレメントは、Ｐ（ＨＨＦ２）由来のコアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であるコアプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターのコアプロモーターエレメントは、Ｐ（ＰＭＰ２０）由来のコアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であるコアプロモーター配列を含む。
いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、ｂｍＯ、ｔｅｔＯ、ｐｈｌＯまたはｖａｎＯを含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、ｂｍＯを含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、ｔｅｔＯを含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、ｐｈｌＯを含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、ｖａｎＯを含む。
いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターは、１またはそれを超えるオペレーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターの１またはそれを超えるオペレーターは、メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない。
いくつかの実施形態では、合成転写因子はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）Ｂｍ３Ｒ１を含み、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）はｂｍＯの１またはそれを超えるコピーを含む。いくつかの実施形態では、合成転写因子はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ＰｈｌＦ＿ＡＭを含み、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）はｐｈｌＯの１またはそれを超えるコピーを含む。いくつかの実施形態では、合成転写因子はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ＴｅｔＲを含み、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）はｔｅｔＯの１またはそれを超えるコピーを含む。いくつかの実施形態では、合成転写因子はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ＶａｎＲ＿ＡＭを含み、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）はｖａｎＯの１またはそれを超えるコピーを含む。
いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターは、配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むまたはからなる。
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子はＲＮＡとして発現される。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子はタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、酵素、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、感覚タンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質、または貯蔵タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、タンパク質は、分子を合成、修飾、または変換する。いくつかの実施形態では、分子は、ヘムまたはヘム生合成経路の中間体である。いくつかの実施形態では、タンパク質はヘム結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ヘム結合タンパク質は、ヘモグロビン、ニューログロビン、サイトグロビン、レグヘモグロビン、またはミオグロビンである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ワクシニアキャップ化酵素、Ｔ７ポリメラーゼ、またはＯ－メチルトランスフェラーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質はヘム生合成経路の酵素である。いくつかの実施形態では、ヘム生合成経路の酵素は、シトクロムＰ４５０、９－アデニル酸シクラーゼ、可溶性グアニル酸シクラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、および／またはシトクロムオキシダーゼである。
いくつかの実施形態では、メチロトローフ性宿主細胞は、第２の転写単位に、分泌タグをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、分泌タグは、α－アミラーゼ分泌タグ、Ｓｃ Ｍｆ α１分泌タグ、またはプレ－イヌリナーゼ分泌タグである。いくつかの実施形態では、第２の転写単位は分泌タグを含み、目的の遺伝子はタンパク質をコードし、タンパク質がメチロトローフ性宿主細胞から分泌される。いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は、α－アミラーゼ、β－ラクトグロブリン、またはオボアルブミンである。
いくつかの実施形態では、第１および／または第２の転写単位は、転写ターミネーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および／または第２の転写単位の転写ターミネーターは天然に存在する。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および／または第２の転写単位の転写ターミネーターが合成のものである。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および／または第２の転写単位の転写ターミネーターは、リボソームタンパク質をコードする遺伝子由来である。いくつかの実施形態では、遺伝子は、リボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）をコードする。
いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、配列番号１４６または１４７のいずれかの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むまたはからなる。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、スペーサーによって分離されている。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位および／または第２の転写単位は、メチロトローフ性宿主細胞中に複数コピーで存在する。いくつかの実施形態では、第２の転写単位対第１の転写単位のコピー数の比が１：１である。いくつかの実施形態では、第２の転写単位対第１の転写単位のコピー数の比は、少なくとも２：１、少なくとも４：１、または少なくとも１０：１である。いくつかの実施形態では、第１の転写単位対第２の転写単位のコピー数の比は、少なくとも２：１、少なくとも４：１、または少なくとも１０：１である。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位は単一コピーで存在し、第２の転写単位は複数コピーで存在する。いくつかの実施形態では、複数の第２の転写単位のうちの少なくとも２つは、異なる目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位の合成転写因子は、複数の第２の転写単位の各合成アウトプットプロモーターの活性化因子である。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、メチロトローフ性宿主細胞に対して内因性である１またはそれを超える配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、単一のプラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、異なるプラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および／または第２の転写単位は、メチロトローフ性宿主細胞のゲノムに組み込まれている。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、メチロトローフ性宿主細胞ゲノム内の同じ染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、同じ方向に向けられている。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、異なる方向に向けられている。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、メチロトローフ性宿主細胞ゲノム内の異なる染色体上に位置する。
いくつかの実施形態では、メチロトローフ性宿主細胞はメチロトローフ性酵母細胞である。いくつかの実施形態では、メチロトローフ性宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＣａｎｄｉｄａから選択される属に由来する。いくつかの実施形態では、メチロトローフ性宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｋｕｒｔｚｍａｎｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｍｏｎｄａｖｉｏｒｕｍ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、またはＰｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａである。いくつかの実施形態では、メチロトローフ性宿主細胞はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、対照宿主細胞（すなわち、同じ合成発現系を含まない宿主細胞）で産生される生物的産物のレベルよりも高いレベルで、目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を提供する。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、メチロトローフ性宿主細胞と同じ種の細胞である。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞はＰ．Ｐａｓｔｏｒｉｓである。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、天然のインプットプロモーターを有する。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、目的の遺伝子に作動可能に連結されたメタノール誘導性プロモーターを有する。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞のメタノール誘導性プロモーターは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＰ（ＡＯＸ１）である。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、外因的に添加されたメタノールの存在下で培養される。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞によってコードされる目的の遺伝子は、合成発現系を含むメチロトローフ性宿主細胞によってコードされる同じ目的の遺伝子である。
いくつかの実施形態では、メチロトローフ性宿主細胞は、増殖期および産生期を含む条件下で培養される。いくつかの実施形態では、産生期にメチロトローフ性宿主細胞において産生される目的の遺伝子の転写産物の量は、増殖期にメチロトローフ性宿主細胞において産生される目的の遺伝子の転写産物の量よりも少なくとも１００％高い。いくつかの実施形態では、産生期にメチロトローフ性宿主細胞において産生される目的の遺伝子の転写産物の量は、増殖期にメチロトローフ性宿主細胞において産生される目的の遺伝子の転写産物の量よりも少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％高い。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を、対照宿主細胞において産生される生物的産物のレベルよりも少なくとも２００％高いレベルで提供する。いくつかの実施形態では、合成発現系は、目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を、対照宿主細胞において産生される生物的産物のレベルよりも少なくとも６００％、少なくとも９００％、少なくとも１２００％、少なくとも１５００％、少なくとも１８００％、少なくとも２１００％、少なくとも２４００％、少なくとも２７００％、少なくとも３０００％、少なくとも５０００％、または少なくとも１０，０００％高いレベルで提供する。いくつかの実施形態では、合成発現系は、目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を、対照宿主細胞で産生される生物的産物のレベルよりも１０，０００％を超える高いレベルで提供する。いくつかの実施形態では、合成発現系は、目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を、対照宿主細胞で産生される生物的産物のレベルよりも約３００％～約６００％、約５００％～約１０００％、約８００％～約１５００％、約１０００％～約２０００％、約１２００％～約２０００％、約１８００％～約２５００％、約２０００％～約２５００％、約２２００％～約３０００％、約３０００％～約５０００％、または約５０００％～約１０，０００％高いレベルで提供する。
本発明のいくつかの態様は、本開示の任意の実施形態による合成発現系で宿主細胞を形質転換することを含む、タンパク質発現のために宿主細胞を操作する方法を記載する。
他の態様では、本明細書に記載の合成発現系、転写単位またはその成分を含むメチロトローフ性宿主細胞を培養することを含む、目的の遺伝子を発現させる方法が企図される。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ヘム結合タンパク質またはヘム生合成経路の１またはそれを超える酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ヘム結合タンパク質は、ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビン、サイトグロビンまたはレグヘモグロビンである。いくつかの実施形態では、ヘム結合タンパク質はミオグロビンである。いくつかの実施形態では、ヘム生合成経路の１またはそれを超える酵素は、シトクロムＰ４５０、９－アデニル酸シクラーゼ、可溶性グアニル酸シクラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、および／またはシトクロムオキシダーゼである。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ワクシニアキャップ化酵素、Ｔ７ポリメラーゼ酵素またはＯ－メチルトランスフェラーゼ酵素をコードする。
本発明の特定の態様は、本明細書に記載の合成発現系、転写単位またはその成分を含むメチロトローフ性宿主細胞を培養すること、およびバイオマスまたは培養物から目的の分子を得ることを含む、目的の分子を製造する方法を記載する。いくつかの実施形態では、目的の分子は、バイオマスから抽出される。いくつかの実施形態では、分子は、培養物、培養培地、細胞不含使用済み培養培地、および／または細胞含有培養培地から回収される。目的の遺伝子が酵素をコードするいくつかの実施形態では、本方法は、（１）目的の遺伝子によってコードされる酵素を精製する工程；および（２）目的の分子への基質の生物変換のために、精製された酵素を使用する工程を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子はヘムである。
他の態様では、目的の遺伝子を発現させるかまたは目的の分子を産生する方法であって、（ａ）宿主細胞を、本開示の方法に従って、細胞増殖を可能にする期間にわたって適切な培地中で培養する工程、および（ｂ）１またはそれを超える培養条件を変更して目的の遺伝子の発現または目的の分子の産生を促進する工程を含む方法が企図される。
いくつかの実施形態では、１またはそれを超える培養条件を変更することは、培養培地の組成を変更することを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、栄養素を制限、添加、および／または枯渇させることを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）はチアミン枯渇を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）はグリセロール制限を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は単糖制限を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）はギ酸添加を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、任意の炭素源、糖、デンプン、ガラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、イノシトール、グリセロール、ビタミン、ステロイド、窒素源、硝酸、亜硝酸、アンモニウム、アミノ酸、メチオニン、重金属、銅、安息香酸、過酸化水素、カルシウム含有化合物、および／またはリン酸の制限を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、任意の２つの栄養素の組み合わせの制限を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、グルコースの制限およびチアミンの枯渇を含む。
いくつかの態様では、合成発現系は、配列番号１～１５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むまたはからなる。いくつかの実施形態では、合成発現系は、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むインプットプロモーターを含むまたはからなる。いくつかの実施形態では、合成発現系は、合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドを含むまたはからなる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２６～４０または１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むまたはからなる。いくつかの実施形態では、コードされた合成転写因子は、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含むまたはからなる。いくつかの実施形態では、合成発現系は、配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む合成アウトプットプロモーターを含むまたはからなる。
いくつかの態様では、合成発現系は、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むまたはからなる。
いくつかの態様では、合成発現系は、配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むまたはからなる。
いくつかの態様では、合成発現系は、配列番号２６～４０または１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる合成転写因子を含むまたはからなる。
いくつかの態様では、合成発現系は、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含むまたはからなる合成転写因子をコードするまたは含む。
本発明のいくつかの態様は、以下を含む合成発現系を記載する：（１）転写因子の１またはそれを超える成分をコードするポリヌクレオチドを含む第１の転写単位、および（２）合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位。いくつかの実施形態では、転写因子は合成アウトプットプロモーターの活性化因子である。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、メチロトローフ性宿主細胞、例えばメチロトローフ性酵母において使用するためのものである。いくつかの実施形態では、合成発現系は、メチロトローフ性宿主細胞において発現される。いくつかの実施形態では、合成発現系は、メチロトローフ性酵母において発現される。いくつかの実施形態では、合成発現系は、メチロトローフ性宿主細胞において使用または発現される。いくつかの実施形態では、メチロトローフ性宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属の酵母細胞である。いくつかの実施形態では、合成発現系は、メチロトローフ性宿主細胞において使用または発現されるためのメタノール非依存性発現系である。いくつかの実施形態では、合成発現系は、メチロトローフ性酵母において使用するための、または発現されるための、メタノール非依存性発現系である。いくつかの実施形態では、酵母はＰｉｃｈｉａ属またはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属のものである。
本発明のいくつかの態様は、以下を含む合成発現系を記載する：（１）転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドを含む第１の転写単位、および（２）合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位。いくつかの実施形態では、転写因子は合成アウトプットプロモーターの活性化因子である。
本発明のいくつかの態様は、以下を含む合成のメタノール非依存性発現系を記載する：（１）転写因子の１またはそれを超える成分をコードするポリヌクレオチドを含む第１の転写単位、および（２）合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位。いくつかの実施形態では、転写因子は合成アウトプットプロモーターの活性化因子である。
本発明のいくつかの態様は、以下を含む合成のメタノール非依存性発現系を記載する：（１）転写因子の１またはそれを超える成分をコードするポリヌクレオチドを含む第１の転写単位、および（２）合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位。いくつかの実施形態では、転写因子は合成アウトプットプロモーターの活性化因子である。いくつかの実施形態では、合成のメタノール非依存性発現系は、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属の宿主細胞で発現される。
本発明の各特徴は、本発明の様々な態様に包含され得る。任意の１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の各特徴は、本発明の各実施形態に含まれ得ると考えられる。本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるかまたは図面に示される構成要素の構造および配置の詳細に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または実行することができる。
添付の図面は、縮尺どおりに描かれていることを意図していない。図面は、例示的かつ非限定的な例にすぎず、本開示を実施可能にするために必要とされない。明確にするために、すべての構成要素がすべての図面でラベル付けされているわけではない。図面は以下のとおりである：
図１Ａ～１Ｂはそれぞれ、本開示の合成発現系の非限定的な例、例えばメタノール非依存性発酵プロセス下で誘導可能なものの概略図を示す。図１Ａは、第１の転写単位が、合成転写因子（ｓＴＦ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたインプットプロモーター（Ｐ（ｉｎ））および必要に応じて第１の転写ターミネーター（ＴＴ）から構成されることを示す。図１Ｂは、第１の転写単位が、上流活性化配列（ＵＡＳ）を含むＰ（ｉｎ）と、ｓＴＦをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたコアプロモーターエレメントと、必要に応じて第１のＴＴから構成されることを示す。いくつかの実施形態では、Ｐ（ｉｎ）は、コアプロモーターエレメントのみを含む（例えば、ＵＡＳなし）。いくつかの実施形態では、図１Ａまたは図１Ｂに示されるように、Ｐ（ｉｎ）は、発酵プロセス（培養）条件の操作に応答して活性化される。操作は、ｓＴＦコード遺伝子の転写を活性化する。図１Ａおよび図１Ｂは両方とも、第２の合成転写単位が、目的の遺伝子（ＧＯＩ）に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーター（Ｐ（ｏｕｔ））および必要に応じて第２のＴＴを含むことを示しており、第１のＴＴおよび第２のＴＴは、同じであるか、または異なる。Ｐ（ｏｕｔ）は、コアプロモーター（ＣＰ）配列に作動可能に連結された上流活性化配列（ＵＡＳ）を含む。発現されると、ｓＴＦタンパク質は、Ｐ（ｏｕｔ）の上流活性化配列中の１またはそれを超える同族部位（例えば、オペレーター）に結合し、それによってコアプロモーターからの転写を活性化する。Ｐ（ｏｕｔ）は、目的の遺伝子に作動可能に連結され、その発現を駆動する。 図１Ａ～１Ｂはそれぞれ、本開示の合成発現系の非限定的な例、例えばメタノール非依存性発酵プロセス下で誘導可能なものの概略図を示す。図１Ａは、第１の転写単位が、合成転写因子（ｓＴＦ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたインプットプロモーター（Ｐ（ｉｎ））および必要に応じて第１の転写ターミネーター（ＴＴ）から構成されることを示す。図１Ｂは、第１の転写単位が、上流活性化配列（ＵＡＳ）を含むＰ（ｉｎ）と、ｓＴＦをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたコアプロモーターエレメントと、必要に応じて第１のＴＴから構成されることを示す。いくつかの実施形態では、Ｐ（ｉｎ）は、コアプロモーターエレメントのみを含む（例えば、ＵＡＳなし）。いくつかの実施形態では、図１Ａまたは図１Ｂに示されるように、Ｐ（ｉｎ）は、発酵プロセス（培養）条件の操作に応答して活性化される。操作は、ｓＴＦコード遺伝子の転写を活性化する。図１Ａおよび図１Ｂは両方とも、第２の合成転写単位が、目的の遺伝子（ＧＯＩ）に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーター（Ｐ（ｏｕｔ））および必要に応じて第２のＴＴを含むことを示しており、第１のＴＴおよび第２のＴＴは、同じであるか、または異なる。Ｐ（ｏｕｔ）は、コアプロモーター（ＣＰ）配列に作動可能に連結された上流活性化配列（ＵＡＳ）を含む。発現されると、ｓＴＦタンパク質は、Ｐ（ｏｕｔ）の上流活性化配列中の１またはそれを超える同族部位（例えば、オペレーター）に結合し、それによってコアプロモーターからの転写を活性化する。Ｐ（ｏｕｔ）は、目的の遺伝子に作動可能に連結され、その発現を駆動する。
図２は、合成転写因子（ｓＴＦ）の２つの非限定的な例の成分を示す。ｓＴＦは、１成分ｓＴＦ、２成分ｓＴＦ、または多成分（例えば、３またはそれを超える成分）ｓＴＦであり得る。１成分ｓＴＦは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、核局在化シグナル（ＮＬＳ、任意）、リンカー（Ｌ、任意）、および転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含み得る。２成分ｓＴＦは、ＤＢＤ、ＮＬＳ（任意）、Ｌ（任意）、バイオコンジュゲートタンパク質部分１（ＢＰＰ１、任意）、２Ａペプチド（２Ａ、任意）、バイオコンジュゲートタンパク質部分２（ＢＰＰ２、任意）、ＮＬＳ（任意）、オリゴマー化ドメイン（ＯＤ、任意）およびＴＡＤを含み得る。２成分ｓＴＦにおいて、ＤＢＤ、ＮＬＳ（任意）、リンカー（任意）およびＢＰＰ１は一緒になって、成分１を形成する。２成分ｓＴＦにおいて、ＢＰＰ２、ＮＬＳ（任意）、ＯＤ（任意）およびＴＡＤは一緒になって、成分２を形成する。成分１および成分２は一緒になって、成分１－成分２付加物を含む「バイオコンジュゲート（合成）転写因子」（Ｂ（ｓ）ＴＦ）を形成する。
図３は、発酵（培養）フロー図の非限定的な例を示す。発酵の３つの段階を示す。発酵のバッチ期は、最初に添加された一定質量の炭素を含有する出発培養培地で開始する（段階Ｉ）。フェドバッチ期である段階ＩＩは、バイオマス生成期であり、所望の残留炭素レベルを維持しながら成長を維持するのに十分な速度で炭素供給が維持される。段階ＩＩＩは産生期である。段階ＩＩＩでは、炭素供給速度を調整して、所望の残留炭素レベルを維持しながら生産を維持することができる。添加（例えば、１回のボーラスまたは供給のいずれかとして）または制限もしくは枯渇（例えば、栄養素）は、必要に応じて発酵プロセス全体を通して行うことができる。
図４は、実施例１において宿主細胞ゲノムに組み込まれた試験構築物および対照構築物を示す。上側の構築物は、組み込まれて試験された合成発現系（ＳＥＳ）を示し、下側の構築物は対照を示す。
図５は、ディープウェルプレートにおける発現のアッセイを示す（アッセイ３）。各株は、それぞれ発光タグを有する３つのタンパク質のうちの１つを発現する１つの合成発現系（ＳＥＳ）を含む。各株は、そのＰ（ｉｎ）に対応するディープウェルプロセスでアッセイされる。固有のＳＥＳごとに１～３個のコロニーを選び、アッセイした。２４１ピックの性能を要約する。平均バックグラウンド発光は約３３７発光単位である。 図５は、ディープウェルプレートにおける発現のアッセイを示す（アッセイ３）。各株は、それぞれ発光タグを有する３つのタンパク質のうちの１つを発現する１つの合成発現系（ＳＥＳ）を含む。各株は、そのＰ（ｉｎ）に対応するディープウェルプロセスでアッセイされる。固有のＳＥＳごとに１～３個のコロニーを選び、アッセイした。２４１ピックの性能を要約する。平均バックグラウンド発光は約３３７発光単位である。
図６は、プロセス３におけるディープウェルプレート形式での発現のアッセイを示す。各ドットは、９つのタンパク質を産生する固有の株を表す。上側のパネルの値は、細胞内ミオグロビンの量を表し、下のパネルの値は、同じ細胞内のヘムの量を表す。 図６は、プロセス３におけるディープウェルプレート形式での発現のアッセイを示す。各ドットは、９つのタンパク質を産生する固有の株を表す。上側のパネルの値は、細胞内ミオグロビンの量を表し、下のパネルの値は、同じ細胞内のヘムの量を表す。
詳細な説明
本開示は、合成発現系、転写単位、合成発現系および転写単位を含む宿主細胞、ならびに、例えばメタノール非依存性条件下で所望の生物的産物（例えば、限定されないが、酵素または他のタンパク質、ＲＮＡ、小分子など）の高収率産生を促進する方法を提供する。「合成」は、天然に存在しない配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）、または天然に存在しない１またはそれを超える配列を含む成分を指す。「天然に存在する」とは、天然に見られ得るもの（例えば、核酸またはポリペプチド）を指す。例えば、天然に存在する核酸またはポリペプチド配列は、天然の供給源から単離することができ、実験室でヒトによって他の方法で改変されていないものである。いくつかの実施形態では、天然に存在しない配列は、組み合わされて新しい配列を形成する２またはそれを超える天然に存在する配列を含む。
本開示の転写単位および合成発現系は、インプットプロモーター、合成アウトプットプロモーター、転写因子（例えば、転写活性化因子）をコードするポリヌクレオチド、発現される目的の遺伝子、および任意の転写ターミネーターを含み得るいくつかの成分を含み得る。これらの成分は、転写単位または転写系を作製するために他の成分と併せて使用され得る。
いくつかの実施形態では、合成発現系は第１の転写単位を含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、それを発現することができるインプットプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドと、挿入部位とを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位において、挿入部位は、挿入部位に挿入されたプロモーター（例えば、インプットプロモーター）が、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、それを発現することができるように配置される。いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、挿入部位に挿入されたインプットプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その転写を調節する。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位を含む。いくつかの実施形態では、合成発現系は、アウトプットプロモーターおよび挿入部位を含む第２の転写単位を含む。いくつかの実施形態では、第２の転写単位において、挿入部位は、挿入部位に挿入された目的の遺伝子がアウトプットプロモーターに作動可能に連結され、発現され得るように配置される。いくつかの実施形態では、転写因子（その一部または全部が第１の転写単位によってコードされる）は、第２の転写単位のアウトプットプロモーターの活性化因子である。いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは、目的の遺伝子に作動可能に連結され、その転写を調節し、第１の転写単位によってコードされる転写因子は、第２の転写単位のアウトプットプロモーターの活性化因子である。いくつかの実施形態では、転写因子および／またはアウトプットプロモーターは合成である。本開示はまた、合成発現系を含む宿主細胞、ならびに宿主細胞、転写単位または合成発現系を使用する方法に関する。
いくつかの実施形態では、宿主細胞内の合成発現系を使用して、生物的産物を産生することができる。いくつかの実施形態では、合成発現系の設計、宿主細胞の選択、および培養条件のパラメータを操作して、生物的産物の産生のタイミングおよびレベルを制御することができる。
合成発現系（ＳＥＳ）
本開示の態様は、例えば所望の生物的産物の生合成において有用であり得る転写単位および合成発現系を提供する。
本開示で使用される場合、「合成発現系」は、所望の生物的産物を合成する目的で、目的の遺伝子［例えば、目的の内因性および／または合成（例えば、改変された、異種の、または外因性の宿主細胞など）遺伝子］の発現を可能にする非天然発現系を指す。いくつかの実施形態では、合成発現系は１またはそれを超える転写単位を含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および／または第２の転写単位は合成である。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、転写因子（例えば、転写活性化因子）または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドを含む第１の転写単位と、転写因子と同族であるアウトプットプロモーターを含む第２の転写単位とを含む。いくつかの実施形態では、合成発現系は、第１の挿入部位と、転写因子（例えば、転写活性化因子）または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドとを含む第１の転写単位と、転写因子と同族であるアウトプットプロモーターおよび第２の挿入部位を含む第２の転写単位とを含み、第１の挿入部位に挿入されたプロモーター（例えば、インプットプロモーター）は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、ポリヌクレオチドの発現を促進することができ、第２の挿入部位に挿入された目的の遺伝子は、アウトプットプロモーターに作動可能に連結され、アウトプットプロモーターによって発現されることができる。いくつかの実施形態では、合成発現系は、１またはそれを超える以下の成分を含む：（ａ）転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、それを発現することができるインプットプロモーターを含む第１の転写単位、および（ｂ）第２の転写単位であって、目的の遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができるアウトプットプロモーター、および、必要に応じて、目的の遺伝子の下流の転写ターミネーターを含む第２の転写単位。いくつかの実施形態では、転写因子は合成転写因子（ｓＴＦ）である。いくつかの実施形態では、合成転写因子は、１成分ｓＴＦ、２成分ｓＴＦ、または多成分ｓＴＦであり得る。いくつかの実施形態では、第１の転写単位のインプットプロモーター（Ｐ（ｉｎ））は（その転写活性が特定の培養条件によって調節される）、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドの発現を駆動し、これは次に１またはそれを超える第２の転写単位の転写活性化を媒介する。いくつかの実施形態では、各第２の転写単位は、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分に対する結合部位を含むアウトプットプロモーター（Ｐ（ｏｕｔ））と、目的の遺伝子とを含む。いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは合成である。いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは上流活性化配列（ＵＡＳ）を含み、上流活性化配列は転写因子に対する１またはそれを超える結合部位；コアプロモーター；および５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは５’－ＵＴＲを含む。５’－ＵＴＲは、＋１転写開始（端を含む）からＡＴＧ翻訳開始（端を含まない）までのプロモーターの部分である。
実施例１、３および４を含む実施例は、本開示の転写単位および合成発現系のいくつかの非限定的な例を示す。
本開示の転写単位または合成発現系は、宿主細胞ゲノム内で様々な方法で構成することができることが当業者によって理解されよう（例えば、連続または非連続ポリヌクレオチド配列上に；同じまたは異なる染色体上に；転写の方向に対して同じまたは反対の方向に向けられる）。
いくつかの実施形態では、合成発現系（例えば、第１の転写単位および第２の転写単位を含む）は、単一のプラスミドまたは染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、合成発現系は、２またはそれを超えるプラスミドおよび／または染色体上に位置する。例えば、いくつかの実施形態では、第１の転写単位は第１のプラスミドまたは染色体上に位置し、第２の転写単位は第２のプラスミドまたは染色体上に位置する。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、２またはそれを超えるコピーの第１の転写単位；および／または２またはそれを超えるコピーの第２の転写単位を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、互いに同じまたは異なる２またはそれを超える第１の転写単位；および／または互いに同じまたは異なる２またはそれを超える第２の転写単位を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、同じまたは異なる目的の遺伝子の２またはそれを超えるコピーを発現することができる。いくつかの実施形態では、合成発現系は、２またはそれを超える異なる生物的産物を産生することができる。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位は単一コピーで存在し、第２の転写単位は複数コピー（例えば、２またはそれを超えるコピー）で存在する。いくつかの実施形態では、複数の第２の転写単位のうちの少なくとも２つは、異なる目的の遺伝子を含む。例えば、第２の転写単位＃１は、ヘム生合成経路の酵素をコードする遺伝子を含んでよく、第２の転写単位＃２は、ヘムまたはヘム生合成経路の中間体をコードする遺伝子を含んでよい。いくつかの実施形態では、第１の転写単位の転写因子（例えば、合成転写因子）は、複数の第２の転写単位の各アウトプットプロモーター（例えば、合成アウトプットプロモーター）の活性化因子である。しかしながら、第１の転写単位の転写因子（例えば、合成転写因子）が複数の第２の転写単位の各アウトプットプロモーター（例えば、合成アウトプットプロモーター）を活性化するために、複数の第２の転写単位は、同一のアウトプットプロモーター（または同一の成分を含むアウトプットプロモーター）を含む必要はないことが理解されよう。例えば、複数の第２の転写単位のアウトプットプロモーター（例えば、合成アウトプットプロモーター）は、それぞれ異なるコアプロモーターエレメントを含んでもよいが、共通の上流活性化配列（ＵＡＳ）を共有してもよく、それにより、それぞれが第１の転写単位の転写因子（例えば、合成転写因子）によって活性化され得る。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、少なくとも２つの第１の転写単位であって、それぞれが、同じ転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された異なるインプットプロモーターを含む、少なくとも２つの第１の転写単位；および／または、少なくとも２つの第２の転写単位であって、それぞれが、転写因子によって活性化可能であり、目的の遺伝子に作動可能に連結されたアウトプットプロモーターを含み、少なくとも２つの第２の転写単位のアウトプットプロモーターおよび目的の遺伝子が同じまたは異なる、少なくとも２つの第２の転写単位を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分を発現することができる第１の転写単位；および２またはそれを超える異なる第２の転写単位を含み、それぞれが、転写因子によって活性化され、異なる目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、２またはそれを超えるポリヌクレオチドに作動可能に連結されたインプットプロモーターを含み、それぞれが、同じもしくは異なる転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分（例えば、ポリシストロニックなまたは遺伝子座）を発現する。いくつかの実施形態では、同じまたは異なる転写因子は、同じまたは異なる目的の遺伝子の転写を活性化する。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、（ａ）それぞれが同じもしくは異なる転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分を発現する２またはそれを超えるポリヌクレオチドに作動可能に連結されたインプットプロモーターを含む第１の転写単位；および（ｂ）１またはそれを超える第２の転写単位であって、それぞれが、転写因子によって活性化され目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターを含む、１またはそれを超える第２の転写単位を含み；１またはそれを超える第２の転写単位の合成アウトプットプロモーターおよび／または目的の遺伝子は同じまたは異なる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡの機能単位は、同じプロモーターの制御下にある２またはそれを超える遺伝子を含む（例えば、マルチシストロニックまたはポリシストロニック単位）。様々な実施形態では、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードする遺伝子を含む転写単位は、マルチシストロニックまたはポリシストロニック［例えば、転写単位は、複数の異なる転写因子である（またはその成分）または同じ転写因子（またはその成分）の複数のコピーをコードする］；および／または、目的の遺伝子を含む転写単位は、マルチシストロニックまたはポリシストロニックである（例えば、転写単位は、複数の異なる目的の遺伝子または同じ目的の遺伝子の複数のコピーをコードする）。いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、同じもしくは異なる転写因子またはその成分をコードする２またはそれを超えるポリヌクレオチドに作動可能に連結された単一のインプットプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第２の転写単位は、（同じであっても異なっていてもよい）２またはそれを超える目的の遺伝子に作動可能に連結された単一のアウトプットプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、（ａ）それぞれが異なる転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分を発現する２またはそれを超えるポリヌクレオチドに作動可能に連結されたインプットプロモーターを含む転写単位；および（ｂ）それぞれが、第１の転写単位によってコードされた異なる転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分によって活性化され異なる目的の遺伝子に作動可能に連結された、合成アウトプットプロモーターを含む、２またはそれを超える第２の転写単位を含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、そのゲノム中に、本出願に記載される転写単位または転写系のいずれか１つなどの転写単位または合成発現系の複数のコピーを含む。これらの複数のコピーは、いくつかの実施形態では、宿主細胞ゲノムへの系または単位の複数回の導入、または合成発現系、単位（複数可）もしくはその成分を含む１またはそれを超えるプラスミドの単回導入とそれに続く自己複製から生じ得る。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、１またはそれを超える以下の成分：インプットプロモーター、転写因子またはその少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチド、合成アウトプットプロモーター、目的の遺伝子、および転写ターミネーター（例えば、実施例１、３、および４を参照）を含む。実施例１、３および４は、本開示の転写単位および合成発現系のいくつかの非限定的な例を記載する。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系は、実施例１および３、表２１、２８、および３０～３６の配列に対して、または配列番号１～１６６のいずれか１つから選択される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、１つまたは多数の異なる第１の転写単位および／または第２の転写単位を含む合成発現系を含む。様々な転写単位は、互いに対して任意の向きにあり得る。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、転写単位または合成発現系の任意の２つの成分の間に配置することができる。スペーサーは、典型的には、様々な目的のために、例えば、相互作用性を減少させるかまたは促進するために、成分間に挿入することができる短いポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列である。スペーサーは、任意部分タイプであり、本開示の転写単位および／または合成発現系の適切な機能のために必要であるとは考えられない。スペーサーの非限定的な例を表２０に記載し、この部分タイプの対応するＤＮＡ配列を表２１に提供する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列番号１６６の配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、５’から３’へと順に、以下の部分のＤＮＡ配列を含む：（１）Ｐ（ｉｎ）、（２）ＴＦ（例えば、ｓＴＦ）または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチド、および（３）第１の転写単位のＴＴ、（４）任意のスペーサー、（５）Ｐ（ｏｕｔ）、および（６）目的の遺伝子。いくつかの実施形態では、合成発現系は、５’から３’へと順に、以下の部分のＤＮＡ配列を含む：（１）Ｐ（ｉｎ）、（２）ＴＦ（例えば、ｓＴＦ）または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチド、および（３）第１の転写単位のＴＴ、（４）任意のスペーサー、（５）Ｐ（ｏｕｔ）、（６）分泌タグ、および（７）目的の遺伝子。いくつかの実施形態では、合成発現系は、５’から３’へと順に、以下の部分のＤＮＡ配列を含む：（１）Ｐ（ｉｎ）、（２）ＴＦ（例えば、ｓＴＦ）または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチド、および（３）第１の転写単位のＴＴ、（４）任意のスペーサー、（５）Ｐ（ｏｕｔ）、（６）分泌タグ、（７）検出タグ、および（８）目的の遺伝子。
いくつかの実施形態では、発現系は、産生プロセスに関して同族である。いくつかの実施形態では、発現系は、その発現系がプロセスにおいて特定の培養工程または培養条件（例えば、プロセス１の場合、グリセロール制限およびギ酸添加；プロセス２の場合、グルコース制限およびギ酸添加；およびプロセス３について、グルコース制限およびチアミン枯渇）のもとで活性化されるならば、特定の生産プロセス（例えば、プロセス１、プロセス２、プロセス３、またはプロセス４などの本明細書に記載されたプロセス）に関して同族である。
表２は、合成発現系の非限定的な例の組み合わせの設計を示す。これらは、とりわけ、グルコースが制限されてギ酸が添加されるプロセス２による製造プロセスに有用である。
表３は、合成発現系の非限定的な例の組み合わせの設計を示す。これらは、とりわけ、グルコースが制限されてチアミンが枯渇しているプロセス３による製造プロセスに有用である。
合成発現系を設計、構築および／または評価するプロセスでは、レポーター遺伝子を目的の遺伝子として使用することができる。実施例に示すように、レポーター遺伝子として赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を使用して、いくつかの合成発現系を構築した。合成発現系（例えば、実施例に記載のもの）の評価が成功した後、レポーター遺伝子が目的の遺伝子として使用された場合、レポーター遺伝子は、特定の生物的産物の産生に有用な異なる目的の遺伝子で置き換えることができる。
いくつかの実施形態では、合成発現系はメタノール非依存性である。いくつかの実施形態では、メタノール非依存性合成発現系は、（ａ）転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドを含む第１の転写単位と、（ｂ）合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位とを含む。いくつかの実施形態では、転写因子の１またはそれを超える成分は、第２の転写単位の合成アウトプットプロモーターの活性化因子である。いくつかの実施形態では、合成のメタノール非依存性発現系は、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、または任意の酵母（任意のメチロトローフ性酵母が含まれるが、これらに限定されない）の宿主細胞で発現される。
本開示の特定の態様は、グリセロールを制限し、ギ酸を添加した発酵条件下（実施例に記載のプロセス１）で酵母に使用するための合成発現系を包含する。そのような合成発現系は、合成転写因子（ｓＴＦ）に作動可能に連結されたインプットプロモーター（Ｐ（ｉｎ））および目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーター（Ｐ（ｏｕｔ））を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ（ｉｎ）は、Ｐ（ＧＱ６７０４４９９）、Ｐ（ＨＧＴ１）、およびＰ（ＦＤＨ１）から選択され得る（これらのプロモーターのそれぞれについての特定の配列の非限定的な例を表２１に見出すことができる。これらのプロモーターの適切なバリアントは、上に詳述したように、当業者の技術の範囲内である）。いくつかの実施形態では、ｓＴＦは、ＴｅｔＲベースの１成分系、ＶａｎＲ＿ＡＭベースの１成分系、ＰｈｌＦベースの１成分系、またはＰｈｌＦベースの２成分系から選択され得る。これらのｓＴＦのそれぞれについての特定の配列の非限定的な例は、表３０および３６（核酸配列）および３１（アミノ酸配列）に見出され得る。これらのｓＴＦの適切なバリアントは、上で詳述したように、当業者の技術の範囲内である）。いくつかの実施形態では、Ｐ（ｏｕｔ）は、８ｘｔｅｔＯ、４ｘｖａｎＯ、８ｘｐｈｌＯ、１ｘｔｅｔＯまたは２ｘｐｈｌＯで修飾されたＰ（ＡＯＸ１）またはＰ（ＨＨＦ２）コアプロモーターから選択される（各Ｐ（ｏｕｔ）に関する特定の配列の非限定的な例は、表３３または表３６に見出すことができる。これらのプロモーターの適切なバリアントは、上に詳述したように、当業者の技術の範囲内である）。
本開示の特定の態様はまた、グルコースを制限し、ギ酸を添加した発酵条件下（実施例に記載のプロセス２）で酵母に使用するための合成発現系も包含する。そのような合成発現系は、合成転写因子（ｓＴＦ）に作動可能に連結されたインプットプロモーター（Ｐ（ｉｎ））および目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーター（Ｐ（ｏｕｔ））を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ（ｉｎ）は、Ｐ（ＡＯＸ２）、Ｐ（ＲＧＩ２）、およびＰ（ＦＤＨ１）から選択され得る（これらのプロモーターのそれぞれについての特定の配列の非限定的な例を表２１に見出すことができる。これらのプロモーターの適切なバリアントは、上に詳述したように、当業者の技術の範囲内である）。いくつかの実施形態では、ｓＴＦは、Ｂｍ３Ｒ１ベースの１成分系、ＰｈｌＦベースの１成分系、またはＰｈｌＦベースの２成分系から選択され得る。これらのｓＴＦのそれぞれについての特定の配列の非限定的な例は、表３０および３６（核酸配列）および３１（アミノ酸配列）に見出され得る。これらのｓＴＦの適切なバリアントは、上で詳述したように、当業者の技術の範囲内である）。いくつかの実施形態では、Ｐ（ｏｕｔ）は、４ｘｂｍＯ、８ｘｂｍＯ、８ｘｐｈｌＯ、または２ｘｐｈｌＯで修飾されたＰ（ＡＯＸ１）またはＰ（ＰＭＰ２０）コアプロモーターから選択される（各Ｐ（ｏｕｔ）に関する特定の配列の非限定的な例は、表３３または表３６に見出すことができる。これらのプロモーターの適切なバリアントは、上に詳述したように、当業者の技術の範囲内である）。
本開示の特定の態様はまた、グルコースを制限し、チアミンが枯渇した発酵条件下（実施例に記載のプロセス３）で酵母に使用するための合成発現系も包含する。そのような合成発現系は、合成転写因子（ｓＴＦ）に作動可能に連結されたインプットプロモーター（Ｐ（ｉｎ））および目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーター（Ｐ（ｏｕｔ））を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ（ｉｎ）は、Ｐ（ＴＨＩ１３）＿ｓｈｏｒｔおよびＰ（ＴＨＩ１３）＿ｌｏｎｇから選択され得る（これらのプロモーターのそれぞれについての特定の配列の非限定的な例を表２１に見出すことができる。これらのプロモーターの適切なバリアントは、上に詳述したように、当業者の技術の範囲内である）。いくつかの実施形態では、ｓＴＦは、Ｂｍ３Ｒ１ベースの２成分系またはＰｈｌＦベースの２成分系から選択され得る。これらのｓＴＦのそれぞれについての特定の配列の非限定的な例は、表３０および３６（核酸配列）および３１（アミノ酸配列）に見出され得る。これらのｓＴＦの適切なバリアントは、上で詳述したように、当業者の技術の範囲内である）。いくつかの実施形態では、Ｐ（ｏｕｔ）プロモーターは、２ｘｂｍＯまたは２ｘｐｈｌＯで修飾されたＰ（ＡＯＸ１）コアプロモーターである（各Ｐ（ｏｕｔ）に関する非限定的な例は、表３３または表３６に見出すことができる。これらのプロモーターの適切なバリアントは、上に詳述したように、当業者の技術の範囲内である）。
生物的産物
本開示に記載される転写単位、合成発現系、宿主細胞、および他の方法は、例えばメタノール非依存性条件下での生物的産物の高収率、大規模生産に使用することができる。
「生物的産物」という用語は、バイオマスによってまたはバイオマスから作製され、本開示の転写単位および／または合成発現系によって発現され得る任意の製品を指す。「バイオマス」は、任意の宿主細胞における産生によるものを含む、再生可能なベースで利用可能な任意の生物学的材料を指す。
いくつかの実施形態では、生物的産物は、目的の遺伝子から発現されるタンパク質、またはポリヌクレオチド；または目的の遺伝子から発現されるタンパク質もしくはポリヌクレオチドによって直接的もしくは間接的に合成、修飾もしくは他の方法で作用される任意の他の組成物である。
いくつかの実施形態では、生物的産物は、タンパク質、核酸（例えば、ｍＲＮＡ；またはポリヌクレオチド）、小分子もしくは大分子、複合体もしくは超分子複合体（またはいずれかの成分）、または目的の遺伝子によってコードされるタンパク質もしくは核酸の作用によって、直接的もしくは間接的に、（全体的もしくは部分的に）合成され、修飾され、および／または別の最終的な、またはより有用もしくは安定な形態に変換される化合物もしくは組成物である。
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子がタンパク質を発現する場合、タンパク質は、酵素、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、感覚タンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質または貯蔵タンパク質である。
いくつかの実施形態では、タンパク質は酵素である。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子によって発現されるタンパク質は、ヘム生合成経路の酵素である。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子によって発現される酵素は、シトクロムＰ４５０、９－アデニル酸シクラーゼ、可溶性グアニル酸シクラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼまたはシトクロムオキシダーゼのうちの１またはそれを超えるものである。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、分子を合成、修飾または変換する。いくつかの実施形態では、分子はヘムである。
いくつかの実施形態では、合成発現系を使用して、ヘム結合タンパク質を産生する。本開示の転写単位または合成発現系を使用して発現され得る様々なクラスのヘム結合タンパク質としては、限定されないが、グロビン（例えば、ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビン、サイトグロビン、レグヘモグロビン）、シトクロム（例えば、ａ型、ｂ型およびｃ型、ｃｄ１－亜硝酸レダクターゼ、チトクロム酸化酵素）、トランスフェリン（例えば、ラクトトランスフェリン、セロトランスフェリン、メラノトランスフェリン）、バクテリオフェリチン、ヒドロキシルアミンオキシドレダクターゼ、ニトロホリン、ペルオキシダーゼ（例えば、リグニンペルオキシダーゼ）、シクロオキシゲナーゼ（例えば、ＣＯＸ－１、ＣＯＸ－２、ＣＯＸ－３、プロスタグランジンＨシンターゼ）、カタラーゼ、シトクロムＰ－４５０ｓ、クロロペルオキシダーゼ、ＰＡＳドメインヘムセンサ、Ｈ－ＮＯＸヘムセンサ（例えば、可溶性グアニル酸シクラーゼ、ＦｉｘＬ、ＤＯＳ、ＨｅｍＡＴおよびＣｏｏＡ）、ヘムオキシゲナーゼ、および一酸化窒素シンターゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示の転写単位または合成発現系を使用して発現される組換えヘム結合タンパク質は、原核生物起源または真核生物起源のものであり得る。いくつかの実施形態では、ヘム結合タンパク質は、哺乳動物起源のものである。いくつかの実施形態では、ヘム結合タンパク質は、ウシ起源のものである。いくつかの実施形態では、ヘム結合タンパク質は、細菌起源のものである。いくつかの実施形態では、ヘム結合タンパク質は、真菌（例えば、酵母）起源のものである。いくつかの実施形態では、ヘム結合タンパク質は、植物起源のもの、または任意の他の起源のものである。
いくつかの実施形態では、１またはそれを超える合成発現系を使用して、宿主細胞においてヘムおよびヘム結合タンパク質を産生する。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、分泌タグをコードするポリヌクレオチドを第２の転写単位にさらに含む。いくつかの実施形態では、分泌タグは宿主細胞に天然である。いくつかの実施形態では、分泌タグは天然に存在するが、宿主細胞にとって天然ではない。いくつかの実施形態では、分泌タグは、Ｐｒｅ－ＯＳＴ１－Ｐｒｏ Ｓｃ ＭＦα１、マウスＩｇＧ１、ＰＨＡ－Ｅ、Ｓｃインベルターゼ、Ｓｃ ＭＥＬ１、Ｓｃ ＩＮＵ、ＹＩＬｉｐ１１、ＹＩＬｉｐ２、Ｄａｎ４、ＧＡＳ１、ＭＳＢ２、ＦＲＥ２、ＰＨＯ１、ＰＨＯ５、ＳＯＤ１、ＥＸＧ１、ＢＧＬ２、ＣＰＲ５、ＹＰＳ１、ＥＮＯ１、ＰＥＰ４、ＴＨＩ４、ＩＬＶ５、ＣＴＲ９、ＰＩＲ３、ＦＬＯ１０、ＨＳＰ１５０、ＮＵ１４５、ＭＵＣ１、ＲＯＴ１、またはＭＥＴ６である。いくつかの実施形態では、分泌タグは、α－アミラーゼ分泌タグ、Ｓｃ Ｍｆ α１分泌タグ、またはプレ－イヌリナーゼ分泌タグである。第２の転写単位が分泌タグをさらに含み、目的の遺伝子がタンパク質をコードするいくつかの実施形態では、タンパク質は宿主細胞から分泌され得る。理解されるように、いくつかの実施形態では、合成発現系によってコードされるタンパク質の宿主細胞からの分泌は、コードされるタンパク質を抽出および精製するために宿主細胞を溶解または他の方法で損傷する必要がないので有利である。したがって、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、コードされたタンパク質の回収後でさえ、目的のタンパク質を産生し続けることができる。いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は、α－アミラーゼ、β－ラクトグロブリン、またはオボアルブミンである。
いくつかの実施形態では、生物的産物は、目的の遺伝子から転写された核酸（例えば、ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、生物的産物は、ウイルスタンパク質をコードするｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、生物的産物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質をコードし、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンとして有用なｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質はスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、生物的産物は、ウイルスタンパク質をコードし、ｍＲＮＡワクチンとして有用なｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、生物的産物は、ワクシニアキャップ化酵素である。いくつかの実施形態では、生物的産物は、Ｏ－メチルトランスフェラーゼまたはＴ７ポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、生物的産物は小分子である。いくつかの実施形態では、小分子はヘムである。
いくつかの実施形態では、生物的産物は、目的の遺伝子から発現されるタンパク質の作用によって、直接的または間接的に、（全体的または部分的に）合成され、修飾され、および／または別の最終的な、またはより有用もしくは安定な形態に変換される小分子または大分子である。
いくつかの実施形態では、生物的産物は、ＲＮＡ（複数可）、タンパク質（複数可）、および／または大分子もしくは小分子のいずれか１またはそれを超えるものを含む複合体または超分子複合体であるか；または、生物的産物は、そのような複合体または超分子複合体の成分である。
いくつかの実施形態では、生物的産物は、生物変換プロセスに有用な成分（例えば、タンパク質、核酸、小分子または大分子など）である。
生物的産物の測定
生物的産物の生産量は、当業者によく知られているメトリックを使用して、最終産物または中間産物などの経路の任意の１つまたは複数の工程で評価され得る。生産は、当技術分野で公知の任意のメトリックによって、例えば、１またはそれを超える生物的産物の体積生産性、酵素速度論／反応速度、比生産性、バイオマス特異的生産性、力価、収率および総力価を評価することによって評価され得る。
いくつかの実施形態では、生産を測定するために使用されるメトリックは、連続プロセスが監視されているかどうか、または特定の最終産物が測定されているかどうかに依存し得る。例えば、いくつかの実施形態では、連続プロセスによる生産を監視するために使用されるメトリックは、体積生産性、酵素速度論、および反応速度を含み得る。いくつかの実施形態では、特定の産物の生産を監視するために使用されるメトリックは、１またはそれを超える生物的産物の比産生性、バイオマス特異的生産性、活性、力価および収率を含み得る。「体積生産性」または「生産速度」という用語は、単位時間当たりの媒体の体積当たり形成される産物量を指す。体積生産性は、グラム／リットル／時間（ｇ／Ｌ／ｈ）で報告することができる。
生物的産物は、当業者に公知の任意の手段によって測定することができることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、生物的産物は、例えば、単位時間当たりの単位バイオマス当たり産生された生物的産物の量を測定することによって決定され得る。例えば、生物的産物は、例えば、１時間当たりの発酵培地１リットル当たり産生される生物的産物（ｍｍｏｌ）で測定され得る。いくつかの実施形態では、本開示の転写単位もしくは合成発現系、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞は、少なくとも０．１ｍｍｏｌ、少なくとも１ｍｍｏｌ、少なくとも１．５ｍｍｏｌ、少なくとも２ｍｍｏｌ、少なくとも２．５ｍｍｏｌ、少なくとも３、少なくとも３．５ｍｍｏｌ、少なくとも４ｍｍｏｌ、少なくとも４．５ｍｍｏｌ、少なくとも５ｍｍｏｌ、少なくとも５．５ｍｍｏｌ、少なくとも６ｍｍｏｌ、少なくとも６．５ｍｍｏｌ、少なくとも７ｍｍｏｌ、少なくとも７．５ｍｍｏｌ、少なくとも８ｍｍｏｌ、少なくとも８．５ｍｍｏｌ、少なくとも９ｍｍｏｌ、少なくとも９．５ｍｍｏｌ、または少なくとも１０ｍｍｏｌの生物的産物を産生し得る。いくつかの実施形態では、本開示の転写単位もしくは合成発現系、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞は、約０．１～約０．６ｍｍｏｌ、約０．５～約１ｍｍｏｌ、約０．９～約１．４ｍｍｏｌ、約１．３～約１．８ｍｍｏｌ、約１．７～約２．５ｍｍｏｌ、約２．４～約２．９ｍｍｏｌ、約２．８～約３．３ｍｍｏｌ、約３．２～約３．７ｍｍｏｌ、約３．６～約４．１ｍｍｏｌ、約４～約４．５ｍｍｏｌ、約４．４～約４．９ｍｍｏｌ、約４．８～約５．３ｍｍｏｌ、約５．２～約５．７ｍｍｏｌ、約５．６～約６．１ｍｍｏｌ、約６～約６．５ｍｍｏｌ、約６．４～約６．９ｍｍｏｌ、約６．８～約７．３ｍｍｏｌ、約７．２～約７．７ｍｍｏｌ、約７．６～約８．１ｍｍｏｌ、約８～約８．５ｍｍｏｌ、約８．４～約８．９ｍｍｏｌ、約８．８～約９．３ｍｍｏｌ、約９．２～約９．７ｍｍｏｌ、または約９．６～約１０ｍｍｏｌの生物的産物を産生し得る。いくつかの実施形態では、本開示の転写単位もしくは合成発現系、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞は、約０．１～約３ｍｍｏｌ、約０．５～約４ｍｍｏｌ、約１～約４．５ｍｍｏｌ、約２～約５ｍｍｏｌ、約２．５～約５ｍｍｏｌ、約３～約７ｍｍｏｌ、約３．５～約７．５ｍｍｏｌ、約４～約８ｍｍｏｌ、約４．５～約９ｍｍｏｌ、約５～約１０ｍｍｏｌ、約６～約１０ｍｍｏｌ、約７～約１０ｍｍｏｌ、または約８～約１０ｍｍｏｌの生物的産物を産生し得る。
いくつかの実施形態では、生物的産物は、例えば、細胞によって産生される（任意の同一性の）全転写産物１００万個当たりの、細胞によって産生される生物的産物の転写産物の量を測定することによって決定され得る（例えば、「転写産物／１００万個」）。いくつかの実施形態では、本開示の転写単位もしくは合成発現系、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞は、１００万個当たり少なくとも３００個の転写産物、１００万個当たり少なくとも５００個の転写産物、１００万個当たり少なくとも１０００個の転写産物、１００万個当たり少なくとも５０００個の転写産物、１００万個当たり少なくとも１万個の転写産物、１００万個当たり少なくとも５万個の転写産物、１００万個当たり少なくとも１０万個の転写産物、１００万個当たり少なくとも３０万個の転写産物、１００万個当たり少なくとも４０万個の転写産物、１００万個当たり少なくとも５０万個の転写産物、または１００万個当たり少なくとも６０万個の転写産物の生物的産物を産生し得る。いくつかの実施形態では、本開示の転写単位もしくは合成発現系、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞は、１００万個当たり６０万個を超える転写産物の生物的産物を産生し得る。
いくつかの実施形態では、生物的産物は、例えば、本開示の合成発現系を含む宿主細胞によって産生された生物的産物の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）または量（ａｍｏｕｎｔ）を対照宿主細胞と比較することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、合成発現系は、対照宿主細胞において産生される生物的産物のレベルよりも高いレベルで、目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を提供する。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、目的の遺伝子に作動可能に連結されたメタノール誘導性プロモーター、例えばＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＰ（ＡＯＸ１）を含む細胞である。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、目的の遺伝子に作動可能に連結されたメタノール誘導性プロモーター、例えばＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＰ（ＡＯＸ１）を含む細胞である。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞によってコードされる目的の遺伝子は、メチロトローフ性宿主細胞によってコードされる同じ目的の遺伝子である。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞のメタノール誘導性プロモーターは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＰ（ＡＯＸ１）である。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、外因的に添加されたメタノールの存在下で培養される。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、合成発現系の目的の遺伝子と同じ目的の遺伝子に作動可能に連結されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＰ（ＡＯＸ１）を含む細胞であり、外因的に添加されたメタノールの存在下で培養される。いくつかの実施形態では、外因的に添加されたメタノールはＰ（ＡＯＸ１）を誘導する。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞および合成発現系を含む宿主細胞は、同じ種のものである。
いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、本開示による転写単位または合成発現系を含むが、同一の転写単位または合成発現系を含む宿主細胞とは異なる（例えば、メタノール依存性）条件で培養され、宿主細胞は同じ種類である。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、転写単位または合成発現系を含む宿主細胞と同じまたは異なる条件で培養される内因性転写単位または発現系を含み、宿主細胞は同じ種類である。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、メタノール依存的様式で発現される転写単位または発現系を含む。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、野生型のＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、またはＰｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ細胞などの野生型細胞である。いくつかの実施形態では、対照宿主細胞は、異なる種類の宿主細胞で発現される転写単位または合成発現系と同一の転写単位または発現系を含む。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系または本開示の合成発現系を含む宿主細胞によって産生される生物的産物の濃度（または量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、量（ａｍｏｕｎｔ）など）は、対照宿主細胞の濃度の少なくとも１．１倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍高い。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を含む宿主細胞によって産生される生物的産物の濃度（または量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、量（ａｍｏｕｎｔ）など）は、合成発現系を含まない同じ宿主細胞よりも１００倍高い。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系または本開示の合成発現系を含む宿主細胞によって産生される生物的産物の濃度は、合成発現系を含む対照宿主細胞または合成発現系を含まない同じ宿主細胞の濃度よりも、約１．１～約４倍、約２～約１０倍、約５～約１５倍、約１０～約２０倍、約１５約３０倍、約２５～約４０倍、約３５～約５０倍、約４５～約６０倍、約５５～約７０倍、約７０～約９０倍、または約８５～約１００倍高い。
いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を含む宿主細胞によって産生される生物的産物のレベル（または濃度、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、量（ａｍｏｕｎｔ）など）は、対照宿主細胞のレベルよりも少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１０００％、少なくとも１１００％、少なくとも１２００％、少なくとも１３００％、少なくとも１４００％、少なくとも１５００％、少なくとも１６００％、少なくとも１７００％、少なくとも１８００％、少なくとも１９００％、少なくとも２０００％、少なくとも２１００％、少なくとも２２００％、少なくとも２３０００％、少なくとも２４００％、少なくとも２５００％、少なくとも２６００％、少なくとも２７００％、少なくとも２８００％、少なくとも２９００％、少なくとも３０００％、少なくとも３２００％、少なくとも３４００％、少なくとも３６００％、少なくとも３８００％、少なくとも４０００％、または少なくとも５０００％高い。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を含む宿主細胞によって産生される生物的産物のレベル（または濃度、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、量（ａｍｏｕｎｔ）など）は、対照宿主細胞のレベルよりも５０００％超高い。
いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系または本開示の合成発現系を含む宿主細胞によって産生される生物的産物のレベル（または濃度、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、量（ａｍｏｕｎｔ）など）は、対照宿主細胞のレベルよりも約１００％～約５００％、約３００％～約６００％、約３００％～約８００％、約５００％～約１０００％、約８００％～約１２００％、約８００％～約１５００％、約１０００％～約１５００％、約１０００％～約２０００％、約１２００％～約２０００％、約１５００％～約２０００％、約１８００％～約２５００％、約２０００％～約２５００％、約２２００％～約３０００％、約２５００％～約３０００％、約３０００％～約３５００％、約３５００％～約４０００％、約４０００％～約４５００％、または約４５００％～約５０００％高い。いくつかの実施形態では、本開示の転写単位もしくは合成発現系、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞は、少なくとも５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、少なくとも１５ｇ／Ｌ、少なくとも２０ｇ／Ｌ、少なくとも少なくとも２５ｇ／Ｌ、少なくとも３０ｇ／Ｌ、少なくとも３５ｇ／Ｌ、または少なくとも４０ｇ／Ｌの１またはそれを超える生物的産物を産生することができる。いくつかの実施形態では、本開示の転写単位もしくは合成発現系、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞は、４０ｇ／Ｌよりも多くの１またはそれを超える生物的産物を産生することができる。いくつかの実施形態では、本開示の転写単位もしくは合成発現系、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞は、約５ｇ／Ｌ～約１１ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約１３ｇ／Ｌ～約１９ｇ／Ｌ、約１７ｇ／Ｌ～約２３ｇ／Ｌ、約２１ｇ／Ｌ～約２７ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ～約３１ｇ／Ｌ、約２９ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、または約３３ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌの１またはそれを超える生物的産物を産生することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の転写単位もしくは合成発現系、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞は、メタノール非依存性条件下で少なくとも５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、少なくとも２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、少なくとも３０ｇ／Ｌ、少なくとも３５ｇ／Ｌ、または少なくとも４０ｇ／Ｌの１またはそれを超える生物的産物を産生することができる。いくつかの実施形態では、本開示の転写単位もしくは合成発現系、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞は、メタノール非依存性条件下で約５ｇ／Ｌ～約１１ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約１３ｇ／Ｌ～約１９ｇ／Ｌ、約１７ｇ／Ｌ～約２３ｇ／Ｌ、約２１ｇ／Ｌ～約２７ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ～約３１ｇ／Ｌ、約２９ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、または約３３ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌの１またはそれを超える生物的産物を産生することができる。いくつかの実施形態では、合成発現系の効力は、特定の培養期（例えば、増殖期、産生期など）で生成された生物的産物の量に基づいて評価される。増殖期に生成される過剰な生物的産物は、非特異的または「漏出性」プロモーター活性の指標であり得、これは望ましくない場合がある。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用して産生される生物的産物の量は、増殖期よりも産生期の方が多い。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用して産生期に産生される生物的産物の量は、対照宿主細胞によって産生期に産生され得る量よりも多い。
いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用して、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞を使用して産生期に産生される生物的産物の量は、対照宿主細胞によって産生期に産生され得る量よりも、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、または少なくとも５００％高い。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用して、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞を使用して産生期に産生される生物的産物の量は、対照宿主細胞によって産生期に産生され得る量よりも、５００％超高い。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用して、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞を使用して産生期に産生される生物的産物の量は、対照宿主細胞によって産生期に産生され得る量よりも、約８０％～約１２０％、約１１０％～約１５０％、約１４０％～約１８０％、約１７０％～約２２０％、約２１０％～約２６０％、約２５０％～約３００％、約２９０％～約３４０％、約３３０％～約３８０％、約３７０％～約４２０％、約４１０％～約４６０％、または約４５０％～約５００％高い。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用して、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞を使用して産生期に産生される生物的産物の量は、対照細胞または合成発現系を含まない同じ宿主細胞によって産生期に産生され得る量よりも、約１％～約１００％、約５０％～約１５０％、約１００％～約２００％、または約１５０％～約２００％多い。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用して産生される生物的産物の量は、産生期よりも増殖期の方が少ない。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用して増殖期に産生される生物的産物の量は、対照宿主細胞によって増殖期に産生される量よりも少ない。
いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用して、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞を使用して増殖期に産生される生物的産物の量は、対照細胞または合成発現系を含まない同じ宿主細胞によって増殖期に産生される生物的産物よりも少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、または少なくとも５００％少ない。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用して、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞を使用して増殖期に産生される生物的産物の量は、対照細胞または合成発現系を含まない同じ宿主細胞によって増殖期に産生される生物的産物よりも、約８０％～約１２０％、約１１０％～約１５０％、約１４０％～約１８０％、約１７０％～約２２０％、約２１０％～約２６０％、約２５０％～約３００％、約２９０％～約３４０％、約３３０％～約３８０％、約３７０％～約４２０％、約４１０％～約４６０％、または約４５０％約５００％少ない。
いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞の効率は、増殖期に発現される生物的産物と産生期に発現される生物的産物との比（例えば、１：１、１：２、１：３など）として表され得る。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用するか、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞を使用して、増殖期に発現される生物的産物と産生期に発現される生物的産物との比は、約１：１．１、約１：１．２、約１：１．３、約１：１．４、約１：１．５、約１：１．６、約１：１．７、約１：１．８、約１：１．９、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、約１：１１０、約１：１３０、約１：１３０、約１：１４０、約１：１５０、約１：１６０、約１：１７０、約１：１８０、約１：１９０、または約１：２００（またはその中に含まれる任意の比）である。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用するか、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞を使用して、増殖期に発現される生物的産物と産生期に発現される生物的産物との比は、約１：１．１～約１：１０、約１：９．５～約１：２０、約１：１０～約１：４０、約１：３０～約１：６０、約１：５０～約１：８０、約１：７０～約１：１００、約１：１００～約１：１４０、約１：１４０～約１：１７０、約１：１６０～約１：１９０、または約１：１８０～約１：２００である。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系を使用するか、または本開示の転写単位もしくは合成発現系を含む宿主細胞を使用して、増殖期に発現される生物的産物と産生期に発現される生物的産物との比は、約１：１０～約１：５０、約１：２５～約１：７５、約１：５０～約１：１００、約１：７５～約１：１２５、約１：１００～約１：１５０、または約１：１５０～約１：２００である。
いくつかの実施形態では、本出願に記載される方法のいずれかは、目的の遺伝子の発現の産物（例えば、タンパク質および／または核酸）の単離および／または精製を含み得る。例えば、単離および／または精製は、細胞溶解、遠心分離、抽出、カラムクロマトグラフィー、蒸留、結晶化、および凍結乾燥の１またはそれを超えるものを含み得る。
任意の合成発現系、本出願に開示される合成発現系を発現する宿主細胞、または本出願に記載される任意のインビトロ方法によって産生された産物は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して同定、単離、抽出、および／または精製され得る。質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ）は、同定方法の非限定的な例であり、目的の化合物の化学組成および／または化学構造および／または濃度を分析するために使用され得る。
無細胞発現
いくつかの実施形態では、本開示の転写単位または合成発現系は無細胞発現系の成分である。いくつかの実施形態では、本開示の転写単位または合成発現系を利用して、無細胞発現系で１またはそれを超える生物的産物が産生される。例示的な無細胞発現系には、大腸菌（ＥＣＥ）、ウサギ網状赤血球（ＲＲＬ）、小麦胚芽（ＷＧＥ）、昆虫細胞（ＩＣＥ）または酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（Ｄ２Ｐ系）から作製された細胞抽出物が含まれる。
宿主細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、転写単位または合成発現系を含む宿主細胞を提供する。本開示の転写単位または合成発現系のいずれも、宿主細胞において使用され得る。
本出願に記載の転写単位または合成発現系は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して適切な宿主細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞ゲノムに組み込まれた転写単位または合成発現系を含む。いくつかの実施形態では、合成発現系は、第１の転写単位の１つのコピー；および第２の転写単位の１つのコピーを含む。第１の転写単位および第２の転写単位の量は、第２の転写単位に対する第１の転写単位の比として、または第１の転写単位に対する第２の転写単位の比として表され得る（すなわち、「コピー数の比」）。いくつかの実施形態では、第２の転写単位対第１の転写単位のコピー数の比は１：１である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、転写単位または合成発現系の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位または第２の転写単位は複数コピーで存在する。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位の両方とも、複数のコピーで存在する。いくつかの実施形態では、合成発現系は、２またはそれを超えるコピーの第１の転写単位；および／または２またはそれを超えるコピーの第２の転写単位を含む。いくつかの実施形態では、第２の転写単位対第１の転写単位のコピー数の比は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、または少なくとも３０：１である。いくつかの実施形態では、第１の転写単位対第２の転写単位のコピー数の比は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、または少なくとも３０：１である。
いくつかの実施形態では、宿主ゲノム内に、第１の転写単位は単一コピーで存在し、第２の転写単位は複数コピーで存在する。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、宿主細胞にとって内因性である１またはそれを超える配列を含む。
「宿主細胞」は、転写単位または合成発現系およびその前駆体を発現するために使用することができる細胞を指す。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｋｕｒｔｚｍａｎｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｍｏｎｄａｖｉｏｒｕｍ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、またはＰｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、転写単位または合成発現系が導入される特定の組換え宿主だけでなく、そのような宿主細胞の子孫または潜在的子孫も指すことが理解される。本出願で使用される「細胞」という用語は、単一の細胞または細胞の集団、例えば同じ細胞株または株に属する細胞の集団を指し得る。単数形の用語「細胞」の使用は、細胞の集団ではなく単一の細胞を明示的に指すと解釈されるべきではない。
真核細胞または原核細胞を含む、任意の適切な宿主細胞を使用して、本出願に開示される転写単位または合成発現系を発現させることができる。適切な宿主細胞には、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はメチロトローフ性である。「メチロトローフ性細胞」は、その成長のための炭素源としてメタノールまたはメタンなどの還元された１炭素化合物、およびジメチルエーテルおよびジメチルアミンなどの炭素－炭素結合を含まない多炭素化合物を利用する能力を自然に（すなわち、人間による任意の操作の前に）有するものである。メチロトローフ性細胞は当技術分野で公知であり、例えば、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、およびＣａｎｄｉｄａ属のものが挙げられる。天然にメチロトローフ性である宿主細胞、例えばＰｉｃｈｉａ属、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、またはＣａｎｄｉｄａ属のものなどであるが、例えば操作によってメタノールを利用することができなくなった宿主細胞は、本開示の目的に関してメチロトローフ性宿主細胞であると依然として考えられる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ属、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｍａｇｎｕｓｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｏｇａｔａｅ属、Ｐｈａｆｆｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｔａｒｍｅｒａ属、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ属、Ｓｕｇｉｙａｍａｅｌｌａ属、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｃｕｓ属、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ属、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ属、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、もしくはＺｙｇｏａｓｃｕｓ属のメンバー；またはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ Ｃｌａｄｅ、Ｐｈａｆｆｏｍｙｃｅｓ Ｃｌａｄｅ、Ｄｉｐｏｄａｓｃａｃｅａｅ、Ｐｈａｆｆｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、もしくはＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｃａｃｅａｅのメンバーのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属のメンバーである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｋｕｒｔｚｍａｎｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｍｏｎｄａｖｉｏｒｕｍ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ ａｎｏｍａｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ ｇｌｕｃｏｚｙｍａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｌａｎｋｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｏｒｂａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｅｔｒｏｈｕｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｎｔｊａｃｏｂｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｒｂｏｘｙｌｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｍａｇｎｕｓｉｏｍｙｃｅｓ ｍａｇｎｕｓｉｉ、Ｐｈａｆｆｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｌｌｅｎｓｉｓ、Ｐｈａｆｆｏｍｙｃｅｓ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｈａｆｆｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｓｕｇｉｙａｍａｅｌｌａ ｓｍｉｔｈｉａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｅｔａｓｏｓｐｏｒｕｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ ｄｏｍｅｒｃｑｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、またはＺｙｇｏａｓｃｕｓ ｈｅｌｌｅｎｉｃｕｓのいずれかである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＰｉｃｈｉａまたはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａの説明されていない種である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＰｉｃｈｉａ種またはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ種である。
いくつかの実施形態では、酵母株は工業用酵母株である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は真菌細胞である。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ種、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ種、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ種、Ｓｏｒｄａｒｉａ種、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ種、Ａｌｌｏｍｙｃｅｓ種、Ｕｓｔｉｌａｇｏ種、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ種、またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞を含む。
いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本開示は、科学文献のいくつかの報告では、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓをＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属に再割り当てし、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの様々な株がＫ．ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＫ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓに分離されたことに留意する。いくつかの実施形態では、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉと同一であり、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉは、その旧種名Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓで呼ばれることがある。本開示で使用される場合、Ｐｉｃｈｉａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓと交換可能である。これらの様々な属および種、ならびにそれらの間の関係は、科学文献、例えば、Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０２０ Ｙｅａｓｔ ３７（２）：２３７－２４５；Ｄｅ Ｓｃｈｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２７（６）：５６１－５６６；Ｈｅｉｓｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３８ Ｉｓｓｕｅ ２ ｅ００３９８－１７；Ｋｕｒｔｚｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００５），５５：９７３－９７６；Ｋｕｒｔｚｍａｎ ２０１１ Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ ９９：１３－２３；Ｋｕｒｔｚｍａｎ ２０１３ Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ １０４：３３９－３４７；Ｋｕｒｔｚｍａｎ ２０１２．Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ １０１：８５９－８６８；Ｎａｕｍｏｖ ２０１８ Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ １１１：１１９７－１２０７；およびＹａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９－４４４に記載されている。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）などの藻類細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。適切な原核細胞には、グラム陽性、グラム陰性、およびグラム可変細菌細胞が含まれる。
本開示の実施において宿主細胞として使用され得る様々な株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などの多数の培養コレクションから容易に入手可能である。
宿主細胞は、転写単位を有することに加えて、野生型対応物に対する遺伝子改変を含み得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、１またはそれを超える内因性遺伝子を減少または不活性化するように改変される。遺伝子発現および／または遺伝子不活性化の低減は、遺伝子の欠失、遺伝子への点突然変異の導入、遺伝子の切断、遺伝子への挿入の導入、タグの導入もしくは遺伝子への融合、または遺伝子の選択的編集を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法によって達成され得る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を使用してもよく（例えば、Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；１２０５：４５－７８を参照）、または遺伝子編集技術を使用してもよい。非限定的な例として、遺伝子は、遺伝子置換（例えば、選択マーカーを含むマーカーを用いる）によって欠失され得る。遺伝子はまた、トランスポゾンシステム（例えば、Ｐｏｕｓｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５；３３（１２）：ｅ１０４を参照）の使用によって切断され得る。
本開示の転写単位または合成発現系は、宿主細胞ゲノム内で様々な方法で構成することができることが当業者によって理解されよう（例えば、同じまたは異なるポリヌクレオチド配列上に；同じまたは異なる染色体上に；第１および第２の転写単位のプロモーターによって媒介される転写の一次方向に対して５’または３’方向に向けられる）。
いくつかの実施形態では、合成発現系（例えば、第１の転写単位および第２の転写単位を含む）は、単一のプラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、単一のプラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、合成発現系は２またはそれを超える（例えば、異なる）プラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、２またはそれを超える（例えば、異なる）プラスミド上に位置する。例えば、いくつかの実施形態では、第１の転写単位は第１のプラスミド上に位置し、第２の転写単位は第２のプラスミド上に位置する。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、宿主細胞ゲノム内の単一の染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、合成発現系の成分は、宿主細胞ゲノム内の２またはそれを超える（例えば、異なる）の染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、宿主細胞ゲノム内の同じ染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、合成発現系は、宿主細胞ゲノム内の２またはそれを超える（例えば、異なる）の染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、宿主細胞ゲノム内の２またはそれを超える（例えば、異なる）染色体上に位置する。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、同じ方向に向けられている（例えば、第１および第２の転写単位のプロモーターによって媒介される転写の一次方向に対して同じ５’または３’方向に向けられる）。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、異なる方向（例えば、第１および第２の転写単位のプロモーターによって媒介される転写の一次方向に対して５’または３’方向）に向けられている。いくつかの実施形態では、複数の異なる第１の転写単位および／または第２の転写単位が宿主細胞内に存在し得、それらは互いに対して任意の向きにあり得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は合成タンパク質発現のために操作され得、そのような操作は、合成発現系を含む１またはそれを超えるポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換することを含む。本開示の任意の合成発現系を使用することができる。
宿主細胞は、本開示に記載される培養条件を含むがこれらに限定されない任意の適切な条件下で培養され得る。例えば、当技術分野で公知の任意の培地、温度およびインキュベーション条件を使用することができる。例示的な培養条件が本開示に提供され、メタノール非依存性条件が含まれる。誘導性ベクターを有する宿主細胞の場合、細胞は、発現を促進するために適切な誘導剤と共に培養され得る。
宿主細胞における目的の遺伝子の発現
本開示は、宿主細胞における合成発現系による目的の遺伝子の発現を包含する。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子が宿主細胞において発現される方法は、宿主細胞を培養することを含む。宿主細胞は、本開示の任意の宿主細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、発現される目的の遺伝子は合成である。いくつかの実施形態では、宿主細胞に導入される目的の合成遺伝子は、宿主細胞とは異なる生物、属または種に由来するポリヌクレオチド；または合成、操作されたもしくはキメラのポリヌクレオチド、または宿主細胞と同じ生物もしくは種で同様に内因的に発現されるが変化しているポリヌクレオチドであり得る。例えば、宿主細胞内に内因的に存在するポリヌクレオチドは、宿主細胞内に非天然に位置するように変更されている場合；宿主細胞において安定的または一過性のいずれかで組換え発現される場合；宿主細胞内で改変される場合；宿主細胞内で選択的に編集される場合；宿主細胞内の天然に存在するコピー数とは異なるコピー数で発現される場合；または、ポリヌクレオチドの発現を制御する調節領域を操作することなどによって宿主細胞内で非天然の方法で発現される場合、合成とみなされ得る。
いくつかの実施形態では、目的の合成遺伝子は、宿主細胞に内因的に存在するが、その発現がポリヌクレオチドの発現を天然に調節しないプロモーターによって駆動されるポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、目的の合成遺伝子は、宿主細胞に内因的に存在し、その発現がポリヌクレオチドの発現を天然に調節するプロモーターによって駆動されるポリヌクレオチドであり、プロモーターは改変されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは組換えによって活性化または抑制される。例えば、遺伝子編集に基づく技術を使用して、内因性プロモーターを含むプロモーターからの内因性ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの発現を調節することができる。例えば、Ｃｈａｖｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１６ Ｊｕｌ；１３（７）：５６３－５６７を参照のこと。目的の合成遺伝子は、参照ポリヌクレオチド配列と比較してバリアント配列を含んでもよく；または、野生型配列を含んでもよいがゲノム内の野生型状況にはあり得ない（例えば、通常は発現されない、宿主細胞において／宿主細胞によって、または染色体位置において、発現される野生型配列）。
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ヘム結合タンパク質またはヘム生合成経路の１またはそれを超える酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ヘム結合タンパク質は、ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビン、サイトグロビンまたはレグヘモグロビンである。いくつかの実施形態では、ヘム結合タンパク質はミオグロビンである。いくつかの実施形態では、ヘム生合成経路の１またはそれを超える酵素は、シトクロムＰ４５０、９－アデニル酸シクラーゼ、可溶性グアニル酸シクラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、および／またはシトクロムオキシダーゼである。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ワクシニアキャップ化酵素、Ｔ７ポリメラーゼ酵素またはＯ－メチルトランスフェラーゼ酵素をコードする。
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子のコード配列は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｋｕｒｔｚｍａｎｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｍｏｎｄａｖｉｏｒｕｍ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、またはＰｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａを含むがこれらに限定されない特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得る。
宿主細胞の培養
いくつかの実施形態では、本開示は、転写単位または合成発現系を含む宿主細胞に関し、宿主細胞が培養されると、宿主細胞内の単位または系は生物的産物（例えば、目的の分子）を産生することができる。いくつかの実施形態では、生物的産物はバイオマスまたは培養物から得られる。いくつかの実施形態では、生物的産物を得ることは、生物的産物をバイオマスから抽出することを含む。いくつかの実施形態では、生物的産物を得ることは、培養培地から生物的産物を回収することを含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞を培養することによって目的の遺伝子を発現させる工程、目的の遺伝子によってコードされる酵素を精製する工程、および目的の分子への基質の生物変換のために、精製された酵素を使用する工程を含む、生物的産物を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、目的の分子はヘムである。
本出願に開示される合成発現系を含む宿主細胞のいずれも、生物的産物の産生のタイミングおよび／またはレベルを制御するために、当技術分野で公知の任意の方法および任意の種類の培地（例えば、豊富および／または最小および／または栄養素制限など）を用いて培養することができる。
いくつかの実施形態では、培養はいくつかのフェーズにわたって行うことができ、目的の遺伝子の発現または高発現が毒性を引き起こし、および／または他の方法で細胞増殖を低下させる可能性があるので、後のフェーズ、例えば産生期まで目的の遺伝子の発現を制限することが望ましい場合がある。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本開示は、比較的厳密に制御された遺伝系であっても、目的の遺伝子の低レベルまたは基礎レベルの発現が産生期の前に起こり得るが、そのような発現が毒性をもたらす場合、細胞および合成発現系は、発現を技術的に実行可能な限り低いレベルに低下させる条件下で維持され得ることに留意する。
非限定的な例として、合成発現系を含む宿主細胞の培養条件は、インプットプロモーターが誘導され、転写因子および合成アウトプットプロモーターの作用を介して、目的の遺伝子の高レベルの発現が達成されるように、産生期に変更することができる。
いくつかの実施形態では、産生期中の栄養素の制限または培養条件の別の変更によってインプットプロモーターを活性化させて、プロモーターを誘導し、目的の遺伝子の発現を増加させることができる。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の発現は、第２の栄養素の添加によってさらに増加させることができる。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは誘導性ではなく、および／または栄養素の制限もしくは培養条件の別の変更によって活性化することができず、構成的に活性である。
いくつかの実施形態では、本出願に開示される合成発現系を含む宿主細胞は、メタノール非依存性培地中で、またはメタノール非依存性方法を使用して培養される。培地、培養条件、転写単位、合成発現系などに関する「メタノール非依存性」または「メタノール非含有」は、外因性メタノールが培地に添加されていないことを意味する。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本開示は、いくつかの培養条件下では、いくつかの宿主細胞が少量のメタノールを内因的に産生し得るが、そのようなメタノールは、培地がメタノール非含有であるか否かを考慮する際に無視されることに留意する。「メタノール非依存性」とは、合成発現系が培地に添加された外因性メタノールとは無関係に宿主細胞内で作動し、外因性メタノールの添加は合成発現系の機能に必要ではないことを意味する。一部の培養条件下で、一部の宿主細胞が少量のメタノールを内因的に産生し得るという事実は、系がメタノール非依存性であるかメタノール依存性であるかを考慮する際に無視される。
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子を発現させるかまたは目的の分子を産生する方法であって、（ａ）宿主細胞を、本開示の方法に従って、細胞増殖を可能にする期間にわたって適切な培地中で培養する工程、および（ｂ）１またはそれを超える培養条件を変更して目的の遺伝子の発現または目的の分子の産生を促進する工程を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、培養条件を変更することは、培養培地の組成を変更することを含む。いくつかの実施形態では、培養条件を変更することは、チアミン、グリセロール、１またはそれを超える単糖類、および／またはギ酸などの栄養素を制限または枯渇させることを含む。いくつかの実施形態では、培養条件を変更することは、炭素源、糖、デンプン、ガラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、イノシトール、グリセロール、ビタミン、ステロイド、窒素源、硝酸、亜硝酸、アンモニウム、アミノ酸、メチオニン、重金属、銅、安息香酸、過酸化水素、カルシウム含有化合物、および／またはリン酸のいずれかを制限することを含む。いくつかの実施形態では、培養条件を変更することは、任意の２つの栄養素の組み合わせの制限を含む。いくつかの実施形態では、培養条件を変更することは、ギ酸を添加することを含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系を含む宿主細胞の培養は、いくつかのフェーズまたは段階にわたって行われる。「段階（ｓｔａｇｅ）」および「期・フェーズ（ｐｈａｓｅ）」という用語は、本出願では互換的に使用される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞の培養は、段階Ｉ、段階ＩＩ、および段階ＩＩＩの段階にわたって行われる。
いくつかの実施形態では、段階Ｉ（バッチ期としても知られる）において、新鮮な滅菌培地に、合成発現系を含む宿主細胞を最初に接種する。増殖期間の後、段階Ｉからの培養物は次のフェーズの準備ができている。
いくつかの実施形態では、段階ＩＩ（細胞増殖期としても知られる）において、培養物が増殖し、バイオマスが増加する。いくつかの実施形態では、段階ＩＩの少なくとも一部において、細胞増殖は指数関数的である。
いくつかの実施形態では、段階ＩＩＩ（産生期または誘導期としても知られる）において、合成発現系は、まだ誘導されていない場合、目的の遺伝子を発現するように誘導される。いくつかの実施形態では、合成発現系は、段階Ｉまたは段階ＩＩでは誘導されず、段階ＩＩＩの間に誘導され、目的の遺伝子の高発現を可能にする。いくつかの実施形態では、産生期の間に、追加の成分が培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、追加の成分は栄養素である。いくつかの実施形態では、追加の成分は、インプットプロモーターからの発現をさらに増加させる。いくつかの実施形態では、追加の成分は、ギ酸またはメタノールである。
様々な段階は、同じまたは異なる増殖培地、体積、持続時間、温度（例えば、３０°Ｃ、３５°Ｃ、３７°Ｃ、または４２°Ｃ）、ｐＨレベル（例えば、酸性、わずかに酸性、中性、わずかに塩基性または塩基性）、撹拌レベル、通気レベル、溶存酸素レベル、制限栄養素、添加栄養素のレベルおよび／または濃度および／または流量、条件などを使用して行うこともできる。
当技術分野で知られているように、また培養体積および細胞密度の差に適切であるように、様々な段階は任意の容器で起こり得、同じタイプまたはサイズの容器で起こる必要はない。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、工業規模のプロセスで培養することができる。いくつかの実施形態では、工業規模のプロセスは、連続的、半連続的または非連続的なモードで運転される。動作モードの非限定的な例は、バッチ、供給バッチ、延長バッチ、反復バッチ、吸引／充填、回転壁、紡糸フラスコ、および／または灌流動作モードである。
いくつかの実施形態では、バイオリアクタ、発酵槽、または他の容器は、反応パラメータを測定および／または調整するためのセンサおよび／または制御システムを備える。反応パラメータの非限定的な例には、生物学的パラメータ（例えば、増殖速度、細胞サイズ、細胞数、細胞密度、細胞タイプ、または細胞状態など）、化学的パラメータ（例えば、ｐＨ、酸化還元電位、反応基質および／または生成物の濃度、溶存ガスの濃度、栄養素濃度、代謝産物濃度など）、物理的／機械的パラメータ（例えば、密度、導電率、撹拌の程度、圧力、および流量など）が含まれる。
培地は、限定するものではないが、カリウム、一塩基性リン酸カリウム、アンモニウム、硫酸アンモニウム、カルシウム、硫酸カルシウム二水和物、硫酸カリウム、マグネシウム、硫酸マグネシウム七水和物、微量金属、ＰＴＭ４溶液、銅、硫酸銅（ＩＩ）五水和物、ヨウ化ナトリウム、マンガン、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物、ナトリウム、モリブデン、モリブデン酸ナトリウム二水和物、ホウ酸、コバルト、塩化コバルト（ＩＩ）（無水）、亜鉛、塩化亜鉛（無水）、鉄、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、ビオチン、硫酸塩、硫酸、水および他の任意の栄養素（存在してもよく、豊富に存在してもよく、過剰に存在してもよく、または制限されてもよい（例えば、栄養素は、培地に存在しないか、または外因的に添加されない）を含む様々な成分のいずれかを含み得る。培地は、当技術分野で公知の任意の方法によって滅菌することができる。いくつかの実施形態では、培養培地は炭素源を含む。いくつかの実施形態では、発酵中（例えば、段階Ｉおよび／または段階ＩＩなどの増殖期）の炭素源（複数可）は、グルコース；グリセロールおよび／またはソルビトール；またはグリセロールおよび／またはソルビトールである。培養培地の種々の非限定的な例を実施例に記載する。様々な容器、目的、および宿主細胞に適した様々な培養培地は、本明細書に記載されており、および／または当技術分野で一般的に知られている。
以下に詳述するように、いくつかの実施形態では、（例えば、合成発現系における）インプットプロモーターは誘導性である（例えば、栄養素の枯渇によって誘導することができる）。いくつかの実施形態では、栄養素は、段階Ｉおよび段階ＩＩ（例えば、インプットプロモーターが誘導されない場合）では豊富にまたは過剰に存在するが、段階ＩＩＩ（例えば、インプットプロモーターが誘導され、目的の遺伝子が高度に発現される場合）では限定される。いくつかの実施形態では、栄養素は、段階Ｉおよび／または段階ＩＩ（例えば、インプットプロモーターが誘導されない場合）ではボーラスとして添加されるが、段階ＩＩＩでは制限される。いくつかの実施形態では、栄養素は枯渇され得る。
「制限」とは、栄養素または他の培養添加物が、外因的に添加されるのと等しいかまたはそれより速い速度で消費されることを意味する。「枯渇」は、外因的に添加される栄養素または他の培養添加物が部分的または完全に消費されることを意味する。
場合によっては、制限栄養素は炭素を含む。したがって、「栄養素制限」（および同様の語句）は、「炭素制限」とも称され得る。いくつかの実施形態では、（例えば、産生期中に）栄養素を制限する行為は、誘導と称される。いくつかの実施形態では、栄養素の制限条件は、栄養素が完全に存在しないことを必要としない。
いくつかの実施形態では、枯渇または制限され得る栄養素は、イノシトール、メチオニン、リン酸、グルコース、グリセロールまたはチアミンである。いくつかの実施形態では、栄養素の制限または枯渇の条件において、栄養素は培養培地中に（例えば、低レベルまたは中レベルで）提供または供給されるが、宿主細胞は供給されるよりも速い速度で栄養素を消費するので、培養培地中に利用可能な遊離（または検出可能）レベルの栄養素が存在しない。
いくつかの実施形態では、栄養素の制限ではない条件において、栄養素は、培養培地中に（例えば、高レベルまたは過剰で）提供または供給され、宿主細胞は供給されるよりも遅い速度で栄養素を消費するので、培養培地中に利用可能な遊離（または検出可能）レベルの栄養素が存在する。
任意の特定の細胞密度またはバイオマス密度で、宿主細胞の基本的な知識（ならびにその生化学および増殖パターン）を有しており合成発現系を理解している当業者は、所望に応じて、栄養素が制限または枯渇している条件、または栄養素が制限されていない条件を達成するために、特定の栄養素を培養培地に供給する速度を計算、予測、および／または監視することができる。
いくつかの実施形態では、培養プロセスは、栄養素が過剰に維持されるバッチ期と、過剰レベルの栄養素を維持するために培養物が段階的に供給されるフェドバッチ期とを含む。いくつかの実施形態では、溶存酸素レベルは、栄養レベルの指標を提供することができる。例えば、栄養素の枯渇は溶存酸素の増加をもたらし得、そのような増加はフェドバッチ期を引き起こし得、培養物は過剰レベルの栄養素を維持するために段階的に供給される。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはグルコースの枯渇によって誘導され、グルコースの枯渇は突然の溶存酸素スパイクを誘発し得る。いくつかの実施形態では、バッチ期は段階Ｉの最後の部分と考えることができ、段階ＩＩにおいてフェドバッチ期が続く。いくつかの実施形態では、バッチ期は段階ＩＩの第１の部分と考えることができ、段階ＩＩの第２の部分においてフェドバッチ期が続く。
本開示の態様は、メタノール非依存性発酵条件における目的の遺伝子から発現されるタンパク質および／または核酸の産生に関する。いくつかの実施形態では、第１の転写単位のインプットプロモーターおよび／または第２の転写単位のアウトプットプロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、メタノールの非存在下で応答性（例えば、誘導性）である。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、同族培養プロセスに関する栄養素制限、添加、または枯渇に応答する。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはチアミン枯渇に応答性である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはグリセロール枯渇に応答性である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはグルコース制限に応答性である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはギ酸制限に応答性である。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは単糖制限に応答性である。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、炭素源、糖、デンプン、ガラクトース、マルトース、グルコース、デキストロース、ソルビトール、イノシトール、グリセロール、メチオニン、ビタミン、リン酸、ステロイド、窒素源、硝酸、亜硝酸、アンモニウム、アミノ酸、メチオニン、金属（例えば、重金属）、銅、安息香酸、過酸化水素、カルシウム含有化合物、アルコール、メタノール、テトラサイクリン、ステロイドおよび／またはリン酸の制限に応答する。様々な誘導性プロモーターが当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、栄養素、抗生物質、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、糖、デンプン、ガラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、イノシトール、グリセロール、ギ酸、ビタミン、ステロイド、窒素源、硝酸、亜硝酸、アンモニウム、アミノ酸、メチオニン、イオン、ナトリウムおよび／またはリン酸のいずれかの存在または添加（例えば、培地への過剰の添加）に応答する。
いくつかの実施形態では、単一の制限栄養素が使用される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、（例えば、合成発現系を含む宿主細胞の培養の産生期の間の）栄養素の組み合わせ（例えば、２つの栄養素、または２つよりも多くの栄養素）の制限に応答する。いくつかの実施形態では、制限栄養素の組み合わせが使用される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、グリセロール、グルコース、およびチアミンを含むがこれらに限定されない栄養素の組み合わせの制限に応答し、または組み合わせは、グリセロールおよびギ酸；グルコースおよびギ酸；またはグルコースおよびチアミンである。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの活性は、ギ酸の存在によって増加する。いくつかの実施形態では、プロモーターの応答は（例えば、一度誘導されると）活性化である。いくつかの実施形態では、プロモーターの応答は（例えば、一度誘導されると）抑制である。
いくつかの実施形態では、１つよりも多くの栄養素を制限または枯渇させることができ、単一の栄養素の制限または枯渇が制御された条件下で宿主細胞を培養するために有用な任意の方法または組成物を、２またはそれを超える栄養素の制限または枯渇が制御された条件下で宿主細胞を培養する際に使用するために組み合わせ、複製し、および／または変更することができる。
いくつかの実施形態では、産生期中に同時に制限される栄養素は、チアミンおよびグルコースである。いくつかの実施形態では、グルコースが制限されてよく、一方でチアミンは枯渇され得る。
いくつかの実施形態では、制限栄養素はイノシトールであり；発酵中（例えば、段階Ｉおよび／または段階ＩＩなどの増殖期）の炭素源（複数可）は、グルコース、グリセロールまたはソルビトールであり；インプットプロモーターＰ（ｉｎ）はＰ（ＩＮＯ１）である。
いくつかの実施形態では、制限栄養素はメチオニンであり；発酵中（例えば、段階Ｉおよび／または段階ＩＩなどの増殖期）の炭素源（複数可）は、グルコース、グリセロールまたはソルビトールであり；インプットプロモーターＰ（ｉｎ）はＰ（ＭＥＴ６）、Ｐ（ＳＡＨ１）、Ｐ（ＳＡＭ２）、またはＰ（ＭＸＲ１）である。
いくつかの実施形態では、制限栄養素はリン酸であり；発酵中（例えば、段階Ｉおよび／または段階ＩＩなどの増殖期）の炭素源（複数可）は、グルコース、グリセロールまたはソルビトールであり；インプットプロモーターＰ（ｉｎ）はＰ（ＰＨＯ８９）である。
いくつかの実施形態では、制限栄養素はグルコースであり；発酵中（例えば、段階Ｉおよび／または段階ＩＩなどの増殖期）の炭素源（複数可）はグリセロールまたはソルビトールであり；インプットプロモーターＰ（ｉｎ）は、本開示に記載の制限グルコースによって誘導可能な様々なプロモーターのいずれかである。
いくつかの実施形態では、制限栄養素はグリセロールであり；発酵中（例えば、段階Ｉおよび／または段階ＩＩなどの増殖期）の炭素源（複数可）はグルコースまたはソルビトールであり；インプットプロモーターＰ（ｉｎ）は、本開示に記載の制限グリセロールによって誘導可能な様々なプロモーターのいずれかである。
いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは化学的に調節されたプロモーターである。
いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、物理的に調節されるプロモーターであり、例えば、転写活性は、光（例えば、光の周波数、光の波長、光の明るさ、光の持続時間、光／暗サイクルなど）、温度（例えば、ヒートショックまたはコールドショックプロモーター）、圧力、重力、ｐＨ（酸性または塩基性条件）、塩分、または任意の他の物理的条件の変更を含むがこれらに限定されない培養条件の変更によって調節される。いくつかの実施形態では、合成発現系を含む宿主細胞の培養の産生期中に、インプットプロモーターが物理的に調節されたプロモーターである場合、産生期中に培養条件（例えば、光または温度）を変更してインプットプロモーターを活性化し、目的の遺伝子の高発現をもたらすことができる。
実施例１は、合成発現系の様々な非限定的な例、およびこれらの系を含む宿主細胞を培養し、生物的産物を発現させるのに有用な様々な培養条件（プロセス１、２、３）を示す。
表１は、合成発現系の非限定的な例の組み合わせの設計を示す。これらは、とりわけ、グリセロールが制限されてギ酸が添加されるプロセス１による製造プロセスに有用である。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、産生プロセスに関して同族である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、そのインプットプロモーターがプロセスにおいて特定の培養工程または培養条件（例えば、プロセス１の場合、グリセロール制限＋ギ酸添加；プロセス２の場合、グルコース制限＋ギ酸添加；およびプロセス３について、グルコース制限＋チアミン枯渇）のもとで活性化されるならば、特定の生産プロセス（例えば、プロセス１、プロセス２、またはプロセス３などの本明細書に記載されたプロセス）に関して同族である。
いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは、転写因子に関して同族である。いくつかの実施形態では、特定のアウトプットプロモーターは、転写因子がアウトプットプロモーターからの転写を活性化するという点で、特定の転写因子［例えば、転写因子（ＴＦ）または合成転写因子（ｓＴＦ）］に関して同族である。
いくつかの実施形態では、合成転写因子（ｓＴＦ）は、ｓＴＦの一部（例えば、ＤＮＡ結合ドメインまたはＴＡＤ）が野生型転写因子の対応する部分に由来し得るか、または野生型転写因子の対応する部分のバリアントであり得るという点で、野生型転写因子に基づくものとして記載される（例えば、ｓＴＦはＢｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦであってもよい）。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターは、アウトプットプロモーターがｓＴＦによって活性化され得るという点で、特定のｓＴＦに対して同族である（例えばそれに関して同族である）。非限定的な例では、ｓＴＦに対して同族の合成アウトプットプロモーターは、ｓＴＦのＤＮＡ結合ドメインによって結合されるオペレーターを含み得る。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス１に関して同族のインプットプロモーター（例えば表４に記載される）；１成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦ、表７；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１５；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス１に関して同族のインプットプロモーター（例えば表４に記載される）；１成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦ、表８；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１６；および目的の遺伝子を含む。ｐｈＩＦ＿ＡＭは、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１５：１９６に記載されるｐｈＩＦＡＭまたはそのバリアントもしくは誘導体を指す。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス１に関して同族のインプットプロモーター（例えば表４に記載される）；１成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ、表９；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＴｅｔＲベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１７；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス１に関して同族のインプットプロモーター（例えば表４に記載される）；１成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦ、表１０；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１８；および目的の遺伝子を含む。 ＶａｎＲ＿ＡＭは、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１５：１９６に記載されるＶａｎＲＡＭまたはそのバリアントもしくは誘導体を指す。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス１関して同族のインプットプロモーター（例えば表４に記載される）；２成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦ、表１１；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１５；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス１関して同族のインプットプロモーター（例えば表４に記載される）；２成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦ、表１２；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１６；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス１関して同族のインプットプロモーター（例えば表４に記載される）；２成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ、表１３；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＴｅｔＲベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１７；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス１関して同族のインプットプロモーター（例えば表４に記載される）；２成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦ、表１４；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１８；および目的の遺伝子を含む。
表２は、合成発現系の非限定的な例の組み合わせの設計を示す。これらは、とりわけ、グルコースが制限されてギ酸が添加されるプロセス２による製造プロセスに有用である。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス２関して同族のインプットプロモーター（例えば表５に記載される）；１成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦ、表７；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１５；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス２関して同族のインプットプロモーター（例えば表５に記載される）；１成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦ、表８；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１６；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス２関して同族のインプットプロモーター（例えば表５に記載される）；１成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ、表９；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＴｅｔＲベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１７；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス２関して同族のインプットプロモーター（例えば表５に記載される）；１成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦ、表１０；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１８；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス２関して同族のインプットプロモーター（例えば表５に記載される）；２成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦ、表１１；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１５；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス２関して同族のインプットプロモーター（例えば表５に記載される）；２成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦ、表１２；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１６；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス２関して同族のインプットプロモーター（例えば表５に記載される）；２成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ、表１３；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＴｅｔＲベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１７；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス２関して同族のインプットプロモーター（例えば表５に記載される）；２成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦ、表１４；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１８；および目的の遺伝子を含む。
表３は、合成発現系の非限定的な例の組み合わせの設計を示す。これらは、とりわけ、グルコースが制限されてチアミンが枯渇しているプロセス３による製造プロセスに有用である。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス３関して同族のインプットプロモーター（例えば表６に記載される）；１成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦ、表７；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１５；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス３関して同族のインプットプロモーター（例えば表６に記載される）；１成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦ、表８；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１６；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス３関して同族のインプットプロモーター（例えば表６に記載される）；１成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ、表９；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＴｅｔＲベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１７；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス３関して同族のインプットプロモーター（例えば表６に記載される）；１成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦ、表１０；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１８；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス３関して同族のインプットプロモーター（例えば表６に記載される）；２成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦ、表１１；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１５；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス３関して同族のインプットプロモーター（例えば表６に記載される）；２成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦ、表１２；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１６；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス３関して同族のインプットプロモーター（例えば表６に記載される）；２成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ、表１３；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＴｅｔＲベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１７；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、プロセス３関して同族のインプットプロモーター（例えば表６に記載される）；２成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦ、表１４；任意の転写ターミネーター、表１９；任意のスペーサー、表２０；ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、表１８；および目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｔｅｔ．１３．１０２．４；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｖａｎ．９．１０３．４；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．１２．９９．６；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｔｅｔ．１．１０６．４；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．７．１１．７；およびＰ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．５．１０７．４から選択される合成発現系に関連する組成物および方法；ならびに目的の遺伝子をさらに含む合成発現系に関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、プロセス１の下で培養され、Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｔｅｔ．１３．１０２．４；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｖａｎ．９．１０３．４；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．１２．９９．６；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｔｅｔ．１．１０６．４；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．７．１１．７；およびＰ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．５．１０７．４から選択される合成発現系を含む宿主細胞から生物的産物を産生する方法；ならびに目的の遺伝子をさらに含む合成発現系に関する。これらの合成発現系の様々な成分は詳細に記載されている。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．５．４０．８；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｂｍ．９．１１８．８；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．１２．２５．７；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．５．１０９．８；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｂｍ．１３．１００．７；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．１２．１７．９；およびＰ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．９．１０７．７から選択される合成発現系に関連する組成物および方法；ならびに目的の遺伝子をさらに含む合成発現系に関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、プロセス２の下で培養され、Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．５．４０．８；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｂｍ．９．１１８．８；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．１２．２５．７；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．５．１０９．８；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｂｍ．１３．１００．７；Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．１２．１７．９；およびＰ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．９．１０７．７から選択される合成発現系を含む宿主細胞から生物的産物を産生する方法；ならびに目的の遺伝子をさらに含む合成発現系に関する。これらの合成発現系の様々な成分は、本明細書に詳細に記載されている。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．５．４１．１０；およびＰ９６．ｓＴＦ．Ｂｍ．５．２３．１１から選択される合成発現系に関連する組成物および方法；ならびに目的の遺伝子をさらに含む合成発現系に関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、プロセス３の下で培養され、Ｐ９６．ｓＴＦ．Ｐｈｌ．５．４１．１０；およびＰ９６．ｓＴＦ．Ｂｍ．５．２３．１１から選択される合成発現系を含む宿主細胞から生物的産物を産生する方法；ならびに目的の遺伝子をさらに含む合成発現系に関する。これらの合成発現系の様々な成分は詳細に記載されている。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、配列番号１～１５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。これらの合成発現系において、いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、転写因子または転写因子の成分は、配列番号２６～４０または１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされ、転写因子または転写因子の成分は、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含み、および／または、アウトプットプロモーターは、配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、転写単位または発現系において使用することができる個々の成分（転写単位、インプットプロモーター、転写因子またはその成分、合成アウトプットプロモーター、目的の遺伝子、転写ターミネーター、スペーサーなど）を提供する。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むまたはそれからなるインプットプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、合成発現系は、配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むまたはそれからなるアウトプットプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、合成発現系は、配列番号２６～４０もしくは１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するか、または、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含むもしくはそれからなるポリヌクレオチドによってコードされる転写因子を含む。
転写単位
いくつかの実施形態では、本開示は、転写単位、または第１および第２の転写単位を含む合成発現系を提供する。いくつかの実施形態では、合成発現系は、転写因子（またはその少なくとも１つの成分）を含む第１の転写単位と、合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位とを含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、第２の転写単位の合成アウトプットプロモーターの活性化因子である。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、転写因子またはその成分をコードするポリヌクレオチドの上流に挿入部位（例えば、プロモーターの挿入に適した部位）を含む。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーターが転写因子またはその成分をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、それを発現することができるように、第１の転写単位の挿入部位に挿入することができる。
いくつかの実施形態では、第２の転写単位は、挿入部位（例えば、目的の遺伝子の挿入に適した部位）の上流にアウトプットプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、アウトプットプロモーターが目的の遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができるように、第２の転写単位の挿入部位に挿入することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、合成発現系または転写単位を含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは挿入部位を含む。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子は、挿入部位に挿入される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、目的のタンパク質の発現を促進する。
いくつかの実施形態では、挿入部位は、限定するものではないがプロモーターまたは目的の遺伝子を含むポリヌクレオチド（例えば、合成ポリヌクレオチドまたは外因性ポリヌクレオチド）の指向性挿入に適した核酸内の部位である。いくつかの実施形態では、挿入部位は１またはそれを超える制限酵素部位を含む。いくつかの実施形態では、挿入部位はマルチクローニング部位である。いくつかの実施形態では、マルチクローニング部位は、２またはそれを超える制限部位（例えば、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＸｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｗａＩ、ＡｓｉＳＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩＩ、ＮｈｅＩ、ＡｃｃＩなど）を含む核酸の短いスパンである。いくつかの実施形態では、挿入部位はランディングパッドである。いくつかの実施形態では、挿入部位はランディングパッドであり、ランディングパッドは、合成ポリヌクレオチドまたは外因性ポリヌクレオチド（例えば、プロモーターまたは目的の遺伝子）のリコンビナーゼ媒介挿入に適している。いくつかの実施形態では、挿入部位はマルチランディングパッド部位である。様々なランディングパッドおよびマルチランディングパッドが当技術分野で知られている（例えば、Ｌｅｏｎｉｄ Ｇａｉｄｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６（８）：４０７２－４０８６；Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１９ ＰＬＯＳ ＯＮＥ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ：Ｊｕｌｙ ２５，２０１９，Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ；およびＰｈａｎ ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐ．７：１７７７１）。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、１またはそれを超える以下の成分を含む：（ａ）転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、それを発現することができるインプットプロモーターを含む第１の転写単位、および（ｂ）第２の転写単位であって、目的の遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができる合成アウトプットプロモーター、および、必要に応じて、目的の遺伝子の下流の転写ターミネーターを含む第２の転写単位。
合成発現系の転写単位および他の成分に関する、本開示で使用される様々な用語および本発明の他の態様を以下にさらに詳述する。
本開示で使用される場合、いくつかの実施形態では、「転写単位」は、少なくとも１つのＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド（例えば、第１の転写単位中の転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチド；または第２の転写単位中の目的の遺伝子）の配列、ならびにそのインスタンス化に必要な配列、例えばプロモーターを指し；転写ユニットは、必要に応じて、転写ターミネーターおよび／または他の調節配列を含む。「転写単位」は、少なくとも１つのＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド（例えば、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチド）の配列、ならびにそのインスタンス化に必要な配列の挿入に適した部位（例えば、挿入部位）、例えばプロモーターを指し；転写ユニットは、必要に応じて、転写ターミネーターおよび／または他の調節配列を含む。いくつかの実施形態では、「転写単位」は、プロモーター（例えば、アウトプットプロモーター）および目的の遺伝子の挿入に適した部位（例えば、挿入部位）、ならびにそのインスタンス化に必要な配列、例えば必要に応じて、転写ターミネーターおよび／または他の調節配列を含むヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施形態では、転写単位はスペーサーをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーター、および／または、転写因子、転写因子の少なくとも１つの成分または目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、それによってコードされるタンパク質、例えば５’－ＵＴＲ（５’－非翻訳領域）、リーダー配列、および／または３’－ＵＴＲ（３’－非翻訳領域）、および／または１またはそれを超えるイントロンの発現、転写、および／または翻訳のための追加の配列を含む。
「合成転写単位」は、天然に存在しない転写単位を指す。「合成発現系」は、天然に存在しない発現系を指す。いくつかの実施形態では、合成転写単位または合成発現系は、天然に見られる１またはそれを超える配列に対して１またはそれを超える改変が行われたものであり、限定されないが、配列を再編成すること異なる起源の２つの配列間にキメラを作製すること（例えば、異なる種由来、または単一ゲノム内の異なる配置由来）；配列間の間隔を（例えば、異なる配列に結合するタンパク質が、それらの相互作用を改善するためにＤＮＡらせん上でより良好に回転的に整列するように）変更すること；ＤＮＡ結合配列を変更して、それらの配列へのタンパク質の結合を改善すること；発現または発現の制御を増加させるための点突然変異を導入すること；転写因子または他のポリペプチドの異なるドメインを置換または再編成すること；成分を再配置することまたは成分（例えば、オペレーター、エンハンサー、上流活性化配列など）をプロモーターに導入すること；通常は目的の特定の遺伝子の上流にあるプロモーターを異なるプロモーターで置き換えること；等を含む。いくつかの実施形態では、本開示の合成発現系は２またはそれを超える転写単位から構成される。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、目的の遺伝子を含む第２の転写単位を含み、目的の遺伝子は、宿主細胞において発現されることが望ましい［５’－ＵＴＲ、コードセグメント、３’－ＵＴＲ、任意のイントロン（複数可）、任意の翻訳エンハンサー、任意の翻訳ターミネーターなどの様々なシス作用成分に作動可能に連結されている］遺伝子である。目的の遺伝子は、例えば、目的のｍＲＮＡまたはタンパク質を産生するために発現され得る。いくつかの実施形態では、生物的産物は、目的の遺伝子から発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、生物的産物は、目的の遺伝子から発現されるタンパク質もしくはポリヌクレオチドによって直接的もしくは間接的に合成、修飾もしくは他の方法で作用される化合物または他の組成物である。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、転写因子を含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、インプットプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、転写因子またはその成分をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、転写を調節するインプットプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、転写ターミネーターをさらに含む。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、プラスミド上に存在する。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、転写ターミネーターを含む。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、転写因子またはその成分をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、転写を調節するインプットプロモーター（Ｐ（ｉｎ））および転写ターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、実施例１、実施例３、表２１、２８および３０～３６の核酸配列に対して、または配列番号７１～８５のいずれかの核酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であり、転写因子（例えば、転写活性化因子）またはその少なくとも１つの成分をコードすることができるポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、または第２の転写単位と組み合わせてプラスミド上に存在し、それにより合成発現系を含む。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位および第２の転写単位は、スペーサーによって分離されている。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約２～約３０塩基対、約２～約２５塩基対、約２～約２０塩基対、約２～約１０塩基対または約５～約１０塩基対を有するポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくとも７塩基対を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列ＧＣＴＴＡＣＡ（配列番号１６６）を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、第２の転写単位は合成アウトプットプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターは、目的の遺伝子に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は内因性である。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は宿主細胞にとって外因性である。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は合成である。いくつかの実施形態では、第２の転写単位は、転写ターミネーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の転写単位は、実施例１、実施例３、または表２１、２８、および３０～３６の核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ユーザ制御の培養条件によるインプットプロモーターの誘導は、第１の転写単位の転写を活性化する。いくつかの実施形態では、第１の転写単位の転写因子は、第２の転写単位の合成アウトプットプロモーターを活性化する。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターの活性化は、第２の転写単位の転写を活性化する。
プロモーター
本出願で使用される場合、「プロモーター」（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）は、ＤＮＡの配列のＲＮＡへの転写を指示するＤＮＡの調節領域を指す。いくつかの実施形態では、プロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）は、ＴＡＴＡボックスまたは特定のポリヌクレオチド配列の適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示することができる同様の配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）は、転写開始速度に影響を及ぼす、上流プロモーターエレメントと呼ばれる、ＴＡＴＡボックスの上流に常にではないが一般に位置する他の配列をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、プロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）は、上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含む。いくつかの実施形態では、プロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）は、コアプロモーターエレメントを含み、上流活性化配列（ＵＡＳ）を含まない。
特定の生物（例えば、酵母）では、プロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）は、遺伝子の開始コドンの最大１５００ｂｐ上流から、遺伝子の開始コドンの最初の塩基に隣接する塩基までに及ぶ配列を包含すると理解され得る。いくつかの実施形態では、５’－ＵＴＲ領域は、転写開始部位で始まり、開始コドンのすぐ上流で終わるｍＲＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、プロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）は、転写開始の＋１位から遺伝子の開始コドン（例えば、ＡＴＧ）に隣接する（すぐ上流の）塩基までの領域を含む５’－ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、プロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）は、コアプロモーターおよび５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、任意の特定のプロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）について、プロモーター配列の正確な５’および３’末端は、異なる情報源、科学的参考文献などによって異なって定義され得る。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で定義される任意のプロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）の任意の配列（例えば、添付の配列表における任意の配列、または表２１、２８および３０～３６に示される配列）に関する。
いくつかの実施形態では、プロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）は、配列番号１６～２５、５６～７０、もしくは１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチド、またはその機能的断片を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、プロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）は、配列番号１６～２５、５６～７０、もしくは１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有するポリヌクレオチド、またはその機能的断片を含むかまたはそれからなる。
プロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）の「断片」は、全長プロモーター配列未満の部分を指す。本開示のプロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）の「機能的断片」は、プロモーター配列の生物学的に活性な部分を指す。プロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）などの遺伝子調節エレメントの「生物学的に活性な部分」は、全長遺伝子調節エレメントの一部または断片を含み、全長遺伝子調節エレメントと同じまたは類似のタイプの活性を有し得るが、遺伝子調節エレメントの生物学的に活性な部分の活性のレベルは、全長遺伝子調節エレメントの活性のレベルと比較して変動し得る。
インプットプロモーター
いくつかの実施形態では、本開示は、第１の転写単位の一部として、インプットプロモーターの制御下にある転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドの発現を提供する。本出願で使用される場合、「インプットプロモーター」は、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、転写を活性化することができるプロモーターを指す。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、転写因子または転写因子の成分の発現を駆動する（例えば、それに作動可能に連結される）。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含む。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、コアプロモーターエレメントを含み、上流活性化配列（ＵＡＳ）を含まない。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは天然に存在する。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、天然に存在するプロモーターと少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは宿主細胞にとって内因性である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは宿主細胞にとって外因性である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは合成である。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位のインプットプロモーターは調節可能なインプットプロモーターである。本出願で使用される場合、「調節可能なインプットプロモーター」は、分子、栄養素、もしくは化合物の有無、または特定の物理的条件によって制御されるインプットプロモーターである。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは誘導性である。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは抑制性である。調節可能なインプットプロモーターは、例えば、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分の発現を制御可能に活性化（例えば、誘導）または抑制するために使用され得、転写因子は合成アウトプットプロモーターを活性化して目的の遺伝子を発現させる。理解されるように、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分の発現の「抑制」は、いくつかの実施形態において、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分の発現レベルを低下させることを含み得る。いくつかの実施形態では、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分の発現は完全に排除されてもよく、この用語が本開示で使用される場合、依然として「抑制されている」とみなされ得る。
調節可能なインプットプロモーターの非限定的な例としては、化学的に調節されたインプットプロモーターおよび物理的に調節されたインプットプロモーターが挙げられる。化学的に調節されたインプットプロモーターの場合、転写活性は、１またはそれを超える化合物、例えばアルコール（例えば、メタノール）、テトラサイクリン、ガラクトース、グリセロール、グルコース、マルトース、デキストロース、ソルビトール、イノシトール、メチオニン、ギ酸、リン酸、ステロイド、金属、栄養素、およびそれらの組み合わせによって調節され得る。いくつかの実施形態では、転写活性は、化合物またはそれらの組み合わせの添加または制限もしくは枯渇によって調節される。物理的に調節されたインプットプロモーターの場合、転写活性は、光、圧力、温度または他の因子の変更によって調節され得る。
テトラサイクリ調節プロモーターの非限定的な例としては、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーターおよび他のテトラサイクリン応答性プロモーター系（例えば、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）およびテトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質（ｔＴＡ））が挙げられる。ステロイド調節プロモーターの非限定的な例としては、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、モスエクジソン受容体に基づくプロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーからのプロモーターが挙げられる。金属調節プロモーターの非限定的な例としては、メタロチオネイン（金属イオンに結合して捕捉するタンパク質）遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。病原性調節プロモーターの非限定的な例としては、サリチル酸、エチレンまたはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）によって誘導されるプロモーターが挙げられる。温度／熱誘導性プロモーターの非限定的な例としては、ヒートショックプロモーターが挙げられる。光調節プロモーターの非限定的な例としては、植物細胞由来の光応答性プロモーターが挙げられる。
いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、メタノール誘導性インプットプロモーターである。本開示で使用される場合、「メタノール誘導性プロモーター」は、その活性が培養培地中のメタノールの存在によって実質的に増加するプロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）である。メタノール誘導性プロモーターが目的の遺伝子の発現を駆動するいくつかの実施形態では、「実質的な活性の増加」は、外因的に添加されたメタノールが培地中に存在する場合に、外因的に添加されたメタノールが培地中に存在しない場合と比較して、目的の遺伝子の１００万個当たり少なくとも２０倍多い転写産物が産生される場合である。
逆に、「メタノール誘導性プロモーターではない」プロモーターは、その活性が培養培地中のメタノールの存在によって実質的に増加しないプロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）である。メタノール誘導性プロモーターが目的の遺伝子の発現を駆動するいくつかの実施形態では、「非実質的な活性の増加」は、外因的に添加されたメタノールが培養培地中に存在しない場合と比較して外因的に添加されたメタノールが培養培地中に存在する場合に産生される目的の遺伝子の１００万個当たりの転写産物の差が２倍未満である場合である。
いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、メタノール非依存性条件で調節可能である。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、外因的に提供されるメタノールの非存在下で調節可能である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはメタノール誘導性ではない。いくつかの実施形態では、誘導性インプットプロモーターは、１またはそれを超える生理学的条件（例えば、ｐＨ、温度、放射線、浸透圧、生理食塩水勾配、細胞表面結合、または１またはそれを超える外因性もしくは内因性誘導剤の濃度）によって誘導される。外因性誘導因子または誘導剤の非限定的な例としては、アミノ酸およびアミノ酸類似体、糖類および多糖類、ポリヌクレオチド、タンパク質転写活性化因子および抑制因子、サイトカイン、毒素、石油系化合物、金属含有化合物、塩類、イオン、酵素基質類似体、ホルモン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
本開示の態様は、メタノール非依存性発酵条件における目的の遺伝子から発現されるタンパク質および／または核酸の産生に関する。いくつかの実施形態では、第１の転写単位のインプットプロモーターおよび／または第２の転写単位のアウトプットプロモーターは、調節可能なインプットプロモーターである。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、メタノールの非存在下で応答性（例えば、誘導性）である。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、同族培養プロセスに関する栄養素の添加、制限、または枯渇に応答する。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターはチアミン枯渇に応答性である。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターはグリセロール枯渇に応答性である。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターはグルコース制限に応答性である。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターはギ酸制限に応答性である。いくつかの実施形態では、調節可能な誘導性プロモーターは単糖制限に応答性である。いくつかの実施形態では、調節可能な誘導性プロモーターは、炭素源、糖、デンプン、ガラクトース、マルトース、グルコース、デキストロース、ソルビトール、イノシトール、グリセロール、メチオニン、ビタミン、リン酸、ステロイド、窒素源、硝酸、亜硝酸、アンモニウム、アミノ酸、メチオニン、金属（例えば、重金属）、銅、安息香酸、過酸化水素、カルシウム含有化合物、アルコール、メタノール、テトラサイクリン、ステロイドおよび／またはリン酸の制限に応答する。様々な調節可能なインプットプロモーターが当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、栄養素、抗生物質、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、糖、デンプン、ガラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、イノシトール、グリセロール、ギ酸、ビタミン、ステロイド、窒素源、硝酸、亜硝酸、アンモニウム、アミノ酸、メチオニン、イオン、ナトリウムおよび／またはリン酸のいずれかの存在または添加（例えば、培地への過剰の添加）に応答する。
いくつかの実施形態では、単一の制限栄養素が使用される。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、栄養素（例えば、２つの栄養素、または２つよりも多くの栄養素）の組み合わせの制限に応答する。いくつかの実施形態では、制限栄養素の組み合わせが使用される。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターは、グリセロール、グルコース、およびチアミンを含むがこれらに限定されない栄養素の組み合わせの制限に応答し、または組み合わせは、グリセロールおよびギ酸；グルコースおよびギ酸；またはグルコースおよびチアミンである。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターの活性は、外因的に提供されるギ酸の存在によって増加する。調節可能なインプットプロモーターの活性は、例えば、転写因子の発現レベルがギ酸の外因的提供前の転写因子の発現レベルと比較して上昇している場合、外因的に提供されたギ酸の存在によって「増加した」と考えられる。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターの応答は（例えば、一度誘導されると）活性化である。いくつかの実施形態では、調節可能なインプットプロモーターの応答は抑制である。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、そのインプットプロモーターがプロセスにおいて特定の培養工程または培養条件（例えば、プロセス１の場合、グリセロール制限＋ギ酸添加；プロセス２の場合、グルコース制限＋ギ酸添加；およびプロセス３について、グルコース制限＋チアミン枯渇）のもとで活性化されるならば、特定の生産プロセス（例えば、プロセス１、プロセス２、またはプロセス３などの本明細書に記載されたプロセス）に関して同族である。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、グリセロールおよびギ酸添加の培養条件下で活性化される。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、グルコースおよびギ酸添加の培養条件下で活性化される。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、グルコースおよびチアミン枯渇の培養条件下で活性化される。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、メタノール依存性プロセスにおいて活性化される。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、グリセロールおよびギ酸添加の培養条件を含むプロセス１に関して同種である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、グルコースおよびギ酸添加の培養条件を含むプロセス２に関して同種である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、グルコースおよびチアミン枯渇の培養条件を含むプロセス３に関して同種である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、メタノール依存性プロセスであるプロセス４に関して同族である。本明細書に記載のいくつかの実験では、プロセス４を対照として使用する。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、プロセス１に関して同族であり、例えば、表４に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、プロセス２に関して同族であり、例えば、表５に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、プロセス３に関して同族であり、例えば、表６に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、表４に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、表５に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、表６に列挙されるものである。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位のインプットプロモーターおよび／または第２の転写単位のアウトプットプロモーターは、構成的プロモーターである。本出願で使用される場合、「構成的プロモーター」は、所与の宿主ゲノムに関連してＤＮＡ配列に作動可能に連結されると、ＤＮＡ配列の連続的な転写をもたらすプロモーターである。構成的プロモーターの非限定的な例としては、Ｐ（ＧＡＰ）、Ｐ（ＥＮＯ１）、Ｐ（ＧＰＭ１）、Ｐ（ＨＳＰ８２）、Ｐ（ＩＬＶ５）、Ｐ（ＫＡＲ２）、Ｐ（ＫＥＸ２）、Ｐ（ＰＥＴ９）、Ｐ（ＰＧＫ１）、Ｐ（ＳＳＡ４）、Ｐ（ＴＥＦ１）、Ｐ（ＴＰＩ１）、およびＰ（ＹＰＴ１）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位のインプットプロモーターは、実施例１および実施例３、表２１の核酸配列に対して、または配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるポリヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、または３００個以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、転写因子またはその少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドの転写を開始することができる。いくつかの実施形態では、転写因子は転写活性化因子である。いくつかの実施形態では、第１の転写単位のインプットプロモーターは、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、Ｐ（ＣＭＣ１）、Ｐ（ＪＥＮ１）、Ｐ（ＧＱ６７０４４９９）、Ｐ（ＧＱ７００９２６）、Ｐ（ＨＧＴ１）、Ｐ（ＦＤＨ１）、Ｐ（ＡＯＸ２）、Ｐ（ＲＧＩ２）、Ｐ（ＰＩＨ１）、Ｐ（ＴＨＩ４ａ）、またはＰ（ＴＨＩ４ｂ）のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターはＰ（ＡＴ２４９＿ＧＱ６７０４４９９）である。いくつかの実施形態では、インプットプロモーターは、Ｐ（ＡＯＸ１）、またはＰ（ＡＯＸ１）に対して９０％、８０％、または７０％を超える配列同一性を有するプロモーターを含まない。
Ｐ（ｉｎ）の非限定的な例は、表４、表５、および表６に記載されている。
表４、表５または表６のＰ（ｉｎ）の（配列番号による）ＤＮＡ配列は、表２１に見出すことができる。
転写因子［ＴＦまたはｓＴＦ］
いくつかの実施形態では、本開示は、転写因子の少なくとも１つの成分を発現する転写単位に関する。いくつかの実施形態では、合成発現系は第１および第２の転写単位を含み、第１の転写単位は転写因子の少なくとも１つの成分を発現し、第２の転写単位は転写因子によって活性化される合成アウトプットプロモーターを含み、合成アウトプットプロモーターは目的の遺伝子の発現を促進する。
いくつかの実施形態では、インプットプロモーターが、第１の転写単位に存在するポリヌクレオチドによってコードされる転写因子の少なくとも１つの成分の発現を駆動する合成発現系が提供される。いくつかの実施形態では、合成転写因子はインプットプロモーターの活性化因子ではない。いくつかの実施形態では、合成転写因子は合成アウトプットプロモーターの活性化因子である。いくつかの実施形態では、転写因子の成分は、第２の転写単位の合成アウトプットプロモーターに結合し、目的の遺伝子の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は合成転写因子（ｓＴＦ）である。
「転写因子」は、プロモーター内またはプロモーター周囲の１またはそれを超える特異的ＤＮＡ配列に結合することによって、同族プロモーターからの転写速度を制御するタンパク質である。
いくつかの実施形態では、転写因子は、目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターに結合することによって、目的の遺伝子の転写速度を増加させる。転写因子は、単独で作用し得るか、または合成アウトプットプロモーターにおいてＲＮＡポリメラーゼを含む複合体の成分を動員するおよび／または安定化することによって複合体中の他のタンパク質と共に作用し得る。いくつかの実施形態では、転写因子は少なくとも１つの以下を含む：（１）特定のＤＮＡ配列に結合するＤＮＡ結合ドメイン、および／または（２）ＲＮＡポリメラーゼ、別のタンパク質、またはＲＮＡポリメラーゼを含む複合体中の別の成分などの別のタンパク質と相互作用することができる転写活性化ドメイン（例えば、トランス作用性ドメイン；ＴＡＤ）。
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、転写因子は、プロモーターへのＲＮＡポリメラーゼの結合を安定化すること；ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性を介したヒストンタンパク質のアセチル化を触媒すること；ＤＮＡとヒストンとの会合を弱め、転写にＤＮＡをよりアクセスしやすくすること；および／またはコアクチベータータンパク質もしくはコリプレッサータンパク質を転写複合体に動員することを含むがこれらに限定されない様々な機構によって合成アウトプットプロモーターからの発現を増加させることができることに留意されたい。いくつかの実施形態では、転写因子はシグナル感知ドメイン（ＳＳＤ）（例えば、リガンド結合ドメイン）を含み、これは外部シグナルを感知し、それに応答してこれらのシグナルを転写複合体の残りの部分に伝達し、目的の遺伝子の発現の上方制御をもたらす。
種々の転写因子、ならびにそれらの構造および機能が、以下を含む文献に記載されている：Ｌａｔｃｈｍａｎ １９９７ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２９（１２）：１３０５－１２；Ｋａｒｉｎ １９９０ Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ．２（２）：１２６－３１；Ｂａｂｕ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１４（３）：２８３－９１；Ｒｏｅｄｅｒ １９９６ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２１（９）：３２７－３５；Ｎｉｋｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．９４（１）：１５－２２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．２０００ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．３４：７７－１３７；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４５（４９１６）：３７１－８；Ｐｔａｓｈｎｅ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｎａｔｕｒｅ．３８６（６６２５）：５６９－７７；Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４２（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１１８２－７；およびＭａｔｙｓ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３４（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１０８－１０。
いくつかの実施形態では、転写因子は、１またはそれを超える以下の成分を含む：（ａ）合成アウトプットプロモーターに結合する（例えば、合成アウトプットプロモーター内のオペレーターに結合する）ＤＮＡ結合ドメイン、および／または（ｂ）合成アウトプットプロモーターからの転写を促進する別の因子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）に結合する転写活性化ドメイン、（ｃ）必要に応じて、核局在化シグナル、（ｄ）必要に応じて、オリゴマー化ドメイン、および（ｅ）必要に応じて、存在する場合、成分（ａ）～（ｄ）のいずれかの間の１またはそれを超えるリンカー。いくつかの実施形態では、転写因子は、１またはそれを超える以下の成分をさらに含む：（ｆ）必要に応じて、１またはそれを超える追加のドメイン、および（ｇ）必要に応じて、１またはそれを超える成分（ｆ）が存在する場合、成分（ｆ）と成分（ａ）～（ｄ）のいずれかとの間の１またはそれを超えるリンカー、および／または、１つよりも多くの成分（ｆ）が存在する場合、成分（ｆ）のいずれかの間の１またはそれを超えるリンカー。いくつかの実施形態では、１またはそれを超える成分（ｆ）は、ＡＴＰに結合すること；１またはそれを超えるヒストンのアセチル化または脱アセチル化を直接的または間接的に触媒すること；別のタンパク質に結合すること；コアクチベーターを動員すること；別の転写因子に結合すること；転写開始前複合体の成分に結合すること；リガンドまたはシグナル化合物に結合すること；シグナル感知ドメインとして作用すること；シグナル伝達カスケードにおいて機能を実行すること；細胞周期の調節に関連する機能を果たすこと；発生の制御に関する機能を実行すること；リン酸化部位として作用すること；および／または膜に結合することを含むがこれらに限定されない様々な機能のいずれかを行うことができる。本開示で使用される場合、転写因子の「成分」または「成分部分」は、上記（ａ）～（ｆ）に提供されるものなどの部分タイプを指す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、および／または任意の他の成分のうちの任意の２またはそれを超えるものが異なる供給源（例えば、異なる種）に由来するという点で、転写因子はキメラである。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分を含み、転写因子は、配列番号２６～５５のいずれか１つから選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）を含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、合成発現系は、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分を含み、転写因子は、メタノール発現調節因子１（ｍｘｒ１）、またはｍｘｒ１と９０％、８０％もしくは７０％の配列同一性を有する転写因子を含まない。いくつかの実施形態では、合成発現系は、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分を含み、転写因子は、ヒトエストロゲン受容体アルファ（ｈＥＲα）またはｈＥＲαと９０％、８０％もしくは７０％の配列同一性を有する転写因子を含まない。いくつかの実施形態では、合成発現系は、転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分を含み、転写因子は、フェロモン調節膜タンパク質１（ｐｒｍ１）またはｐｒｍ１と９０％、８０％もしくは７０％の配列同一性を有する転写因子を含まない。
いくつかの実施形態では、転写因子はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む。「ＤＮＡ結合ドメイン」は、二本鎖または一本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１つの構造モチーフを含む独立して折り畳まれたタンパク質ドメインである。ＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ配列（認識配列）を認識するか、またはＤＮＡに対して一般的な親和性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｂｍ３Ｒ１、ＴｅｔＲ、ＰｈｌＦ＿ＡＭまたはＶａｎＲ＿ＡＭのものであるか、またはそれらに由来する。
いくつかの実施形態では、Ｂｍ３Ｒ１のＤＮＡ結合ドメインは、全長Ｂｍ３Ｒ１リプレッサーに基づく（例えば、その一部、それに由来する、そのバリアントなど）ＤＮＡ結合ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｂｍ３Ｒ１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の転写リプレッサーＢｍ３Ｒ１の全長配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿０１３０８３９７２．１）をコードする。
いくつかの実施形態では、ＴｅｔＲのＤＮＡ結合ドメインは、全長ＴｅｔＲリプレッサーに基づくＤＮＡ結合ドメインである。いくつかの実施形態では、ＴｅｔＲは、Ｔｎ１０由来の転写リプレッサーＴｅｔＲの全長配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿００００８８６０５．１）をコードする。
いくつかの実施形態では、ＰｈｌＦ＿ＡＭのＤＮＡ結合ドメインは、全長ＰｈｌＦ＿ＡＭに基づくＤＮＡ結合ドメインである。いくつかの実施形態では、ＰｈｌＦ＿ＡＭは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の転写リプレッサーＰｈｌＦの全長配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹＪ７２２２７．１）のバリアントをコードする。
いくつかの実施形態では、ＶａｎＲ＿ＡＭのＤＮＡ結合ドメインは、全長ＶａｎＲ＿ＡＭに基づくＤＮＡ結合ドメインである。いくつかの実施形態では、ＶａｎＲ＿ＡＭは、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ由来の転写リプレッサーＶａｎＲの全長配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹＪ７２２３６．１）のバリアントをコードする。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８６～８９のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチド、またはその機能的断片を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９０～９３のいずれかの核酸配列を有するアミノ酸、またはその機能的断片を含む。
いくつかの実施形態では、転写因子は１成分、２成分または多成分の転写因子である。
いくつかの実施形態では、転写因子は、８つの異なるタイプのｓＴＦのうちのいずれか１つである：（１）１成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦ、（２）１成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦ、（３）１成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ、（４）１成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦ、（５）２成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦ、（６）２成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦ、（７）２成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ、（８）２成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦ。本明細書で使用される場合、「１成分」、「２成分」、および「多成分」は、ｓＴＦに存在するいくつかのサブユニットを指す。ｓＴＦ「サブユニット」は、成分部分（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、ＢＰＰ１、ＢＰＰ２、核局在化シグナル、スペーサーなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、１成分ｓＴＦは、ＤＢＤ、ＮＬＳ、およびＴＡＤを有するポリペプチド鎖の１またはそれを超えるモノマーを含む合成転写因子であり、ポリペプチド鎖は単一のＤＮＡコード配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、転写因子はＢｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子はＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子はＴｅｔＲベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子はＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子はＢｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子はＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子はＴｅｔＲベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子はＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子は１成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子は１成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子は１成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子は１成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子は、１成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦ、例えば表７に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、転写因子は、１成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦ、例えば表８に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、転写因子は、１成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ、例えば表９に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、転写因子は、１成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦ、例えば表１０に列挙されるものである。
いくつかの実施形態では、転写因子は２成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子は２成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子は２成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子は２成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦである。いくつかの実施形態では、転写因子は、２成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦ、例えば表１１に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、転写因子は、２成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦ、例えば表１２に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、転写因子は、２成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ、例えば表１３に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、転写因子は、２成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦ、例えば表１４に列挙されるものである。
いくつかの実施形態では、１成分ｓＴＦは、同族の合成アウトプットプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼ複合体とコンジュゲートして、合成アウトプットプロモーターの転写活性化を媒介するＤＢＤおよびＴＡＤを分子的に近接させるように設計される。いくつかの実施形態では、ＤＢＤおよびＴＡＤは、１成分ｓＴＦによって媒介される合成発現系の機能性に関して必須の成分である。
１またはそれを超える成分を含む転写因子
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示に記載の任意の転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分を含む合成発現系、またはその使用方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、本開示に記載の任意の転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分、またはその使用方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、同族のアウトプットプロモーターと組み合わせて使用するための、本開示に記載の任意の転写因子または転写因子の少なくとも１つの成分、またはその使用方法に関する。
いくつかの実施形態では、転写因子は、１つの成分、２つの成分、３つの成分、４つの成分、５つの成分、または５つよりも多くの成分を含む。２つよりも多くの成分を有する転写因子は、「多成分」転写因子と呼ばれる。いくつかの実施形態では、転写因子は１つの成分を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、転写因子は２つの成分を含む。いくつかの実施形態では、転写因子は２またはそれを超える成分を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、転写因子の少なくとも１つの成分は、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、転写因子の少なくとも１つの成分は、転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、転写因子の少なくとも１つの成分は、転写因子の異なる成分に結合する部分を含む。様々な実施形態では、転写因子の２またはそれを超える成分は、異なる供給源（例えば、異なる属、異なる種など）に由来し得る。
いくつかの実施形態では、転写因子の２またはそれを超える成分が結合して（例えば、一方を他方に結合させるか、または互いに結合させる）、転写因子を形成する。いくつかの実施形態では、転写因子の２またはそれを超える成分が結合して、ヘテロ二量体、キメラまたは融合を形成する。いくつかの実施形態では、転写因子の２つの成分が結合して、一方の成分の一部が他方に結合するか、もしくはその逆であるか、または２つの成分の一部が互いに結合する任意の生化学的機構を介して、ヘテロ二量体、キメラまたは融合を形成する。
いくつかの実施形態では、２成分ｓＴＦは、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１の１またはそれを超えるモノマーおよび２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２の１またはそれを超えるモノマーを含む複合体を含む合成転写因子である。２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１と２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２との間の分子間複合体化は、非共有結合相互作用または共有結合（例えば、バイオコンジュゲートタンパク質の使用）のいずれかによって媒介され得る。いくつかの実施形態では、２成分または多成分転写因子は、バイオコンジュゲートタンパク質をさらに含む。
非共有結合的複合体化のいくつかの実施形態では、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１および２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２は、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１上のタンパク質ドメインまたは他のサブ配列（例えば、短いエピトープまたはタグ）と、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２上の同族タンパク質ドメインまたは他のサブ配列（例えば、短いエピトープまたはタグ）との間の特異的な高親和性非共有結合相互作用を介して一緒にすることができる。そのようなシステムの一例は、ＡＬＦＡタグが同族ナノボディ（ＮｂＡＬＦＡ）によって強固に結合された短いペプチド配列を含む、ＡＬＦＡタグ／ＮｂＡＬＦＡシステムにおいて具現化される。
共有結合的複合体化のいくつかの実施形態では、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１および２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２は、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１上のタンパク質ドメインまたは他のサブ配列（例えば、短いエピトープまたはタグ）と、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２上の同族タンパク質ドメインまたは他のサブ配列（例えば、短いエピトープまたはタグ）との間の特異的共有結合形成事象を介して一緒にすることができる。いくつかの実施形態では、形成された共有結合はイソペプチド結合である。そのようなシステムの一例は、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムに具体化され、ＳｐｙＴａｇは、同族ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインとイソペプチド結合を形成する短いペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１は、ＤＢＤおよび第１のＮＬＳ（ＮＬＳ１）を保有し、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２は、ＴＡＤおよび第２のＮＬＳ（ＮＬＳ２）を保有する。したがって、２成分ｓＴＦは、同族の合成アウトプットプロモーターとコンジュゲートして、合成アウトプットプロモーターの転写活性化を媒介する１またはそれを超えるＤＢＤおよび１またはそれを超えるＴＡＤを分子的に近接させるように設計される。
いくつかの実施形態では、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１と２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２との間の分子間複合体化は、共有結合性イソペプチド結合の形成によって媒介される。いくつかの実施形態では、２成分または多成分転写因子は、ＳｐｙＴａｇおよび／またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをさらに含む。いくつかの実施形態では、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１は、ＳｐｙＴａｇバリアントの１またはそれを超えるコピーを有し、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒバリアントの１つのコピーを有する。そのような系の他の例としては、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＳｄｙＴａｇ／ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒ、および／または当技術分野で公知の任意の他のバイオコンジュゲートタンパク質のバリアントが挙げられる。本明細書で使用される場合、ＳｐｙＴａｇバリアントと機能的に同等な短いタンパク質配列を「バイオコンジュゲートタンパク質部分１（ＢＰＰ１）」と呼び、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒバリアントと機能的に同等な比較的大きな同族タンパク質配列を「バイオコンジュゲートタンパク質部分２（ＢＰＰ２）」と呼ぶ。
いくつかの実施形態では、転写因子は単一コピーのＢＰＰ１を含む。いくつかの実施形態では、単一コピーのＢＰＰ１は、配列番号１４８の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、単一コピーのＢＰＰ１は、配列番号１５１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはこれからなる。
いくつかの実施形態では、転写因子は、複数コピー、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０コピーまたはそれを超えるコピーのＢＰＰ１を含む。いくつかの実施形態では、転写因子は２コピーのＢＰＰ１を含む。いくつかの実施形態では、２コピーのＢＰＰ１は、配列番号１４９の配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、２コピーのＢＰＰ１は、配列番号１５２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、転写因子は６コピーのＢＰＰ１を含む。いくつかの実施形態では、６コピーのＢＰＰ１は、配列番号１５０の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、６コピーのＢＰＰ１は、配列番号１５３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、転写因子は、１またはそれを超えるコピーのＢＰＰ１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０よりも多くのコピー）および／または単一コピーのＢＰＰ２を含む。いくつかの実施形態では、単一コピーのＢＰＰ２は、配列番号１５４の配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、単一コピーのＢＰＰ２は、配列番号１５５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、転写因子は、１またはそれを超えるコピーのＢＰＰ１（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０よりも多くのコピー）および／または１またはそれを超えるコピー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０よりも多くのコピー）のＢＰＰ２を含む。
いくつかの実施形態では、転写因子は自己切断性ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、自己切断性ポリペプチドは２Ａペプチドである。いくつかの実施形態では、自己切断性ポリペプチドはＥＲＢＶ＿１＿Ｐ２Ａである。いくつかの実施形態では、自己切断性ポリペプチドはＥ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＴ２Ａである。
いくつかの実施形態では、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１のタンパク質配列および２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２のタンパク質配列は、単一のプロモーターによって駆動される同じ転写単位にコードされており、２つの異なるポリペプチド鎖は、介在するコードされた２Ａペプチド配列によって媒介される「リボソームスキッピング」事象を介して単一のコード配列から生成される。いくつかの実施形態では、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１のタンパク質配列および２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２のタンパク質配列は、それぞれ別個のプロモーターによって駆動される別個の転写単位でコードされる。
いくつかの実施形態では、転写因子の異なる成分は異なる遺伝子によってコードされる。合成発現系のいくつかの実施形態では、転写因子は、２またはそれを超える成分を含むか、またはそれらからなり、各成分は異なる遺伝子によってコードされる。
合成発現系のいくつかの実施形態では、転写因子は２またはそれを超える成分を含むかまたはそれからなり、各成分は異なる遺伝子によってコードされ、２またはそれを超える成分をコードする異なる遺伝子はポリシストロニックである（例えば、インプットプロモーターによって、および／または同じプロモーターによって制御される）。
合成発現系のいくつかの実施形態では、転写因子は、３またはそれを超える成分を含むか、またはそれからなり、各成分は異なる遺伝子によってコードされ、異なる遺伝子のうちの２またはそれを超えるものはポリシストロニックである（例えば、インプットプロモーターによって制御され、および／または同じプロモーターによって制御され、調節可能であっても調節不可能であってもよい）。
様々な実施形態では、合成発現系は、２またはそれを超える成分を含む転写因子を含むことができ、成分は同じまたは異なる転写単位の一部として発現される。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、それぞれが転写因子の成分をコードする２つの遺伝子の発現を制御するインプットプロモーターを含み、インプットプロモーターおよび２つの遺伝子はポリシストロニック（またはバイシストロニック）単位（例えば、ポリシストロニックまたはバイシストロニックな遺伝子座、系など）の一部である。
いくつかの実施形態では、転写因子は、それぞれが別個の遺伝子によってコードされる２つの成分を含み、遺伝子の両方とも、第１の転写単位の一部として発現され、２つの成分をコードする遺伝子が発現されると、２つの成分が結合して転写因子を形成することができ、転写因子は、目的の遺伝子に作動可能に連結されて目的の遺伝子を発現するアウトプットプロモーターを活性化することができる。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、（ａ）第１の転写単位であって、（ｉ）転写因子の第１の成分をコードする遺伝子、および（ｉｉ）転写因子の第２の成分をコードする遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができる第１のインプットプロモーターを含む第１の転写単位、（ｂ）第２の転写単位であって、目的の遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができるアウトプットプロモーターを含む第２の転写単位を含み；第１の成分および第２の成分は、結合して転写因子を形成することができ、転写因子は、アウトプットプロモーターを活性化して目的の遺伝子を発現させることができる。
いくつかの実施形態では、転写因子は、少なくとも２つの成分を含み、各成分は、同じまたは異なる転写単位の一部として発現され、少なくとも２つの成分をコードする遺伝子が発現されると、少なくとも２つの成分が結合して転写因子を形成することができ、転写因子は、目的の遺伝子に作動可能に連結されて目的の遺伝子を発現するアウトプットプロモーターを活性化することができる。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、（ａ）第１の転写単位であって、転写因子の第１の成分をコードする遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができる第１のインプットプロモーターを含む第１の転写単位；（ｂ）第２の転写単位であって、目的の遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができるアウトプットプロモーターを含む第２の転写単位；および（ｃ）第３の転写単位であって、転写因子の第２の成分をコードする遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができる第２のインプットプロモーターを含む、第３の転写単位を含み；第１のインプットプロモーターおよび第２のインプットプロモーターは、同じであるか、または異なり；第１のインプットプロモーターおよび第２のインプットプロモーターのいずれも誘導性ではないか、いずれかまたは両方とも誘導性であり；第１の成分および第２の成分は、結合して転写因子を形成することができ、転写因子は、アウトプットプロモーターを活性化して目的の遺伝子を発現させることができる。
いくつかの実施形態では、転写因子は、少なくとも３つの成分を含み、各成分は、異なる転写単位の一部として発現され、少なくとも３つの成分をコードする遺伝子が発現されるとき、少なくとも３つの成分が結合して転写因子を形成することができ、転写因子は、目的の遺伝子に作動可能に連結されて目的の遺伝子を発現するアウトプットプロモーターを活性化することができる。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、（ａ）第１の転写単位であって、転写因子の第１の成分をコードする遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができる第１のインプットプロモーターを含む第１の転写単位；（ｂ）第２の転写単位であって、目的の遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができるアウトプットプロモーターを含む第２の転写単位；および（ｃ）第３の転写単位であって、転写因子の第２の成分をコードする遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができる第２のインプットプロモーターを含む、第３の転写単位；および（ｄ）第４の転写単位であって、転写因子の第３の成分をコードする遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができる第３のインプットプロモーターを含む第４の転写単位を含み；第１、第２、および第３のインプットプロモーターは、同じまたは異なり；第１、第２、または第３のインプットプロモーターのいずれも誘導性ではないか、いずれかまたはすべてが誘導性であり；第１、第２、および第３の成分は、結合して転写因子を形成することができ、転写因子は、アウトプットプロモーターを活性化して目的の遺伝子を発現させることができる。
いくつかの実施形態では、転写因子は、少なくとも３つの成分を含み、各成分は、同じまたは異なる転写単位の一部として発現され、少なくとも３つの成分をコードする遺伝子が発現されるとき、少なくとも３つの成分が結合して転写因子を形成することができ、転写因子は、目的の遺伝子に作動可能に連結されて目的の遺伝子を発現するアウトプットプロモーターを活性化することができる。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、（ａ）第１の転写単位であって、転写因子の第１の成分をコードする遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができる第１のインプットプロモーターを含む第１の転写単位；（ｂ）第２の転写単位であって、目的の遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができるアウトプットプロモーターを含む第２の転写単位；および（ｃ）第３の転写単位であって、（ｉ）転写因子の第２の成分をコードする遺伝子、および（ｉｉ）転写因子の第３の成分をコードする遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができる第２のインプットプロモーターを含む、第３の転写単位を含み；第１のインプットプロモーターおよび第２のインプットプロモーターは、同じであるか、または異なり；インプットプロモーターのいずれも誘導性ではないか、いずれかまたは両方とも誘導性であり；第１の成分、第２の成分、および第３の成分は、結合して転写因子を形成することができ、転写因子は、アウトプットプロモーターを活性化して目的の遺伝子を発現させることができる。
いくつかの実施形態では、転写因子は、ｎ個の成分を含み、ｎは２またはそれを超える数であり、２またはそれを超えるｎ個の成分は、同じまたは異なる転写単位の一部として発現され、ｎ個の成分をコードする遺伝子が発現されると、ｎ個の成分が結合して転写因子を形成することができ、転写因子は、目的の遺伝子に作動可能に連結されて目的の遺伝子を発現するアウトプットプロモーターを活性化することができる。
いくつかの実施形態では、ｎ個の成分を含む転写因子を含む合成発現系であって、ｎ個の成分の各々が異なる遺伝子によってコードされており、系は、（ａ）転写因子のｎ個の成分をコードする遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができる第１のインプットプロモーターを含む第１の転写単位；（ｂ）第２の転写単位であって、目的の遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができるアウトプットプロモーターを含む第２の転写単位を含み；ｎ個の成分は、結合して転写因子を形成することができ、転写因子は、アウトプットプロモーターを活性化して目的の遺伝子を発現させることができ；式中、ｎは２またはそれを超える。
いくつかの実施形態では、合成発現系は、複数の成分を含む転写因子を含み、各成分は異なる遺伝子によってコードされており、系は、（ａ）１またはそれを超える第１の転写単位であって、それぞれが、転写因子の成分をコードする少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができるインプットプロモーターを含み、転写単位のすべてが一緒になって、転写因子のすべての成分を発現する、第１の転写単位；および（ｂ）第２の転写単位であって、目的の遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができるアウトプットプロモーターを含む第２の転写単位を含み；複数の成分は、結合して転写因子を形成するができ、転写因子は、アウトプットプロモーターを活性化して目的の遺伝子を発現させることができる。
いくつかの実施形態では、複数の成分を含む転写因子を含む合成発現系であって、成分のそれぞれが異なる遺伝子によってコードされており、系は、（ａ）１またはそれを超える第１の転写単位であって、それぞれが、転写因子の成分をコードする少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができるインプットプロモーターを含み、該１またはそれを超える第１の転写単位上のインプットプロモーターは同じまたは異なり、該１またはそれを超える第１の転写単位の数が成分の数と同等またはそれ未満であり、転写単位のすべてが一緒になって転写因子のすべての成分を発現する、第１の転写単位；および（ｂ）第２の転写単位であって、目的の遺伝子に作動可能に連結され、それを発現することができるアウトプットプロモーターを含む第２の転写単位を含み；複数の成分は結合して転写因子を形成することができ、転写因子は、アウトプットプロモーターを活性化して目的の遺伝子を発現させることができる。
いくつかの実施形態では、転写因子は転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含む。「転写活性化ドメイン」は、ＤＮＡ結合ドメインと併せて、プロモーターからの転写を活性化することができる転写因子の領域である。いくつかの実施形態では、転写活性化ドメインは、Ｂ１１２＿ＴＡＤ、Ｂ４２＿ＴＡＤ、ＧＡＬ４＿ＴＡＤ、ｍｉｎｉＶＰＲ＿ＴＡＤ、Ｍｘｒ１＿ＴＡＤ、ＰＨ＿ＴＡＤ、ＶＰ１６＿ＴＡＤ、ＶＰ６４＿ＴＡＤ、ＶＰ６４ｖ２＿ＴＡＤ、ＶＰＨ＿ＴＡＤ、またはＶＰＲ＿ＴＡＤ（例えば、それぞれ、Ｂ１１２の転写活性化ドメイン、Ｂ４２の転写活性化ドメイン、ＧＡＬ４の転写活性化ドメイン、ｍｉｎｉＶＰＲの転写活性化ドメイン、Ｍｘｒ１の転写活性化ドメイン、ＰＨの転写活性化ドメイン、ＶＰ１６の転写活性化ドメイン、ＶＰ６４の転写活性化ドメイン、ＶＰ６４ｖ２の転写活性化ドメイン、ＶＰＨの転写活性化ドメイン、またはＶＰＲの転写活性化ドメイン）である。本明細書に記載されるいくつかの構築物では、例えば、いくつかの対照では、「Ｎｏ＿ＴＡＤ」は、その特定の構築物にＴＡＤが存在しないことを示す。本明細書に記載されるいくつかの構築物、例えばいくつかの対照では、転写活性化ドメインの位置は、転写活性化ドメインが存在しないことを示すＮｏ＿ＴＡＤとして本明細書に記載されている。いくつかの構築物では、例えばいくつかの対照では、成分（例えば、ＴＡＤ、オペレーターなど）は存在しなくてもよく、スペーサーで置き換えることができる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｂｍ３Ｒ１、ＴｅｔＲ、ＰｈｌＦ＿ＡＭもしくはＶａｎＲ＿ＡＭのＤＮＡ結合ドメインであり、またはそれらに由来し、転写活性化ドメインは、Ｂ１１２＿ＴＡＤ、Ｂ４２＿ＴＡＤ、ＧＡＬ４＿ＴＡＤ、ｍｉｎｉＶＰＲ＿ＴＡＤ、Ｍｘｒ１＿ＴＡＤ、ＰＨ＿ＴＡＤ、ＶＰ１６＿ＴＡＤ、ＶＰ６４＿ＴＡＤ、ＶＰ６４ｖ２＿ＴＡＤ、ＶＰＨ＿ＴＡＤ、またはＶＰＲ＿ＴＡＤ（本開示に記載）のいずれか１つである。
いくつかの実施形態では、転写活性化ドメインは、配列番号９４～１０４のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチド、またはその機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、転写活性化ドメインは、配列番号１０５～１１５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド、またはその機能的断片を含む。
いくつかの実施形態では、転写因子は、必要に応じて核局在化シグナルを含む。「核局在化シグナル」は、細胞核への核タンパク質の輸送を媒介するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、核局在化シグナルは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０由来の核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列は、ＧＡＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＣ（配列番号１１６）である。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０由来の核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列は、ＧＡＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴ（配列番号１１７）である。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０由来の核局在化シグナルのポリヌクレオチド配列は、アミノ酸配列ＥＦＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１８）を有するタンパク質（例えば、ポリペプチド）をコードする。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０由来の核局在化シグナルのポリヌクレオチド配列は、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１９）を有するタンパク質をコードする。
例えば、限定されないが、酵母リプレッサーα２のホメオドメイン；サイトゾルタンパク質；トウモロコシ調節タンパク質Ｏｐａｑｕｅ－２；Ｒａｓ；Ｒｈｏファミリーの小型ＧＴＰアーゼ；アグロバクテリウムＶｉｒＤ２タンパク質；ＶｉｒＥ２およびＶｉｒＤ２；ステロイド受容体ヘテロ複合体のｈｓｐ５６イムノフィリン成分；細胞質固定タンパク質；様々なシグナルトランスデューサ；糖質コルチコイド受容体；ヒトサイトメガロウイルスのＵＬ８４タンパク質；孔複合体または細胞質中のタンパク質；ＥｒｂＢ３ １３；ＥｒｂＢ４ １；ＥｒｂＢ２；網膜芽細胞腫遺伝子産物；Ｔｙ１インテグラーゼ；またはＳＶ４０を含むタンパク質の一部として、多くの異なる核局在化シグナルが当技術分野で記載されている。例えば、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｖｏｌｕｍｅ １０，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：２０２（２００９）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２９，２０１３，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７６８６４；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００７，６，４，１４０２－１４０９；Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ３１，Ｉｓｓｕｅ １，１ Ｊａｎｕａｒｙ ２００３，Ｐａｇｅｓ ３９７－３９９を参照のこと。
いくつかの実施形態では、転写因子はオリゴマー化ドメイン（ＯＤ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化ドメインは、Ｌｉｎｋｅｒ＿ｏｎｌｙ＿ｆｏｒ＿ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（例えば、オリゴマー化のためのリンカー；配列番号１５７）；Ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿ｄｏｍａｉｎ（例えば、三量化ドメイン；配列番号１５８）；またはＨｅｐｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿ｄｏｍａｉｎ（例えば、七量体化ドメイン；配列番号１５７）である。いくつかの実施形態では、転写因子は、配列番号１５６～１５８のいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチドを含むオリゴマー化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、配列番号１５９～１６１のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むオリゴマー化ドメインを含む。
本開示で使用される場合、「Ｌｉｎｋｅｒ＿ｏｎｌｙ＿ｆｏｒ＿ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」は、Ｋｉｍ Ｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３５：６０２６の補足情報の「リンカー１」をコードするポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、このリンカーは、オリゴマー化ドメインを欠く２部分転写因子に使用される。
いくつかの実施形態では、Ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿Ｄｏｍａｉｎは、両側にリンカーが隣接するオリゴマー化ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、Ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿Ｄｏｍａｉｎは、リンカーの後にヒトコラーゲンＸｖ三量体化ドメインおよび第２のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、Ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿Ｄｏｍａｉｎは、以下の３つのコードサブ部分の連結を、示された順序でコードする：（ｉ）Ｋｉｍ Ｄら（２０１４）の補足情報の「リンカー１」；（ｉｉ）Ｗｉｒｚ ＪＡ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．，３０：９に由来する三量化ドメインおよび関連するＴＤＢ構造３Ｎ３Ｆ；および（ｉｉｉ）Ｋｉｍ Ｄら（２０１４）の補足情報の「リンカー２」。
いくつかの実施形態では、Ｈｅｐｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿ｄｏｍａｉｎは、両側にリンカーが隣接する七量体化ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、Ｈｅｐｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿ｄｏｍａｉｎは、リンカーの後に、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ Ｓｍ１七量体化ドメインおよび第２のリンカーをコードする。いくつかの実施形態では、Ｈｅｐｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿ｄｏｍａｉｎは、以下の３つのコードサブ部分の連結を、示された順序でコードする：（ｉ）Ｋｉｍ Ｄら（２０１４）の補足情報の「リンカー１」；（ｉｉ）Ｋｉｍ Ｄら（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．，７：ｅ４３０７７の表１に由来する「七量体化ドメイン」；および（ｉｉｉ）Ｋｉｍ Ｄら（２０１４）の補足情報の「リンカー２」。
いくつかの実施形態では、転写因子は１またはそれを超えるリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１２０の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１２１の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１２２の核酸配列を有するアミノ酸を含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１２３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むかまたはこれからなる。
転写因子はオリゴマー（例えば、複数のモノマーまたはサブユニットを含有する）またはモノマー（例えば、単一のモノマーまたはサブユニットを含む）であり得ることが当業者には理解されよう。いくつかの実施形態では、オリゴマーである転写因子は、同じまたは異なる２またはそれを超えるサブユニットを含むことができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞で発現される場合、転写因子は単一のポリペプチド鎖として翻訳される。いくつかの実施形態では、転写因子は複数のポリペプチド鎖として翻訳される。いくつかの実施形態では、転写因子は、翻訳後に会合する少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド鎖は、自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、自己切断性ポリペプチドは２Ａペプチドである。いくつかの実施形態では、自己切断性ポリペプチドはＰ２Ａである。いくつかの実施形態では、自己切断性ポリペプチドはＥ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＴ２Ａである。いくつかの実施形態では、自己切断性ポリペプチドは、配列番号１２４の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、自己切断性ポリペプチドは、配列番号１２５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、転写因子は１またはそれを超えるリンカーを含む。
（３つのプロセスすべてに使用される）１成分ｓＴＦの非限定的な例は、表７、表８、表９、および表１０に記載されており、４つのサブ部分：ＤＢＤ、ＮＬＳ、リンカー、およびＴＡＤを含む。合成発現系機能に必要なｓＴＦの部分タイプには、ＤＢＤおよびＴＡＤが含まれる。
２成分ｓＴＦの非限定的な例は、表１１、表１２、表１３、表１４、および表３６に記載されており、９つの可能なサブ部分：ＤＢＤ（必要）、ＮＬＳ１、リンカー、ＢＰＰ１、２Ａ、ＢＰＰ２、ＮＬＳ２、ＯＤ、およびＴＡＤ（必要）を含む。
ｓＴＦバリアントの非限定的な例は、表７、表８、表９、表１０、表１１、表１２、表１３、表１４および表３６に記載されている。
いくつかの実施形態では、ｓＴＦバリアントをコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、表７、表８、表９、表１０、表１１、表１２、表１３、表１４、または表３６の対応する行を参照し、次いで、表２１に示すように対応する成分の部分タイプバリアントのＤＮＡ配列の連結を介して完全なｓＴＦ遺伝子配列を生成することによって得ることができる。本開示のある特定のｓＴＦバリアントの完全なＤＮＡおよびアミノ酸配列は、（配列番号によって）表３０、３１および３６に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位の転写ターミネーターのＤＮＡ配列（例えば、実施例１で使用される）を表２１に示す（配列番号による）。
いくつかの実施形態では、転写因子をコードするポリヌクレオチドは、実施例２、実施例３、表２１、３０、および３６の核酸配列に対して、または配列番号２６～４０もしくは１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、転写因子をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２６～４０または１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、転写因子をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２６～４０または１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、または３００個以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、転写因子は、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、転写因子は、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列の配列を含むかまたはこれからなるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、コードされる転写因子は、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０または１００個以下のアミノ酸置換、挿入、付加または欠失を有するポリペプチドを含むか、またはそれらからなる。
合成アウトプットプロモーター［Ｐ（ｏｕｔ）］
いくつかの実施形態では、本開示は、合成アウトプットプロモーターの制御下にある目的の遺伝子を含む第２の転写単位を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、合成アウトプットプロモーターおよび挿入部位を含む第２の転写単位を提供し、挿入部位は、挿入部位に挿入された目的の遺伝子が合成アウトプットプロモーターに作動可能に連結され、その制御下にあるように配置される。本出願で使用される場合、例えば、「合成アウトプットプロモーター」または「Ｐ（ｏｕｔ）」は、第１の転写単位の転写因子によって駆動され（例えば、それに関して同族である）、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その転写を活性化することができる合成プロモーターを指す。いくつかの実施形態では、宿主細胞ゲノムで発現される場合、目的の遺伝子は、宿主細胞にとって内因性であってもなくてもよい。
コード配列および調節配列（例えば、プロモーター配列）は、コード配列と調節配列が共有結合している場合、および／またはコード配列の発現もしくは転写が調節配列の影響もしくは制御下にある場合、「作動可能に結合されている」または「作動可能に連結されている」と言われる。
いくつかの実施形態では、Ｐ（ｏｕｔ）は、ＲＮＡをコードする目的の遺伝子に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｐ（ｏｕｔ）は、タンパク質をコードする目的の遺伝子に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は酵素をコードする。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、有機分子の生合成に関与するタンパク質をコードする。
コード配列が機能的生物的産物に翻訳される場合、コード配列および調節配列は、５’調節配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写を可能にし、コード配列と調節配列との間の連結の性質が（１）コード配列のリーディングフレームを変化させるフレームシフト事象をもたらさない、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を指示する能力を妨害しない、または（３）対応するＲＮＡ転写産物がタンパク質に翻訳される能力を妨害しない場合に、作動可能に結合または連結されていると言われる。
いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは、Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーターである。いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは、ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーターである。いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは、ＴｅｔＲベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーターである。いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは、ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーターである。いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは、Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、例えば表１５に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは、ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、例えば表１６に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは、ＴｅｔＲベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、例えば表１７に列挙されるものである。いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは、ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦに関して同族の合成アウトプットプロモーター、例えば表１８に列挙されるものである。
いくつかの実施形態では、合成発現系はアウトプットプロモーターを含み、アウトプットプライマーは、実施例２および実施例３、表３３、表３６の核酸配列に対して、または配列番号５６～７０もしくは１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるポリヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターは、配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０個以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を有するポリヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターは、配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる。
いくつかの実施形態では、転写因子はアウトプットプロモーターに結合する。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって直接結合されるＤＮＡ配列と、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン成分によって結合されるＤＮＡ配列とを含む。いくつかの実施形態では、転写因子によって結合されるＤＮＡ配列は、オペレーターおよび／またはエンハンサーであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、上流活性化配列は、オペレーターおよび／またはエンハンサーであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、オペレーターは転写因子によって直接に結合されるＤＮＡ配列であり、エンハンサーはオペレーターを含むＤＮＡのより大きな領域である。いくつかの実施形態では、コアプロモーターまたはコアプロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼによって直接結合されるポリヌクレオチドセグメントまたは配列である。
本出願で使用される場合、「コアプロモーター」は、転写を開始するために必要であり、転写開始部位を含むプロモーターの最小部分を指す。典型的には、コアプロモーターは、ＴＡＴＡボックスの約１５～２０塩基上流から翻訳開始部位まで伸長する。
いくつかの実施形態では、アウトプットプロモーターのコアプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって直接結合され、作動可能に連結されたコード配列の転写の開始に必要な最小ヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。
いくつかの実施形態では、プロモーター（例えば、インプットプロモーターまたはアウトプットプロモーター）は、（ａ）コアプロモーターと、（ｂ）１またはそれを超えるコピーの上流活性化配列、オペレーターおよび／またはエンハンサーうちのいずれか１またはそれを超えるものであるかまたはそれらを含む転写因子によって結合されるポリヌクレオチドまたは配列とを含む。いくつかの実施形態では、エンハンサーは複数のオペレーターを含むことができる。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターは、１またはそれを超えるオペレーターおよび／またはエンハンサーを含むことができる。
いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターは、上流活性化配列およびコアプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、合成アウトプットプロモーターは、コアプロモーターエレメントを含み、上流活性化配列（ＵＡＳ）を含まない。いくつかの実施形態では、上流活性化配列は、コアプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、上流活性化配列は合成である。いくつかの実施形態では、上流活性化配列はキメラである。いくつかの実施形態では、上流活性化配列は１またはそれを超えるオペレーターを含む。いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるオペレーターは、ｂｍＯ、ｔｅｔＯ、ｐｈｌＯ、またはｖａｎＯを含むことができる。いくつかの実施形態では、オペレーター（または転写単位もしくは発現系の他の成分）の指定または説明は、オペレーター（または他の成分）のコピー数を示す接頭辞を含み、例えば、「１×」は１コピーを示し、「２×」は２コピーを示すなどである。
いくつかの構築物、例えば対照では、オペレーター（または転写単位もしくは発現系の他の成分）の指定または説明は、オペレーター（または他の成分）のコピー数を示す接頭辞を含み、０ｘはコピーがないこと（ゼロ）を示す（例えば、オペレーターまたは成分が存在しない）。いくつかの構築物、例えば対照では、ＴＡＤ（または転写単位もしくは発現系の他の成分）の指定または説明は、この成分が存在しないことを示す接頭辞「Ｎｏ＿」を含み；例えば、「Ｎｏ＿ＴＡＤ」は、ＴＡＤが存在しないことを示す。
いくつかの実施形態では、１コピーのｂｍＯが上流活性化配列内にある。ｂｍＯは、示された順序で、以下の３つの非コードサブ部分：（ｉ）非反復配列スペーサー、（ｉｉ）Ｂｍ３Ｒ１オペレーターＣＧＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＴＴＣＣＧ（配列番号１３０）、および（ｉｉｉ）非反復配列スペーサーの連結によって作成される。いくつかの実施形態では、１コピーのｂｍＯは配列番号１２６を含む。
いくつかの実施形態では、１コピーのｔｅｔＯが、１コピーのＴｅｔＲオペレーターを含む上流活性化配列内にある。ｔｅｔＯは、示された順序で、以下の３つの非コードサブ部分：（ｉ）非反復配列スペーサー、（ｉｉ）ＴｅｔＲオペレーターＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ（配列番号１３１）、および（ｉｉｉ）非反復配列スペーサーの連結によって作成される。いくつかの実施形態では、１コピーのｔｅｔＯは配列番号１２８を含む。
いくつかの実施形態では、１コピーのｐｈｌＯが上流活性化配列内にある。ｐｈｌＯは、示された順序で、以下の３つの非コードサブ部分：（ｉ）非反復配列スペーサー、（ｉｉ）ＰｈｌＦオペレーターＡＴＧＡＴＡＣＧＡＡＡＣＧＴＡＣＣＧＴＡＴＣＧＴＴＡＡＧＧＴ（配列番号１３２）、および（ｉｉｉ）非反復配列スペーサーの連結によって作成される。いくつかの実施形態では、１コピーのｐｈｌＯは配列番号１２７を含む。
いくつかの実施形態では、１コピーのｖａｎＯが、１コピーのＶａｎＲオペレーターを含む上流活性化配列内にある。ｖａｎＯは、示された順序で、以下の３つの非コードサブ部分：（ｉ）非反復配列スペーサー、（ｉｉ）ＶａｎＲオペレーターＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴ（配列番号１３３）、および（ｉｉｉ）非反復配列スペーサーの連結によって作成される。いくつかの実施形態では、１コピーのｖａｎＯは配列番号１２９を含む。
いくつかの実施形態において、上流活性化配列は、オペレーターを含まない（「０ｘｏｐｅｒａｔｏｒ」）。
いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるオペレーターは転写因子によって結合され、転写因子またはその成分は本開示の第１の転写単位によってコードされている。いくつかの実施形態では、１またはそれを超える結合したオペレーターは、コアプロモーター配列を活性化する。
いくつかの実施形態では、コアプロモーターは、天然に存在するコアプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は、天然に存在するコアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は合成である。いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は、宿主細胞にとって内因性である。いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は、宿主細胞にとって外因性である。いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は、宿主細胞の内因性コアプロモーター配列と相同配列を含む。いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は、宿主細胞の内因性コアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、コアプロモーター配列は、Ｐ（ＡＯＸ１）（配列番号１６２）、Ｐ（ＤＡＳ２）（配列番号１６３）、Ｐ（ＨＨＦ２）（配列番号１６４）またはＰ（ＰＭＰ２０）（配列番号１６５）由来のコアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一である配列を含むか、またはそれからなる。
合成アウトプットプロモーターの非限定的な例は、使用される４つの異なるＤＢＤタイプに基づいて、表１５、表１６、表１７、表１８および表３６に記載されており、２つの成分：上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターを含む。
実施例１で使用される合成アウトプットプロモーターのＤＮＡ配列は、表１５、表１６、表１７、表１８または表３６の対応する行を参照することによって得ることができる。実施例１で使用した合成アウトプットプロモーターの全ＤＮＡ配列を表３３および表３６に示す（配列番号による）。
いくつかの実施形態では、転写因子はＢｍ３Ｒ１のＤＮＡ結合ドメインを含み、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列は、０コピー、１コピー、２コピー、４コピーもしくは８コピー、または他の複数コピーのｂｍＯを含む。いくつかの実施形態では、２コピーのｂｍＯは、配列番号１３４を含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、４コピーのｂｍＯは、配列番号１３５を含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、８コピーのｂｍＯは、配列番号１３６を含むかまたはこれからなる。
いくつかの実施形態では、転写因子はＰｈｌＦ＿ＡＭのＤＮＡ結合ドメインを含み、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列は、０コピー、１コピー、２コピー、４コピーもしくは８コピー、または他の複数コピーのｐｈｌＯを含む。いくつかの実施形態では、２コピーのｐｈｌＯは、配列番号１３７を含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、４コピーのｐｈｌＯは、配列番号１３８を含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、８コピーのｐｈｌＯは、配列番号１３９を含むかまたはこれからなる。
いくつかの実施形態では、転写因子はＴｅｔＲのＤＮＡ結合ドメインを含み、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列は、０コピー、１コピー、２コピー、４コピーもしくは８コピー、または他の複数コピーのｔｅｔＯを含む。いくつかの実施形態では、２コピーのｔｅｔＯは、配列番号１４０を含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、４コピーのｔｅｔＯは、配列番号１４１を含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、８コピーのｔｅｔＯは、配列番号１４２を含むかまたはこれからなる。
いくつかの実施形態では、転写因子はＶａｎＲ＿ＡＭのＤＮＡ結合ドメインを含み、合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列は、０コピー、１コピー、２コピー、４コピーもしくは８コピー、または他の複数コピーのｖａｎＯを含む。いくつかの実施形態では、２コピーのｖａｎＯは、配列番号１４３を含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、４コピーのｖａｎＯは、配列番号１４４を含むかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、８コピーのｖａｎＯは、配列番号１４５を含むかまたはこれからなる。
転写ターミネーター［ＴＴ］
いくつかの実施形態では、転写単位は、必要に応じて転写ターミネーターを含む。
いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは転写（例えば、転写因子、転写活性化因子、または生物的産物の転写）を終結させることができる。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは順方向ターミネーターである。転写のためにプライミングされたポリヌクレオチド配列の下流に位置する場合、順方向転写ターミネーターは、ポリヌクレオチドの転写後に転写を終結させる。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位および／または第２の転写単位のいずれかまたは両方は、必要に応じて転写ターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位は、転写因子をコードするポリヌクレオチドの下流に必要に応じて第１の転写ターミネーターを含んでもよい。いくつかの実施形態では、第２の転写単位は、目的の遺伝子の下流に必要に応じて転写ターミネーターを含んでもよい。様々な実施形態において、第１の転写ターミネーターおよび第２の転写ターミネーターは、同じであるか、または異なる。
いくつかの実施形態では、第１の転写単位および／または第２の転写単位は、天然に存在する転写ターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および／または第２の転写単位は、合成転写ターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞で発現される場合、第１の転写単位および／または第２の転写単位は、宿主細胞にとって内因性の転写ターミネーターを含む。
いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、実施例１、実施例３、表２１および３２の核酸配列に対して、または配列番号１４６および１４７のいずれかの核酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、配列番号１４６および１４７のいずれかの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる。
いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーターおよび第２の転写単位の転写ターミネーターは、同じポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および／または第２の転写単位は、リボソームタンパク質をコードする遺伝子由来の転写ターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および／または第２の転写単位は、リボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）をコードする遺伝子由来の転写ターミネーターを含む（配列番号１４６）。いくつかの実施形態では、第１の転写単位および／または第２の転写単位は、アルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）をコードする遺伝子由来の転写ターミネーターを含む（配列番号１４７）。
転写ターミネーター（ＴＴ）の非限定的な例を、表１９、２１（ＲＰＳ２由来の転写ターミネーターの対応するＤＮＡ配列）および表３２（ＡＯＸ１由来の転写ターミネーターの対応するＤＮＡ配列）に記載する。
様々な転写ターミネーターが、本明細書および／または科学文献に記載されている。例えば、Ｍａｔｓｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．１２８：６５５－６６１；Ｃａｎｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１８ ＥＭＢＯ Ｊ．３７：ｅ９７４９０；Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．２０１６ ＷＩＲＥｓ ＲＮＡ ７：９１－１０４；ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．９：Ａｒｔｉｃｌｅ ４３６４；およびＫａｒｂａｌａｅｉ ｅｔ ａｌ．２０２ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．９：５８６７を参照のこと。本明細書および／または科学文献に記載されている任意の適切な転写ターミネーターは、転写単位または合成発現系の成分として組み込むことができる。
バリアント
いくつかの実施形態では、本開示は、転写単位または合成発現系のバリアントを提供する。
本開示の態様は、転写因子（例えば、インプットプロモーターから発現される）をコードするポリヌクレオチドおよび生物的産物（例えば、転写因子によって活性化される合成アウトプットプロモーターから発現される）をコードする目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドに関する。本出願に記載されるポリヌクレオチド、転写因子および生物的産物のバリアントも本開示に包含される。バリアントは、参照配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を共有し得る。
特に明記しない限り、当技術分野で公知の「配列同一性」という用語は、配列比較（アラインメント）によって決定される、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係を指す。いくつかの実施形態では、配列同一性は配列の全長にわたって決定されるが、他の実施形態では、配列同一性は配列の領域にわたって決定される。
同一性はまた、２またはそれを超える残基（例えば、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸残基）のストリング間のマッチ数によって決定される、２つの配列間の配列関連性の程度を指すことができる。同一性は、２またはそれを超える配列のうちの小さい方と、特定の数学的モデル、アルゴリズムまたはコンピュータプログラムによって対処されるギャップアライメント（存在する場合）との間の同一マッチのパーセントを測定する。
関連するポリヌクレオチド配列、転写因子および／または生物的産物の同一性は、当業者に公知の任意の方法によって容易に計算することができる。好ましい実施形態では、２つの配列（例えば、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列）の「同一性パーセント」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３で改変）のアルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ（登録商標）およびＸＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。２つの配列間にギャップが存在する場合、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（登録商標）を利用することができる。ＢＬＡＳＴ（登録商標）およびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ（登録商標）およびＮＢＬＡＳＴ（登録商標））のデフォルトパラメータを使用することができ、または当業者によって理解されるようにパラメータを適切に調整することができる。
使用され得る別のローカルアライメント技術は、例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）に基づく。使用され得る一般的なグローバルアライメント技術は、例えば、動的プログラミングに基づくＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）である。
より最近では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適なグローバルアライメント方法よりも速く核酸およびアミノ酸配列のグローバルアライメントを生成すると言われているＦａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＯＧＳＡＡ）が開発された。いくつかの実施形態では、２つのポリペプチドの同一性は、２つのアミノ酸配列をアライメントし、同一のアミノ酸の数を計算し、アミノ酸配列の一方の長さで割ることによって決定される。いくつかの実施形態では、２つのポリヌクレオチドの同一性は、２つのヌクレオチド配列をアライメントし、同一のヌクレオチドの数を計算し、ポリヌクレオチドの一方の長さで割ることによって決定される。
複数の配列アラインメントのために、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２０１１ Ｏｃｔ １１；７：５３９）を含むコンピュータプログラムを使用することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含む配列は、配列同一性がＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２０１１ Ｏｃｔ １１；７：５３９）を使用して決定される場合、本出願に開示されるおよび／または特許請求の範囲に記載される配列などの参照配列に対して特定のパーセント同一性を有することが見出される。
本出願で使用される場合、配列「Ｘ」中の残基（例えば核酸残基またはアミノ酸残基）は、配列ＸおよびＹが当技術分野で公知のアミノ酸配列アラインメントツールを使用してアライメントされる場合に配列Ｘ中の残基が配列Ｙ中のＺの対応位置にある場合、異なる配列「Ｙ」中の位置または残基（例えば核酸残基またはアミノ酸残基）「Ｚ」に対応すると呼ばれる。
突然変異は、当業者に公知の様々な方法によってヌクレオチド配列において作製することができる。例えば、突然変異は、ＰＣＲ指向突然変異、Ｋｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８－４９２，１９８５）の方法による部位指向突然変異誘発、ポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成、遺伝子編集ツール、またはタグ（例えば、ＨＩＳタグまたはＧＦＰタグ）の挿入などの挿入によって行うことができる。突然変異は、例えば、当技術分野で公知の任意の方法によって生成される置換、欠失および転座を含み得る。突然変異を生成する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１２、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１０などの参考文献に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、バリアントを作製するための方法は、環状置換（Ｙｕ ａｎｄ Ｌｕｔｚ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ Ｊａｎ；２９（１）：１８－２５）を含む。環状置換では、ポリペプチドの線状一次配列を環状化し（例えば、配列のＮ末端およびＣ末端を結合することによる）、ポリペプチドを異なる位置で切り離す（「切断する」）ことができる。したがって、新しいポリペプチドの線状一次配列は、線状配列アラインメント法（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａまたはＢＬＡＳＴ）によって決定されるように、低い配列同一性（例えば、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、未満または５％未満）を有し得る。しかしながら、２つのタンパク質のトポロジー分析は、２つのポリペプチドの三次構造が類似または非類似であることを明らかにし得る。特定の理論に束縛されるものではないが、参照ポリペプチドの環状置換によって作製され、参照ポリペプチドと類似の三次構造を有するバリアントポリペプチドは、類似の機能的特徴（例えば、酵素活性、酵素速度、基質特異性または生成物特異性）を共有することができる。いくつかの例では、環状置換は、二次構造、三次構造または四次構造を変化させ、異なる機能的特徴（例えば、酵素活性の増加または減少、異なる基質特異性、または異なる生成物特異性）を有する酵素を産生し得る。例えば、Ｙｕ ａｎｄ Ｌｕｔｚ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ Ｊａｎ；２９（１）：１８－２５を参照のこと。
環状置換を受けたタンパク質では、タンパク質の線状アミノ酸配列は、環状置換を受けていない参照タンパク質とは異なることを理解されたい。しかしながら、当業者は、例えば配列を整列させ、保存されたモチーフを検出することによって、および／または、例えば相同性モデリングによってタンパク質の構造または予測される構造を比較することによって、環状置換を受けたタンパク質中のどの残基が環状置換を受けていない参照タンパク質中の残基に対応するかを決定することができるであろう。
いくつかの実施形態では、バリアント配列は相同配列を含む。本出願で使用される場合、相同配列は、特定のパーセント同一性（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のパーセント同一性を共有する配列（例えば、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列）である。相同配列には、パラロガス配列、オルソロガス配列、または収束進化から生じる配列が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、パラロガス配列は、種のゲノム内の遺伝子の重複から生じるが、オーソロガス配列は種分化事象後に分岐する。２つの異なる種は独立して進化した可能性があるが、収束進化の結果として、他の種からの配列と特定のパーセント同一性を共有する配列をそれぞれ含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドと二次構造（例えば、アルファヘリックス、ベータシート）を共有するドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドと三次構造を共有する。非限定的な例として、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して低い一次配列同一性（例えば、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満の配列同一性）を有し得るが、１またはそれを超える二次構造（例えば、ループ、アルファヘリックス、またはベータシートを含むがこれらに限定されない）を共有するか、または参照ポリペプチドと同じ三次構造を有し得る。例えば、ループは、ベータシートとアルファヘリックスとの間、２つのアルファヘリックスの間、または２つのベータシートの間に配置され得る。相同性モデリングを使用して、２またはそれを超える三次構造を比較することができる。
本出願に開示されるタンパク質、酵素、または他の生物的産物の機能的バリアントも本開示に含まれる。機能的バリアントは、当技術分野で公知の任意の方法を用いて同定され得る。例えば、上記のＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを用いて、既知の機能を有する相同タンパク質を同定することができる。
機能的にアノテーションされたドメインを有するポリペプチドを検索することによって、推定される機能的バリアントを同定することもできる。Ｐｆａｍ（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．１９９７ Ｊｕｌ；２８（３）：４０５－２０）を含むデータベースを使用して、特定のドメインを有するポリペプチドを同定することができる。
当業者はまた、生物的産物のコード配列における突然変異が、前述の生物的産物の機能的に等価なバリアント、例えば生物的産物の活性を保持するバリアントを提供するための保存的アミノ酸置換をもたらし得ることを認識するであろう。本出願で使用される「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換が行われる生物的産物の相対的な電荷もしくはサイズ特性または機能活性を変化させないアミノ酸置換を指す。
当業者はまた、組換えポリペプチドのコード配列における突然変異が、前述のポリペプチドの機能的に等価なバリアント、例えばポリペプチドの活性を保持するバリアントを提供するための保存的アミノ酸置換をもたらし得ることを認識するであろう。本出願で使用される「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷もしくはサイズ特性または機能活性を変化させないアミノ酸置換を指す。
いくつかの例において、アミノ酸は、そのＲ基（例えば、表２９を参照）を特徴とする。例えば、アミノ酸は、非極性脂肪族Ｒ基、正荷電Ｒ基、負荷電Ｒ基、非極性芳香族Ｒ基、または極性非荷電Ｒ基を含んでもよい。非極性脂肪族Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的な例としては、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンが挙げられる。正荷電Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的な例としては、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。負荷電Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的な例としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。非極性芳香族Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的な例としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。極性非荷電Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的な例としては、セリン、トレオニン、システイン、プロリン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。
ポリペプチドの機能的に等価なバリアントの非限定的な例は、本出願に開示されるタンパク質のアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換を含み得る。アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ，Ｙ，Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。保存的アミノ酸置換のさらなる非限定的な例を表２９に提供する。
いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドを調製する際に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個または２０個を超える残基を変更することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、保存的アミノ酸置換によって置き換えられる。
Figure 2023540500000002
所望の特性および／または活性を有する組換えポリペプチドバリアントを産生するためのポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、ポリペプチドのコード配列の変更によって行うことができる。同様に、ポリペプチドの機能的に等価なバリアントを産生するためのポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、典型的には組換えポリペプチドのコード配列の変更によって行われる。
いくつかの実施形態では、本出願に記載される生物的産物のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、１またはそれを超える調節配列の制御下にある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、プロモーターは天然プロモーターである。本明細書で使用される場合、「天然」プロモーターは、少なくとも１つのコピーが宿主細胞において天然に存在するプロモーターを指す。天然プロモーターには、宿主細胞における元のコピー（単数または複数）が含まれ得るが、これらに限定されない。それにもかかわらず、細胞におけるその天然の遺伝子座とは異なる遺伝子座におけるプロモーターは、その細胞にとって天然であるプロモーターとみなされる。いくつかの実施形態では、プロモーターは合成である。
本出願で使用される表現および用語は、説明のためのものであり、限定とみなされるべきではない。本出願における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、および／またはそれらの変形などの用語の使用は、その後に列挙される項目およびその均等物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。実施例における任意の特定の方法、プロセス、培地または条件の具体的な詳細は、例にすぎず、限定することを意図するものではない。
記載された実施形態
特定の実施形態は、以下に記載された項に記載されている。
１． 合成発現系を含む、メチロトローフ性宿主細胞であって、前記合成発現系が、
（ａ）（ｉ）上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含むインプットプロモーター、ならびに
（ｉｉ）合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドであって、前記合成転写因子がＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含み、前記ＤＢＤおよび前記ＴＡＤが前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、ポリヌクレオチド
を含む第１の転写単位であって、前記インプットプロモーターが、前記合成転写因子の前記少なくとも１つの成分の発現を駆動する、第１の転写単位と、
（ｂ）目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位であって、前記合成転写因子が前記合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、第２の転写単位と、
を含み、
前記目的の遺伝子は、外因的に提供されるメタノールの非存在下で発現される、メチロトローフ性宿主細胞。
２． 前記第１の転写単位の前記ポリヌクレオチドが、前記合成転写因子のすべての成分をコードする、項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
３． 前記インプットプロモーターが合成のものである、項１～２のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
４． 前記インプットプロモーターが、天然に存在するプロモーターと少なくとも９０％の配列同一性を有する、項３に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
５． 前記インプットプロモーターが天然に存在する、項４に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
６． 前記インプットプロモーターが前記細胞にとって天然である、項５に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
７． 前記インプットプロモーターが、調節可能なインプットプロモーターである、項１～５のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
８． 前記調節可能なインプットプロモーターが誘導性である、項７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
９． 前記調節可能なインプットプロモーターが抑制性である、項７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１０． 前記調節可能なインプットプロモーターが、同族の培養プロセスに関する栄養素の添加、制限、または枯渇に応答する、項７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１１． 前記調節可能なインプットプロモーターが、チアミン枯渇、グリセロール制限、単糖制限、または炭素源、糖、デンプン、ガラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、イノシトール、グリセロール、ビタミン、ステロイド、窒素源、硝酸、亜硝酸、アンモニウム、アミノ酸、メチオニン、重金属、銅、安息香酸、過酸化水素、カルシウム含有化合物および／もしくはリン酸の制限に応答する、項１０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１２． 前記調節可能なインプットプロモーターが、任意の２またはそれを超える栄養素の組み合わせの制限または枯渇に応答する、項１０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１３． 前記調節可能なインプットプロモーターの活性が、外因的に提供されるギ酸の存在によって増加する、項１０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１４． 前記調節可能なインプットプロモーターが、外因的に提供されるメタノールの非存在下で調節可能である、項７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１５． 前記インプットプロモーターがメタノール誘導性でない、項１～１４のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１６． 前記インプットプロモーターが構成的インプットプロモーターである、項１～９のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１７． 前記インプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）および／または前記コアプロモーターエレメントが、前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、項１～１６のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１８． 前記インプットプロモーターが、Ｐ（ＪＥＮ１）、Ｐ（ＧＱ６７０４４９９）、Ｐ（ＧＱ６７００９２６）、Ｐ（ＨＧＴ１）、Ｐ（ＦＤＨ１）、Ｐ（ＡＯＸ２）、Ｐ（ＲＧＩ２）、Ｐ（ＴＨＩ１３）＿ｓｈｏｒｔ、Ｐ（ＴＨＩ１３）＿ｌｏｎｇ、またはＰ（ＴＨＩ４）である、項１～１５のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１９． 前記インプットプロモーターが、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドである、項１～１８のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
２０． 前記インプットプロモーターが、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドである、項１～１８のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
２１． 前記合成転写因子の前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、Ｂｍ３Ｒ１、ＴｅｔＲ、ＰｈｌＦ＿ＡＭ、またはＶａｎＲ＿ＡＭである、項１～２０のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
２２． 前記合成転写因子の前記転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）が、Ｂ１１２＿ＴＡＤ、Ｂ４２＿ＴＡＤ、ＧＡＬ４＿ＴＡＤ、ｍｉｎｉＶＰＲ＿ＴＡＤ、Ｍｘｒ１＿ＴＡＤ、ＰＨ＿ＴＡＤ、ＶＰ１６＿ＴＡＤ、ＶＰ６４＿ＴＡＤ、ＶＰ６４ｖ２＿ＴＡＤ、ＶＰＨ＿ＴＡＤ、またはＶＰＲ＿ＴＡＤである、項１～２１のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
２３． 前記合成転写因子の前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、Ｂｍ３Ｒ１、ＴｅｔＲ、ＰｈｌＦ＿ＡＭ、またはＶａｎＲ＿ＡＭであり、前記合成転写因子の前記転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）が、Ｂ１１２＿ＴＡＤ、Ｂ４２＿ＴＡＤ、ＧＡＬ４＿ＴＡＤ、ｍｉｎｉＶＰＲ＿ＴＡＤ、Ｍｘｒ１＿ＴＡＤ、ＰＨ＿ＴＡＤ、ＶＰ１６＿ＴＡＤ、ＶＰ６４＿ＴＡＤ、ＶＰ６４ｖ２＿ＴＡＤ、ＶＰＨ＿ＴＡＤ、またはＶＰＲ＿ＴＡＤである、項１～２２のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
２４． 前記合成転写因子が、前記インプットプロモーターの活性化因子ではない、項１～２３のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
２５． 前記合成転写因子が１成分合成転写因子である、項１～２３のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
２６． 前記合成転写因子が、２成分または多成分の合成転写因子である、項１～２３のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
２７． 前記２成分または多成分の合成転写因子が、少なくとも２つのバイオコンジュゲートタンパク質産物を含む、項２６に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
２８． 第１のバイオコンジュゲートタンパク質産物（ＢＰＰ１）がＳｐｙＴａｇ００２であり、第２のバイオコンジュゲートタンパク質産物（ＢＰＰ２）がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２である、項２７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
２９． 前記合成転写因子が核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、項１～２８のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
３０． 前記核局在化シグナルがＳＶ４０核局在化シグナルである、項２９に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
３１． 前記合成転写因子がリンカーを含む、項１～３０のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
３２． 前記合成転写因子が自己切断性ポリペプチドを含む、項１～３１のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
３３． 前記自己切断性ポリペプチドが２Ａペプチドである、項３２に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
３４． 前記自己切断性ポリペプチドがＥＲＢＶ＿１＿Ｐ２Ａである、項３２に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
３５． 前記合成転写因子がオリゴマー化ドメインを含む、項１～３４のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
３６． 前記オリゴマー化ドメインが、Ｌｉｎｋｅｒ＿ｏｎｌｙ＿ｆｏｒ＿ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿ｄｏｍａｉｎ、またはＨｅｐｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿ｄｏｍａｉｎである、項３５に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
３７． 前記合成転写因子が、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項１～３６のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
３８． 前記第１の転写単位が、配列番号２６～４０または１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む、項１～３７のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
３９． 前記合成アウトプットプロモーターがメタノール誘導性でない、項１～３８のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
４０． 前記合成アウトプットプロモーターが、上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含む、項１～３９のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
４１． 前記合成アウトプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）が、前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
４２． 前記合成アウトプットプロモーターの前記コアプロモーターエレメントが、３００塩基対以下の長さの核酸配列を有する、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
４３． 前記合成アウトプットプロモーターの前記コアプロモーターエレメントが、約６塩基対～約３００塩基対、約２５塩基対～約２５０塩基対、約７５～約２２５塩基対、または約１００塩基対～約１７５塩基対の長さである核酸配列を有する、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
４４． 前記合成アウトプットプロモーターの、前記上流活性化配列（ＵＡＳ）の３’末端と前記コアプロモーターエレメントの５’末端との間の距離が、０～約２００塩基対の長さである、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
４５． 前記合成アウトプットプロモーターの、前記上流活性化配列（ＵＡＳ）と前記コアプロモーターエレメントとの間の距離が、約６塩基対～約２００塩基対、約６塩基対～約５３塩基対、約２０塩基対～約１５０塩基対、約５０塩基対～約１２５塩基対、または約５０塩基対～約１００塩基対の長さを有する核酸配列である、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
４６． 前記合成アウトプットプロモーターの前記コアプロモーターエレメントが、天然に存在するコアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるコアプロモーター配列を含む、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
４７． 前記合成アウトプットプロモーターの前記コアプロモーターエレメントが、Ｐ（ＡＯＸ１）、Ｐ（ＤＡＳ２）、Ｐ（ＨＨＦ２）、またはＰ（ＰＭＰ２０）由来のコアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるコアプロモーター配列を含む、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
４８． 前記合成アウトプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）が、ｂｍＯ、ｔｅｔＯ、ｐｈｌＯ、またはｖａｎＯである、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
４９． 前記合成アウトプットプロモーターが、１またはそれを超えるオペレーターをさらに含む、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
５０． 前記合成アウトプットプロモーターの前記１またはそれを超えるオペレーターが、前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、項４９に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
５１． 前記合成転写因子が前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）Ｂｍ３Ｒ１を含み、前記合成アウトプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）がｂｍＯの１またはそれを超えるコピーを含む、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
５２． 前記合成転写因子が前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ＰｈｌＦ＿ＡＭを含み、前記合成アウトプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）がｐｈｌＯの１またはそれを超えるコピーを含む、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
５３． 前記合成転写因子が前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ＴｅｔＲを含み、前記合成アウトプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）がｔｅｔＯの１またはそれを超えるコピーを含む、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
５４． 前記合成転写因子が前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ＶａｎＲ＿ＡＭを含み、前記合成アウトプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）がｖａｎＯの１またはそれを超えるコピーを含む、項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
５５． 前記合成アウトプットプロモーターが、配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む、項１～５４のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
５６． 前記目的の遺伝子がＲＮＡとして発現される、項１～５５のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
５７． 前記目的の遺伝子がタンパク質をコードする、項１～５５のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
５８． 前記目的の遺伝子が、酵素、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、感覚タンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質、または貯蔵タンパク質をコードする、項５７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
５９． 前記タンパク質が、分子を合成、修飾、または変換する、項５７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
６０． 前記分子が、ヘムまたはヘム生合成経路の中間体である、項５９に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
６１． 前記タンパク質がヘム結合タンパク質である、項５７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
６２． 前記ヘム結合タンパク質が、ヘモグロビン、ニューログロビン、サイトグロビン、レグヘモグロビン、またはミオグロビンである、項６１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
６３． 前記タンパク質が、ワクシニアキャップ化酵素、Ｔ７ポリメラーゼ、またはＯ－メチルトランスフェラーゼである、項５７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
６４． 前記タンパク質がヘム生合成経路の酵素である、項５７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
６５． 前記ヘム生合成経路の酵素が、シトクロムＰ４５０、９－アデニル酸シクラーゼ、可溶性グアニル酸シクラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、および／またはシトクロムオキシダーゼである、項６４に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
６６． 前記第２の転写単位に、分泌タグをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
６７． 前記分泌タグが、α－アミラーゼ分泌タグ、Ｓｃ Ｍｆ α１分泌タグ、またはプレ－イヌリナーゼ分泌タグである、項６６に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
６８． 前記目的の遺伝子がタンパク質をコードし、前記タンパク質が前記メチロトローフ性宿主細胞から分泌される、項６６に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
６９． 前記分泌タンパク質が、α－アミラーゼ、β－ラクトグロブリン、またはオボアルブミンである、項６８に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
７０． 前記第１の転写単位および／または前記第２の転写単位が、転写ターミネーターをさらに含む、項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
７１． 前記第１の転写単位および／または前記第２の転写単位の前記転写ターミネーターが天然に存在する、項７０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
７２． 前記第１の転写単位および／または前記第２の転写単位の前記転写ターミネーターが合成のものである、項７０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
７３． 前記第１の転写単位および／または前記第２の転写単位の前記転写ターミネーターが、リボソームタンパク質をコードする遺伝子由来である、項７０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
７４． 前記遺伝子が、リボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）をコードする、項７３に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
７５． 前記転写ターミネーターが、配列番号１４６または配列番号１４７のいずれかの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む、項７３に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
７６． 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、スペーサーによって分離されている、項１～７５のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
７７． 前記第１の転写単位および／または前記第２の転写単位が、複数コピーで存在する、項１～７６のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
７８． 前記第２の転写単位対前記第１の転写単位のコピー数の比が１：１である、項７７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
７９． 前記第２の転写単位対前記第１の転写単位のコピー数の比が、少なくとも２：１、少なくとも４：１、または少なくとも１０：１である、項７７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
８０． 前記第１の転写単位対前記第２の転写単位のコピー数の比が、少なくとも２：１、少なくとも４：１、または少なくとも１０：１である、項７７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
８１． 前記第１の転写単位が単一コピーで存在し、前記第２の転写単位が複数コピーで存在する、項７７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
８２． 前記複数の第２の転写単位のうちの少なくとも２つが、異なる目的の遺伝子を含む、項８１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
８３． 前記第１の転写単位の前記合成転写因子が、前記複数の第２の転写単位の各合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、項８１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
８４． 前記合成発現系が、前記メチロトローフ性宿主細胞に対して内因性である１またはそれを超える配列を含む、項１～８３のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
８５． 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、単一のプラスミド上に位置する、項１～８４のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
８６． 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、異なるプラスミド上に位置する、項１～８４のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
８７． 前記第１の転写単位および／または前記第２の転写単位が、前記メチロトローフ性宿主細胞のゲノムに組み込まれている、項１～８４のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
８８． 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、前記メチロトローフ性宿主細胞ゲノム内の同じ染色体上に位置する、項８７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
８９． 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、同じ方向に向けられている、項８７～８８のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
９０． 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、異なる方向に向けられている、項８７～８８のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
９１． 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、前記メチロトローフ性宿主細胞ゲノム内の異なる染色体上に位置する、項８７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
９２． 前記メチロトローフ性宿主細胞がメチロトローフ性酵母細胞である、項１～９１のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
９３． 前記メチロトローフ性宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＣａｎｄｉｄａから選択される属に由来する、項１～９２のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
９４． 前記メチロトローフ性宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｋｕｒｔｚｍａｎｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｍｏｎｄａｖｉｏｒｕｍ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、またはＰｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａである、項９３に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
９５． 前記メチロトローフ性宿主細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、項９３に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
９６． 前記合成発現系が、前記目的の遺伝子によってコードされる生物的産物生物的産物の産生を、対照宿主細胞において産生される前記生物的産物のレベルよりも高いレベルで提供する、項１～９５のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
９７． 前記対照宿主細胞が、前記メチロトローフ性宿主細胞と同じ種のものである、項９６に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
９８． 前記対照宿主細胞が、目的の遺伝子に作動可能に連結されたメタノール誘導性プロモーターを含む、項９７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
９９． 前記対照宿主細胞によってコードされる目的の遺伝子が、前記メチロトローフ性宿主細胞によってコードされる同じ目的の遺伝子である、項９８に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１００． 前記メタノール誘導性プロモーターが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＰ（ＡＯＸ１）である、項９８に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１０１． 前記対照細胞が、外因的に添加されたメタノールの存在下で培養される、項１００に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１０２． 前記メチロトローフ性宿主細胞が、増殖期および産生期を含む条件下で培養される、項１～１０１のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１０３． 前記産生期に前記メチロトローフ性宿主細胞において産生される前記目的の遺伝子の転写産物の量が、前記増殖期に前記メチロトローフ性宿主細胞において産生される前記目的の遺伝子の転写産物の量よりも少なくとも１００％高い、項１０２に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１０４． 前記産生期に前記メチロトローフ性宿主細胞において産生される前記目的の遺伝子の転写産物の量が、前記増殖期に前記メチロトローフ性宿主細胞において産生される前記目的の遺伝子の転写産物の量よりも少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％高い、項１０２に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１０５． 前記合成発現系が、前記目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を、対照宿主細胞において産生される前記生物的産物のレベルよりも少なくとも２００％高いレベルで提供する、項１～１０４のいずれかに記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１０６． 前記合成発現系が、前記目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を、対照宿主細胞において産生される前記生物的産物のレベルよりも少なくとも６００％、少なくとも９００％、少なくとも１２００％、少なくとも１５００％、少なくとも１８００％、少なくとも２１００％、少なくとも２４００％、少なくとも２７００％、または少なくとも３０００％高いレベルで提供する、項１０５に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１０７． 前記合成発現系が、前記目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を、対照宿主細胞で産生される前記生物的産物のレベルよりも約３００％～約６００％、約５００％～約１０００％、約８００％～約１５００％、約１０００％～約２０００％、約１２００％～約２０００％、約１８００％～約２５００％、約２０００％～約２５００％、または約２２００％～約３０００％高いレベルで提供する、項１０５に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１０８． 合成発現系を含む、メチロトローフ性宿主細胞であって、前記合成発現系が、
（ａ）（ｉ）上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含むインプットプロモーター、ならびに
（ｉｉ）合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドであって、前記合成転写因子がＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含み、前記ＤＢＤおよび前記ＴＡＤが前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、ポリヌクレオチド
を含む第１の転写単位であって、前記インプットプロモーターが、前記合成転写因子の前記少なくとも１つの成分の発現を駆動する、第１の転写単位と、
（ｂ）目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位であって、前記合成転写因子が前記合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、第２の転写単位と、
を含み、
前記目的の遺伝子は、外因的に提供されるメタノールの非存在下で発現され、
メチロトローフ性宿主細胞は、増殖期および産生期を含む条件下で培養され、
前記産生期にメチロトローフ性宿主細胞によって産生される前記目的の遺伝子の転写産物の量が、前記増殖期におけるよりも少なくとも１００％多い、メチロトローフ性宿主細胞。
１０９． 合成発現系を含む、メチロトローフ性宿主細胞であって、前記合成発現系が、
（ａ）（ｉ）上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含むインプットプロモーター、ならびに
（ｉｉ）合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドであって、前記合成転写因子がＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含み、前記ＤＢＤおよび前記ＴＡＤが前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、ポリヌクレオチド
を含む第１の転写単位であって、前記インプットプロモーターが、前記合成転写因子の前記少なくとも１つの成分の発現を駆動する、第１の転写単位と、
（ｂ）目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターであって、前記合成転写因子が前記合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、合成アウトプットプロモーターと、分泌タグをコードするポリヌクレオチドを含む第２の転写単位と、
を含み、
前記目的の遺伝子は、外因的に提供されるメタノールの非存在下で発現される、メチロトローフ性宿主細胞。
１１０． 合成発現系を含む、メチロトローフ性宿主細胞であって、前記合成発現系が、
（ａ）（ｉ）上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含むインプットプロモーター、ならびに
（ｉｉ）合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドであって、前記合成転写因子がＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含み、前記ＤＢＤおよび前記ＴＡＤが前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、ポリヌクレオチド
を含む第１の転写単位であって、前記インプットプロモーターが、前記合成転写因子の前記少なくとも１つの成分の発現を駆動する、第１の転写単位と、
（ｂ）目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位であって、前記合成転写因子が前記合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、第２の転写単位と、
を含み、
前記目的の遺伝子は、外因的に提供されるメタノールの非存在下で発現され、
前記合成発現系が、前記目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を、対照宿主細胞において産生される前記生物的産物のレベルよりも少なくとも３００％高いレベルで提供する、メチロトローフ性宿主細胞。
１１１． 項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞を培養する工程を含む、目的の遺伝子を発現させる方法。
１１２． 前記目的の遺伝子が、ヘム結合タンパク質またはヘム生合成経路の１またはそれを超える酵素をコードする、項１１１に記載の方法。
１１３． 前記ヘム結合タンパク質が、ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビン、サイトグロビン、またはレグヘモグロビンである、項１１２に記載の方法。
１１４． 前記ヘム生合成経路の１またはそれを超える酵素が、シトクロムＰ４５０、９－アデニル酸シクラーゼ、可溶性グアニル酸シクラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、および／またはシトクロムオキシダーゼである、項１１２に記載の方法。
１１５． 前記目的の遺伝子が、ワクシニアキャップ化酵素、Ｔ７ポリメラーゼ酵素、またはＯ－メチルトランスフェラーゼ酵素をコードする、項１１１に記載の方法。
１１６． 目的の分子を製造する方法であって、項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞を培養し、バイオマスまたは培養物から前記目的の分子を得る工程を含む、方法。
１１７． 前記得る工程が、前記目的の分子をバイオマスから抽出することを含む、項１１６に記載の方法。
１１８． 前記得る工程が、培養物、培養培地、細胞不含使用済み培養培地、および／または細胞含有培養培地から前記分子を回収することを含む、項１１６に記載の方法。
１１９． 項１１１～１１５のいずれか一項にしたがって目的の遺伝子を発現させる工程を含む目的の分子を産生する方法であって、前記目的の遺伝子が酵素をコードし、前記方法は、
（ａ）前記目的の遺伝子によってコードされる前記酵素を精製する工程、および
（ｂ）前記目的の分子への基質の生物変換のために前記精製された酵素を使用する工程、を含む、方法。
１２０． 前記目的の分子がヘムである、項１１６～１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２１． 目的の遺伝子を発現させるか、または目的の分子を産生する方法であって、
（ａ）項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞を、ある期間にわたって適切な培地中で培養して細胞増殖させる工程、および
（ｂ）１またはそれを超える培養条件を変更して前記目的の遺伝子の発現または前記目的の分子の産生を促進する工程、を含む、方法。
１２２． １またはそれを超える培養条件を変更することが、前記培養培地の組成を変更することを含む、項１２１に記載の方法。
１２３． 工程（ｂ）が、栄養素を制限、添加、および／または枯渇させることを含む、項１２１～１２２のいずれか一項に記載の方法。
１２４． 工程（ｂ）が、チアミン枯渇、グリセロール制限、単糖制限、またはギ酸添加を含む、項１２１～１２３のいずれか一項に記載の方法。
１２５． 工程（ｂ）が、任意の炭素源、糖、デンプン、ガラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、イノシトール、グリセロール、ビタミン、ステロイド、窒素源、硝酸、亜硝酸、アンモニウム、アミノ酸、メチオニン、重金属、銅、安息香酸、過酸化水素、カルシウム含有化合物、および／またはリン酸の制限を含む、項１２１～１２４のいずれか一項に記載の方法。
１２６． 工程（ｂ）が、任意の２つの栄養素の組み合わせの制限を含む、項１２１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
１２７． 工程（ｂ）が、グルコースの制限およびチアミンの枯渇を含む、項１２１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
１２８． 配列番号１～１５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む合成発現系。
１２９． 前記合成発現系が、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むインプットプロモーターを含む、項１２８に記載の合成発現。
１３０． 前記合成発現系が、合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドを含む、項１２８～１２９のいずれかに記載の合成発現。
１３１． 合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２６～４０または１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、項１３０に記載の合成発現系。
１３２． 前記コードされた合成転写因子が、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含む、項１３１に記載の合成発現系。
１３３． 前記合成発現系が、配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む合成アウトプットプロモーターを含む、項１２８～１３２のいずれか一項に記載の合成発現。
１３４． 配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１３５． 配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１３６． 前記合成転写因子が、配列番号２６～４０または１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１３７． 前記合成転写因子が、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含む、項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
１３８． タンパク質発現のために宿主細胞を操作する方法であって、
項１２８～１３３のいずれか一項に記載の合成発現系で前記宿主細胞を形質転換する工程を含む、方法。
１３９． 複数の核酸分子であって、前記複数の核酸分子における各核酸分子は、
（ａ）転写単位またはその成分をコードする核酸配列を含む第１の転写単位と、
（ｂ）蛍光タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターの核酸配列を含む第２の転写単位と、
（ｃ）異なるバーコードの核酸配列と目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位であって、前記合成転写因子が前記合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、第２の転写単位と、
を含み、
前記合成転写因子が前記合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、
複数の核酸分子。
１４０． 前記複数の核酸分子が、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００または少なくとも５０，０００の異なる核酸分子を含む、項１３９に記載の複数の核酸分子。
１４１． 項１３９～１４０のいずれか一項に記載の核酸分子を含む複数の宿主細胞を、目的の特性についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）個々の宿主細胞において複数の核酸分子を発現させる工程と、
（ｂ）目的の特性を有する宿主細胞を単離する工程と
を含む方法。
１４２． （ｂ）における前記核酸分子が、次世代シークエンシングにより特定される、項１４１に記載の方法。
実施例１．ライブラリの設計および構築。
この非限定的な例は、例示的な合成発現系を含む宿主細胞の設計および構築を記載する。本開示による合成発現系の他の実施形態は、この例では除外されない。
合成発現系（ＳＥＳ）ライブラリを、目的の３つのメタノール非依存性培養プロセス、すなわちプロセス１（グリセロール制限およびギ酸原価）、プロセス２（グルコース制限およびギ酸添加）、およびプロセス３（グルコース制限およびチアミン枯渇）を使用して目的の遺伝子の発現を増加させるように設計した。設計原理はすべての場合で同じであった。
具体的には、第１の転写単位は、インプットプロモーターの転写制御下で合成転写因子（ｓＴＦ）を発現するように設計された。この実験のためのインプットプロモーターは、メタノール非依存性プロセスの産生期中に誘導されることに基づいて選択された（例えば、プロセス１、プロセス２、またはプロセス３であるが、対応するインプットプロモーターを有する他のプロセスを選択することもできた）。第２の転写単位を、第１の転写単位によって発現されるｓＴＦのＤＮＡ結合ドメインと同族であるように設計された合成アウトプットプロモーターの転写制御下で、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）（すなわち、目的の遺伝子）をコードするレポーター遺伝子を発現するように設計した。合わせて、特定の第１の転写単位および特定の第２の転写単位は、ＳＥＳを含む。
プロセス１～３の各々について、ＤＮＡベースのＳＥＳライブラリは、８つのＳＥＳサブライブラリを含み、各サブライブラリは、８つの異なるタイプのｓＴＦのうちの１つに対応していた：（１）１成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦ、（２）１成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦ、（３）１成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ、（４）１成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦ、（５）２成分Ｂｍ３Ｒ１ベースのｓＴＦ、（６）２成分ＰｈｌＦ＿ＡＭベースのｓＴＦ、（７）２成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ、（８）２成分ＶａｎＲ＿ＡＭベースのｓＴＦ。各所与のプロセス＃の各ＳＥＳライブラリは、８つのＳＥＳサブライブラリを一緒にプールすることによって作製された。完全な詳細は、表１、２、および３に見出すことができる。
本実施例で使用された２成分ｓＴＦは、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１と２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２との間の分子間複合体化が、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムのバージョンを使用した共有結合イソペプチド結合形成によって媒介されるタイプのものであったが、ＳｐｙＴａｇバリアントと機能的に同等の任意の短いタンパク質配列を「バイオコンジュゲートタンパク質部分１（ＢＰＰ１）」と呼ぶことができ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒバリアントと機能的に同等の任意の同族タンパク質配列を「バイオコンジュゲートタンパク質部分２（ＢＰＰ２）」と呼ぶことができる。
さらに、本実施例で使用した２成分ｓＴＦでは、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１のタンパク質配列および２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２のタンパク質配列は、単一のプロモーターによって駆動される同じ転写単位にコードされ、２つの異なるポリペプチド鎖は、介在するコードされたＰ２Ａ配列によって媒介される「リボソームスキッピング」事象を介して単一のコード配列から生成された。別の可能な構成は、２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃１のタンパク質配列および２成分ｓＴＦ成分ポリペプチド＃２のタンパク質配列は、それぞれ別個のプロモーターによって駆動される別個の転写単位でコードされるものであった。
８つのＳＥＳサブライブラリのそれぞれは、５つの部分タイプの組み合わせのアセンブリを含み、これらの５つの部分タイプのそれぞれは、１またはそれを超えるバリアントＤＮＡ配列を含み、部分タイプ間には機能的相互依存性があり、ｓＴＦのＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、Ｂｍ３Ｒ１、ＰｈｌＦ＿ＡＭ、ＴｅｔＲ、またはＶａｎＲ＿ＡＭ）と合成アウトプットプロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）との間の同族関係を維持していた。
より具体的には、各サブライブラリの組み合わせのアセンブリの部分タイプは以下のとおりであった：（１）インプットプロモーター［Ｐ（ｉｎ）］、（２）ｓＴＦ（上記の８つのタイプのうちの１つ）、（３）第１の転写単位の転写ターミネーター（ＴＴ）、（４）スペーサー、および（５）合成アウトプットプロモーター［Ｐ（ｏｕｔ）］。任意部分（３）および（４）は、効率をＳＥＳに付与すると推定されたので含まれた。内因性配列はまた、これらの部分のいくつかまたは部分の断片についてｉｎ ｓｉｔｕで使用することもできる。所与のＳＥＳサブライブラリの理論的組み合わせのサイズは、５つの部分タイプにわたるバリアント部分の数の積であった。例えば、部分タイプ１、２、３、４、および５のそれぞれ５、２４、１、１、および２０個のバリアントがある場合、理論上のサブライブラリサイズは２４００、または５×２４×１×１×２０になる。全ＳＥＳライブラリの理論サイズは、８つのＳＥＳサブライブラリのそれぞれの理論サイズの合計である。例えば、８つのＳＥＳサブライブラリにわたって２４００、２３００、２３００、２２００、９５００、９１００、９１００、および９２００個のバリアントがあった場合、理論上の全ＳＥＳライブラリサイズは４６、１００、または２４００＋２３００＋２３００＋２２００＋９５００＋９１００＋９１００＋９２００となる。
表１は、発酵プロセス１の完全なＤＮＡベースのＳＥＳライブラリを設計するために使用された部分タイプ、ならびに表４～表２１を参照して、対応する部分タイプバリアントおよびそれらの配列を記載する。プロセス１の理論的な全ＳＥＳライブラリサイズは４６，１００バリアントであった。表２は、発酵プロセス２のためのＳＥＳライブラリを記載しており、理論的な全ＳＥＳライブラリサイズは５５，３２０バリアントである。表３は、発酵プロセス３のためのＳＥＳライブラリを記載しており、理論的な全ＳＥＳライブラリサイズは２７，６６０バリアントである。
Figure 2023540500000003
Figure 2023540500000004
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Figure 2023540500000010
Figure 2023540500000011
各ＳＥＳサブライブラリについて、部分（１）インプットプロモーター（Ｐ（ｉｎ））、（２）ｓＴＦ（上記の８つのタイプのうちの１つ）および（５）合成アウトプットプロモーター（Ｐ（ｏｕｔ））は、複数のバリアントを有した。Ｐ（ｉｎ）を、表４、表５、および表６に記載する。プロセス１に使用したＰ（ｉｎ）とプロセス２に使用したＰ（ｉｎ）との間には重複がある。表４、表５、および表６に記載されるすべてのインプットプロモーターのバリアントについて、対応するＤＮＡ配列は表２１に示す。
表４．プロセス１（グリセロール制限＋ギ酸添加）と共に使用するためのインプットプロモーター。部分タイプバリアントのＤＮＡ配列は表２１に示す。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされる。インプットプロモーター部分タイプは必要であるが、他の特定のインプットプロモーターを選択することができた。
Figure 2023540500000012
 表５．プロセス２（グルコース制限＋ギ酸添加）と共に使用するためのインプットプロモーター。部分タイプバリアントのＤＮＡ配列は表２１に示す。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされる。インプットプロモーター部分タイプは必要であるが、他の特定のインプットプロモーターを選択することができた。
Figure 2023540500000013
 表６．プロセス３（グルコース制限＋チアミン枯渇）と共に使用するためのインプットプロモーター。部分タイプバリアントのＤＮＡ配列は表２１に示す。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされる。インプットプロモーター部分タイプは必要であるが、他の特定のインプットプロモーターを選択することができた。
Figure 2023540500000014
（３つのプロセスすべてに使用される）１成分ｓＴＦは、表７、表８、表９、および表１０に記載されており、４つのサブ部分：ＤＢＤ、ＮＬＳ（任意）、リンカー（任意）、およびＴＡＤを含む。所与のＤＢＤについて、１つのＤＢＤバリアント×１つのＮＬＳバリアント×２つのリンカーバリアント×１２個のＴＡＤバリアントの組み合わせのアセンブリに基づいて、最大２４の可能な１成分ｓＴＦをＳＥＳライブラリアセンブリに使用した。
表７．ＤＮＡ結合ドメインＢｍ３Ｒ１に基づく１成分ｓＴＦ。所与の行の「完全名称」エントリは、その行のｓＴＦタンパク質をコードする遺伝子の名称とこのｓＴＦタンパク質の名称の両方である。このｓＴＦコード遺伝子のＤＮＡ配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのＤＮＡ配列を左から右の順序で連結したものである。このｓＴＦタンパク質のアミノ酸配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのアミノ酸配列を左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡおよびアミノ酸配列は表２１に示す。所与の行の「使用したか？」エントリは、その行のｓＴＦコード遺伝子が実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。
Figure 2023540500000015
Figure 2023540500000016
Figure 2023540500000017
 表８．ＤＮＡ結合ドメインＰｈｌＦ＿ＡＭに基づく１成分ｓＴＦ。所与の行の「完全名称」エントリは、その行のｓＴＦタンパク質をコードする遺伝子の名称とこのｓＴＦタンパク質の名称の両方である。このｓＴＦコード遺伝子のＤＮＡ配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのＤＮＡ配列を左から右の順序で連結したものである。このｓＴＦタンパク質のアミノ酸配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのアミノ酸配列を左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡおよびアミノ酸配列は表２１に示す。所与の行の「使用したか？」エントリは、その行のｓＴＦコード遺伝子が実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。
Figure 2023540500000018
Figure 2023540500000019
 表９．ＤＮＡ結合ドメインＴｅｔＲ．に基づく１成分ｓＴＦ。所与の行の「完全名称」エントリは、その行のｓＴＦタンパク質をコードする遺伝子の名称とこのｓＴＦタンパク質の名称の両方である。このｓＴＦコード遺伝子のＤＮＡ配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのＤＮＡ配列を左から右の順序で連結したものである。このｓＴＦタンパク質のアミノ酸配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのアミノ酸配列を左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡおよびアミノ酸配列は表２１に示す。所与の行の「使用したか？」エントリは、その行のｓＴＦコード遺伝子が実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。
Figure 2023540500000020
Figure 2023540500000021
 表１０．ＤＮＡ結合ドメインＶａｎＲ＿ＡＭに基づく１成分ｓＴＦ。所与の行の「完全名称」エントリは、その行のｓＴＦタンパク質をコードする遺伝子の名称とこのｓＴＦタンパク質の名称の両方である。このｓＴＦコード遺伝子のＤＮＡ配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのＤＮＡ配列を左から右の順序で連結したものである。このｓＴＦタンパク質のアミノ酸配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのアミノ酸配列を左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡおよびアミノ酸配列は表２１に示す。所与の行の「使用したか？」エントリは、その行のｓＴＦコード遺伝子が実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。
Figure 2023540500000022
Figure 2023540500000023
 （３つのプロセスすべてに使用される）２成分ｓＴＦは、表１１、表１２、表１３、および表１４に記載されており、９つのサブ部分：ＤＢＤ、ＮＬＳ１、リンカー、ＢＰＰ１、２Ａ、ＢＰＰ２、ＮＬＳ２、ＯＤ、およびＴＡＤを含む。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、ＤＢＤおよびＴＡＤである。所与のＤＢＤについて、１つのＤＢＤバリアント×１つのＮＬＳ１バリアント×１つのリンカーバリアント×３つのＢＰＰ１バリアント×１つの２Ａバリアント×１つのＢＰＰ２バリアント×１つのＮＬＳ２バリアント×３つのＯＤバリアント×１２個のＴＡＤバリアントの組み合わせのアセンブリに基づいて、最大１０８の可能な２成分ｓＴＦをＳＥＳライブラリアセンブリに使用した。
表１１．ＤＮＡ結合ドメインＢｍ３Ｒ１に基づく２成分ｓＴＦ。所与の行の「完全名称」エントリは、その行のｓＴＦタンパク質をコードする遺伝子の名称と対応するｓＴＦタンパク質の名称の両方である。各ｓＴＦコード遺伝子のＤＮＡ配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのＤＮＡ配列を左から右の順序で連結したものである。各ｓＴＦタンパク質のアミノ酸配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのアミノ酸配列を左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡおよびアミノ酸配列は表２１に示す。所与の行の「使用したか？」エントリは、その行のｓＴＦコード遺伝子が実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。
Figure 2023540500000024
Figure 2023540500000025
Figure 2023540500000026
Figure 2023540500000027
Figure 2023540500000028
Figure 2023540500000029
Figure 2023540500000030
Figure 2023540500000031
Figure 2023540500000032
Figure 2023540500000033
Figure 2023540500000034
Figure 2023540500000035
Figure 2023540500000036
 表１２．ＤＮＡ結合ドメインＰｈｌＦ＿ＡＭに基づく２成分ｓＴＦ。所与の行の「完全名称」エントリは、その行のｓＴＦタンパク質をコードする遺伝子の名称とこのｓＴＦタンパク質の名称の両方である。このｓＴＦコード遺伝子のＤＮＡ配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのＤＮＡ配列を左から右の順序で連結したものである。このｓＴＦタンパク質のアミノ酸配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのアミノ酸配列を左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡおよびアミノ酸配列は表２１に示す。所与の行の「使用したか？」エントリは、その行のｓＴＦコード遺伝子が実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。
Figure 2023540500000037
Figure 2023540500000038
Figure 2023540500000039
Figure 2023540500000040
Figure 2023540500000041
Figure 2023540500000042
Figure 2023540500000043
Figure 2023540500000044
Figure 2023540500000045
Figure 2023540500000046
Figure 2023540500000047
Figure 2023540500000048
Figure 2023540500000049
Figure 2023540500000050
Figure 2023540500000051
 表１３．ＤＮＡ結合ドメインＴｅｔＲに基づく２成分ｓＴＦ。所与の行の「完全名称」エントリは、その行のｓＴＦタンパク質をコードする遺伝子の名称とこのｓＴＦタンパク質の名称の両方である。このｓＴＦコード遺伝子のＤＮＡ配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのＤＮＡ配列を左から右の順序で連結したものである。このｓＴＦタンパク質のアミノ酸配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのアミノ酸配列を左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡおよびアミノ酸配列は表２１に示す。所与の行の「使用したか？」エントリは、その行のｓＴＦコード遺伝子が実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。
Figure 2023540500000052
Figure 2023540500000053
Figure 2023540500000054
Figure 2023540500000055
Figure 2023540500000056
Figure 2023540500000057
Figure 2023540500000058
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Figure 2023540500000060
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Figure 2023540500000062
Figure 2023540500000063
Figure 2023540500000064
Figure 2023540500000065
 表１４．ＤＮＡ結合ドメインＶａｎＲ＿ＡＭに基づく２成分ｓＴＦ。所与の行の「完全名称」エントリは、その行のｓＴＦタンパク質をコードする遺伝子の名称とこのｓＴＦタンパク質の名称の両方である。このｓＴＦコード遺伝子のＤＮＡ配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのＤＮＡ配列を左から右の順序で連結したものである。このｓＴＦタンパク質のアミノ酸配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのアミノ酸配列を左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡおよびアミノ酸配列は表２１に示す。所与の行の「使用したか？」エントリは、その行のｓＴＦコード遺伝子が実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。
Figure 2023540500000066
Figure 2023540500000067
Figure 2023540500000068
Figure 2023540500000069
Figure 2023540500000070
Figure 2023540500000071
Figure 2023540500000072
Figure 2023540500000073
Figure 2023540500000074
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Figure 2023540500000076
Figure 2023540500000077
Figure 2023540500000078
Figure 2023540500000079
Figure 2023540500000080
Figure 2023540500000081
所与のタイプのすべての可能な組み合わせのｓＴＦバリアント（例えば、１成分ＴｅｔＲベースのｓＴＦ）がＤＮＡベースのＳＥＳライブラリアセンブリに使用されたわけではなかった。これは、すべてのｓＴＦコード遺伝子がデノボＤＮＡ合成のために提供され、ほとんどが首尾よく合成されたが、すべてがそうではなかったからである。
表７、表８、表９、表１０、表１１、表１２、表１３、および表１４に記載されているすべてのｓＴＦバリアントについて、対応するｓＴＦコード配列のＤＮＡ配列は、対応する行の部分タイプバリアントのＤＮＡ配列を左から右の順序で連結したものである。同様に、対応するｓＴＦタンパク質のアミノ酸配列は、対応する行の部分タイプバリアントのアミノ酸配列を左から右の順序で連結したものである。ｓＴＦバリアントのＤＮＡおよびアミノ酸配列は表２１に示す。
合成アウトプットプロモーターは、使用される４つの異なるＤＢＤタイプに基づいて、表１５、表１６、表１７、および表１８に記載されており、２つの成分：ＵＡＳおよびコアプロモーターを含む。所与のＤＢＤについて、５個のＵＡＳバリアント×４個のコアプロモーターの組み合わせのアセンブリに基づいて、２０個の可能なコアプロモーターをＳＥＳライブラリアセンブリに使用した。表１５、表１６、表１７、および表１８に記載されているすべての合成アウトプットプロモーターバリアントについて、対応する合成アウトプットプロモーターバリアントのＤＮＡ配列は、対応する行のＵＡＳおよびコアプロモーターのＤＮＡ配列を左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡ配列を表２１に示す。
表１５．合成アウトプットプロモーターは、ＤＮＡ結合ドメインＢｍ３Ｒ１に関して同族である。所与の行の「完全名称」エントリは、その行の合成アウトプットプロモーターの名称である。この合成アウトプットプロモーターのＤＮＡ配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのＤＮＡ配列の左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡ配列は表２１に示す。所与の行の「使用したか？」エントリは、その行の合成アウトプットプロモーターが実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。１ｘ、２ｘなどは、オペレーターなどの配列のコピー数を示す。「０ｘｏｐｅｒａｔｏｒ」は、オペレーターが存在しないこと（０ｘ）を示す。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。アウトプットプロモーター部分タイプが必要であるが、他の特定のアウトプットプロモーターを選択することができた。
Figure 2023540500000082
Figure 2023540500000083
 表１６．合成アウトプットプロモーターは、ＤＮＡ結合ドメインＰｈｌＦ＿ＡＭに関して同族である。所与の行の「完全名称」エントリは、その行の合成アウトプットプロモーターの名称である。この合成アウトプットプロモーターのＤＮＡ配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのＤＮＡ配列の左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡ配列は表２１に示す。所与の行の「使用したか？」エントリは、その行の合成アウトプットプロモーターが実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。アウトプットプロモーター部分タイプが必要であるが、他の特定のアウトプットプロモーターを選択することができた。
Figure 2023540500000084
Figure 2023540500000085
 表１７．合成アウトプットプロモーターは、ＤＮＡ結合ドメインＴｅｔＲに関して同族である。所与の行の「完全名称」エントリは、その行の合成アウトプットプロモーターの名称である。この合成アウトプットプロモーターのＤＮＡ配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのＤＮＡ配列の左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡ配列は表２１に示す。所与の行の「使用したか？」エントリは、その行の合成アウトプットプロモーターが実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。アウトプットプロモーター部分タイプが必要であるが、他の特定のアウトプットプロモーターを選択することができた。
Figure 2023540500000086
Figure 2023540500000087
 表１８．合成アウトプットプロモーターは、ＤＮＡ結合ドメインＶａｎＲ＿ＡＭに関して同族である。所与の行の「完全名称」エントリは、その行の合成アウトプットプロモーターの名称である。この合成アウトプットプロモーターのＤＮＡ配列は、対応する行の示された部分タイプバリアントのＤＮＡ配列の左から右の順序で連結したものである。成分部分タイプバリアントのＤＮＡ配列は表２１に示す。所与の行の「使用したか？」エントリは、その行の合成アウトプットプロモーターが実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。アウトプットプロモーター部分タイプが必要であるが、他の特定のアウトプットプロモーターを選択することができた。
Figure 2023540500000088
Figure 2023540500000089
 各プロセスに関して、各ＳＥＳサブライブラリについて、部分（３）（第１の転写単位の転写ターミネーター（ＴＴ））および（４）（スペーサー）（それぞれ任意部分であるが、この実施例では設計上の選択肢として含まれる）は、表１９および表２０にそれぞれ記載される単一のバリアントのみを有する。これらの２つの部分の対応するＤＮＡ配列を表２１に示す。
表１９．ｓＴＦ発現転写単位のための転写ターミネーター。所与の行の「完全名称」エントリは、その行のターミネーターの名称である。この場合、ターミネーターは、完全に表２１の部分タイプバリアントのうちの１つである。「使用したか？」エントリは、その行のターミネーターが実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。
Figure 2023540500000090
 表２０．ｓＴＦ発現転写単位の後のスペーサー所与の行の「完全名称」エントリは、その行のターミネーターの名称である。この場合、ターミネーターは、完全に表２１の部分タイプバリアントのうちの１つである。「使用したか？」エントリは、その行のターミネーターが実際にＳＥＳライブラリ構築に使用された場合は「はい」であり、そうでない場合は「いいえ」である。ＳＥＳ機能に必要であると考えられる部分タイプは、「必要な部分タイプ」とラベル付けされ、ＳＥＳ機能に任意であると考えられる部分タイプは「任意部分タイプ」とラベル付けされる。
Figure 2023540500000091
したがって、第２の転写単位のＲＦＰおよび転写ターミネーター成分を除く各ＳＥＳライブラリのバリアントは、以下の順序で以下の部分のＤＮＡ配列を含む：（１）Ｐ（ｉｎ）、（２）ｓＴＦ、（３）第１の転写単位のＴＴ、（４）スペーサー、および（５）Ｐ（ｏｕｔ）。Ｐ（ｉｎ）バリアントのＤＮＡ配列は、表４、表５または表６の対応する行を参照し、次いで表２１の対応する行を参照することによって得ることができる。表２１は、上記の表で参照された６２個すべての原子部分タイプバリアントのＤＮＡおよび該当する場合はアミノ酸配列を示す。
ｓＴＦバリアントをコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、表７、表８、表９、表１０、表１１、表１２、表１３、または表１４の対応する行を参照し、次いで、表２１に列挙される対応する成分部分タイプバリアントのＤＮＡ配列の連結を介して完全なｓＴＦ遺伝子配列を生成することによって得ることができる。ライブラリ構築に使用した第１の転写単位のＤＮＡ転写ターミネーターを表２１にある。このアッセイのためのライブラリ構築に使用したスペーサーのＤＮＡ配列を表２１にある。合成アウトプットプロモーターバリアントのＤＮＡ配列は、表１５、表１６、表１７または表１８の行にあり、表２１に記載される対応する成分部分タイプバリアントのＤＮＡ配列を連結したものによるｓＴＦに対応する。
Figure 2023540500000092
Figure 2023540500000093
Figure 2023540500000094
個々のＳＥＳバリアントのＲＦＰ発現プロファイルが、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に連結されたＦＡＣＳを使用して多重様式でアッセイされ得るように、ＳＥＳライブラリを設計した。より具体的には、表１、表２および表３における各ＤＮＡベースのＳＥＳサブライブラリを、ＳＥＳバリアントに対応するＤＮＡ配列付近の短い設計されたＤＮＡベースのバーコードの挿入を可能にするようにアセンブルした。そのような各バーコードの配列は、はるかに長い（複数キロベース）ＳＥＳバリアントの完全な配列を一意的に示した。この設計スキーマにより、ＰＣＲ増幅および短い解読ＮＧＳを使用して、それらのＲＦＰ存在量のレベルに基づいて、ＦＡＣＳを使用して分画した細胞ベースのＳＥＳライブラリのサブプール内の各ＳＥＳバリアントの集団画分の決定が可能になった。これにより、各所与のプロセス条件下で多くの細胞ベースのＳＥＳバリアントのＲＦＰ発現の経時変化の並行測定が可能になった。
実施例２．アッセイ１．
この実施例は、本開示の合成発現系が、様々な細胞培養プロセスに適応するように構築され得ることを実証する。各ライブラリの８つのＳＥＳサブライブラリのそれぞれの等モル混合物（それぞれ、アッセイ１で使用される３つのプロセスのうちの１つと同族であるように設計されている）を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を形質転換した。バリアントＳＥＳをＡＯＸ１遺伝子座で単一コピーで細胞に組み込んだ。天然のＡＯＸ１転写ターミネーターが、第２の転写単位、すなわちＲＦＰを発現する転写単位の転写ターミネーターとして機能することを可能にする位置にＳＥＳを組み込んだ。すべてのライブラリのメンバーが首尾よく合成されたわけではなく、すべてが首尾よく形質転換されたわけではなかった。したがって、以下の表２２に報告されるように、アッセイ１は、対応するＤＮＡベースのＳＥＳライブラリ由来のすべての可能な細胞ベースのＳＥＳライブラリのバリアントを試験しなかった。
アッセイ１は、対照として従来のメタノール依存性プロセスにおけるＲＦＰのＰ（ＡＯＸ１）によって駆動される発現を使用して、３つのプロセスのそれぞれにおけるライブラリのバリアントのＲＦＰ存在量をアッセイした。アッセイ１はまた、発酵の産生期前（これは、発現される遺伝子産物またはその代謝産物が宿主細胞に対して毒性であり得る場合に関連する）においてＳＥＳが発現を厳密に調節する程度を測定した。
形質転換Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株のライブラリを含むグリセロールストックを、各インプットプロモーターＰ（ｉｎ）に関連するプロセスを使用して実験室規模の発酵に供した。試料を発酵開始の２０時間後および９０時間後に採取し、ＰＢＳで１００倍希釈した後、４°Ｃで保存した。各試料を蛍光活性化細胞選別に供し、続いて配列決定して、各合成発現系の同一性およびその活性を確認した。表２２は、従来のメタノール依存性プロセスで評価したＰ（ＡＯＸ１）対照株と比較したライブラリのメンバーの性能をまとめたものである。
Figure 2023540500000095
合成発現系（表２２、行５）を有する株の選択を単離し、第２のアッセイに供した（下記のアッセイ２）。上記の表２２に示すように、アッセイ１で高性能であった株を、２つの基準－フェドバッチ期における厳密な制御および産生期における発現の強度に基づいて、各場合において、メタノール依存性発酵条件で培養したＰ（ＡＯＸ１）対照と比較して評価した。驚くべきことに、本開示に従って構築された１００を超える合成発現系が、これらの非常に厳しい基準を満たした。表２２の行５に列挙されている株に加えて他の株の多くは、アッセイ１に使用される基準に基づいて、高性能のメタノール非依存性合成発現系に適している。
当業者はまた、本開示による合成発現系の設計者が、アッセイ１のために選択されたものとは全く異なる基準を使用し得ることを理解するであろう。例えば、いくつかの生物的産物を発現させるために、設計者は、増殖期の生産に関係なく、フェドバッチ期における全体的な生産量の豊富さを強調することができる。表２２、行４に示すように、本開示に従って構築された合成発現系を含むほぼ７００株は、その基準に従って、従来のＰ（ＡＯＸ１）対照よりも優れていた。また、さらに他の生物的産物の場合、設計者は、生物的産物をあまり豊富ではないレベルで発現する本開示による合成発現系を構築することができる。したがって、本開示の範囲は、アッセイ１で特定され、実施例３に記載されているＳＥＳに限定されない。目的の条件に適したＳＥＳに到達するために、実施例１に示すようなＳＥＳ成分の部分タイプの任意の組み合わせを組み合わせて、任意の数の基準に従って評価することができる。
実施例３．アッセイ２．
アッセイ１（実施例２）からの高性能合成発現系の選択を含むＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を、ＹＥＰ＋４％デキストロース寒天プレート上にストリークし、３０°Ｃで４８時間増殖させた。
これらのコロニーを、各合成発現系のＰ（ｉｎ）に関連するプロセスを使用して、表２７に詳述する実験室規模の発酵に供した（プロセス１～３）。試料を発酵中の様々な時点で採取し、ＰＢＳで１００倍希釈した後、４°Ｃで保存した。各希釈試料の細胞内蛍光を、フローサイトメトリーを使用して１００，０００個の細胞からの蛍光値の中央値として測定した。Ｐ（ＡＯＸ１）の制御下でＲＦＰを発現する対照株を、グリセロールからメタノールへのプロセスを用いた実験室規模の発酵後に同様に評価した（プロセス４）。結果を以下の表２３、２４および２５に示す。
Figure 2023540500000096
Figure 2023540500000097
Figure 2023540500000098
表２６は、表２３、表２４および表２５におけるアッセイ２によって同定されたＳＥＳバリアントの組成を詳細に記載している。表２６ならびにそこに引用されている表ならびに前述の文章に基づいて、これらのＳＥＳバリアントのそれぞれの完全なＤＮＡ配列は、表２１に記載されている部分タイプのバリアントＤＮＡ配列の特定の連結から導き出すことができる。これらのＳＥＳバリアントのそれぞれの完全なＤＮＡ配列を表２８に示す。
表２６．表２３、表２４および表２５におけるアッセイ２によって同定されたＳＥＳバリアントの詳細なアノテーション。所与のＳＥＳのＤＮＡ配列は、対応する行の左から右への順序で、（ｉ）インプットプロモーターバリアント（表４、表５または表６、ならびに配列の抽出方法に関する本文を参照）、（ｉｉ）合成転写因子バリアント（表７、表８、表９、表１０、表１１、表１２、表１３、または表１４、ならびに配列の抽出方法に関する本文を参照）、（ｉｉｉ）第１の転写単位のＴＴ（不変；表１９ならびに配列の抽出方法に関する本文を参照）、（ｉｖ）スペーサー（不変；表２０ならびに配列の抽出方法に関する本文を参照）、および（ｖ）合成アウトプットプロモーターバリアント（表１５、表１６、表１７または表１８、ならびに配列の抽出方法に関する本文を参照）のフィールドのＤＮＡ配列を連結したものである。各ＳＥＳバリアントの完全なＤＮＡ配列は表２８に示す。
Figure 2023540500000099
Figure 2023540500000100
Figure 2023540500000101
アッセイ１および２で使用したものであり、工業規模の生産に使用することができる実験室規模の発酵プロセス（段階Ｉ、段階ＩＩおよび段階ＩＩＩを含む）を以下に記載する。
Figure 2023540500000102
実験室規模の発酵プロセス
目的の株（複数可）の新しく増殖したコロニーを固体培養培地プレートから掻き取り、これを使用して、プロセスに対応する炭素源を補充した培養培地を含む三角振盪フラスコに接種した（表２７）。あるいは、振盪フラスコに株（複数可）の解凍されたグリセロールストックを直接接種することができる。培養物を３０°Ｃ、２５０ｒｐｍで１８～２０時間、６００ｎｍで２０±５の光学密度（ＯＤ）まで増殖させた。これは、表２７に示すように、炭素源および添加物を補充した新鮮な培養培地を予め充填したバイオリアクタの接種材料として機能した。炭素源を４０ｇ／Ｌの最終濃度まで添加した。バイオリアクタは、一定のｐＨ、温度および溶存酸素レベルを維持しながら連続的に動作し（図３）、バッチ期中に追加の炭素は供給されなかった。バッチ期の終了を添加炭素の完全な消費によってマークし、炭素供給を開始してフェドバッチ期をマークした。炭素供給速度を表２７に示すように調節した。過剰供給（プロセス１、２および３）は、炭素が細胞によって消費され得るよりも速い速度でバイオリアクタに添加されるものである。制限供給（プロセス４）は、炭素が細胞によって消費され得る速度またはそれより遅い速度でバイオリアクタに添加されるものである。フェドバッチ期は、十分なバイオマスが達成されたときに終了し、産生期は、表２７に示す添加と共に、新しい炭素源（プロセス４）および／または新しい炭素供給速度に移行することによって開始された。プロセス３の産生期は、チアミン枯渇によってさらに特徴付けられ、その間、外因性／添加チアミンは、プロセス３依存性インプットプロモーター（Ｐ（ｉｎ））の発現を誘導するレベルまで増殖中に消費されるか、または増殖によって希釈された。発酵は、発行開始の８６～９６時間後に終了した。
培養培地の組成：一塩基性リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸カルシウム二水和物、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム七水和物、硫酸銅（ＩＩ）五水和物、ヨウ化ナトリウム、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物、モリブデン酸ナトリウム二水和物、ホウ酸、硫酸カルシウム二水和物、塩化コバルト（ＩＩ）亜鉛塩化物、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、ビオチンおよび硫酸。
ビタミン溶液の組成：ビオチン、パントテン酸カルシウム、葉酸、ミオイノシトール、ニコチン酸、４－アミノ安息香酸、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン。
Figure 2023540500000103
Figure 2023540500000104
Figure 2023540500000105
Figure 2023540500000106
Figure 2023540500000107
Figure 2023540500000108
Figure 2023540500000109
 実施例４．ペイロードタンパク質を発現する２部分ＳＥＳを用いた株ライブラリ構築。
実施例３で試験したＳＥＳのサブセットを２つの部分として再構築し、部分ＩはＰ（ｉｎ）の転写制御下でｓＴＦを発現する独立した転写単位を含み、部分ＩＩはＰ（ｏｕｔ）の転写制御下でペイロードを発現する転写単位を含んだ。それぞれがＰ（ｉｎ）とｓＴＦの固有の組み合わせを有する部分Ｉの４つのバリアント（表３６）を、実施例３のために合成した部分からアセンブリした。同様に、部分ＩＩの７２個のバリアントをアセンブリし、それぞれ８個のＰ（ｏｕｔ）のうち１個および９個のペイロードのうち１個であった。９つのペイロードは分泌されるように設計され、それぞれ発光検出タグを有する３つの固有の分泌タグと３つの目的のタンパク質との組み合わせであり、分泌後のタンパク質に結合するように設計された（表３７）。
Figure 2023540500000110
Figure 2023540500000111
部分Ｉ組込み構築物の各々を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を形質転換し、その結果、各転写単位がゲノム内の所定の遺伝子座に単一コピーで組み込まれ、４つの固有の株が得られた。それぞれの得られた株における部分Ｉの正しい組込みを次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によってクローン的に検証し、株を２５％グリセロール中で凍結保存した。部分ＩＩのＰ（ｏｕｔ）が部分Ｉ含有ベース株のその同族ｓＴＦと一致するように、各ベース株を部分ＩＩの７２個のバリアントのサブセットでさらに形質転換した。可能な組み合わせの合計を表３６に要約する。部分ＩＩを、ランダムなゲノム位置で組み込むように設計した。すべての形質転換が成功したわけではなく、それぞれの成功した形質転換から１～３個のコロニーをライブラリ中の合計２４１株について選択した。最終株を２０％グリセロール中で凍結保存した。
実施例５．アッセイ３：ディープウェルプレートにおける発現。
この実施例は、ロバストに多様な発現系のセットにおける有効なタンパク質発現を実証する。実施例４で作製した株ライブラリをＰ（ｉｎ）に従って分け、そのＰ（ｉｎ）に対応するディープウェルプレートプロセスによってアッセイした（表３６）。形質転換Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株のライブラリの各メンバーのグリセロールストックをプロセス特異的スポッティングプレート（後述）にスポットし、３０°Ｃで２４時間増殖させた。これらのスポットを使用して、ディープウェルプレート中でＹＥＰに２％グルコースおよび１％グリセロールを接種し、３０°Ｃで１４時間増殖させた。次いで、これらの培養物を２５０μｌのプロセス特異的アッセイ培地（後述）中で継代培養し、３０°Ｃで７２時間増殖させた。培養物の細胞密度を、小アリコートを使用してプレートリーダーで測定した。プレートリーダーを使用して細胞不含培地から細胞外発光を測定し、機械的溶解によって得られた細胞溶解物から同様に細胞内発光を測定した。注目すべきことに、いくつかの多様な合成発現系が、生物的産物産生を効果的に駆動することが示された（結果を図５に示す）。
ディープウェルプレート培養培地の組成：ＹＥＰ培地は、酵母エキス、バクトペプトンおよびＮａＣｌを含有する。プロセス１のスポッティングプレートは、酵母エキス、ペプトン、酵母窒素塩基（アミノ酸なし）、リン酸カリウム、ビオチンおよび２％グリセロールを含む寒天を含有する。プロセス２および３のスポッティングプレートは、寒天および２％グルコースを含むＹＥＰを含有する。アッセイ培地は、一塩基性リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸カルシウム二水和物、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム七水和物、硫酸銅（ＩＩ）五水和物、ヨウ化ナトリウム、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物、モリブデン酸ナトリウム二水和物、ホウ酸、硫酸カルシウム二水和物、コバルト（ＩＩ）塩化亜鉛塩化物、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、ビオチンおよび硫酸を含み、１％グリセロールがプロセス１のために添加され、１％グルコースがプロセス２のために添加され、または１％グルコースと１００ｎＭチアミンがプロセス３のために添加される。ＹＥＰ培地は、酵母エキス、バクトペプトンおよびＮａＣｌを含有する。
実施例６．アッセイ４：実験室規模のバイオリアクタにおける発現。
実施例５からの株のサブセットを、実施例３に記載の４つのプロセスのうちの１つを使用して実験室規模の発酵に供した。発酵開始２４時間後、およびその後１２時間後、９６時間経過するまで試料を採取し、４℃で保存した。各試料の細胞外および細胞内発光を上記のように測定し、表３８に要約する。
Figure 2023540500000112
実施例７．ディープウェルプレートにおける、二倍体由来のミオグロビンおよびヘムの発現のアッセイ。
２つのＤＮＡライブラリを設計および合成し、第１のライブラリは、１またはそれを超えるＳＥＳの転写制御下で１またはそれを超える天然ヘム生合成酵素（ＨＥＭ１、ＨＥＭ２、ＨＥＭ３、ＨＥＭ４、ＨＥＭ１２、ＨＥＭ１３、ＨＥＭ１４、ＨＥＭ１５）を発現し、第２のライブラリは、１またはそれを超えるＰ（ｏｕｔ）の下で発現されるミオグロビン（ＭＢ）の１またはそれを超える転写単位を含む。第１のＤＮＡライブラリを使用して、各株が、８つのヘム生合成遺伝子を発現するゲノム上に組み込まれた１またはそれを超える転写単位と、２４の半数体株をもたらす１またはそれを超える追加のＰ（ｉｎ）－ｓＴＦ－Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ構築物とを含むように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を形質転換した。第２のＤＮＡライブラリを使用して、各株が異なるＰ（ｏｕｔ）の下でミオグロビンを発現する１またはそれを超える転写単位を含むように、別々のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を形質転換し、１５の半数体株を得た。２つの株ライブラリ内の同族部分を有する半数体をアレイ状に交配し、１２７の固有の二倍体株を得た。
二倍体Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株のライブラリの各メンバーを２％デキストロースを含むＹＥＰ上にスポットし、３０°Ｃで２４時間増殖させた。これらのスポットを使用して、ディープウェルプレート中でＹＥＰに２％グルコースを接種し、３０°Ｃで１９時間増殖させた。次いで、これらの培養物を、２％グルコース、５ｇ／Ｌグルタミン酸一ナトリウムおよび１００ｎＭチアミンを補充した２４０μｌのアッセイ培地で継代培養し、３０°Ｃで２４時間増殖させた。細胞溶解物を機械的溶解によって得て、ミオグロビンおよびヘムの濃度を、ピーク面積を既知量の市販標準と比較することによってサイズ排除クロマトグラフィーによって得た。結果を図６に要約する。
実施例８．発酵条件における、半数体におけるミオグロビンおよびヘム生合成遺伝子の転写発現のアッセイ。
特定のＳＥＳの下で８つすべてのヘム生合成遺伝子および異なるＳＥＳの下でミオグロビンを発現する１つの半数体株を構築し、次いで、実施例３に記載のプロセス３を使用して実験室規模の発酵に供した。試料を発酵中の様々な時点で採取し、ＲＮＡシーケンシングに供した。転写産物を１００万個の全転写産物に対して正規化し、選択されたサブセットについて表３９に要約する。
Figure 2023540500000113
同等物
当業者は、本出願に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または日常的な実験以下を使用して確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。本出願の任意の１つのセクションで提供される定義は、適用可能な場合、任意の他のセクションに適用されることが意図されている。

Claims (138)

  1. 合成発現系を含む、メチロトローフ性宿主細胞であって、前記合成発現系が、
    （ａ）（ｉ）上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含むインプットプロモーター、ならびに
    （ｉｉ）合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドであって、前記合成転写因子がＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含み、前記ＤＢＤおよび前記ＴＡＤが前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、ポリヌクレオチド
    を含む第１の転写単位であって、前記インプットプロモーターが、前記合成転写因子の前記少なくとも１つの成分の発現を駆動する、第１の転写単位と、
    （ｂ）目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位であって、前記合成転写因子が前記合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、第２の転写単位と、
    を含み、
    前記目的の遺伝子は、外因的に提供されるメタノールの非存在下で発現される、メチロトローフ性宿主細胞。
  2. 前記第１の転写単位の前記ポリヌクレオチドが、前記合成転写因子のすべての成分をコードする、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  3. 前記インプットプロモーターが合成のものである、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  4. 前記インプットプロモーターが、天然に存在するプロモーターと少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  5. 前記インプットプロモーターが天然に存在する、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  6. 前記インプットプロモーターが前記細胞にとって天然である、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  7. 前記インプットプロモーターが、調節可能なインプットプロモーターである、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  8. 前記調節可能なインプットプロモーターが誘導性である、請求項７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  9. 前記調節可能なインプットプロモーターが抑制性である、請求項７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  10. 前記調節可能なインプットプロモーターが、同族の培養プロセスに関する栄養素の添加、制限、または枯渇に応答する、請求項７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  11. 前記調節可能なインプットプロモーターが、チアミン枯渇、グリセロール制限、単糖制限、または炭素源、糖、デンプン、ガラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、イノシトール、グリセロール、ビタミン、ステロイド、窒素源、硝酸、亜硝酸、アンモニウム、アミノ酸、メチオニン、重金属、銅、安息香酸、過酸化水素、カルシウム含有化合物および／もしくはリン酸の制限に応答する、請求項１０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  12. 前記調節可能なインプットプロモーターが、任意の２またはそれを超える栄養素の組み合わせの制限または枯渇に応答する、請求項１０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  13. 前記調節可能なインプットプロモーターの活性が、外因的に提供されるギ酸の存在によって増加する、請求項１０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  14. 前記調節可能なインプットプロモーターが、外因的に提供されるメタノールの非存在下で調節可能である、請求項７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  15. 前記インプットプロモーターがメタノール誘導性でない、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  16. 前記インプットプロモーターが構成的インプットプロモーターである、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  17. 前記インプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）および／または前記コアプロモーターエレメントが、前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  18. 前記インプットプロモーターが、Ｐ（ＪＥＮ１）、Ｐ（ＧＱ６７０４４９９）、Ｐ（ＧＱ６７００９２６）、Ｐ（ＨＧＴ１）、Ｐ（ＦＤＨ１）、Ｐ（ＡＯＸ２）、Ｐ（ＲＧＩ２）、Ｐ（ＴＨＩ１３）＿ｓｈｏｒｔ、Ｐ（ＴＨＩ１３）＿ｌｏｎｇ、またはＰ（ＴＨＩ４）である、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  19. 前記インプットプロモーターが、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  20. 前記インプットプロモーターが、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドである、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  21. 前記合成転写因子の前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、Ｂｍ３Ｒ１、ＴｅｔＲ、ＰｈｌＦ＿ＡＭ、またはＶａｎＲ＿ＡＭである、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  22. 前記合成転写因子の前記転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）が、Ｂ１１２＿ＴＡＤ、Ｂ４２＿ＴＡＤ、ＧＡＬ４＿ＴＡＤ、ｍｉｎｉＶＰＲ＿ＴＡＤ、Ｍｘｒ１＿ＴＡＤ、ＰＨ＿ＴＡＤ、ＶＰ１６＿ＴＡＤ、ＶＰ６４＿ＴＡＤ、ＶＰ６４ｖ２＿ＴＡＤ、ＶＰＨ＿ＴＡＤ、またはＶＰＲ＿ＴＡＤである、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  23. 前記合成転写因子の前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、Ｂｍ３Ｒ１、ＴｅｔＲ、ＰｈｌＦ＿ＡＭ、またはＶａｎＲ＿ＡＭであり、前記合成転写因子の前記転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）が、Ｂ１１２＿ＴＡＤ、Ｂ４２＿ＴＡＤ、ＧＡＬ４＿ＴＡＤ、ｍｉｎｉＶＰＲ＿ＴＡＤ、Ｍｘｒ１＿ＴＡＤ、ＰＨ＿ＴＡＤ、ＶＰ１６＿ＴＡＤ、ＶＰ６４＿ＴＡＤ、ＶＰ６４ｖ２＿ＴＡＤ、ＶＰＨ＿ＴＡＤ、またはＶＰＲ＿ＴＡＤである、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  24. 前記合成転写因子が、前記インプットプロモーターの活性化因子ではない、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  25. 前記合成転写因子が１成分合成転写因子である、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  26. 前記合成転写因子が、２成分または多成分の合成転写因子である、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  27. 前記２成分または多成分の合成転写因子が、少なくとも２つのバイオコンジュゲートタンパク質産物を含む、請求項２６に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  28. 第１のバイオコンジュゲートタンパク質産物（ＢＰＰ１）がＳｐｙＴａｇ００２であり、第２のバイオコンジュゲートタンパク質産物（ＢＰＰ２）がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２である、請求項２７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  29. 前記合成転写因子が核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  30. 前記核局在化シグナルがＳＶ４０核局在化シグナルである、請求項２９に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  31. 前記合成転写因子がリンカーを含む、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  32. 前記合成転写因子が自己切断性ポリペプチドを含む、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  33. 前記自己切断性ポリペプチドが２Ａペプチドである、請求項３２に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  34. 前記自己切断性ポリペプチドがＥＲＢＶ＿１＿Ｐ２Ａである、請求項３２に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  35. 前記合成転写因子がオリゴマー化ドメインを含む、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  36. 前記オリゴマー化ドメインが、Ｌｉｎｋｅｒ＿ｏｎｌｙ＿ｆｏｒ＿ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿ｄｏｍａｉｎ、またはＨｅｐｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ＿ｄｏｍａｉｎである、請求項３５に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  37. 前記合成転写因子が、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  38. 前記第１の転写単位が、配列番号２６～４０または１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  39. 前記合成アウトプットプロモーターがメタノール誘導性でない、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  40. 前記合成アウトプットプロモーターが、上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含む、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  41. 前記合成アウトプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）が、前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  42. 前記合成アウトプットプロモーターの前記コアプロモーターエレメントが、３００塩基対以下の長さの核酸配列を有する、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  43. 前記合成アウトプットプロモーターの前記コアプロモーターエレメントが、約６塩基対～約３００塩基対、約２５塩基対～約２５０塩基対、約７５～約２２５塩基対、または約１００塩基対～約１７５塩基対の長さである核酸配列を有する、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  44. 前記合成アウトプットプロモーターの、前記上流活性化配列（ＵＡＳ）の３’末端と前記コアプロモーターエレメントの５’末端との間の距離が、０～約２００塩基対の長さである、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  45. 前記合成アウトプットプロモーターの、前記上流活性化配列（ＵＡＳ）と前記コアプロモーターエレメントとの間の距離が、約６塩基対～約２００塩基対、約６塩基対～約５３塩基対、約２０塩基対～約１５０塩基対、約５０塩基対～約１２５塩基対、または約５０塩基対～約１００塩基対の長さを有する核酸配列である、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  46. 前記合成アウトプットプロモーターの前記コアプロモーターエレメントが、天然に存在するコアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるコアプロモーター配列を含む、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  47. 前記合成アウトプットプロモーターの前記コアプロモーターエレメントが、Ｐ（ＡＯＸ１）、Ｐ（ＤＡＳ２）、Ｐ（ＨＨＦ２）、またはＰ（ＰＭＰ２０）由来のコアプロモーター配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるコアプロモーター配列を含む、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  48. 前記合成アウトプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）が、ｂｍＯ、ｔｅｔＯ、ｐｈｌＯ、またはｖａｎＯである、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  49. 前記合成アウトプットプロモーターが、１またはそれを超えるオペレーターをさらに含む、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  50. 前記合成アウトプットプロモーターの前記１またはそれを超えるオペレーターが、前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、請求項４９に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  51. 前記合成転写因子が前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）Ｂｍ３Ｒ１を含み、前記合成アウトプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）がｂｍＯの１またはそれを超えるコピーを含む、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  52. 前記合成転写因子が前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ＰｈｌＦ＿ＡＭを含み、前記合成アウトプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）がｐｈｌＯの１またはそれを超えるコピーを含む、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  53. 前記合成転写因子が前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ＴｅｔＲを含み、前記合成アウトプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）がｔｅｔＯの１またはそれを超えるコピーを含む、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  54. 前記合成転写因子が前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ＶａｎＲ＿ＡＭを含み、前記合成アウトプットプロモーターの前記上流活性化配列（ＵＡＳ）がｖａｎＯの１またはそれを超えるコピーを含む、請求項４０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  55. 前記合成アウトプットプロモーターが、配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  56. 前記目的の遺伝子がＲＮＡとして発現される、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  57. 前記目的の遺伝子がタンパク質をコードする、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  58. 前記目的の遺伝子が、酵素、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、感覚タンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質、または貯蔵タンパク質をコードする、請求項５７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  59. 前記タンパク質が、分子を合成、修飾、または変換する、請求項５７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  60. 前記分子が、ヘムまたはヘム生合成経路の中間体である、請求項５９に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  61. 前記タンパク質がヘム結合タンパク質である、請求項５７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  62. 前記ヘム結合タンパク質が、ヘモグロビン、ニューログロビン、サイトグロビン、レグヘモグロビン、またはミオグロビンである、請求項６１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  63. 前記タンパク質が、ワクシニアキャップ化酵素、Ｔ７ポリメラーゼ、またはＯ－メチルトランスフェラーゼである、請求項５７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  64. 前記タンパク質がヘム生合成経路の酵素である、請求項５７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  65. 前記ヘム生合成経路の酵素が、シトクロムＰ４５０、９－アデニル酸シクラーゼ、可溶性グアニル酸シクラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、および／またはシトクロムオキシダーゼである、請求項６４に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  66. 前記第２の転写単位に、分泌タグをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  67. 前記分泌タグが、α－アミラーゼ分泌タグ、Ｓｃ Ｍｆ α１分泌タグ、またはプレ－イヌリナーゼ分泌タグである、請求項６６に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  68. 前記目的の遺伝子がタンパク質をコードし、前記タンパク質が前記メチロトローフ性宿主細胞から分泌される、請求項６６に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  69. 前記分泌タンパク質が、α－アミラーゼ、β－ラクトグロブリン、またはオボアルブミンである、請求項６８に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  70. 前記第１の転写単位および／または前記第２の転写単位が、転写ターミネーターをさらに含む、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  71. 前記第１の転写単位および／または前記第２の転写単位の前記転写ターミネーターが天然に存在する、請求項７０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  72. 前記第１の転写単位および／または前記第２の転写単位の前記転写ターミネーターが合成のものである、請求項７０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  73. 前記第１の転写単位および／または前記第２の転写単位の前記転写ターミネーターが、リボソームタンパク質をコードする遺伝子由来である、請求項７０に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  74. 前記遺伝子が、リボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）をコードする、請求項７３に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  75. 前記転写ターミネーターが、配列番号１４６または配列番号１４７のいずれかの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項７３に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  76. 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、スペーサーによって分離されている、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  77. 前記第１の転写単位および／または前記第２の転写単位が、複数コピーで存在する、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  78. 前記第２の転写単位対前記第１の転写単位のコピー数の比が１：１である、請求項７７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  79. 前記第２の転写単位対前記第１の転写単位のコピー数の比が、少なくとも２：１、少なくとも４：１、または少なくとも１０：１である、請求項７７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  80. 前記第１の転写単位対前記第２の転写単位のコピー数の比が、少なくとも２：１、少なくとも４：１、または少なくとも１０：１である、請求項７７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  81. 前記第１の転写単位が単一コピーで存在し、前記第２の転写単位が複数コピーで存在する、請求項７７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  82. 前記複数の第２の転写単位のうちの少なくとも２つが、異なる目的の遺伝子を含む、請求項８１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  83. 前記第１の転写単位の前記合成転写因子が、前記複数の第２の転写単位の各合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、請求項８１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  84. 前記合成発現系が、前記メチロトローフ性宿主細胞に対して内因性である１またはそれを超える配列を含む、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  85. 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、単一のプラスミド上に位置する、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  86. 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、異なるプラスミド上に位置する、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  87. 前記第１の転写単位および／または前記第２の転写単位が、前記メチロトローフ性宿主細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  88. 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、前記メチロトローフ性宿主細胞ゲノム内の同じ染色体上に位置する、請求項８７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  89. 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、同じ方向に向けられている、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  90. 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、異なる方向に向けられている、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  91. 前記第１の転写単位および前記第２の転写単位が、前記メチロトローフ性宿主細胞ゲノム内の異なる染色体上に位置する、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  92. 前記メチロトローフ性宿主細胞がメチロトローフ性酵母細胞である、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  93. 前記メチロトローフ性宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＣａｎｄｉｄａから選択される属に由来する、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  94. 前記メチロトローフ性宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｋｕｒｔｚｍａｎｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｍｏｎｄａｖｉｏｒｕｍ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、またはＰｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａである、請求項９３に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  95. 前記メチロトローフ性宿主細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項９３に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  96. 前記合成発現系が、前記目的の遺伝子によってコードされる生物的産物生物的産物の産生を、対照宿主細胞において産生される前記生物的産物のレベルよりも高いレベルで提供する、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  97. 前記対照宿主細胞が、前記メチロトローフ性宿主細胞と同じ種のものである、請求項９６に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  98. 前記対照宿主細胞が、目的の遺伝子に作動可能に連結されたメタノール誘導性プロモーターを含む、請求項９７に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  99. 前記対照宿主細胞によってコードされる目的の遺伝子が、前記メチロトローフ性宿主細胞によってコードされる同じ目的の遺伝子である、請求項９８に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  100. 前記メタノール誘導性プロモーターが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＰ（ＡＯＸ１）である、請求項９８に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  101. 前記対照細胞が、外因的に添加されたメタノールの存在下で培養される、請求項１００に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  102. 前記メチロトローフ性宿主細胞が、増殖期および産生期を含む条件下で培養される、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  103. 前記産生期に前記メチロトローフ性宿主細胞において産生される前記目的の遺伝子の転写産物の量が、前記増殖期に前記メチロトローフ性宿主細胞において産生される前記目的の遺伝子の転写産物の量よりも少なくとも１００％高い、請求項１０２に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  104. 前記産生期に前記メチロトローフ性宿主細胞において産生される前記目的の遺伝子の転写産物の量が、前記増殖期に前記メチロトローフ性宿主細胞において産生される前記目的の遺伝子の転写産物の量よりも少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％高い、請求項１０２に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  105. 前記合成発現系が、前記目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を、対照宿主細胞において産生される前記生物的産物のレベルよりも少なくとも２００％高いレベルで提供する、請求項１に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  106. 前記合成発現系が、前記目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を、対照宿主細胞において産生される前記生物的産物のレベルよりも少なくとも６００％、少なくとも９００％、少なくとも１２００％、少なくとも１５００％、少なくとも１８００％、少なくとも２１００％、少なくとも２４００％、少なくとも２７００％、または少なくとも３０００％高いレベルで提供する、請求項１０５に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  107. 前記合成発現系が、前記目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を、対照宿主細胞で産生される前記生物的産物のレベルよりも約３００％～約６００％、約５００％～約１０００％、約８００％～約１５００％、約１０００％～約２０００％、約１２００％～約２０００％、約１８００％～約２５００％、約２０００％～約２５００％、または約２２００％～約３０００％高いレベルで提供する、請求項１０５に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  108. 合成発現系を含む、メチロトローフ性宿主細胞であって、前記合成発現系が、
    （ａ）（ｉ）上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含むインプットプロモーター、ならびに
    （ｉｉ）合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドであって、前記合成転写因子がＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含み、前記ＤＢＤおよび前記ＴＡＤが前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、ポリヌクレオチド
    を含む第１の転写単位であって、前記インプットプロモーターが、前記合成転写因子の前記少なくとも１つの成分の発現を駆動する、第１の転写単位と、
    （ｂ）目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位であって、前記合成転写因子が前記合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、第２の転写単位と、
    を含み、
    前記目的の遺伝子は、外因的に提供されるメタノールの非存在下で発現され、
    メチロトローフ性宿主細胞は、増殖期および産生期を含む条件下で培養され、
    前記産生期にメチロトローフ性宿主細胞によって産生される前記目的の遺伝子の転写産物の量が、前記増殖期におけるよりも少なくとも１００％多い、メチロトローフ性宿主細胞。
  109. 合成発現系を含む、メチロトローフ性宿主細胞であって、前記合成発現系が、
    （ａ）（ｉ）上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含むインプットプロモーター、ならびに
    （ｉｉ）合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドであって、前記合成転写因子がＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含み、前記ＤＢＤおよび前記ＴＡＤが前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、ポリヌクレオチド
    を含む第１の転写単位であって、前記インプットプロモーターが、前記合成転写因子の前記少なくとも１つの成分の発現を駆動する、第１の転写単位と、
    （ｂ）目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターであって、前記合成転写因子が前記合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、合成アウトプットプロモーターと、分泌タグをコードするポリヌクレオチドを含む第２の転写単位と、
    を含み、
    前記目的の遺伝子は、外因的に提供されるメタノールの非存在下で発現される、メチロトローフ性宿主細胞。
  110. 合成発現系を含む、メチロトローフ性宿主細胞であって、前記合成発現系が、
    （ａ）（ｉ）上流活性化配列（ＵＡＳ）およびコアプロモーターエレメントを含むインプットプロモーター、ならびに
    （ｉｉ）合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドであって、前記合成転写因子がＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含み、前記ＤＢＤおよび前記ＴＡＤが前記メチロトローフ性宿主細胞にとって天然ではない、ポリヌクレオチド
    を含む第１の転写単位であって、前記インプットプロモーターが、前記合成転写因子の前記少なくとも１つの成分の発現を駆動する、第１の転写単位と、
    （ｂ）目的の遺伝子に作動可能に連結された合成アウトプットプロモーターを含む第２の転写単位であって、前記合成転写因子が前記合成アウトプットプロモーターの活性化因子である、第２の転写単位と、
    を含み、
    前記目的の遺伝子は、外因的に提供されるメタノールの非存在下で発現され、
    前記合成発現系が、前記目的の遺伝子によってコードされる生物的産物の産生を、対照宿主細胞において産生される前記生物的産物のレベルよりも少なくとも３００％高いレベルで提供する、メチロトローフ性宿主細胞。
  111. 請求項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞を培養する工程を含む、目的の遺伝子を発現させる方法。
  112. 前記目的の遺伝子が、ヘム結合タンパク質またはヘム生合成経路の１またはそれを超える酵素をコードする、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記ヘム結合タンパク質が、ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビン、サイトグロビン、またはレグヘモグロビンである、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記ヘム生合成経路の１またはそれを超える酵素が、シトクロムＰ４５０、９－アデニル酸シクラーゼ、可溶性グアニル酸シクラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、および／またはシトクロムオキシダーゼである、請求項１１２に記載の方法。
  115. 前記目的の遺伝子が、ワクシニアキャップ化酵素、Ｔ７ポリメラーゼ酵素、またはＯ－メチルトランスフェラーゼ酵素をコードする、請求項１１１に記載の方法。
  116. 目的の分子を製造する方法であって、請求項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞を培養し、バイオマスまたは培養物から前記目的の分子を得る工程を含む、方法。
  117. 前記得る工程が、前記目的の分子をバイオマスから抽出することを含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記得る工程が、培養物、培養培地、細胞不含使用済み培養培地、および／または細胞含有培養培地から前記分子を回収することを含む、請求項１１６に記載の方法。
  119. 請求項１１１～１１５のいずれか一項にしたがって目的の遺伝子を発現させる工程を含む目的の分子を産生する方法であって、前記目的の遺伝子が酵素をコードし、前記方法は、
    （ａ）前記目的の遺伝子によってコードされる前記酵素を精製する工程、および
    （ｂ）前記目的の分子への基質の生物変換のために前記精製された酵素を使用する工程、を含む、方法。
  120. 前記目的の分子がヘムである、請求項１１６～１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 目的の遺伝子を発現させるか、または目的の分子を産生する方法であって、
    （ａ）請求項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞を、ある期間にわたって適切な培地中で培養して細胞増殖させる工程、および
    （ｂ）１またはそれを超える培養条件を変更して前記目的の遺伝子の発現または前記目的の分子の産生を促進する工程、を含む、方法。
  122. １またはそれを超える培養条件を変更することが、前記培養培地の組成を変更することを含む、請求項１２１に記載の方法。
  123. 工程（ｂ）が、栄養素を制限、添加、および／または枯渇させることを含む、請求項１２１または請求項１２２に記載の方法。
  124. 工程（ｂ）が、チアミン枯渇、グリセロール制限、単糖制限、またはギ酸添加を含む、請求項１２１～１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 工程（ｂ）が、任意の炭素源、糖、デンプン、ガラクトース、マルトース、グルコース、ソルビトール、イノシトール、グリセロール、ビタミン、ステロイド、窒素源、硝酸、亜硝酸、アンモニウム、アミノ酸、メチオニン、重金属、銅、安息香酸、過酸化水素、カルシウム含有化合物、および／またはリン酸の制限を含む、請求項１２１～１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 工程（ｂ）が、任意の２つの栄養素の組み合わせの制限を含む、請求項１２１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 工程（ｂ）が、グルコースの制限およびチアミンの枯渇を含む、請求項１２１～１２５のいずれかに記載の方法。
  128. 配列番号１～１５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む合成発現系。
  129. 前記合成発現系が、配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むインプットプロモーターを含む、請求項１２８に記載の合成発現。
  130. 前記合成発現系が、合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１２８または請求項１２９に記載の合成発現。
  131. 合成転写因子の少なくとも１つの成分をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２６～４０または１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１３０に記載の合成発現系。
  132. 前記コードされた合成転写因子が、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１３１に記載の合成発現系。
  133. 前記合成発現系が、配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む合成アウトプットプロモーターを含む、請求項１２８～１３２のいずれか一項に記載の合成発現。
  134. 配列番号１６～２５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  135. 配列番号５６～７０または１８６～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  136. 前記合成転写因子が、配列番号２６～４０または１８２～１８５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  137. 前記合成転写因子が、配列番号４１～５５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１～１１０のいずれか一項に記載のメチロトローフ性宿主細胞。
  138. タンパク質発現のために宿主細胞を操作する方法であって、
    請求項１２８～１３３のいずれか一項に記載の合成発現系で前記宿主細胞を形質転換する工程を含む、方法。
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