CN107177611B

CN107177611B - 编码组织型纤溶酶原激活剂的dna分子及其重组细胞株

Info

Publication number: CN107177611B
Application number: CN201710367902.2A
Authority: CN
Inventors: 薛剑峰; 张淼; 康涛; 钟正明
Original assignee: JIANGSU KANGHE BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: JIANGSU KANGHE BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2017-05-23
Filing date: 2017-05-23
Publication date: 2020-03-20
Anticipated expiration: 2037-05-23
Also published as: CN107177611A

Abstract

本发明提供了一种编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了一种包含本发明的DNA分子的表达载体和用于表达组织型纤溶酶原激活剂的CHO细胞株。本发明的提供的编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子经过优化，更有利于哺乳动物细胞表达。本发明提供的表达组织型纤溶酶原激活剂的CHO细胞株极大地提高了表达效率，从而降低了生产和使用成本。

Description

编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子及其重组细胞株

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子，本发明还涉及包含该DNA分子的载体以及其重组细胞株。

背景技术

组织型纤溶酶原激活剂(Tissue-type plaminogen activator，tPA)由血管内皮细胞合成并分泌的一种糖蛋白，是血液内纤溶系统的生理性激活剂。在血栓形成时，能特异与血栓中的纤维蛋白结合，并与纤溶酶原形成三元复合物，在血栓处激活纤溶酶原，达到局部溶栓的效果。基于这一特性，美国Genentech公司开发了重组人tPA并于1987年上市，通用名为阿替普酶(Actilyse)。作为一种高效特异的溶血栓药，阿替普酶用于心肌梗死、脑血栓等血栓性疾病的抢救和治疗。阿替普酶采用CHO细胞重组表达，具有与天然tPA相同的生物学活性，对血栓中的纤维蛋白有很高的亲和性，而对血液中的纤维蛋白原、凝血因子等没有作用，这就避免了由于激活全身纤溶系统所带来的潜在出血危险。重组表达的阿替普酶与天然tPA序列一致，临床应用不会产生免疫反应等副作用。因此，疗效好、安全性高、溶栓后再凝趋势弱及便于抢救等是该药的最大优点。

但是，阿替普酶在血液中可以被I型纤溶酶原激活剂抑制物快速、特异地结合，从而失去溶栓活性，也可以与肝细胞、血管内皮细胞上的特异性受体结合而被吞噬和从血液中清除。这一缺点使得其在血液中的半衰期非常短，仅3-6分钟，这也导致阿替普酶临床应用剂量大(最大剂量达90mg)、费用昂贵。为了改变这一缺陷，主要从两方面进行改善：一是延长半衰期，主要是通过构建tPA的突变体，增强其活性或者降低与I型纤溶酶原激活剂抑制物及受体的亲和力实现，如德国Boehringer Mannheim公司开发的瑞替普酶、美国Genentech公司的TNK酶、美国Bristol-Myers Squibb公司开发的mPA酶、日本Eisai公司开发的孟替普酶等。二是优化tPA的生产工艺，通过改变表达系统、简化纯化步骤等提高生产率。例如，中国发明专利CN1314490公开了在酵母菌中分泌表达人组织纤溶酶原激活剂(htPA)及其活性测定方法。在获得htPA cDNA的基础上，对该基因5’端加以修饰，使其正确插入pPIC9载体的α因子信号肽序列下游，经转化构建阳性工程菌，然而酵母菌表达系统的糖基化形式与哺乳动物细胞存在一定的差异，这些差异将直接影响重组蛋白的活性、稳定性及免疫原性。

中国发明专利CN101085978公开了一种用于动物细胞灌流培养的过滤-沉降双结合灌流系统，通过改造灌流培养系统的方式提高CHO细胞密度和产量。中国发明专利CN101096655公开了一种采用CYTOPORE多孔微载体培养法生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的方法，将TNK-TPA基因工程CHO细胞株加培养基重新悬浮后，使用CYTOPORE多孔微载体培养TNK-TPA基因工程细胞生产TNK-TPA。中国发明专利CN1786161将含天然或改构的人组织型纤溶酶原激活剂的样品过亲和层析柱，通过特异的仿生亲和分离材料提高tPA的纯化收率等。

以上的研究多侧重于培养和纯化工艺方面的改进，而上游工艺特别是表达细胞株的设计和优化却鲜有报道。然而，当前生产重组tPA及其突变体的方法涉及的环节众多，是一项复杂的系统工程，而对细胞株构建的过程，如启动子的选择、目的基因的序列、筛选标记的选择等进行深入研究，将更有效地提高tPA的生产效率、并进一步地降低生产成本和使用成本。

基于此，当前对大规模生产重组tPA的高效率、低成本的方法存在需求。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种编码tPA的DNA分子。本发明提供的编码tPA的DNA分子更有利于哺乳动物细胞表达，极大地提高了tPA的分泌表达效率。进一步地，本发明还提供了包含该DNA分子的载体以及其重组细胞株。本发明提供的载体中引入了谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)筛选加压体系，本发明还提供了用于表达重组人tPA的CHO细胞株。

一方面，本发明提供了一种编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。其中，本发明所述的编码tPA的DNA分子根据人tPA蛋白序列设计并优化，所述人组织型纤溶酶原激活剂蛋白序列来源于UniProt蛋白质数据库(UniProtReference Sequence:P00750)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。该氨基酸序列共编码562个氨基酸，分子量为62.9kDa，等电点为8.1。

另一方面，本发明提供了一种包含本发明的DNA分子的表达载体；优选地，本发明的表达载体为真核生物表达载体，更优选地选自pDNA、pCMV、pEF系列载体，进一步优选地为pIRES表达载体；

优选地，本发明所述的表达载体还包括谷氨酰胺合成酶基因。所述谷氨酰胺合成酶基因用作筛选和加压标记。

再一方面，本发明提供了一种用于表达组织型纤溶酶原激活剂的CHO细胞株，所述细胞株包括上述DNA分子或上述载体。

再一方面，本发明提供了一种优化所述CHO细胞株的方法，所述方法包括引入谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)筛选加压体系。

本发明还提供了本发明的编码组织型纤溶酶原激活剂的优化DNA分子、包含本发明的优化DNA分子的表达载体、用于表达组织型纤溶酶原激活剂的CHO细胞株在生产重组组织型纤溶酶原激活剂中的用途。

在本发明的一个实施例中，给出了制备本发明的用于表达组织型纤溶酶原激活剂的CHO细胞株的方法，所述方法包括以下步骤：

1)按照哺乳动物细胞密码子偏好性设计并合成编码人组织型纤溶酶原激活剂的核苷酸序列，优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

2)将编码人组织型纤溶酶原激活剂的核苷酸序列构建进入pIRES表达载体，获得pIRES-tPAm重组质粒。

3)将GS基因编码序列构建进入pIRES-tPAm表达载体，获得pIRES-tPA-GS重组质粒。

4)将pIRES-tPAm和pIRES-tPAm-GS重组质粒转染CHO-K1哺乳动物细胞株。

5)使用G418(Geneticin，遗传霉素)进行筛选获得稳定细胞株，并用MSX(蛋氨酸亚氨基代砜)加压获得高表达的CHO/pIRES-tPAm-GS重组细胞株。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

1)本发明的DNA分子经过优化，避免和降低了影响转录和翻译效率的诸多因素，例如密码子偏好性、mRNA高级结构、GC含量、提前终止序列等，优化后的序列更有利于哺乳动物细胞表达。

2)本发明的技术方案中，将GS基因克隆进入表达载体，构建了GS加压筛选系统。经过加压后，组织型纤溶酶原激活剂的拷贝数随GS基因在细胞内得到扩增，因而，目的蛋白的表达量较非扩增表达系统显著增加，为大规模生产奠定了基础。

3)本发明提供的表达组织型纤溶酶原激活剂的CHO细胞株极大地提高了表达效率，从而降低了生产和使用成本。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的tPA编码DNA序列与天然tPA编码DNA序列的序列比对。

图2为本发明中pIRES-tPAm质粒和pIRES-tPAm-GS质粒的构建流程图。

图3为本发明中对CHO/pIRES-tPAm-GS细胞株的筛选结果。

图4为测定本发明的细胞株培养液上清的活性的显色反应；

其中，1为未加入细胞培养上清的测活显色的本底反应；

2为CHO/pIRES-tPA稳定细胞株培养上清的测活显色反应；

3为CHO/pIRES-tPAm稳定细胞株培养上清的测活显色反应；

4为CHO/pIRES-tPAm-GS稳定细胞株培养上清的测活显色反应；

5为CHO/pIRES-tPAm-GS稳定细胞株经MSX加压后培养上清的测活显色反应。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1.编码人组织型纤溶酶原激活剂的核苷酸序列的密码子优化

人组织型纤溶酶原激活剂蛋白序列来源于UniProt蛋白质数据库(UniProtReference Sequence:P00750)，具体序列如下：

SEQ ID NO:2

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQEIHARFRRGARSYQVICRDEKTQMIYQQHQSWLRPVLRSNRVEYCWCNSGRAQCHSVPVKSCSEPRCFNGGTCQQALYFSDFVCQCPEGFAGKCCEIDTRATCYEDQGISYRGTWSTAESGAECTNWNSSALAQKPYSGRRPDAIRLGLGNHNYCRNPDRDSKPWCYVFKAGKYSSEFCSTPACSEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP

按照哺乳动物细胞密码子偏好性，同时减少序列中GC含量、避免mRNA的二级结构、去除剪切位点和终止信号等因素，获得的优化序列如SEQ ID NO:1所示,由南京金斯瑞公司合成并克隆至pUC57载体。经优化的序列命名为tPAm，含有该序列的pUC57重组质粒命名为pUC57-tPAm。

优化后的tPA编码DNA序列与天然tPA编码DNA序列(GenBank:AY221101.1)的比对如图1所示，两者的相似度为79％。

实施例2.重组质粒pIRES-tPAm的构建

重组质粒pIRES-tPAm的构建流程如图1所示。

以pUC57-tPAm重组质粒为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增；

F1:SEQ ID NO:3ATATCTCGAGATGGACGCCATGAAGAGGGG和引物

R1:SEQ ID NO:4ATATACGCGT TCATGGCCGCATATTGTCCC。

反应体系为H₂O 20μl，2×Taq PCR Master mix(天根生化科技有限公司的KT201)25μl，10μM引物F11μl，10μM引物R11μl，pUC57-tPAm质粒1μl。

扩增条件为：94℃2min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共35个循环；94℃5min。

扩增产物大小为1699bp，经琼脂糖凝胶回收后溶于30μl无菌水中。将扩增回收的产物进行酶切反应，反应体系为：H₂O 6μl，10×buffer H 2μl，Xho I 1μl(Takara生物技术有限公司)，MluI1μl(Takara生物技术有限公司)，扩增回收的产物10μl，反应条件为：37℃3hr。用同样的体系和条件酶切2μg pIRES表达载体。

反应结束后回收经酶切的基因片段和表达载体，分别溶于30μl无菌水。将表达载体和基因片段进行连接，反应体系为：H2O 4μl，10×Ligation buffer，Ligase(NewEngland Biolabs公司的M0202V)1μl，酶切回收的基因片段10μl，酶切回收的pIRES表达载体3μl。室温放置16hrs。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，涂布于含有氨苄青霉素25μg/ml的LB平板，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落进行DNA测序验证，测序结果无误的质粒用于哺乳动物细胞的转染。

实施例3.重组质粒pIRES-tPAm-GS的构建

重组质粒pIRES-tPAm-GS的构建流程如图1所示。

以带有GS基因编码序列的pUC57-GS重组质粒为模板，用引物F2:SEQ ID NO:5ATATGGATCCATGGCCACCTCAGCAAGTTCCCACT和引物R2:SEQ ID NO:6ATATGTCGACTTAGTTTTTGTATTGGAAGGGCTCG进行PCR扩增。反应体系为H2O20μl，2×Taq PCR Master mix(天根生化科技有限公司的KT201)25μl，10μM引物F21μl，10μM引物R21μl，pUC57-GS质粒1μl。扩增条件为：94℃2min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共35个循环；94℃5min。扩增产物大小为1142bp，经琼脂糖凝胶回收后溶于30μl无菌水中。将扩增回收的产物进行酶切反应，反应体系为：H2O 6μl，10×buffer H 2μl，Bam H I 1μl(Takara生物技术有限公司)，Sal I 1μl(Takara生物技术有限公司)，扩增回收的产物10μl。反应条件为：37℃3hr。用同样的体系和条件酶切2μgpIRES-tPA表达载体。反应结束后回收经酶切的基因片段和表达载体，分别溶于30μl无菌水。将表达载体和基因片段进行连接，反应体系为：H2O4μl，10×Ligation buffer，Ligase(New England Biolabs公司的M0202V)1μl，酶切回收的基因片段10μl，酶切回收的pIRES-tPAm表达载体3μl。室温放置16hrs。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，涂布于含有氨苄青霉素25μg/ml的LB平板，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落进行DNA测序验证，测序结果无误的质粒用于哺乳动物细胞的转染。

实施例4.重组质粒pIRES-tPAm和pIRES-tPAm-GS的提取

将测序正确的pIRES-tPAm和pIRES-tPAm-GS分别接种于100ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按照天根生化科技有限公司的高纯度质粒大提试剂盒(DP116-M)操作说明提取质粒用于哺乳动物细胞的转染。

实施例5.CHO-K1细胞的培养、转染

CHO-K1细胞复苏之后用CDM4MAB培养基(Hyclone公司，sh30800)培养，培养条件为37℃，5％CO₂，120rpm/min。每3天换一次培养液，按1：3比例传代。传3代当其存活率达到95％时，进行转染。

利用默克密理博的NovaCHOice转染试剂盒(72622-3)，按照说明书进行转染。具体地，取pIRES-tPAm和pIRES-tPAm-GS各20μl，分别与2ml的培养基、20μl的转染试剂、10μl的转染稀释液混合，室温孵育30分钟。将混匀的转染试剂分别加入20ml培养的细胞中，混匀后继续培养。转染48h后加入G418至终浓度800μg/ml，每3天换一次培养液，培养两周后获得稳定CHO/pIRES-tPAm和CHO/pIRES-tPAm-GS细胞株，分别收集细胞培养上清进行活性检测。

实施例6.CHO/pIRES-tPAm-GS细胞的加压和筛选

取存活率达到95％的CHO/pIRES-tPAm-GS细胞，将培养基更换为无谷氨酰胺的CDM4mab培养基进行培养，培养条件为37℃，5％CO₂，120rpm/min。每3天换一次培养液，传2代后加入MSX至终浓度25μM，每3天换一次培养液，培养两周收集细胞培养上清进行活性检测。

用有限稀释法筛选CHO/pIRES-tPAm-GS细胞株。具体的，将浓度为1×10⁶个/ml的CHO/pIRES-tPAm-GS的细胞，用CDM4mab培养基稀释至2-4个细胞/200μl，按照200μl/孔的量铺于96孔深孔板，于37℃，5％CO₂，120rpm/min条件下进行培养，至细胞密度达到0.5×10⁵个/ml时转移至24孔板进行培养，培养3天后取上清分别测定活性。

实施例7.对照CHO/pIRES-tPA细胞株的构建和培养

提取pIRES-tPA质粒，其中，带有天然tPA编码DNA序列(序列同GenBank:AY221101.1)。转染宿主细胞CHO-K1获得含有未优化表达序列的CHO/pIRES-tPA重组细胞株，收集培养上清进行活性检测。质粒提取方法同实施例4，细胞转染和培养方法同实施例5。

实施例8.组织型纤溶酶原激活剂活性检测

取细胞培养上清50μl、55U/ml纤溶酶原(abacm公司，GR299758)10μl、10mg/ml牛纤维蛋白原(索莱宝生物技术有限公司，622C061)50μl、1U/ml牛凝血酶(索莱宝生物技术有限公司，522A0214)50μl混合，于37℃温育10min。加入5mg/ml S-2403发色底物(上海冠东生物科技有限公司)40μl混匀，于37℃温育60min。加入20μl的1.25M醋酸终止剂，测定405nm波长下的吸光度值。取不同浓度的(2-10U)组织型纤溶酶原激活剂标准品(abacm公司，ab92633)，按照上述操作反应，绘制活性-浓度标准曲线，计算细胞上清中组织型纤溶酶原激活剂的活性，结果如表1和图3所示，含有优化基因序列的CHO/pIRES-tPAm稳转细胞库的培养上清中tPA的活性是CHO/pIRES-tPA稳转细胞库的4倍。经有限稀释法共筛选了CHO/pIRES-tPAm-GS细胞株149株，活性呈正态分布，其中最高一株克隆1C1的表达量达373IU/ml。

表1

	比活(U/ml)
		CHO/pIRES-tPA稳转细胞库	20
CHO/pIRES-tPAm稳转细胞库	85
		CHO/pIRES-tPAm-GS稳转细胞库	87
CHO/pIRES-tPAm-GS经MSX加压细胞库	175
		CHO/pIRES-tPAm-GS克隆1C1	373

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110> 江苏康禾生物制药有限公司

<120> 编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子及其重组细胞株

<130> DIC17110009

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1689

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码tPA的优化DNA分子

<400> 1

atggacgcca tgaagagggg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

agccccagcc aggagatcca cgccaggttc aggaggggcg ccaggagcta ccaggtcatc 120

tgcagagacg agaagaccca gatgatctat cagcagcacc agtcctggct gcgccctgtg 180

ctgagaagca accgcgtgga gtactgctgg tgtaattctg gcagggccca gtgtcattcc 240

gtgcctgtga agtcttgctc cgagccacgg tgtttcaacg gcggcacatg ccagcaggct 300

ctgtatttct ccgatttcgt gtgccagtgt cctgagggct ttgccggcaa gtgctgtgag 360

atcgatacca gggctacatg ttacgaggac cagggcatca gctatagggg cacctggtct 420

acagctgagt ccggagctga gtgcaccaac tggaactcct ccgccctggc tcagaagcct 480

tactctggca ggcggccaga tgctatcagg ctgggactgg gcaaccacaa ttattgtaga 540

aatcccgatc gcgactctaa gccttggtgc tacgtgttca aggccggcaa gtattcttcc 600

gagttttgct ccaccccagc ttgtagcgag ggcaactctg actgttactt tggcaatggc 660

agcgcctata gaggcaccca ttctctgaca gagtccggcg ctagctgcct gccatggaac 720

tctatgatcc tgatcggcaa ggtgtacaca gctcagaatc catccgccca ggctctggga 780

ctgggcaagc acaactattg tcgcaatcca gatggcgacg ctaagccctg gtgccatgtg 840

ctgaagaaca gacgcctgac ctgggagtac tgcgatgtgc ccagctgctc tacatgtggc 900

ctgaggcagt attctcagcc tcagttccgg atcaagggcg gcctgtttgc cgacatcgct 960

agccacccat ggcaggccgc tatcttcgcc aagcataggc ggtctcccgg cgagaggttt 1020

ctgtgcggcg gcatcctgat cagctcttgt tggattctgt ccgccgctca ctgcttccag 1080

gagcggtttc cccctcacca tctgaccgtg atcctgggca ggacataccg ggtggtgcca 1140

ggcgaggagg agcagaagtt cgaggtggag aagtacatcg tgcataagga gtttgacgat 1200

gacacctatg ataacgacat cgccctgctg cagctgaaga gcgactccag cagatgtgct 1260

caggagtctt ccgtggtgcg caccgtgtgc ctgccaccag ccgatctgca gctgccagac 1320

tggacagagt gtgagctgtc cggatacggc aagcacgagg ccctgtcccc tttctatagc 1380

gagaggctga aggaggctca cgtgagactg tacccaagct ctcgctgtac cagccagcat 1440

ctgctgaaca gaaccgtgac agataatatg ctgtgcgctg gcgacacacg ctccggagga 1500

ccacaggcta acctgcatga tgcttgtcag ggcgacagcg gaggacctct ggtgtgcctg 1560

aatgatggcc ggatgaccct ggtgggcatc atctcttggg gactgggatg cggacagaag 1620

gacgtgcctg gcgtgtacac caaggtgaca aactatctgg attggatcag ggacaatatg 1680

cggccatga 1689

<210> 2

<211> 562

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> tPA的氨基酸序列

<400> 2

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg

20 25 30

Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met

35 40 45

Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn

50 55 60

Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser

65 70 75 80

Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr

85 90 95

Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu

100 105 110

Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr

115 120 125

Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser

130 135 140

Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro

145 150 155 160

Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His

165 170 175

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val

180 185 190

Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys

195 200 205

Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg

210 215 220

Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn

225 230 235 240

Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala

245 250 255

Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly

260 265 270

Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp

275 280 285

Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr

290 295 300

Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala

305 310 315 320

Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro

325 330 335

Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile

340 345 350

Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu

355 360 365

Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu

370 375 380

Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp

385 390 395 400

Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser

405 410 415

Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly

435 440 445

Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys

450 455 460

Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His

465 470 475 480

Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr

485 490 495

Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp

500 505 510

Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val

515 520 525

Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly

530 535 540

Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met

545 550 555 560

Arg Pro

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物F1

<400> 3

atatctcgag atggacgcca tgaagagggg 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物R1

<400> 4

atatacgcgt tcatggccgc atattgtccc 30

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物F2

<400> 5

atatggatcc atggccacct cagcaagttc ccact 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物R2

<400> 6

atatgtcgac ttagtttttg tattggaagg gctcg 35

Claims

1.一种编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种包含如权利要求1所述的DNA分子的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述载体为真核生物表达载体。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述载体选自pDNA、pCMV、pEF系列载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述载体为pIRES表达载体。

6.如权利要求2-5中任一项所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括谷氨酰胺合成酶基因。

7.一种用于表达组织型纤溶酶原激活剂的CHO细胞株，其特征在于，所述细胞株包括如权利要求1所述的DNA分子或如权利要求2-6中任一项所述的表达载体。

8.一种优化如权利要求7所述的CHO细胞株的方法，所述方法包括引入谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)筛选加压体系。

9.如权利要求1所述的编码组织型纤溶酶原激活剂的DNA分子、如权利要求2-6中任一项所述的表达载体、如权利要求7所述的CHO细胞株在生产重组组织型纤溶酶原激活剂中的用途。