CN1694958A - 以密码子翻译效率为基础的基因表达系统 - Google Patents

以密码子翻译效率为基础的基因表达系统 Download PDF

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CN1694958A CNA038251086A CN03825108A CN1694958A CN 1694958 A CN1694958 A CN 1694958A CN A038251086 A CNA038251086 A CN A038251086A CN 03825108 A CN03825108 A CN 03825108A CN 1694958 A CN1694958 A CN 1694958A
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Abstract

本法明揭示调节CHO细胞中从多核苷酸生成蛋白的方法，通过用同义密码子取代至少1个多核苷酸的密码子，同义密码子在CHO细胞中的翻译效率高于或低于它取代的密码子，或通过将编码同工tRNA的多核苷酸导入CHO细胞，同工tRNA限制多肽生成速度且对应于第1个多核苷酸的密码子。本发明也揭示使用编码蛋白的多核苷酸，修改其密码子组成以提高CHO细胞中的蛋白生成。

Description

以密码子翻译效率为基础的基因表达系统
                            发明背景
本发明一般涉及基因表达。本发明更具体地涉及调节CHO细胞中从多核苷酸生成蛋白的方法，通过用同义密码子取代至少1个多核苷酸密码子，同义密码子在CHO细胞中的翻译效率高于或低于它取代的密码子，或通过将编码同工tRNA的多核苷酸导入CHO细胞，同工tRNA限制多肽生成速度且对应于第1个多核苷酸的密码子。本发明更加具体地涉及使用编码蛋白的多核苷酸修改其密码子组成，以提高CHO细胞中的蛋白生成。
目前在转化细胞中表达外来异源基因是平常的。大量哺乳动物基因已在不同宿主细胞中成功地表达，基因包括例如鼠和人基因，宿主细胞包括细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物宿主细胞。然而，尽管表达系统和重组DNA技术的知识不断增长，当试图在所选择的宿主细胞中表达外来或合成基因时仍有重大障碍。例如，即使与强启动子偶联，合成基因的翻译通常比预期的慢许多。对宿主细胞外来的外源基因也常同样如此。低于预期翻译效率通常是由于基因的蛋白编码区具有不类似于在宿主细胞中高表达基因的密码子使用模式。在此方面已知密码子使用有高度偏向的且在不同生物体中变化显著，密码子使用中的偏性能改变肽延伸速度。也已知密码子使用模式涉及tRNA同功受体的相对丰度，编码高丰度蛋白的基因相对编码低丰度蛋白的基因显示在其密码子优先上不同。
发展密码子-最优化技术用于改进翻译效率低的蛋白编码区的翻译动力学。这些技术传统上基于用宿主优先的密码子取代宿主细胞中罕见或不常用的密码子。密码子频率可获得自许多生物体的高表达基因的文献来源(参见例如Nakamura等.，1996，Nucleic Acids Res 24：214-215)。这些频率一般在“全生物体平均基础”上表示，表示为同义密码子用于编码一相应氨基酸跨越该生物体的一批蛋白编码基因的情况百分比，蛋白编码基因优选地高表达。
通常，密码子分类为：(a)“普通”密码子(或“优选”密码子)，如果它们的使用频率大于约4/3x密码子使用中没有任何偏性时所预期的使用频率；(b)“稀有”密码子(或“非优选”密码子)，如果它们的使用频率低于约2/3x密码子使用中没有任何偏向时所预期的使用频率；(c)“中间”密码子(或“不太优选”密码子)，如果它们的使用频率是“普通”密码子与“稀有”密码子的在中间使用频率。由于氨基酸可由2、3、4或6个密码子编码，任何选择密码子的使用频率取决于所编码氨基酸与选择密码子相同的同义密码子数量，使用频率是密码子使用中没有任何偏性时所预期的频率。因此，对于特定氨基酸，将密码子分成“普通”、“中间”和“稀有”类别的频率阈值取决于该氨基酸的同义密码子数量。因而，对于有6种同义密码子选择的氨基酸，密码子使用中没有任何偏性时所预期的密码子使用频率是16％，因此“普通”、“中间”和“稀有”密码子分别定义为使用频率大于20％、10与20％之间和低于10％的密码子。对于有4种同义密码子选择的氨基酸，密码子使用中没有任何偏性时所预期的密码子使用频率是25％，因此“普通”、“中间”和“稀有”密码子分别定义为使用频率大于33％、16与33％之间和低于16％的密码子。对于异亮氨酸，异亮氨酸是有3种同义密码子选择的唯一氨基酸，密码子使用中没有任何偏性时所预期的密码子使用频率是33％，因此异亮氨酸的“普通”、“中间”和“稀有”密码子分别定义为使用频率大于45％、20与45％之间和低于20％的密码子。对于有2种同义密码子选择的氨基酸，密码子使用中没有任何偏性时所预期的密码子使用频率是50％，因此“普通”、“中间”和“稀有”密码子分别定义为使用频率大于60％、30与60％之间和低于30％的密码子。因而，将密码子分成“普通”、“中间”和“稀有”类(或分别为“优选”、“不太优选”或“非优选”)接常规基于生物体一般密码子使用汇编(例如‘全人类’)或用于一般生物体种类(例如‘全哺乳动物’)。例如，参考Seed(参见美国专利序列号5,786,464和5,795,737)，他公开了用于一般哺乳动物的优选、不太优选和非优选密码子。然而，本发明者在WO 99/02694和WO 00/42190中揭示单个多细胞生物体(例如哺乳动物或植物)的不同细胞或组织中特定同功受体转移RNA的相对丰度有显著差异且这在从编码序列蛋白翻译中起关键作用，编码序列具有特定密码子使用或组成。
因此，与本领域认为的多细胞生物体的不同细胞具有相同密码子使用偏性的假设相反，首次揭示多细胞生物体的一种细胞类型使用密码子的方式不同于相同生物体的另一种细胞类型。换句话说，显示生物体的不同细胞对相同密码子能表现出不同翻译效率且不可能预测哪些密码子会在所选择的细胞类型中优选、不太优选或非优选。所以提出了可利用细胞类型之间密码子翻译效率中的差异与基因的密码子组成一起以调节在一个选择细胞类型中蛋白的生成，或者引导蛋白的生成。因此，为使编码蛋白的多核苷酸在特定细胞类型中的表达最优化，首先需要确定各密码子在该细胞类型中的翻译效率，而不是取决于在全生物体平均基础上计算的密码子频率，然后在此确定的基础上修改多核苷酸密码子。
                          发明概述
本发明部分在实验确定中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中各同义密码子翻译效率值的基础上推断。这些值显然与分析所得密码子频率值不相连，分析的频率是密码子用于编码相应氨基酸的，相应氨基酸跨越一批高表达的哺乳动物蛋白编码基因，如Seed所示(同上)。结果，本发明第一次能构建编码蛋白的多核苷酸，它们是用于CHO细胞中有效表达的密码子最优化的。
因此，在本发明的一个方面，提供构建合成多核苷酸的方法，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的水平不同于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率不同于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸，
其中，密码子翻译效率的比较示于表1：
                            表1
 密码子 翻译效率  密码子 翻译效率  密码子 翻译效率
 AlaGCA  38  GlyGGA  60  ProCCC  70
 AlaGCG  28  GlyGGG  18  ProCCT  63
 AlaGCT  18  GlyGGC  12  ProCCG  60
 AlaGCC  14  GlyGGT  6  ProCCA  56
 ArgAGA  36  HisCAC  32  SerAGC  72
 ArgCGA  34  HisCAT  27  SerTCT  69
 ArgCGG  35  SerAGT  65
 ArgCGT  33  IleATC  8  SerTCG  58
 ArgAGG  29  IleATT  6  SerTCA  58
 ArgCGC  19  IleATA 6  SerTCC  55
 AsnAAC  40  LeuCTC 45  ThrACA  47
 AsnAAT  33  LeuTTG 34  ThrACG  47
 LeuCTA 25  ThrACT  45
 AspGAT  27  LeuCTG 20  ThrACC  28
 AspGAC  18  LeuTTA 18
 LeuCTT 17  TyTAC  27
 CysTGC  32  TyrTAT  27
 CysTGT  19  LysAAG 28
 LysAAA 15  ValGTG  17
 GlnCAA  18  ValGTT  16
 GlnCAG  18  PheTTT 30  ValGTC  15
 PheTTC 20  ValGTA  14
 GluGAA  16
 GluGAG  9
因此，通过选择同义密码子能获得较高生成多肽，同义密码子的翻译效率高于其取代的第1个密码子。在此类型的一个较佳实施方案中，选择同义密码子，使它在CHO细胞中的翻译效率至少约为它所取代密码子翻译效率的110％。在此实施方案中，第1个和同义密码子选自表2：
                             表2
第1个密码子  同义密码子 第1个密码子 同义密码子 第1个密码子 同义密码子
 AlaGCG  AlaGCA  GlyGGG  GlyGGA  ProCCT  ProCCC
 AlaGCT  AlaGCA  GlyGGC  GlyGGA  ProCCG  ProCCC
 AlaGCC  AlaGCA  GlyGGT  GlyGGA  ProCCA  ProCCC
 AlaGCT  AlaGCG  GlyGGC  GlyGGG  ProCCG  ProCCT
 AlaGCC  AlaGCG  GlyGGT  GlyGGG  ProCCA  ProCCT
 AlaGCC  AlaGCT  GlyGGT  GlyGGC  ProCCA  ProCCG
 ArgCGT  ArgAGA  HisCAT  HisCAC  SerAGT  SerAGC
 ArgAGG  ArgAGA  SerTCG  SerAGC
 IleATT  IleATC  SerTCA  SerAGC
 ArgCGC  ArgAGA  IleATA  IleATC  SerTCC  SerAGC
 ArgCGT  ArgCGA  SerTCG  SerTCT
 ArgAGG  ArgCGA  LeuTTG  LeuCTC  SerTCA  SerTCT
 ArgCGC  ArgCGA  LeuCTA  LeuCTC  SerTCC  SerTCT
 ArgAGG  ArgCGG  LeuCTG  LeuCTC  SerTCG  SerAGT
 ArgCGC  ArgCGG  LeuTTA  LeuCTC  SerTCA  SerAGT
 ArgAGG  ArgCGT  LeuCTT  LeuCTC  SerTCC  SerAGT
 ArgCGC  ArgCGT  LeuCTA  LeuTTG  SerTCC  SerTCG
 ArgCGC  ArgAGG  LeuCTG  LeuTTG  SerTCC  SerTCA
 LeuTTA  LeuTTG
 AsnAAT  AsnAAC  LeuCTT  LeuTTG  ThrACC  ThrACA
 LeuCTG  LeuCTA  ThrACC  ThrACG
 AspGAC  AspGAT  LeuTTA  LeuCTA  ThrACC  ThrACT
 LeuCTT  LeuCTA
 CysTGT  CysTGC  LeuTTA  LeuCTG  ValGTC  ValGTG
 LeuCTT  LeuCTG  ValGTA  ValGTG
 GluGAG  GluGAA  LeuCTT  LeuTTA  ValGTA  ValGTT
 LysAAA  LysAAG
 PheTTC  PheTTT
相反，通过选择同义密码子能获得低生成，同义密码子的翻译效率低于其取代的第1个密码子。在此类型的一个较佳实施方案中，选择同义密码子，使它在CHO细胞中的翻译效率小于它所取代密码子的翻译效率约90％。在此实施方案中，第1个和同义密码子选自表3：
                               表3
 第1个密码子  同义密码子  第1个密码子  同义密码子  第1个密码子  同义密码子
 AlaGCA  AlaGCG  GlyGGA  GlyGGG  ProCCC  ProCCT
 AlaGCA  AlaGCT  GlyGGA  GlyGGC  ProCCC  ProCCG
 AlaGCA  AlaGCC  GlyGGA  GlyGGT  ProCCC  ProCCA
 AlaGCG  AlaGCT  GlyGGG  GlyGGC  ProCCT  ProCCG
 AlaGCG  AlaGCC  GlyGGG  GlyGGT  ProCCT  ProCCA
 AlaGCT  AlaGCC  GlyGGC  GlyGGT  ProCCG  ProCCA
 ArgAGA  ArgCGT  HisCAC  HisCAT  SerAGC  SerAGT
 ArgAGA  ArgAGG  SerAGC  SerTCG
 IleATC  IleATT  SerAGC  SerTCA
 ArgAGA  ArgCGC  IleATC  IleATA  SerAGC  SerTCC
 ArgCGA  ArgCGT  SerTCT  SerTCG
 ArgCGA  ArgAGG  LeuCTC  LeuTTG  SerTCT  SerTCA
 ArgCGA  ArgCGC  LeuCTC  LeuCTA  SerTCT  SerTCC
 ArgCGG  ArgAGG  LeuCTC  LeuCTG  SerAGT  SerTCG
 ArgCGG  ArgCGC  LeuCTC  LeuTTA  SerAGT  SerTCA
 ArgCGT  ArgAGG  LeuCTC  LeuCTT  SerAGT  SerTCC
 ArgCGT  ArgCGC  LeuTTG  LeuCTA  SerTCG  SerTCC
 ArgAGG  ArgCGC  LeuTTG  LeuCTG  SerTCA  SerTCC
 LeuTTG  LeuTTA
 AsnAAC  AsnAAT  LeuTTG  LeuCTT  ThrACA  ThrACC
 LeuCTA  LeuCTG  ThrACG  ThrACC
 AspGAT  AspGAC  LeuCTA  LeuTTA  ThrACT  ThrACC
 LeuCTA  LeuCTT
 CysTGC  CysTGT  LeuCTG  LeuTTA  ValGTG  ValGTC
 LeuCTG  LeuCTT  ValGTG  ValGTA
 GluGAA  GluGAG  LeuTTA  LeuCTT  ValGTT  ValGTA
 LysAAG  LysAAA
 PheTTT  PheTTC
在一个特别较佳实施方案中，密码子翻译效率的比较示于表4：
                          表4
                          翻译效率
    高     中等     低
 AlaGCA  AlaGCG，AlaGCT  AlaGCC
 ArgAGA，ArgCGA，ArgCGC，ArgCGT，ArgAGG  ArgCGC
 AsnAAC  AsnAAT
 AspGAT  AspGAC
 CysTGC  CysTGT
 GluGAA  GluGAG
 GlnCAA，GlnCAG
 GlyGGA  GlyGGG  GlyGGC，GlyGGT
 HisCAC  HisCAT
 IleATT，IleATC，IleATA
 LeuCTC，LeuTTG  LeuCTA，LeuCTG  LeuTTA，LeuCTT
 LysAAG  LysAAA
 PheTTT  PheTTC
 ProCCC，ProCCT，ProCCG，ProCCA
 SerAGC，SerTCT，SerAGT，
 SerTCG，SerTCA，SerTCC
 ThrACA，ThrACG，ThrACT  ThrACC
 TyrTAC，TyrTAT
 ValGTA，ValGTT，ValGTC，ValGTG
因此，本发明的另一方面考虑构建合成多核苷酸的方法，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的水平高于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率高于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸，
其中，第1个和同义密码子选自表5：
                      表5
  第1个密码子  同义密码子  第1个密码子  同义密码子
 AlaGCC  AlaGCA  GlyGGT  GlyGGA
 AlaGCC  AlaGCG  GlyGGT  GlyGGG
 AlaGCC  AlaGCT  GlyGGC  GlyGGA
 AlaGCT  AlaGCA  GlyGGC  GlyGGG
 AlaGCG  AlaGCA  GlyGGG  GlyGGA
 ArgCGC  ArgAGA  HisCAT  HisCAC
 ArgCGC  ArgCGA
 ArgCGC  ArgCGG  LeuCTT  LeuCTC
 ArgCGC  ArgCGT  LeuCTT  LeuTTG
 ArgCGC  ArgAGG  LeuTTA  LeuCTC
 LeuTTA  LeuTTG
 AsnAAT  AsnAAC  LeuCTG  LeuCTC
 LeuCTG  LeuTTG
 AspGAC  AspGAT  LeuCTA  LeuCTC
 LeuCTA  LeuTTG
 CysTGT  CysTGC
 LysAAA  LysAAG
 GluGAG  GluGAA
 PheTTC  PheTTT
而在又一方面，本发明考虑构建合成多核苷酸的方法，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的水平低于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率低于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸，
其中，第1个和同义密码子选自表6：
                     表6
  第1个密码子  同义密码子  第1个密码子  同义密码子
 AlaGCA  AlaGCC  GlyGGA  GlyGGT
 AlaGCG  AlaGCC  GlyGGG  GlyGGT
 AlaGCT  AlaGCC  GlyGGA  GlyGGC
 AlaGCA  AlaGCT  GlyGGG  GlyGGC
 AlaGCA  AlaGCG  GlyGGA  GlyGGG
 ArgAGA  ArgCGC  HisCAC  HisCAT
 ArgCGA  ArgCGC
 ArgCGG  ArgCGC  LeuCTC  LeuCTT
 ArgCGT  ArgCGC  LeuTTG  LeuCTT
 ArgAGG  ArgCGC  LeuCTC  LeuTTA
 LeuTTG  LeuTTA
 AsnAAC  AsnAAT  LeuCTC  LeuCTG
 LeuTTG  LeuCTG
 AspGAT  AspGAC  LeuCTC  LeuCTA
 LeuTTG  LeuCTA
 CysTGC  CysTGT
 LysAAG  LysAAA
 GluGAA  GluGAG
 PheTTT  PheTTC
在又一方面，发明提供根据任一种上述方法构建的合成多核苷酸。
在另一方面，发明包括修饰中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的方法，从而使多肽可以较高的水平从第1个多核苷酸生成，方法包括：
-将编码同工tRNA的第2个多核苷酸导入CHO细胞，同工tRNA限制多肽生成速度且对应于第1个多核苷酸的密码子，其中密码子选自AlaGCC、AlaGCT、AlaGCG、ArgAGA、ArgCGG、ArgCGA、ArgCGT、ArgAGG、ArgCGC、AsnAAC、AsnAAT、AspGAC、CysTGT、GluGAG、GlnCAA、GlnCAG、GlyGGC、GlyGGG、GlyGGT、HisCAC、HisCAT、IleATT、IleATC、IleATA、LeuCTA、LeuCTG、LeuTTA、LeuCTT、LysAAA、PheTTT、PheTTC、ProCCC、ProCCA、ProCCG、ProCCT、SerAGC、SerTCT、SerAGT、SerTCG、SerTCA、SerTCC、ThrACA、ThrACG、ThrACT、ThrACC、TyrTAC、TyrTAT、ValGTA、ValGTT、ValGTC和ValGTG，其中第2个多核苷酸可操作连接于调节多核苷酸。
在一个较佳实施方案中，同工tRNA对应的密码子选自AlaGCC、ArgCGC、AspGAC、CysTGT、GluGAG、GlyGGC、GlyGGG、GlyGGT、LeuTTA、LeuCTT、LysAAA和ThrACC。
在一方面，发明提供从上面方法获得的一种修饰的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在又一方面，发明包括在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的方法，生成水平不同于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率不同于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率，比较示于表1或表4；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸；
-将合成多核苷酸导入CHO细胞；
-在CHO细胞中表达合成多核苷酸，从而在CHO细胞中从合成多核苷酸生成多肽，生成水平不同于从亲代多核苷酸生成的水平。
在另一方面，发明特征是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的方法，生成水平高于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率高于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率，其中第1个和同义密码子都选自表2或表5；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸；
-将合成的多核苷酸导入CHO细胞；
-在CHO细胞中表达合成多核苷酸，从而在CHO细胞中从合成多核苷酸生成多肽，生成水平高于从亲代多核苷酸生成的水平。
在另一方面，发明特征是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的方法，生成水平低于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率低于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率，其中第1个和同义密码子都选自表3或表6；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸；
-将合成多核苷酸导入CHO细胞；和
-在CHO细胞中表达合成多核苷酸，从而在CHO细胞中从合成多核苷酸生成多肽，生成水平低于从亲代多核苷酸生成的水平。
在一些实施方案中，上面的方法进一步包括从CHO细胞中分离或纯化多肽。
在另一方面，发明提供根据上面任意一种方法生成的多肽。
在另一方面，发明延伸到在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生成病毒颗粒的方法，其中病毒颗粒包含装配病毒颗粒所需的多肽，其中多肽在CHO细胞中从亲代多核苷酸生成，但水平不足以允许在其中进行生产性病毒装配，方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率高于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率，比较示于表1或表4；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸；和
-将合成多核苷酸导入CHO细胞，合成多核苷酸可操作连接于调节多核苷酸，
从而表达合成多核苷酸以生成多肽，水平足以允许在CHO细胞中生成病毒颗粒。
在另外一方面，发明延伸到在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生成病毒颗粒的方法，其中病毒颗粒包含装配病毒颗粒所需的多肽，其中多肽在CHO细胞中从亲代多核苷酸生成，但水平不足以允许在其中进行生产性病毒装配，方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率高于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率，其中第1个和同义密码子都选自表2或表5；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸；
-将合成多核苷酸导入CHO细胞，合成多核苷酸可操作连接于调节多核苷酸，
从而表达合成多核苷酸以生成多肽，水平足以允许在CHO细胞中生成病毒颗粒。
在又一方面，发明提供在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生成病毒颗粒的方法，其中病毒颗粒包含装配病毒颗粒所需的至少1种多肽，其中多肽在CHO细胞中从第1个多核苷酸生成，但水平不足以允许在其中进行生产性病毒装配，且其中特异于第1个多核苷酸密码子的同工tRNA丰度限制多肽生成速度且对应的密码子选自AlaGCC、AlaGCT、AlaGCG、ArgCGC、AsnAAT、AspGAC、CysTGT、GluGAG、GlnCAA、GlyGGT、GlyGGC、GlyGGG、HisCAT、LeuCTT、LeuTTA、LeuCTG、LeuCTA、LysAAA、PheTTC，方法包括：
-将第2个多核苷酸导入CHO细胞，第2个多核苷酸编码同工tRNA且可操作连接于调节多核苷酸，
从而表达第2个多核苷酸以生成同工tRNA，水平足以增加多肽的生成速度，因而允许在CHO细胞中生成病毒颗粒。
在一些实施方案中，上面的方法进一步包括从CHO细胞中分离或纯化病毒颗粒。
在另一方面，发明提供根据上面任意一种方法生成的病毒颗粒。
                             附图简述
结合附图可更好理解上述概要以及下列发明较佳实施方案的详细描述。为了阐述发明的目的，图显示目前较佳的实施方案。然而，应理解发明不限于所示精确的安排和仪器。在图中：
图1是示意图，描述编码Enbrel_(也称为依那西普)的亲代核苷酸序列[SEQ IDNO：1]，Enbrel_是由2种可溶TNF受体组成的重组融合蛋白，受体由人IgG1分子的Fc片段连接，Enbrel_的氨基酸序列列于SEQ ID NO：2。亲代核苷酸序列引入突变以生成密码子修改的Enbrel_核苷酸序列[SEQ ID NO：3]，是下面所示的亲代序列的相应核苷酸。这些核苷酸取代产生编码氨基酸序列与亲代Enbrel_核苷酸序列相同的核酸序列，但具有的同义密码子在CHO细胞中的翻译效率高于其取代的密码子。
图2是示意图，描述编码人乳头瘤病毒(HPV)16 E7型蛋白的野生型核苷酸序列[SEQ ID NO：4]，HPV 16 E7型蛋白的氨基酸序列列于SEQ ID NO：5。野生型序列引入突变以生成密码子修改的HPV 16 E7核苷酸序列[SEQ ID NO：6]，是下面所示的野生型序列的相应核苷酸。这些核苷酸取代产生编码氨基酸序列与野生型HPV 16 E7核苷酸序列相同的核酸序列，但具有的同义密码子在CHO细胞中的翻译效率高于其取代的密码子。
图3是示意图，描述编码人生长激素(hGH)的野生型cDNA序列[SEQ IDNO：7]，hGH的氨基酸序列列于SEQ ID NO：8。野生型序列引入突变以生成密码子修改的hGH核苷酸序列，是下面标所示的野生型序列的相应核苷酸。这些核苷酸取代产生编码氨基酸序列与野生型hGH核苷酸序列相同的核酸序列，但具有的同义密码子在CHO细胞中的翻译效率高于其取代的密码子。
图4是示意图，显示编码人生长激素(hGH)的野生型基因组序列[SEQ IDNO：26]，hGH的氨基酸序列列于SEQ ID NO：8或27。野生型序列引入突变以生成密码子修改的hGH基因组序列，是下面所示的野生型序列的相应核苷酸。这些核苷酸取代产生编码氨基酸序列与野生型基因组序列相同的修改的，基因组序列，但具有的同义密码子在CHO细胞中的翻译效率高于其取代的密码子。
图5是蛋白质印迹的示意照片，显示在CHO细胞中来自密码子修改的Enbrel_核苷酸序列[SEQ ID NO：3]的Enbrel_生成比来自亲代或未修改的Enbrel_核苷酸序列[SEQ ID NO：1]高约5倍。
图6是蛋白质印迹的示意照片，显示在CHO细胞中来自密码子修改的HPV 16E7核苷酸序列[SEQ ID NO：6]的HPV 16 E7生成比来自亲代或未修改的HPV 16 E7核苷酸序列[SEQ ID NO：4]高约2.5倍。
                          序列简要说明
                              表A
序列ID号     序列     长度
SEQ ID NO：1  编码Enbrel_的亲代核苷酸序列 1470个核苷酸
SEQ ID NO：2  Enbrel_的氨基酸序列 489个氨基酸
SEQ ID NO：3  编码Enbrel_的密码子修改的核苷酸序列 1470个核苷酸
SEQ ID NO：4  编码HPV 16 E7的野生型核苷酸序列 297个核苷酸
SEQ ID NO：5  HPV 16 E7的氨基酸序列 98个氨基酸
SEQ ID NO：6  编码HPVl6E7的密码子修改的核苷酸序列 297个核苷酸
SEQ ID NO：7  编码hGH的野生型核苷酸序列 654个核苷酸
SEQ ID NO：8  hGH的氨基酸序列 217个氨基酸
SEQ ID NO：9  编码hGH的密码子修改的核苷酸序列 654个核苷酸
SEQ ID NO：10  Enbrel_Fl寡核苷酸 80个核苷酸
SEQ ID NO：11  Enbrel_R1寡核苷酸 77个核苷酸
SEQ ID NO：12  Enbrel_F2寡核苷酸 78个核苷酸
SEQ ID NO：13  Enbrel_R2寡核苷酸 89个核苷酸
SEQ ID NO：14  Enbrel_F3寡核苷酸 58个核苷酸
SEQ ID NO：15  Enbrel_R3寡核苷酸 59个核苷酸
SEQ ID NO：16  hGH F1寡核苷酸 86个核苷酸
SEQ ID NO：17  hGH R1寡核苷酸 70个核苷酸
SEQ ID NO：18  hGH F2寡核苷酸 80个核苷酸
SEQ ID NO：19  hGH R2寡核苷酸 74个核苷酸
SEQ ID NO：20  hGH F3寡核苷酸 65个核苷酸
SEQ ID NO：21  hGH R3寡核苷酸 68个核苷酸
SEQ ID NO：22  基因组hGH F1寡核苷酸 97个核苷酸
SEQ ID NO：23  基因组hGH R1寡核苷酸 64个核苷酸
SEQ ID NO：24  基因组hGH F2寡核苷酸 31个核苷酸
SEQ ID NO：25 基因组hGH R2寡核苷酸 27个核苷酸
SEQ ID NO：26 编码hGH的野生型基因组序列 1679个核苷酸
SEQ ID NO：27 hGH的氨基酸序列 217个氨基酸
SEQ ID NO：28 编码hGH的密码子修改的核苷酸序列 1679个核苷酸
                           发明详述
1.定义
除非另有定义，本文所用全部技术和科学术语与发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。尽管任何与本文所述类似或相等的方法和材料可用于实践或测试本发明，描述了优选方法和材料。为了本发明目的，下列术语定义于下。
本文所用的冠词“一个”和“一种”指1种或超过1种(即至少1种)的语法对象。例如，“一种元件”指1种元件或超过1种元件。
“约”指数量、水平、值、频率、百分比、尺度、大小或量相对参考数量、水平、值、频率、百分比、尺度、大小或量变化多达30％，优选多达20％，更优选多达10％。
如本文所用，术语“顺式作用序列”或“顺式调节区”或类似术语指任何获得自可表达遗传序列的核苷酸序列，其中遗传序列的表达至少部分受核苷酸序列调节。本领域技术人员意识到顺式调节区能活化、沉默、提高、抑制或另外改变任何结构基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。
除非上下文另有需要，本说明书中单词“包括”、“包含”和“含有”理解为包括规定步骤或元件或者步骤或元件组，但不排除任何其它步骤或元件或者步骤或元件组。
“相应于”或“与…相应的”指多核苷酸，(a)具有的核苷酸序列与所有或部分参考多核苷酸序列大体相同或互补或(b)编码的氨基酸序列与肽或蛋白中的氨基酸序列相同。此短语的范围也包括肽或多肽，具有的氨基酸序列与参考肽或蛋白中的氨基酸序列大体相同。
“衍生物”指获得自基本序列的多肽，通过本领域理解的修饰例如与其它化学部分缀合或复合或通过翻译后修饰技术。
“表达多核苷酸”指转录多核苷酸，从而生成mRNA和编码的蛋白产物。
“表达载体”指能指导载体编码蛋白合成的自主遗传元件。本领域实践者已知这种表达载体。
术语“基因”以最广泛范围使用，包括对应于基因的基因组DNA区以及对应于外显子或重组分子的cDNA序列，重组分子工程改造成编码功能形式的产物。
“高表达基因”指相对其它基因表达高水平mRNA的基因，优选高水平蛋白。
“同功受体转移RNA”或“同工tRNA”指1种或多种转移RNA，它们的反密码子核苷酸序列不同，但对相同氨基酸特异。
“天然基因”指天然编码蛋白的基因。然而，亲代多核苷酸可能编码非天然产生的蛋白，但用重组技术改造。
术语“5’非编码区”在本文中以最广泛范围使用，包括获得自表达基因的上游区的所有核苷酸序列，除了编码氨基酸残基包括基因的多肽产物的序列，其中5’非编码区至少部分赋予或激活或另外促进基因的表达。
如本文所用，术语“寡核苷酸”指聚合物由核苷酸单位的多重性(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或相关结构变体或其合成类似物)组成，核苷酸单位经磷酸二酯键(或相关结构变体或其合成类似物)连接。因此，尽管术语“寡核苷酸”通常指核苷酸聚合物，其中核苷酸和它们之间的键天然产生，要理解此术语范围也包括各种类似物，包括但不限于肽核酸(PNAs)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核酸等。分子的精确大小可变化，取决于特定应用。寡核苷酸长度通常颇短，一般从约10到30个核苷酸，但此术语可指任何长度的分子，尽管术语“多核苷酸”或“核酸”通常用于大的寡核苷酸。
如本文所用，术语“可操作联接”或“可操作连接”指将结构基因置于启动子的调节控制下，启动子随后控制基因转录且任选控制基因翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中，一般优选将遗传序列或启动子放置离基因转录起始位置一定距离，此距离和遗传序列或启动子与在其天然背景中控制基因间的距离大致相同，天然背景即获得遗传序列或启动子的基因。本领域已知可调节此距离中的一些变化，而不损失功能。类似地，相对于异源基因的调节序列元件的定位优选置于其控制下是通过元件在其天然背景中的定位而定义的，天然背景即获得元件的基因。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。术语一般指长度大于30个核苷酸的寡核苷酸。
“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可交换使用，指氨基酸残基聚合物和相同的变体及合成类似物。因此，这些术语应用于氨基酸聚合物，其中1种或多种氨基酸残基是合成的非天然产生的氨基酸，如相应天然产生的氨基酸的化学类似物，也应用于天然产生的氨基酸聚合物。
“引物”指寡核苷酸，当与DNA链配对时，它能在合适聚合剂存在时起始引物延伸产物的合成。引物优选是单链以产生最大扩增效率，但可另外是双链。引物必须足够长以在聚合剂存在时引发延伸产物的合成。引物长度取决于许多因素，包括应用、待使用温度、模板反应条件、其它试剂和引物来源。例如，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常包含15到35个或更多核苷酸，尽管它可包含较少核苷酸。引物可以是大的多核苷酸，如从约200个核苷酸到几千碱基或更多。引物可选择与模板上的序列“大体互补”，引物设计与模板杂交并作为起始合成的位点。“大体互补”指引物足以与靶核苷酸序列互补杂交。引物优选不包含与模板的错配，引物设计与模板杂交，但这不是必需的。例如，非互补核苷酸可附于引物的5’末端，剩余引物序列与模板互补。另外，非互补核苷酸或一段非互补核苷酸可散布于引物中，只要引物序列与待杂交模板序列有足够互补性并从而形成合成引物的延伸产物的模板。
在上下文或蛋白生成中的“生成”等术语如“生产”和“可生产”指蛋白生产水平足以影响与蛋白相关的特定功能。相反，术语“不能生产”和“大体不能生产”在本文中可交换使用，指(a)蛋白不生成，(b)蛋白生成水平不足以影响与蛋白相关的特定功能，(c)不能通过蛋白特异的单克隆抗体检测蛋白的生成，或(d)通常产生的野生型细胞中蛋白生产水平小于1％。
本文中提及“启动子”是指其最广泛范围，且包括经典基因组基因的转录调节序列，包括精确转录起始所需的TATA框，有或没有CCAAT框序列和另外的调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，这些元件随发育和/或环境刺激而改变基因表达，或以组织特异或细胞类型特异方式改变。启动子通常但不一定置于其调节表达的结构基因的上游或5’。此外，包含启动子的调节元件通常置于基因转录起始位置的2kb内。根据发明的优选启动子可包含1种或多种特异调节元件的另外拷贝，以进一步提高细胞中的表达和/或改变其可操作连接的结构基因的表达定时。
“重组多肽”指用重组技术产生的多肽，即通过重组或合成多肽的表达。
如本文所用，术语“合成多核苷酸”指体外形成的多核苷酸，通过将多核苷酸操作成通常不在自然界中发现的形式。例如，合成多核苷酸可以表达载体的形式。一般，这种表达载体包括转录和翻译调节多核苷酸可操作连接于多核苷酸。
如本文所用，术语“同义密码子”指密码子的核苷酸序列与另外密码子不同，但编码的氨基酸与其它密码子相同。
“翻译效率”指细胞蛋白合成机器将密码子编码氨基酸掺入新生多肽链的效率。例如此效率可通过细胞能从含密码子的RNA模板合成多肽的速度，或通过从这种模板合成肽的量来证明。
“载体”指核酸分子，优选DNA分子，例如获得自质粒、噬菌体或植物病毒，核酸序列可插入或克隆于其中。载体优选包含1个或多个独特限制性位点，能在确定宿主细胞中自主复制，包括靶细胞或组织或祖细胞或其组织，或能与确定宿主的基因组整合，从而克隆序列可再生。因此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，如线性或闭合环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含任何确保自我复制的方法。另外，当导入宿主细胞时，载体可整合入基因组中并与其整合的染色体一起复制。载体系统可包括单载体或质粒、2种或更多载体或质粒，它们一起包含待导入宿主细胞基因组的总DNA或转座子。选择载体通常取决于载体与待导入载体的宿主细胞的相容性。载体也可包括选择标记，如可用于选择合适转化子的抗生素抗性基因。这种抗性基因的例子是本领域技术人员熟知的。
2.缩写
HPV：人乳头瘤病毒
PV：乳头瘤病毒
VLP：病毒样颗粒
HGH：人生长激素
gfp：绿色荧光蛋白基因
GFP：绿色荧光蛋白
3.密码子在CHO细胞中的翻译效率
本发明首次提供翻译效率值用于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的各个同义密码子。确定这些值是通过用一系列59个报导构建物转染CHO细胞，构建物各含gfp基因，框内gfp基因以前是人工起始密码子和5个相同密码子的串联重复。此系列详细描述于WO 00/42215且涵盖编码氨基酸的整个组的同义密码子。瞬时转染CHO细胞的荧光强度然后通过流式细胞仪确定以测量各构建物生成的GFP。CHO细胞产生的GFP量对同工tRNA种类的胞内丰度敏感，同工tRNA对应于测试下的相同密码子的串联重复，因此提供了CHO细胞中特定密码子的翻译效率的直接相关性。因而，在CHO细胞中从特定构建物生成的GFP量越高，构建物中串联重复的密码子翻译效率越高。
上面表1显示59个不同密码子的相对翻译效率，通过测量多至15个不同瞬时转染CHO细胞样品中各种构建物生成的平均荧光强度获得。这些结果揭示同义密码子对于单氨基酸的GFP生成水平变化范围从对谷氨酰胺和酪氨酸的约1倍到对甘氨酸的约10倍，中值约2倍。它们也证明：(1)对一些有3种或多种同义密码子选择的氨基酸，有(a)翻译效率比同义密码子的平均翻译效率至少高约30％的密码子，(b)翻译效率比同义密码子的平均翻译效率至少低约30％的密码子和(c)翻译效率在(a)和(b)中间的密码子；(2)对有2种同义密码子选择的一些氨基酸，有(i)1个翻译效率比其它同义密码子的翻译效率至少高约10％的密码子和(ii)1个翻译效率比其它同义密码子的翻译效率至少低约10％的密码子。根据本发明，认为归入类别1(a)和2(i)的密码子是‘高’效率密码子，认为归入类别2(c)的密码子是‘中间’或‘中等’效率密码子，认为归入类别1(b)和2(ii)的密码子是‘低’效率密码子，如上面表4所列。比较如此分类的翻译效率显示翻译效率分级中的差异，翻译效率获得自Seed确定的一般哺乳动物细胞的密码子使用频率值(参见美国专利序列号5,786,464和5,795,737)。为了方便起见，这些差异在表7中突出，其中Seed优选密码子用蓝背景突出，Seed不太优选密码子用绿背景突出，Seed非密码子用灰背景突出。
                                      表7
氨基酸      Seed预测的一般哺乳动物细胞的优先密码子使用          实验确定的CHO细胞中密码子的翻译效率
  优选   不太优选   非优选     高     中等     低
  Ala   GCC   GCG，GCTGCA   GCA   GCG，GCT     GCG
  Arg   CGC   CGA，CGT，AGA，AGG，CGG   AGA，CGG，CGA，CGT，AGG     CGC
  Asn   AAC   AAT   AAC，AAT
  Asp   GAC   GAT   GAT     GAC
  Cys   TGC   TGT   TGC     TGT
  Glu   GAA，GAG   GAA     GAG
  Gln   CAG   CAA   CAA，CAG
  Gly   GGC     GGG   GGT，GGA   GGA     GGC，GGG，GGT
  His   CAC   CAT   CAC，CAT
  Ile   ATC     ATT   ATA   ATT，ATC，ATA
  Leu   CTG     CTC   TTA，CTA，CTT，TTG   CTC，TTG   CTA，CTG   TAA，CTT
  Lys   AAG   AAA   AAG   AAA
  Phe   TTC   TTT   TTT，TTC
  Pro   CCC   CCG，CCA，CCT   CCC，CCA，CCG，CCT
  Ser   AGC   TCC   TCG，AGT，TCA，TCT   AGC，TCT，AGT，TCG，TCA，TCC
  Thr   ACC   ACG，ACA，ACT   ACA，ACG，ACT   ACC
  Tyr   TAC   TAT   TAC，TAT
  Val   GTG   GTC   GTA，GTT   GTA，GTTGTC，GTG
从上面表中显然：
(1)一些密码子，Seed认为是优选密码子(AlaGCC、AlaCGC、AspGAC、GlyGGC和ThrACC)，事实上翻译效率比其它同义密码子低许多；
(2)一些密码子，Seed认为是非优选密码子(AlaGCA、AspGAT、GluGAA、GlyGGA和LeuTTG)，事实上翻译效率比其它同义密码子高许多；
(3)一些密码子，Seed认为是优选(AsnAAC、GlnCAG、HisCAC、IleATC、LeuCTG、PheTTC、ProCCC、SerAGC、TyrTAC和ValGTG)或非优选密码子(AlaGCG、AlaGCT、ArgAGA、ArgCGG、ArgCGA、ArgCGT、ArgAGG、AsnAAT、GlnCAA、HisCAT、IleATA、LeuCTA、PheTTT、ProCCA、ProCCG、ProCCT、SerTCT、SerAGT、SerTCG、SerTCA、ThrACA、ThrACG、ThrACT、TyrTAT、ValGTA和ValGTT)，具有中等翻译效率；
(4)密码子LeuCTC，Seed认为是不太优选密码子，事实上是高翻译效率的密码子。
因此，本发明首次能调节CHO细胞中来自亲代多核苷酸的蛋白生成，通过用同义密码子取代1个或多个多核苷酸密码子，同义密码子的翻译效率高或低于其取代的密码子。因此在一个实施方案中，本发明包括构建合成多核苷酸的方法，在CHO细胞中从合成多核苷酸生成的蛋白水平高于从编码相同蛋白的亲代多核苷酸生成的水平。此方法包括从表1选择亲代多核苷酸的1个密码子(本文常称为“第1个密码子”)用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率高于第1个密码子。
当选择同义密码子时，它在CHO细胞中的翻译效率优选至少约为它所取代第1个密码子翻译效率的110％，至少约120％合适，优选至少约130％，更优选至少约140％，更加优选至少约150％，更优选至少约160％，更加优选至少约170％，更优选至少约180％，更加优选至少约190％，更优选至少约200％，更加优选至少约250％，更优选至少约300％，更加优选至少约350％，更优选至少约400％，更加优选至少约450％，更优选至少约500％，更加优选至少约550％，更优选至少约600％，更加优选至少约650％，甚至更优选至少约700％。在2个或多个有类似翻译效率的同义密码子的情况中，认为任何一个这些密码子可用于取代第1个密码子。
在另一个实施方案中，同义密码子和第1个密码子都选自上面表4，选择基础是：(a)如果第1个密码子分类为‘低’翻译有效密码子，则同义密码子选自‘高’或‘中等’翻译有效密码子；或(b)如果第1个密码子分类为‘中等’翻译有效密码子，则同义密码子选自‘高’翻译有效密码子。为了方便起见，相关选择示于上面表5。一旦选择，第1个密码子用同义密码子取代以构建生成感兴趣蛋白的合成多核苷酸，水平高于从亲代多核苷酸生成的水平。
因此，根据本发明，亲代多核苷酸可用同义密码子修饰，从而在CHO细胞中从如此修饰的多核苷酸(合成多核苷酸)翻译的蛋白高于亲代多核苷酸。一般，CHO细胞中从合成多核苷酸生成的蛋白水平相对于从亲代多核苷酸生成水平中的差异取决于同义密码子取代的第1个密码子数量、在CHO细胞中第1个密码子与同义密码子之间翻译效率的差异。换句话说，这种取代越少和/或同义与第1个密码子间翻译效率的差异越小，合成多核苷酸与亲代多核苷酸间蛋白生成的差异越小。相反，这种取代越多和/或同义与第1个密码子间翻译效率的差异越大，合成多核苷酸与亲代多核苷酸间蛋白生成的差异越大。
优选但不必需用同义密码子取代所有亲代多核苷酸密码子，同义密码子在CHO细胞中的翻译效率高于第1个密码子。表达增加甚至可伴随着部分取代。通常，取代步骤影响至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％的亲代多核苷酸第1个密码子，更优选至少约35％、40％、50％、60％、70％或更多。适当地选择第1个密码子和同义密码子的数量以及它们间翻译效率的差异，从而在CHO细胞中从合成多核苷酸生成感兴趣蛋白，水平至少约为CHO细胞中从亲代多核苷酸生成蛋白水平的110％，至少约150％合适，优选至少约200％，更优选至少约250％，更加优选至少约300％，更优选至少约350％，更加优选至少约400％，更优选至少约450％，更加优选至少约500％，甚至更优选至少约1000％。
一般，如果亲代多核苷酸选择低和中等翻译有效密码子，在第1种情况中优选用同义密码子取代一些低翻译有效密码子，或更优选取代全部，同义密码子具有中等或优选高翻译效率。通常，用中等或高翻译有效密码子取代低翻译有效密码子导致来自如此构建的合成多核苷酸的多肽生成显著增加。然而，也优选用高翻译有效密码子取代一些中等翻译有效密码子，或优选取代全部，用于多肽的最优化生成。
在又一个实施方案中，本发明考虑构建合成多核苷酸的方法，在CHO细胞中从合成多核苷酸生成的蛋白水平低于从编码相同蛋白的亲代多核苷酸生成的水平。这在高水平蛋白生成对CHO细胞有有害作用时需要。另外或除此之外，可修饰编码蛋白的多核苷酸以引起翻译效率局部减少，以协助蛋白在翻译期间折叠。在此方面，当密码子改变在一部分编码蛋白的多核苷酸中引入翻译暂停(translational pause)时，认为可提高蛋白折叠。因此，在此实施方案中，方法包括从表1选择亲代多核苷酸的1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率低于第1个密码子。所选同义密码子在CHO细胞中的翻译效率优选小于它所取代密码子翻译效率的约90％，小于约80％合适，优选小于约70％，更优选小于约60％，更加优选小于约50％，更优选小于约45％，更加优选小于约40％，更优选小于约35％，更加优选小于约30％，更优选小于约25％，更加优选小于约20％，更优选小于约15％，更加优选小于约10％，甚至更优选小于约5％。
在另外一个实施方案中，同义密码子和第1个密码子都选自上面表4，选择基础是：(a)如果第1个密码子分类为‘高’翻译有效密码子，则同义密码子选自‘中等’或‘低’翻译有效密码子；或(b)如果第1个密码子分类为‘中等’翻译有效密码子，则同义密码子选自‘低’翻译有效密码子。为了方便起见，相关选择示于上面表6。一旦选择，第1个密码子用同义密码子取代以构建生成感兴趣蛋白的合成多核苷酸，水平低于从亲代多核苷酸生成的水平。
4.合成多核苷酸的构建和表达
一个密码子取代另一个可用本领域已知的标准方法完成。例如，可影响亲代多核苷酸的密码子修饰，使用一些已知突变技术，包括例如寡核苷酸-定向诱变、用简并寡核苷酸的诱变和区特异性诱变。示范的体外诱变技术描述于例如美国专利号4,184,917、4,321,365和4,351,901或在Ausubel等(《新编分子生物学实验指南》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，John Wiley & Sons，Inc.1997)和Sambrook等(《分子克隆.实验室手册》(MOLECULAR CLONING.ALABORATORY MANUAL)，Cold Spring Harbor Press，1989)的相关部分。合成多核苷酸可用易获得的机器从头合成，代替体外诱变，描述于例如美国专利号4,293,652。然而，应指出本发明不依赖且不指向任何一种构建合成多核苷酸的特定技术。
亲代多核苷酸优选是天然基因。然而，可能亲代多核苷酸是非天然产生的，但用重组技术改造。亲代多核苷酸可获得自任何合适的来源，如来自真核或原核生物体，包括但不限于哺乳动物或其它动物，以及致病生物体如酵母、细菌、原生动物和病毒。
发明也考虑编码1种或多种感兴趣蛋白所需部分的合成多核苷酸。在此方面，合成多核苷酸优选编码至少1个蛋白功能域，功能域优选至少约为10个蛋白的毗连氨基酸残基，更优选至少约20，更加优选至少约50，更优选至少约100，更加优选至少约150，甚至更优选至少约500。
发明进一步考虑含发明合成多核苷酸的合成构建物(或表达载体)，合成多核苷酸可操作连接于调节多核苷酸。调节多核苷酸适当包括转录和/或翻译控制序列，这些序列适合在CHO细胞中表达。通常，转录和翻译调节控制序列包括但不限于启动子序列、5’非编码区、顺式调节区如转录调节蛋白或翻译调节蛋白的功能性结合位点、上游可读框、核糖体结合序列、转录起始位点、翻译起始位点和/或编码前导序列的核苷酸序列、终止密码子、翻译终止位点和3’-非翻译区。发明考虑本领域已知的组成型和诱导型启动子。启动子可以是天然产生的启动子或结合超过1种启动子元件的杂合启动子。本发明考虑的启动子序列可对CHO细胞是天然的，或可获得自另外来源，其中该区在CHO细胞中有功能。可用于在CHO细胞中表达的示范启动子包括哺乳动物启动子，如金属硫蛋白启动子，它可响应重金属(如镉)而受诱导，以及β-肌动蛋白启动子。也可使用病毒启动子如SV40大T抗原启动子、人巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子、劳氏肉瘤病毒LTR启动子、腺病毒启动子或HPV启动子，特别是HPV上游调节区(URR)。所有这些启动子在本领域较好描述且易获得。
本发明的合成构建物也可包含3’-非翻译序列。3’-非翻译序列指包含DNA区段的基因部分，区段含聚腺苷酸化信号和能影响mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号。聚腺苷酸化信号的特征是将聚腺苷酸段有效加入mRNA前体的3’末端。识别聚腺苷酸化信号一般是通过与规范形式5’AATAAA-3’的同源性存在，尽管变化并不罕见。3’-非翻译调节DNA序列优选包括约50到1,000个核苷酸碱基对，除了聚腺苷酸化信号和能影响mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号之外，它可包含转录和翻译终止序列。
在一个较佳实施方案中，合成构建物进一步包含可选择标记基因以选择转染的CHO细胞。选择基因在本领域熟知且适合在CHO细胞中表达。
在另一个较佳实施方案中，合成构建物包括融合伴侣(通常由表达载体提供)，从而可生成重组多肽作为具融合伴侣的融合多肽。融合伴侣的主要优点是它们协助鉴定和/或纯化融合多肽。为表达融合多肽，必需在读框内连接合成多核苷酸与编码融合伴侣的多核苷酸。熟知的融合伴侣例子包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麦芽糖结合蛋白(MBP)和六组氨酸(HIS6)，它们特定用于通过亲和层析分离融合多肽。为了通过亲和层析纯化融合多肽，用于亲和层析的相关基质分别是谷胱甘肽-、直链淀粉-、镍-或钴-缀合树脂。许多这种基质可以“试剂盒”形式获得，如与(HIS6)融合伴侣一起使用的QLAexpressTM系统(Qiagen)和Pharmacia GST纯化系统。在一个较佳实施方案中，重组多核苷酸在商业载体pFLAG中表达，如在下文中更详细描述。融合伴侣优选也具有蛋白酶切割位点，如用于因子Xa或凝血酶，使相关蛋白酶能部分消化发明的融合多肽并从而释放发明的重组多肽。然后能通过后续层析分离从融合伴侣中分离释放的多肽。根据发明的融合伴侣范围也包括“抗原表位标签”，它们通常是有特异抗体的短肽序列。熟知的抗原表位标签例子包括c-Myc、流感病毒、血凝素和FLAG标记，这些标记的特异单克隆抗体易获得。
发明的合成构建物可导入CHO细胞，使用任何合适的转染，包括例如电穿孔、微粒轰击、脂质体、病毒或噬菌体感染等。这种方法对本领域技术人员熟知。
然而，要理解目前熟知编码蛋白的多核苷酸在异源系统中的表达，本发明不指向于或依赖任何特定载体或技术。相反，用本文所列修饰制备的合成多核苷酸可用于以任何合适方式转染CHO细胞，结合任何合适的合成构建物或载体，合成多核苷酸可用已知启动子以任何常规方式表达。
通过用发明的合成构建物转染培养的CHO细胞，可产生发明的重组蛋白。适合在CHO细胞中表达多核苷酸的条件在本领域已知。如此生成的重组蛋白可由本领域技术人员纯化，使用标准方案例如描述于Sambrook等.，《分子克隆.实验室手册》(Cold Spring Harbor Press，1989)，特别是16和17部分；Ausubel等.，《新编分子生物学实验指南》(John Wiley & Sons，Inc.1994-1998)，特别是第10和16章；Coligan等.，《最新蛋白质科学实验指南》(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEINSCIENCE)(John Wiley & Sons，Inc.1995-1997)，特别是第1、5和6章。
5.通过表达编码同功受体转移RNA的多核苷酸在CHO细胞中生成蛋白
发明的特征也包括修饰CHO细胞的方法，从而蛋白可以较高水平从编码蛋白的第1个多核苷酸中生成。此方法包括选择第1个多核苷酸的密码子，其翻译效率限制蛋白生成且其对应同功受体转移RNA(同工tRNA)不以相对高丰度在CHO细胞中生成。然后将第2个多核苷酸导入CHO细胞，能产生同工tRNA，水平足以提高从第1个多核苷酸中生成蛋白。
在实践中，当同工tRNA以相对低丰度存在于CHO细胞且当第1个多核苷酸包含对该同工tRNA特异的密码子时，通过第2个多核苷酸提供同工tRNA给CHO细胞。一般说来，提供的同工tRNA可特异于在CHO细胞中具‘低’或‘中等’翻译效率的密码子，密码子列于上面表4且可选自AlaGCC、AlaGCT、AlaGCG、ArgAGA、ArgCGG、ArgCGA、ArgCGT、ArgAGG、ArgCGC、AsnAAC、AsnAAT、AspGAC、CysTGT、GluGAG、GlnCAA、GlnCAG、GlyGGC、GlyGGG、GlyGGT、HisCAC、HisCAT、IleATT、IleATC、IleATA、LeuCTA、LeuCTG、LeuTTA、LeuCTT、LysAAA、PheTTT、PheTTC、ProCCC、ProCCA、ProCCG、ProCCT、SerAGC、SerTCT、SerAGT、SerTCG、SerTCA、SerTCC、ThrACA、ThrACG、ThrACT、ThrACC、TyrTAC、TyrTAT、ValGTA、ValGTT、ValGTC和ValGTG。在一个较佳实施方案中，提供的同工tRNA特异于在CHO细胞中具‘低’翻译效率的密码子，密码子列于表4且可选自AlaGCC、ArgCGC、AspGAC、CysTGT、GluGAG、GlyGGC、GlyGGG、GlyGGT、LeuTTA、LeuCTT、LysAAA和ThrACC。
6.提高CHO细胞中病毒颗粒的生成
发明也提供在CHO细胞中生成病毒颗粒的方法。病毒颗粒通常包括病毒装配必需的至少1种蛋白，其中在细胞中从亲代多核苷酸生成的该蛋白或各蛋白水平不足以允许在其中进行生产性病毒装配，之后称它们为装配-限制蛋白。此方法包括从上面表1或2选择亲代多核苷酸的第1个密码子用同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率高于第1个密码子。合适的选择可根据部分3进行。然后用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸，例如描述于部分4的例子。如此生成的合成多核苷酸可操作连接于调节多核苷酸，然后导入CHO细胞，从而在装配病毒颗粒所需其它病毒蛋白存在时在细胞中生成装配-限制蛋白，因而产生病毒颗粒。
装配-限制蛋白优选是病毒衣壳蛋白或衣壳粒。合适的病毒衣壳蛋白包括但不限于乳头瘤病毒的L1和L2蛋白、多瘤病毒的VP1-3、蓝舌病毒的VP1-6和腺病毒的衣壳蛋白。
在CHO细胞中装配病毒颗粒所需的其它病毒蛋白可从1个或多个其它多核苷酸生成，多核苷酸适当包含剩余病毒基因组。当装配-限制蛋白选自乳头瘤病毒的L1或L2时，其它多核苷酸优选包括没有L1-或L2-编码序列的乳头瘤病毒基因组。
在另一个实施方案中，提供在CHO细胞中生成病毒颗粒的方法，其中病毒颗粒包括上述至少1种装配-限制蛋白，装配-限制蛋白从亲代多核苷酸生成。在此实施方案中，至少1个亲代多核苷酸的密码子对装配-限制蛋白的生成是限速的且之后称为限速密码子。方法包括将可表达同工tRNA的多核苷酸导入CHO细胞，多核苷酸对限速密码子特异。合适的限速密码子可根据部分5选择。
发明也提供通过上面任何方法产生的病毒颗粒以及含发明的合成多核苷酸的CHO细胞，或另外通过发明方法生成的CHO细胞。
5.药物组合物
发明的进一步特征是使用根据部分4和5产生的多肽作为药物组合物的活性物，组合物用于治疗、预防或缓解疾病症状，能用这种多肽改善疾病症状。药物组合物适当包括药学上可接受载体。取决于特定施用途径，可使用本领域熟知的多种药学上可接受载体。这些载体可选自糖、淀粉、纤维素和其衍生物、麦芽、明胶、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等渗盐水和无热原的水。
任何合适的施用途径可用于提供发明组合物给病人。例如，可使用口腔、直肠、肠胃外、舌下、颊部、静脉内、关节内、肌肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、经皮等。
剂型包括片剂、分散体、混悬剂、注射剂、溶液、糖浆、锭剂、胶囊、栓剂、气雾剂、经皮贴片等。这些剂型也可包括注射或移植受控释放装置，装置特定设计用于此目的，或修改以此方式另外作用的其它植入物形式。可影响治疗剂的受控释放，通过例如同样用疏水聚合物包衣，包括丙烯酸树脂、蜡、较高脂族醇、聚乳酸和聚乙醇酸和某些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素。此外，影响受控释放可用其它聚合物基质、脂质体和/或微球体。
适合口服或肠胃外施用的本发明药物组合物可作为不连续单位呈现，如胶囊、小药囊或片剂，各含预定量的1种或多种发明治疗剂，作为粉末或颗粒或作为溶液或悬浮液在含水液体、非含水液体、水包油乳剂或油包水液体乳剂中。制备这种组合物可通过任何药学方法，但所有方法包括步骤使上述1种或多种免疫原性剂结合构成1种或多种必需成分的载体。一般，制备组合物是通过均匀和密切混合发明免疫原性剂与液体载体或精细分开的固体载体或两者混合，然后如果需要，将产物制成所需形状。
上面的组合物可以与剂型可配伍的方式施用，施用量可有效治疗或预防以减轻病人与疾病相关的症状，或量足以保护病人不发展与疾病相关的症状。在本发明上下文中，施用给病人的剂量应足以在病人中随着时间获得有益反应，如上述治疗或预防作用。待施用的多肽量取决于待治疗受试者，包括其年龄、性别、体重和一般健康状况。在此方面，施用精确的多肽量取决于专业人员的判断。在确定待施用多肽治疗或预防疾病的有效量时，医师可评估疾病的进展。无论如何，根据发明制备的多肽的合适剂量易由本领域技术人员确定。这种剂量可以是纳克到毫克等级的多肽。
为使发明容易理解并付诸实践，现在通过下列非限制性例子描述特定的较佳实施方案。
                             实施例
实施例1
构建密码子修改的Enbrel_-编码多核苷酶以提高CHO细胞中的表达
Enbrel_(也称为依那西普)是由2种可溶TNF受体组成的重组融合蛋白，受体由人IgG1分子的Fc片段连接，Enbrel_的氨基酸序列列于SEQ ID NO：2。未修改的基因序列示于SEQ ID NO：1，在此序列中鉴定了一些密码子(编码Leu10和Leu14的CTG；编码Glu15和Glu35的GAG；编码Gly37的GGG；编码Gly60的GGC；编码Lys56和Lys64的AAA；编码His62的CAT；编码Phe66的TTC；编码Thr68和Thr70的ACC)，它们具有低翻译效率，如表1和2所列。然后选择有较高翻译效率的同义密码子(LeuCTC、GluGAA、GlyGGA、LysAAG、HisCAC、PheTTT和ThrACA)以取代低翻译效率的密码子。为了方便起见，这些取代示于图1，图1描述修改和未修改的Enbrel_基因序列的比较。
然后，盒诱变用于使较高翻译效率的密码子取代未修改的基因序列的低翻译效率的密码子。简要地，用无菌、无核酸酶的水使100pmol的下列寡核苷酸达到40μL总体积。
(a)F1(5’-CATGGCGGCCCGTCGCCGTCTGGGCCGCGCTCGCCGTCGGACTCGAACTCTGGGCTGCGGCACGCCTTGCCCGCCCAGGT-3’)[SEQ ID NO：10]和
R1(5’-GGGCGGGCAAGGCGTGCGCCGCAGCCCAGAGATCGAGTCCGACGGCGAAGCGCGGCCCCAGACGGCGCGACGGGCGC-3’)[SEQ ID NO：11]；或
(b)F2(5’-GGCATTTACACCCTACGCCCCGGAACCCGGAAGCACATGCCGGCTCAGAGAATACTATGACAGCTCAGATGTGCTGCA-3’)[SEQ ID NO：12]和
R2(5’-GCACATCTGAGCTGTCTGGTCATAGTATTCTCTGAGCCGGCATGTGCTTCCGGGTTCCGGGTCCGGGGCGTAGGGTGTAAATGCCACCT-3’)[SEQ IDNO：13]；或
(c)F3(5’-GCAAGTGCTCGCCGGGACAACACGCAAAGGTCTTTTGTACAAAGACATCGGACACCGT-3’)[SEQ ID NO：14]和
R3(5’-GTGTCCGATGTCTTTGTACAAAAGACCTTTGCGTGTTGTCCCGGCGAGCACTTGCTGCA-3’)[SEQ ID NO：15]。
通过在100℃加热2分钟，37℃孵育2小时并冷却到室温使单独的寡核苷酸对退火。然后连接退火的寡核苷酸，凝胶纯化并连接入含Enbrel_基因的pUC19载体，载体用NcoI/DraIII消化。然后通过用KpnI和HindII消化从pUC19中取出修改和未修改的Enbrel_基因并连接入KpnI/EcoRV消化的pCDNA3，用于在CHO细胞中表达。
实施例2
构建密码子修改的HPV16E7-编码多核苷酸以提高CHO细胞中的表达
HPV 16E7的野生型编码序列示于SEQ ID NO：4，在此序列中鉴定了一些密码子(编码His2、His9和His51的CAT；编码Pro6的CCT；编码Pro17和Pro98的CCA；编码Pro47的CCG；编码Leu8、Leu15、Leu67和Leu79的TTG；编码Leu13、Leu28和Leu83的TTA；编码Leu65的CTT；编码Leu82的CTG；编码Leu87的CTA；编码Glu18、Glu26、Glu33、Glu34和Glu35的GAG；编码Thr20和Thr78的ACT；编码Thr56的ACC；编码Cys24、Cys58、Cys61和Cys94的TGT；编码Asn29和Asn53的AAT；编码Asp30、Asp48、Asp62、Asp75和Asp81的GAC；编码Ser32的TCA；编码Ala42的GCT；编码Ala50的GCC；编码Gly85的GGC；编码Lys97的AAA)，它们具有低翻译效率，如表1和4所列。然后选择有较高翻译效率的同义密码子(HisCAC、ProCCC、LeuCTC、GluGAA、CysTGC、AsnAAC、AspGAT、SerTCT、AlaGCA、ThrACA、GlyGGA和LysAAG)以取代低翻译效率的密码子。为了方便起见，这些取代示于图2，图2描述修改和野生型HPV 16E7编码序列的比较。
修改的HPV 16E7编码序列商业构建(Operon)并定向连接入pCDNA3的BamHI和EcoRI位点以在CHO细胞中表达。
实施例3
构建密码子修改的人生长激素cDNA以提高CHO细胞中的表达
人生长激素(hGH)的野生型编码序列示于SEQ ID NO：7，在此序列中鉴定了一些密码子(编码Ala2、Ala12和Ala29的GCT；编码Ala26、Ala43、Ala50和A1a60的GCC；编码Thr3的ACA；编码Thr29和Thr53的ACC；编码Gly4、Gly14和Gly24的GGC；编码Ser5、Ser8和Ser33的TCC；编码Ser25的AGT；编码Ser69的TCA；编码Leu9、Leu11、Leu15、Leu18、Leu46和Leu49的CTG；编码Leu21的CTT；编码Leu32的TTA；编码Glu23和Glu56的GAG；编码Phe27和Phe70的TTC；编码Pro28和Pro63的CCA；编码Pro35的CCT；编码Arg34的AGG；编码Arg42的CGC；编码Asp37的GAC；编码His44的CAT)，它们具有低翻译效率，如表1和2所列。然后选择有较高翻译效率的同义密码子(AlaGCA、GlyGGA、SerTCT、LeuCTC、GluGAA、PheTTT、ProCCC、ThrACA、ArgAGA、HisCAC和AspGAT)以取代低翻译效率的密码子。为了方便起见，这些取代示于图3，图3描述修改和野生型hGH编码序列的比较。
然后，盒诱变用于使较高翻译效率的密码子取代野生型编码序列的低翻译效率密码子，如实施例1所述，除了使用下列寡核苷酸取代该实施例所用引物。
(a)F1(5’-GATCCACCATGGCAACAGGATCTCGGACGTCTCTCCTCCTCGCATTTGGACTCCTCTGCCTCCCCTGGCTCCAAGAAGAAGGAAGC-3’)[SEQ IDNO：16]；和
R1(5’-TTCTTGGAGCCAGGGGAGGCAGAGGAGTCCAAATGCGAGGAGGAGAGACGTCCGAGATCCTGTTGCCATG-3’)[SEQ ID NO：17]；或
(b)F2(5’-GCATTTCCCACAATTCCCCTCCCCTCTCTAGACCCTTTGATAACGCAATGCTCCGGGCACACCGTCTCCACCAGCTCGCA-3’)[SEQ ID NO：18]；和
R2(5’-TGGTGGAGACGGTGTGCCCGGAGCATTGCGTTATCAAAGGGTCTAGAGAGGGGAATTGTGGGAAATGCGCTTCC-3’)[SEQ ID NO：19]；或
(c)F3(5’-TTTGACACATACCAGGAATTTGAAGAAGCATATATCCCCAAGGAACAGAAGTATTCTTTTCTGCA-3’)[SEQ ID NO：20]；和
R3(5’-GAAAAGAATACTTCTGTTCCTTGGGGATATATGCTTCTTCAAATTCCTGGTATGTGTCAAATGCGAGC-3’)[SEQ ID NO：21]。
然后连接退火的寡核苷酸，凝胶纯化并连接入BamHI和DraII消化的hGH基因。然后，修改和野生型hGH编码序列连接入pCDNA3以在CHO细胞中表达。
实施例4
构建密码子修改的人生长激素基因组DNA以提高CHO细胞中的表达
基因组hGH克隆亚克隆入pCDNA3中且此亚克隆的BamHI/SacI片段进一步亚克隆入pUC18中。所得pUC18亚克隆用作PCR扩增的模板，使用下列引物：
(a)F1(5’-CCGGGCCAACATGGCTACAGGATCTCGGACGTCTCTCCTCCTCGCATTTGGACTCCTCTGCCTCCCCTGGCTCCAAGAAGGAAGCGCATTTCCCACA-3’)[SEQ ID NO：22]；和
(b)R1(5’-GCGCGGCCAGCTGGTGGAGACGGTGTGCCCGGAGCATTGCGTTGTCAAAGGGTCTAGAGAGGGG-3’)[SEQ ID NO：23]。
扩增产物克隆入上面pUC18亚克隆的BamHI/PvuII位点，所得修改的克隆用作第2次PCR扩增的模板，使用下列引物：
(c)F2(5’-CAGCTGGCCTTTGACACATACCAGGAATTTG-3’)[SEQ ID NO：24]和
(d)R2(5’-CTTCGGGAAAAACCCTGAGCTCCTTAG-3’)[SEQ ID NO：25]。
所得扩增产物连接入修改克隆的PvuII/SacI位点，然后所得第2个修改克隆的BamHI/SacI片段回亚克隆回入原始hGH pCDNA3克隆中。
hGH基因的野生型基因组序列示于SEQ ID NO：26，其编码序列内的多个密码子(编码G1y4、Gly14和Gly24的GGC；编码Ser5、Ser8和Ser33的TCC；编码Ser25的AGT；编码Leu9、Leu11、Leu15、Leu18和Leu46的CTG；编码Leu21的CTT；编码Leu32的TTA；编码Ala12和Ala39的GCT；编码Ala26和Ala43的GCC；编码Glu23和Glu56的GAG；编码Phe27的TTC；编码Pro28的CCA；编码Pro35的CCT；编码Thr29和Thr53的ACC；编码Asp37的GAC；编码Arg34的AGG；编码Arg42的CGC；编码His44的CAT)鉴定为具有低翻译效率，如表1和2所列。然后选择有较高翻译效率的同义密码子(GlyGGA、SerTCT、LeuCTC、AlaGCA、GluGAA、SerAGT、PheTTT、ProCCC、ThrACA、ArgAGA、AspGAT、ArgCGG和HisCAC)以取代低翻译效率的密码子。修改的hGH基因组序列的核苷酸序列示于SEQ ID NO：28。为了方便起见，这些取代示于图4，图4描述修改和野生型hGH基因组序列的比较。
实施例5
用密码子修改的Enbrel_构建物瞬时转染CHO细胞和蛋白质印迹
中国仓鼠卵巢细胞在DMEM/F12培养基(Invitrogen)中培养，培养基补充10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(Gibco BRL)。细胞用LipofectaminePlus(Invitrogen)转染。转染前16小时，细胞接种于T25烧瓶。4μg未修改Enbrel_构建物或密码子修改的Enbrel_构建物在750μL OptiMEM ITM培养基(Invitrogen)中稀释，质粒DNA与20μL Plus试剂(Invitrogen)混合，室温孵育30分钟，然后加入含30μL Lipofectamine试剂(Invitrogen)的750μL OptiMEM ITM培养基，室温孵育30分钟。细胞单层用OptiMEM ITM培养基洗1次，用5mL OptiMEM ITM培养基和转染混合物孵育过夜，接着用5mL还原生长培养基(DMEM/F12、2％胎牛血清)更换并再培养24小时，然后收集。收集5mL细胞培养物上清。随然样品浓缩到100μL，用50 000 MWCO自旋滤器(Amicon)。样品在-20℃保存。
加入5X样品缓冲液到20μL样品后，样品在7.5％凝胶上以150V进行SDS-PAGE 1小时。蛋白电印迹到PVDF膜(Amersham)上，125mA 2小时。用PBS/0.5％吐温20中的5％脱脂奶粉封闭后，通过加入4μg/mL(1∶250)人IgG Fc区特异抗体(小鼠单克隆(HP6017)，Santa Cruz Biotechnology Inc.)探测膜。使用过氧化物酶-偶联的二抗(小鼠抗人IgG，1∶1000稀释)和化学发光检测系统呈现蛋白，胶片曝光并显影。
图5所示结果显示密码子修改的Enbrel_构建物产生的Enbrel_约为未修改Enbrel_构建物的5倍。
实施例6
用密码子修改的HPV16E7构建物瞬时转染CHO细胞和蛋白质印迹
中国仓鼠卵巢细胞在DMEM/F12培养基(Invitrogen)中培养，培养基补充10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(Gibco BRL)。细胞用LipofectaminePlus(Invitrogen)转染。转染前16小时，细胞接种于T25烧瓶。4μg HPV 16 E7野生型或修改的HPV 16 E7 CHO在750μL OptiMEM ITM培养基(Invitrogen)中稀释，质粒DNA与20μL Plus试剂TM(Invitrogen)混合，室温孵育30分钟，然后加入含30μL Lipofectamine试剂(Invitrogen)的750μL OptiMEM ITM培养基，室温孵育30分钟。细胞单层用OptiMEM ITM培养基洗1次，用5mL OptiMEM ITM培养基和转染混合物孵育过夜，接着用5mL生长培养基(DMEM/F12、10％胎牛血清)更换并再培养24小时，然后收集。收集细胞并沉淀，然后重悬浮于0.1mL裂解缓冲液(0.1％NP-40、2μg/mL抑蛋白酶肽、5mg/mL DTT、1μg/mL亮抑酶肽、2mM PMSF)，超声处理并在-20℃保存。
加入5X样品缓冲液到30μL样品后，样品加热至100℃3分钟，然后在12％凝胶上以150V进行SDS-PAGE 1小时。蛋白电印迹到PVDF膜(Amersham)上，125mA 2小时。用PBS/0.5％吐温20中的5％脱脂奶粉封闭后，通过加入1∶1000稀释的抗HPV 16 E7(Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)探测膜。使用过氧化物酶-偶联的二抗(山羊抗小鼠IgG，1∶1000稀释)和化学发光检测系统呈现蛋白，胶片曝光，显影并扫描。然后剥下印迹且用抗β微管蛋白抗体(Sigma)再探测作为对照。光密度分析后，E7蛋白水平根据β微管蛋白水平标准化。
图6所示结果显示密码子修改的HPV 16E7构建物生的HPV 16E7约为未修改HPV 16E7构建物的2.5倍。
本文引用的各专利、专利申请和出版物的说明全部纳入本文供参考。
引用的任何参考文献不应认为是允许这种参考文献可以用来作为本申请的“先有技术”。
说明书的目的是描述发明的较佳实施方案，对发明不限于任何一个实施方案或特别收集的特征。因此，根据本说明，本领域技术人员理解可对示范的特定实施方案进行多种修改和变化而不背离本发明的范围。所有这些修改和变化包括在所附权利要求的范围内。
                            序列表
<110>昆士兰大学(The University of Queensland)(美国以外的所有国家)
     I.H.弗拉泽(Frazer，Ian Hector)(仅适用于美国)
<120>表达系统
<130>12177822
<140>未知
<141>2003-09-12
<150>USSN 60/410410
<151>2002-09-13
<160>28
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1470
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码Enbrel的DNA，Enbrel是一种由通过人IgG1分子的Fc片段相连接的两个
     可溶性TNF受体构成的重组融合蛋白
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1467)
<400>1
atg gcg ccc gtc gcc gtc tgg gcc gcg ctg gcc gtc gga ctg gag ctc     48
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1               5                   10                  15
tgg gct gcg gcg cac gcc ttg ccc gcc cag gtg gca ttt aca ccc tac     96
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
            20                  25                  30
gcc ccg gag ccc ggg agc aca tgc cgg ctc aga gaa tac tat gac cag    144
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
        35                  40                  45
aca gct cag atg tgc tgc agc aaa tgc tcg ccg ggc caa cat gca aaa    192
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
    50                  55                  60
gtc ttc tgt acc aag acc tcg gac acc gtg tgt gac tcc tgt gag gac    240
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65                  70                  75                  80
agc aca tac acc cag ctc tgg aac tgg gtt ccc gag tgc ttg agc tgt    288
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
                85                  90                  95
ggc tcc cgc tgt agc tct gac cag gtg gaa act caa gcc tgc act cgg    336
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
            100                 105                 110
gaa cag aac cgc atc tgc acc tgc agg ccc ggc tgg tac tgc gcg ctg    384
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
        115                 120                 125
agc aag cag gag ggg tgc cgg ctg tgc gcg ccg ctg cgc aag tgc cgc    432
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
    130                 135                 140
ccg ggc ttc ggc gtg gcc aga cca gga act gaa aca tca gac gtg gtg    480
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145                 150                 155                 160
tgc aag ccc tgt gcc ccg ggg acg ttc tcc aac acg act tca tcc acg    528
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
                165                 170                 175
gat att tgc agg ccc cac cag atc tgt aac gtg gtg gcc atc cct ggg    576
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
            180                 185                 190
aat gca agc atg gat gca gtc tgc acg tcc acg tcc ccc acc cgg agt    624
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
        195                 200                 205
atg gcc cca ggg gca gta cac tta ccc cag cca gtg tcc aca cga tcc    672
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
    210                 215                 220
caa cac acg cag cca act cca gaa ccc agc act gct cca agc acc tcc    720
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225                 230                 235                 240
ttc ctg ctc cca atg ggc ccc agc ccc cca gct gaa ggg agc act ggc    768
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
                245                 250                 255
gac gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca    816
Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
            260                 265                 270
gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa    864
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
        275                 280                 285
ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg    912
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
    290                 295                 300
gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac     960
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
305                 310                 315                 320
gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag    1008
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
                325                 330                 335
cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac    1056
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
            340                 345                 350
cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa    1104
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
        355                 360                 365
gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag    1152
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
    370                 375                 380
ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg    1200
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
385                 390                 395                 400
acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc    1248
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
                405                 410                 415
agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac    1296
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
            420                 425                 430
tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc    1344
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
        435                 440                 445
tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc    1392
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
    450                 455                 460
ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag    1440
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
465                 470                 475                 480
aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga                            1470
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                485
<210>2
<211>489
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>编码Enbrel的DNA，Enbrel是一种由通过人IgGl分子的Fc片段相连接的两个
     可溶性TNF受体构成的重组融合蛋白
<400>2
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1               5                   10                  15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
            20                  25                  30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
        35                  40                  45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
    50                  55                  60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65                  70                  75                  80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
                85                  90                  95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
            100                 105                 110
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
        115                 120                 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
    130                 135                 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145                 150                 155                 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
            180                 185                 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
        195                 200                 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
    210                 215                 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225                 230                 235                 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
                245                 250                 255
Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
            260                 265                 270
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
        275                 280                 285
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
    290                 295                 300
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
305                 310                 315                 320
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
                325                 330                 335
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
            340                 345                 350
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
        355                 360                 365
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
385                 390                 395                 400
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
                405                 410                 415
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
            420                 425                 430
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
        435                 440                 445
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
    450                 455                 460
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
465                 470                 475                 480
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                485
<210>3
<211>1470
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子修改的Enbrel DNA
<400>3
atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctc gccgtcggac tcgaactctg ggctgcggcg    60
cacgccttgc ccgcccaggt ggcatttaca ccctacgccc cggaacccgg aagcacatgc    120
cggctcagag aatactatga ccagacagct cagatgtgct gcagcaagtg ctcgccggga    180
caacacgcaa aggtcttttg tacaaagaca tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac    240
agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt    300
agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc    360
aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg    420
cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg    480
tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg    540
ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcatgga tgcagtctgc    600
acgtccacgt cccccacccg gagtatggcc ccaggggcag tacacttacc ccagccagtg    660
tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc    720
ttcctgctcc caatgggccc cagcccccca gctgaaggga gcactggcga cgagcccaaa    780
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg   840
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag   900
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac   960
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc   1020
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag   1080
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa   1140
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg   1200
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc   1260
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg   1320
gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag   1380
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag   1440
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga                                    1470
<210>4
<211>297
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒16
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(294)
<400>4
atg cat gga gat aca cct aca ttg cat gaa tat atg tta gat ttg caa     48
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1               5                   10                  15
cca gag aca act gat ctc tac tgt tat gag caa tta aat gac agc tca     96
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
            20                  25                  30
gag gag gag gat gaa ata gat ggt cca gct gga caa gca gaa ccg gac    144
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
        35                  40                  45
aga gcc cat tac aat att gta acc ttt tgt tgc aag tgt gac tct acg    192
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
    50                  55                  60
ctt cgg ttg tgc gta caa agc aca cac gta gac att cgt act ttg gaa    240
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65                  70                  75                  80
gac ctg tta atg ggc aca cta gga att gtg tgc ccc atc tgt tct cag    288
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
                85                  90                  95
aaa cca taa                                                        297
Lys Pro
<210>5
<211>98
<212>PRT
<213>人乳头瘤病毒16
<400>5
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1               5                   10                  15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
            20                  25                  30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
        35                  40                  45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
    50                  55                  60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65                  70                  75                  80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
                85                  90                  95
Lys Pro
<210>6
<211>297
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子修改的HPV16E7 DNA
<400>6
atgcacggag atacacccac actccacgaa tatatgctcg atctccaacc cgaaacaaca    60
gatctctact gctatgaaca actcaacgat agctctgaag aagaagatga aatagatgga    120
ccagcaggac aagcagaacc cgatagagca cactacaaca ttgtaacatt ttgctgcaag    180
tgcgattcta cgctccggct ctgcgtacaa agcacacacg tagatattcg tacactcgaa    240
gatctcctca tgggaacact cggaattgtg tgccccatct gctctcagaa gccctaa       297
<210>7
<211>654
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(651)
<400>7
atg gct aca ggc tcc cgg acg tcc ctg ctc ctg gct ttt ggc ctg ctc     48
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
tgc ctg ccc tgg ctt caa gag ggc agt gcc ttc cca acc att ccc tta     96
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
            20                  25                  30
tcc agg cct ttt gac aac gct atg ctc cgc gcc cat cgt ctg cac cag    144
Ser Arg Pro Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
        35                  40                  45
ctg gcc ttt gac acc tac cag gag ttt gaa gaa gcc tat atc cca aag    192
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
    50                  55                  60
gaa cag aag tat tca ttc ctg cag aac ccc cag acc tcc ctc tgt ttc    240
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65                  70                  75                  80
tca gag tct att ccg aca ccc tcc aac agg gag gaa aca caa cag aaa    288
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
                85                  90                  95
tcc aac cta gag ctg ctc cgc atc tcc ctg ctg ctc atc cag tcg tgg    336
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
            100                 105                 110
ctg gag ccc gtg cag ttc ctc agg agt gtc ttc gcc aac agc ctg gtg    384
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
        115                 120                 125
tac ggc gcc tct gac agc aac gtc tat gac ctc cta aag gac cta gag    432
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
    130                 135                 140
gaa ggc atc caa acg ctg atg ggg agg ctg gaa gat ggc agc ccc cgg    480
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145                 150                 155                 160
act ggg cag atc ttc aag cag acc tac agc aag ttc gac aca aac tca    528
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
                165                 170                 175
cac aac gat gac gca cta ctc aag aac tac ggg ctg ctc tac tgc ttc    576
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
            180                 185                 190
agg aag gac atg gac aag gtc gag aca ttc ctg cgc atc gtg cag tgc    624
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
        195                 200                 205
cgc tct gtg gag ggc agc tgt ggc ttc tag                            654
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
    210                 215
<210>8
<211>217
<212>PRT
<213>人
<400>8
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
            20                  25                  30
Ser Arg Pro Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
        35                  40                  45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
    50                  55                  60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65                  70                  75                  80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
                85                  90                  95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
            100                 105                 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
        115                 120                 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
    130                 135                 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
                165                 170                 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
            180                 185                 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
        195                 200                 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
    210                 215
<210>9
<211>654
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子修改的人生长激素DNA
<400>9
atggcaacag gatctcggac gtctctcctc ctcgcatttg gactcctctg cctcccctgg    60
ctccaagaag gaagcgcatt tcccacaatt cccctctcta gaccctttga taacgcaatg    120
ctccgggcac accgtctcca ccagctcgca tttgacacat accaggaatt tgaagaagca    180
tatatcccca aggaacagaa gtattctttt ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc    240
tcagagtcta ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag    300
ctgctccgca tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg    360
agtgtcttcg ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta    420
aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg    480
actgggcaga tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac    540
gcactactca agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag    600
acattcctgc gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt ctag          654
<210>10
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Enbrel F1寡核苷酸
<400>10
catggcggcc cgtcgccgtc tgggccgcgc tcgccgtcgg actcgaactc tgggctgcgg     60
cacgccttgc ccgcccaggt                                                 80
<210>11
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Enbrel R1寡核苷酸
<400>11
gggcgggcaa ggcgtgcgcc gcagcccaga gatcgagtcc gacggcgaag cgcggcccca     60
gacggcgcga cgggcgc                                                    77
<210>12
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Enbrel F2寡核苷酸
<400>12
ggcatttaca ccctacgccc cggaacccgg aagcacatgc cggctcagag aatactatga     60
cagctcagat gtgctgca                                                   78
<210>13
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Enbrel R2寡核苷酸
<400>13
gcacatctga gctgtctggt catagtattc tctgagccgg catgtgcttc cgggttccgg    60
gtccggggcg tagggtgtaa atgccacct                                      89
<210>14
<21l>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Enbrel F3寡核苷酸
<400>14
gcaagtgctc gccgggacaa cacgcaaagg tcttttgtac aaagacatcg gacaccgt      58
<210>15
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Enbrel R3寡核苷酸
<400>15
gtgtccgatg tctttgtaca aaagaccttt gcgtgttgtc ccggcgagca cttgctgca     59
<210>16
<211>86
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hGH F1寡核苷酸
<400>16
gatccaccat ggcaacagga tctcggacgt ctctcctcct cgcatttgga ctcctctgcc    60
tcccctggct ccaagaagaa ggaagc                                         86
<210>17
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hGH R1寡核苷酸
<400>17
ttcttggagc caggggaggc agaggagtcc aaatgcgagg aggagagacg tccgagatcc    60
tgttgccatg                                                           70
<210>18
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hGH F2寡核苷酸
<400>18
gcatttccca caattcccct cccctctcta gaccctttga taacgcaatg ctccgggcac    60
accgtctcca ccagctcgca                                                80
<210>19
<211>74
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hGH R2寡核苷酸
<400>19
tggtggagac ggtgtgcccg gagcattgcg ttatcaaagg gtctagagag gggaattgtg    60
ggaaatgcgc ttcc                                                      74
<210>20
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hGH F3寡核苷酸
<400>20
tttgacacat accaggaatt tgaagaagca tatatcccca aggaacagaa gtattctttt    60
ctgca                                                                65
<210>21
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hGH R3寡核苷酸
<400>21
gaaaagaata cttctgttcc ttggggatat atgcttcttc aaattcctgg tatgtgtcaa    60
atgcgagc                                                             68
<210>22
<211>97
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基因组hGH F1寡核苷酸
<400>22
ccgggccaac atggctacag gatctcggac gtctctcctc ctcgcatttg gactcctctg    60
cctcccctgg ctccaagaag gaagcgcatt tcccaca                             97
<210>23
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基因组hGH R1寡核苷酸
<400>23
gcgcggccag ctggtggaga cggtgtgccc ggagcattgc gttgtcaaag ggtctagaga    60
gggg                                                                 64
<210>24
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基因组hGH F2寡核苷酸
<400>24
cagctggcct ttgacacata ccaggaattt g                                   31
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基因组hGH R2寡核苷酸
<400>25
cttcgggaaa aaccctgagc tccttag                                        27
<210>26
<211>1679
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(65)..(74)
<220>
<221>CDS
<222>(334)..(494)
<220>
<221>CDS
<222>(704)..(823)
<220>
<221>CDS
<222>(916)..(1080)
<220>
<221>CDS
<222>(1334)..(1528)
<400>26
caaggatccc aaggcccaac tccccgaacc actcagggtc ctgtggacag ctcacctagc    60
tgca atg gct aca g gtaagcgccc ctaaaatccc tttggcacaa tgtgtcctga      114
     Met Ala Thr
     1
ggggagaggc agcgacctgt agatgggacg ggggcactaa ccctcaggtt tggggcttct   174
gaatgtgagt atcgccatgt aagcccagta tttggccaat ctcagaaagc tcctggtccc   234
tggagggatg gagagagaaa aacaaacagc tcctggagca gggagagtgc tggcctcttg   294
ctctccggct ccctctgttg ccctctggtt tctccccag gc  tcc cgg acg tcc      347
                                           Gly Ser Arg Thr Ser
                                               5
ctg ctc ctg gct ttt ggc ctg ctc tgc ctg ccc tgg ctt caa gag ggc     395
Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly
    10                  15                  20
agt gcc ttc cca acc att ccc tta tcc agg cct ttt gac aac gct atg     443
Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Pro Phe Asp Asn Ala Met
25                  30                  35                  40
ctc cgc gcc cat cgt ctg cac cag ctg gcc ttt gac acc tac cag gag     491
Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu
                45                  50                  55
ttt gtaagctctt ggggaatggg tgcgcatcag gggtggcagg aaggggtgac          544
Phe
tttcccccgc tgggaaataa gaggaggaga ctaaggagct cagggttttt cccgaagcga   604
aaatgcaggc agatgagcac acgctgagtg aggttcccag aaaagtaaca atgggagctg   664
gtctccagcg tagaccttgg tgggcggtcc ttctcctag gaa gaa gcc tat atc      718
                                           Glu Glu Ala Tyr Ile
                                                   60
cca aag gaa cag aag tat tca ttc ctg cag aac ccc cag acc tcc ctc     766
Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu
        65                  70                  75
tgt ttc tca gag tct att ccg aca ccc tcc aac agg gag gaa aca caa     814
Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln
    80                  85                  90
cag aaa tcc gtgagtggat gccttctccc caggcgggga tgggggagac             863
Gln Lys Ser
95
ctgtagtcag agcccccggg cagcacagcc aatgcccgtc cttcccctgc ag aac cta   921
                                                          Asn Leu
gag ctg ctc cgc atc tcc ctg ctg ctc atc cag tcg tgg ctg gag ccc     969
Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro
100                 105                 110                 115
gtg cag ttc ctc agg agt gtc ttc gcc aac agc ctg gtg tac ggc gcc    1017
Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala
                120                 125                 130
tct gac agc aac gtc tat gac ctc cta aag gac cta gag gaa ggc atc    1065
Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile
            135                 140                 145
caa acg ctg atg ggg gtgagggtgg cgccaggggt ccccaatcct ggagccccac    1120
Gln Thr Leu Met Gly
        150
tgactttgag agctgtgtta gagaaacact gctgccctct ttttagcagt caggccctga  1180
cccaagagaa ctcaccttat tcttcatttc ccctcgtgaa tcctccaggc ctttctctac  1240
accctgaagg ggagggagga aaatgaatga atgagaaagg gagggaacag tacccaagcg  1300
cttggcctct ccttctcttc cttcactttg cag agg ctg gaa gat ggc agc ccc   1354
                                    Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro
                                            155
cgg act ggg cag atc ttc aag cag acc tac agc aag ttc gac aca aac    1402
Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn
160                 165                 170                 175
tca cac aac gat gac gca cta ctc aag aac tac ggg ctg ctc tac tgc    1450
Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys
                180                 185                 190
ttc agg aag gac atg gac aag gtc gag aca ttc ctg cgc atc gtg cag    1498
Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln
            195                 200                 205
tgc cgc tct gtg gag ggc agc tgt ggc ttc tagctgcccg ggtggcatcc      1548
Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
        210                 215
ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag tgcccaccag  1608
ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct tctataatat  1668
tatggggtgg a                                                       1679
<210>27
<211>217
<212>PRT
<213>人
<400>27
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
            20                  25                  30
Ser Arg Pro Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
        35                  40                  45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
    50                  55                  60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65                  70                  75                  80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
                85                  90                  95
Ser Ash Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
            100                 105                 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
        115                 120                 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
    130                 135                 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
                165                 170                 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
            180                 185                 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
        195                 200                 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
    210                 215
<210>28
<211>1679
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子修改的基因组hGH序列
<400>28
caaggatccc aaggcccaac tccccgaacc actcagggtc ctgtggacag ctcacctagc     60
tgcaatggct acaggtaagc gcccctaaaa tccctttggc acaatgtgtc ctgaggggag    120
aggcagcgac ctgtagatgg gacgggggca ctaaccctca ggtttggggc ttctgaatgt    180
gagtatcgcc atgtaagccc agtatttggc caatctcaga aagctcctgg tccctggagg    240
gatggagaga gaaaaacaaa cagctcctgg agcagggaga gtgctggcct cttgctctcc    300
ggctccctct gttgccctct ggtttctccc caggatctcg gacgtctctc ctcctcgcat    360
ttggactcct ctgcctcccc tggctccaag aaggaagcgc atttcccaca attcccctct   420
ctagaccctt tgataacgca atgctccggg cacaccgtct ccaccagctg gcctttgaca   480
cataccagga atttgtaagc tcttggggaa tgggtgcgca tcaggggtgg caggaagggg   540
tgactttccc ccgctgggaa ataagaggag gagactaagg agctcagggt ttttcccgaa   600
gcgaaaatgc aggcagatga gcacacgctg agtgaggttc ccagaaaagt aacaatggga   660
gctggtctcc agcgtagacc ttggtgggcg gtccttctcc taggaagaag cctatatccc   720
aaaggaacag aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc   780
tattccgaca ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccgtgagtg gatgccttct   840
ccccaggcgg ggatggggga gacctgtagt cagagccccc gggcagcaca gccaatgccc   900
gtccttcccc tgcagaacct agagctgctc cgcatctccc tgctgctcat ccagtcgtgg   960
ctggagcccg tgcagttcct caggagtgtc ttcgccaaca gcctggtgta cggcgcctct   1020
gacagcaacg tctatgacct cctaaaggac ctagaggaag gcatccaaac gctgatgggg   1080
gtgagggtgg cgccaggggt ccccaatcct ggagccccac tgactttgag agctgtgtta   1140
gagaaacact gctgccctct ttttagcagt caggccctga cccaagagaa ctcaccttat   1200
tcttcatttc ccctcgtgaa tcctccaggc ctttctctac accctgaagg ggagggagga   1260
aaatgaatga atgagaaagg gagggaacag tacccaagcg cttggcctct ccttctcttc   1320
cttcactttg cagaggctgg aagatggcag cccccggact gggcagatct tcaagcagac   1380
ctacagcaag ttcgacacaa actcacacaa cgatgacgca ctactcaaga actacgggct   1440
gctctactgc ttcaggaagg acatggacaa ggtcgagaca ttcctgcgca tcgtgcagtg   1500
ccgctctgtg gagggcagct gtggcttcta gctgcccggg tggcatccct gtgacccctc   1560
cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat   1620
aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta tggggtgga    1679

Claims (34)

1.一种构建合成多核苷酸的方法，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的水平不同于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，其特征在于，所述方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率不同于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率；和
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸，
其中，密码子翻译效率的比较示于表1：
                               表1   密码子  翻译效率   密码子  翻译效率   密码子  翻译效率   AlaGCA     38   GlyGGA     60   ProCCC     70   AlaGCG     28   GlyGGG     18   ProCCT     63   AlaGCT     18   GlyGGC     12   ProCCG     60   AlaGCC     14   GlyGGT     6   ProCCA     56   ArgAGA     36   HisCAC     32   SerAGC     72   ArgCGA     34   HisCAT     27   SerTCT     69   ArgCGG     35   SerAGT     65   ArgCGT     33   IleATC     8   SerTCG     58   ArgAGG     29   IleATT     6   SerTCA     58   ArgCGC     19   IleATA     6   SerTCC     55   AsnAAC     40   LeuCTC     45   ThrACA     47   AsnAAT     33   LeuTTG     34   ThrACG     47   LeuCTA     25   ThrACT     45   AspGAT     27   LeuCTG     20   ThrACC     28   AspGAC     18   LeuTTA     18
  LeuCTT     17   TyrTAC     27   CysTGC     32   TyrTAT     27   CysTGT     19   LysAAG     28   LysAAA     15   ValGTG     17   GlnCAA     18   ValGTT     16   GlnCAG     18   PheTTT     30   ValGTC     15   PheTTC     20   ValGTA     14   GluGAA     16   GluGAG     9
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过选择同义密码子能以较高水平生成多肽，同义密码子的翻译效率高于其取代的第1个密码子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，选择同义密码子，使它在CHO细胞中的翻译效率至少约为它取代的密码子翻译效率的110％。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，选择第1个密码子和同义密码子，使CHO细胞中从合成多核苷酸生成多肽的水平至少是CHO细胞中从亲代多核苷酸生成多肽水平的110％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，亲代多核苷酸中至少约5％的第1个密码子用同义密码子取代。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，第1个密码子和同义密码子选自表2：
                               表2   第1个密码子 同义密码子   第1个密码子 同义密码子   第1个密码子 同义密码子   AlaGCG   AlaGCA   GlyGGG   GlyGGA   ProCCT   ProCCC   AlaGCT   AlaGCA   GlyGGC   GlyGGA   ProCCG   ProCCC   AlaGCC   AlaGCA   GlyGGT   GlyGGA   ProCCA   ProCCC   AlaGCT   AlaGCG   GlyGGC   GlyGGG   ProCCG   ProCCT   AlaGCC   AlaGCG   GlyGGT   GlyGGG   ProCCA   ProCCT
    AlaGCC     AlaGCT     GlyGGT     GlyGGC   ProCCA   ProCCG     ArgCGT     ArgAGA     HisCAT     HisCAC   SerAGT   SerAGC     ArgAGG     ArgAGA   SerTCG   SerAGC     IleATT     IleATC   SerTCA   SerAGC     ArgCGC     ArgAGA     IleATA     IleATC   SerTCC   SerAGC     ArgCGT     ArgCGA   SerTCG   SerTCT     ArgAGG     ArgCGA     LeuTTG     LeuCTC   SerTCA   SerTCT     ArgCGC     ArgCGA     LeuCTA     LeuCTC   SerTCC   SerTCT     ArgAGG     ArgCGG     LeuCTG     LeuCTC   SerTCG   SerAGT     ArgCGC     ArgCGG     LeuTTA     LeuCTC   SerTCA   SerAGT     ArgAGG     ArgCGT     LeuCTT     LeuCTC   SerTCC   SerAGT     ArgCGC     ArgCGT     LeuCTA     LeuTTG   SerTCC   SerTCG     ArgCGC     ArgAGG     LeuCTG     LeuTTG   SerTCC   SerTCA     LeuTTA     LeuTTG     AsnAAT     AsnAAC     LeuCTT     LeuTTG   ThrACC   ThrACA     LeuCTG     LeuCTA   ThrACC   ThrACG     AspGAC     AspGAT     LeuTTA     LeuCTA   ThrACC   ThrACT     LeuCTT     LeuCTA     CysTGT     CysTGC     LeuTTA     LeuCTG   ValGTC   ValGTG     LeuCTT     LeuCTG   ValGTA   ValGTG     GluGAG     GluGAA     LeuCTT     LeuTTA   ValGTA   ValGTT     LysAAA     LysAAG     PheTTC     PheTTT
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过选择同义密码子能以较低水平生成多肽，同义密码子的翻译效率低于其取代的第1个密码子。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，选择同义密码子，使它在CHO细胞中的翻译效率小于它取代的密码子翻译效率的约90％。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，第1个密码子和同义密码子选自表3：
                                 表3   第1个密码子   同义密码子   第1个密码子 同义密码子   第1个密码子   同义密码子   AlaGCA     AlaGCG   GlyGGA   GlyGGG   ProCCC     ProCCT   AlaGCA     AlaGCT   GlyGGA   GlyGGC   ProCCC     ProCCG   AlaGCA     AlaGCC   GlyGGA   GlyGGT   ProCCC     ProCCA   AlaGCG     AlaGCT   GlyGGG   GlyGGC   ProCCT     ProCCG   AlaGCG     AlaGCC   GlyGGG   GlyGGT   ProCCT     ProCCA   AlaGCT     AlaGCC   GlyGGC   GlyGGT   ProCCG     ProCCA   ArgAGA     ArgCGT   HisCAC   HisCAT   SerAGC     SerAGT   ArgAGA     ArgAGG   SerAGC     SerTCG   IleATC   IleATT   SerAGC     SerTCA   ArgAGA     ArgCGC   IleATC   IleATA   SerAGC     SerTCC   ArgCGA     ArgCGT   SerTCT     SerTCG   ArgCGA     ArgAGG   LeuCTC   LeuTTG   SerTCT     SerTCA   ArgCGA     ArgCGC   LeuCTC   LeuCTA   SerTCT     SerTCC   ArgCGG     ArgAGG   LeuCTC   LeuCTG   SerAGT     SerTCG   ArgCGG     ArgCGC   LeuCTC   LeuTTA   SerAGT     SerTCA   ArgCGT     ArgAGG   LeuCTC   LeuCTT   SerAGT     SerTCC   ArgCGT     ArgCGC   LeuTTG   LeuCTA   SerTCG     SerTCC   ArgAGG     ArgCGC   LeuTTG   LeuCTG   SerTCA     SerTCC   LeuTTG   LeuTTA   AsnAAC     AsnAAT   LeuTTG   LeuCTT   ThrACA     ThrACC   LeuCTA   LeuCTG   ThrACG     ThrACC
  AspGAT   AspGAC   LeuCTA   LeuTTA    ThrACT     ThrACC   LeuCTA   LeuCTT   CysTGC   CysTGT   LeuCTG   LeuTTA    ValGTG     ValGTC   LeuCTG   LeuCTT    ValGTG     ValGTA   GluGAA   GluGAG   LeuTTA   LeuCTT    ValGTT     ValGTA   LysAAG   LysAAA   PheTTT   PheTTC
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，亲代多核苷酸中至少约5％的第1个密码子用同义密码子取代。
11.一种构建合成多核苷酸的方法，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的水平不同于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，其特征在于，所述方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率不同于第1个密码子，这是通过比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率；和
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸，
其中密码子翻译效率的比较示于表4：
                   表4                    翻译效率    高           中等    低  AlaGCA  AlaGCG，AlaGCT  AlaGCC  ArgAGA，ArgCGA，ArgCGC，ArgCGT，ArgAGG  ArgCGC  AsnAAC  AsnAAT  AspGAT  AspGAC  CysTGC  CysTGT
 GluGAA  GluGAG  GlnCAA，GlnCAG  GlyGGA  GlyGGG  GlyGGC，GlyGGT  HisCAC  HisCAT  IleATT，IleATC，IleATA  LeuCTC，LeuTTG  LeuCTA，LeuCTG  LeuTTA，LeuCTT  LysAAG  LysAAA  PheTTT  PheTTC  ProCCC，ProCCT，ProCCG，ProCCA  SerAGC，SerTCT，SerAGT，SerTCG，SerTCA，SerTCC  ThrACA，ThrACG，ThrACT  ThrACC  TyrTAC，TyrTAT  ValGTA，ValGTT，ValGTC，ValGTG
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，通过选择同义密码子能以较高水平生成多肽，同义密码子的翻译效率高于其取代的第1个密码子，其中：(a)如果第1个密码子分类为‘低’翻译有效密码子，则同义密码子选自‘高’或‘中等’翻译有效密码子；其中(b)如果第1个密码子分类为‘中等’翻译有效密码子，则同义密码子选自‘高’翻译有效密码子。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，通过选择同义密码子能以较低水平生成多肽，同义密码子的翻译效率低于其取代的第1个密码子，其中：(a)如果第1个密码子分类为‘高’翻译有效密码子，则同义密码子选自‘中等’或‘低’翻译有效密码子；其中(b)如果第1个密码子分类为‘中等’翻译有效密码子，则同义密码子选自‘低’翻译有效密码子。
14.一种构建合成多核苷酸的方法，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的水平高于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，其特征在于，所述方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率高于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率；和
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸，
其中，第1个密码子和同义密码子选自表5：
                     表5  第1个密码子  同义密码子  第1个密码子  同义密码子  AlaGCC  AlaGCA  GlyGGT  GlyGGA  AlaGCC  AlaGCG  GlyGGT  GlyGGG  AlaGCC  AlaGCT  GlyGGC  GlyGGA  AlaGCT  AlaGCA  GlyGGC  GlyGGG  AlaGCG  AlaGCA  GlyGGG  GlyGGA  ArgCGC  ArgAGA  HisCAT  HisCAC  ArgCGC  ArgCGA  ArgCGC  ArgCGG  LeuCTT  LeuCTC  ArgCGC  ArgCGT  LeuCTT  LeuTTG  ArgCGC  ArgAGG  LeuTTA  LeuCTC  LeuTTA  LeuTTG  AsnAAT  AsnAAC  LeuCTG  LeuCTC  LeuCTG  LeuTTG  AspGAC  AspGAT  LeuCTA  LeuCTC  LeuCTA  LeuTTG  CysTGT  CysTGC  LysAAA  LysAAG  GluGAG  GluGAA  PheTTC  PheTTT
15.一种构建合成多核苷酸的方法，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的水平低于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，其特征在于，所述方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率低于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率；和
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸，
其中，第1个密码子和同义密码子选自表6：
                     表6  第1个密码子  同义密码子  第1个密码子 同义密码子  AlaGCA  AlaGCC  GlyGGA  GlyGGT  AlaGCG  AlaGCC  GlyGGG  GlyGGT  AlaGCT  AlaGCC  GlyGGA  GlyGGC  AlaGCA  AlaGCT  GlyGGG  GlyGGC  AlaGCA  AlaGCG  GlyGGA  GlyGGG  ArgAGA  ArgCGC  HisCAC  HisCAT  ArgCGA  ArgCGC  ArgCGG  ArgCGC  LeuCTC  LeuCTT  ArgCGT  ArgCGC  LeuTTG  LeuCTT  ArgAGG  ArgCGC  LeuCTC  LeuTTA  LeuTTG  LeuTTA  AsnAAC  AsnAAT  LeuCTC  LeuCTG  LeuTTG  LeuCTG  AspGAT  AspGAC  LeuCTC  LeuCTA  LeuTTG  LeuCTA  CysTGC  CysTGT
 LysAAG  LysAAA  GluGAA  GluGAG  PheTTT  PheTTC
16.一种合成多核苷酸，其特征在于，多核苷酸如权利要求1、14和15中任一项所述构建。
17.一种修饰中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的方法，从而能以较高的水平从第1个多核苷酸生成多肽，其特征在于，所述方法包括：
-将编码同工tRNA的第2个多核苷酸导入CHO细胞，同工tRNA限制多肽生成速度且对应于第1个多核苷酸的密码子，其中密码子选自AlaGCC、AlaGCT、AlaGCG、ArgAGA、ArgCGG、ArgCGA、ArgCGT、ArgAGG、ArgCGC、AsnAAC、AsnAAT、AspGAC、CysTGT、GluGAG、GluCAA、GluCAG、GlyGGC、GlyGGG、GlyGGT、HisCAC、HisCAT、IleATT、IleATC、IleATA、LeuCTA、LeuCTG、LeuTTA、LeuCTT、LysAAA、PheTTT、PheTTC、ProCCC、ProCCA、ProCCG、ProCCT、SerAGC、SerTCT、SerAGT、SerTCG、SerTCA、SerTCC、ThrACA、ThrACG、ThrACT、ThrACC、TyrTAC、TyrTAT、ValGTA、ValGTT、ValGTC和ValGTG，其中第2个多核苷酸可操作连接于调节多核苷酸。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，同工tRNA对应的密码子选自AlaGCC、ArgCGC、AspGAC、CysTGT、GluGAG、GlyGGC、GlyGGG、GlyGGT、LeuTTA、LeuCTT、LysAAA和ThrACC。
19.一种修饰的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其特征在于，所述细胞由权利要求17所述的方法产生。
20.一种在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的方法，生成水平不同于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，其特征在于，所述方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率不同于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率，比较示于表1或表4，分别如权利要求1和11所定义；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸；
-将合成多核苷酸导入CHO细胞；和
-在CHO细胞中表达合成多核苷酸，从而在CHO细胞中从合成多核苷酸生成多肽，生成水平不同于从亲代多核苷酸生成的水平。
21.一种在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的方法，生成水平高于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，其特征在于，所述方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率高于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率，其中第1个密码子和同义密码子都选自表2或表5，分别如权利要求6和14所定义；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸；
-将合成多核苷酸导入CHO细胞；和
-在CHO细胞中表达合成多核苷酸，从而在CHO细胞中从合成多核苷酸生成多肽，生成水平高于从亲代多核苷酸生成的水平。
22.一种在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从合成多核苷酸生成多肽的方法，生成水平低于从编码相同多肽的亲代多核苷酸生成的水平，其特征在于，所述方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率低于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率，其中第1个密码子和同义密码子都选自表3或表6，分别如权利要求9和15所定义；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸；
-将合成多核苷酸导入CHO细胞；和
-在CHO细胞中表达合成多核苷酸，从而在CHO细胞中从合成多核苷酸生成多肽，生成水平低于从亲代多核苷酸生成的水平。
23.如权利要求20到22中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括从CHO细胞中分离或纯化多肽。
24.一种多肽，其特征在于，多肽根据权利要求20到22中任一项所述的方法生成。
25.一种在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生成病毒颗粒的方法，其特征在于，病毒颗粒包含装配病毒颗粒所需的多肽，其中多肽在CHO细胞中从亲代多核苷酸生成，但水平不足以允许在其中进行生产性病毒装配，方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率高于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率，比较示于表1或表4，分别如权利要求1和11所定义；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸；和
-将合成多核苷酸导入CHO细胞，合成多核苷酸可操作连接于调节多核苷酸，
从而表达合成多核苷酸以生成多肽，水平足以允许在CHO细胞中生成病毒颗粒。
26.一种在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生成病毒颗粒的方法，其特征在于，病毒颗粒包含装配病毒颗粒所需的多肽，其中多肽在CHO细胞中从亲代多核苷酸生成，但水平不足以允许在其中进行生产性病毒装配，方法包括：
-选择亲代多核苷酸的第1个密码子用于同义密码子取代，其中选择同义密码子的基础是它在CHO细胞中的翻译效率高于第1个密码子，这是比较密码子在测试CHO细胞中的翻译效率，其中第1个密码子和同义密码子都选自表2或表5，分别如权利要求6和14所定义；
-用同义密码子取代第1个密码子以构建合成多核苷酸；和
-将合成多核苷酸导入CHO细胞，合成多核苷酸可操作连接于调节多核苷酸，
从而表达合成多核苷酸以生成多肽，水平足以允许在CHO细胞中生成病毒颗粒。
27.一种在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生成病毒颗粒的方法，其特征在于，病毒颗粒包含装配病毒颗粒所需的至少1种多肽，其中多肽在CHO细胞中从第1个多核苷酸生成，但水平不足以允许在其中进行生产性病毒装配，且其中特异于第1个多核苷酸密码子的同工tRNA丰度限制多肽生成速度且对应的密码子选自AlaGCC、AlaGCT、AlaGCG、ArgCGC、AsnAAT、AspGAC、CysTGT、GluGAG、GlnCAA、GlyGGT、GlyGGC、GlyGGG、HisCAT、LeuCTT、LeuTTA、LeuCTG、LeuCTA、LysAAA、PheTTC，方法包括：
-将第2个多核苷酸导入CHO细胞，第2个多核苷酸编码同工tRNA且可操作连接于调节多核苷酸，
从而表达第2个多核苷酸以生成同工tRNA，水平足以增加多肽生成速度，因而允许在CHO细胞中生成病毒颗粒。
28.如权利要求25到27中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括从CHO细胞中分离或纯化病毒颗粒。
29.一种病毒颗粒，其特征在于，所述病毒颗粒根据权利要求25到27中任一项所述的方法生成。
30.一种CHO细胞，其特征在于，所述细胞由权利要求25到27中任一项所述的方法产生。
31.如权利要求2、11和14中任一项所述的方法，其特征在于，多肽选自Enbrel_、HPV 16 E7和人生长激素(hGH)。
32.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：3所列核苷酸序列。
33.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：6所列核苷酸序列。
34.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：9所列核苷酸序列。
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