CN1896104A

CN1896104A - 细胞抑制因子与白蛋白的融合蛋白

Info

Publication number: CN1896104A
Application number: CN 200510027696
Authority: CN
Inventors: 杨健良
Original assignee: ANPING BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd DEQING COUNTY ZHEJIANG
Current assignee: ANPING BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd DEQING COUNTY ZHEJIANG
Priority date: 2005-07-13
Filing date: 2005-07-13
Publication date: 2007-01-17

Abstract

本发明提供了包含细胞抑制因子多肽(尤其是干扰素多肽)和人白蛋白多肽的融合蛋白。本发明还提供编码所述融合蛋白的核酸序列，含有该核酸序列的载体，经该载体转化的宿主细胞。本发明还提供了该融合蛋白的制备方法及其应用。

Description

细胞抑制因子与白蛋白的融合蛋白

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及细胞抑制因子与人血清白蛋白直接连接所形成的融合蛋白，特别是人细胞抑制因子IFNα2b与人血清白蛋白组成的活性融合蛋白，以及这些蛋白的制备和应用。同时，本发明还涉及人血清白蛋白与IFNα2a，IFNα1b，IFNα2b，IFNβ，IFNγ所形成的重组融合蛋白的制备和应用。

背景技术

白蛋白是人血清中的主要蛋白组分，占血清总蛋白量的一半。人血清白蛋白由585个氨基酸组成，分子量为66KD。人血清白蛋白表现出多样性，有30种变异分子。人血清白蛋白基因已经被克隆(A.Drgaiczyk et al。，PNAS，79.71-75，1982)，并被成功地在多种体外表达系统中进行表达。人血清白蛋白功能可能是多方面的，但是其详细的生物学功能不完全明了。白蛋白在正常生理状况下不易透过肾小球，在血清中的半衰期达14-21天，作为血清中的主要成分，其存在可能对维持血液的稳定性有关键的作用。例如，大量白蛋白的存在可以保持血液的渗透压，离子强度等的稳定。同时，白蛋白由于具有较长的半衰期，也可以作为一种载体通过与血液中的其它因子，包括生物活性蛋白的结合，从而保持或延长其它因子在体内的生物活性。

事实上，白蛋白作为一种药物载体，在临床上已经获得了应用。使用白蛋白作为载体，既可以延长药物的半衰期，也可以提高药物的使用剂量。近年来，利用基因工程技术，将白蛋白与具有生物活性的蛋白分子进行重组表达的融合蛋白，已经成为开发长效蛋白药物的一个重要手段。

近年来，细胞因子的发现达到了至少100种以上。除了各种刺激细胞增殖的因子以外，其中，也有一部分细胞因子通过抑制作用来起发挥生物学功能。例如，肿瘤坏死因子可以抑制肿瘤细胞的生长甚至杀死肿瘤细胞，而血管抑素，内皮抑素，血小板因子4，转化生长因子β，白介素-2等则可以抑制血管的生成。干扰素可抑制骨髓细胞，抑制病毒增殖和肿瘤细胞，都可以归为胞抑制因子。

Issaces和Lindenman 1957年在一次研究中发现病毒感染的细胞能产生一种因子，它可以作用于其它细胞，干扰感染病毒的复制，因而将这种因子命名为干扰素(Interferon，或者简称INF)。后来研究发现，INF实际上是一类关系密切的蛋白质。这类蛋白质除了具有抗病毒作用外，还具有抗肿瘤和免疫调节等作用。

目前发现的IFN主要分I型和II型，I型包括IFNα和IFNβ，IFNα由于具有20多个亚型，而且它们之间具有一些共同的特点，IFNα和IFNβ共用同一个受体。II型干扰素主要为IFNγ。

目前通过基因重组生产的干扰素包括IFNα-2a，IFNα-2b以及IFNα-1b，IFNβ和IFNγ。主要由大肠杆菌发酵表达，在临床上都已被广泛的运用于抗病毒及抗肿瘤。多年来，IFN-直被用于治疗丙型，乙型肝炎的首选用药。但是IFN的疗效不太理想，只有较小比例的患者在停止用药之后仍能维持对病毒的抑制作用。主要的问题在于IFN的血液半衰期只有仅仅3-6个小时，一般肝炎病人需要每周接受至少三次注射来到达治疗效果，给病人带来巨大的痛苦。

因此，生产出稳定并且具有较长血液半衰期的长效干扰素在临床上具有重要的意义。例如，美国的罗氏制药(Roche)和先灵葆雅(Schering-Plough)将IFN聚乙二醇化，以保障一个稳定的血浆浓度，聚乙二醇化(长效)IFN展示出较好的临床治疗效果。目前，聚乙二醇化(长效)IFN在临床上已经在很大程度上替代了干扰素单体。干扰素与白蛋白融合蛋白的开发，也是生产长效干扰素的一种选择。

发明内容

为实现上述目的，本发明一方面涉及一种分离的融合蛋白，所述融合蛋白包含细胞抑制因子多肽和人白蛋白多肽。在较佳的实施方案中，所述细胞抑制因子多肽的C-末端与人白蛋白区N-末端直接相连。在另一较佳的实施方案中，所述融合蛋白具有选自下列的氨基酸序列：(a)序列表SEQ ID NO：7-11任一所示的氨基酸序列；(b)相对于SEQ ID NO：7-11任一所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQ ID NO：7-11任一所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；(c)相对于SEQ ID NO：7-11任一所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQ ID NO：7-11任一所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。

本发明还涉及一种分离的核酸序列，它具有上述融合蛋白的核酸序列或其互补序列。在较佳的方案中，所述核酸序列具有SEQ ID NO：12-16任一所示的核酸序列。

本发明还涉及含有上述核酸序列的载体和被所述载体转化的宿主细胞。

本发明另一方面还涉及一种产生上述融合蛋白的方法，该方法包括：(a)提供一宿主细胞，该宿主细胞包含一表达载体，该表达载体包含上述核酸序列以及与其操作性相连的表达调控序列；(b)在适合蛋白表达的条件下，培养步骤(a)所述的宿主细胞；(c)分离出所述的融合蛋白。

本发明另一方面还涉及一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有上述融合蛋白以及药学上可接受的载体。

本发明另一方面还涉及该融合蛋白在制备药物中的用途。

本发明使用遗传工程技术，制备人血清白蛋白与细胞抑制因子的融合蛋白。通过生化以及细胞和动物实验验证，融合蛋白具有良好的稳定性和延长的体内半衰期。

附图简述

图1显示了本发明所用的表达载体质粒图谱，图中Ampicillin表示氨苄青霉素抗性基因。

图2显示了IFNα2b/HSA融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳结果。

图3显示了IFNα2b/HSA融合蛋白表达的Westem印迹结果。

图4显示了IFNα2b/HSA融合蛋白的活性测定结果。

图5显示了IFNα2b/HSA融合蛋白融合表达蛋白体内半衰期测定结果。

具体实施方案

本发明一方面提供了一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含细胞抑制因子(CIF)多肽和人白蛋白(HAS)多肽。

在本发明中，术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。术语“蛋白质”、“肽”或“多肽”可互换使用。它们指通过肽键或酰胺键连接在一起的两个或多个氨基酸的链，无论是否经过翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。该定义范围中特别包括抗体。本发明的多肽还可包含一个以上的亚基，每个亚基一条由分开的DNA序列编码。

在较佳的方案中，所述融合蛋白是由CIF与HSA直接连接而成的。术语“CIF与HSA直接连接”是指这两种蛋白质分子间的连接无任何连接多肽，这避免了因不必要的连接肽可能导致的免疫原性，连接方式可以是以CIF多肽的C-末端直接连接在HSA多肽的N-末端，即CIF/HSA融合蛋白，也可以是以CIF多肽的N-末端直接连接在HSA多肽的C-末端，即HSA/CIF。优选连接方式是CIF/HSA。

本发明涉及的细胞抑制因子包括但不局限于：IFNα2a，IFNα1b，IFNα2b，IFNβ，IFNγ(其氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：1-5中)，其中较佳的是IFNα2b。本发明的人白蛋白多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。由IFNα2a，IFNα1b，IFNα2b，IFNβ，IFNγ与人白蛋白多肽分别直接偶联形成的融合蛋白的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：7-11中。

IFNα是IFN家族中最大的一类，有20多种亚型，其中又以IFNα2a，IFNα1b，IFNα2b三种为主。IFNα由白细胞分泌产生，含有165-166个氨基酸，以及2个二硫键，分子量为19.3Kda。IFNα的具体分子结构可参考孙为民等编著的“细胞因子研究方法”(人民卫生出版社，1999)。IFNα具有抗病毒，抗肿瘤增殖，以及免疫调节的作用，广泛应用于病毒性肝炎，恶性肿瘤，以及多发性硬化症等严重疾病的治疗。早期临床使用的IFNα通过诱导人白细胞产生，经提取后制成。由于提取纯度低，比活性低，生产成本高，并且具有病毒污染的可能，严重地影响了干扰素在临床上的使用价值。近年来，基因工程重组IFNα已经代替了天然提取IFNα，具有没有污染、安全性高、纯度高、比活性高、成本低、疗效确切等优点。

IFNβ由成纤维细胞和白细胞分泌产生。人IFNβ含有166个氨基酸，以及一对半二硫键，分子量为19.6KDa。IFNβ的具体分子结构可参考孙为民等编著的“细胞因子研究方法”(人民卫生出版社，1999)。IFNβ与IFNα共用同一个受体，因此与IFNα功能类似，具有抗病毒，抗肿瘤增殖，以及免疫调节的作用，广泛应用于病毒性肝炎，恶性肿瘤，以及多发性硬化症等严重疾病的治疗。目前基因工程重组IFNβ已经在临床上得到广泛的应用，主要要用于多发性硬化症的治疗。

IFNγ主要由活化的T细胞和NK细胞产生分泌产生。人IFN-γ成熟分子由143个氨基酸组成，糖蛋白，以同源双体形式存在，分子量为40kDa。IFNγ的具体分子结构可参考孙为民等编著的“细胞因子研究方法”(人民卫生出版社，1999)。IFN-α、IFN-β竞争结合细胞表面相同的受体，而IFNγ结合的受体与IFN-α和IFN-β结合的受体不同。IFN-γ具有抗病毒和免疫调节功能，尤其在治疗类风湿性关节炎具有很好的疗效。目前基因工程重组IFN-γ已经在临床上得到广泛的应用。

本发明的术语“细胞抑制因子多肽”和“人白蛋白多肽”的含义还包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似生物活性或功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：相对于天然蛋白的氨基酸序列有若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸：脂族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了细胞抑制因子和人白蛋白的片段或衍生物，较佳的是该片段或衍生物保留了所需的蛋白生物活性。

上述变异形式还包括上述蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异和/或不影响序列的修饰形式上的差异。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明的术语“细胞抑制因子多肽”和“人白蛋白多肽”还包括与其相同(同源)或基本上相同(同源)的多肽，例如，有至少60％、更佳70％、还要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的多肽。

在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同”或“相同性百分数”是指，当比较和排列对比其最大一致性(用下列序列对比算法之一(或本领域技术人员可获得的其他算法)或目视观察来测定)时，两个或多个序列或亚序列相同，或具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸。术语“基本上相同”是指，当比较和排列对比其最大一致性(用下列序列对比算法之一或目视观察来测定)时，两个或多个序列或亚序列具有至少60％、较佳的80％、最佳的90-95％的核苷酸或氨基酸残基相同性。这样的“基本上相同的”序列通常被认为是同源的。为了比较序列和确定同源性，通常将一个序列作为参比序列与测试序列比较。当用序列对比算法时，将测试和参比序列输入计算机内，指定亚序列坐标，如果需要，指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。序列比较的最优序列排列对比可采用例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)中的同源性排列算法、Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci(USA)85：2444(1988)中的相似性搜寻方法、这些算法的计算机化操作(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)来进行。

具体地说，当该CIF/HSA融合蛋白中的CIF因子为IFNα2b时，其氨基酸序列与SEQ IDNO：3宜有至少90％的同源性，优选同源性是95％。同样，当该CIF/HSA融合蛋白中的CIF因子分别为IFNα2a，IFNα1b，IFNβ和IFNγ时，则该融合蛋白中的CIF多肽区分别与SEQ IDNO：1，2，4，5保持有至少90％的同源性，优选同源性是95％。当IFNα2a、IFNα1b、IFNα2b、IFNβ和IFNγ与人白蛋白直接连接形成融合蛋白时，与SEQ ID NO：7-11所示氨基酸序列有至少90％同源性、更佳有95％同源性的氨基酸序列且具有相同生物活性的蛋白质也包括在本发明的范围内。本发明所用的术语“生物活性”指该融合蛋白表现出所述细胞抑制因子多肽活性半衰期延长的效应。

本发明另一方面提供了一种分离的核酸序列，其特征在于，它具有编码上述融合蛋白的核酸序列或其互补序列。当本发明的融合蛋白是由IFNα2a，IFNα1b，IFNα2b，IFNβ，IFNγ与人白蛋白多肽分别直接偶联形成时，本发明的核酸序列宜具有SEQ ID NO：12-16所示的核酸序列。另外，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了与相同(同源)或基本上相同(同源)以下的核酸序列，如有至少60％、更佳70％、还要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的核酸序列。两个核酸序列基本上相同/同源的另一个指标是两个核酸序列在高度严谨条件下相互杂交。因此，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与本发明核酸序列(尤其是SEQ ID NO：12-16的核酸序列)杂交的核酸序列。

本发明的核酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，通常可通过重叠(overlapping)扩增，例如进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明的融合蛋白可用固相技术通过直接合成肽而加以生产，也可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。在一个较佳的方案中，本发明的融合蛋白用重组方法来制备。具体地说，首先用常规手段克隆获得编码HSA多肽和CIF多肽的核酸序列。具体是从适当的组织、细胞提取mRNA，通过RT-PCR获得相应的cDNA。也可以从适当的cDNA文库直接获得相应的cDNA。还可以通过人工合成获得。人工合成的核苷酸序列可适当进行密码子的改变，以便在相应的蛋白表达宿主中获得表达蛋白的最佳效果。

随后，将编码HSA多肽的核酸序列与编码CIF多肽的核酸序列连接形成单一编码CIF/HSA多肽的核酸序列。优选的合成方法为Overlap PCR的方法合成。然后，上述重组核酸序列被克隆到表达载体质粒中，使该核酸序列与表达调控序列操作性相连。本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。本发明选用的表达质粒载体，包括适合在不同细胞宿主中表达融合蛋白的各种质粒，优选的质粒是表达载体质粒pYES3/CT(Novogen)，可以在市场上获得。

然后，将上述表达质粒转化到重组工程细胞宿主内，从而构建表达CIF/HSA融合蛋白的重组工程细胞宿主。这些重组工程细胞可以是来源于动物，植物，昆虫，真菌，酵母，细菌等。质粒pYES3/CT适合在酵母工程菌中表达融合蛋白，因此优选的重组工程细胞宿主为酵母工程菌，更优选的酵母工程菌为酿酒酵母工程菌BJ5457。本文所用的术语“转化”是指用本领域技术人员熟知的方法将含有感兴趣的核酸的表达载体直接导入宿主细胞内。转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括：电转化；采用氯化钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；感染和其它方法(见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。较佳的方法是电转化方法。

随后，在适合本发明融合蛋白表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。本领域技术人员根据常规试验就能选择和确定培养基、培养温度、时间等条件。采用本领域常规检测手段，如SDS-PAGE，Western印迹等，可以检测出本发明融合蛋白的表达。最后，可用常规的蛋白分离纯化技术，进行融合蛋白的纯化，其包括离心，沉淀，过滤，层析等手段。具体地，层析方法又包括亲和法，凝胶过滤，离子交换，疏水层析，以及反向层析等。本发明提供的CIF/HSA融合蛋白的分离纯化方法也包括上述各种方法的适当组合。

本发明的融合蛋白的生物活性可用常规方法来鉴定。例如，可利用细胞病变抑制法测定IFNα2b/HSA融合蛋白的生物活性。本发明还提供了测定CIF/HSA融合蛋白体内半衰期鉴定的方法。具体地，检测方法包括测定融合蛋白在的动物以及人类体内的活性半衰期。动物包括但不限制于小鼠，狗，猴子。

本发明的融合蛋白可以用作药物，以治疗病毒性肝炎、恶性肿瘤、多发性硬化症、类风湿性关节炎等各种疾病。因此，本发明另一方面还提供了一种药物组合物，该组合物含有药学上有效量的本发明融合蛋白以及药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“载体”应当与本发明的融合蛋白相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的药效。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量，通过是注射，口服，鼻内，呼吸道等方式进行施用。为了提高用药效果，本发明的融合蛋白也可以与其他药物共同使用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1：白蛋白基因克隆

白蛋白基因可以通过RT-PCR获得。首先获得正常人肝组织，并从中制备RNA。然而，通过反转录方法获得cDNA。再用PCR分子克隆技术扩增获得白蛋白基因。具体说明如下：

首先制备总RNA。用正常人肝组织适量，加入1ml Trizol试剂裂解细胞，匀浆再以氯仿和异丙醇进行抽提RNA，用乙醇进行洗涤，RNA便可以进行RT-PCR反转录了。RT-PCR使用宝生物公司mRNA Selective PCR试剂盒。具体条件如下：

2xmRNA Selective PCR Buffer I，25μl，MgCl₂，10μl，dNTP/analog Mixture，5μl，RNase inhibitor，1μl，AMV RNase XL，1μl，Oligo dT Primer，1μl，RNA，1μl，RNaseFree dH₂O，6μl。根据下列的程序进行反应：30℃，10min，42℃，30min，5℃，5min。合成的cDNA可以在-20℃保存。

白蛋白基因也可以从商业购得的人胎肝cDNA文库获得。

根据文献设计HSA的引物，用常规的PCR方法扩增HSA基因。

HSA1：TTTAAGAAGTAAGGAAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATC(SEQID NO：17)

HSA2：CCCctcgag(XhoI)TTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT(SEQ ID NO：18)

PCR反应体系为：cDNA，1μl；HSA1，2.5μl；HSA2，2.5μl；Premix Taq(Ex Taq)，25μl；ddH₂O，19μl。PCR根据下列的程序进行反应。开始，94℃；5min；然后，94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，一共30个循环。最后，72℃，5min。

然后用1％的琼脂糖胶电泳PCR产物，然后切下1800bp左右的目的条带，再用博大泰克公司《PCR产物快速胶回收试剂盒》回收切胶产物，-20℃保存。

实施例2：IFN基因克隆

本实验说明IFNα2b基因的克隆。本方法也适合其它IFN基因的克隆。基本方法是，先取正常人外周血获得人白细胞，并从中制备RNA。通过反转录方法获得cDNA。具体步骤如下。

首先制备总RNA。具体是从正常人外周血人白细胞，经Sendai virus诱导培养后，白细胞加入1ml Trizol试剂裂解细胞，再以氯仿和异丙醇进行抽提RNA，用乙醇进行洗涤，RNA便可以进行RT-PCR反转录了。RT-PCR使用宝生物公司mRNA Selective PCR试剂盒。具体条件如下。

2xmRNA Selective PCR Buffer I，25μl，MgCl₂，10μl，dNTP/analog Mixture，5μl，RNase inhibitor，1μl，AMV RNase XL，1μl，Oligo dT Primer，1μl，RNA，1μl，RNase FreedH₂O，6μl。根据下列的程序进行反应：30℃，10min，42℃，30min，5℃，5min。合成的cDNA可以在-20℃保存。

为扩增IFNa-2b基因，根据文献设计的两条引物：

IFN1：CCCggtacc(KpnI)ATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCA(前导肽)TGTGATCTGCCTCAAACCCACA(SEQ ID NO：19)

IFN2：CTCACTCTTGTGTGCATCTTCCTTACTTCTTAAAC(SEQ ID NO：20)

用常规的PCR方法扩增IFN基因的条件如下。

PCR反应体系：前面准备的cDNA，1μl；10×pfu Buffer，5μl；dNTP Mixture，2μl；IFN1，2.5μl；IFN2，2.5μl；pfu DNA Polymerase，0.5μl；ddH₂O，36.5μl。

PCR根据下列的程序进行反应。开始，94℃；5min；然后，94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，一共30个循环。最后，72℃，5min。

然后用常用的分子生物学方法，分离获得IFN基因。具体是用1.5％的琼脂糖胶电泳PCR产物，然后切下500bp左右的目的条带，再用博大泰克公司《PCR产物快速胶回收试剂盒》回收切胶产物。

实施例3：融合基因克隆

本实验以HSA基因和IFNα2b基因形成HAS/IFNα2b融合基因为例，说明融合基因的克隆方法。本方法也适合HSA基因与其它IFN基因形成融合基因的克隆。

融合蛋白基因的克隆使用Overlap PCR的反应方法获得。具体如下。

Overlap PCR的反应体系为：IFNα2b DNA，2μl；HSA DNA，2ul；Premix Taq(Ex Taq)，50μl；ddH₂O，36μl。

PCR条件为：开始，94℃；5min；然后，94℃，1min；55℃，1min，72℃，2min，一共5个循环。然后，加入引物IFN15ul和HSA25ul。进入下个程序：94℃，1min；55℃，1min，72℃，2min，一共30个循环。最后，72℃，5min。

然后用常用的分子生物学方法，分离获得IFN-HSA基因。具体是用1.5％的琼脂糖胶电泳PCR产物，然后切下2300bp左右的目的条带，再用博大泰克公司《PCR产物快速胶回收试剂盒》回收切胶产物。

实施例4：HSA/IFN载体质粒的构建

以下以HSA/IFNα2b融合基因为例，说明表达载体质粒的构建。本实验采用pYES3/CT为表达载体质粒，其制备方法为常用分子生物学方法。即，通过培养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒。制备好的质粒-20℃保存待用。

为了将HAS/IFNα2b融合基因克隆到pYES3/CT表达载体质粒中，先对表达载体质粒pYES3/CT和IFN-HAS用KpnI和XhoI双酶切。具体条件如下。

37℃恒温水浴锅内反应3小时，酶切体系如下：

酶切体系：表达载体质粒或HSA/IFN，10ul；KpnI，1ul；XhoI，1ul；10x M，2ul；ddH₂O，6ul。

然后用常用的分子生物学方法，分离获得IFN-HSA基因。具体是用1％的琼脂糖胶电泳酶切产物，然后切下目的条带，再用博大泰克公司《PCR产物快速胶回收试剂盒》回收切胶产物

然后，对酶切产物进行连接，获得HSA/IFNα2b融合基因表达载体(图1)。具体如下。

连接体系一般为10ul，solutionI连接酶占体系的一半，剩下一半体系中表达载体与双酶切IFN-HSA的摩尔比为1∶2-10，不足补加无菌水。16℃恒温水浴锅内反应2小时。连接产物转化感受态DH5α细胞。转化反应用博大泰克生物基因技术有限公司购买的高效DH5α感受肽及配带的试剂操作。

转化体系为，连接产物，10ul，无菌水，30ul，酶A，10ul。

取一管感受态DH5α细胞加入上述混合液中，轻柔混匀后冰上放置30分钟再37℃放置10分钟。加入500ul LB液体培养基37℃180rpm摇30分钟。取100ul转化液涂氨苄抗性的LB固体培养基，37℃倒置培养12-16小时。

阳性克隆的鉴定，是通过挑选阳性克隆抽提质粒，进行酶切和测序结果来确定。

实施例5：IFN/HSA融合蛋白表达工程菌的构建

本实验利用电转化方法和IFNα2b/HSA融合基因为例，构建IFN/HSA融合蛋白表达工程菌的构建。具体方法如下。

首先挑选含有IFNα2b/HSA融合基因的表达载体质粒的细菌克隆，提取表达载体质粒。然后，用电转化的方法把质粒转入酿酒酵母。提取方法为常用的分子生物学方法。电转化方法转化酿酒酵母具体如下。

先进行菌体的准备。挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜。然后取100-500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28～30℃、250-300r/min培养过夜，至OD600达到1.3-1.5。再将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。离心后，再用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。再离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml。

然后用电击方法进行转化。具体如下。将5～20μgIFNα2b/HSA融合基因的表达载体质粒DNA线性化，再溶解在5～10μl TE溶液中，与80μl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中。将电转化杯冰浴5min。然后根据相应的电转化仪，采用优化的电压、电流、电容等参数，进行电击。电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中，将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上，每200～600μl涂布一块平板。将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。本实验推荐电击参数为：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击时间为4～10msec。

实施例6：IFN/HSA融合蛋白表达和纯化

实施例5中构建的IFN/HSA融合蛋白表达工程细胞，可以用以下的方法表达融合蛋白并进行纯化。以下是以IFNα2b/HSA融合基因的表达为例，也可适合本发明所涉及的其它IFN/HSA融合蛋白。

将酵母接种于500ml的SDA(6.7％YNB+3，30mg/L leucine，20mg/L lysine)培养基中，摇床30℃，180转/分，培养24小时。然后，接种至装有5升YPD(蛋白胨2％，酵母提取物1％，葡萄糖2％)的发酵罐中。发酵过程控温在30℃，溶氧始终大于20％的饱和度。PH不能低于5。培养至密度OD₆₀₀为8。

利用常用的重组蛋白分离方法，获得以上酵母所表达的融合蛋白初提物。具体地，可以利用离心，沉淀等方法。然后，可以利用层析方法，进一步纯化融合蛋白。具体地，可以采用SPXL层析柱用于融合蛋白的捕获，再利用Butyl Sepharose FF层析柱，CeramicHydroxyapatite层析柱，以及DEAE Sepharose FF层析柱，进行更高的纯化。融合蛋白表达和纯化结果通过常用的蛋白分析方法进行鉴定，包括但不限制于SDS-PAGE，Western印迹ting等方法。图2显示了IFNα2b/HSA融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳图，结果显示表达的融合蛋白分子量为85.7kDa，与预期的完全一致(请对电泳结果进行描述)。图3显示了IFNα2b/HSA融合蛋白表达的Western印迹结果，表明用抗干扰素的抗体能特异性识别分子量为85.7kDa融合蛋白。

实施例7：IFN/HSA融合蛋白的活性鉴定

本实施例中IFN/HSA融合蛋白表达和纯化的活性鉴定，采用细胞病变抑制法。本实验以纯化的IFNα2b/HSA融合蛋白为例，具体方法如下。

首先，弃去WISH细胞培养瓶中的培养液，用PBS洗两次后消化收集细胞，用完全培养液配制成2.5×10⁵～3.5×10⁵个/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。37℃、5％CO2条件下培养4～6小时。同时，配制标准品溶液，具体地，取1支人α干扰素效价测定国家标准品按说明书溶解后，用测定培养液稀释至1024IU/ml。再配制供试品溶液，具体地，将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成约1000IU/ml。然后，于96孔细胞培养板中每孔加入150μl测定培养液，将上述稀释好的标准品和样品分别加入50μl，一式二孔，自上而下作4倍稀释，每孔留150μl余液。再取4-1项制备的细胞培养板，将3-4项制备的溶液移入该细胞培养板，每孔100μl，37℃，5％CO₂条件下培养18～24小时。然后攻毒试验，具体取4-5项制备的96孔细胞培养板，弃去上清。将保存的水泡性口炎病毒(VSV，-70℃保存)用攻毒培养液稀释至工作浓度，每孔100μl。37℃，5％CO₂培养22-24小时(镜检标准溶液的50％病变点在D或E行)。最后通过显色，鉴定结果，具体如下。弃去96孔细胞培养板的上清，每孔加入50μl染色液，室温放置30分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入100μl脱色液，在室温放置3-5分钟，混匀后在酶标仪上比色，测定波长570nm，参照波长630nm，记录测定结果。

结果以下列方式计算。

试验数据采用计算机程序或直线回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果：

式中Pr为标准品效价，IU/ml；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品半效稀释倍数(即从供试品溶液至相当于标准品50％最大效应点的稀释倍数)；Er为标准品半效稀释倍数。

图4显示出IFNα2b/HSA融合蛋白活性测定结果。结果表明，在WISH/VSV系统中，本发明的IFNα2b/HSA融合蛋白具有抗病毒生物活性，EC₅₀值为2.079±0.077ng/ml(EC₅₀值是指在WISH/VSV系统中测定抗病毒生物活性时，能产生50％病变抑制所需要的IFNα2b/HSA融合蛋白的浓度)。

实施例7：融合表达蛋白体内半衰期测定

以猕猴为研究对象，按不同剂量和途径注射IFNα2b/HSA融合蛋白，在不同的时间点取血样，用ELISA测定血浆中融合蛋白含量，获得单次用药在猕猴体内的半衰期，生物利用度、AUC等药代学资料。

选择猕猴为试验动物，其理由按照已有的资料证明，猕猴是研究干扰素的最合适的动物，猕猴和人的同源性高，而且试验材料比其它和人高同源的动物易得。同时有较多的背景资料。动物18只，雌雄各半，由苏州西山中科实验动物有限公司提供。动物年龄：实验开始时，3-5岁龄。体重：试验开始时，雌性动物3.5-5kg；雄性动物4.0-5.5kg。

按不同剂量和途径注射IFNα2b/HSA融合蛋白，在0、30分钟、1、3、6、10、24、48、96、144、192、240、288、336小时分别取1ml的加入抗凝剂(EDTA)的血(用于ELISA检测)。血样置冰浴上1小时，离心后取上清液，-20℃保存待测定。用ELISA(美国PBL BiomedicalLaboratories公司生产制备)测定血浆中融合蛋白含量，获得单次用药在猕猴体内的药代动力学资料。

结果显示在图5中。在猕猴体内的实验表明，一次单剂量给予50-300ug/kg IFNα2b/HSA融合蛋白(IV，SC)，其血清浓度呈缓慢下降，半衰期为70-90小时，而文献报道的普通干扰素的半衰期为3-8小时。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

序列表

<110>浙江德清安平生物制药有限公司

<120>细胞抑制因子与白蛋白的融合蛋白

<130>053215

<160>20

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>166

<212>PRT

<213>智人

<400>1

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aggaaatact tccaaagaat cactctatat ctgacagaga agaaatacag ctcttgtgcc 420

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agattgaaga gtaaggaaga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcgatt taaagatttg 540

ggagaagaaa atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt 600

ccatttgaag atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt 660

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gaacctgaga gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga 840

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ttgaaaaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc 960

cttttctttg ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa 1020

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gcagtagctc gcctgagcca gagatttccc aaagctgagt ttgcagaagt ttccaagtta 1200

gtgacagatc ttaccaaagt ccacacggaa tgctgccatg gagatctgct tgaatgtgct 1260

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ctgaaggaat gctgtgaaaa acctctgttg gaaaaatccc actgcattgc cgaagtggaa 1380

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gatgaattta aacctcttgt ggaagagcct cagaatttaa tcaaacaaaa ttgtgagctt 1680

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<210>14

<211>2253

<212>DNA

<213>智人

<400>14

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480

ttaagaagta aggaagatgc acacaagagt gaggttgctc atcgatttaa agatttggga 540

gaagaaaatt tcaaagcctt ggtgttgatt gcctttgctc agtatcttca gcagtgtcca 600

tttgaagatc atgtaaaatt agtgaatgaa gtaactgaat ttgcaaaaac atgtgttgct 660

gatgagtcag ctgaaaattg tgacaaatca cttcataccc tttttggaga caaattatgc 720

acagttgcaa ctcttcgtga aacctatggt gaaatggctg actgctgtgc aaaacaagaa 780

cctgagagaa atgaatgctt cttgcaacac aaagatgaca acccaaacct cccccgattg 840

gtgagaccag aggttgatgt gatgtgcact gcttttcatg acaatgaaga gacatttttg 900

aaaaaatact tatatgaaat tgccagaaga catccttact tttatgcccc ggaactcctt 960

ttctttgcta aaaggtataa agctgctttt acagaatgtt gccaagctgc tgataaagct 1020

gcctgcctgt tgccaaagct cgatgaactt cgggatgaag ggaaggcttc gtctgccaaa 1080

cagagactca agtgtgccag tctccaaaaa tttggagaaa gagctttcaa agcatgggca 1140

gtagctcgcc tgagccagag atttcccaaa gctgagtttg cagaagtttc caagttagtg 1200

acagatctta ccaaagtcca cacggaatgc tgccatggag atctgcttga atgtgctgat 1260

gacagggcgg accttgccaa gtatatctgt gaaaatcaag attcgatctc cagtaaactg 1320

aaggaatgct gtgaaaaacc tctgttggaa aaatcccact gcattgccga agtggaaaat 1380

gatgagatgc ctgctgactt gccttcatta gctgctgatt ttgttgaaag taaggatgtt 1440

tgcaaaaact atgctgaggc aaaggatgtc ttcctgggca tgtttttgta tgaatatgca 1500

agaaggcatc ctgattactc tgtcgtgctg ctgctgagac ttgccaagac atatgaaacc 1560

actctagaga agtgctgtgc cgctgcagat cctcatgaat gctatgccaa agtgttcgat 1620

gaatttaaac ctcttgtgga agagcctcag aatttaatca aacaaaattg tgagcttttt 1680

gagcagcttg gagagtacaa attccagaat gcgctattag ttcgttacac caagaaagta 1740

ccccaagtgt caactccaac tcttgtagag gtctcaagaa acctaggaaa agtgggcagc 1800

aaatgttgta aacatcctga agcaaaaaga atgccctgtg cagaagacta tctatccgtg 1860

gtcctgaacc agttatgtgt gttgcatgag aaaacgccag taagtgacag agtcaccaaa 1920

tgctgcacag aatccttggt gaacaggcga ccatgctttt cagctctgga agtcgatgaa 1980

acatacgttc ccaaagagtt taatgctgaa acattcacct tccatgcaga tatatgcaca 2040

ctttctgaga aggagagaca aatcaagaaa caaactgcac ttgttgagct cgtgaaacac 2100

aagcccaagg caacaaaaga gcaactgaaa gctgttatgg atgatttcgc agcttttgta 2160

gagaagtgct gcaaggctga cgataaggag acctgctttg ccgaggaggg taaaaaactt 2220

gttgctgcaa gtcaagctgc cttaggctta taa 2253

<210>15

<211>2256

<212>DNA

<213>智人

<400>15

atgagctaca acttgcttgg attcctacaa agaagcagca attttcagtg tcagaagctc 60

ctgtggcaat tgaatgggag gcttgaatac tgcctcaagg acaggatgaa ctttgacatc 120

cctgaggaga ttaagcagct gcagcagttc cagaaggagg acgccgcatt gaccatctat 180

gagatgctcc agaacatctt tgctattttc agacaagatt catctagcac tggctggaat 240

gagactattg ttgagaacct cctggctaat gtctatcatc agataaacca tctgaagaca 300

gtcctggaag aaaaactgga gaaagaagat ttcaccaggg gaaaactcat gagcagtctg 360

cacctgaaaa gatattatgg gaggattctg cattacctga aggccaagga gtacagtcac 420

tgtgcctgga ccatagtcag agtggaaatc ctaaggaact tttacttcat taacagactt 480

acaggttacc tccgaaacga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcgatt taaagatttg 540

ggagaagaaa atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt 600

ccatttgaag atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt 660

gctgatgagt cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta 720

tgcacagttg caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa 780

gaacctgaga gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga 840

ttggtgagac cagaggttga tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattt 900

ttgaaaaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc 960

cttttctttg ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa 1020

gctgcctgcc tgttgccaaa gctcgatgaa cttcgggatg aagggaaggc ttcgtctgcc 1080

aaacagagac tcaagtgtgc cagtctccaa aaatttggag aaagagcttt caaagcatgg 1140

gcagtagctc gcctgagcca gagatttccc aaagctgagt ttgcagaagt ttccaagtta 1200

gtgacagatc ttaccaaagt ccacacggaa tgctgccatg gagatctgct tgaatgtgct 1260

gatgacaggg cggaccttgc caagtatatc tgtgaaaatc aagattcgat ctccagtaaa 1320

ctgaaggaat gctgtgaaaa acctctgttg gaaaaatccc actgcattgc cgaagtggaa 1380

aatgatgaga tgcctgctga cttgccttca ttagctgctg attttgttga aagtaaggat 1440

gtttgcaaaa actatgctga ggcaaaggat gtcttcctgg gcatgttttt gtatgaatat 1500

gcaagaaggc atcctgatta ctctgtcgtg ctgctgctga gacttgccaa gacatatgaa 1560

accactctag agaagtgctg tgccgctgca gatcctcatg aatgctatgc caaagtgttc 1620

gatgaattta aacctcttgt ggaagagcct cagaatttaa tcaaacaaaa ttgtgagctt 1680

tttgagcagc ttggagagta caaattccag aatgcgctat tagttcgtta caccaagaaa 1740

gtaccccaag tgtcaactcc aactcttgta gaggtctcaa gaaacctagg aaaagtgggc 1800

agcaaatgtt gtaaacatcc tgaagcaaaa agaatgccct gtgcagaaga ctatctatcc 1860

gtggtcctga accagttatg tgtgttgcat gagaaaacgc cagtaagtga cagagtcacc 1920

aaatgctgca cagaatcctt ggtgaacagg cgaccatgct tttcagctct ggaagtcgat 1980

gaaacatacg ttcccaaaga gtttaatgct gaaacattca ccttccatgc agatatatgc 2040

acactttctg agaaggagag acaaatcaag aaacaaactg cacttgttga gctcgtgaaa 2100

cacaagccca aggcaacaaa agagcaactg aaagctgtta tggatgattt cgcagctttt 2160

gtagagaagt gctgcaaggc tgacgataag gagacctgct ttgccgagga gggtaaaaaa 2220

cttgttgctg caagtcaagc tgccttaggc ttataa 2256

<210>16

<211>2256

<212>DNA

<213>智人

<400>16

atgaaatata caagttatat cttggctttt cagctctgca tcgttttggg ttctcttggc 60

tgttactgcc aggacccata tgtaaaagaa gcagaaaacc ttaagaaata ttttaatgca 120

ggtcattcag atgtagcgga taatggaact cttttcttag gcattttgaa gaattggaaa 180

gaggagagtg acagaaaaat aatgcagagc caaattgtct ccttttactt caaacttttt 240

aaaaacttta aagatgacca gagcatccaa aagagtgtgg agaccatcaa ggaagacatg 300

aatgtcaagt ttttcaatag caacaaaaag aaacgagatg acttcgaaaa gctgactaat 360

tattcggtaa ctgacttgaa tgtccaacgc aaagcaatac atgaactcat ccaagtgatg 420

gctgaactgt cgccagcagc taaaacaggg aagcgaaaaa ggagtcagat gctgtttcga 480

ggtcgaagag catcccagga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcgatt taaagatttg 540

ggagaagaaa atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt 600

ccatttgaag atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt 660

gctgatgagt cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta 720

tgcacagttg caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa 780

gaacctgaga gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga 840

ttggtgagac cagaggttga tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattt 900

ttgaaaaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc 960

cttttctttg ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa 1020

gctgcctgcc tgttgccaaa gctcgatgaa cttcgggatg aagggaaggc ttcgtctgcc 1080

aaacagagac tcaagtgtgc cagtctccaa aaatttggag aaagagcttt caaagcatgg 1140

gcagtagctc gcctgagcca gagatttccc aaagctgagt ttgcagaagt ttccaagtta 1200

gtgacagatc ttaccaaagt ccacacggaa tgctgccatg gagatctgct tgaatgtgct 1260

gatgacaggg cggaccttgc caagtatatc tgtgaaaatc aagattcgat ctccagtaaa 1320

ctgaaggaat gctgtgaaaa acctctgttg gaaaaatccc actgcattgc cgaagtggaa 1380

aatgatgaga tgcctgctga cttgccttca ttagctgctg attttgttga aagtaaggat 1440

gtttgcaaaa actatgctga ggcaaaggat gtcttcctgg gcatgttttt gtatgaatat 1500

gcaagaaggc atcctgatta ctctgtcgtg ctgctgctga gacttgccaa gacatatgaa 1560

accactctag agaagtgctg tgccgctgca gatcctcatg aatgctatgc caaagtgttc 1620

gatgaattta aacctcttgt ggaagagcct cagaatttaa tcaaacaaaa ttgtgagctt 1680

tttgagcagc ttggagagta caaattccag aatgcgctat tagttcgtta caccaagaaa 1740

gtaccccaag tgtcaactcc aactcttgta gaggtctcaa gaaacctagg aaaagtgggc 1800

agcaaatgtt gtaaacatcc tgaagcaaaa agaatgccct gtgcagaaga ctatctatcc 1860

gtggtcctga accagttatg tgtgttgcat gagaaaacgc cagtaagtga cagagtcacc 1920

aaatgctgca cagaatcctt ggtgaacagg cgaccatgct tttcagctct ggaagtcgat 1980

gaaacatacg ttcccaaaga gtttaatgct gaaacattca ccttccatgc agatatatgc 2040

acactttctg agaaggagag acaaatcaag aaacaaactg cacttgttga gctcgtgaaa 2100

cacaagccca aggcaacaaa agagcaactg aaagctgtta tggatgattt cgcagctttt 2160

gtagagaagt gctgcaaggc tgacgataag gagacctgct ttgccgagga gggtaaaaaa 2220

cttgttgctg caagtcaagc tgccttaggc ttataa 2256

<210>17

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>17

tttaagaagt aaggaagatg cacacaagag tgaggttgct catc 44

<210>18

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>18

cccctcgagt tataagccta aggcagcttg actt 34

<210>19

<211>88

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>19

cccggtacca tgcttttgca agctttcctt ttccttttgg ctggttttgc agccaaaata 60

tctgcatgtg atctgcctca aacccaca 88

<210>20

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>20

ctcactcttg tgtgcatctt ccttacttct taaac 35

Claims

1.一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含细胞抑制因子多肽和人白蛋白多肽。

2.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其特征在于，所述细胞抑制因子多肽的C-末端与人白蛋白区N-末端直接相连或者细胞抑制因子多肽的N-末端与人白蛋白区C-末端直接相连。

3.根据权利要求2所述的分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有选自下列的氨基酸序列：

(a)序列表SEQ ID NO：7-11任一所示的氨基酸序列；

(b)相对于SEQ ID NO：7-11任一所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQ ID NO：7-11任一所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；

(c)相对于SEQ ID NO：7-11任一所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQ ID NO：7-11任一所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。

4.一种分离的核酸序列，其特征在于，它具有编码权利要求1所述的融合蛋白的核酸序列或其互补序列。

5.根据权利要求4所述的分离的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列具有SEQID NO：12-16任一所示的核酸序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的核酸序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求6所述的载体转化。

8.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)提供一宿主细胞，该宿主细胞包含一表达载体，该表达载体包含权利要求4所述的核酸序列以及与其操作性相连的表达调控序列；

(b)在适合蛋白表达的条件下，培养步骤(a)所述的宿主细胞；

(c)分离出权利要求1所述的融合蛋白。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。

10.权利要求1所述的融合蛋白在制备药物中的用途。