CN107699590A - 一种制备重组人α‑L‑艾杜糖醛酸酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人α‑L‑艾杜糖醛酸酶表达载体，它是pCMV‑IDUA表达质粒。以及一种重组人α‑L‑艾杜糖醛酸酶的制备方法。本发明通过克隆表达编码人α‑L‑艾杜糖醛酸酶的基因，转染中国仓鼠卵巢细胞系DG44，并在该细胞中实现了α‑L‑艾杜糖醛酸酶的稳定表达。最终获得的α‑L‑艾杜糖醛酸酶具有催化底物α‑Liduronide酶促反应的生物活性，适合用于治疗因α‑L‑艾杜糖醛酸酶缺乏致糖胺聚糖降解代谢障碍引发的粘多糖贮积症I型（MPS‑Ⅰ）。

Description

一种制备重组人α-L-艾杜糖醛酸酶的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及人α-L-艾杜糖醛酸酶基因重组载体，用该载体转化的宿主重组表达人α-L-艾杜糖醛酸酶的方法及应用。
背景技术
粘多糖贮积症(Mucopolysaccharidosis，MPS)由酸性粘多糖降解酶缺乏，致糖胺聚糖降解代谢障碍引起，根据不同酶缺陷(大约10余种)，临床上又分为8型，其中MPS-Ⅰ是我国发病率相对较高的类型。溶酶体α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-iduronidase,IDUA)缺陷致糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAGs)降解代谢障碍引发MPS-Ⅰ，多在婴儿或儿童期发生，是一种致残、致死性遗传性代谢疾病。重组人α-L-艾杜糖醛酸酶(recombinantα-L-iduronidase,rhIDUA)作为酶替代治疗(ERT)药物在临床治疗显示患者均能安全度过童年期，且伴随明显的认知功能恢复和某些症状的改善。
除ERT治疗手段外，造血干细胞治疗也是十分有效的手段。ERT以及造血干细胞治疗目前在中国仍属于空白领域，虽然，中国专利(CN201180051220.1)公开了一种反义寡核苷酸，用于调节IDUA表达来达到治疗MPS-Ⅰ型粘多糖贮积症的目的，另有中国专利(201380041239.7)公开了一种IDUA与血管肽素-2的重组融合蛋白，通过连接血管素肽靶向血脑屏障，有效改善中枢溶酶体中的葡糖氨基葡聚糖(粘多糖)的贮积。重组IDUA在欧美上市并用于MPS-Ⅰ治疗已超过十年，但我国该领域的治疗至今仍是空白。尽管重组IDUA尚不能透过血脑屏障，但其改善MPS-Ⅰ患者肺功能，尤其改善肝、脾肿大的疗效十分显著，在治疗MPS-Ⅰ并延长患者生命周期仍具有十分重要的意义。
目前虽然国外大型医疗企业有生产重组人α-L-艾杜糖醛酸酶的治疗试剂，但是该试剂价格较高，对于临床患者的治疗用药较为不利。由于治疗药物的缺失，使得国内对于该领域的治疗研究缺失严重，不利于基因治疗技术的发展，特别是对于MPS-Ⅰ型婴幼儿的治疗技术发展缓慢。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中缺少关于重组表达人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)研究的不足，提供一种重组表达人IDUA的方法，其包含编码IDUA的核苷酸序列、表达载体以及宿主细胞DG44细胞。
同时，本发明也公开了重组IDUA的生物活性以及用于MPS-Ⅰ型粘多糖贮积症治疗的用途。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)表达载体，它是pCMV-IDUA表达质粒。
一种pCMV-IDUA表达质粒构建方法，用BglII和PacI对pCMV质粒进行双酶切后回收大片段，再用BglII和PacI对pUC-IDUA质粒进行双酶切回收目的基因片段，酶切后将产生相同黏性末端的载体片段与目的基因进行连接。
通过双酶切回收获取目的基因片段，然后进行目的基因转化结合，其中rhIDUA的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，通过如此方式获得表达质粒载体，实现制备所需要的表达载体，它是表达质粒，性质稳定，转化效率高。
一种制备人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)的方法，包括用上述pCMV-IDUA表达质粒转化宿主细胞，培养转化体，获得人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)。
进一步，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢DG44(CHO DG44)细胞、人胚胎肾细胞HEK293细胞。优选中国仓鼠卵巢DG44悬浮细胞系，具有更好的表达稳定性和表达水平。
重组人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)，将所述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物获得重组人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)。
进一步，将重组质粒pCMV-IDUA经电转法转染至CHO DG44细胞中，得到转化体。
优选地，将电转后细胞混合液转移至含SFM4培养基的6孔板中，置于37℃孵箱中培养，48h后加入10nM MTX进行加压筛选，待细胞活率恢复至90％以上，MTX增加至100nM；细胞加入MTX至500nM，待活率恢复至90％以上后，将细胞转入摇瓶培养，在培养第3天和第5天分别补加4g/L葡萄糖，继续培养至第7天。取培养液在4℃条件下，以5000rpm离心15min，收集上清经0.45μm滤膜过滤后进行纯化，得到重组人α-L-艾杜糖醛酸酶。
进一步，将所得rhIDUA的纯化采用离子交换层析纯化。优选地，采用阴离子交换层析或阳离子交换层析。
一种用中国仓鼠卵巢DG44(CHO DG44)细胞重组表达人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)的方法，其特征在于所述方法包括：
a.rhIDUA的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；
b.构建pCMV-IDUA表达质粒；
c.在CHO DG44细胞的稳定表达；
d.离子交换层析纯化rhIDUA。
通过将rhIDUA和pCMV连接构建pCMV-IDUA表达质粒，转化CHO DG44细胞，筛选出稳定表达的目标遗传系，进行培养制备得到大量rhIDUA，然后经过离子交换层析纯化得到纯净产物rhIDUA。如此制备的rhIDUA可以应用于MPS-Ⅰ型婴幼儿的治疗，对于促进基因治疗技术的发展具有重要意义。
上述方法制备得到的rhIDUA，用于制备粘多糖贮积症MPS-Ⅰ型的治疗的生物制剂。所述rhIDUA具有催化底物α-Liduronide酶促反应的生物活性，可用于粘多糖贮积症MPS-Ⅰ型的治疗。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.本发明将IDUA结合pCMV构建表达质粒，通过转化宿主细胞可以实现体外重组制备α-L-艾杜糖醛酸酶，为治疗MPS-Ⅰ型粘多糖贮积症的研究提供所需的基因治疗制剂原料，对于相应的研究促进具有重要意义。
2.本发明利用pCMV-IDUA表达质粒转化宿主细胞，培养转化体，培养所得培养液进行离子交换层析处理，可以获取大量高纯度的重组人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)，具有纯净度高，应用效果好的特点。
3.本发明通过克隆表达编码人α-L-艾杜糖醛酸酶的基因，转染中国仓鼠卵巢细胞系DG44，并在该细胞中实现了α-L-艾杜糖醛酸酶的稳定表达。最终获得的α-L-艾杜糖醛酸酶具有催化底物α-Liduronide酶促反应的生物活性，适合用于治疗因α-L-艾杜糖醛酸酶缺乏致糖胺聚糖降解代谢障碍引发的粘多糖贮积症I型(MPS-Ⅰ)
附图说明：
图1是pCMV-IDUA-1,2,3酶切鉴定结果。
图2是重组IDUA蛋白的SEC-HPLC纯度分析。
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
<实施例1>
rhIDUA表达质粒构建
针对CHO种属进行IDUA编码区基因序列(GenBank:M74715.1)的优化和合成，将合成的基因序列重组至质粒载体pUC19中，获得包含目的基因的质粒为pUC-IDUA。用BglII和PacI对pCMV质粒进行双酶切后回收大片段，再用BglII和PacI对pUC-IDUA质粒进行双酶切回收目的基因片段，酶切后将产生相同黏性末端的载体片段与目的基因进行连接。将连接产物转化至Top10大肠杆菌感受态细胞中，涂布于2YT平板培养基上，37℃静止过夜。挑取单菌落小量培养后提取质粒酶切鉴定。
rhIDUA的序列如下：
SEQ ID No 1
GCCACCATGAGGCCTCTGAGGCCCCGTGCTGCTCTGCTCGCCCTCCTCGCTTCCCTGCTGGCCGCTCCTCCTGTGGCTCCCGCCGAAGCTCCTCACCTGGTGCAGGTGGACGCTGCTAGGGCTCTGTGGCCCCTGAGGCGGTTTTGGCGGAGCACCGGCTTCTGTCCTCCTCTCCCTCACAGCCAGGCCGATCAGTATGTGCTGTCCTGGGACCAGCAACTGAATCTGGCCTACGTGGGAGCCGTGCCCCACAGGGGCATTAAGCAGGTGAGGACCCACTGGCTGCTGGAGCTGGTCACCACAAGGGGATCCACCGGCAGGGGCCTCAGCTATAACTTCACCCATCTCGACGGCTACCTGGACCTCCTGCGGGAAAACCAGCTGCTCCCTGGCTTCGAGCTGATGGGCAGCGCCTCCGGCCACTTTACAGACTTCGAGGATAAGCAGCAGGTGTTCGAATGGAAGGACCTGGTCAGCTCCCTCGCTCGGAGGTACATTGGCAGGTACGGACTGGCCCACGTGTCCAAGTGGAACTTTGAGACCTGGAACGAGCCTGACCACCACGACTTCGACAACGTGTCCATGACCATGCAGGGCTTCCTGAACTACTACGACGCCTGCAGCGAGGGCCTGAGGGCCGCCTCCCCCGCCCTGAGGCTCGGCGGCCCTGGCGACTCCTTTCACACACCTCCCCGTAGCCCCCTGAGCTGGGGACTGCTGCGGCATTGCCATGACGGCACCAACTTCTTCACAGGAGAGGCCGGCGTGCGGCTGGATTATATCTCCCTGCACCGGAAGGGAGCTCGGAGCTCCATCAGCATTCTGGAGCAGGAGAAAGTGGTGGCTCAGCAGATCCGGCAACTGTTCCCCAAATTCGCTGACACCCCCATCTACAACGATGAGGCTGACCCTCTCGTGGGCTGGAGCCTCCCTCAGCCTTGGCGGGCTGACGTCACCTACGCCGCTATGGTCGTGAAGGTCATCGCCCAGCATCAAAACCTGCTCCTCGCTAACACAACATCCGCTTTCCCCTACGCCCTGCTGTCCAACGACAACGCCTTTCTCAGCTACCACCCCCATCCTTTTGCCCAGAGGACACTCACCGCCCGGTTTCAGGTGAACAACACCAGGCCTCCTCACGTGCAGCTGCTGCGGAAGCCTGTCCTCACCGCTATGGGCCTCCTGGCCCTGCTGGATGAGGAGCAGCTCTGGGCTGAGGTCTCCCAGGCTGGAACCGTGCTGGATTCCAATCATACCGTGGGAGTGCTCGCTTCCGCTCATAGGCCCCAGGGCCCTGCTGATGCCTGGAGGGCTGCTGTCCTGATTTATGCTAGCGACGATACCCGGGCCCATCCTAATAGGTCCGTGGCTGTGACCCTGAGGCTCAGGGGAGTGCCTCCTGGACCTGGCCTGGTCTATGTGACCAGGTATCTGGACAACGGCCTGTGCTCCCCTGATGGCGAATGGCGGAGGCTGGGCAGGCCTGTCTTTCCCACAGCCGAGCAGTTCCGGCGGATGAGGGCTGCTGAAGACCCTGTGGCTGCTGCCCCCAGGCCCCTGCCTGCTGGAGGAAGGCTCACCCTGAGGCCTGCCCTGAGGCTGCCTTCCCTGCTGCTGGTCCATGTGTGCGCCAGGCCCGAGAAGCCTCCTGGACAGGTGACCCGGCTGAGGGCTCTGCCCCTGACACAGGGCCAGCTGGTCCTGGTGTGGAGCGACGAGCATGTCGGCTCCAAGTGCCTGTGGACATACGAAATCCAGTTCTCCCAGGACGGCAAGGCCTACACACCCGTGAGCAGGAAGCCTTCCACATTCAACCTCTTCGTGTTCTCCCCCGATACAGGCGCCGTCAGCGGAAGCTACAGGGTGAGGGCCCTCGATTATTGGGCCAGGCCTGGCCCCTTTAGCGATCCTGTGCCTTATCTGGAGGTGCCCGTGCCTCGGGGACCTCCCAGCCCCGGCAACCCCTGA
<实施例2>
rhIDUA在CHO DG44细胞中的表达
将实施例1鉴定正确的重组质粒pCMV-IDUA(如图1)经电转法转染至CHO DG44细胞中，将电转后细胞混合液转移至含SFM4培养基的6孔板中，置于37℃孵箱中培养，48h后加入MTX(10nM)进行加压筛选，待细胞活率恢复至90％以上，MTX增加至100nM；细胞加入MTX至500nM，待活率恢复至90％以上后，将细胞转入摇瓶培养，在培养第3天和第5天分别补加葡萄糖(4g/L)，继续培养至第7天。取培养液在4℃条件下，以5000rpm离心15min，收集上清经0.45μm滤膜过滤后进行纯化。
<实施例3>
rhIDUA的纯化
采用离子交换层析技术对上述表达细胞的上清进行纯化，具体操作如下：
阴离子交换层析：将1mL HiTrapTM Q HP预装柱与AKTA purifier层析系统相连。流动相A为：20mM Tris-HCl，pH＝8.0；流动相B为：20mM Tris-HCl，含1M氯化钠，pH＝8.0；流速1.5mL/min，检测波长254nm和280nm。先用流动相A平衡层析柱5-10CV，对已收集处理的细胞上清液进行上样，目的蛋白结合于介质上，部分杂质穿透。上样结束后，采用流动相A清洗层析柱3-5CV，最后用流动相B对其目的蛋白进行梯度洗脱(0-50％B，20min)，收集洗脱样品并将缓冲液置换至20mM柠檬酸(pH＝6.0)中。层析柱用3-5CV的1M氯化钠再生，并用0.1M氢氧化钠进行清洗。
阳离子交换层析：将1ml HiTrapTM SP HP预装柱与AKTA purifier层析系统相连。流动相A为：20mM柠檬酸，pH＝6.0；流动相B为：20mM柠檬酸，含1M氯化钠，pH＝6.0；流速1.5mL/min，检测波长254nm和280nm。先用流动相A平衡层析柱5-10CV，将阴离子层析透析样品上样，目的蛋白结合于介质上，部分杂质穿透。上样结束后，采用流动相A进行冲洗层析柱3-5CV，线性梯度洗脱0-30％B，20min。
<实施例4>
rhIDUA的生物活性检测
采用公开报道的酶活性检测方法测试了rhIDUA的生物活性，结果如表1所示，rhIDUA催化底物α-Liduronide的相对酶活力为16203.27±251.782pmol/min/μg，这与文献资料报告IDUA的酶活力大于7500pmol/min/μg相符合，表明本研究中的rhIDUA具有良好的生物活性，可用于MPS-Ⅰ型粘多糖贮积症的治疗。
表1 rhIDUA催化荧光底物酶活力检测
SEQUENCE LISTING
<110> 成都中医药大学
<120> 一种制备重组人α-L-艾杜糖醛酸酶的方法
<130> 人工序列的描述：rhIDUA的序列
<160> 1
<210> 1
<211> 1968
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：rhIDUA的序列
<400> 1
gccaccatga ggcctctgag gccccgtgct gctctgctcg ccctcctcgc ttccctgctg 60
gccgctcctc ctgtggctcc cgccgaagct cctcacctgg tgcaggtgga cgctgctagg 120
gctctgtggc ccctgaggcg gttttggcgg agcaccggct tctgtcctcc tctccctcac 180
agccaggccg atcagtatgt gctgtcctgg gaccagcaac tgaatctggc ctacgtggga 240
gccgtgcccc acaggggcat taagcaggtg aggacccact ggctgctgga gctggtcacc 300
acaaggggat ccaccggcag gggcctcagc tataacttca cccatctcga cggctacctg 360
gacctcctgc gggaaaacca gctgctccct ggcttcgagc tgatgggcag cgcctccggc 420
cactttacag acttcgagga taagcagcag gtgttcgaat ggaaggacct ggtcagctcc 480
ctcgctcgga ggtacattgg caggtacgga ctggcccacg tgtccaagtg gaactttgag 540
acctggaacg agcctgacca ccacgacttc gacaacgtgt ccatgaccat gcagggcttc 600
ctgaactact acgacgcctg cagcgagggc ctgagggccg cctcccccgc cctgaggctc 660
ggcggccctg gcgactcctt tcacacacct ccccgtagcc ccctgagctg gggactgctg 720
cggcattgcc atgacggcac caacttcttc acaggagagg ccggcgtgcg gctggattat 780
atctccctgc accggaaggg agctcggagc tccatcagca ttctggagca ggagaaagtg 840
gtggctcagc agatccggca actgttcccc aaattcgctg acacccccat ctacaacgat 900
gaggctgacc ctctcgtggg ctggagcctc cctcagcctt ggcgggctga cgtcacctac 960
gccgctatgg tcgtgaaggt catcgcccag catcaaaacc tgctcctcgc taacacaaca 1020
tccgctttcc cctacgccct gctgtccaac gacaacgcct ttctcagcta ccacccccat 1080
ccttttgccc agaggacact caccgcccgg tttcaggtga acaacaccag gcctcctcac 1140
gtgcagctgc tgcggaagcc tgtcctcacc gctatgggcc tcctggccct gctggatgag 1200
gagcagctct gggctgaggt ctcccaggct ggaaccgtgc tggattccaa tcataccgtg 1260
ggagtgctcg cttccgctca taggccccag ggccctgctg atgcctggag ggctgctgtc 1320
ctgatttatg ctagcgacga tacccgggcc catcctaata ggtccgtggc tgtgaccctg 1380
aggctcaggg gagtgcctcc tggacctggc ctggtctatg tgaccaggta tctggacaac 1440
ggcctgtgct cccctgatgg cgaatggcgg aggctgggca ggcctgtctt tcccacagcc 1500
gagcagttcc ggcggatgag ggctgctgaa gaccctgtgg ctgctgcccc caggcccctg 1560
cctgctggag gaaggctcac cctgaggcct gccctgaggc tgccttccct gctgctggtc 1620
catgtgtgcg ccaggcccga gaagcctcct ggacaggtga cccggctgag ggctctgccc 1680
ctgacacagg gccagctggt cctggtgtgg agcgacgagc atgtcggctc caagtgcctg 1740
tggacatacg aaatccagtt ctcccaggac ggcaaggcct acacacccgt gagcaggaag 1800
ccttccacat tcaacctctt cgtgttctcc cccgatacag gcgccgtcag cggaagctac 1860
agggtgaggg ccctcgatta ttgggccagg cctggcccct ttagcgatcc tgtgccttat 1920
ctggaggtgc ccgtgcctcg gggacctccc agccccggca acccctga 1968

Claims (7)

1.一种人α-L-艾杜糖醛酸酶表达载体，其特征在于，它是pCMV-IDUA表达质粒。
2.一种pCMV-IDUA表达质粒构建方法，其特征在于，用BglII和PacI对pCMV质粒进行双酶切后回收大片段，再用BglII和PacI对pUC-IDUA质粒进行双酶切回收目的基因片段，酶切后将产生相同黏性末端的载体片段与目的基因进行连接。
3.制备人α-L-艾杜糖醛酸酶的方法，其特征在于，包括用上述pCMV-IDUA表达质粒转化宿主细胞，培养转化体，获得人α-L-艾杜糖醛酸酶。
4.权利要求3所述方法，其特征在于，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢DG44细胞。
5.重组人α-L-艾杜糖醛酸酶，将权利要求1所述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物获得重组人α-L-艾杜糖醛酸酶。
6.一种用中国仓鼠卵巢DG44（CHO DG44）细胞重组表达人α-L-艾杜糖醛酸酶（rhIDUA）的方法，其特征在于所述方法包括：
a.rhIDUA的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；
b.构建pCMV-IDUA表达质粒；
c.在CHO DG44细胞的稳定表达；
d.离子交换层析纯化rhIDUA。
7.如权利要求6方法制备得到的rhIDUA，用于制备粘多糖贮积症MPS-Ⅰ型的治疗的生物制剂。
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