CN101845425B - 一种α-半乳糖苷酶及其表达、纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α-半乳糖苷酶及其表达、纯化方法。该α-半乳糖苷酶由序列表中的SEQ ID NO：1表示，由脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)ATCC25285的重组基因组DNA序列SEQ ID NO：3编码得到，为具有将人红细胞血型由B型转变为O型、由AB型转变为A型作用的蛋白质。本发明的α-半乳糖苷酶用途广泛，表达及纯化方法简便、成本低廉，具有重要的临床及科学研究意义，市场前景广阔。

Description

一种α-半乳糖苷酶及其表达、纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的酶及其纯化方法，特别是涉及一种细菌的α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)及其表达、纯化方法。 

背景技术

1900年，Landsteiner首次发现ABO血型系统并提出同型输血，为现代输血医学奠定了基础，Landsteiner因此获得1930年诺贝尔奖。1960年，Witkins证明ABH的抗原决定簇是糖类，这一发现加深了人们对血型的认识。近二十多年来，通过运用其它学科先进的分析方法，输血医学得到长足发展，在保障人民生命安全中发挥了巨大作用。然而，输血安全和血液偏型仍是摆在我们面前的两大难题。长期以来，因血型鉴定错误、识别错误等主客观因素引起的错误输血发生率居高不下，在科技发达的美国，错误输血发生率达1例/1.2万单位之多，其中，ABO血型不合的错误率为1例/3.3万单位，死亡率约1例/80万单位，是输血死亡的首要原因，比输血传播疾病(如HIV、HBV等)发生率(1例/200万单位)高得多。由于目前红细胞的保存期仅6周，在遇到长节假日、寒暑假等情况时采血量大大减少，很容易出现某种血型RBC供应告急而其它型RBC过剩甚至过期以至浪费的偏型现象。血液偏型不仅危及需要输血患者的生命安全，还造成巨大的浪费，美国统计达6％之多，这对本来就不充裕的血源来说无疑是雪上加霜。 

人类红细胞血型系统至少有29种，以ABO和Rh血型系统对输血安全最为重要。O型RBC不含A或B抗原，在RhD血型匹配的前提下，可安全地输给A、B、AB或O型的受血者，因此又被称为“通用型RBC”。应用通用型RBC可以极大的降低因ABO血型不合所致的输血反应，提高输血的安全性；解决血液偏型难题、减少血液浪费；简化血液采集、储存和配型程序，提高血站和医院输血科的工作效率，输血成本可节省近9％，据报道美国每年可节约7亿美元，保守估计我国每年可节约3亿元。美国红十字会血液中心科学主管Garratty预计未来几年内有望将A、B或AB型RBC转变成O型，届时将只储存和使用O型RBC，这将是输血医学的一场革命。此外，在战争、恐怖袭击、巨大灾难和其它突发事件中，及时安全的输血是救治伤员的一个关键因素。应用通用型RBC时，无需检查受血者的ABO血型，使用简便、迅速、安全，可增强应急输血保障能力，提高伤员的存活率。 

ABH血型抗原的本质为糖蛋白和糖脂，血型是由其末端糖链的种类及排列顺序决定的。O型RBC仅表达H抗原；B型RBC仅含B抗原，B抗原非还原端比H抗原多一个α-1，3半乳糖；A型RBC较为复杂，主要分为A1和A2两种亚型。在A1亚型红细胞上含有A和A1抗原，而A2型红细胞上仅含有A抗原。A2亚型RBC表面的人抗原比H抗原多一个α-1，3-N-乙酰半乳糖胺，而A1亚型RBC表面的A1抗原比A抗原多一个N-乙酰半乳糖胺α1→3(岩藻糖α1→2)半乳糖[GalNAcα1→3(Fucα1→2)Gal]三糖结构，我国A1亚型占A型99％以上；AB型RBC则含有A、B两种抗原。 

糖苷水解酶酶解法是目前实现通用型红细胞的最有前途的方法。糖苷水解酶存在广泛，种类丰富。国际生物化学和分子生物学联合会根据作用机制和酶切底物分类，已正式命名了150多类糖苷水解酶。这些糖苷水解酶部分来自高等动物、酵母、黑曲霉等，这些酶都是溶酶体酶，最适pH一般都在3.5-4.5之间，酶比活性一般不超过50U/mg，反应需要高浓度的酶蛋白(＞3mg/mL)和低pH值，酶解不完全，不能满足血型转变要求。部分糖苷水解酶来源于产气荚膜梭菌、沙门氏菌、肺炎球菌、双歧杆菌、空肠弯曲杆菌、黄杆菌、粪球菌等微生物中。α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)可分别将B抗原非还原端的α-1，3半乳糖酶切，生成O型红细胞表面的H抗原。 

国外文献(Liu QP，Sulzenbacher G，Yuan HP，et al.Bacterial glycosidasesfor the production of universal red blood cells[J].Nat Biotechnol，2007，25(3)：454-464.)提供了一种α-半乳糖苷酶，其来源于脆弱类杆菌，氨基酸残基序列为605个氨基酸，编码基因在基因库中登录序列号为AM109954.1(由1818个脱氧核苷酸组成)。该工具酶具有酶解B型红细胞功能，但酶比活仅为0.3U/mg。 

发明内容

本发明提供了一种可用于将人红细胞血型由B型转变为O型、由AB型转变为A型的高活性的α-半乳糖苷酶。 

本发明所提供的α-半乳糖苷酶，名称为α-gal，来源于脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)ATCC25285，是下述氨基酸残基序列之一： 

1)序列表中的SEQ ID NO：1； 

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有将人红细胞血型由B型转变为O型、由AB型转变为A型作用的蛋白质。 

序列表中的SEQ ID NO：1由572个氨基酸残基组成。 

编码所述α-半乳糖苷酶的基因可命名为α-gal，是下述核苷酸序列之一： 

1)序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列； 

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列； 

3)与序列表中SEQ ID NO：3限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有将人红细胞血型由B型转变为O型、由AB型转变为A型作用的核苷酸序列； 

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下与NC膜或PVDF膜杂交并洗涤。 

序列表中的SEQ ID NO：3由1719个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID NO：1氨基酸残基序列的蛋白质。 

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。 

本发明的另一个目的是提供一种可表达可溶性且有活性的α-半乳糖苷酶的方法。 

木发明所提供的表达上述α-半乳糖苷酶的方法，是将含有上述α-半乳糖苷酶基因的编码序列插入表达载体中，再将构建的重组表达载体导入宿主细胞，经表达、纯化得到高活性的α-半乳糖苷酶。 

所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。 

所述大肠杆菌具体可为BL2l(DE3)、BL2l(DE3，plysS)，E.coli JM109，E.coliHB101或E.coli Topl0等，优选为BL2l(DE3)。 

当所述宿主为大肠杆菌时，用于构建所述重组表达载体的出发载体可为现有的在上述大肠杆菌中表达外源基因的表达载体。 

所述重组表达载体具体可为将所述α-半乳糖苷酶基因的编码序列(自5′末端的第70至1785位核苷酸)插入pET-22b(+)的多克隆位点得到的重组表达载体pET-22b-α-gal。 

具体来讲，转化有pET-22b-α-gal的重组大肠杆菌为pET-22b-α-gal/大肠杆菌BL2l(DE3) 

上述重组表达载体和工程菌均可按照常规方法构建。 

培养含有本发明α-半乳糖苷酶基因编码序列的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

用上述方法表达的α-半乳糖苷酶以胞内可溶形式存在，需要对其进行纯化，具体方法包括以下步骤： 

1)预处理：用BufferA(20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，25mM NaCl，pH5.0)悬浮菌体沉淀，超声破碎菌体，离心，取上清液用0.45μm膜过滤； 

2)阳离子纯化：将上清液上样至BufferA已经平衡的阳离子柱Histrap^TMSP HP层析柱，用BufferA洗涤，用BufferB(20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，300mM NaCl，pH7.6)洗脱目的蛋白； 

3)阴离子纯化：将洗脱蛋白调pH至8.6，再用水将样品稀释至NaCl浓度为60mM，上样至BufferC(40mMTris-Hcl，10mMNaCl，pH8.6)平衡好的阴离子交换层析柱Hitrap Q^TM XL，接流出液及平衡液，测活有活性，保留；用BufferC洗涤，用BufferD(40mMTris-Hcl，300mMNaCl，pH8.6)洗脱，测活无活性； 

4)超滤：将流出液采用超滤的方法进行浓缩并更换缓冲液为酶解缓冲液(等渗的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH6.8)，得到经纯化的α-半乳糖苷酶。 

本发明还提供了一种用于将人红细胞血型由B型转变为O型、由AB型转变为A型血型转变的试剂盒。 

本发明所提供的试剂盒，包含有本发明的α-半乳糖苷酶α-gal。 

本发明提供一种α-半乳糖苷酶及其编码基因。实验证明，本发明的α-半乳糖苷酶α-gal能够在中性pH下高效、完全酶解人RBC表面的B抗原，使之转变为H抗原，从而实现B型RBC到O型RBC的转变。表明α-gal可将人红细胞血型由B型转变为O型。本发明的α-半乳糖苷酶α-gal用途广泛(可用于制备用于血型转变的试剂盒、通用型红细胞等)，表达及纯化方法简便、成本低廉，具有重要的临床及科学研究(可成为糖生物学研究的一个工具酶)意义，市场前景广阔。 

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 

附图说明

图1为α-gal全长基因的PCR产物电泳图谱 

图2为α-gal基因编码序列的PCR产物电泳图谱 

图3为pET-22b-α-gal的PCR鉴定图谱 

图4为pET-22b-α-gal/大肠杆菌BL2l(DE3)的表达图谱 

图5为纯化后的α-gal的SDS-PAGE图谱 

图6为用血型定型试剂检测酶解前后红细胞的血型显微照片 

图7为B型红细胞与人源O型血清主侧配血实验结果 

具体实施方式

下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中末注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。 

实施例1、α-半乳糖苷酶α-gal编码基因的克隆 

用Promega公司的基因组DNA提取试剂盒并按照说明书提取脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)ATCC25285(购于美国标准菌种收藏所(American TypeCulture Collection，ATCC))的基因组DNA。再以提取的基因组DNA为模板，用上游引物(序列为：5′-GC GGATCCATGAAGACAATCCTACTCTT-3′)和下游引物(序列为： 

5′GGAAGCTTTCGCTCTGAAATCTTCACGT-3′)进行PCR扩增。PCR条件为：先95℃预变性5min；然后95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸120s，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示(M：DL2000DNA Marker，l：α-gal的全长基因)，得到分子量约为1788bp的条带，与预期结果相符。回收并纯化PCR产物，将该PCR产物与pGEM-T Easy质粒(购自Promega公司)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pGEM-α-gal。以该重组质粒载体上的SP6和T7序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果与序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列(GenBank：AM109955.1，标准序列)相同。以pGEM-α-gal为模板，在上游引物为：5′-GGGGATCCTGATGACGACGACAAGGAGCGTGTTTATGACATT-3′(下划线处为BamH I酶切位点)，下游引物为：5′-GGAAGCTTTCGCTCTGAAATCTTCACGT-3′(下划线处为Hind III酶切位点)的引导下扩增α-半乳糖苷酶基因。PCR扩增条件为：先95℃预变性5min；然后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸120s，共30个循环；最后72℃延伸10min。利用BamH I和Hind III双酶切将α-半乳糖苷酶基因克隆到表达载体pET-22b(+)中，命名为pET-22b-α-gal。重组质粒经序列测定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)，利用含有氨苄青霉素的LB平板进行筛选，提取生长的菌落的质粒，利用PCR和DNA测序方法进行鉴定。 

测序结果表明本发明的α-半乳糖苷酶基因具有序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列属于重组DNA序列，由1719个碱基组成。序列表中SEQ ID NO：2第1-69位核苷酸为信号肽的编码序列，序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列的第70-1788位碱基，且在1050位的碱基序列由G变成了A，其编码序列表中SEQ ID NO：1氨基酸残基序列的蛋白质(与SEQ ID NO：2的编码蛋白相比去掉了N端1-23位的信号肽)。 

另外，本发明得到的SEQ ID NO：3的核苷酸序列与美国ZymeQuest公司的Liu等发表的文章(NAT BIOTECHNOL.2007 Apr；25：454-464)中记载的序列GenBank：AM109954.1不同，两者相似性仅为23.6％。 

实施例2、α-半乳糖苷酶α-gal的表达及纯化 

一、含有α-半乳糖苷酶α-gal基因编码序列的表达载体pET-22b(+)-α-gal的构建 

以pGEM-α-gal为模板，用上游引物(序列为：5′-GGGGATCCTGATGACGACGACAAGGAGCGTGTTTATGACATT-3′(具有BamH I酶切位点)，和下游引物(序列为：5′-GGAAGCTTTCGCTCTGAAATCTTCACGT-3′(具有Hind III酶切位点))PCR扩增α-半乳糖苷酶α-gal基因编码序列。PCR条件为：先95℃预变性5min；然后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸120s，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(M：DL2000DNA Marker，l：α-gal基因编码序列)，得到分于量约为1700bp的条带，与预期结果相符。按照TaKaRa公司的操作指南，用BamH I和HindIII双酶切PCR产物和质粒pET-22b(+)(Novagen公司)，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，用T4DNA Ligase(Promega公司)连接所得产物，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，用酶切法、PCR法和测序鉴定构建的质粒，鉴定结果表明获得了序列及插入位置均正确的含有α-gal基因编码序列的重组表达载体，命名为pET-22b-α-gal。其中，pET-22b-α-gal的PCR鉴定结果如图3所示(M：DL2000DNA Marker；l-8：质粒pET-22b-α-gal的菌落PCR结果)，得到约为1700bp的条带，与预期结果相符。 

二、α-半乳糖苷酶α-gal的表达 

将质粒pET 22b-α-gal转化大肠杆菌BL2l(DE3)感受态细胞，通过酶切法、PCR法和测序鉴定，筛选得到转入pET-22b-α-gal的阳性细胞，所得的阳性细胞即为可以表达目的蛋白的遗传工程宿主细胞，将该阳性菌称为pET-22b-α-gal/大肠杆菌BL2l(DE3)。

将pET-22b-α-gal大肠杆菌BL2l(DE3)划线接种于LB固体培养基(含氨卡青霉素60ug/mL)培养过夜，挑取单个菌落接种于3mL LB液体培养基(含氨卡青霉素60ug/ml)培养过夜，以1∶100的体积比稀释过夜培养菌液于LB液体培养基(含氨卡青霉素60ug/ml)中，于37℃、200转/分钟培养至菌液OD600达到0.8时，加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.25mmol/L，于37℃诱导表达4h。培养结束后，4℃离心收集菌体。pET-22b-α-gal/大肠杆菌BL21(DE3)的表达图谱如图4所示(1∶诱导菌的超声上清，2：诱导菌的超声沉淀)。 

三、α-半乳糖苷酶α-gal的纯化 

用本发明的方法对步骤二表达的α-半乳糖苷酶α-gal进行纯化，具体方法包括以下步骤： 

1)预处理：用1/10体积的BufferA(20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，25mM NaCl，pH5.0)悬浮菌体沉淀，超声破碎菌体。10000rpm离心20min，取上清液用0.45μm膜过滤。 

2)阳离子纯化：将上清液上样至BufferA已经平衡的阳离子柱(Histrap^TMSP HP层析柱)(购自GE公司)，用10倍柱体积的Buffer A(20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，25mM NaCl，pH5.0)洗涤，用Buffer B(20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，300mM NaCl，pH7.6)洗脱目的蛋白。 

3)阴离子纯化：将洗脱蛋白用1M Tris调pH至8.6，再用水将样品稀释至NaCl浓度为60mM，上样至Buffer C(40mMTris-Hcl，10mMNaCl，pH8.6)平衡好的阴离子交换层析柱(Hitrap Q^TM XL)(购自GE公司)，接流出液及平衡液，测活有活性，保留。用10倍柱体积的Buffer C洗涤，用Buffer D(40mMTris-Hcl，300mMNaCl，pH8.6)洗脱，测活无活性。 

4)超滤：将流出液采用超滤的方法进行浓缩并更换缓冲液为酶解缓冲液(等渗的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH6.8)。 

将纯化产物进行12％SDS-PAGE电泳鉴定，电泳结果如图5所示(1：纯化后的α-gal，2：相对分子质量标准116.0，66.2，45.0，35.0，25.0，18.4，14.4)，表明获得了分子量为64.6KD的目的条带，与预期结果相符。浓缩后的蛋白用BCA蛋白定量试剂盒(pierce公司)确定蛋白浓度，根据酶活定义用单糖底物(Galα-pNP substrate)对蛋白的活性进行测定。结果纯化后得到了电泳纯的重组细菌α-半乳糖苷酶，比活由纯化前的0.42U/mg提高到了2.1U/mg。 

另一方面，将本发明的纯化工艺与国外文献(Liu QP，Sulzenbacher G，Yuan HP，et al.Bacterial glycosidases for the production of universal red bloodcells[J].Nat Biotechnol，2007，25(3)：454-464.)进行比较，该文献介绍的纯化方法，在阳离子纯化前，还需经过亲和层析的步骤，操作繁杂，另外，本发明前处理中用超声破菌的方法，并对后续操作的控制参数进行了调整和优化，提高了纯化效果。文献中用单糖底物(Galα-pNP substrate)对纯化后的重组细菌α-半乳糖苷酶测活时其比活仅为0.3U/mg，说明本发明表达的重组细菌α-半乳糖苷酶的活性更好，是其7倍(2.1U/mg)。 

实施例3、用α-半乳糖苷酶α-gal将人红细胞由B型转变为O型 

分别用生埋盐水洗涤人B型红细胞(307医院输血科提供)2遍，用酶解缓冲液(等渗的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液，pH6.8)洗涤人B型红细胞2遍，取0.2mL压积B型红细胞，加入实施例2表达及纯化的α-半乳糖苷酶50ug，用酶解缓冲液补够0.5mL，26℃孵育2小时，其间不停摇晃使其均匀酶解。用抗B血型定型试剂(长春博德生物技术公司)和主侧交叉配血实验检测血型。 

1、用血型定型试剂检测红细胞血型 

取酶解前或酶解后的红细胞40ul，生理盐水洗涤2次，配成5％的细胞悬液，在载玻片上的两侧各加入20ul的抗B、抗A抗体(购自长春博德生物技术公司)，再加入等量的红细胞悬液，充分混匀，用显微镜观察结果。血型定型试剂检测结果如图6所示(1：酶解前B型红细胞，与抗B单抗强凝集，2：酶解后B型红细胞，抗B单抗不凝集)，α-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase)酶解前B型红细胞与抗A不凝集、与抗B强凝集。酶解后的B型红细胞与抗A、抗B均不凝集。本发明的α-gal将B型RBC表面的人抗原以及B型RBC表面的B抗原最外侧的α-1，3半乳糖苷键断裂，将α-半乳糖胺降解掉，使B抗原均转化为H抗原，从而说明α-gal为一种α-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase)。 

2、用主侧交叉配血实验检测酶解前后的红细胞 

取酶解前或酶解后的红细胞，用生埋盐水洗涤2次，配成5％的细胞悬液。在载玻片上的加入20ul的人源O型血清(307医院输血科提供)，再加入等量的红细胞悬液，充分混匀，用显微镜观察。结果如图7所示(1：酶解前B型红细胞与人源O型血清凝集，2：酶解后的红细胞与人源O型血清不凝集，呈O型)，发现酶解前的B型红细胞与O型血清凝集，酶解后的B型红细胞与O型血清不凝集，说明α-gal已将红细胞分别由B型转变O型。 

实施例4、用于将人红细胞血型由B型转变为O型、由AB型转变为A型血型转变的试剂盒 

将α-半乳糖苷酶α-gal(50mg)、四联袋(分别为空袋，装有250ml生理盐水的袋子，装有250ml酶解缓冲液的袋子，装有50ml红细胞保存液的袋子)、抗A血型定型试剂(50ul)、抗B血型定型试剂(50ul)共同包装，得到用于将人红细胞血型由B型转变为O型、由AB型转变为A型血型转变的试剂盒。 

序列表

<160>3

<210>1

<211>572

<212>PRT

<213>脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)ATCC25285

<400>1

Glu Arg Val Tyr Asp Ile Ser Gln Phe Gly Leu Lys Ala Asn Ser Lys

1               5                   10                  15

Lys Asn Ala Ser Pro Val Val Arg Lys Ala Ile Ala Lys Ile Lys Ala

            20                  25                  30

Glu Cys Arg Asp Gly Glu Lys Val Ile Leu Arg Phe Pro Ala Gly Arg

        35                  40                  45

Tyr Asn Phe His Glu Ala Gly Ser Thr Val Arg Glu Tyr Tyr Ile Ser

    50                  55                  60

Asn His Asp Gln Asp Asn Pro Lys Lys Val Gly Ile Ala Leu Glu Asp

65                  70                  75                  80

Met Lys Asn Leu Thr Ile Asp Gly Gln Gly Ser Glu Phe Val Phe Tyr

                85                  90                  95

Gly Arg Met Ile Pro Val Ser Leu Leu Arg Ser Glu Asn Cys Val Leu

            100                 105                 110

Lys Asn Phe Ser Ile Asp Phe Glu Gln Pro His Ile Ala Gln Val Gln

        115                 120                 125

Val Val Glu Asn Asp Pro Glu Lys Gly Ile Thr Phe Glu Pro Ala Pro

    130                 135                 140

Trp Val Asp Tyr Arg Ile Ser Lys Asp Ser Val Phe Glu Gly Leu Gly

145                 150                 155                 160

Glu Gly Trp Val Met Arg Tyr Ser Trp Gly Ile Ala Phe Asp Gly Lys

                165                 170                 175

Thr Lys His Val Val Tyr Asn Thr Ser Asp Ile Gly 6ys Pro Thr Lys

            180                 185                 190

Gly Ala Phe Glu Val Ala Pro Arg Arg Ile Cys Ser Pro Lys Trp Lys

        195                 200                 205

Asp Ala Arg Leu Val Pro Gly Thr Val Val Ala Met Arg Gly Trp Gly

    210                 215                 220

Arg Pro Thr Pro Gly Ile Phe Met Ser His Asp Val Asn Thr Ser Leu

225                 230                 235                 240

Leu Asp Val Lys Val His Tyr Ala Glu Gly Met Gly Leu Leu Ala Gln

                245                 250                 255

Leu Cys Glu Asp Ile Thr Leu Asp Gly Phe Gly Val Cys Leu Lys Gly

            260                 265                 270

Asp Asn Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Thr Gln Ala Asp Ala Thr His Phe

        275                 280                 285

Ser Gly Cys Lys Gly Lys Ile Val Ser Lys Asn Gly Leu Tyr Glu Gly

    290                 295                 300

Met Met Asp Asp Ala Ile Asn Val His Gly Thr Tyr Leu Lys Val Ile

305                 310                 315                 320

Lys Arg Val Asp Asp His Thr Leu Ile Gly Arg Tyr Met His Asp Gln

                325                 330                 335

Ser Trp Gly Phe Glu Trp Gly Arg Pro Gly Asp Asp Val Gln Phe Val

            340                 345                 350

Arg Ser Glu Thr Met Glu Leu Ile Gly Lys Gln Asn Gln Ile Thr Ala

        355                 360                 365

Ile Arg Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Ile Arg Gly Ala Arg Glu Phe Ser

    370                 375                 380

Ile Thr Phe Lys Glu Ala Ile Asp Pro Ala Ile Asn Glu Lys Ser Gly

385                 390                 395                 400

Phe Gly Ile Glu Asn Leu Thr Trp Thr Pro Glu Val Leu Phe Ala Gly

                405                 410                 415

Asn Thr Ile Arg Asn Asn Arg Ala Arg Gly Thr Leu Phe Ser Thr Pro

            420                 425                 430

Lys Lys Thr Val Val Glu Asp Asn Leu Phe Asp His Thr Ser Gly Thr

        435                 440                 445

Ala Ile Leu Leu Cys Gly Asp Cys Asn Gly Trp Phe Glu Thr Gly Ala

    450                 455                 460

Cys Arg Asp Val Thr Ile Arg Arg Asn Arg Phe Ile Asn Ala Leu Thr

465                 470                 475                 480

Asn Met Phe Gln Phe Thr Asn Ala Val Ile Ser Ile Tyr Pro Glu Ile

                485                 490                 495

Pro Asn Leu Lys Asp Gln Gln Lys Tyr Phe His Gly Gly Lys Asp Gly

            500                 505                 510

Gly Ile Val Ile Glu Asp Asn Glu Phe Asp Thr Phe Asp Ala Pro Ile

        515                 520                 525

Leu Tyr Ala Lys Ser Val Asp Gly Leu Ile Phe Arg Asn Asn Val Ile

    530                 535                 540

Lys Thr Asn Thr Glu Phe Lys Pro Phe His Trp Asn Lys Asp Arg Phe

545                 550                 555                 560

Leu Leu Glu Arg Val Thr Asn Val Lys Ile Ser Glu

                565                 570

<210>2

<211>1788

<212>DNA

<213>脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)ATCC25285

<400>2

atgaagacaa tcctactctt tgctctgagt ctgttgctct ctttatccgt gtcggatgtt     60

tgtgcacaag agcgtgttta tgacatttcc cagtttggct tgaaagctaa tagtaagaaa    120

aatgcgtctc ctgtggttcg taaggccata gcgaagatta aagctgaatg ccgtgatggg    180

gaaaaagtga tacttcgttt tcctgccgga cgttacaatt ttcatgaagc gggttctacc    240

gtgcgtgaat attatatttc caatcacgac caggacaatc ctaaaaaagt ggggattgcc    300

ttggaggata tgaaaaacct gactattgac gggcagggtt ccgaatttgt gttttatgga    360

agaatgattc cggtttcttt gcttcgttcg gagaattgtg tattgaaaaa ctttagcatt    420

gattttgaac aaccccatat tgctcaagta caagtggtag agaatgatcc ggaaaaagga    480

atcacgttcg aacctgcacc atgggtcgat taccgcatca gtaaggattc ggtattcgaa    540

gggctgggtg aaggctgggt gatgagatat tcatggggca ttgctttcga tggcaaaacg     600

aaacatgtgg tatataatac cagtgatatc ggttgtccta ccaagggagc ttttgaagtg     660

gctccccgcc ggatttgctc tccaaagtgg aaagatgcac gtctggtgcc cggcacagtg     720

gtggctatgc gtggatgggg acgtccgact ccgggcattt tcatgtcgca tgatgtgaat     780

acttccttgc tggatgtcaa agtacattat gccgaaggta tgggattgct ggcacagctt     840

tgcgaagata ttacgcttga tggttttgga gtctgcctga aaggcgataa tgatccgcgc     900

tattttacaa cgcaggcaga tgctacacac ttttccggat gtaagggaaa gattgtctca     960

aagaatggtt tgtatgaagg aatgatggat gatgccatta atgtacatgg tacgtatttg    1020

aaagtcatca agcgtgtgga tgatcatacg ctgataggac gttatatgca cgatcaatcc    1080

tggggctttg aatggggacg tccgggtgac gatgttcagt ttgtacgttc ggaaacaatg    1140

gagttgattg gcaagcagaa tcagattact gccattcgtc cgtatgataa gggtgagata    1200

cgaggtgccc gtgagttcag cattactttt aaagaggcaa tcgatcctgc tattaacgaa    1260

aaaagtggct ttggtattga aaacctgacg tggacccctg aagtgttatt tgccggtaat    1320

acgattcgta ataaccgtgc tcgcggtaca ctattcagta ctcctaaaaa gacggtggtg    1380

gaggacaatt tgtttgacca tacttccggt acggctatat tgctgtgtgg cgattgcaat    1440

ggctggtttg agacaggtgc ttgccgtgat gtcaccattc gtcgcaatcg ttttatcaat    1500

gcgcttacta atatgttcca gtttaccaat gcagtaatct ctatctatcc ggaaatacct    1560

aatctgaaag atcagcaaaa gtacttccat ggtggtaaag atggaggtat cgtgattgag    1620

gataatgaat tcgatacgtt tgatgcaccg attctttatg caaaatctgt agatgggttg    1680

atattccgta acaatgtgat caaaaccaat acagagttta agcccttcca ctggaataaa    1740

gatcgattct tgttggaacg agtgacaaac gtgaagattt cagagtga                 1788

<210>3

<211>1719

<212>DNA

<213>脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)ATCC25285

<400>3

gagcgtgttt atgacatttc ccagtttggc ttgaaagcta atagtaagaa aaatgcgtct     60

cctgtggttc gtaaggccat agcgaagatt aaagctgaat gccgtgatgg ggaaaaagtg    120

atacttcgtt ttcctgccgg acgttacaat tttcatgaag cgggttctac cgtgcgtgaa    180

tattatattt ccaatcacga ccaggacaat cctaaaaaag tggggattgc cttggaggat    240

atgaaaaacc tgactattga cgggcagggt tccgaatttg tgttttatgg aagaatgatt    300

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caaccccata ttgctcaagt acaagtggta gagaatgatc cggaaaaagg aatcacgttc    420

gaacctgcac catgggtcga ttaccgcatc agtaaggatt cggtattcga agggctgggt    480

gaaggctggg tgatgagata ttcatggggc attgctttcg atggcaaaac gaaacatgtg    540

gtatataata ccagtgatat cggttgtcct accaagggag cttttgaagt ggctccccgc    600

cggatttgct ctccaaagtg gaaagatgca cgtctggtgc ccggcacagt ggtggctatg    660

cgtggatggg gacgtccgac tccgggcatt ttcatgtcgc atgatgtgaa tacttccttg    720

ctggatgtca aagtacatta tgccgaaggt atgggattgc tggcacagct ttgcgaagat    780

attacgcttg atggttttgg agtctgcctg aaaggcgata atgatccgcg ctattttaca    840

acgcaggcag atgctacaca cttttccgga tgtaagggaa agattgtctc aaagaatggt    900

ttgtatgaag gaatgatgga tgatgccatt aatgtacatg gtacgtattt gaaagtcatc    960

aagcgtgtgg atgatcatac gctgatagga cgttatatgc acgatcaatc ctggggcttt   1020

gaatggggac gtccgggtga cgatgttcag tttgtacgtt cggaaacaat ggagttgatt   1080

ggcaagcaga atcagattac tgccattcgt ccgtatgata agggtgagat acgaggtgcc   1140

cgtgagttca gcattacttt taaagaggca atcgatcctg ctattaacga aaaaagtggc   1200

tttggtattg aaaacctgac gtggacccct gaagtgttat ttgccggtaa tacgattcgt   1260

aataaccgtg ctcgcggtac actattcagt actcctaaaa agacggtggt ggaggacaat   1320

ttgtttgacc atacttccgg tacggctata ttgctgtgtg gcgattgcaa tggctggttt   1380

gagacaggtg cttgccgtga tgtcaccatt cgtcgcaatc gttttatcaa tgcgcttact   1440

aatatgttcc agtttaccaa tgcagtaatc tctatctatc cggaaatacc taatctgaaa   1500

gatcagcaaa agtacttcca tggtggtaaa gatggaggta tcgtgattga ggataatgaa   1560

ttcgatacgt ttgatgcacc gattctttat gcaaaatctg tagatgggtt gatattccgt   1620

aacaatgtga tcaaaaccaa tacagagttt aagcccttcc actggaataa agatcgattc   1680

ttgttggaac gagtgacaaa cgtgaagatt tcagagtga                          1719

Claims (11)

1.一种α-半乳糖苷酶，是由序列表中的SEQ ID NO：1氨基酸残基序列表示的蛋白质。

2.编码权利要求1所述α-半乳糖苷酶的基因。

3.根据权利要求2所述编码权利要求1所述α-半乳糖苷酶的基因，是序列表中SEQ ID NO：3表示的DNA序列。

4.含有权利要求2所述基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

5.一种表达权利要求1所述α-半乳糖苷酶的方法，是将含有权利要求2所述α-半乳糖苷酶基因的编码序列插入表达载体中，再将构建的重组表达载体导入宿主细胞，经表达、纯化得到高活性的α-半乳糖苷酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌；所述大肠杆菌为BL2l(DE3)、BL2l(DE3，plysS)、E.coli JM109、E.coli HB101或E.coli Topl0。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为将所述α-半乳糖苷酶基因的编码序列插入pET-22b(+)的多克隆位点得到的重组表达载体pET-22b-α-gal。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：转化有pET-22b-α-gal的重组大肠杆菌为pET-22b-α-gal/大肠杆菌BL2l(DE3)。

9.根据权利要求5或6或7或8所述的方法，其特征在于：所述对表达的α-半乳糖苷酶进行纯化的过程，依次包括超声破菌的预处理、阳离子纯化、阴离子纯化和超滤的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述对表达的α-半乳糖苷酶 进行纯化的过程，具体包括以下步骤：

1)预处理：用Buffer A悬浮菌体沉淀，超声破碎菌体，离心，取上清液用0.45μm膜过滤；Buffer A由20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和25mM NaCl组成，pH5.0；

2)阳离子纯化：将上清液上样至BufferA已经平衡的阳离子柱Histrap^TM SP HP层析柱，用Buffer A洗涤，用Buffer B洗脱目的蛋白；Buffer B由20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和300mM NaCl组成，pH7.6；

3)阴离子纯化：将洗脱蛋白调pH至8.6，再用水将样品稀释至NaCl浓度为60mM，上样至Buffer C平衡好的阴离子交换层析柱Hitrap Q^TM XL，接流出液及平衡液，测活有活性，保留；用Buffer C洗涤，用Buffer D洗脱，测活无活性；Buffer C由40mMTris-Hcl和10mMNaCl组成，pH8.6；Buffer D由40mMTris-Hcl和300mMNaCl组成，pH8.6；

4)超滤：将流出液采用超滤的方法进行浓缩并更换缓冲液为酶解缓冲液，得到经纯化的α-半乳糖苷酶；酶解缓冲液为等渗的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH6.8。

11.一种用于将人红细胞血型由B型转变为O型血型转变的试剂盒，包含有权利要求1所述的α-半乳糖苷酶。 

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