CN103865882B - α-半乳糖苷酶的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α-半乳糖苷酶的单克隆抗体及其应用。本发明提供了保藏号为CGMCC？No.8794的小鼠杂交瘤细胞（mus？musculus？hybridoma）B7G11。还提供了由保藏号为CGMCC？No.8794的小鼠杂交瘤细胞（mus？musculus？hybridoma）B7G11产生的单克隆抗体。本发明的实验证明，本发明筛选得到1株能稳定分泌α-半乳糖苷酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞株B7G11，并制备得到α-半乳糖苷酶的单克隆抗体，将其与多抗一起用作双抗夹心ELISA法中的抗体，可以用来检测酶解转变的通用型红细胞中α-半乳糖苷酶的残留量。

Description

α-半乳糖苷酶的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种α-半乳糖苷酶的单克隆抗体及其应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶是从原核生物脆弱类杆菌（B.Fragilis）中克隆的新型α-半乳糖苷酶（专利号ZL201010189985.9），该酶可在中性环境下将B型红细胞改造成O型红细胞，且酶活高，需要的酶的剂量仅为0.005mg/ml压积红细胞，目前已成功将B型红细胞转变为O型，研究表明，O型红细胞因不含A和B抗原，在RhD血型匹配的前提下，可安全地输给A、B、AB或O型的受血者，因此又被称为“通用型红细胞”。输注通用型红细胞有以下优势：1.从根本上防止因血型不符引起的错误输血，大大提高输血安全性；2.大大节省血型鉴定所需的人力、物力和财力，降低输血成本；3.简化血液采集、储存和配型程序，提高工作效率；4.避免由于血液偏型而导致的血液浪费；5.增加稀有红细胞的利用率。而在战争及紧急状况下，及时输血是挽救严重失血患者的唯一手段，输注通用型红细胞无需考虑受血者的ABO血型，使用简便、迅速、安全，可增强应急输血保障能力，提高患者的存活率。因此，制备、储存和使用通用型红细胞，在临床输血和突发事件中均具有重要意义，这是未来输血医学的一场革命，也是未来输血医学发展的一个重要方向。

酶解转变的O型红细胞用于临床的关键问题之一是不能携带任何外源蛋白进入人体，因此检测酶解转变的O型红细胞中是否残留α-半乳糖苷酶及确定其残留量是必须解决的问题。酶联免疫吸附测定技术（ELISA）是检测微量蛋白的常规方法之一，可以检测到纳克（ng）级的微量蛋白。

进一步的研究表明，该酶不仅可以切除支链多糖末端的αGal（B抗原），也可以切除直链多糖末端的αGal，而异种抗原表位(Galαl-3Galβl-4GlcNAc-R和Galαl-3Galβl-4GlcNAcβ1-3Galβl-4Glc-R)正是以αGal为末端的直链多糖结构，因此该酶也是清除异种αGal抗原，降低移植引起的超急性排斥反应（HAR）的理想工具酶，具有广泛的应用前景。实验证实，该酶可以酶解清除动物红细胞、皮肤、腹膜、韧带等组织的αGal抗原，降低其免疫原性。这一技术必将在异种移植领域产生深远的影响。由此，这一检测方法可以应用在检测酶解获得的低免疫原性的动物组织中α-半乳糖苷酶的残留量的检测上。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株小鼠杂交瘤细胞（musmusculushybridoma）B7G11。

本发明提供的小鼠杂交瘤细胞（musmusculushybridoma）B7G11，其保藏号为CGMCCNo.8794。

由上述保藏号为CGMCCNo.8794的小鼠杂交瘤细胞（musmusculushybridoma）B7G11产生的单克隆抗体也是本发明保护的范围。

上述的单克隆抗体在检测α-半乳糖苷酶中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测α-半乳糖苷酶的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的单克隆抗体。

上述试剂盒还包括α-半乳糖苷酶多克隆抗体。

上述试剂盒中，所述α-半乳糖苷酶多克隆抗体为α-半乳糖苷酶多克隆兔抗体。

上述的单克隆抗体在制备检测待测样品是否含有α-半乳糖苷酶产品中的应用。

上述的应用或上述的试剂盒中，所述α-半乳糖苷酶源自脆弱类杆菌。

上述的应用或上述的试剂盒中，所述α-半乳糖苷酶的氨基酸序列为序列表中的序列2。

所述待测样品为酶解获得的通用型红细胞或酶解获得的低免疫原性异种组织；所述低免疫原性异种组织具体为皮肤、韧带、腹膜或骨骼。

将能稳定分泌α-半乳糖苷酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞株B7G11于2014年02月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCCNo.8794，其分类命名为小鼠杂交瘤细胞。

本发明的实验证明，本发明筛选得到1株能稳定分泌α-半乳糖苷酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞株B7G11，并制备得到α-半乳糖苷酶的单克隆抗体，将其与多抗一起用作双抗夹心ELISA法中的抗体，可以用来检测酶解转变的通用型红细胞中α-半乳糖苷酶的残留量。鉴于市场上没有针对脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶的商品化抗体出售，这一检测方法为酶解法制备的通用型红细胞中微量NAGA的检测提供了经济实用的检测试剂。

附图说明

图1为α-半乳糖苷酶纯化的SDS-PAGE图谱

图2为杂交瘤细胞株B7G11的染色体核型分析结果

图3为α-半乳糖苷酶腹水单抗的纯化分析图谱

图4为Westernblotting鉴定腹水单抗的特异性

图5为Westernblotting鉴定兔多抗的特异性

图6为双抗体夹心间接ELISA法检测微量α-半乳糖苷酶的标准曲线

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的α-半乳糖苷酶来源于脆弱类杆菌(Bacteriodesfragilis)ATCC25285，其氨基酸序列为序列表中的序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

实施例1、α-半乳糖苷酶单克隆的制备及其杂交瘤细胞株的获得

一、高纯度α-半乳糖苷酶的制备

重组菌BL21(DE3)/pet22b-gal为将重组载体pet22b-gal导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌；

重组载体pet22b-gal为将α-半乳糖苷酶gal的编码基因（序列1）插入pet22b载体的BamHⅠ和HindⅢ位点间得到的载体。

重组菌BL21(DE3)/pet22b-gal在LB平板（Amp+）上划线活化菌种，第二天挑取单克隆培养过夜，第三天转接扩大培养至D600为0.8时加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导目的蛋白的表达，诱导时间为2h。诱导结束后发酵液4℃，9000r/min离心5min，回收菌体沉淀。用BufferA（20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，25mMNaCl，pH5.0）悬浮菌体，超声破碎法裂解菌体后离心收集上清（4℃，9000r/min离心20min），上清用缓冲液A稀释3倍后用0.45μm的膜过滤后备用将上清液上样至BufferA平衡过的阳离子层析柱(Hitrap^TMSP-HP)，用10倍柱体积的BufferA洗柱，用BufferB(20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，0.3MNaCl，pH7.6)洗脱目的蛋白。

将洗脱的蛋白用水稀释至NaCl浓度为60mM，再用1MTris调pH至8.5，上样至BufferC（40mMTris-Hcl，10mMNaCl，pH8.5）平衡过的阴离子交换层析柱（Hitrap^TMQXL），接上样流出液，用10倍柱体积的BufferC洗柱，用BufferD（40mMTris-Hcl，300mMNaCl，pH8.5）洗脱,通过测α-半乳糖苷酶活性判断目的蛋白峰，得到纯化α-半乳糖苷酶。

将纯化α-半乳糖苷酶进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示，其中1为超声上清、2为阳离子层析后的样品、3为阴离子层析后的样品、4为相对分子质量标准，可以看到纯化得到的α-半乳糖苷酶为单一条带。

将洗脱液用截留分子量为10KD的超滤管超滤浓缩并更换缓冲液为等渗的酶解缓冲液（柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH6.8），得到纯化的α-半乳糖苷酶。

二、杂交瘤细胞株的获得

1、免疫

利用上述一制备的纯化α-半乳糖苷酶作抗原，采用微型搅拌器冰浴乳化抗原，初次免疫采用福氏完全佐剂，50-100ug/只，皮下多点注射，间隔3周。第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周。第三次免疫，计量同上，不加佐剂，于生理盐水中腹腔注射，7-10d后采血测其效价，检测免疫效果，间隔2-3周。加强免疫，剂量10ug为宜，腹腔或静脉注射。3d后，取脾融合。

2、饲养细胞的制备

融合前一天制备饲养细胞。采用与免疫小鼠相同的品系，用6～10周龄的BALB/c小鼠。将未免疫小鼠拉颈处死，浸泡于75%酒精，消毒3～5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。用无菌注射器注入6～8ml培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。放入10ml离心管，1200rpm离心5-6min。用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数为1×10⁵/ml。加入96孔板，100μl/孔。放入37℃CO₂孵箱培养。

细胞融合在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。细胞数约为2×10⁸。取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5min，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，在无菌条件下取出脾脏，用不完全培养液洗涤一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2×10⁸左右。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8min。弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略微松动。在室温下融合：⑴30s内加入37℃预热的1ml45%PEG（Merck，分子量4000），含5%DMSO，边加边搅拌；⑵作用90s，若冬天室温较低时可延长至120s；⑶加预热37℃不完全培养液，终止PEG作用，连续每2min内分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml。离心800rpm，6min。弃上清，先用6ml左右的20%小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切忌不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液10ml一块96孔板。将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5%CO₂孵箱培养。

3、阳性单克隆细胞株筛选及鉴定

建立间接ELISA方法，第10天左右，肉眼可见细胞克隆，用间接ELIS方法检测杂交瘤细胞培养上清液，筛选出阳性单克隆细胞株。挑取阳性单克隆细胞株，进行细胞计数，采用有限稀释法（10细胞/ml）进行亚克隆。用间接ELISA方法和有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行3次克隆，直至筛选结果100%阳性为止。经过3次亚克隆筛选，获得3株阳性单克隆细胞株A6E11，B7G11，C3F12。

选取效价最高的单克隆细胞株B7G11（效价为1:256）为能稳定分泌抗α-半乳糖苷酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞株B7G11。

阳性单克隆细胞株染色体核型分析:对细胞株B7G11传代培养36-48小时后,按照常规秋水仙碱阻断法,将处于对数生长期的杂交瘤细胞用秋水仙素处理后,经裂解、固定和染色,在油镜下观察细胞染色体形态和数目。结果显示杂交瘤细胞有96条染色体(图2),接近小鼠脾细胞染色体(40条)和SP2/0细胞染色体(平均60条左右)之和,提示筛选的细胞为小鼠脾细胞和SP2/0的杂交瘤细胞。说明获得了稳定的杂交瘤细胞株。

将能稳定分泌α-半乳糖苷酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞株B7G11于2014年02月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCCNo.8794，其分类命名为小鼠杂交瘤细胞。

三、腹水单抗的制备

1、腹水单抗的制备

BALB/c小鼠每只腹腔注射0.5ml液体石蜡，一周后每只腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞B7G11，观察小鼠状态，待肿瘤生长10d后收集腹水,离心，取上清液，为α-半乳糖苷酶单克隆抗体（腹水）。

用间接ELISA法检测α-半乳糖苷酶单克隆抗体的效价，具体如下：

1）包被抗原α-半乳糖苷酶：以10μg/ml上述一制备的纯化α-半乳糖苷酶包被酶联板，4℃湿盒中孵育过夜；

2）洗板：将已包被α-半乳糖苷酶的酶标板孔中的液体倒入水槽或废弃容器中，用PBST洗3次。洗完后，将板条在折叠吸水纸上拍几次，使孔中不留液体；

3）封闭：加入封闭液（2%BSA），150μl/孔。37℃孵育半小时；

4）加样：弃去孔内封闭液,加入倍比稀释的免疫小鼠腹水单抗，37℃孵育40分钟；

5）洗板：同前；

6）加入HRP标记羊抗鼠抗体：加入100μl稀释好的HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)（产品目录号：ZB-2305,北京中杉金桥；1:5000稀释），37℃放置孵育半小时；

7）洗板：同前；

8）加底物：底物现用现配（TMB反应液配制：底物缓冲液：9ml，TMB底物：1ml，0.75%H₂O₂:32μl）。每孔100μl，室温25℃放置5-10min，目测观察反应情况。10、加终止液：2mol/L的H₂SO₄终止反应；每孔50μl，检测OD450值。

结果为α-半乳糖苷酶单克隆抗体的效价为1：1×10⁶。

2、腹水单抗的纯化

将α-半乳糖苷酶单克隆抗体腹水1ml用平衡缓冲液20倍稀释后经10000r/min高速离心10min,用0.45μm的圆盘滤器过滤,用HiTraprProteinA柱(5mL预装柱)进行亲和纯化:平衡缓冲液为TBS缓冲液(50mMTris,150mMNaCl,0.05%叠氮钠),洗脱缓冲液为pH值2.7和1.9的甘氨酸缓冲液（3.75g/L）,洗脱流速3ml/min,pH值2.7洗脱3个柱体积未出现目标蛋白峰，用pH值1.9的洗脱4个柱体积，出现目标蛋白峰，马上用200μl中和缓冲液（1mol/L的Tris-HCl缓冲液,pH8.0）中和,得到纯化的α-半乳糖苷酶单克隆抗体，加50%甘油分装保存于-70℃。

用间接ELISA测纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体的效价，结果为纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体的效价为1:1×10⁵。

检测其浓度，纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体的蛋白浓度是0.78mg/ml。

将纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体通过非还原SDS-PAGE检测，结果如图3所示，M、相对分子质量标准；1、上样液；2、上样流出液；3、纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体（左侧为还原型SDS-PAGE，右侧为非还原型SDS-PAGE），可以看到纯化后的抗体呈单一条带，还原SDS-PAGE后抗体分成2条带，分别是抗体的重链和轻链。

3、Westernblotting鉴定单抗与α-半乳糖苷酶的结合特异性

通过Westernblotting检测纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体与α-半乳糖苷酶的结合特异性，

结果如图4所示，1为EasySeeWesternMarker；2为含α-半乳糖苷酶（来源于脆弱类杆菌）的菌体超声上清，可以看出，单抗与脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶特异性结合。

实施例2、α-半乳糖苷酶单克隆抗体在检测微量来源于脆弱类杆菌的α-半乳糖苷酶中的应用

一、α-半乳糖苷酶多克隆抗体的制备

利用实施例1的一制备的纯化α-半乳糖苷酶作抗原，采用微型搅拌器冰浴乳化抗原，初次免疫采用福氏完全佐剂，第2、3次免疫采用福氏不完全佐剂，乳化完全后经脊柱两旁皮下注射新西兰兔，每只6-8点，每隔2周后于上述部位不同点再次注射免疫兔，共免疫3次，每次免疫的抗原用量按0.5mg/kg体重计算，每只兔子一般约注射1.5mg左右，收集血清。

利用酶联免疫吸附测定法(间接ELISA法)测定集血清效价，以无关兔血清（注射PBS）作为阴性对照。

结果为：二次免疫后测得血清效价为1:1×10⁵，三次免疫后血清效价达到1:1×10⁶。

免疫三次后，用股动脉插管的方法对麻醉的兔子放血，3000r／min离心15min分离血清，为α-半乳糖苷酶多克隆抗体；将血清分装后于一80℃保存。

α-半乳糖苷酶多克隆抗体的蛋白浓度是50.7mg/ml，效价是1：1×10⁶。

α-半乳糖苷酶多克隆抗体通过非还原SDS-PAGE可以看到纯化后的抗体呈单一条带，还原SDS-PAGE后抗体分成2条带，分别是抗体的重链和轻链。

α-半乳糖苷酶多克隆抗体经HiTraprProteinA柱纯化后，得到纯化α-半乳糖苷酶多克隆抗体，其蛋白浓度为0.7mg/ml，效价为1:5×10⁴。

用纯化α-半乳糖苷酶多克隆抗体分别与脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶和红细胞裂解物反应。

结果如图5所示，1为脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶（氨基酸序列为序列2，原核表达获得）；2为红细胞裂解物（1倍体积的O型红细胞加入9倍体积的红细胞裂解液（BD公司），室温放置裂解15min。），可以看出，α-半乳糖苷酶的多抗只与脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶反应，与红细胞裂解物无交叉反应。

二、检测微量α-半乳糖苷酶方法的建立（双抗体夹心间接ELISA法）

1、包被兔多抗：以10μg/ml纯化α-半乳糖苷酶多克隆抗体（兔抗体）包被酶联板，4℃湿盒中孵育过夜；

2、洗板：将已包被多抗的酶标板孔中的液体倒入水槽或废弃容器中，用PBST洗3次。洗完后，将板条在折叠吸水纸上拍几次，使孔中不留液体；

3、封闭：加入封闭液（2%BSA），150μl/孔。37℃孵育半小时；加入实施例1的一制备的α-半乳糖苷酶：加入不同浓度的α-半乳糖苷酶（从μg级依次倍比稀释至pg级），37℃孵育半小时；

4、洗板：同前；

5、加入实施例1制备的纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体：加入100μlα-半乳糖苷酶单克隆抗体（1:2000稀释），37℃孵育半小时；

6、洗板：同前；

7、加入HRP标记羊抗鼠抗体：加入100μl稀释好的HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)（ZB-2305,北京中杉金桥；1:5000稀释），37℃放置孵育半小时；

8、洗板：同前；

9、加底物：底物现用现配。每孔100μl，室温25℃放置5-10min，目测观察反应情况。

TMB反应液配制（现用现配）：

底物缓冲液：9ml

TMB底物：1ml

0.75%H₂O₂:32μl

10、加终止液：

2mol/L的H₂SO₄终止反应；每孔50μl，检测OD450值。

制备标准曲线，结果如图6所示，看出，本方法的检测下限为1ng/ml。

（注：本方法经过3次独立的重复，标准曲线一致，检测下限一致。）

对照：多抗对残留酶的检测:

1）、包被不同浓度的α-半乳糖苷酶：（从μg级依次倍比稀释至ng级）4℃湿盒中孵育过夜；

2）、洗板：将已包被多抗的酶标板孔中的液体倒入水槽或废弃容器中，用PBST洗3次。洗完后，将板条在折叠吸水纸上拍几次，使孔中不留液体；

3）、封闭：加入封闭液（2%BSA），150μl/孔。37℃孵育半小时；分别加入100μl不同稀释浓度上述一制备的纯化α-半乳糖苷酶多克隆抗体（将0.7mg/mlα-半乳糖苷酶多克隆抗体分别按1：400，1：800，1：1600，1：3200，1：6400，1：12800稀释），37℃孵育半小时；

4）、洗板：同前；

5）、加入HRP标记羊抗兔抗体：加入100μl稀释好的HRP标记山羊抗兔IgG(H+L（GGHL-90P,ImmunologyConsultantsLaboratory；1:5000稀释），37℃放置孵育半小时；

6）、洗板加底物等其余步骤同前；

制备不同多抗稀释度的标准曲线，结果显示检测下限为10ng/ml。

（注：本方法经过3次独立的重复，标准曲线一致，检测下限一致。）

三、α-半乳糖苷酶单克隆抗体检测来源于脆弱类杆菌的α-半乳糖苷酶

1、利用α-半乳糖苷酶单克隆抗体检测通用型红细胞上残留α-半乳糖苷酶

1）、通用型红细胞的制备

健康人B型或AB型血离心去除上清液，4倍体积的酶解缓冲液（250mM甘氨酸，pH6.8）洗2遍，加入α-半乳糖苷酶（0.005mg/mlpRBCs）或NAGA（0.015mg/mlpRBCs）与α-半乳糖苷酶（0.005mg/mlpRBCs），26℃缓慢上下振荡孵育2小时，待血型转变为O型后停止孵育，用PBS按1:4体积洗涤红细胞4次，2000rpm离心弃上清，保留第四次洗涤上清液和洗涤后的红细胞以备检测。

2）、残留酶的检测

洗涤上清液直接用上述二的间接ELISA法检测，红细胞用红细胞裂解液按1:9体积裂解后检测。

检测结果见表1。

表1为通用型红细胞制备过程中残留α-半乳糖苷酶的检测

2、利用α-半乳糖苷酶单克隆抗体检测α-半乳糖苷酶处理的动物皮肤上残留α-半乳糖苷酶的检测

1）动物皮肤的酶解

动物皮肤（如牛或猪）皮肤用PBS缓冲液洗2遍后，加入10mg/L的α-半乳糖苷酶室温震荡酶解过夜，然后用5倍酶解体积的PBS缓冲液震荡清洗3遍，每次2小时。

2）残留酶的检测

将皮肤（厚度0.5-1mm）切成1cm²的小块，剪碎后研磨成匀浆，用1mlPBS悬浮。然后用上述二的间接ELISA法检测。

检测结果：残留酶为15.5±3.3ng/cm²。

3、利用α-半乳糖苷酶单克隆抗体检测α-半乳糖苷酶处理的动物腹膜上残留α-半乳糖苷酶的检测

1）动物腹膜的酶解

动物（如牛或猪）腹膜用PCS缓冲液洗2遍后，加入10mg/L的α-半乳糖苷酶室温震荡酶解过夜，然后用5倍酶解体积的PBS缓冲液震荡清洗3遍，每次2小时。

2）残留酶的检测

将腹膜切成1cm²的小块，剪碎后研磨成匀浆，用1mlPBS悬浮。然后用上述二的间接ELISA法进行检测。

检测结果：残留酶为17.8±5.6ng/cm²。

4、利用α-半乳糖苷酶单克隆抗体检测α-半乳糖苷酶处理的骨骼上残留α-半乳糖苷酶的检测

1）动物骨骼的酶解

动物（如牛或猪）骨骼用PCS缓冲液洗2遍后，加入10mg/L的α-半乳糖苷酶室温震荡酶解过夜，然后用5倍酶解体积的PBS缓冲液震荡清洗3遍，每次2小时。

2）残留酶的检测：

称取1g的骨骼小块，剪碎后研磨成匀浆，用1mlPBS悬浮。然后用上述二的间接ELISA法进行检测。检测结果：残留酶为55±9.6ng/g。

Claims (8)

1.小鼠杂交瘤细胞(musmusculushybridoma)B7G11，其保藏号为CGMCCNo.8794。

2.权利要求1所述的小鼠杂交瘤细胞(musmusculushybridoma)B7G11产生的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测α-半乳糖苷酶中的应用；

所述α-半乳糖苷酶的氨基酸序列为序列表中的序列1。

4.一种用于检测α-半乳糖苷酶的试剂盒，包括权利要求2所述的单克隆抗体；所述α-半乳糖苷酶的氨基酸序列为序列表中的序列1。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括α-半乳糖苷酶多克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述α-半乳糖苷酶多克隆抗体为α-半乳糖苷酶多克隆兔抗体。

7.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测待测样品是否含有α-半乳糖苷酶的试剂或试剂盒中的应用。

8.根据权利要求3或7所述的应用或权利要求4-6中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述α-半乳糖苷酶源自脆弱类杆菌。