CN102154217B - 一种重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物工程技术领域，涉及一种重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体及其应用。本发明重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.4502的杂交瘤细胞3H4分泌。该杂交瘤细胞系3H4，2010年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4502。本发明杂交瘤细胞系3H4能够稳定的分泌重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体，该抗体具有良好的特异性，能够与鸡骨钙素蛋白特异性结合，可用于检测鸡骨钙素蛋白，用该抗体制备的鸡骨钙素检测试剂特别是鸡骨钙素ELISA检测试剂盒可检测鸡血清骨钙素的含量，有利于监测骨骼生长情况和诊断鸡骨骼疾病的试剂及其他与能引起BGP异常变化的疾病。

Description

一种重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及一种重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体及其应用。

背景技术

骨钙素(BGP)主要由骨和牙齿中的成骨细胞合成并分泌，是体内最丰富的非胶原骨基质蛋白，经肝和肾水解，最后由肾排除。BGP的基因首先翻译成一个88个氨基酸残基的骨钙素原，骨钙素原移走信号肽后，γ-羧基化识别位点与依赖维生素K的羧化酶结合发生羧化反应，从无活性的谷氨酸残基转化为有活性的γ-羧基谷氨酸，此后前肽移走，使骨矿化。鸡骨钙素(chBGP)由49个氨基酸组成，其特点是17，21，24位有3个羧化的谷氨酸残基以及23、29位形成一个分子内二硫健，在Ca²⁺存在条件下，羧化后chBGP 16～25位氨基酸残基形成一紧密的α螺旋结构，这种构象使3个谷氨酸残基突向同一方向排列，促进其与羟磷灰石结合。BGP表达具有组织特异性，最初研究表明BGP的mRNA仅见于骨组织，由成熟的骨细胞合成并分泌，但1994年Thiede等发现在小鼠骨髓巨核细胞和外周血小板也可表达BGP。BGP的表达还具有发育阶段特异性，成骨细胞的成熟过程分为三个阶段，即成骨细胞增殖期、细胞外基质成熟期及基质矿化期。只有在基质矿化期开始后，BGP基因才被诱导表达。BGP是骨转化的特异性标志物，成骨细胞分泌的BGP大部分沉积在骨基质中，约20％进入血液循环，血清中BGP水平变化，直接反映成骨细胞活性，比血液中碱性磷酸酶和尿中羟脯氨酸更具特异性。但是BGP的天然蛋白分子量小，不易获得，一定程度上制约了人们对骨钙素的研究及利用，不利于BGP抗体的制备，也制约了BGP的应用及生理特征的研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供该单克隆抗体的应用。

一种杂交瘤细胞系3H4，2010年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4502。

一种重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.4502的杂交瘤细胞3H4分泌。

本发明重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组鸡骨钙素成熟蛋白(rchBGP)的制备：

a)重组质粒载体的构建：取鸡胫骨，液氮保存，Trizol法提取鸡胫骨总RNA。根据GenBank报道鸡BGP序列(U10578)，设计成熟肽基因的特异性引物，5’端引物P1：5’-CAGGAATTCCACTACGCCCAGGAC-3’(SEQ ID NO.2)；3’端引物P2：5’-ATACTCGAGAGACGGGGCCGTAGAAG-3’(SEQ ID NO.3)，用于扩增鸡BGP成熟肽基因cDNA(SEQ ID NO.1)。PCR产物连接于pMD-18T载体，获得重组克隆载体pMD-18T-chBGP，pMD-18T-chBGP和pET-32a(+)分别用EcoR I和Xho I双酶切后，用T4DNA连接酶进行连接，获得重组载体pET-32a(+)-chBGP。

b)rchBGP原核表达和纯化：构建好的原核表达质粒pET-32a(+)-chBGP转化到E.coilRosetta-gami(DE3)pLyS宿主菌中表达。表达产物经His-trap纯化小柱纯化(GE公司生产)。纯化后的重组蛋白用Western-blotting进行鉴定。重组产生的蛋白可与羟基磷灰石进行特异性结合，表明重组产生的rchBGP具有天然BGP的α螺旋结构。

(2)rchBGP单克隆抗体及其制备：得到的重组蛋白rchBGP与弗氏佐剂混合后免疫BALB/C小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合，经抗原表位识别位点分析和特异性鉴定，最终筛选1株能稳定分泌抗鸡BGP单克隆抗体的杂交瘤细胞3H4，抗体分型结果显示属IgG1亚类。

本发明所述的重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体在制备鸡骨钙素检测试剂中的应用。

其中，所述的鸡骨钙素检测试剂为鸡骨钙素ELISA检测试剂盒。

鸡骨钙素ELISA检测试剂盒的研制：以表达的重组鸡骨钙素成熟蛋白(rchBGP)为包被抗原，鸡骨钙素标准蛋白为竞争的半抗原，两者与一定量的本发明重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体发生竞争性反应，经羊抗鼠IgG二抗级联放大，TMB显色后，根据标准曲线和样品的OD₄₅₀值定量测样品中鸡骨钙素的含量。

所述的鸡骨钙素检测试剂为检测鸡骨钙素的Western-blotting检测试剂盒或Western-blotting检测试剂。如利用本发明重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体用western-blotting检测chBGP在组织中存在部位及含量变化。

有益效果：

本发明杂交瘤细胞系3H4能够稳定的分泌重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体，该抗体具有良好的特异性，能够与鸡骨钙素蛋白特异性结合，可用于检测鸡骨钙素蛋白，用该抗体制备的鸡骨钙素检测试剂特别是鸡骨钙素ELISA检测试剂盒可检测鸡血清骨钙素的含量，有利于监测骨骼生长情况和诊断鸡骨骼疾病的试剂及其他与能引起BGP异常变化的疾病。

生物材料保藏信息

杂交瘤细胞系3H4，2010年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4502，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

说明书附图

图1、成熟肽基因cDNA的PCR扩增结果。M DNA marker，1～4RT-PCR结果。

图2、质粒pMD18-T-chBGP经EcoR I和Xhol I双酶切鉴定图；

M：DNAmarker，1～2：pMD18-T-chBGP经EcoR I和Xhol I双酶切结果。

图3、重组pET-32a(+)-chBGP在E.coli Rosetta-gami(DE3)pLyS中表达产物的SDS-PAGE鉴定结果；

M：蛋白marker，1为未经IPTG诱导的pET-32a(+)-chBGP表达产物；2为IPTG诱导pET-32a(+)表达产物；3～8分别为pET-32a(+)-chBGP经IPTG诱导4h、3h、2h、1.5h、1h及0.5h的表达产物。

图4、重组pET-32a(+)-chBGP在E.coli Rosetta-gami(DE3)pLyS中表达产物的SDS-PAGE鉴定结果；

M：蛋白marker，1为未经IPTG诱导pET-32a(+)-chBGP表达产物；2为IPTG诱导pET-32a(+)表达产物；3～9分别为pET-32a(+)-chBGP经浓度分别为0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1mM、1.5mM及2mM的IPTG诱导表达的产物。

图5、使用His抗体，用western-blotting鉴定pET-32a(+)-chBGP菌液表达蛋白；1诱导表达pET-32a(+)-chBGP菌液经SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色鉴定结果，2Mark，3目的蛋白Western-blotting鉴定结果。

图6、表达蛋白存在形式的鉴定；

1：超声裂解前的诱导表达菌体pET-32a(+)-chBGP；2：超声裂解后沉淀；3：超声裂解后上清液；4：未经诱导的pET-32a(+)-chBGP菌体；5：经IPTG诱导的pET-32a(+)菌体。

图7、western-blotting鉴定本发明重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体的特异性；

1：诱导表达pET-32a(+)-chBGP菌液经SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色鉴定结果，2：Mark，3：本发明单抗检测重组鸡骨钙素成熟蛋白的Western-blotting鉴定结果。

图8、鸡骨钙素蛋白标准曲线。

具体实施方案

实施例1重组鸡骨钙素成熟蛋白(rchBGP)的制备

1.1目的基因的获得和目的基因克隆载体的获得

取鸡胫骨，液氮保存，Trizol法提取鸡胫骨总RNA。选取OD_260/280在1.8以上的进行反转录。RNA 2μg，Oligo(dT18)1μL，用RNase-free H₂O补足到10μL，75℃水浴5min，冰浴2min；加入5×Buffer 4μL，dNTP 2μL，RNase抑制剂0.5μL，M-MLV反转录酶0.5μL，RNase-freeH₂O 3μL 42℃1h，95℃反应5min，4℃保存备用。根据GenBank报道的鸡BGP序列(U10578)，设计成熟肽基因的特异性引物P1、P2，并分别插入EcoR I、Xhol I酶切位点，5’端引物P1：5’-CAGGAATTCCACTACGCCCAGGAC-3’(SEQ ID NO.2)，3’端引物P2：5’-ATACTCGAGAGACGGGGCCGTAGAAG-3’(SEQ ID NO.3)，用于扩增成熟肽基因cDNA，长度为166bp，PCR反应条件为：94℃预变性5min后，按下述参数循环40次：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s。40个循环后再72℃延伸10min。冷却至4℃，结束反应。取10μL产物行2％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果，见图1。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳分离，经初步鉴定，回收后插入pMD-18T载体(大连TAKARA公司)中，并转入到TOP10中，提取质粒，经酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测，可见一大、一小两个片段(图2)，与预期结果相符。阳性质粒送与博雅生物技术公司进行测序。

1.2目的基因表达载体的构建

pMD-18T-chBGP和pET-32a(+)(NOVAGEN公司，下同)分别用EcoR I和Xho I双酶切后。用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物转入到TOP10中，提取质粒，经PCR和酶切鉴定后，阳性质粒送与英俊生物技术公司进行测序。

1.3目的蛋白的表达

构建好的原核表达质粒pET-32a(+)-chBGP和空载体pET-32a(+)分别转化到Rosetta-gami(DE3)pLyS感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，将新鲜培养的细菌按1∶100的比例接于100mL LB液中，37℃剧烈震荡值菌液OD600为0.6时，加入0.1mMIPTG，并于不同的时间收集1mL菌液，进行表达产物的检测(图3)，同时收集未诱导的菌液作为阴性对照。在大约26kd处可见明显的阳性条带，且在3～4h时表达量达到高峰。

构建好的原核表达质粒pET-32a(+)-chBGP和空载体pET-32a(+)转化到Rosetta-gami(DE3)pLyS感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，将新鲜培养的细菌按1∶100的比例接于100mLLB液中，37℃剧烈震荡值菌液OD600为0.6时，加入0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1mM、1.5mM及2mM IPTG，并于不同的时间收集1mL菌液，进行表达产物的检测(图4)，同时收集未诱导的菌液作为阴性对照。由图可见诱导剂的浓度对表达产物的影响不大，故可选择较低浓度诱导剂进行诱导表达。

1.4Western-blot鉴定目的蛋白

未纯化的表达产物(Marker左右对称点样)经SDS-PAGE后，Marker连其中一个样品经考马斯亮蓝染色，另一泳道的蛋白样品转印到硝酸纤维素膜上，5％的PBST脱脂奶粉室温封闭1h；PBST洗膜3次，每次10min；1∶500稀释(稀释液：5％的PBS脱脂奶粉)鼠抗His-IgG为一抗4℃孵育过夜；PBST洗膜3次，每次10min；1∶5000稀释(稀释液：5％的PBS脱脂奶粉)HRP-兔抗鼠IgG为二抗室温孵育1h；PBST洗膜3次，每次10min；HRP化学发光检测，在大约25～35kD处看见一明显阳性条带，证明表达产物具有良好的抗原性(图5)。

1.5目的蛋白的大量表达和纯化

构建好的原核表达质粒pET-32a(+)-chBGP和空载体pET-32a(+)转化到Rosetta-gami(DE3)pLyS宿主菌中，将新鲜培养的细菌按1∶100的比例接于2000mL LB液中，37℃剧烈震荡值菌液OD600为0.6时，加入0.1mM IPTG，诱导表达3h。将诱导表达菌液5000r/min离心15min，弃上清，用PBS液重悬、洗涤后5000r/min离心10min，弃上清。用20mLHis-trap纯化小柱纯化(GE公司生产)结合液(20mM Na₃PO₄·12H₂O；0.5MNaCl；20mM咪唑)再次重悬菌体后，置于-20℃冰箱中，反复冻融3次。超声破碎菌体，工作10s，间歇5s，99次，重复1次，破碎后的菌液经12000r/min离心15min分别收集上清和沉淀。取上清100μL加入100μL 2×SDS-PAGE混合(图6泳道3)，将收集的所有沉淀用20mL结合液(20mM Na₃PO₄·12H₂O；0.5M NaCl；20mM咪唑)重悬，取100μL加入100μL 2×上样缓冲液混合(图6泳道2)，并取超声破碎前菌体，未诱导表达菌体，诱导的空载体菌体做对照经15％SDS-PAGE凝胶电泳，鉴定表达产物的存在形式(图6)，表明该蛋白主要以溶解形式存在于上清液中。

表达产物经His-trap纯化小柱纯化(GE公司生产)，具体步骤为上清液用0.45μm滤膜过滤。10倍体积的超纯水清洗His蛋白纯化柱；10倍体积的结合液平衡His蛋白纯化柱，将处理过的上清液加到His蛋白纯化柱，弃掉流出液。10倍体积的结合液加到His蛋白纯化柱，弃掉流出液。洗脱液(20mMNa₃PO₄·12H₂O；0.5MNaCl；0.2M咪唑)洗脱蛋白样品，并收集流出液，0.45μm滤膜过滤。纯化后的蛋白经15％的SDS-PAGE凝胶电泳，鉴定表达产物纯化效果。

1.6蛋白活性鉴定

羟基磷灰石在100μg的置于1mL的PBS液中，倍比稀释成12个管，每个管中加入2mg/mL的chBGP 10μL，37℃，200rpm/min震荡5min，3000rpm/min离心5min。间接ELISA法检测上清液免疫原性，每个样品做3个重复，其中一抗为鼠抗His-IgG，二抗为HRP-兔抗鼠IgG。显色后，用酶标仪(波长450nm)测定OD值。结果显示随着羟基磷灰石的增加，被结合的chBGP增加，上清液所含的chBGP减少，该重组蛋白能与羟基磷灰石结合，表明基因工程产生的重组鸡骨钙素具有天然构象。

实施例2chBGP单克隆抗体的制备

6只雌性6周龄BALB/C小鼠，200μg/mL的表达蛋白溶液0.5mL与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化后，皮下多点注射，每点0.2mL。3周后，200μg/mL的表达蛋白溶液0.5mL与弗氏不完全佐剂皮下多点注射，每点0.3mL。3周后，加强免疫剂量和方法同前。1周后，用ELISA检测血清抗体效价，再过1周，1000μg/mL的表达蛋白溶液，不加佐剂，肌肉注射，3d后，取脾融合。

融合前二周复苏骨髓瘤细胞SP2/0，为了确保所用的骨髓瘤对HAT筛选培养液的敏感性，在培养液中加入8-氮杂鸟嘌呤(8-AG)筛选一次，以防止细胞的突变返祖。融合前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2×10⁵/mL。融合前一天，2只6周龄BALB/C小鼠拉颈处死，无菌操作，制备小鼠腹腔巨噬细胞的。取加强免疫3d后的脾脏，制备细胞悬液：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成悬液后计数。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶4的比例混合在一起，在50mL塑料管内用不完全培养液洗一次，1000r/min离心10min。弃上清，轻轻弹击离心管底，使两种细胞充分混匀成糊状。在室温下融合。30s内加入37℃预热的1mL 45％PEG(聚乙二醇)，分子质量2000Da含5％二甲基亚砜DMSO，边加边搅拌，作用90s。加37℃预热的不完全培养液，终止PEG作用，前30s加入1mL，后30秒加入3mL，然后在一分钟内加入16mL不完全培养液。离心，1000r/min，10min。弃上清，先用6mL左右20％胎牛血清RPMI 1640HAT培养液轻轻混悬。根据所用96孔培养板的数量，补加HAT完全培养液，10mL一块96孔板。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μL/孔，37℃、5％CO₂孵箱培养。3d后吸取100μL上清液弃掉补加100μL1×HAT培养液，培养两周后，改用HT培养液，再维持两周，改用一般培养液。

在杂交瘤细胞布满孔地1/10面积时，即开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。采用间接ELISA方法筛选阳性抗原。

将经反复两次检测均为阳性的杂交瘤细胞进行亚克隆化。利用有限稀释法克隆杂交瘤细胞。连续进行5次亚克隆，共筛选出6株细胞，分别是3D10，3D6，3H4，4E4，三F1，二F1，克隆细胞进行冻存，当杂交瘤细胞长满孔底时，一孔就可以冻一只冻存管。冻存时从室温依次放入4℃冰箱1h，-20℃2h，液氮上层过夜，次日放入液氮液面下。

3个月后进行复苏，制备腹水。取12只10周龄的健康BALB/c小鼠，腹腔注射0.5mL液体石蜡，7d后收集杂交瘤细胞，离心，去上清，加入生理盐水，调节细胞密度至1×10⁶个/mL，每只小鼠注射1.0mL，每一单克隆细胞株接种2只。接种细胞10d后，收集腹水，用2.5mL注射器针头，无菌刺入腹腔，抽出腹水2mL离心管中，并使劲晃动防止腹水凝结。1500r/min，离心10min，吸取上清，以0.45μL的滤器过滤除菌。测定其效价效价为105～106，使用Sigma的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂鉴定抗体亚型，结果显示6株杂交瘤细胞所分泌的单抗均属于IgG1亚类。

实施例3单克隆抗体抗原识别位点分析

采用测相加指数法，用ELISA鉴定单克隆抗体抗原识别位点。以最适抗原浓度包被酶标板，洗涤后分别加入任意两两相加的单抗腹水。37℃孵育1h，洗涤后分别加入HRP-羊抗鼠IgG，37℃孵育h，洗涤后显色，分别测定OD₄₅₀值，每个样做3个重复。按公式分别AI＝[2A12/(A1+A2)-1]×100％计算6株单抗两两叠加后的AI值。AI＜10％抗原表位相似，AI＝10％～50％抗原表位有差异，AI＞50％抗原表位不同。经鉴定3D10，3D6属于相似的抗原识别位点；3H4，4E4属于相似的抗原识别位点；三F1，二F1属于相似的抗原识别位点。

实施例4单克隆抗体特异性和稳定性鉴定

ELISA鉴定：用相同表达载体和表达菌表达的其他蛋白(非鸡BGP蛋白)为阴性对照，鉴定该抗体的特异性，该蛋白与本发明所获得的蛋白区别在于插入的基因不同，但标签蛋白和其它载体蛋白完全相同，用此类蛋白(可以任意选用，本人用了两种蛋白做阴性对照，结果相似)可以有效的鉴定制备的单克隆抗体是否仅针对所要表达的蛋白，而不是标签蛋白。ELISA鉴定发现只有3H4对用相同表达体系表达的其他蛋白显色反应阴性。鸡BGP标准蛋白做包被抗原，检测抗体的特异性，3H4、4E4及3D10对鸡BGP标准蛋白显色反应阳性。最终筛选得到3H4杂交瘤细胞株。通过辛酸-硫酸铵沉淀法对3H4杂交瘤细胞株小鼠腹水进行纯化，纯化后分管保存，纯化后抗体效价为1∶2048000。将杂交瘤细胞株3H4送交CGMCC保藏，保藏号为CGMCC No.4502。

Western-blotting鉴定抗体特异性：未纯化的pET-32a(+)-chBGP菌液(Mark左右对称点样)经SDS-PAGE后，Mark连同泳道1的pET-32a(+)-chBGP菌液经考马斯亮蓝染色，另一泳道的pET-32a(+)-chBGP菌液，转印到硝酸纤维素膜上，5％的PBST脱脂奶粉室温封闭1h；PBST洗膜3次，每次10min；1∶300稀释(稀释液：5％的PBS脱脂奶粉)3H4杂交瘤细胞培养上清液(本发明单抗)为一抗4℃孵育过夜；PBST洗膜3次，每次10min 1∶5000稀释(稀释液：5％的PBS脱脂奶粉)HRP-兔抗鼠IgG为二抗室温孵育1h；PBST洗膜3次，每次10min；HRP化学发光检测(图7)，在大约25～35kD处看见一明显的阳性条带，证明该单克隆抗体能特异性的与重组鸡BGP发生抗原抗体反应。其结果与His抗体鉴定结果十分相似。证明该单克隆抗体能特异性的与chBGP发生抗原抗体反应。

稳定性鉴定：冻存的杂交瘤细胞3个月后复苏细胞，仍能分泌大量抗体，细胞在体外连续传代培养两个月细胞效价仍保持在1/4000。

实施例5抗体检测试剂盒的制备

棋盘法确定抗原的最佳包被浓度及抗体的最佳稀释浓度，将rchBGP以碳酸盐缓冲液做一系列梯度稀释(8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL及0.25μg/mL)；每一稀释度加一列酶标孔，每孔100μL；4℃包被过夜，洗涤拍干，加入封闭液，300μL/孔；将本发明单抗做1∶1000、1∶4000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000、1∶256000、1∶512000、1∶1024000及1∶2048000稀释，每孔加一行酶标孔，每孔100μL；加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔100μL，进行间接ELISA测定，确定包被抗原及单抗最佳工作浓度。最后确定包被抗原的最佳稀释浓度为1μg/mL，抗体工作浓度为1∶64000。

将rchBGP按照1μg/mL进行稀释，分别在3种不同的条件下包被酶标板(1)4℃包被过夜；(2)37℃包被3h；(3)37℃包被3h后，再4℃包被过夜，进行间接ELISA测定，根据OD450值确定最佳包被条件，最终确定的最佳的包被条件为4℃包被过夜。

在确定了包被条件以后，分别用以PBS稀释的1％BSA、3％BSA、5％脱脂奶粉、10％脱脂奶粉、1％明胶及10％FCS作为最佳封闭液，进行间接ELISA测定，根据OD450值确定最佳封闭液，最佳封闭液为10％脱脂奶粉。

将rchBGP按照1μg/mL进行稀释；4℃包被过夜；10％脱脂奶粉封闭后；PBS稀释一抗和标准品后提前37℃预混，水浴2h，加入到洗涤好的包被板上；PBS稀释一抗和标准品后不预后，直接加入到洗涤好的包被板上。根据OD450值确定一抗竞争条件。确定最佳的一抗竞争条件PBS稀释的一抗和标准品不预混直接加入到洗涤好的包被板上。

将rchBGP按照1μg/mL进行稀释；4℃包被过夜；10％脱脂奶粉封闭后；分别选择PBS、PBST及5mmol CaCl₂的0.05mol Tris-HCl稀释一抗，将稀释好的单抗，标品分别加入洗涤好的包被板上，37℃孵育1.5h，进行间接竞争ELISA测定，根据OD450值确定最佳单抗稀释液是PBST。

将rchBGP按照1μg/mL进行稀释；4℃包被过夜；10％脱脂奶粉封闭后；PBST稀释一抗，将稀释好的单抗，标品分别加入到洗涤好的包被板上，37℃孵育0.5h，1h，1.5h进行间接竞争ELISA测定，根据OD450值确定最佳孵育时间为0.5h。

间接竞争ELISA的操作程序：将rchBGP按照1μg/mL进行稀释，4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min，拍干；10％脱脂奶粉封闭1h，PBST洗涤3次，每次5min，拍干；用PBST稀释标准品，加标准品或样品50μL，再加50μL 1∶32000稀释的抗体工作液，混匀，37℃反应1.5h，PBST洗涤5次，每次3min，拍干；加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃反应0.5h，PBST洗涤5次，每次3min，拍干；每孔加100μL TMB 37℃显色5min；2M H₂SO₄终止显色，酶标仪读取OD450值。

以鸡骨钙素质量为横坐标，不同质量浓度所测的间接竞争ELISA OD450值为纵坐标绘制标准曲线(图8，表1)。

标准曲线的斜率是47.71，截距是100.01。浓度过大时，相关系数较低，结果表明，试剂盒对标准品检测准确可靠。ELISA试剂盒的检测下限，以10复孔的零孔值按计算，其最低检测下限为10ng/mL。

表1标准品竞争ELISA试剂盒检测值

实施例6抗体的应用

将新鲜采集的鸡血清37℃孵育1h，4℃3000rpm离心30min，取血清。间接竞争ELISA试剂盒检测该鸡血清骨钙素含量，同时做6个复孔，其OD₄₅₀值分别为0.709，0.726、0.668、0.674、0.655及0.655，平均值为0.6812，批内差异为2.96％，根据标准曲线测得该样品为骨钙素含量为98.60ng/mL。

实施例7抗体的应用

Western-blotting检测鸡BGP特异性：鸡BGP标准品经SDS-PAGE后，转印到硝酸纤维素膜上，本发明单抗为一抗，1∶200稀释，4℃孵育过夜，在大约5kD处可见一明显的阳性条带。证明该单克隆抗体能特异性地与鸡BGP发生抗原抗体反应。

Claims (5)

1.一种杂交瘤细胞3H4，2010年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4502。

2.一种鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体，由权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.4502的杂交瘤细胞分泌。

3.权利要求2所述的鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体在制备鸡骨钙素检测试剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的鸡骨钙素检测试剂用于鸡骨钙素ELISA检测试剂盒。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的鸡骨钙素检测试剂用于鸡骨钙素Western-blotting检测试剂盒。

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