CN103614355B - 利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法 - Google Patents

利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103614355B
CN103614355B CN201310455457.7A CN201310455457A CN103614355B CN 103614355 B CN103614355 B CN 103614355B CN 201310455457 A CN201310455457 A CN 201310455457A CN 103614355 B CN103614355 B CN 103614355B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
beta
culture
galactosidase enzymes
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201310455457.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103614355A (zh
Inventor
高兆建
陈宏伟
张桂英
孙会刚
王东星
于洋
杜永凯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xuzhou University of Technology
Original Assignee
Xuzhou University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xuzhou University of Technology filed Critical Xuzhou University of Technology
Priority to CN201310455457.7A priority Critical patent/CN103614355B/zh
Publication of CN103614355A publication Critical patent/CN103614355A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103614355B publication Critical patent/CN103614355B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法，其特征在于选用枯草芽孢杆菌(<i>Bacillus？subtilis</i>)？F69作为β-半乳糖苷酶的生产菌种，先经摇瓶震荡法发酵制备发酵液或者发酵罐通风发酵法制备发酵液、再经β-半乳糖苷酶酶制剂制备，而得到β-半乳糖苷酶酶制剂成品。本发明生产的β-半乳糖苷酶耐热性好，即80℃保温60min、残余酶活达85％；酶活性高，即发酵液酶活达216U/ml；酶回收率高，即总酶活回收率大于80%、酶冻干粉酶活力单位达到2512U/g；且操作工艺简单、生产效率高和生产成本低，适合于大批量生产。

Description

利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法。
背景技术
β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)，又称乳糖酶，广泛存在于各种动物、植物及微生物中，其来源十分丰富。其中细菌中的乳酸菌、环状芽抱杆菌、大肠杆菌、产气肠细菌等；霉菌中的米曲霉、黑曲霉、炭色曲霉等；酵母中的脆壁克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母等；放线菌中的天蓝色链霉菌等均产β-半乳糖苷酶。由于微生物的快速生长和高效代谢的生物学特性，使其成为工业化酶制剂的主要来源。β-半乳糖苷酶在乳品工业中具有重要用途：第一，它能够水解牛乳和其他乳制品中的乳糖，消除人们在饮用乳制品时出现的乳糖消化吸收差，以致产生腹胀、腹泻等乳糖不耐症现象；第二，有效解决液态牛奶在超高温瞬时杀菌时，牛乳中乳糖的存在会导致胶状物的产生以致堵塞管道的问题；第三，β-半乳糖苷酶的转糖苷活力还可将乳糖水解生成的半乳糖转移给果糖受体生成乳果糖，即目前颇受关注的功能性低聚糖，促进双歧杆菌增殖，调整肠道菌群平衡，增强机体免疫作用；同时乳糖经乳糖酶水解生成其组分单糖-葡萄糖和半乳糖，不仅大大改善了其加工性能，而且甜度提高，发酵性能好，更易被小肠消化吸收，提高人体免疫力。
目前β-半乳糖苷酶已经从多种细菌、真菌中分离到，但应用于生产中的β-半乳糖苷酶耐热性较差，仅能在常温下工作，而且水解反应速度较慢，所需时间较长，鲜奶容易受到细菌污染而发生变质，极大限制了它的应用范围。耐热β-半乳糖苷酶与不耐热的相比有众多优势，它可能在巴氏消毒温度水解乳糖，温度高水解速度快，所需时间短，需要酶量减少，同时乳糖的水解过程也是巴氏消毒过程，防止杂菌污染。因此，如何克服现有技术的不足，加快研发耐热性好的β-半乳糖苷酶产品已成为当今生物工程技术领域中亟待解决的重点难题之一。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足而提供一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法，本发明生产的β-半乳糖苷酶不仅耐热性好，而且β-半乳糖苷酶的回收率高，可大大降低生产成本，从而实现大规模生产耐热性β-半乳糖苷酶的目的。
根据本发明提出的一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法，其特征在于选用属于微生物类群的保藏号为CGMCCNo.5699的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)F69作为β-半乳糖苷酶的生产菌种，先经摇瓶震荡法发酵制备发酵液或者发酵罐通风发酵法制备发酵液、再经β-半乳糖苷酶酶制剂制备，而得到β-半乳糖苷酶酶制剂成品，具体步骤如下：
所述的摇瓶震荡法发酵制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵种子液制备和⑶摇瓶液体发酵；
所述的发酵罐通风发酵法制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵一级种子液制备、⑶二级种子液制备和⑷发酵罐气升式发酵；
所述的β-半乳糖苷酶酶制剂制备：包括⑴发酵液分段超滤、⑵发酵液硫酸铵盐析、⑶透析、⑷超滤浓缩、⑸添加保护剂、⑹粗酶冷冻干燥和⑺固体粗酶粉碎。
本发明选用属于微生物类群的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)F69作为β-半乳糖苷酶的生产菌种，该菌种于2012年1月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCCNo.5699。目前，枯草芽孢杆菌已被广泛用来生产功能性食品和饲用微生态制剂，是食品、饲料中允许使用的微生物，具有极高的安全性，是一种潜在的益生菌。
本发明与现有技术相比其显著优点在于:一是本发明生产的β-半乳糖苷酶耐热性好，即80℃保温60min、残余酶活达85％；酶活性高，即发酵液酶活达216U/ml；酶回收率高，即总酶活回收率大于80％、酶冻干粉酶活力单位达到2512U/g；二是本发明以豆饼粉、蛋白胨和玉米浆为主要原料，生产成本低；三是酶制剂制备过程采用离心、超滤、硫酸铵盐析、透析和冷冻干燥等步骤，成品杂质含量低，达到食品添加剂标准的要求；四是生产过程无废固物处理问题，对环境不造成污染；五是操作工艺简单、生产效率高和生产成本低，适合于大批量生产。
附图说明：
图1是本发明提出的以一种枯草芽孢杆菌为菌种，经由摇瓶震荡法发酵制备发酵液，再制备β-半乳糖苷酶酶制剂的工艺流程方框示意图。
图2是本发明提出的以一种枯草芽孢杆菌为菌种，经由发酵罐通风发酵法发酵制备发酵液，再制备β-半乳糖苷酶酶制剂的工艺流程方框示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明实施例所用菌种为属于微生物类群的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)F69，该菌种均已公开，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCCNo.5699。若实施例中未特别指明的技术手段即为本领域技术人员公知的常规手段。
本发明提出的一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法，选用属于微生物类群的保藏号为CGMCCNo.5699的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)F69作为β-半乳糖苷酶的生产菌种，先经摇瓶震荡法发酵制备发酵液或者发酵罐通风发酵法制备发酵液、再经β-半乳糖苷酶酶制剂制备，而得到β-半乳糖苷酶酶制剂成品，具体步骤如下：
所述的摇瓶震荡法发酵制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵种子液制备和⑶摇瓶液体发酵，其中：
⑴菌种活化：将保藏号为CGMCCNo.5699的枯草芽孢杆菌菌种F69在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线活化，然后倒置于40-42℃恒温培养箱中进行活化培养，培养时间15-24h；其中：
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、琼脂粉1.5g和蒸馏水100mL，培养条件pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min；
⑵种子液制备：从⑴的活化好的菌种中挑取单菌落，接入装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，培养温度40-42℃、摇床震荡培养18-24h，震荡频率160-200r/min；其中：
种子培养基：乳糖0.5-1g、蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl0.5g、K2HPO40.02g，加蒸馏水至100ml，培养条件pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min；
⑶摇瓶液体发酵：将⑵中的种子液，以4-8％的接种量接入装有150-200ml摇瓶发酵培养基的1000mL三角瓶中，三角瓶塞采用乳胶塞，发酵温度40-42℃，摇床发酵18-24h，摇床转速160-200r/min；然后将发酵温度降至35-37℃，继续震荡发酵培养，发酵时间达到40-48h时；发酵终止，测得发酵液酶活为152U/ml；其中：
摇瓶发酵培养基：豆饼粉10-15g、玉米浆15g、乳糖5-10g、葡萄糖3-4g、硫酸铵3-5g、牛肉膏2-5g、NaCl2-5g、KH2PO40.1g、MgSO4·7H2O0.04g、CaCl20.2-0.5g、吐温802g和蒸馏水1000mL，培养条件pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min。
所述的发酵罐通风发酵法制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵一级种子液制备、⑶二级种子液制备和⑷发酵罐气升式发酵，其中：
⑴菌种活化：将保藏号为CGMCCNo.5699的枯草芽孢杆菌菌种F69在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线活化，然后倒置于40-42℃恒温培养箱中进行活化培养，培养时间15-24h；其中：
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、琼脂粉1.5g和蒸馏水100mL，培养条件pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min；
⑵一级种子液制备：从⑴的活化好的平板中挑取单菌落，接入装液量为50mL的容量为250mL的一级种子培养基中，培养温度40-42℃，摇床震荡培养18-24h，震荡频率160-200r/min；其中：
一级种子培养基配方：乳糖5-8g、葡萄糖8-10g、蛋白胨5-10g、牛肉膏2-5g、NaCl2-5g、KH2PO40.1g和蒸馏水1000mL，培养条件：pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min；
⑶二级种子液制备：从⑵中培养好的一级种子液，接入装有150-200mL二级种子培养基的1000mL锥形瓶中，接种量为6-10％，培养温度40-42℃摇床震荡培养16-20h，震荡频率160-200r/min；其中：
二级种子培养基配方：豆饼粉5-8g、玉米浆10-15g、乳糖8-12g、蛋白胨2-5g、NaCl2-5g、K2HPO40.02g、加蒸馏水至1000mL，培养条件：pH7.2、灭菌温度121℃，灭菌时间20min。
⑷发酵罐气升式发酵：将10L发酵罐发酵培养基装入15升的气升式发酵罐中，发酵罐夹套升温至95℃，再将蒸汽直接通入液体发酵培养基中，灭菌温度121℃、灭菌时间30min，将温度逐渐降至40-45℃，将⑶所得的二级种子液按照5-8％的重量接入发酵罐液体发酵培养基中，初始发酵16-20h，发酵条件：发酵温度40-42℃，发酵培养基初始pH6.5-6.8，无菌空气通风比1:0.6-0.8(V/V)，发酵16-20h后，发酵温度降为32-37℃，无菌空气通风比1:0.4-0.6(V/V)，pH调节至7.0-7.5；发酵结束，测得发酵液β-半乳糖苷酶活力为216U/ml；
发酵过程中的补料操作：所补加培养基为乳糖溶液，浓度为200g/L；发酵过程中检测乳糖浓度，由乳糖浓度变化确定补料时机，当发酵液中乳糖浓度低于1.8g/L时，开始补料，补料体积每次50-100ml，共补料2-3次；
发酵罐发酵培养基配方：豆饼粉12-15g、玉米浆10-15g、乳糖10-15g、硫酸铵3-5g、牛肉膏2-5g、NaCl2-5g、KH2PO40.1g、MgSO4·7H2O0.04g、CaCl20.3-0.5g、吐温802g和蒸馏水1000mL，培养条件：pH6.5-6.8、灭菌温度121℃，灭菌时间30min。
所述的选用属于微生物类群的保藏号为CGMCCNo.5699的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)F69作为β-半乳糖苷酶的生产菌种，该β-半乳糖苷酶酶制剂制备：包括⑴发酵液分段超滤、⑵发酵液硫酸铵盐析、⑶透析、⑷超滤浓缩、⑸添加保护剂、⑹粗酶冷冻干燥和⑺固体粗酶粉碎，其中：
⑴发酵液分段超滤：将摇瓶震荡法发酵制备的发酵液或者发酵罐通风发酵法制备的发酵液离心去菌体，冷冻离心机4℃、8000r/min、离心10min，弃去沉淀，保留上清；采用超滤膜超滤，第一次采用截留分子质量为70-80kDa的超滤膜过滤，保留滤出液；第二次用15-25kDa的超滤膜过滤，滤液浓缩3-5倍，保存截留液；调节超滤后的截留液pH至6.5；
⑵发酵液硫酸铵盐析：然后向其中加入硫酸铵粉末至30％饱和度，4℃环境下静置10-12h，然后4℃下8000r/min离心10min，弃去沉淀，保留上清；然后调节上清液pH8.0，添加硫酸铵至饱和度70-80％，4℃静置10-12h后冷冻离心机4℃离心后收集沉淀蛋白；去离子水充分溶解沉淀，得到β-半乳糖苷酶粗酶溶液；
⑶透析：将粗酶溶液装入透析袋中4℃下透析10-12h，每隔2-3h换水一次，经饱和BaCl2检测透析完全后进行超滤浓缩；
⑷超滤浓缩：将粗酶液通过20kDa的超滤膜，浓缩6-10倍；
⑸粗酶液添加保护剂：向浓缩后的粗酶液中加入保护剂,该保护剂为2-3％的脱脂奶粉、1-3％的蔗糖和0.1-0.2％的山梨酸钾；
⑹粗酶冷冻干燥：将加入保护剂的粗酶液充分分散后，在-20℃下冷冻8-10h；在真空度30-40Pa、温度-35℃下冷冻15-18h；得到β-半乳糖苷酶酶制剂成品。
经对本发明所得的β-半乳糖苷酶酶制剂成品检测，主要指标为：β-半乳糖苷酶酶制剂成品收率高达80％以上；成品为棕褐色固体粉末、可以溶于水、无异味；成品热稳定性好，35℃下，保存6个月后酶活力仍大于90％；酶活力得到2512U/g；酶催化活性强，最适作用温度在55℃-75℃；本成品最适作用pH值范围在5.5-7.5。
本发明经反复试验验证，取得了满意的应用效果。
以上具体实施方式及实施例是对本发明提出的一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法的技术思想的具体支持，不能以此来限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在本技术方案基础上所做的任何等同变化或等效的改动，均仍属于本发明技术方案保护的范围。

Claims (4)

1.一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法，其特征在于选用属于微生物类群的保藏号为CGMCCNo.5699的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)F69作为β-半乳糖苷酶的生产菌种，先经摇瓶震荡法发酵制备发酵液或者发酵罐通风发酵法制备发酵液、再经β-半乳糖苷酶酶制剂制备，而得到β-半乳糖苷酶酶制剂成品，具体步骤如下：
所述的摇瓶震荡法发酵制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵种子液制备和⑶摇瓶液体发酵；
所述的发酵罐通风发酵法制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵一级种子液制备、⑶二级种子液制备和⑷发酵罐气升式发酵；
所述的β-半乳糖苷酶酶制剂制备：包括⑴发酵液分段超滤、⑵发酵液硫酸铵盐析、⑶透析、⑷超滤浓缩、⑸添加保护剂、⑹粗酶冷冻干燥和⑺固体粗酶粉碎。
2.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法，其特征在于所述的摇瓶震荡法发酵制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵种子液制备和⑶摇瓶液体发酵，其中：
⑴菌种活化：将保藏号为CGMCCNo.5699的枯草芽孢杆菌菌种F69在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线活化，然后倒置于40-42℃恒温培养箱中进行活化培养，培养时间15-24h；其中：
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、琼脂粉1.5g和蒸馏水100mL，培养条件pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min；
⑵种子液制备：从⑴的活化好的菌种中挑取单菌落，接入装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，培养温度40-42℃、摇床震荡培养18-24h，震荡频率160-200r/min；其中：
种子培养基：乳糖0.5-1g、蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl0.5g、K2HPO40.02g，加蒸馏水至100ml，培养条件pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min；
⑶摇瓶液体发酵：将⑵中的种子液，以4-8％的接种量接入装有150-200ml摇瓶发酵培养基的1000mL三角瓶中，三角瓶塞采用乳胶塞，发酵温度40-42℃，摇床发酵18-24h，摇床转速160-200r/min；然后将发酵温度降至35-37℃，继续震荡发酵培养，发酵时间40-48h；
摇瓶发酵培养基：豆饼粉10-15g、玉米浆15g、乳糖5-10g、葡萄糖3-4g、硫酸铵3-5g、牛肉膏2-5g、NaCl2-5g、KH2PO40.1g、MgSO4·7H2O0.04g、CaCl20.2-0.5g、吐温802g和蒸馏水1000mL，培养条件pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min。
3.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法，其特征在于所述的发酵罐通风发酵法制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵一级种子液制备、⑶二级种子液制备和⑷发酵罐气升式发酵，其中：
⑴菌种活化：将保藏号为CGMCCNo.5699的枯草芽孢杆菌菌种F69在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线活化，然后倒置于40-42℃恒温培养箱中进行活化培养，培养时间15-24h；其中：
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、琼脂粉1.5g和蒸馏水100mL，培养条件pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min；
⑵一级种子液制备：从⑴的活化好的平板中挑取单菌落，接入装液量为50mL的容量为250mL的一级种子培养基中，培养温度40-42℃，摇床震荡培养18-24h，震荡频率160-200r/min；其中：
一级种子培养基配方：乳糖5-8g、葡萄糖8-10g、蛋白胨5-10g、牛肉膏2-5g、NaCl2-5g、KH2PO40.1g和蒸馏水1000mL，培养条件：pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min；
⑶二级种子液制备：从⑵中培养好的一级种子液，接入装有150-200mL二种子培养基的1000mL锥形瓶中，接种量为6-10％，培养温度40-42℃摇床震荡培养16-20h，震荡频率160-200r/min；其中：
二级种子培养基配方：豆饼粉5-8g、玉米浆10-15g、乳糖8-12g、蛋白胨2-5g、NaCl2-5g、K2HPO40.02g、加蒸馏水至1000mL，培养条件：pH7.2、灭菌温度121℃，灭菌时间20min；
⑷发酵罐气升式发酵：将10L发酵罐发酵培养基装入15升的气升式发酵罐中，发酵罐夹套升温至95℃，再将蒸汽直接通入液体发酵培养基中，灭菌温度121℃、灭菌时间30min，将温度逐渐降至40-45℃，将⑶所得的二级种子液按照5-8％的重量接入发酵罐液体发酵培养基中，初始发酵16-20h，发酵条件：发酵温度40-42℃，发酵培养基初始pH6.5-6.8，无菌空气通风比1:0.6-0.8(V/V)，发酵16-20h后，发酵温度降为32-37℃，无菌空气通风比1:0.4-0.6(V/V)，pH调节至7.0-7.5；
发酵过程中的补料操作：所补加培养基为乳糖溶液，浓度为200g/L；发酵过程中检测乳糖浓度，由乳糖浓度变化确定补料时机，当发酵液中乳糖浓度低于1.8g/L时，开始补料，补料体积每次50-100ml，共补料2-3次；
发酵罐发酵培养基配方：豆饼粉12-15g、玉米浆10-15g、乳糖10-15g、硫酸铵3-5g、牛肉膏2-5g、NaCl2-5g、KH2PO40.1g、MgSO4·7H2O0.04g、CaCl20.3-0.5g、吐温802g和蒸馏水1000mL，培养条件：pH6.5-6.8、灭菌温度121℃，灭菌时间30min。
4.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法，其特征在于所述的选用属于微生物类群的保藏号为CGMCCNo.5699的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)F69作为β-半乳糖苷酶的生产菌种，该β-半乳糖苷酶酶制剂制备：包括⑴发酵液分段超滤、⑵发酵液硫酸铵盐析、⑶透析、⑷超滤浓缩、⑸添加保护剂、⑹粗酶冷冻干燥和⑺固体粗酶粉碎，其中：
⑴发酵液分段超滤：将摇瓶震荡法发酵制备的发酵液或者发酵罐通风发酵法制备的发酵液离心去菌体，冷冻离心机4℃、8000r/min、离心10min，弃去沉淀，保留上清；采用超滤膜超滤，第一次采用截留分子质量为70-80kDa的超滤膜过滤，保留滤出液；第二次用15-25kDa的超滤膜过滤，滤液浓缩3-5倍，保存截留液；调节超滤后的截留液pH至6.5；
⑵发酵液硫酸铵盐析：然后向其中加入硫酸铵粉末至30％饱和度，4℃环境下静置10-12h，然后4℃下8000r/min离心10min，弃去沉淀，保留上清；然后调节上清液pH8.0，添加硫酸铵至饱和度70-80％，4℃静置10-12h后冷冻离心机4℃离心后收集沉淀蛋白；去离子水充分溶解沉淀，得到β-半乳糖苷酶粗酶溶液；
⑶透析：将粗酶溶液装入透析袋中4℃下透析10-12h，每隔2-3h换水一次，经饱和BaCl2检测透析完全后进行超滤浓缩；
⑷超滤浓缩：将粗酶液通过20kDa的超滤膜，浓缩6-10倍；
⑸粗酶液添加保护剂：向浓缩后的粗酶液中加入保护剂,该保护剂为2-3％的脱脂奶粉、1-3％的蔗糖和0.1-0.2％的山梨酸钾；
⑹粗酶冷冻干燥：充分分散后，-20℃冷冻8-10h，真空度30-40Pa、温度-35℃下，冷冻15-18h；即得到β-半乳糖苷酶酶制剂成品。
CN201310455457.7A 2013-09-30 2013-09-30 利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法 Expired - Fee Related CN103614355B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310455457.7A CN103614355B (zh) 2013-09-30 2013-09-30 利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310455457.7A CN103614355B (zh) 2013-09-30 2013-09-30 利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103614355A CN103614355A (zh) 2014-03-05
CN103614355B true CN103614355B (zh) 2015-12-02

Family

ID=50165072

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310455457.7A Expired - Fee Related CN103614355B (zh) 2013-09-30 2013-09-30 利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103614355B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104911120A (zh) * 2015-03-11 2015-09-16 浙江理工大学 一种枯草芽孢杆菌的发酵生产工艺
CN114875013A (zh) * 2022-06-21 2022-08-09 南京林业大学 一种使用重组枯草芽孢杆菌分泌天然胞内β-半乳糖苷酶的方法
CN116539702B (zh) * 2023-04-25 2023-10-31 国科赛赋河北医药技术有限公司 检测猕猴血浆中反义寡核苷酸含量的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010151660A1 (en) * 2009-06-24 2010-12-29 Modular Genetics, Inc. Engineered microorganisms and methods of use
CN101845425B (zh) * 2010-05-25 2012-07-04 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种α-半乳糖苷酶及其表达、纯化方法
CN103276007A (zh) * 2013-06-19 2013-09-04 江南大学 利用非经典分泌蛋白质实现外源蛋白质的分泌表达

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE176971T1 (de) * 1984-09-29 1986-11-27 Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio/Tokyo Fuer ein thermostabiles beta-galaktosidase, kodierendes gen, dieses gen enthaltender bacillus-subtilis, das durch dieses gen kodiertes enzym und verfahren zu dessen herstellung.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010151660A1 (en) * 2009-06-24 2010-12-29 Modular Genetics, Inc. Engineered microorganisms and methods of use
CN101845425B (zh) * 2010-05-25 2012-07-04 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种α-半乳糖苷酶及其表达、纯化方法
CN103276007A (zh) * 2013-06-19 2013-09-04 江南大学 利用非经典分泌蛋白质实现外源蛋白质的分泌表达

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
High production of thermostable beta-Galactosidase of Bacillus stearothermophilus in bacillus subtilis;Haruhisa Hirata et al.;《Applied and Environmental Microbiology》;19850630;第49卷(第6期);1547-1549 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103614355A (zh) 2014-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102630749B (zh) 灵芝白灵菇酸奶的制备方法
CN107022493B (zh) 一种高产饲用复合酶的米曲霉菌株及其应用
CN103141666A (zh) 一种利用白酒酒糟生产微生物饲料益生菌剂的方法
CN104928208A (zh) 一种植物乳杆菌Lp90及其筛选方法和应用
Prasad et al. Extraction and characterisation of β-galactosidase produced by Bifidobacterium animalis spp. lactis Bb12 and Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus ATCC 11842 grown in whey
CN110607255B (zh) 一种德氏乳杆菌及直投式德氏乳杆菌发酵剂的制备方法和应用
CN103205376A (zh) 一株适用于发酵饲料的植物乳杆菌及其应用
CN108220071A (zh) 一种羊肚菌黄酒的制备方法
CN103571775A (zh) 一种改善发酵乳黏度的产胞外多糖乳酸菌及其应用
CN103627689A (zh) 一种利用微生物液态发酵生产弹性蛋白酶酶制剂的方法
CN112126599B (zh) 一种瑞士乳杆菌的高密度培养方法、高活力菌粉的制备及其应用
CN103614355B (zh) 利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法
CN103614313B (zh) 一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法
CN105176872A (zh) 嗜热链球菌及其应用
CN102174448B (zh) 一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用
CN104911167A (zh) 类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶及制备方法
CN109295037B (zh) 一种采用米曲霉发酵生产乳糖酶的方法及其所产乳糖酶
CN103039710A (zh) 一种混合菌株发酵生产茶籽粕饲料的方法
CN105400728A (zh) 一种产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法
CN104232542A (zh) 一种液体酸奶发酵剂的制备方法及其产品与应用
CN107151640B (zh) 一种产乳糖酶的嗜冷杆菌菌株及使用该菌株制备低温乳糖酶的方法
CN105002112A (zh) 一种高产乙酸乙酯的植物乳杆菌及其应用
CN104357359A (zh) 一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂的生产技术
CN104673690A (zh) 乳酸菌冻干粉的生产工艺
CN109321469B (zh) 一株高产乳糖酶的米曲霉及其发酵产酶方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20151202

Termination date: 20160930