CN103276007A - 利用非经典分泌蛋白质实现外源蛋白质的分泌表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中实现外源蛋白质分泌表达的新策略。以非经典分泌蛋白质Eno，YceD和YvgN作为转运信号实现了外源蛋白质BgaB的分泌表达，但在YceD引导下，BgaB的分泌量很低。在PdhA和KatA情况下，虽然在细胞内检测到很高的融合蛋白质的量，在细胞外没有检测到相应的蛋白质和BgaB的活性，说明PdhA和KatA并不能实现BgaB的分泌表达。当GapA作为融合蛋白质时，胞内和胞外均没有检测到融合蛋白质，可能是融合蛋白质在细胞内并没有表达。本实验的方法对于实现外源蛋白质在枯草芽孢杆菌中的分泌表达提供了新的可能。

Description

利用非经典分泌蛋白质实现外源蛋白质的分泌表达

技术领域

本发明涉及在枯草芽孢杆菌中实现外源蛋白质分泌表达的一种新策略。更特殊地涉及枯草芽孢杆菌的非经典分泌蛋白质甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapA，丙酮酸脱氢酶PdhA，烯醇酶Eno，过氧化氢酶KatA，功能未知蛋白质YceD，乙二醛还原酶YvgN作为转运信号来实现外源蛋白质的分泌表达。

背景技术

由于枯草芽孢杆菌没有外膜，分泌的蛋白质直接被释放到细胞外；自身具有较强的蛋白质分泌能力；遗传特性清楚而且是食品级微生物等优点。因此近年来很多科学家尝试利用枯草芽孢杆菌分泌表达外源蛋白质。在枯草芽孢杆菌中主要存在四种蛋白质分泌途径：Sec分泌途径、Tat分泌途径、ABC转运子途径和Com途径。超过90%的报道是尝试利用Sec途径实现外源蛋白质的分泌表达。但是令人失望的是大量的外源蛋白质分泌量极低，一些细胞质蛋白质（如乳糖酶LacZ、耐热乳糖酶BgaB、氯霉素乙酰转移酶Cat）即使加上不同的Sec信号肽仍不能被分泌到细胞外。因此，开拓能实现外源蛋白质分泌表达的新策略变的十分重要。

到目前为止，通过2D电泳和质谱技术，在枯草芽孢杆菌的发酵上清液中总共检测到113种不同的蛋白质。其中仅有54种蛋白质的N端含有信号肽酶切位点的信号肽但不含保留信号；其余59种蛋白质由于含有保留信号或者不含有信号肽，而被预测为不是分泌蛋白质。这些蛋白质包括17种细胞质蛋白质、5种噬菌体相关蛋白质、7种鞭毛相关蛋白质、18种脂蛋白、6种膜蛋白质和6种细胞壁蛋白质(Antelmann et al.Methods Biochem Anal,2006;49:179-208)。

由于一直认为17种细胞质蛋白质是由于细胞裂解而被释放到细胞外，所以对于此类蛋白质的分泌途径和机理研究极少。直到最近，Yang等人在胞内表达羧酸酯酶Est55时发现，细胞外Est55的量比其在细胞内多。作者进一步研究表明Est55和枯草芽孢杆菌自身的17种细胞质蛋白质不是由于细胞裂解被释放到细胞外的，而是通过一种或者几种目前尚未鉴定的分泌途径被转运到细胞外，而且这在细菌中是一种普遍现象(Yang et al.J Bacteriol.2011;193:5607-5615)。由于没有一种已知的转运途径负责这些蛋白质分泌，而且这些蛋白质均不含有经典的信号肽，因此这些蛋白质被称作为非经典分泌蛋白质(non-classically secretedproteins)，负责这些蛋白质转运的途径被称作非经典分泌途径(nonclassical proteinsecretion pathway)。

来源于嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）的β-半乳糖苷酶具有良好的热稳定性，70℃热处理30分钟仍能保持80%的酶活，该酶适宜于乳品加工中的高温度水解路线，具有良好的工业应用前景。为了简化下游的分离纯化工艺，节约成本，常采用分泌方式将目标蛋白质分泌到细胞外。我们曾尝试利用不同的信号肽实现BgaB的分泌表达，但遗憾的是，BgaB并不能通过一般分泌途径被分泌到细胞外。这些非经典分泌蛋白质的分泌系统为外源蛋白质的分泌表达提供了一种新的潜在的策略。本发明是以细胞质蛋白质耐热乳糖酶BgaB为报告蛋白质，通过融合非经典分泌蛋白质而实现BgaB的分泌表达。

发明内容

本发明的目的是以非经典分泌蛋白质GapA，PdhA，Eno，KatA，YceD，YvgN作为转运信号来实现外源蛋白质的分泌表达。

本发明所采用的技术方案是：

以枯草芽孢杆菌的非经典分泌蛋白质作为转运信号来实现外源蛋白质的分泌表达。具体的，是利用枯草芽孢杆菌gapA(GeneID:938627)，pdhA(GeneID:936005)，eno(GeneID:938641)，katA(GeneID:939240)，yceD(GeneID:938364)，yvgN(GeneID:936001)基因作为转运信号，分别与外源目的蛋白质（BgaB）的编码基因进行融合，构建能够融合表达重组蛋白的质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，从而实现融合蛋白质的分泌表达。其中，可以使用不同的枯草芽孢杆菌的非经典分泌蛋白质作为转运信号，因为不同的枯草芽孢杆菌的gapA，pdhA，eno，katA，yceD，yvgN蛋白之间的同源性极高，本发明优选使用来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168的gapA，pdhA，eno，katA，yceD，yvgN蛋白作为转运信号。

本发明选择gapA，pdhA，eno，katA，yceD，yvgN作为融合标签，选择易检测的细胞质蛋白质BgaB为外源基因，以具有转化能力且遗传学特性清楚的枯草芽孢杆菌菌株作为重组质粒的转化菌株，如Bacillus subtilis168及其衍生菌株，例如Bacillus subtilis WB800，Bacillus subtilis WB600，Bacillus subtilis QB928等。

本发明涉及GapA，PdhA，Eno，KatA，YceD，YvgN，将这些蛋白质的编码基因分别与外源目的蛋白基因的编码序列融合后构建成重组质粒pMA5-GapA-BgaB、pMA5-PdhA-BgaB、pMA5-Eno-BgaB、pMA5-KatA-BgaB、pMA5-YceD-BgaB和pMA5-YvgN-BgaB，这些质粒中含有强启动子HpaII、融合片段的编码基因以及外源目的蛋白基因（BgaB），它可在枯草芽孢杆菌中表达融合蛋白。

本发明涉及利用构建的融合表达重组蛋白的重组质粒转化枯草芽孢杆菌后得到的重组菌株，该菌株能组成型表达融合蛋白质，可通过酶活活性或者蛋白质电泳检测发酵上清液中的外源蛋白质。本发明中的空白对照是把BgaB基因直接连接到中性蛋白酶NprE的信号肽（ssNprE）上而构成的重组质粒pMA5-ssNprE-BgaB。耐热乳糖酶的酶活以测定水解邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（oNPG）产生黄色的邻硝基苯在420nm下的吸光值。乳糖酶酶活单位U定义为：在pH6.5，55℃条件下，每分钟水解产生1μmol的oNP所需的酶量为一个乳糖酶活单位U。

本发明涉及相关引物序列如下：

GapANdeIF:ATCAATTGCATATGGCAGTAAAAGTCGGTATTAAC

GapAEcoRIR:CAATGAATTCGGATCCAAGACCTTTTTTTGCGATGT

PdhANdeIF:GCGTGAATTCCATATGGCTGCAAAAACGAAAAAAGCT

PdhAEcoRIR:GCGTGAATTCAGATCTCTTCGACTCCTTCTGTGTAT

EnoNdeIF:ATGAATTCCATATGCCATACATTGTTGATGTTTATGC

EnoMfeIR:GCATCAATTGGGATCCCTTGTTTAAGTTGTAGAAAGAGTTG

KatANdeIF:ATCAATTGCATATGAGTTCAAATAAACTGAC

KatAMfeIR:GCATCAATTGAGATCTAGAATCTTTTTTAATCGGCAAT

YceDNdeIF:GCGTGAATTCCATATGACAATTTCATTGGCAAAAGGAC

YceDEcoRIR:

GCATGAATTCGGATCCACCGACTTGCAAACCGTAGTCTG

YvgNNdeIF:GCGTGAATTCCATATGCCAACAAGTTTAAAAGATAC

YvgNEcoRIR:GCATGAATTCGGATCCAAACAGAAGCTCATCAGGAT

与本领域已知的方法相比，本发明是成功的利用非经典分泌蛋白质GapA，PdhA，Eno，KatA，YceD，YvgN作为转运信号分泌表达外源蛋白质，但是，不同的转运信号分泌表达的效率存在差异。阴性对照在细胞外检测不到外源蛋白质。

附图说明

图1pMA5-NCSP-BgaB构建流程图。NCSP是非经典分泌蛋白质的英文首字母缩写(Non-Classically Secreted Proteins)。在这分别指gapA，pdhA，eno，katA，yceD，yvgN这6个基因，BgaB是来源于嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001（Bacillusstearothermophilus IAM11001）耐热半乳糖苷酶（乳糖酶）编码基因。PromoterHpaII是组成型强启动子HpaII。

图2蛋白质电泳检测枯草芽孢杆菌WB800转化菌株培养18小时时的BgaB胞内和胞外的蛋白质量。菌体经超声波破碎后用三氯乙酸法（TCA法）浓缩10倍后上样，发酵上清液经TCA浓缩10倍后直接上样，上样量均为10μL。图中，1为YvgN-BgaB融合蛋白质(约102kDa)胞内蛋白质样品，2为其上清样品；3为YceD-BgaB融合蛋白质(约90kDa)胞内蛋白质样品，4为其上清样品；5为KatA-BgaB(约125kDa)的胞内蛋白质样品，6为其KatA-BgaB的上清样品；7为Eno-BgaB(约110kDa)的胞内蛋白质样品，8为其上清样品；9为PdhA-BgaB(约110kDa)的胞内蛋白质样品，10为其上清蛋白质样品；11为GapA-BgaB(约110kDa)的胞内蛋白质样品，12为GapA-BgaB为上清蛋白质样品；13为带空质粒pMA5的发酵上清样品，14带空质粒pMA5的胞内蛋白质样品)。

具体实施方式

1.gapA，pdhA，eno，katA，yceD，yvgN这6个基因的获得

按照细菌基因组快速提取试剂盒说明书提取B.subtilis168菌株基因组DNA。根据已发表的Bacillus subtilis168全基因组序列设计相应引物，在上游和下游引物中分别引入NdeI和EcoRI酶切位点，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。以基因组DNA为模板，PCR扩增相应的编码序列，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，大小与预期相符。扩增用的聚合酶是东洋纺（上海）生物科技有限公司的KOD plus。引物序列如下。

GapANdeIF:ATCAATTGCATATGGCAGTAAAAGTCGGTATTAAC

GapAEcoRIR:CAATGAATTCGGATCCAAGACCTTTTTTTGCGATGT

PdhANdeIF:GCGTGAATTCCATATGGCTGCAAAAACGAAAAAAGCT

PdhAEcoRIR:GCGTGAATTCAGATCTCTTCGACTCCTTCTGTGTAT

EnoNdeIF:ATGAATTCCATATGCCATACATTGTTGATGTTTATGC

EnoMfeIR:GCATCAATTGGGATCCCTTGTTTAAGTTGTAGAAAGAGTTG

KatANdeIF:ATCAATTGCATATGAGTTCAAATAAACTGAC

KatAMfeIR:GCATCAATTGAGATCTAGAATCTTTTTTAATCGGCAAT

YceDNdeIF:GCGTGAATTCCATATGACAATTTCATTGGCAAAAGGAC

YceDEcoRIR:

GCATGAATTCGGATCCACCGACTTGCAAACCGTAGTCTG

YvgNNdeIF:GCGTGAATTCCATATGCCAACAAGTTTAAAAGATAC

YvgNEcoRIR:GCATGAATTCGGATCCAAACAGAAGCTCATCAGGAT

克隆得到的PCR产物进行产物纯化，-20℃保存备用。

2.质粒的构建

通过采用NdeI和EcoRI(或者EcoRI的同工酶MfeI)双酶切PCR产物，经胶回收后克隆于经相同酶切的pMA5-ssNprE-BgaB的质粒中(由实验室保藏，构建过程可参考：王双辉，王光强，陈海琴等.信号肽对耐热β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中表达的影响[OL].中国科技论文在线)，分别得到质粒

pMA5-GapA-BgaB、pMA5-PdhA-BgaB、pMA5-Eno-BgaB、pMA5-KatA-BgaB、pMA5-YceD-BgaB和pMA5-YvgN-BgaB。构建的质粒经测序验证正确。

3.重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定

采用电击法将重组质粒分别转化枯草芽孢杆菌WB800菌株中（2.0kv，1mm，电击1次，时间常数=4.5～5.0ms，Gene Pulser Xcell），涂布含卡那霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接种至5mL含终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基。收集菌体并按照细菌基因组快速提取试剂盒说明书提取基因组DNA，通过PCR验证重组质粒是否转化成功。阳性克隆分别命名为

WB800(pMA5-GapA-BgaB)、WB800(pMA5-PdhA-BgaB)、

WB800(pMA5-Eno-BgaB)、WB800(pMA5-KatA-BgaB)、

WB800(pMA5-YceD-BgaB)和WB800(pMA5-YvgN-BgaB)。

4.枯草芽孢杆菌重组菌株中BgaB的检测

把重组菌株接种于5ml的LB液体培养基中，37℃培养，培养不同时间分别取样。10000rpm离心15min收集菌体，然后用PBS洗涤三次，并重悬于等体积的PBS重悬菌体。然后加入终浓度为5mg/mL的溶菌酶，37℃水浴保温1h，利用超声波破碎菌体（2min,300W，Sonic,VCX500）。利用TCA方法浓缩10倍，具体是在样品中加入1/10体积的70%(v/v)三氯乙酸，在室温放置5分钟，13000转离心15分钟，然后用冰冷的80%丙酮洗涤2次，吹干，然后用1/10样品体积的上样缓冲液重悬，取10μL用来做蛋白质电泳分析。BgaB的酶活测定：取100μL发酵上清液和900μL磷酸盐缓冲液滴入一支离心管中，混合，调温至55℃。加5.0mL oNPG底物溶液，振摇。精确10min后加2.0mL碳酸纳溶液，使反应终止。室温静置5min，随后用分光光度计（420nm）测定吸光度。空白对照时将100μL发酵上清液和900μL磷酸盐缓冲液和2.0mL碳酸钠混合，然后再加5.0mL底物溶液，室温静置5min后测定吸光值。oNPG底物溶液底物的配置：称取250mg oNPG，用20mM的磷酸盐缓冲液（pH6.5）定容到100mL。检测结果如表1所示：

表1枯草芽孢杆菌WB800转化菌株培养18小时时胞内和胞外BgaB的活性

Claims (10)

1.一种重组表达质粒载体pMA5-NCSP-BgaB，其特征在于所述的重组表达质粒载体包含枯草芽孢杆菌的非经典分泌蛋白质Eno，YceD或YvgN的编码序列与外源目的蛋白基因BgaB的编码序列融合而获得的基因序列。

2.根据权利要求1所述的重组表达质粒载体pMA5-NCSP-BgaB，其特征在于其中的Eno，YceD或YvgN来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168。

3.根据权利要求2所述的重组表达质粒载体pMA5-NCSP-BgaB，其特征在于其中的BgaB是来源于嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001的耐热半乳糖苷酶。

4.根据权利要求3所述的重组表达质粒载体pMA5-NCSP-BgaB，其特征在于该质粒还包含组成型强启动子HpaII。

5.根据权利要求4所述的重组表达质粒载体pMA5-NCSP-BgaB，其特征在于该质粒还包含氨苄青霉素或卡那霉素抗性选择标记基因。

6.一种构建权利要求1-5任一项所述的重组表达质粒载体pMA5-NCSP-BgaB的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

a)从细菌B.subtilis168菌株中提取基因组DNA；

b)以提取获得的基因组DNA为模板，利用如下引物扩增eno，yceD，yvgN基因，克隆得到的PCR产物进行产物纯化，-20℃保存备用，其中扩增的具体引物对分别如下：

EnoNdeIF:ATGAATTCCATATGCCATACATTGTTGATGTTTATGC

EnoMfeIR:

GCATCAATTGGGATCCCTTGTTTAAGTTGTAGAAAGAGTTG

YceDNdeIF:GCGTGAATTCCATATGACAATTTCATTGGCAAAAGGAC

YceDEcoRIR:

GCATGAATTCGGATCCACCGACTTGCAAACCGTAGTCTG

YvgNNdeIF:GCGTGAATTCCATATGCCAACAAGTTTAAAAGATAC

YvgNEcoRIR:GCATGAATTCGGATCCAAACAGAAGCTCATCAGGAT

c)通过NdeI和EcoRI双酶切PCR产物，经胶回收产物后克隆于经相同酶切的pMA5-ssNprE-BgaB的质粒中分别得到质粒pMA5-Eno-BgaB、pMA5-YceD-BgaB和pMA5-YvgN-BgaB。

7.一种利用权利要求1所述的重组表达质粒载体pMA5-NCSP-BgaB分泌表达BgaB的方法，其特征在于将重组质粒pMA5-NCSP-BgaB分别转化到枯草芽孢杆菌菌株后进行筛选培养，获得能分泌表达BgaB的阳性克隆。

8.根据权利要求8所述的利用重组表达质粒载体pMA5-NCSP-BgaB分泌表达BgaB的方法，其特征在于，其中被转化的枯草芽孢杆菌菌株是Bacillussubtilis168或其衍生菌株。

9.权利要求8所述的利用重组表达质粒载体pMA5-NCSP-BgaB分泌表达BgaB的方法，其特征在于其中的转化方法是电击法。

10.权利要求1-5任一项的重组表达质粒载体pMA5-NCSP-BgaB用于分泌表达BgaB的。

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