CN104726432B

CN104726432B - 一种D型β‑葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌

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Publication number: CN104726432B
Application number: CN201410801030.2A
Authority: CN
Inventors: 施海峰; 冯婷婷; 刘海涛; 王继峰; 吴黎明; 周阳
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2017-12-22
Anticipated expiration: 2034-12-22
Also published as: CN104726432A

Abstract

本发明涉及一种D型β‑葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌，具体涉及的是一种酶活性显著提高的D型β‑葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌，属于生物工程技术领域；本发明将来源于台湾白蚁的β‑葡萄糖苷酶进行定点突变，将将第182位的酪氨酸Y分别变为色氨酸W、亮氨酸L；第194位的甲硫氨酸M分别变为亮氨酸L、苯丙氨酸F；第244位的天冬氨酸D变为组氨酸H，分别表示为Glu1D‑Y182W、Glu1D‑Y182L、Glu1D‑M194L、Glu1D‑M194F、Glu1D‑D244H；本发明所述的突变体的酶活性与突变前相比分别提高了94.6、92.9、100.3、71.4、69.9倍；本发明所得β‑葡萄糖苷酶突变体酶活性有了大幅度的提高，为工业化应用提供了有利的基础，更能满足社会生产的要求，具有广阔的应用前景。

Description

一种D型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌

技术领域

本发明涉及一种D型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌，具体涉及的是一种酶活性显著提高的D型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

D型β-葡萄糖苷酶（β-D-吡喃葡萄糖苷水解酶，E.C. 3.2.1.21）是一类能水解苷类和寡糖的糖苷键并释放非还原性末端葡糖残基的酶。这些酶普遍存在于所有领域的生命体中，在古细菌、真细菌和真核生物中发挥多种功能和作用。包括微生物内的生物质转换、动物体糖脂和外源性糖苷的降解、细胞壁寡糖的木质化和分解代谢、防御、植物激素结合共轭激活作用、植物中气味释放以及植物-微生物和植物-昆虫相互作用等。

白蚁是自然界中纤维素的最主要消耗者，白蚁主要通过内源和外源纤维素酶的协同作用分解纤维素，最终转化为葡萄糖。白蚁体内就是一个微型的生物发酵器，若能模拟白蚁的纤维素酶降解系统，工业化纤维素-葡萄糖-酒精-燃料的生产体系必是解决当前环境问题能源危机的一条重要途径。

至今，国内外对白蚁体内的内源性D型β-葡萄糖苷酶的研究已经逐步加深，目前人们主要集中在对该酶进行结构功能研究，并通过改造获得高表达、高活性的D型β-葡萄糖苷酶用于工业经济应用(Zhang, et al., 2010)。目前已有的研究显示，该类纤维素水解酶的催化效率较低、人工提取和表达的酶纯化难度较大，若能通过同源建模等手段进行理性分子设计，对白蚁内源性D型β-葡萄糖苷酶蛋白的催化活性、稳定性、底物特异性、耐热性和耐酸碱性等进行合理化改造，将使此类酶具有更大的应用前景，实现巨大工业经济价值。Hsiao-lin Lee等人（Mutations in the substrate entrance region of β-glucosidasefrom Trichoderma reesei improve enzyme activity and thermostability）已经在来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶中研究了突变后的酶，获得了一些活性增强的突变体。

本发明从台湾家白蚁的cDNA中克隆得到D型β-葡萄糖苷酶CfBG Glu1D,根据蛋白质结构预测和同源性序列分析，找出了一系列突变位点，在这些氨基酸位点上进行点突变，得到了一系列突变体酶。经过蛋白质表达与验证，发现有几个突变体酶的催化活性显著增强。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶活性提高的D型β-葡萄糖苷酶突变体。本发明通过基因工程手段对D型β-葡萄糖苷酶进行基因体外克隆和定点突变，然后将含有突变点基因的重组质粒转化进入大肠杆菌宿主细胞中进行表达，得到5个酶活性显著提高的D型β-葡萄糖苷酶突变体。

所述亲本D型β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

突变体的表示方法为：Glu1D- 原始氨基酸-位置-替换的氨基酸

所述突变体是将第182位的酪氨酸Y分别变为色氨酸W、亮氨酸L；第194位的甲硫氨酸M分别变为亮氨酸L、苯丙氨酸F；第244位的天冬氨酸D变为组氨酸H。分别表示为Glu1D-Y182W、Glu1D- Y182L、Glu1D- M194L、Glu1D- M194F、Glu1D- D244H。

本发明的另一目的是提供一种包含有D型β-葡萄糖苷酶突变体DNA序列的突变质粒；

本发明的另一目的是提供一种含有上述突变质粒的重组突变菌株。

所述突变体构建的具体步骤如下：

（1）突变体表达菌株的构建

本发明从实验室饲养的台湾家白蚁的唾液腺和肠道组织中，提取出RNA，

经过反转录，得到cDNA。

依据NCBI基因数据库中的台湾家白蚁的β-葡萄糖苷酶基因（GenBank 登录号为JN565080），根据序列同源性，设计扩增引物，以得到的白蚁cDNA为模板进行PCR扩增，加上限制酶Hind III和Xho I的酶切位点，PCR扩增后的产物插入到载体pET-28a（Novagen公司）上的相应多克隆位点之间，转化入Ecoli.DH5α（Novagen公司）感受态细胞中，筛选转化子，测序后与已有的序列（JN565080）比对，不完全相同，将本实验室得到的此重组质粒称为pET-28a-Glu1D。

将重组质粒pET-28a-Glu1D转化入Ecoli.BL21(DE3)（Novagen公司）进行表达，得到的β-葡萄糖苷酶称为D型β-葡萄糖苷酶(CfBG Glu1D)。

我们在此酶的基础上，对其基因进行突变改造，以pET-28a-Glu1D为模板，设计含有突变位点的核苷酸序列引物，并通过PCR进行定点突变得到目的产物，用Dpn消化去除模板DNA后，进行琼脂糖凝胶电泳割胶回收目的片段，用T4 DNA连接酶进行连接反应后，转化到Ecoli.DH5α（Novagen公司）感受态细胞中，筛选转化子，提取质粒测序验证，得到含有突变后目的基因的重组质粒称为pET-28a- Glu1D-X（X为原始氨基酸-位置-突变后氨基酸），将此重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)（Novagen公司）感受态细胞，筛选得到含目的突变的表达菌株。

（2）突变体表达菌株的诱导表达

将突变体大肠杆菌表达菌株活化后，转接入LB培养基（含50μg/mL的卡

那霉素）中振荡培养，加入诱导剂IPTG，振荡培养后收集菌液，离心收集菌体，超声波破碎细胞，离心取上清即得到CfBG Glu1D的突变体酶，测定酶的催化活性。

本发明的有益效果：

本发明通过对台湾家白蚁的D型β-葡萄糖苷酶（CfBG Glu1D）的体外表达，并在其基础上进行点突变，发现其中有5个突变体酶的活性有显著增强。即第182位的酪氨酸Y分别突变为色氨酸W、亮氨酸L；第194位的甲硫氨酸M分别突变为亮氨酸L、苯丙氨酸F；第244位的天冬氨酸D变为组氨酸H，所得到的D型β-葡萄糖苷酶突变体的酶活性与突变前的相比分别提高了94.6、92.9、100.3、71.4、69.9倍。该酶的活性有了大幅度的提高，这对现今降解生物质尤其是纤维素类具有重大的意义，可以使自然界中的秸秆等在β-葡萄糖苷酶的促进催化作用下，更好更快速的降解产生葡萄糖，实现催化过程的高效优化。产生的葡萄糖又可以进一步参与更多的工业过程，如生物燃料乙醇的生产，生物洗涤剂等一系列相关工艺。

附图说明

图1为本发明中所得的突变体的核苷酸序列发生突变的位点示意图，箭头指向为突变位点；

图2为本发明构建的突变株以及原始菌株表达酶的酶活性情况。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：突变表达质粒的构建及重组大肠杆菌突变体表达菌株的获得

1.突变表达质粒的构建

通过基因工程手段对D型β-葡萄糖苷酶进行基因体外克隆和定点突变，具

体过程如下：

从实验室饲养的台湾家白蚁的唾液腺和肠道组织中，提取出RNA，经过反转录，得到cDNA。

在NCBI基因数据库查到台湾家白蚁的β-葡萄糖苷酶基因（JN565080），根据序列同源性，设计扩增引物，以得到的白蚁cDNA为模板进行扩增，加上限制酶Hind III和Xho I的酶切位点，PCR扩增后的产物插入到载体pET-28a（Novagen公司）上的相应多克隆位点之间，转化入Ecoli.DH5α（Novagen公司）感受态细胞中，筛选转化子，测序后与已有的序列（JN565080）比对，不完全相同，本实验室得到的此重组质粒称为pET-28a-Glu1D。

带有限制酶Hind III和Xho I的酶切位点的扩增引物序列如下：

F: Hind III 5'- CCCAAGCTTGCATGAGAGTTTTTCCTCCAAG

R: Xho I 5'- CCGCTCGAGTTAAACTCCTTCTGTGCG

我们在此酶的基础上，对其基因进行突变改造，以pET-28a-Glu1D为突变模板，设计含有突变位点的核苷酸序列引物，并以pET-28a-Glu1D为扩增模板，通过PCR进行定点突变得到目的产物。

用于定点突变的引物为：（下划线部分为突变位点）

Y182W -F：P-TGGACTTCTTGTATGCAAGG

Y182W -R：P-AGGTTCATTGAAAGTTGAC

Y182L-F：P-SYGACTTCTTGTATGCAAGG

Y182L-R：P-AGGTTCATTGAAAGTTGAC

M194L -F：P-YWCGCTCCTGGAAGGAATATTC

M194L -R：P-GGAACCATATTGATATCCTTG

M194F -F：P-YWCGCTCCTGGAAGGAATATTC

M194F -R：P-GGAACCATATTGATATCCTTG

D244H-F：P-GTCANTGGCAAGAGCCTTATAC

D244H-R：P-AATTAACTGCGATTGAAATTG

PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：

95℃ 5min 1 循环；（95℃ 30s；58℃ 30s；72℃ 820s ）×30 循环；

72℃ 7min；4℃ ∞。

将通过PCR得到的产物用Dpn消化去除模板DNA后，进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，用T4 DNA连接酶进行连接反应，转化Ecoli.DH5α（Novagen）感受态细胞中，筛选转化子，提取质粒进行测序验证，如图1所示，在所获得的突变体的核苷酸序列中在相应的位点发生了突变，得到了含有突变后目的基因的重组质粒，称为pET-28a- Glu1D-X（X为原始氨基酸-位置-替换后氨基酸），将正确的重组质粒转化入Ecoli.BL21(DE3)感受态细胞，筛选得到含目的突变体酶的表达菌株。

2.重组大肠杆菌突变体菌株诱导表达产生Glu1D突变体酶

将重组大肠杆菌Bl-21表达菌株活化后，以1%的接种量转接入200mL的LB培养基中（含有50μg/mL的卡那霉素）振荡培养，至OD₆₀₀约0.4时加入0.2mM的诱导剂IPTG，25℃振荡培养6h。收集菌液，10000g离心收集菌体，加入20mLTris-HCl缓冲液超声破碎细胞，离心取上清即得到相应Glu1D突变体酶，分别测定酶活性。原未突变菌株pET-28a- Glu1D表达产物作为对照。

实施例2：突变前后D型β-葡萄糖苷酶的活性测定

按照实施例1中的方法分别对原大肠杆菌pET-28a- Glu1D以及其他突变株进行诱导表达，测定酶活性，得到结果如图2所示，通过附图2可以看出突变之后的菌株酶活性与突变之前的相比，分别提高了94.6、92.9、100.3、71.4、69.9倍。

本发明所述的突变之后的酶的活性相对于突变前有了很大的提高。结果表明在关键位点突变氨基酸，可以使该酶的活性及其他性质发生改变，这种策略可以广泛应用于酶学性质的改进，加速了酶在工业生产中的应用，具有重要的社会意义。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> 一种D型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌

<130> 一种D型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 481

<212> PRT

<213> Coptotermes formosanus

<400> 1

Met Lys Leu Leu Leu Phe Phe Phe Gly Leu Ser Ile Ser Glu Gly Arg

1 5 10 15

Val Phe Pro Pro Ser Phe Lys Phe Cys Ala Ala Thr Ala Ala Tyr Gln

20 25 30

Ile Glu Gly Ala Ala Arg Glu Glu Gly Arg Ser Pro Ser Ile Trp Asp

35 40 45

Val Phe Ser His Ile Pro Gly Lys Thr Asp Gly Gly Gln Asn Gly Asp

50 55 60

Asn Ala Val Asp His Tyr His Leu Phe Lys Asp Asp Ile Asp Leu Met

65 70 75 80

Lys Gln Leu Asn Phe Gly Val Phe Arg Phe Ser Leu Ser Pro Ser Arg

85 90 95

Ile Leu Pro Thr Pro Asp Tyr Lys Val Asn Glu Glu Gly Ile Phe His

100 105 110

Tyr Arg Arg Val Leu Glu Tyr Leu Lys Phe Gln Gly Ile Lys Pro Leu

115 120 125

Val Thr Leu Phe His Trp Asp Leu Pro Gln Tyr Met Asp Glu Leu Tyr

130 135 140

Gly Gly Leu Leu Asn Ala Thr Ala Leu Lys Glu Phe Phe Ser Lys Tyr

145 150 155 160

Ala Glu Ala Ala Phe Asp Gly Leu Gly Asp Leu Val Asp Ser Trp Ser

165 170 175

Thr Phe Asn Glu Pro Tyr Thr Ser Cys Met Gln Gly Tyr Gln Tyr Gly

180 185 190

Ser Met Ala Pro Gly Arg Asn Ile His Pro Glu Ser Glu Pro Tyr Asp

195 200 205

Cys Ile His Ala Val Leu Val Ser His Gly Ala Val Ala Lys Ile Phe

210 215 220

Arg Glu Lys Phe Pro Lys Gly Thr Ser Asn Lys Thr Ile Ser Ile Ala

225 230 235 240

Phe Asn Cys Asp Trp Gln Glu Pro Tyr Thr Asp Ser Glu Glu Asp Lys

245 250 255

Asn Ala Ser Ile Arg Gly Leu Asp Tyr Tyr Leu His Val Phe Met Asp

260 265 270

Pro Ile Tyr Phe Gly Lys Tyr Pro Asp Gly Met Val Glu Arg Ser Gln

275 280 285

Gly His Leu Lys Pro Leu Thr Pro Glu Glu Val Glu Leu Ile Asn Gly

290 295 300

Ser Val Asp Val Phe Ala Leu Asn Ser Tyr Thr Ser Asn Tyr Val Tyr

305 310 315 320

Asn Asp Pro Asn Leu Thr Leu Gly Glu Ser Tyr Asp Asn Asp Gly Leu

325 330 335

Leu Gly Lys Thr Phe Thr Ser Ile Asn Gly Thr Ser Ile Gly Asn Val

340 345 350

Thr Glu Pro Ser Trp Leu Tyr Asn Val Pro Trp Gly Ile Gly Lys Leu

355 360 365

Ile Arg His Ile Asn Gln Arg Tyr Asn Pro Gly Glu Ile Leu Val Thr

370 375 380

Glu Asn Gly Leu Cys Val Thr Gly Glu Pro Asn Trp Val Gly Asp Glu

385 390 395 400

Val Leu Lys Asp Gln Gly Arg Ile Asp Phe Tyr Lys Gly Tyr Leu Asn

405 410 415

Ala Ile Leu Asp Ala Val Glu Glu Gly Val Pro Val Ser Thr Phe Cys

420 425 430

Ala Trp Ser Met Phe Asp Asn Tyr Glu Trp Ala Arg Gly Tyr Thr Gln

435 440 445

Arg Phe Gly Ile Thr Tyr Val Asn Tyr Thr Thr Gln Glu Arg Phe Phe

450 455 460

Lys Asp Ser Ala Leu Trp Phe Gly Arg Leu Ile Asn Arg Thr Glu Gly

465 470 475 480

Val

Claims

1.一种D型β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的第182位的酪氨酸Y变为色氨酸W或亮氨酸L。

2.编码如权利要求1所述的一种D型β-葡萄糖苷酶突变体的DNA序列。

3.一种突变质粒，称为pET-28a- Glu1D-X，其特征在于，所述质粒包含有权利要求2所述的D型β-葡萄糖苷酶突变体的DNA序列，其中X为原始氨基酸-位置-突变后氨基酸。

4.一种突变体表达重组菌株，其特征在于，所述菌株包含有权利要求3所述的突变质粒。

5.一种D型β-葡萄糖苷酶突变体酶，其特征在于，所述突变体酶由IPTG诱导剂诱导权利要求4所述的突变体表达菌株获得。