CN103349794B - 重组α-半乳糖苷酶清除异种皮肤抗原的方法和产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低免疫原性非人类动物皮肤及其制备方法与应用，是经重组α-半乳糖苷酶酶解处理后细胞表面的异种抗原α-半乳糖(α-Gal)被清除的非人类动物皮肤。本发明的非人类动物皮肤具有低免疫原性的特点，主要原因是异种抗原α-Gal被清除，从而延长了移植后免疫排斥反应的发生时间，可用于覆盖烧伤病人的烧伤创面，降低异种移植过程中的免疫排斥反应，延长动物皮肤在烧伤创面的存活时间，从而达到促进创面愈合、减少疤痕形成的目的。

Description

重组α-半乳糖苷酶清除异种皮肤抗原的方法和产品

技术领域

本发明属于生物领域，涉及异种皮肤的制备，特别是涉及一种用α-半乳糖苷酶处理异种皮得到低免疫原性非人类动物皮肤的方法，该皮肤可作为医用敷料用于覆盖烧伤病人的烧伤创面，促进创面愈合，减少疤痕形成。

背景技术

烧伤是生活中常见病之一，发病率约为千分之一，其中十分之一需要入院治疗。烧伤具有伤害力大、危险性强并且容易感染、休克甚至死亡的特点。火灾中的烧伤人员，特别是大面积烧伤人员，如果创面得不到及时有效的封闭，势必会引起机体内环境紊乱、大量病原体入侵等，导致休克、感染及多脏器功能障碍等重症疾病的发生，使治疗难度加大，治疗成本大幅度增加。此外，由于创面得不到及时愈合或有效覆盖，将出现非生理性愈合过程，使创面疤痕形成增加，残疾程度加剧，从而严重影响伤员愈后生命质量。

覆盖物大致可分为三大类，一是天然皮肤，包括自体皮、异体皮和异种皮；二是体外培养的表皮细胞片；三是人工复合皮等生物复合材料。自体皮是封闭深度烧伤创面的最佳材料，但自体皮常因大面积烧伤等而严重不足，且切取自体皮对患者本身也是一种创伤，很多患者不愿意切取自体皮，而希望有其它皮肤代替。异体皮虽能解决上述问题，但其来源越来越困难，且不易控制HIV和HBV等的传播，并且它同样存在类似于异种皮移植的免疫排斥反应。此外，由于存在功能、结构及时间要求等方面的不足，培养表皮细胞及人工皮达到大量实际应用尚有很大的距离。所以对异种皮肤移植的研究就显得更为重要，寻找不被人体排斥且安全可靠的异种皮成为封闭烧伤创面的新策略。

猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面与人类最为相近，是研究多种人类疾病及器官移植等的首选动物。特别是猪的皮肤在结构、理化特性及功能等方面均与人类皮肤极为相似，并且猪的体表面积较大，皮源丰富；由于猪皮与人的皮肤结构非常类似，透气性好，可以防止血浆外渗，防止创口感染，早在1965年就被用于烫、烧伤患者的代用皮肤；此外，猪皮可以为表皮细胞的增殖铺垫基质和提供营养，有利于上皮细胞的增生、促进创面愈合。目前，猪皮作为临时的皮肤替代品在临床烧伤治疗中发挥作用，在欧洲国家，猪皮的应用率几乎与同种异体皮肤相当。一般来说，猪皮如果能够在创面覆盖20天以上，创面就能够基本愈合，达到理想的治疗效果。但是，猪皮会在短时间内(约一周)被排斥，所以病人在治疗过程中需多次换药、切削痂、植皮，既增加了患者的痛苦，又在供皮区留下瘢痕或色素沉着。近年来发展起来的微粒皮移植技术，也需应用异体(种)皮覆盖于微粒皮上，为自体微粒皮提供合适的生长增生环境，但临床上发现，在微粒皮还没有完全生长覆盖创面前，异体(种)皮就由于免疫排斥等而坏死脱落，使微粒皮失去继续生长扩展的环境，从而使手术达不到理想的效果。因此，如何降低病人对猪皮的免疫排斥反应、实现治疗途中不换药，不仅免去病人换药、切削痂之苦，减少了并发症，还可以大大缩短了病程，减轻病人的费用。

人体与猪皮之间存在免疫排斥反应的原理是：猪细胞表面存在一种称为α-Gal的异种抗原，而人体内先天存在着α-Gal的抗体。当把猪皮与伤员烧伤面的体液接触之后，人类抗原与猪细胞表面异种抗原结合，激活补体，产生免疫排斥反应，破坏猪皮的正常保护功能，从而导致皮肤移植失败。

如何降低或消除猪皮的免疫排斥反应，有相关的研究(如公开号为CN 1453045A的中国专利文献)公开了一种辐照药物猪皮的制造方法，即对猪皮通过辐照起到灭菌并降低免疫排斥反应，但该技术处理的猪皮主要是起到了灭菌的效果，猪皮上的主要异种抗原α-Gal依然存在，因此仍然引起较强的免疫排斥反应；公开号为CN 1266716A的中国专利文献公开了一种交联型猪脱细胞真皮片，通过胰酶和戊二醛等处理猪皮，去除了细胞上的α-Gal抗原,降低了免疫原性，但胰酶不是针对gal抗原的特异性酶，因此可能产生新的抗原，所以该技术不能保证完全清除猪皮的α-Gal抗原；重庆西南医院等在专利文献ZL00103528.2“一种用重组基因转染的异种皮肤”中，通过将CTLA4Ig基因转入猪皮肤，使其表达CTLA4Ig蛋白，竞争阻断抗原B7分子与T细胞上的CD28受体结合，抑制T细胞的活化，降低免疫原性，延长转染猪皮在烧伤创面的存活时间；该技术方案是从另一种信号通路上降低免疫原性，猪皮上的主要异种抗原α-Gal仍会引起免疫排斥反应。因此，现有技术均未能完全去除猪皮上的主要异种抗原α-Gal，而α-Gal是引起免疫排斥的主要原因。

美国的Qiyong Peter Liu公开了“一种用α-半乳糖苷酶制备非人类组织用于异种移植的方法”(Qiyong Peter Liu,Henrik Clausen,Velico Medical,Inc.Method of preparingnon-human tissues for xenotransplantation using α-galactosidase,US7951552B2)，描述了其克隆的α-半乳糖苷酶用于清除异种红细胞的免疫显性抗原α-Gal抗原方面的具体实施例，并提示该克隆的α-半乳糖苷酶在非人类组织异种移植给人中的应用。该文献为清除异种红细胞中α-Gal抗原提供了一种新思路，在实施层面，其使用的酶解缓冲液为200mM甘氨酸(glycine)，3mM NaCl，pH 6.8。该文献对于是否可以以及如何清除异种皮肤α-Gal抗原没有明确提示。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单且行之有效的清除非人类动物皮肤异种抗原的方法，以及一种处理得到低免疫原性的非人类动物皮肤的方法。

一个方面，本发明提供重组α-半乳糖苷酶在清除非人类动物皮肤异种抗原或制备低免疫原性非人类动物皮肤中的应用，所述重组α-半乳糖苷酶的核苷酸序列由序列表中序列1表示。

另一方面，本发明提供一种清除非人类动物皮肤异种抗原的方法，包括将非人类动物皮用酶解缓冲液清洗，再放入含重组α-半乳糖苷酶的酶解缓冲液中进行酶解的过程；经酶解后的非人类动物皮为酶解皮；所述重组α-半乳糖苷酶为前所述。

其中，所述酶解缓冲液为质量浓度5％的葡萄糖溶液；所述重组α-半乳糖苷酶在酶解缓冲液中的浓度为0.01-1U/mL，优选为1U/mL；所述酶解处理条件为在15℃-37℃下酶解2-6小时，优选为在26℃下酶解2小时。

还一方面，本发明还提供上述方法得到的酶解皮。所述酶解皮上异种抗原α-Gal清除率高于99％，具有低免疫原性。

再一方面，本发明提供一种低免疫原性非人类动物皮肤的制备方法，包括以下步骤：

1)皮片检测及灭菌处理：选择无皮肤病的动物皮片，毛茬清理后，用水冲洗，依次用新洁尔灭液和生理盐水漂洗，凉干，再用庆大霉素液漂洗，沥水晾干，置于紫外照射台上照射；

2)剖层、开沟、裁切：用精密剖层机去掉步骤1)处理后皮片的脂肪及部分真皮，制成厚皮片，平铺在操作台上，用梳式开沟器在真皮面开沟，用生理盐水冲洗皮片，剪裁成各种规定的规格；

3)酶解：将步骤2)剪裁后皮片用酶解缓冲液冲洗，然后放入含重组α-半乳糖苷酶0.1-1U/mL的酶解缓冲液中，在15-37℃下酶解2-6小时；所述酶解缓冲液为5％的葡萄糖溶液；所述重组α-半乳糖苷酶为权利要求1中所定义的；优选重组α-半乳糖苷酶的含量为1U/mL，酶解条件为在26℃下酶解2小时；

4)抗生素消毒：将步骤3)酶解后的皮片依次经庆大霉素液、生理盐水、庆大霉素液、生理盐水漂洗后，得到低免疫原性非人类动物皮肤。

所述制备方法中，步骤1)中的新洁尔灭液的质量百分浓度为0.1％，用新洁尔灭液的漂洗时间为15min，用生理盐水的漂洗时间为5-15min，优选为5min；庆大霉素液的质量百分浓度为0.16％，用庆大霉素液的漂洗时间为15min；动物皮肤在紫外照射台上照射时间为20-30min。

步骤2)中将动物皮肤制成0.4-0.6mm厚皮片。

步骤4)中庆大霉素液的质量百分浓度为0.16％，将皮片依次用庆大霉素液、生理盐水、庆大霉素液、生理盐水的漂洗时间为5-15min，优选为5min。

又一方面，本发明还提供所述方法制备得到的低免疫原性非人类动物皮肤，其上异种抗原α-Gal清除率高于99％，具有低免疫原性，可作为医用低异种抗原烧伤敷料。

本发明中，所述的非人类动物皮肤是指来源于不同种的个体的皮肤，如猪、牛、羊、马皮肤等，优选使用猪皮肤；所述猪皮肤可以是任一种品系的猪的皮肤，例如五指山猪、荣昌猪、巴马香猪等，所述猪皮肤可以是任何年龄的猪皮肤，以取自2个月猪龄的猪皮肤为佳。

采用以上方案，本发明利用重组α-半乳糖苷酶酶解清除非人类动物皮肤表面异种抗原α-半乳糖(α-Gal)，得到的非人类动物皮肤具有低免疫原性的特点，其主要原因是异种抗原α-Gal被清除，从而降低异种移植过程中的免疫排斥反应，延长动物皮肤在烧伤创面的存活时间，从而达到促进创面愈合、减少疤痕形成的目的。

本发明所用α-半乳糖苷酶为专利号ZL 201010189985.9特定的重组α-半乳糖苷酶，该酶的酶活性高，可以完全清除异种皮肤的主要异种α-Gal；酶解皮肤中使用5％葡萄糖液作为酶解缓冲液，可以为GLA提供高效的酶解环境，由于5％葡萄糖溶液成本低廉且有商品化的产品，而且是在临床上长期应用的大输液制品，因此更容易被临床上接受和使用。

本发明具有以下优点：

1.材料来源广泛、易得，价格低廉。

2.制备容易：只需对非人类动物皮肤用α-半乳糖苷酶进行酶解处理。

3.产品无抗原性，具有Integra人工皮和去细胞真皮基质(ADM)两种皮肤代替物的功能特点。本发明经α-半乳糖苷酶酶解处理后的非人类动物皮肤与integra人工皮不仅结构功能相似，而且其真皮基质部分更加接近于人的真皮基质。因此，可以作为暂时性的创面覆盖物保护创面。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为纯化的α-半乳糖苷酶的12％SDS-PAGE电泳图谱

图2为猪红细胞表面α-Gal抗原清除率的流式细胞仪检测结果

图3为牛红细胞表面α-Gal抗原清除率的流式细胞仪检测结果

图4为经α-半乳糖苷酶酶解的猪皮表面α-Gal抗原清除率的免疫荧光检测结果

图5为经α-半乳糖苷酶酶解的猪成纤维细胞表面α-Gal抗原清除率的免疫荧光检测结果

具体实施方式

本发明主要是利用α-半乳糖苷酶酶解清除非人类动物皮肤表面α-Gal抗原而得到低免疫原性非人类动物皮肤。

α-半乳糖苷酶是一种普遍存在于生物体内的外切糖苷酶，它能够特异性切除糖链最外端的α-1,3-Gal。在利用α-半乳糖苷酶进行B→O血型转变的研究中，发明人克隆了一种来源于脆弱类杆菌(Bacteriodes.frigilis)的重组α-半乳糖苷酶α-gal。该酶α-gal已申请国家发明专利，并已获得授权，专利号：ZL 201010189985.9，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。α-gal具有活性更高，特异性更强的特点，其清除红细胞B抗原的能力是咖啡豆α-半乳糖苷酶的240倍。发明人深入研究发现，该重组酶α-gal不仅可以切除支链多糖末端的α-Gal，也可以切除直链多糖末端的α-Gal，而异种抗原表位(Galαl-3Galβl-4GlcNAc-R和Galαl-3Galβl-4GlcNAcβ1-3Galβl-4Glc-R)正是以α-Gal为末端的直链多糖结构。因此，本发明充分利用以上重要研究成果，提出该重组α-半乳糖苷酶在清除非人类动物皮肤异种抗原或制备低免疫原性非人类动物皮肤中的应用，并用该重组α-半乳糖苷酶酶解处理得到低免疫原性的非人类动物皮肤。本发明内容及实施例中涉及的重组α-半乳糖苷酶均指该重组酶α-gal。

本发明提供一种清除非人类动物皮肤异种抗原的方法，包括将非人类动物皮用酶解缓冲液清洗，再放入含重组α-半乳糖苷酶的酶解缓冲液中进行酶解的过程。经酶解后的非人类动物皮(本发明中称为“酶解皮”)，酶解皮上异种皮肤抗原α-Gal清除率高于99％，具有低免疫原性。

其中，所述酶解缓冲液选用5％(质量浓度)葡萄糖溶液；所述酶解中，重组α-半乳糖苷酶在酶解缓冲液中的浓度为0.01-1U/mL，优选为1U/mL；所述酶解处理条件为在15℃-37℃下酶解2-6小时，优选为在26℃下酶解2小时。

所述非人类动物皮肤，是指来源于不同种的个体的皮肤，如猪、牛、羊、马皮肤等，优选使用猪皮肤；所述猪皮肤可以是任一种品系的猪的皮肤，例如五指山猪、荣昌猪、巴马香猪等，所述猪皮肤可以是任何年龄的猪皮肤，以取自2个月猪龄的猪皮肤为佳。

该酶解皮也属于本发明所提供的内容。

本发明还提供一种制备低免疫原性非人类动物皮肤的方法，可包括以下步骤：

1)皮片灭菌处理：挑选检疫合格的动物的皮片，毛茬清理后，用水冲洗，依次用新洁尔灭液和生理盐水漂洗，凉干，输送至洁净区，将动物皮肤再用庆大霉素液漂洗，沥水晾干，将动物皮肤置于紫外照射台上照射，传入皮片机械进行处理；

2)剖层、开沟、裁切：用精密剖层机去掉脂肪及部分真皮，制成厚皮片，然后将皮片平铺在操作台上，用梳式开沟器在真皮面开沟，用生理盐水冲洗皮片，在定制的裁切机上剪裁成各种规定的规格；

3)酶解：将皮片用酶解缓冲液(质量浓度5％葡萄糖溶液)洗后放入含重组α-半乳糖苷酶0.1-1U/mL的酶解缓冲液中，在15-37℃下酶解2-6小时，取出酶解后皮片；

4)酶解后皮片抗生素消毒：将酶解后的皮片依此经庆大霉素液、生理盐水、庆大霉素液、生理盐水漂洗后，得到低免疫原性非人类动物皮肤。

其中，所述动物皮片是指来源于不同种的个体的皮肤，如猪、牛、羊、马皮肤等，优选使用猪皮肤；所述猪皮肤可以是任一种品系的猪的皮肤，例如五指山猪、荣昌猪、巴马香猪等，猪皮肤可以是任何年龄的猪皮肤，以取自2个月猪龄的猪皮肤为佳。

所述步骤1)中的新洁尔灭液的质量百分浓度为0.1％，用新洁尔灭液的漂洗时间为15min，用生理盐水的漂洗时间为5-15min，优选为5min；庆大霉素液的质量百分浓度为0.16％，用庆大霉素液的漂洗时间为15min，动物皮肤在紫外照射台照射20-30min。

所述步骤2)中将动物皮肤制成0.4-0.6mm厚皮片；在剖层、开沟、裁切过程中收集的废料进行集中处理。

所述步骤3)中α-半乳糖苷酶的含量优选为1U/mL，酶解条件优选为在26℃下酶解2小时。

所述步骤4)中庆大霉素液的质量百分浓度为0.16％，将皮片依次用庆大霉素液、生理盐水、庆大霉素液、生理盐水的漂洗时间为5min。

用以上方法制备得到低免疫原性非人类动物皮肤也属于本发明所提供的内容。

所述酶解皮在制备医用异种皮烧伤敷料中的应用以及低免疫原性非人类动物皮肤作为医用异种皮烧伤敷料的应用也属于本发明所提供的内容。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度(单位g/100mL)或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、制备重组α-半乳糖苷酶

取-70℃冻存的重组α-半乳糖苷酶菌株pET22b-Gal/BL21(DE3)(构建方法见公开号为CN 101845425A的中国专利文献)，在LB平板(Amp⁺)上划线活化菌种，第二天挑取单克隆培养过夜(10-12小时)，第三天转接扩大培养至D₆₀₀为0.8时加入IPTG(终浓度为0.1mM)诱导目的蛋白的表达，诱导时间4小时，离心收集菌体，用Buffer A(20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，25mM NaCl，pH5.0)悬浮菌体，超声破碎裂解菌体，离心收集上清(4℃、9000r/min离心20min)，将上清液上样至BufferA平衡过的阳离子层析柱(Hitrap^TM SP-HP)，用10倍柱体积的Buffer A洗柱，用BufferB(20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，0.3M NaCl，pH7.6)洗脱目的蛋白。将洗脱的蛋白用水稀释至NaCl浓度为60mM，再用1M Tris调pH至8.5，上样至Buffer C(40mMTris·HCl，10mM NaCl，pH 8.5)平衡过的阴离子交换层析柱(Hitrap^TM Q XL)，接上样流出液，用10倍柱体积的Buffer C洗柱，用Buffer D(40mM Tris·HCl，300mMNaCl，pH8.5)洗脱，通过测α-半乳糖苷酶活性判断目的蛋白峰。纯化的蛋白用截留分子量为10KD的超滤管超滤浓缩并更换缓冲液为等渗的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液缓冲液(77.25mmol/L Na₂HPO₄，11.375mmol/L柠檬酸，53.9mmol/L NaCl，pH 6.8)。将得到的重组α-半乳糖苷酶进行12％SDS-PAGE电泳，电泳结果如图1所示(1.超声上清，2.阳离子纯化样品，3.阴离子纯化样品，M.中低分子量蛋白标准)，呈现65KD的单一带，与预期结果相符，蛋白为重组α-半乳糖苷酶。浓缩后的蛋白用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司)确定蛋白浓度为5mg/mL，比活性为2U/mg。

实施例2、猪红细胞的酶解实验及α-Gal抗原清除率的检测

实验中，重组α-半乳糖苷酶可为按实施例1方法制备得到的；酶解缓冲液为质量浓度为5％葡萄糖溶液。

猪红细胞用酶解缓冲液按体积比1：1、1：4洗涤两次，使红细胞压积为40％；按0.005mg/mL压积红细胞的剂量向其中加入重组α-半乳糖苷酶(如实施例1制备得到)，在26℃酶解反应箱内缓慢振荡孵育1小时；然后用PBS液(配方：每L中含NaCl 8g,Na₂HPO₄1.44g,KCl 0.2g,KH₂PO₄0.24g)按体积比1：4洗涤红细胞4次，加入1/2体积的MAP液(配方：每L中含C₆H₅Na₃O₇.2H₂O 1.5g,C₆H₈O₇.H₂O0.2g,C₆H₁₂O₆.H₂O 7.93g,NaH₂PO₄.2H₂O 0.94g,C₅H₅N₅0.14g,NaCl 4.97g,C₆H₁₄O₆14.57g。)保存红细胞，或用生理盐水制备成2％的红细胞悬液，检测猪红细胞表面α-Gal抗原的清除率。

用质量浓度2％的多聚甲醛固定酶解前后的猪红细胞过夜(10-12小时)，用FITC-IB4 lectin(购自Sigma。FITC-IB4 lectin用于检测猪红细胞表面的Gal抗原)25μg/mL标记，室温反应3小时，用PBS洗涤2遍，用流式细胞仪检测红细胞的荧光强度。

α-Gal清除率＝(RBCs的平均荧光强度－酶处理的RBCs的平均荧光强度)/(RBCs的平均荧光强度-空白对照的平均荧光强度)×100％。

流式细胞仪检测结果如图2(A.blank(空白，未标记的猪红细胞)，B.未酶解的猪红细胞(阳性对照)，C.酶解处理的猪红细胞)所示，检测结果表明猪红细胞表面的α-Gal抗原可以被α-半乳糖苷酶清除，清除率大于99％。

实施例3、牛红细胞的酶解实验及α-Gal抗原清除率的检测

同实施例2的操作，使用牛红细胞进行酶解实验。

流式细胞仪检测结果如图3(A.blank(空白，未标记的牛红细胞)，B.未酶解的牛红细胞(阳性对照)，C.酶解处理的牛红细胞)所示，检测结果表明牛红细胞表面的α-Gal抗原可以被α-半乳糖苷酶清除，清除率大于99％。

实施例4、制备经重组α-半乳糖苷酶酶解处理的猪皮及猪皮上的α-Gal清除率检测

一、制备经α-半乳糖苷酶酶解处理的猪皮

以猪皮为例(还可为牛、羊、马皮肤等)，本发明用重组α-半乳糖苷酶酶解制备低免疫原性非人类动物皮肤，包括以下步骤：

1)皮片的选取及灭菌处理：挑选检疫合格的源自2-6个月龄猪皮皮片，毛茬清理后，用水冲洗，依次用质量百分浓度为0.1％的新洁尔灭液和生理盐水漂洗5min(5-15min均可)，凉干，输送至洁净区，将动物皮肤再用质量百分浓度为0.16％庆大霉素液漂洗15min沥水晾干，将动物皮肤置于紫外照射台上照射时间为20-30min，传入皮片机械进行处理。

2)剖层、开沟、裁切：用精密剖层机去掉脂肪及部分真皮，制成0.5mm(0.4-0.6mm均可)厚皮片，然后将皮片平铺在操作台上，用梳式开沟器在真皮面开沟，用生理盐水冲洗皮片，在定制的裁切机上剪裁成各种规定的规格。在剖层、开沟、裁切过程中收集的废料进行集中处理。

3)酶解皮肤：将皮片用酶解缓冲液(5％葡萄糖溶液)洗后放入含α-半乳糖苷酶使其终浓度为1U/mL的酶解缓冲液中，在26℃下酶解2小时，酶解后取出得到酶解皮。

4)抗生素消毒：将酶解皮依次经质量百分浓度为0.16％的庆大霉素液、生理盐水、0.16％的庆大霉素液、生理盐水漂洗5min(5-15min均可)后，得到经α-半乳糖苷酶酶解处理的猪皮。

二、免疫荧光法检测猪皮上的α-Gal清除率

因为酶解法获得的猪皮只是其最外侧清除了α-Gal抗原，而免疫荧光的操作过程中可能会丢失最外侧的边缘。为了清楚的展示酶解效果，用步骤一中经重组α-半乳糖苷酶酶解处理的猪皮的冰冻切片进行检测。将经重组α-半乳糖苷酶酶解前后的猪皮的冰冻切片分别用免疫荧光法检测α-Gal抗原，具体检测为：猪皮冰冻切片在PBS中平衡10min，然后用20％的胎牛血清室温封闭0.5h，之后加上20μg/mL的FITC-IB4lectin，4℃标记过夜，第二天PBS洗2遍后荧光显微镜下观察照相。

检测结果如图4(A.酶解前猪皮，B.酶解后猪皮)所示，酶解后的猪皮几乎看不到荧光，酶解前的猪皮则有很强的荧光，证明猪皮表面的α-Gal表位可以被α-半乳糖苷酶清除。通过图像分析，α-Gal表位抗原清除率大于99％。

实施例5、猪成纤维细胞的酶解实验及α-Gal抗原清除率的检测

培养原代猪成纤维细胞，培养条件为20％FCS的高糖DMEM。猪成纤维细胞用胰酶消化后，进行酶解，酶浓度为1U/Ml，酶解过程及检测同实施例2的操作。

流式细胞仪检测结果如图5(A.Gal基因敲除的猪成纤维细胞，B.未酶解的猪成纤维细胞(阳性对照)，C.酶解处理的猪成纤维细胞)所示，检测结果表明猪成纤维细胞表面的α-Gal抗原可以被α-半乳糖苷酶清除，清除率大于99％。

实施例6：酶解液的优化

实施例4中，取其步骤2)制备得到的皮片，用不同酶解液进行实施例5的酶解，以此实验比较不同酶解液的酶解效果。

对照酶解液1：200mM甘氨酸，3mM NaCl，pH 6.8；

对照酶解液2：250mM甘氨酸，3mM NaCl，pH 6.8；

酶解液3：5％葡萄糖溶液.

使用实施例5中的检测方法，对不同酶解液得到的酶解皮进行荧光检测，结果显示在三种缓冲液中α-Gal抗原的清除率分别为95％，96.5％和99.1％。表明重组α-半乳糖苷酶在5％葡萄糖溶液这个缓冲液中酶解效率最高，且5％葡萄糖溶液是在临床上长期应用的大输液制品，价格低廉且有商品化的产品，有助于本发明的产业应用。

本发明通过实例详细介绍了一种简单且行之有效的清除非人类动物皮肤异种抗原的方法，以及一种处理得到低免疫原性的非人类动物皮肤的方法，经实验验证，处理后的皮肤α-Gal表位抗原清除率大于99％，表明处理得到的低免疫原性的非人类动物皮肤可以用于覆盖烧伤病人的烧伤创面，降低异种移植过程中的免疫排斥反应，延长动物皮肤在烧伤创面的存活时间，从而达到促进创面愈合、减少疤痕形成的目的。

Claims (22)

1.一种清除非人类动物皮肤异种抗原的方法，包括将非人类动物皮用酶解缓冲液清洗，再放入含重组α-半乳糖苷酶的酶解缓冲液中进行酶解的过程；经酶解后的非人类动物皮为酶解皮；所述重组α-半乳糖苷酶的核苷酸序列由序列表中序列1表示。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酶解缓冲液为质量浓度5％的葡萄糖溶液；所述重组α-半乳糖苷酶在酶解缓冲液中的浓度为0.01-1U/mL；所述酶解处理条件为在15℃-37℃下酶解2-6小时。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述重组α-半乳糖苷酶在酶解缓冲液中的浓度为1U/mL。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述酶解处理条件为在26℃下酶解2小时。

5.根据权利要求1至4任一所述方法，其特征在于，所述的非人类动物皮肤是来源于猪、牛、羊、马的皮肤。

6.根据权利要求1至4任一所述方法，其特征在于，所述的非人类动物皮肤是来源于猪的皮肤。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述猪是五指山猪、荣昌猪或巴马香猪。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述猪皮肤是来源于2个月猪龄的猪皮肤。

9.权利要求1至8任一所述方法得到的酶解皮，所述酶解皮上异种抗原α-Gal清除率高于99％，具有低免疫原性。

10.一种低免疫原性非人类动物皮肤的制备方法，包括以下步骤：

1)皮片检测及灭菌处理：选择无皮肤病的动物皮片，毛茬清理后，用水冲洗，依次用新洁尔灭液和生理盐水漂洗，凉干，再用庆大霉素液漂洗，沥水晾干，置于紫外照射台上照射；

2)剖层、开沟、裁切：用精密剖层机去掉步骤1)处理后皮片的脂肪及部分真皮，制成厚皮片，平铺在操作台上，用梳式开沟器在真皮面开沟，用生理盐水冲洗皮片，剪裁成各种规定的规格；

3)酶解：将步骤2)剪裁后皮片用酶解缓冲液冲洗，然后放入含重组α-半乳糖苷酶0.1-1U/mL的酶解缓冲液中，在15-37℃下酶解2-6小时；所述酶解缓冲液为5％的葡萄糖溶液；所述重组α-半乳糖苷酶的核苷酸序列由序列表中序列1表示；

4)抗生素消毒：将步骤3)酶解后的皮片依次经庆大霉素液、生理盐水、庆大霉素液、生理盐水漂洗后，得到低免疫原性非人类动物皮肤。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的新洁尔灭液的质量百分浓度为0.1％，用新洁尔灭液的漂洗时间为15min，用生理盐水的漂洗时间为5-15min；庆大霉素液的质量百分浓度为0.16％，用庆大霉素液的漂洗时间为15min；动物皮肤在紫外照射台上照射时间为20-30min。

12.根据权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中用生理盐水的漂洗时间为5min。

13.根据权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中将动物皮肤制成0.4-0.6mm厚皮片。

14.根据权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中重组α-半乳糖苷酶的含量为1U/mL。

15.根据权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中酶解条件为在26℃下酶解2小时。

16.根据权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中庆大霉素液的质量百分浓度为0.16％，将皮片依次用庆大霉素液、生理盐水、庆大霉素液、生理盐水的漂洗时间为5-15min。

17.根据权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中将皮片依次用庆大霉素液、生理盐水、庆大霉素液、生理盐水的漂洗时间为5min。

18.根据权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于，所述的非人类动物皮肤是来源于猪、牛、羊、马的皮肤。

19.根据权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于，所述的非人类动物皮肤是来源于猪的皮肤。

20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述猪是五指山猪、荣昌猪或巴马香猪。

21.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述猪皮肤是来源于2个月猪龄的猪皮肤。

22.权利要求10至21任一所述方法制备得到的低免疫原性非人类动物皮肤，其上异种抗原α-Gal清除率高于99％，具有低免疫原性，可作为医用低异种抗原烧伤敷料。