CN113368306A

CN113368306A - 低免疫原性生物材料及其制备方法和用途

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Publication number: CN113368306A
Application number: CN202110297173.4A
Authority: CN
Inventors: 潘登科; 杜明春
Original assignee: Chengdu Zhongke Aoge Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Zhongke Aoge Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2021-09-10

Abstract

本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种降低动物源性生物材料免疫原性的方法，以及由此方法制备的生物材料及其用途。利用本发明加工制备的生物材料，不含活细胞，通过基因编辑技术从原材料源头降低其免疫原性，使用优化的脱细胞处理技术和交联技术进一步降低其免疫原性。根据原材料所属组织/器官的差异性，本发明的生物材料用于临床不同组织/器官的修复再生，在使用过程中可以结合活性分子和/或活细胞。

Description

低免疫原性生物材料及其制备方法和用途

本申请要求于2020年03月23日提交中国专利局、申请号为202010207636.9、发明名称为“低免疫原性生物材料及其制备方法和用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及生物材料领域，特别涉及低免疫原性生物材料及其制备方法和用途。

背景技术

动物源性生物材料已广泛用于组织工程与再生医学研究，在临床应用中展示出巨大潜力。面对异种生物材料存在的免疫原性问题，一般通过去除各种组织器官中的异种细胞，保留其中复杂成分和精密结构，即可得到相应组织/器官的脱细胞基质材料，降低其免疫原性。现有降低生物材料免疫原性的方法主要包括物理法，化学法和生物法(酶法)。仅从脱细胞程度上说，各种方法均可制备出脱细胞程度较高的产品。但从临床应用效果来看，产品的力学强度或生物学活性等仍不令人满意。主要原因在于：现有的脱细胞方案均不可避免的导致细胞外基质成分的丢失，尤其是可溶性的蛋白多糖和糖蛋白成分，丢失率可达80％。为了提高产品性能，满足临床治疗效果，需要进一步优化降低生物材料免疫原性的技术方案。

发明内容

有鉴于此，本发明提供低免疫原性生物材料及其制备方法和用途。利用本发明加工制备的生物材料，不含活细胞，通过基因编辑技术从原材料源头降低其免疫原性，使用优化的脱细胞处理技术和交联技术进一步降低其免疫原性。根据原材料所属组织/器官的差异性，本发明的生物材料用于临床不同组织/器官的修复再生，在使用过程中可以结合活性分子和/或活细胞。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了降低动物源性生物材料免疫原性的方法，包括如下步骤：

步骤1、通过基因编辑获得低免疫源性动物；

步骤2、采集所述低免疫源性动物的组织或器官作为原料；

步骤3、取步骤2制得的所述原料脱细胞；所述脱细胞的次数至少为2次；

步骤4、取步骤3制得的材料交联化；所述交联化的次数至少为2次。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述脱细胞的方法包括物理方法、化学方法和/或生物方法；所述物理方法包括反复冻融、超声处理；所述化学方法包括SDS处理；所述生物方法包括中性蛋白酶酶解；

所述物理方法、化学方法或生物方法的处理次数分别为0～10次，且所述脱细胞的方法中至少有两种的处理次数不同时为0。

在本发明的一些具体实施方案中，所述反复冻融的冷冻温度为-20～-196℃(液氮)，冷冻时间为5min～24h，解冻温度为4～40℃，解冻时间为0.5～6h。

在本发明的一些具体实施方案中，所述超声处理的低频频率为10～40KHz，低频处理时间为5min～24h；高频频率为60～120KHz，高频处理时间为5min～24h；超声功率为100W～10KW，超声温度为0～40℃。

在本发明的一些具体实施方案中，所述中性蛋白酶的浓度范围为0.001～5wt.％，酶活为500～130000U/g；处理温度为0～40℃，振荡频率为50～3000rpm，处理时间为0.5～24h。

在本发明的一些具体实施方案中，所述SDS的浓度范围为0.001～5wt.％，振荡频率为100～3000rpm，处理温度为0～40℃，处理时间为0.5～24h。

在本发明的一些具体实施方案中，所述脱细胞的方法可以将物理方法、化学方法和/或生物方法进行叠加使用；

所述叠加使用包括将超声处理、SDS处理、中性蛋白酶酶解中的至少两种进行叠加同时使用；

所述叠加使用包括将超声处理、SDS处理进行叠加同时使用；

所述叠加使用包括将超声处理、中性蛋白酶酶解进行叠加同时使用；

所述叠加使用包括将SDS处理、中性蛋白酶酶解进行叠加同时使用；

所述叠加使用包括将超声处理、SDS处理、中性蛋白酶酶解进行叠加同时使用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述交联化采用的交联剂包括化学交联剂和/或生物交联剂中的至少一种；

所述化学交联剂包括醛类、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺酯类(NHS酯)、马来酰亚胺类、卤乙酰基类、二硫代联吡啶、酰肼类、碳二亚酰胺类中的一种或两者以上的混合物；

所述醛类包括戊二醛、多聚甲醛中的一种或两者的混合物；

所述生物交联剂包括原花青素、京尼平中的一种或两者的混合物；

所述交联剂的浓度为0.00001～5wt.％，所述交联化的温度为0～40℃，每次交联化的时间为0.5～12h，所述交联化的次数为1～10次。

在本发明的一些具体实施方案中，所述基因编辑包括巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统中的至少一种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述基因编辑包括基因敲除和/或基因转入；

所述基因敲除中敲除的基因包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2或PERV中的至少一种；

基因转入中转入的基因包括hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI或EPCR中的至少一种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述动物包括猪、牛、羊、马、猴、狗、兔、鸡、鼠、蚕、鱼、海洋生物、驴中的至少一种；所述低免疫源性动物为基因编辑后稳定传代3代以上的动物。在另一些具体实施方案中，选用基因编辑后稳定传代6代的动物制备生物材料。

所述鱼包括淡水鱼类。

所述海洋生物包括海洋动物和海洋植物；所述海洋动物包括海洋哺乳动物、海洋爬行动物、海洋鱼类、海洋节肢动物、藤壶、海洋软体动物、海洋棘皮动物或海洋腔肠动物中的一种或多种。所述海洋哺乳动物包括蓝鲸、抹香鲸、虎鲸、齿鲸、海豚、海豹、海狮、儒艮中的一种或多种。所述海洋爬行动物包括海蛇、海龟中的一种或多种。所述海洋鱼类包括前口蝠鲼、电鳐、刺鳐、星鳐、何氏鳐、中国团扇鳐、瞻星鱼、电鳗、康吉鳗、电鲶、箱鲀、鲂鮄、海马、石首鱼类、象鼻鱼、鲨鱼、蝴蝶鱼、刺盖鱼、甲尻鱼、石斑鱼、粗皮鲷、躄鱼、蝙蝠鱼、小丑鱼、带鱼、龙头鱼、烛光鱼、翻车鱼中的一种或多种。所述海洋节肢动物包括鲎、虾、蟹中的一种或多种。所述海洋软体动物包括石鳖、螠蛏、海兔中的一种或多种。所述海洋棘皮动物包括海星、海胆、海参中的一种或多种。所述海洋腔肠动物包括水母、薮枝螅、海蜇、珊瑚或海葵中的一种或多种。所述海洋植物包括浮游藻和底栖藻；所述底栖藻包括绿藻类、褐藻类和红藻类。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组织包括上皮组织、结缔组织、肌组织或神经组织中的至少一种；

所述器官包括骨骼系统、肌肉系统、消化系统、韧带系统、呼吸系统、泌尿系统、内分泌腺、循环系统、神经系统、感觉器官、皮肤系统中的至少一种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述上皮组织包括感觉上皮、腺上皮、被覆上皮中的至少一种；所述被覆上皮包括复层上皮或单层上皮；所述复层上皮包括复层扁平(鳞状)上皮、移行上皮；所述单层上皮包括单层扁平(鳞状)上皮、里、单层柱状上皮(有的有纤毛)、假复层柱状上皮(有的有纤毛)；

所述结缔组织包括血液、骨组织、软骨组织、固有结缔组织；所述固有结缔组织包括脂肪组织、网状组织、致密结缔组织或疏松结缔组织；

所述肌组织包括平滑肌、心肌或骨骼肌；

所述神经组织包括周围神经系统或中枢神经系统。

在本发明的一些具体实施方案中，所述消化系统包括：口部、牙齿、舌、唾腺、腮腺、下颌腺、舌下腺、咽、食道、胃、小肠、十二指肠、空肠、回肠、大肠、肝脏、胆囊、肠系膜、胰脏中的至少一种；

所述呼吸系统包括：鼻腔、咽、喉、气管、支气管、肺、横膈膜中的至少一种；

所述泌尿系统包括：肾、输尿管、膀胱、尿道中的至少一种；

所述生殖系统包括：女性生殖系统和/或男性生殖系统；所述女性生殖系统包括内生殖器官和/或外生殖器官；所述内生殖器官包括卵巢、输卵管、子宫、阴道中的至少一种；外生殖器官包括女阴、阴蒂、胎盘中的至少一种；所述男性生殖系统包括内生殖器官和/或外生殖器官；所述内生殖器官包括睾丸、附睾、输精管、精囊、前列腺、尿道球腺中的至少一种；所述外生殖器官包括阴茎、阴囊中的至少一种；

所述内分泌腺包括脑下垂体、松果体、甲状腺、副甲状腺、肾上腺、胰腺中的至少一种；

所述循环系统包括：心血管系统或淋巴系统；

所述心血管系统包括心脏、动脉、静脉、微血管中的至少一种；

所述淋巴系统包括淋巴管、淋巴结、骨髓、胸腺、脾脏、肠相关淋巴组织、扁桃腺中的至少一种；

所述神经系统包括中枢神经系统或周边蛇精系统；所述中枢神经系统包括大脑、大脑半球、间脑、脑干、中脑、桥脑、延髓、小脑、脊髓、脑室、脉络丛；所述周边神经系统包括：脑神经、脊神经、神经节、肠神经系统；

所述感觉器官包括眼、耳、鼻、口；所述眼包括角膜、虹膜、睫状体、晶状体、视网膜中的至少一种；所述耳包括外耳、耳垂、鼓膜、中耳、听小骨、内耳、耳蜗、耳前庭、半规管；所述鼻包括嗅上皮细胞；所述口包括舌、味蕾中的至少一种；

所述皮肤系统包括表皮、真皮、皮下组织、附属器官、血管、淋巴管、神经或肌肉中的至少一种；所述表皮包括角质层、透明层、颗粒层、棘细胞层、基底层中的至少一种；所述真皮包括纤维、基质或细胞中的至少一种；所述纤维包括胶原纤维、弹力纤维或网状纤维中的至少一种；所述细胞包括成纤维细胞、组织细胞、肥大细胞中的至少一种；所述附属器官包括汗腺、皮脂腺、毛发、指(趾)甲中的至少一种；所述汗腺包括大汗腺或小汗腺中的至少一种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述骨骼系统包括人体骨架、关节、韧带；所述骨骼系统包括中轴骨(26块)、胸廓(25块)、颅骨(23块)、附肢骨骼或听小骨中的至少一种；

所述中轴骨包括：颈椎7块、胸椎12块、腰椎5块、骶椎5块(后期发育为1块骶骨)、尾椎4块(后期发育为1块尾骨)

所述胸廓包括胸骨(1块)、肋骨(从第一到第十二，共12对)中的至少一种；

所述颅骨包括脑颅骨、面颅骨中的至少一种；

所述脑颅骨(8)包括：额骨、筛骨、蝶骨、枕骨(各1块)；顶骨、颞骨(各1对)中的至少一种；

所述面颅骨(15块)包括：上颌骨、颧骨、鼻骨、泪骨、腭骨、下鼻甲(各1对)；下颌骨、舌骨、犁骨(各1块)中的至少一种；

所述附肢骨骼包括上肢骨或下肢骨中的至少一种；

所述上肢骨(共64块，每侧各32块)包括：肩胛骨、锁骨、肱骨、前臂骨、手骨中的至少一种；所述前臂骨包括桡骨或尺骨中的至少一种；

所述手骨包括腕骨(共8块)、掌骨(共5块)或指骨(共14块，除拇指2块其余各指均为3块)中的至少一种；所述腕骨包括：手舟骨、月骨、三角骨、腕豆骨、大多角骨、小多角骨、头状骨、钩骨中的至少一种；

所述下肢骨(62块)包括髋骨(由髂骨、耻骨、坐骨融合而成)、股骨、髌骨、小腿骨或足骨；

所述小腿骨包括胫骨或腓骨中的至少一种；

所述足骨包括跗骨(共7块)、跖骨跖骨(共5块)或趾骨(共14块，除拇趾2块其余各趾均为3块)中的至少一种；

所述跗骨包括：距骨、跟骨、足舟骨、骰骨(各1块)、楔骨3块中的至少一种；

所述肌肉系统包括头部肌、颈前外侧肌、躯干肌、上肢肌、下肢肌中的至少一种；

一、头部肌

(一)颅面肌：1.颅顶肌；2.眼周围肌(眼轮匝肌)；3.口周围肌(口轮匝肌)；

(二)咀嚼肌，包括：咬肌、颞肌、翼内肌、翼外肌；

二、颈前外侧肌

(一)颈浅层肌和颈外侧肌，包括：颈阔肌、胸锁乳突肌；

(二)舌骨上肌群，包括：二腹肌、茎突舌骨肌、下颌舌骨肌、颏舌骨肌(三)舌骨下肌群，包括：胸骨舌骨肌、胸骨甲状肌、甲状舌骨肌、肩胛舌骨肌

(四)椎外侧肌，包括：1.前斜角肌、2.中斜角肌、3.后斜角肌。

三、躯干肌

(一)背部深层肌

1.夹肌，包括：头夹肌、颈夹肌；

2.竖脊肌

(二)枕下肌

(三)胸部肌

1.肋间肌，包括：①肋间外肌、②肋间内肌、③肋间最内肌；

2.膈肌

(四)腹部肌

1.腹前外侧群，包括①腹外斜肌、②腹内斜肌、③腹横肌、④腹直肌；

2.后群，包括：腰大肌、腰方肌

(五)盆部肌，包括：肛提肌、尾骨肌、梨状肌、闭孔内肌；

四、上肢肌

(一)连接上肢与脊柱的肌，包括1.斜方肌、2.背阔肌、3.菱形肌、4.肩胛提肌；

(二)连接上肢与胸壁的肌，包括1.胸大肌、2.胸小肌、3.前锯肌；

(三)肩胛部肌，包括1.三角肌、2.冈上肌、3.冈下肌、4.小圆肌、5.大圆肌、6.肩胛下肌；

(四)上肢肌，包括1.前群，包括①喙肱肌、②肱二头肌、③肱肌；2.后群(为肱三头肌)；

(五)前臂肌

1.前群第一层，包括①肱桡肌、②旋前圆肌、③桡侧腕屈肌、④掌长肌、⑤尺侧腕屈肌；

2.前群第二层(为指浅屈肌)；

3.前群第三层，包括：拇长屈肌、指深屈肌；

4.前群第四层(为旋前方肌)；

5.后群浅层，包括①桡侧腕长伸肌、②桡侧腕短伸肌、③指伸肌、④小指伸肌、⑤尺侧腕伸肌；

6.后群深层，包括①旋后肌、②拇长展肌、③拇短伸肌、④拇长伸肌、⑤示指伸肌；

(六)手肌，包括1.外侧群(为大鱼肌)；2.内侧群(为小鱼肌)；3.中间群(包括：骨间肌7块、蚓状肌4块)；

五、下肢肌

(一)髂区肌，包括1.髂腰肌、2.腰小肌；

(二)臀肌和大腿肌

1.臀肌，包括：臀大肌、臀中肌、臀小肌、梨状肌；

2.大腿肌

①前群，包括：阔筋膜张肌、缝匠肌、股四头肌；

②内侧群，包括：股薄肌、耻骨肌、长收肌、短收肌、大收肌；

③后群，包括：股二头肌、半腱肌、半膜肌；

(三)小腿肌

1.前群，包括：胫骨前肌、拇长伸肌、趾长伸肌；

2.外侧群，包括：腓骨长肌、腓骨短肌；

3.后群

①后群浅层，包括：小腿三头肌、比目鱼肌；

②后群深层，包括：趾长屈肌、胫骨后肌、拇长屈肌；

(四)足肌，包括1.足背肌、2.足底肌、3.足固有肌。

所述消化系统包括口腔、唾液腺、咽、消化管、消化腺、腹膜、系膜中的至少一种；

一、口腔，包括：(一)口腔黏膜、(二)口唇与颊、(三)牙龈、(四)腭、(五)牙、(六)舌；

二、唾液腺，包括：(一)腮腺、(二)下颌下腺、(三)舌下腺；

三、咽，包括(一)鼻咽、(二)口咽、(三)喉咽；

四、消化管，包括：(一)食管、(二)胃；(三)小肠，包括1.十二指肠、2.空肠、3.回肠；(四)大肠，包括1.盲肠、2.阑尾、3.结肠、4.直肠、5.肛管；

五、消化腺，包括：(一)胰；(二)肝；(三)肝外胆道，包括1.肝总管、2.胆囊、3.胆总管；

六、腹膜，包括(一)腹膜腔、(二)腹膜隐窝，包括1.肝肾隐窝、2.陷凹。

(三)网膜，包括1.小网膜、2.大网膜、3.网膜囊；

七、系膜，包括(一)肠系膜、(二)阑尾系膜、(三)横结肠系膜、(四)乙状结肠系膜。

所述韧带系统包括：肝的韧带或脾的韧带中的至少一种；所述肝的韧带包括镰状韧带、冠状韧带、三角韧带或肝圆韧带中的至少一种；所述脾的韧带包括胃脾韧带或脾肾韧带中的至少一种。

所述呼吸系统包括鼻、喉、气管和主支气管、肺、胸膜中的至少一种；

一、鼻，包括：(一)外鼻；(二)鼻腔包括、1.鼻前庭、2.固有鼻腔；

(三)鼻旁窦，包括1.上颌窦、2.额窦、3.蝶窦、4.筛窦；

二、喉，包括：(一)喉的软骨，包括：1.甲状软骨、2.环状软骨、3.勺状软骨、4.会厌软骨；(二)喉的连接，包括：1.环勺关节、2.环甲关节、3.弹性圆锥、4.甲状舌骨膜；(三)喉肌；(四)喉腔；(五)喉黏膜

三、气管和主支气管，包括(一)气管；(二)主支气管，包括1.右主支气管、2.左主支气管；

四、肺(左右各一)

五、胸膜，包括(一)胸膜的分部：1.脏胸膜、2.壁胸膜；(二)壁胸膜的分部：1.胸膜顶、2.肋胸膜、3.膈胸膜。

所述泌尿系统包括：一、肾(左右各一)——(一)结构：1.肾小盏、2.肾大盏、3.肾盂；(二)肾的被膜：1.纤维囊、2.脂肪囊、3.肾筋膜；二、输尿管(左右各一)；三.膀胱；四.尿道。

所述循环系统包括

一、心血管系统

(一)血管的种类

1.动脉，包括：大动脉、中动脉、小动脉、微动脉；

2.毛细血管；

3.静脉，包括：大静脉、中静脉、小静脉、微静脉；

(二)心

1.心壁，包括：心内膜、心肌膜、心外膜；

2.心骨骼，包括：纤维三角2个(即：左、右纤维三角)

瓣环4个(即：肺动脉瓣环、主动脉瓣环、二尖瓣环、三尖瓣环)；

3.心间隔，包括：房间隔、室间隔；

4.心的内腔

①右心房，包括：固有心房、腔静脉窦；

②右心室，包括：右心室流入道、右心室流出道；

③左心房，包括：左心耳、左心房窦；

④左心室，包括：左心室流入道、左心室流出道；

5.心的传导系，包括①窦房结；②房室结，包括：前结间束、中结间束、后结间束；③房室束，包括：左束支、右束支、浦肯野纤维网；

(三)心的血管

1.冠状动脉

①左冠状动脉，包括：前室间支、旋支；

②右冠状动脉，包括：后室间支、左室后支；

2.心的静脉，包括：①心最小静脉；②心前静脉；③冠状窦，包括：心大静脉、心中静脉、心小静脉；

(四)心包，包括1.纤维心包、2.浆膜心包、3.心包窦；

(五)动脉

1.肺动脉干，包括①左肺动脉、②右肺动脉；

2.主动脉，包括①升主动脉；②主动脉弓，包括：头臂干、左颈总动脉、左锁骨下动脉；

③头臂干，包括：右颈总动脉、右锁骨下动脉；

3.头颈部的动脉

①颈总动脉，包括：颈内动脉、颈外动脉；

②颈外动脉

向前发出：甲状腺上动脉、面动脉、舌动脉；

向后发出：枕动脉、耳后动脉；

自内侧壁发出：咽升动脉；

终末支是：上颌动脉、颞浅动脉；

③颈内动脉(入颅腔)

4.上肢的动脉

①锁骨下动脉，包括：椎动脉、胸廓内动脉、甲状颈干；

②腋动脉，包括：胸肩峰动脉、胸外侧动脉、肩胛下动脉、旋肱后动脉；③肱动脉，包括：桡动脉、尺动脉；

④桡动脉，包括：掌浅支、拇主要动脉；

⑤尺动脉，包括：骨间总动脉、掌深支；

⑥掌浅弓、掌深弓

5.躯干的动脉

①胸主动脉

a.壁支，包括：肋间后动脉、膈上动脉；

b.脏支，包括：支气管支、心包支、食管支；

②腹主动脉

a.壁支，包括：膈下动脉、腰动脉、骶正中动脉；

b.脏支，成对的脏支：肾上腺中动脉、肾动脉、睾丸动脉；

不成对的脏支：腹腔干、肠系膜上动脉、肠系膜下动脉；

6.盆部的动脉

①髂总动脉，包括：髂内动脉、髂外动脉；

②髂内动脉

a.壁支，包括：髂腰动脉、骶外侧动脉、臀上动脉、闭孔动脉；

b.脏支，包括：膀胱下动脉、直肠下动脉、子宫动脉、阴部内动脉；

③髂外动脉，包括：腹壁下动脉、旋髂深动脉；

7.下肢的动脉

①股动脉，包括：股深动脉、腹壁浅动脉、旋髂浅动脉；

②腘动脉，包括：胫前动脉、胫后动脉；

③胫前动脉

④胫后动脉，包括：腓动脉、足底内侧动脉、足底外侧动脉；

⑤足背动脉，包括：弓状动脉、足底深支、第一趾背动脉、足底弓；

⑥足底弓

(六)静脉

1.肺循环的静脉，包括：左肺上、下静脉，右肺上、下静脉；

2.体循环的静脉

①上腔静脉系

a.头臂静脉(椎静脉、胸廓内静脉、甲状腺下静脉、肋间最上静脉)

b.头颈部的静脉：

I.颈内静脉(颅骨、脑、面、浅部和颈部大部分区域的静脉)即：颅内属支和颅外属支(面静脉、下颌后静脉、舌静脉、咽静脉、甲状腺上、中静脉)；II.颈外静脉；III.锁骨下静脉

C.上肢的静脉，包括：上肢的浅静脉(头静脉、贵要静脉、肘正中静脉)；上肢的深静脉(腋静脉)

d.胸部的静脉，包括：胸腹壁静脉、奇静脉、半奇静脉、副半奇静脉、脊柱的静脉(椎内静脉丛、椎外静脉丛)

②下腔静脉系

a.下腔静脉；b.髂总动脉：(髂内静脉、髂外静脉)；c.下肢的静脉，包括：下肢浅静脉(小隐静脉、大隐静脉)；下肢深静脉(腘静脉)；d.下腔静脉的属支，包括：壁支(膈下静脉、腰静脉)；脏支(睾丸静脉、卵巢静脉、肾静脉、肾上腺静脉、肝静脉)；e.肝门静脉系统，肝门静脉的主要属支(肠系膜上、下静脉、胃左、右静脉、胆囊静脉、附脐静脉)。

所述淋巴系统包括：

(一)淋巴组织

(二)淋巴管道

1.毛细淋巴管

2.淋巴管

3.淋巴干，包括：①左、右颈干；②左、右锁骨下干；③左、右支气管纵隔干；④左、右腰干；⑤肠干；

4.淋巴导管

①右淋巴导管，包括：右颈干、右锁骨下干、右支气管纵隔干；

②胸导管

(三)淋巴器官，包括：淋巴结、扁桃体、脾和胸腺；

(四)全身各部的淋巴结

【头颈部的淋巴结】

1.头部的淋巴结，包括①枕淋巴结、②乳突淋巴结、③腮腺淋巴结、④下颌下淋巴结、⑤颏下淋巴结；

2.颈部的淋巴结，包括①颈前淋巴结、②颈外侧淋巴结

a.颈外侧浅淋巴结

b.颈外侧深淋巴结，包括：咽后淋巴结、颈内二腹肌淋巴结(角淋巴结)、颈内静脉肩胛舌骨肌淋巴结、锁骨上淋巴结

【上肢的淋巴结】

1.肘淋巴结

2.腋淋巴结，包括：①外侧淋巴结、②胸肌淋巴结、③肩胛下淋巴结、④中央淋巴结、⑤尖淋巴结；

【胸部的淋巴结】

1.胸壁淋巴结，包括①胸骨旁淋巴结、②肋间淋巴结、③膈上淋巴结；

2.胸腔脏器淋巴结，包括①纵隔前淋巴结；②纵隔前淋巴结；③气管、支气管和肺淋巴结，包括：肺门淋巴结、气管、支气管淋巴结、气管旁淋巴结；

【腹部的淋巴结】

1.腹壁的淋巴结

2.腹腔不成对脏器的淋巴结，包括①沿腹腔干及其分支排列的淋巴结、②沿肠系膜上动脉及其分支排列的淋巴结、③沿肠系膜下动脉及其分支排列的淋巴结；

【盆部的淋巴结】，包括：1.髂外淋巴结、2.髂内淋巴结、3.骶淋巴结

【下肢的淋巴结】，包括1.腘淋巴结；2.腹股沟淋巴结包括：腹股沟浅淋巴结、腹股沟深淋巴结。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组织和/或器官包括皮肤、内脏膜、骨/软骨、角膜、血管、脂肪、韧带、跟腱、神经、泌尿系统、结膜、内脏器官、肌肉、耳、眼、鼻、胃、肠道、食道、气管、生殖系统、脊髓、筋膜、心脏瓣膜。

在本发明的一些具体实施方案中，所述皮肤包括真皮；所述内脏膜包括心包膜、胸膜、腹膜、脑膜、肠系膜、睾丸鞘膜、软骨膜、小肠粘膜、羊膜；所述血管包括动脉血管；所述动脉血管包括颈动脉、腹主动脉；所述泌尿系统包括输尿管、膀胱、尿道；所述内脏器官包括心、肝、脾、肺、肾、胰腺。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的方法制得的动物源性生物材料。

本发明还提供了所述的动物源性生物材料在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用。具体应用包括但不限于如下：

(1)植入材料，如异种皮质骨、人工骨、骨修复材料、骨填充材料；

(2)心脏或组织修补材料，如牛或猪心包生物瓣膜、心脏补片；

(3)眼科植入材料，如异种角膜(猪源)、结膜、眼内充填材料等；

(4)接触式人工器官，如人工皮肤、异体脱细胞真皮；

(5)医用卫生材料及生物敷料；

(6)可吸收性止血、防黏连材料，如生物蛋白胶、医用胶原膜、透明质酸；

(7)医用缝合材料，如医用可吸收胶原缝合线、羊肠线等。

在上述研究的基础上，本发明还提供了组合物，包括本发明所述的动物源性生物材料以及医学或药学上可接受的活性分子或活细胞，所述活性分子包括生长因子；所述活细胞包括干细胞。

本发明还提供了所述的组合物在组织工程、再生医学、转化医学中的应用。具体应用包括但不限于如下：

(4)接触式人工器官，如人工皮肤、异体脱细胞真皮；

(5)医用卫生材料及生物敷料；

(6)可吸收性止血、防黏连材料，如生物蛋白胶、医用胶原膜、透明质酸；(7)医用缝合材料，如医用可吸收胶原缝合线、羊肠线等。

本发明提供了一种降低生物材料免疫原性的方法，以及由此方法制备的生物材料及其用途。(1)“基因编辑技术”，通过基因编辑技术获得低免疫原性动物，采集组织/器官得到低免疫原性原材料，即通过基因编辑技术从材料来源上降低动物源性生物材料的免疫原性；(2)“渐次脱细胞技术”，不同于常规方法(如高浓度试剂一次性脱细胞)，采用“少量多次”的原则进行脱细胞处理，比如，通过多次循环使用中性蛋白酶溶液浸泡、十二烷基硫酸钠(SDS)溶液浸泡、反复冻融、超声等步骤脱除原材料中的细胞、多糖等活性成分，从而降低动物源性生物材料的免疫原性，同时尽量降低处理过程中对材料力学性能和活性等影响；(3)“渐次交联技术”，不同于常规方法(如高浓度交联剂一次性交联)，通过低浓度交联剂多次交联，封闭材料中的抗原活性位点降低动物源性生物材料的免疫原性，同时增强材料的力学性能。利用本发明加工制备的生物材料，不含活细胞，通过基因编辑技术从原材料源头降低其免疫原性，使用优化的脱细胞处理技术和交联技术进一步降低其免疫原性。根据原材料所属组织/器官的差异性，本发明的生物材料用于临床不同组织/器官的修复再生，在使用过程中可以结合活性分子和/或活细胞。

本发明降低动物源性生物材料免疫原性的方法，涉及基因编辑技术，与常规方法不同(通过物理、化学、生物方法对既有动物组织/器官进行处理)，基因编辑技术是对目标基因进行定点“编辑”，实现对特定DNA片段的修饰，从生物材料的源头(采集动物)降低其免疫原性。此过程中，根据具体组织材料的特点，经过筛选确定编辑系统、目标基因、动物种类等，其中目标基因范围包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2和PERV等敲除基因，以及hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI和EPCR等转入基因。以α-Gal为例，当动物组织或动物源性生物材料中残留的异种抗原进入人体内时，会引发超急性免疫排斥反应，这种免疫排斥反应的主要靶抗原被认为是由存在于动物组织中的α-Gal抗原引起的，α-Gal抗原存在于除人和高等灵长动物以外的大部分哺乳动物体内；通过基因编辑技术开发α-Gal抗原敲除(GTKO)动物源性生物材料，可以明显降低其免疫原性。

另一方面，本发明降低动物源性生物材料免疫原性的方法，涉及脱细胞技术和交联技术，与常规方法不同(如高浓度SDS溶液单次脱细胞或高浓度戊二醛单次交联)，根据基因编辑技术降低其免疫原性的效果，将优化脱细胞处理和交联处理，比如，低浓度SDS溶液多次脱细胞或低浓度戊二醛多次交联，通过温和的处理方式尽量减小处理过程中对材料力学性能和活性等影响。

因此，本发明提供的低免疫原性生物材料及其制备方法和用途具有重要的现实意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示免疫组化检测结果；其中，图1(A)示实施例1与对比例1的免疫组化检测结果；图1(B)示实施例3与对比例3的免疫组化检测结果；

图2示单轴拉伸测试结果；

图3示组织相容性检测结果；

图4示PBMC细胞的FITC-GSIB4免疫荧光染色；

图5示PBMC细胞的FITC-DBA免疫荧光染色。

具体实施方式

本发明公开了低免疫原性生物材料及其制备方法和用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语：

野生型(Wide type,WT)；

α-1,3-半乳糖基转移酶(α(1,3)galactosyltransferase,GGTA1)；

β-l,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2,β4GalNT2)；

α-1,3-半乳糖基转移酶敲除(GGTA1 knockout,GTKO)；

α-1,3-半乳糖基转移酶/β-l,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2敲除(GGTA1/β4GalNT2knockout,GGTA1/β4GalNT2 KO)；

外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)；

体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT)。

a.通过基因编辑技术获得低免疫原性动物；

b.采集低免疫原性动物的组织/器官作为原材料；

c.将原材料进行多次循环处理，比如，处理方式包括反复冻融、超声、中性蛋白酶溶液浸泡、十二烷基硫酸钠(SDS)溶液浸泡；

d.将处理后材料多次浸没于交联剂溶液中。

在一些实施例中，所述基因编辑技术包括巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统中的至少一种。

在一些实施例中，所述基因编辑技术包括基因敲除和基因转入两种，其中，敲除的基因包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2和PERV中的至少一种，转入的基因包括hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI和EPCR中的至少一种。

在一些实施例中，所述动物包括猪、牛、羊、马、猴、狗、兔、鸡、鼠、蚕、鱼、海洋生物、驴中的至少一种；所述用于制备生物材料的动物为基因编辑后稳定传代3代以上的动物，进一步的，选用基因编辑后稳定传代6代的动物制备生物材料。

在一些实施例中，所述组织/器官包括皮肤，进一步的，包括真皮；包括内脏膜，进一步的，包括心包膜、胸膜、腹膜、脑膜、肠系膜、睾丸鞘膜、软骨膜、小肠粘膜、羊膜；包括骨/软骨；包括角膜；包括血管，进一步的，包括动脉血管，更进一步，包括颈动脉、腹主动脉；包括脂肪；包括韧带；包括跟腱；包括神经；包括泌尿系统，进一步的，包括输尿管、膀胱、尿道；包括巩膜；包括结膜；包括内脏器官，进一步的，包括心、肝、脾、肺、肾、胰腺；包括肌肉；包括耳；包括眼；包括鼻；包括胃；包括肠道；包括食道；包括气管；包括生殖系统；包括脊髓；包括筋膜；包括心脏瓣膜。

在一些实施例中，所述反复冻融处理中冷冻温度范围为-20～-196℃(液氮)，冷冻时间为5min～24h，解冻温度范围为4～40℃，解冻时间为0.5～6h；所述超声处理中低频频率范围为10～40KHz，低频处理时间为5min～24h，高频频率范围为60～120KHz，高频处理时间为5min～24h，超声功率为100W～10KW，超声温度为0～40℃；所述中性蛋白酶处理中中性蛋白酶浓度范围为0.001～5wt.％，处理温度为10～40℃，振荡频率为50～3000rpm，处理时间为0.5～24h；所述SDS处理中SDS浓度范围为0.001～5wt.％，振荡频率为100～3000rpm，处理温度为0～40℃，处理时间为0.5～24h；所述多次循环处理是将上述处理方法进行组合使用，每种处理方法的使用次数为0～10次。

在一些实施例中，所述交联剂包括化学交联剂和生物交联剂中的至少一种；进一步的，化学交联剂包括醛类、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺酯类(NHS酯)、马来酰亚胺类、卤乙酰基类、二硫代联吡啶、酰肼类、碳二亚酰胺类中的至少一种；更进一步的，醛类包括戊二醛、多聚甲醛中的至少一种；生物交联剂包括原花青素、京尼平中的至少一种；交联剂浓度范围为0.00001～5wt.％，浸没温度为0～40℃，单次浸没时间为0.5～12h，浸没次数为1～10次。

本发明还提供了所述的方法制备的动物源性生物材料。

本发明还提供了所述的生物材料在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用，在使用过程中可以结合活性分子和/或活细胞，活性分子包括生长因子；活细胞包括干细胞。

本发明提供的低免疫原性生物材料及其制备方法和用途中所用试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

通过基因编辑技术敲除巴马小型猪的GGTA1和B4GaINT2基因，繁育GTKO、GGTA1/β4GalNT2 KO巴马小型猪，采用植物凝集素荧光染色对PBMC细胞表面目标抗原进行检测。

1.1动物：选用巴马小型猪(minipig)作为实验用猪，野生型(WT)巴马小型猪由本实验室培育，并饲养在普通级猪舍。利用基因编辑技术(包括但不限于ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9等)在猪成纤维细胞上完成GGTA1和B4GalNT2基因的敲除。细胞经单克隆培养、测序鉴定后分别获得GGTA1KO、GGTA1/β4GalNT2 KO的猪成纤维细胞。通过体细胞核移植(SCNT)分别制备GTKO、GGTA1/β4GalNT2 KO巴马小型猪。小猪出生后采集耳样，提取DNA再次测序鉴定每头克隆猪的基因型。

1.2主要试剂与仪器：Ficoll淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)；异硫氰酸荧光素标记的植物凝集素(FITC-GS IB4，FITC-DBA，美国Sigma公司)；杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS，美国Gibco公司)；1640基础培养液(美国Gibco公司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)、流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3实验方法

1.3.1Ficoll分层液法分离PBMC：采集2mlWT巴马小型猪新鲜血液于抗凝管中，移至15ml离心管中用2mlDPBS缓冲液稀释，之后转移至4ml Ficoll淋巴细胞分离液液面上，600g离心20分钟，收集离心管中白色云雾状淋巴细胞层与等体积DPBS混匀，离心后弃上清，加3ml红细胞裂解液重悬。室温静置裂解15分钟后DPBS洗两次，离心弃上清后用含10％FBS的1640培养基重悬，取部分细胞在荧光倒置显微镜下观察细胞状态，剩余细胞待用。GTKO、GGTA1/β4GalNT2 KO巴马小型猪及人(健康志愿者)的PBMC采用同样方法分离。

1.3.2PBMC荧光染色：收集WT、GTKO、GGTA1/β4GalNT2 KO巴马小型猪及人的PBMC，分别与FITC-GSIB4和FITC-DBA共孵育，通过凝集素荧光染色对PBMC细胞表面的目标抗原进行定性测定。具体如下：用细胞计数仪计数分5×10⁵个细胞，用DPBS洗2次，离心后弃上清，分别用50μl浓度为0.1mg/ml的FITC-GSIB4和50μl浓度为0.1mg/ml的FITC-DBA标记，细胞在避光、4℃条件下孵育30分钟，之后DPBS洗3次，用500μl1640完全培养基重悬，取100μl细胞悬浮液在荧光倒置显微镜下观察。

图4结果表明，FITC-GSIB4抗体标记的野生型巴马小型猪PBMC样品荧光强烈，而GTKO和GGTA1/β4GalNT2 KO巴马小型猪PBMC样品基本无荧光信号，与人PBMC样品表现相似，表明GTKO和GGTA1/β4GalNT2 KO巴马小型猪完全敲除α-Gal抗原。

图5结果表明，FITC-DBA抗体标记的野生型巴马小型猪PBMC样品荧光强烈，而GGTA1/β4GalNT2 KO巴马小型猪PBMC样品基本无荧光信号，与人PBMC样品表现相似，表明GGTA1/β4GalNT2 KO巴马小型猪完全敲除β-Gal抗原。

本实施例通过基因编辑技术敲除巴马小型猪的GGTA1和B4GaINT2基因，繁育GTKO和GGTA1/β4GalNT2 KO巴马小型猪，采用凝集素荧光染色对PBMC细胞表面目标抗原进行检测。

实施例2

一种低免疫原性猪源心包膜材料及其制备方法和在心脏瓣膜中的应用。

制备方法如下：

a.通过CRISPR/Cas9系统基因编辑制备敲除GGTA1的猪，使用稳定传代6代的基因编辑猪；

b.采集基因编辑猪的心包膜作为原材料；

c.将心包膜原材料进行如下处理：

c1.浸没于0.08wt.％中性蛋白酶溶液中，温度为25℃，振荡频率为100rpm，处理时间为8h；

c2.浸没于超声波清洗器中，110KHz处理30min，功率1KW，温度为10℃；

c3.浸没于0.1wt.％SDS溶液中12h，振荡频率为1000rpm，温度为30℃；

c4.浸没于超声波清洗器中，20KHz处理200min，功率5KW，温度为30℃。

d.浸没于0.001wt.％京尼平溶液中12h，浸没温度为35℃，重复浸没5次。浸没于0.005wt.％戊二醛溶液中6h，浸没温度为25℃，重复浸没3次。

通过以上步骤制备的猪源心包膜材料，进一步开发介入式瓣膜用于经导管主动脉瓣置入术(Transcatheter Aortic Valve Implantation,TAVI)。

实施例3

一种低免疫原性牛源韧带材料及其制备方法和组织工程应用。

制备方法如下：

a.通过CRISPR/Cas9系统基因编辑制备敲除CMAH，转入hCD47的牛，使用稳定传代4代的基因编辑牛；

b.采集基因编辑牛的韧带作为原材料；

c.将韧带原材料进行如下处理：

c1.浸没于1wt.％中性蛋白酶溶液中，温度为35℃，振荡频率为300rpm，处理时间为12h；

c2.浸没于超声波清洗器中，100KHz处理60min，功率6KW，温度为25℃；

c3.置于-40℃冰柜中6h，置于20℃中2h，置于-80℃冰箱中3h，置于30℃中1h；

c4.浸没于0.5wt.％SDS溶液中3h，振荡频率为200rpm，温度为10℃；

c5.浸没于超声波清洗器中，30KHz处理120min，功率3KW，温度为20℃。

d.浸没于0.01wt.％戊二醛溶液中1h，浸没温度为25℃，重复浸没3次。

通过以上步骤制备的牛源韧带材料，用于韧带撕裂的修复重建，材料中将添加成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)和脂肪间充质干细胞。

实施例4

一种低免疫原性猪源真皮材料及其制备方法和再生医学应用。

制备方法如下：

a.通过TALEN系统基因编辑制备敲除GGTA1、β4GalNT2，转入hCD55的猪，使用稳定传代5代的基因编辑猪；

b.采集基因编辑猪真皮原材料；

c.将真皮原材料进行如下处理：

c1.浸没于3wt.％SDS溶液中12h，振荡频率为500rpm，温度为20℃；

c2.置于-20℃冰箱中12h，置于30℃中2h，置于液氮中4h，置于10℃中2h；

c3.浸没于超声波清洗器中，80KHz处理6h，功率8KW，温度为20℃；

c4.浸没于0.05wt.％SDS溶液中1h，振荡频率为2000rpm，温度为30℃；

c5.浸没于超声波清洗器中，120KHz处理30min，功率5KW，温度为30℃；

c6.置于-100℃冰箱中3h，置于10℃中3h，置于-50℃冰箱中6h，置于20℃中1h；

d.浸没于0.05wt.％原花青素溶液中2h，浸没温度为30℃，重复浸没2次。

通过以上步骤制备的猪源真皮材料，用于乳房重建的补片材料，材料中将添加成纤维细胞。

对比例1

采集普通猪心包膜。脱细胞处理为：浸没于0.5wt.％SDS溶液中48h，振荡频率为100rpm，温度为25℃。交联处理为：浸没于1wt.％戊二醛溶液中6h，浸没温度为25℃。

对比例2

采集普通猪真皮材料。脱细胞处理为：浸没于2wt.％中性蛋白酶溶液中24h，振荡频率为1000rpm，温度为30℃；浸没于1wt.％SDS溶液中12h，振荡频率为300rpm，温度为25℃。交联处理为：浸没于0.5wt.％京尼平溶液中6h，浸没温度为30℃。

对比例3

采集普通猪真皮材料。脱细胞处理为：浸没于10μg/mLα-1,3-半乳糖苷酶的PBS溶液中6小时，振荡频率为200rpm，温度为30℃。交联处理为：浸没于1wt.％戊二醛溶液中6h，浸没温度为30℃。

效果例1免疫原性比较

Gal定量检测：通过人α半乳糖苷酶(αGAL)ELISA试剂盒定量检测样品中Gal含量。

结果如下：

参照行业标准《组织工程医疗器械产品动物源性支架材料残留αGal抗原检测》(YY/T1561-2017)中的方法,按照中检院器械所质量评价室的“动物源医疗器槭中残留α-Gal抗原含量和Gal抗原清除率检测标准操作规范”(NIFDC-SOP-F-T-3001)进行检测，敲除GGTA1的猪(实施例2用猪)心包膜样品的Gal抗原含量低于最低检测限(湿重)，对照组野生猪(对比例1用猪)Gal抗原含量为6.15±0.87×10¹⁵个/mg(湿重)；敲除GGTA1的猪(实施例4用猪)皮肤样品的Gal抗原含量低于最低检测限(湿重)，对照组野生猪(对比例2、3用猪)Gal抗原含量为2.03±0.28×10¹⁵个/mg(湿重)，最低检测限为0.03125(相对于Gal-BSA)μg/mL(相当于8.25×10¹¹个抗原表位/每个反应)。说明通过基因编辑可以获得免疫原性更低的动物，从而得到低免疫原性生物材料原材料。

效果例2免疫组化比较

在大鼠皮下分别植入实施例2获得的动物源性生物材料以及对比例1获得的动物源性生物材料，经1个月后，处死实验大鼠，取出植入材料以及周围皮肤组织，用4wt.％多聚甲醛固定液固定，用CD68或CD3单抗做免疫组化染色。

具体步骤如下：

(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-二甲苯III 15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。

(2)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(PH6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

(3)阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％过氧化氢溶液(双氧水：纯水＝1:9)，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

(4)血清封闭:在组化圈内滴加3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。(一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭)

(5)加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

(6)加二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50min。

(7)DAB显色：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

(8)复染细胞核：Harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。

(9)脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min-85％酒精5min--无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

(10)显微镜镜检，图像采集分析。

结果如图1(A)所示：CD68单抗进行免疫组化染色，主要标识由于免疫排斥反应测试样品中出现的巨噬细胞(深棕色)。结果表明，经过1个月大鼠皮下植入，实施例1样品基本没有发现巨噬细胞，而对比例1发现大量巨噬细胞，说明实施例1样品的免疫原性远远低于对比例1样品。

结果如图1(B)所示：CD3单抗进行免疫组化染色，主要标识由于免疫排斥反应测试样品中出现的T细胞(深棕色)。结果表明，经过1个月大鼠皮下植入，相对于对比例3，实施例3样品中发现更少的T细胞，说明实施例3样品的免疫原性低于对比例3样品。

效果例3生物相容性比较

在大鼠肌肉分别植入实施例2获得的动物源性生物材料以及对比例1获得的动物源性生物材料，经1个月后，处死实验大鼠，取出植入材料以及周围肌肉组织，用4wt.％多聚甲醛固定液固定，进行HE染色。

具体步骤如下：

(1)将样品放在石蜡包埋机里进行包埋，然后用切片机进行切片，将切好的片子放入60℃的水浴锅里，用载玻片小心插入靠近切片的水里，将漂浮的石蜡切片转移到载玻片上，若有水泡，用针头挑出。

(2)二甲苯脱水5min，两次，100％酒精、95％酒精、85％酒精、70％酒精、50％酒精依次冲洗，自来水冲洗，苏木精染色5min，自来水冲洗使颜色变蓝。

(3)放入1％盐酸乙醇溶液褪色2-10s，颜色变红并较浅，自来水冲洗恢复蓝色。

(4)再放入50％酒精、70％酒精、80％酒精各5min，0.5％伊红酒精溶液对比染色1-3min。

(5)将切片放入95％酒精中洗去多余红色，然后放入100％酒精中3-5min，吸水纸吸取多余酒精，将切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各3-5min。

(6)用中性树胶封存，固定。

结果如图2所示：HE染色表明，经过1个月大鼠肌肉植入，实施例1样品和周围肌肉组织完全融合，细胞进入样品生长，而对比例1样品和周围肌肉组织有明显界限，说明实施例1样品的生物活性更好。

效果例4力学性能比较

力学性能通过单轴拉伸测试进行比较，材料剪裁成哑铃型，如尺寸：2mm*35mm。在电子拉力测试仪(Biotester双轴力学测试系统，Cellscale,Canada)上测试实施例2获得的动物源性生物材料以及对比例1获得的动物源性生物材料的拉伸性能，载荷23N，直至样品断裂，测得单轴拉伸最大断裂力，温度25℃，测试中样品保持润湿状态。样品厚度通过电子千分尺测量，精确至1μm。

结果如图3所示，单轴拉伸测试显示，实施例2样品的单轴拉伸最大断裂力明显大于对比例1样品；相较于对比例1样品，实施例2样品经过优化的更温和的脱细胞处理和交联处理，对材料的力学性能影响更小。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.降低动物源性生物材料免疫原性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、通过基因编辑获得低免疫源性动物；

步骤2、采集所述低免疫源性动物的组织或器官作为原料；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中所述脱细胞的方法包括物理方法、化学方法和/或生物方法；所述物理方法包括反复冻融、超声处理；所述化学方法包括十二烷基硫酸钠(SDS)处理；所述生物方法包括中性蛋白酶酶解；

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反复冻融的冷冻温度为-20～-196℃(液氮)，冷冻时间为5min～24h，解冻温度为4～40℃，解冻时间为0.5～6h；

所述超声处理的低频频率为10～40KHz，低频处理时间为5min～24h；高频频率为60～120KHz，高频处理时间为5min～24h；超声功率为100W～10KW，超声温度为0～40℃；

所述中性蛋白酶的浓度范围为0.001～5wt.％，酶活为500～130000U/g；处理温度为0～40℃，振荡频率为50～3000rpm，处理时间为0.5～24h；

所述SDS的浓度范围为0.001～5wt.％，振荡频率为100～3000rpm，处理温度为0～40℃，处理时间为0.5～24h。

4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述交联化采用的交联剂包括化学交联剂和/或生物交联剂中的至少一种；

所述化学交联剂包括醛类、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺酯类(NHS酯)、马来酰亚胺类、卤乙酰基类、二硫代联吡啶、酰肼类、碳二亚酰胺类中的一种或两种以上的混合物；

所述醛类包括戊二醛、多聚甲醛中的一种或两者的混合物；

5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述基因编辑包括巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统中的至少一种。

6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述基因编辑包括基因敲除和/或基因转入；

7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，所述动物包括猪、牛、羊、马、猴、狗、兔、鸡、鼠、蚕、鱼、海洋生物、驴中的至少一种；所述低免疫源性动物为基因编辑后稳定传代3代以上的动物；优选的，选用基因编辑后稳定传代6代的动物制备生物材料。

8.如权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，所述组织包括上皮组织、结缔组织、肌组织或神经组织中的至少一种；

9.如权利要求1至8任一项所述的方法制得的动物源性生物材料。

10.如权利要求9所述的动物源性生物材料在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用。