CN116173303A - 一种生物鼓膜及其制备方法和应用 - Google Patents

一种生物鼓膜及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116173303A
CN116173303A CN202310468969.0A CN202310468969A CN116173303A CN 116173303 A CN116173303 A CN 116173303A CN 202310468969 A CN202310468969 A CN 202310468969A CN 116173303 A CN116173303 A CN 116173303A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tympanic membrane
biological
cartilage
crosslinking
membrane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202310468969.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116173303B (zh
Inventor
李�杰
张召辉
张看
时艳
刘康
赵媛媛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beisai Hongsheng Beijing Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beisai Hongsheng Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beisai Hongsheng Beijing Biotechnology Co ltd filed Critical Beisai Hongsheng Beijing Biotechnology Co ltd
Priority to CN202310468969.0A priority Critical patent/CN116173303B/zh
Publication of CN116173303A publication Critical patent/CN116173303A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116173303B publication Critical patent/CN116173303B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3612—Cartilage, synovial fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/14—Materials or treatment for tissue regeneration for ear reconstruction or ear implants, e.g. implantable hearing aids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种生物鼓膜及其制备方法和应用。本发明的生物鼓膜的制备方法以软骨组织为原料，包括先将软骨组织处理为50‑500μm的软骨膜片，再将软骨膜片进行交联、脱细胞和去除免疫原的步骤；所述交联包括将软骨膜片依次经EDC‑NHS交联和BDDE交联的步骤。本发明制备的生物鼓膜主要组成为软骨脱细胞基质，富含Ⅱ型胶原蛋白、sGAG等活性成分，具有优异的力学性能，有利于鼓膜中间层纤维细胞的黏附、增殖、分化；生物鼓膜通过交联可有效减缓其降解速率，且免疫原性物质残留少，免疫原性低。

Description

一种生物鼓膜及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种生物鼓膜及其制备方法和应用。
背景技术
鼓膜也称耳膜，是一种弹性灰白色半透明薄膜，将外耳道与中耳隔开。鼓膜由三层结构组成，外层为上皮层，与外耳道皮肤相延续；中间层为纤维层，由主要为Ⅱ型胶原的胶原原纤维（fibril）形成的结缔组织组成，构成了以复杂方式排列的纤维束（Ross M.H.etal.Istologia，Testo eatlante con elementi di Biologia cellulare andmolecolare，Ambrosiana Publishing House，2010）；内层为粘膜上皮层，与鼓室粘膜上皮相延续。
鼓膜穿孔是耳科常见症状，多由慢性化脓性中耳炎或耳外伤所致。慢性鼓膜穿孔会导致听力下降、反复中耳感染和胆脂瘤。慢性化脓性中耳炎引起的鼓膜穿孔甚至会导致严重的颅内外并发症。
在组织学方面，鼓膜穿孔是由于上皮层的生长速度超过纤维层，越过纤维层与粘膜层相连，形成永久性穿孔，因此需要手术干预恢复鼓膜功能。目前治疗鼓膜慢性穿孔的方法通常是实施鼓膜修补手术，运用各种自体组织（包括颞肌筋膜、软骨、脂肪、软骨膜）或其他来源（同种异体或异种来源）的组织来修补穿孔鼓膜。尽管这些材料对于鼓膜修复具有一定效果，但都有其局限性：首先，自体移植会损伤自身组织，并且在二次手术时取材受限；另一方面，同种异体移植物和异种移植物具有潜在的感染风险；更重要的是，这些移植物均无法复制出原始鼓膜复杂的精细结构和声学振动特性。
理想的鼓膜修复材料应具备以下特点：①良好的生物相容性，低免疫原性；②能够促进上皮细胞、纤维细胞黏附、增殖；③随着天然鼓膜生长逐渐降解的特性。
专利申请CN105233343A公开了脱细胞真皮基质鼓膜及外耳组织修复材料的制备方法，CN110448730A公开了一种用于鼓膜修复的生物补片及其制备方法，但是，两者制得的修复材料的主要成分为以Ⅰ型胶原蛋白为主的脱细胞基质，与实际鼓膜中间纤维层（主要为Ⅱ型胶原蛋白）存在较大差异，很难达到鼓膜中间纤维层的再生修复。CN101879098A公开了使用丝蛋白的人工鼓膜及其制造方法，其制得的人工鼓膜虽然可以降解，也可以复合一些生物活性物质，但是缺少天然细胞外基质（ECM）三维结构和其中的有效活性成分胶原蛋白、sGAG等，很难有效达到对损伤鼓膜在结构上的修复和功能上的恢复。
目前尚缺乏具有天然ECM三维结构以及天然鼓膜中间纤维层有效活性成分II型胶原蛋白和sGAG，且具有低免疫原性和适宜空间结构以及降解特性的鼓膜修复材料。
发明内容
本发明提供一种生物鼓膜及其制备方法和应用。
现有技术中的鼓膜修复材料大多仅能实现损伤鼓膜的机械修补，较难实现促进、支持鼓膜中间层纤维细胞的黏附、增殖、分化的三维结构和活性成分；鼓膜修复材料植入后，天然鼓膜的再生通常需要一定时间，目前已公开的鼓膜修复材料在植入后降解速率较快，无法达到鼓膜中间层纤维完全修复的需求。
本发明在开发用于鼓膜修复的生物鼓膜材料的过程中发现，生物鼓膜材料不仅需要为鼓膜中间层纤维细胞的黏附、增殖、分化提供空间结构和活性成分，还需要满足植入的生物鼓膜材料的降解速率与天然鼓膜的再生速率相适应，已公开的脱细胞基质较难满足上述需求。经不断研发，本发明以软骨组织为原料，在对软骨组织进行脱细胞处理的过程中引入特定的交联步骤，能够显著减缓生物鼓膜的降解，更好地适应天然鼓膜的再生过程，同时还能够保证提供适宜鼓膜中间层纤维细胞的黏附、增殖、分化的空间结构和活性分子。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种生物鼓膜的制备方法，所述方法以软骨组织为原料，包括先将软骨组织处理为50-500μm的软骨膜片，再将软骨膜片进行交联、脱细胞和去除免疫原的步骤；
所述交联包括将软骨膜片依次经EDC-NHS交联和BDDE交联的步骤。
本发明发现，与其他交联方法相比，采用EDC-NHS交联与BDDE交联的组合能够显著减缓生物鼓膜的降解，促进天然鼓膜再生与生物鼓膜降解实现动态平衡，且不会对脱细胞处理产生不利影响，同时保证较高的Ⅱ型胶原蛋白、sGAG等活性成分含量，显著促进鼓膜中间层纤维细胞的黏附、增殖、分化。
本发明中所述的EDC的化学名称为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺，NHS的化学名称为N-羟基琥珀酰亚胺，BDDE的化学名称为丁二醇二缩水甘油基醚。
上述交联具体为将软骨膜片置于EDC-NHS溶液或BDDE溶液中浸泡处理，实现软骨膜片中成分的交联。
此外，本发明还发现，与在脱细胞处理后进行交联相比，在对软骨膜片进行脱细胞处理前引入交联步骤，能够有效减少Ⅱ型胶原、sGAG等活性物质流失，同时能够稳定生物鼓膜三维空间结构，极大地增加生物鼓膜的力学性能。
以上所述的EDC-NHS交联体系中，EDC的浓度为20-200mM，NHS的浓度为10-100mM。
优选地，EDC-NHS交联体系中，EDC的浓度为20-60mM，NHS的浓度为10-30mM。
优选地，所述EDC-NHS交联在MES缓冲液中进行。
优选地，EDC-NHS交联体系中，MES缓冲液的浓度为10-1000mM。
进一步优选地，EDC-NHS交联体系中，MES缓冲液的浓度为20-50mM。
以上所述的BDDE交联体系中，BDDE的浓度为0.05-0.5%。
优选地，所述BDDE交联体系中，BDDE的浓度为0.1-0.4%。
上述方法中，EDC-NHS交联和BDDE交联均为在2-10℃条件下浸泡2-6h（优选3-5h）。
上述交联的具体条件参数为本发明根据软骨组织的特性以及生物鼓膜对于降解速率和空间结构等特性的要求设计，采用上述交联方法能够有效降低生物鼓膜的降解速率，在天然鼓膜的再生过程中，生物鼓膜缓慢降解，能够更好地为天然鼓膜的再生提供空间结构和活性成分，同时不会对脱细胞处理产生不利影响。
优选地，在EDC-NHS交联后，采用缓冲液（优选为PBS和/或Tris-HCl缓冲液）对软骨膜片进行漂洗（漂洗次数可为2-5次）。
上述生物鼓膜的制备方法中，在EDC-NHS交联前，先将软骨膜片于蛋白酶抑制剂溶液中浸泡处理。
上述生物鼓膜的制备方法中，所述脱细胞为将交联后的软骨膜片于含Triton X-100和/或SDS以及蛋白酶抑制剂的缓冲液中浸泡处理。
上述生物鼓膜的制备方法中，所述去除免疫原为将脱细胞后的软骨膜片于含DNase的缓冲液或者含DNase和RNase的缓冲液中浸泡处理。
本发明使用的交联方法与脱细胞方法能够很好地配合作用，显著提高生物鼓膜中Ⅱ型胶原蛋白、sGAG等活性成分的含量，更好地模拟人体鼓膜的三维空间结构，且具有较好的力学性能，能够更有效地促进鼓膜中间层纤维细胞的黏附、增殖、分化，而且能够有效减缓了生物鼓膜的降解，更有利于实现体内天然鼓膜再生与生物鼓膜降解的动态平衡，此外还能够更有效地去除细胞、DNA等免疫原性物质。
优选地，在脱细胞步骤和去除免疫原的步骤之间，还包括对脱细胞后的软骨膜片进行漂洗的步骤。
上述方法中，所述蛋白酶抑制剂溶液中，蛋白酶抑制剂的浓度为0.01-0.1mM（优选为0.03-0.05 mM）。
优选地，采用蛋白酶抑制剂溶液浸泡处理为在2-25℃（优选4-25℃）条件下浸泡0.5-2h（优选0.5-1.5h）。
本发明中，软骨膜片的制备为将软骨组织经漂洗后切片至50-500μm厚度得到。其中，漂洗可采用PBS和/或Tris-HCl缓冲液。
在蛋白酶抑制剂溶液浸泡处理前，还包括将软骨膜片进行漂洗的步骤。漂洗可采用含蛋白酶抑制剂（优选的浓度为0.01-0.1mM）的PBS和/或Tris-HCl缓冲液。
本发明中，漂洗的次数可为2-5次。
优选地，在BDDE交联后，先采用缓冲液（优选为PBS缓冲液和/或Tris-HCl缓冲液）对软骨膜片进行漂洗（漂洗次数可为2-5次），再将软骨膜片置于含Triton X-100和/或SDS以及蛋白酶抑制剂的缓冲液中浸泡处理。在含Triton X-100和/或SDS以及蛋白酶抑制剂的缓冲液中浸泡处理后，先采用缓冲液（优选为PBS缓冲液和/或Tris-HCl缓冲液）对软骨膜片进行漂洗（漂洗次数可为2-5次），再置于含DNase的缓冲液中浸泡处理。
上述方法中，所述含Triton X-100和/或SDS以及蛋白酶抑制剂的缓冲液中，Triton X-100的浓度为0.5-5%（优选1-2%），SDS的浓度为0.1-2%（优选0.5-1.5%），蛋白酶抑制剂的浓度为0.01-0.1mM（优选0.03-0.05mM）。
上述方法中，所述含DNase的缓冲液中，DNase的浓度为10-100U/mL。
所述含DNase和RNase的缓冲液中，DNase和RNase的浓度均为10-100U/mL。
优选地，所述蛋白酶抑制剂优选为PMSF。
优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液和/或Tris-HCl缓冲液。
上述方法中，采用含Triton X-100和/或SDS以及蛋白酶抑制剂的缓冲液进行浸泡处理为在2-25℃（优选4-25℃）条件下浸泡12-72h。
采用含DNase的缓冲液或者含DNase和RNase的缓冲液浸泡处理为在2-40℃（优选4-25℃）条件下浸泡12h-72h（优选8-24h）。
上述方法中，在含DNase的缓冲液或者含DNase和RNase的缓冲液浸泡处理后进行漂洗、干燥和灭菌。
优选地，在含DNase的缓冲液或者含DNase和RNase的缓冲液浸泡处理后，将软骨膜片采用缓冲液（优选为PBS缓冲液和/或Tris-HCl缓冲液）进行漂洗（漂洗次数可为3-5次）。
所述干燥可采用烘干或冻干的方式。其中，烘干温度为2-50℃（优选30-50℃），风速为0.1-10m³/min（优选0.3-0.7m³/min），时间为1-48h（优选1-10h）。冻干程序为：预冻-20~-40℃，1-12h；第一次干燥-40-0℃，12-48h；第二次干燥0-40℃，12-48h。
上述方法中，所述灭菌可采用辐照（例如Co60辐照）、环氧乙烷灭菌、电子束灭菌等方式。在灭菌前还可包括包装的步骤。
本发明的制备方法对于软骨组织的来源没有特殊限制，适用于各种来源的软骨组织，包括人软骨组织、非人哺乳动物软骨组织或组织工程获得的软骨组织等。
本发明提供以上所述的制备方法制备得到的生物鼓膜。
优选地，所述生物鼓膜的拉伸强度为10-50N/cm，孔径180-210μm，孔隙率为85-95%，Ⅱ型胶原蛋白含量不低于100mg/g，sGAG含量不低于60mg/g，DNA含量不高于10μg/g。
进一步优选地，所述生物鼓膜的拉伸强度为10-50N/cm，孔径180-210μm，孔隙率为85-95%，Ⅱ型胶原蛋白含量150-200mg/g，sGAG含量60-100mg/g，DNA含量1-10μg/g。
本发明还提供所述生物鼓膜在制备用于鼓膜修复的产品中的应用。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的方法制得生物鼓膜的主要组成为软骨脱细胞基质，其主要组成成分为Ⅱ型胶原蛋白、sGAG等活性成分，与人体鼓膜中间纤维层的主要组成成分具有较高的相似度，更有利于鼓膜中间层纤维细胞的黏附、增殖、分化；
2、本发明的方法制得生物鼓膜的降解速率显著降低，可有效减缓生物鼓膜的降解，更精准地控制降解速率，有利于实现机体鼓膜再生与生物鼓膜体内降解的动态平衡；
3、本发明的方法制得生物鼓膜的细胞、DNA等免疫原性物质的残留极少，免疫原性极低；
4、本发明的方法制得生物鼓膜的三维空间结构与人体鼓膜中间层纤维结构的相似度高，有利于营养物、水分和代谢产物输送；
5、本发明的方法制得生物鼓膜的力学性能优异，能够为鼓膜中间层纤维细胞的增殖提供有力的支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例中天然软骨HE染色图片。
图2为本发明实验例中生物鼓膜HE染色图片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种生物鼓膜的制备方法，其步骤如下：
取新鲜的软骨组织，使用PBS漂洗三次，处理为500μm软骨膜片，使用含0.035mmol/L PMSF的PBS漂洗三次，然后将软骨膜片浸泡于0.035mmol/L PMSF溶液中于25℃保存1h；
将上述处理后的软骨膜片于含50mM EDC、25mM NHS和50mM MES的水溶液中于4℃浸泡4h，然后用PBS漂洗三次；再于0.1% BDDE溶液中4℃，浸泡4h，用PBS漂洗三次；
将交联后的软骨膜片用含1%Triton X-100和0.035mmol/L PMSF的PBS溶液于25℃浸泡72h，PBS漂洗三次；再置于含50U/mL DNase的PBS溶液中于4℃浸泡8h，然后用PBS漂洗三次；之后在37℃、风速0.5m³/min条件下鼓风烘干10h，经内包后进行Co60辐照灭菌，即得生物鼓膜样品。
本实施例还提供采用上述方法制备得到的生物鼓膜。
实施例2
本实施例提供一种生物鼓膜的制备方法，其步骤如下：
取新鲜的软骨组织，使用PBS漂洗三次，处理为100μm软骨膜片，使用含0.035mmol/L PMSF的PBS漂洗三次，然后将软骨膜片浸泡于0.035mmol/L PMSF溶液中于4℃保存1.5h；
将上述处理后的软骨膜片于含60mM EDC、30mM NHS和50mM MES的水溶液中于8℃浸泡2h，然后用PBS漂洗三次；0.4%BDDE溶液中2℃，浸泡6h，然后用PBS漂洗三次；
将交联后的软骨膜片用含1%Triton X-100和0.035mmol/L PMSF的PBS溶液于4℃浸泡48h，PBS漂洗三次；再置于含50U/mL DNase的PBS溶液于25℃浸泡24h，然后用PBS漂洗三次；之后在37℃，风速0.5m³/min条件下鼓风烘干10h，经内包后进行Co60辐照灭菌，即得生物鼓膜样品。
本实施例还提供采用上述方法制备得到的生物鼓膜。
实施例3
本实施例提供一种生物鼓膜的制备方法，其步骤如下：
取新鲜的软骨组织，使用PBS漂洗三次，处理为200μm软骨膜片，使用含0.05mmol/LPMSF的PBS漂洗三次，然后将软骨膜片浸泡于0.05mmol/L PMSF溶液中25℃保存1h；
将上述处理后的软骨膜片于含20mM EDC、10mM NHS和20mM MES的水溶液中于2℃浸泡6h，然后用PBS漂洗三次；再于0.1%BDDE溶液中10℃，浸泡2h，用PBS漂洗三次；
将交联后的软骨膜片用含1.5% Triton X-100和0.05mmol/L PMSF的PBS溶液于25℃浸泡12h，PBS漂洗三次；再置于含10U/mL DNase的PBS溶液于4℃浸泡24h，然后用PBS漂洗三次；之后在37℃，风速0.5m³/min条件下鼓风烘干3h，经内包后进行Co60辐照灭菌，即得生物鼓膜样品。
本实施例还提供采用上述方法制备得到的生物鼓膜。
实施例4
本实施例提供一种生物鼓膜的制备方法，其步骤如下：
取新鲜的软骨组织，使用PBS漂洗三次，处理为50μm软骨膜片，使用含0.035mmol/LPMSF的PBS漂洗三次，然后将软骨膜片浸泡于0.035mmol/L PMSF溶液中于4℃保存1h；
将上述处理后的软骨膜片于含50mM EDC、25mM NHS和50mM MES的水溶液中于4℃浸泡3h，然后用PBS漂洗三次；再于0.1% BDDE溶液中6℃，浸泡2h，用PBS漂洗三次；
将交联后的软骨膜片用含1%Triton X-100和0.035mmol/L PMSF的PBS溶液于4℃浸泡24h，PBS漂洗三次；再置于含25U/mL DNase和100U/mL RNase的PBS溶液中于4℃浸泡8h，然后用PBS漂洗三次；之后在37℃，风速0.5m³/min条件下鼓风烘干1h，经内包后进行Co60辐照灭菌，即得生物鼓膜样品。
本实施例还提供采用上述方法制备得到的生物鼓膜。
对比例1
取新鲜的软骨组织，使用PBS漂洗三次，处理为500μm软骨膜片，使用含0.035mmol/L PMSF的PBS漂洗三次，然后将软骨膜片浸泡于0.035mmol/L PMSF溶液中于25℃保存1h；
将上述处理后的软骨膜片于含50mM EDC、25mM NHS和50mM MES的水溶液中于4℃浸泡4h，然后用PBS漂洗三次；
将交联后的软骨膜片用含1%Triton X-100和0.035mmol/L PMSF的PBS溶液于25℃浸泡72h，PBS漂洗三次；再置于含50U/mL DNase的PBS溶液中于4℃浸泡8h，然后用PBS漂洗三次；之后在37℃、风速0.5m³/min条件下鼓风烘干10h，经内包后进行Co60辐照灭菌，即得生物鼓膜样品。
对比例2
取新鲜的软骨组织，使用PBS漂洗三次，处理为500μm软骨膜片，使用含0.035mmol/L PMSF的PBS漂洗三次，然后将软骨膜片浸泡于0.035mmol/L PMSF溶液中于25℃保存1h；
将上述处理后的软骨膜片于含0.1% BDDE溶液中4℃，浸泡4h，用PBS漂洗三次；
将交联后的软骨膜片用含1%Triton X-100和0.035mmol/L PMSF的PBS溶液于25℃浸泡72h，PBS漂洗三次；再置于含50U/mL DNase的PBS溶液中于4℃浸泡8h，然后用PBS漂洗三次；之后在37℃、风速0.5m³/min条件下鼓风烘干10h，经内包后进行Co60辐照灭菌，即得生物鼓膜样品。
对比例3
本对比例提供一种生物鼓膜的制备方法，其步骤如下：
取新鲜的软骨组织，使用PBS漂洗三次，处理为500μm软骨膜片，使用含0.035mmol/L PMSF的PBS漂洗三次，然后将软骨膜片浸泡于0.035mmol/L PMSF溶液中于25℃保存1h；
将上述处理后的软骨膜片于含1%Triton X-100和0.035mmol/L PMSF的PBS溶液于25℃浸泡72h，PBS漂洗三次；
将上述处理后的软骨膜片于含50mM EDC、25mM NHS和50mM MES的水溶液中于4℃浸泡4h，然后用PBS漂洗三次；再于0.1% BDDE溶液中4℃，浸泡4h，用PBS漂洗三次；再置于含50U/mL DNase的PBS溶液中于4℃浸泡8h，然后用PBS漂洗三次；之后在37℃，风速0.5m³/min条件下鼓风烘干10h，经内包后进行Co60辐照灭菌，即得生物鼓膜样品。
实验例
1、生物鼓膜中活性成分含量的检测
检测以上各实施例和对比例制得生物鼓膜中Ⅱ型胶原蛋白和sGAG的含量，其中，采用特异性抗体，酶联免疫吸附测定（ELISA）法分析鉴定Ⅱ型胶原蛋白，Ⅱ型胶原蛋白含量采用液相色谱质谱联用法检测，sGAG采用YY/T 1810-2022《组织工程医疗产品 用以评价软骨形成的硫酸糖胺聚糖（sGAG）的定量检测》的方法检测。
各实施例和对比例的检测结果如表1所示。
表1
Figure SMS_1
2、生物鼓膜的结构和力学性能检测
对各实施例和对比例制得生物鼓膜的空间结构和力学性能进行检测，其中，孔径和孔隙率采用GB/T 21650.1-2008《压汞法和气体吸附法测定固体材料孔径分布和孔隙度第1部分 压汞法》的方法进行检测，拉伸强度采用GBT 528-2009《硫化橡胶或热塑性橡胶拉伸应力应变性能的测定》的方法进行检测。
各实施例和对比例的检测结果如表2所示。
表2
Figure SMS_2
3、免疫原性物质残留检测
采用YY∕T 0606.25-2014《组织工程医疗产品 第25部分：动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法》的方法检测，对各实施例和对比例制得生物鼓膜中的DNA残留量进行检测，结果如表3所示。
表3
Figure SMS_3
进一步地，采用HE染色方法验证本发明制得生物鼓膜的细胞核残留，结果如图1和图2所示，结果显示，使用的软骨组织原料（图1）带有大量细胞核，而实施例1制得生物鼓膜则没有细胞核（图2）。
4、生物鼓膜的降解速率检测
生物鼓膜降解实验方法：取50mg生物鼓膜，浸入盛水的烧杯中，用手指轻柔直至完全浸湿。取出，用滤纸除去多余的水，将该潮湿的样品放入150mL具塞三角瓶中，瓶中已装有100mL预加热到37℃±1℃、质量分数为1%胃蛋白酶（活力约为3000U/mg）的盐酸溶液【c（HCL）=0.1mol/L】。在37℃±1℃，约150r/min轻轻振摇直至完全消化。重复操作3次，记录三次完全消化时间，取平均值。结果如表4所示。
表4
Figure SMS_4
/>
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种生物鼓膜的制备方法，其特征在于，所述方法以软骨组织为原料，包括先将软骨组织处理为50-500μm的软骨膜片，再将软骨膜片进行交联、脱细胞和去除免疫原的步骤；
所述交联包括将软骨膜片依次经EDC-NHS交联和BDDE交联的步骤。
2.根据权利要求1所述的生物鼓膜的制备方法，其特征在于，EDC-NHS交联体系中，EDC的浓度为20-200mM，NHS的浓度为10-100mM。
3.根据权利要求2所述的生物鼓膜的制备方法，其特征在于，所述EDC-NHS交联在MES缓冲液中进行；EDC-NHS交联体系中，MES缓冲液的浓度为10-1000mM。
4.根据权利要求1~3任一项所述的生物鼓膜的制备方法，其特征在于，BDDE交联体系中，BDDE的浓度为0.05-0.5%。
5.根据权利要求4所述的生物鼓膜的制备方法，其特征在于，EDC-NHS交联和BDDE交联均为在2-10℃条件下浸泡2-6h。
6.根据权利要求1~3任一项所述的生物鼓膜的制备方法，其特征在于，在EDC-NHS交联前，先将软骨膜片于蛋白酶抑制剂溶液中浸泡处理；
和/或，所述脱细胞为将交联后的软骨膜片于含Triton X-100和/或SDS以及蛋白酶抑制剂的缓冲液中浸泡处理；
和/或，所述去除免疫原为将脱细胞后的软骨膜片于含DNase的缓冲液或者含DNase和RNase的缓冲液中浸泡处理。
7.根据权利要求6所述的生物鼓膜的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂溶液中，蛋白酶抑制剂的浓度为0.01-0.1mM；
和/或，所述含Triton X-100和/或SDS以及蛋白酶抑制剂的缓冲液中，Triton X-100的浓度为0.5-5%，SDS的浓度为0.1-2%，蛋白酶抑制剂的浓度为0.01-0.1mM；
和/或，所述含DNase的缓冲液中，DNase的浓度为10-100U/mL；
和/或，所述含DNase和RNase的缓冲液中，DNase和RNase的浓度均为10-100U/mL；
和/或，所述缓冲液为PBS缓冲液和/或Tris-HCl缓冲液。
8.根据权利要求7所述的生物鼓膜的制备方法，其特征在于，采用蛋白酶抑制剂溶液浸泡处理为在2-25℃条件下浸泡0.5-2h；
和/或，采用含Triton X-100和/或SDS以及蛋白酶抑制剂的缓冲液进行浸泡处理为在2-25℃条件下浸泡12-72h；
和/或，采用含DNase的缓冲液或者含DNase和RNase的缓冲液浸泡处理为在2-40℃条件下浸泡12-72h。
9.权利要求1~8任一项所述的制备方法制备得到的生物鼓膜。
10.权利要求9所述的生物鼓膜在制备用于鼓膜修复的产品中的应用。
CN202310468969.0A 2023-04-27 2023-04-27 一种生物鼓膜及其制备方法和应用 Active CN116173303B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310468969.0A CN116173303B (zh) 2023-04-27 2023-04-27 一种生物鼓膜及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310468969.0A CN116173303B (zh) 2023-04-27 2023-04-27 一种生物鼓膜及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116173303A true CN116173303A (zh) 2023-05-30
CN116173303B CN116173303B (zh) 2023-07-04

Family

ID=86449324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310468969.0A Active CN116173303B (zh) 2023-04-27 2023-04-27 一种生物鼓膜及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116173303B (zh)

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060134170A1 (en) * 2004-08-13 2006-06-22 May Griffith Vision enhancing ophthalmic devices and related methods and compositions
CN101427947A (zh) * 2008-12-22 2009-05-13 上海冠昊医疗器械有限公司 一种多功能女性盆腔生物补片
CN102805881A (zh) * 2012-06-18 2012-12-05 浙江星月生物科技股份有限公司 一种胶原基骨软骨三层复合物及其制备方法
CN104225677A (zh) * 2013-06-13 2014-12-24 山东省生物药物研究院 交联透明质酸细胞支架材料及其制备方法和应用
CN104861178A (zh) * 2015-05-26 2015-08-26 西北大学 普鲁兰多糖-透明质酸水凝胶及其制备方法
CN105148325A (zh) * 2015-09-18 2015-12-16 广州市朴道联信生物科技有限公司 一种新的角膜组织修复材料及其制备方法
CN108465128A (zh) * 2018-03-01 2018-08-31 杭州协合医疗用品有限公司 一种交联透明质酸细胞支架材料的制备方法
CN109069699A (zh) * 2016-04-14 2018-12-21 澳大利亚耳科学研究所 改善的丝纤蛋白生物相容性聚氨酯膜
CN109589453A (zh) * 2018-12-04 2019-04-09 冠昊生物科技股份有限公司 一种人工软骨支架的制备方法和应用
CN110302425A (zh) * 2019-06-20 2019-10-08 温州医科大学附属第一医院 混合水凝胶生物材料的制备方法及其应用
CN113368306A (zh) * 2020-03-23 2021-09-10 成都中科奥格生物科技有限公司 低免疫原性生物材料及其制备方法和用途
CN114702692A (zh) * 2022-04-01 2022-07-05 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种提高蛋白质类水凝胶稳定性的方法
CN115607733A (zh) * 2022-07-25 2023-01-17 胶原蛋白(武汉)生物科技有限公司 一种矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料、制备方法和应用

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060134170A1 (en) * 2004-08-13 2006-06-22 May Griffith Vision enhancing ophthalmic devices and related methods and compositions
CN101427947A (zh) * 2008-12-22 2009-05-13 上海冠昊医疗器械有限公司 一种多功能女性盆腔生物补片
CN102805881A (zh) * 2012-06-18 2012-12-05 浙江星月生物科技股份有限公司 一种胶原基骨软骨三层复合物及其制备方法
CN104225677A (zh) * 2013-06-13 2014-12-24 山东省生物药物研究院 交联透明质酸细胞支架材料及其制备方法和应用
CN104861178A (zh) * 2015-05-26 2015-08-26 西北大学 普鲁兰多糖-透明质酸水凝胶及其制备方法
CN105148325A (zh) * 2015-09-18 2015-12-16 广州市朴道联信生物科技有限公司 一种新的角膜组织修复材料及其制备方法
CN109069699A (zh) * 2016-04-14 2018-12-21 澳大利亚耳科学研究所 改善的丝纤蛋白生物相容性聚氨酯膜
CN108465128A (zh) * 2018-03-01 2018-08-31 杭州协合医疗用品有限公司 一种交联透明质酸细胞支架材料的制备方法
CN109589453A (zh) * 2018-12-04 2019-04-09 冠昊生物科技股份有限公司 一种人工软骨支架的制备方法和应用
CN110302425A (zh) * 2019-06-20 2019-10-08 温州医科大学附属第一医院 混合水凝胶生物材料的制备方法及其应用
CN113368306A (zh) * 2020-03-23 2021-09-10 成都中科奥格生物科技有限公司 低免疫原性生物材料及其制备方法和用途
CN114702692A (zh) * 2022-04-01 2022-07-05 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种提高蛋白质类水凝胶稳定性的方法
CN115607733A (zh) * 2022-07-25 2023-01-17 胶原蛋白(武汉)生物科技有限公司 一种矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料、制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
顾其胜等: "《胶原蛋白与临床医学》", 第二军医大学出版社, pages: 80 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116173303B (zh) 2023-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Roosens et al. Impact of detergent-based decellularization methods on porcine tissues for heart valve engineering
US10610615B2 (en) Natural tissue scaffolds as tissue fillers
KR101668043B1 (ko) 비등방성 임플란트 및 그의 제조 방법
Lin et al. A new fish scale-derived scaffold for corneal regeneration
KR101060910B1 (ko) 실크단백질을 이용한 인공고막 및 그 제조방법
KR102128863B1 (ko) 임플란트 및 음압 하 관류에 의한 조직의 탈세포화를 통한 임플란트의 제조 방법
EP0773033A1 (en) A raw membranous material for medical materials and manufacturing methods thereof
JP2018527047A (ja) 無細胞軟骨グラフトの調製及びその使用
CN112618799B (zh) 鱼皮脱细胞真皮基质及其制备方法和应用
Qiu et al. In vitro two‐dimensional and three‐dimensional tenocyte culture for tendon tissue engineering
EP3572103A1 (en) Biological tissue matrix material, preparation method therefor and use thereof in otological repair material
JP5247796B2 (ja) 細胞由来細胞外マトリックス支持体の製造方法
Mathapati et al. Nanofibers coated on acellular tissue-engineered bovine pericardium supports differentiation of mesenchymal stem cells into endothelial cells for tissue engineering
Zhang et al. Repair of sciatic nerve defects using tissue engineered nerves
CN116173303B (zh) 一种生物鼓膜及其制备方法和应用
CN102921034A (zh) 猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料及其制备方法
KR100605382B1 (ko) 멍게 또는 미더덕-유래 셀룰로오스 막을 포함하는 피부상처 보호막 및 골형성 유도막
CN111359020B (zh) 软组织修复材料及其制备方法和应用
CN109498840B (zh) 一种眼表修复膜及其制备方法
KR20210095040A (ko) 돼지 피부 조직 탈세포화 방법
Lu et al. Decellularized tympanic membrane scaffold with bone marrow mesenchymal stem cells for repairing tympanic membrane perforation
WO2020062350A1 (zh) 一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜及其制备方法
Ahmadpour et al. Comparative study on surface geometric properties of decellularized and glutaraldehyde fixed bovine pericardium and possible effects on cell seeding
CN114848912B (zh) 一种脱细胞真皮及其制备方法
CN112957534A (zh) 一种脱细胞真皮基质材料的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant