KR20210095040A

KR20210095040A - 돼지 피부 조직 탈세포화 방법

Info

Publication number: KR20210095040A
Application number: KR1020210000903A
Authority: KR
Inventors: 이병택; 라자 벤츄라; 파달힌 안드류
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2021-01-05
Publication date: 2021-07-30
Also published as: KR20240063073A

Abstract

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 돼지 피부 조직을 효과적으로 탈세포화시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 (a) 돼지 피부 조직을 준비하는 단계; (b) 상기 돼지 피부 조직을 세척하고, 트립신 및 EDTA를 함유하는 수용액에서 처리하는 단계; (c) 수용액에서 처리된 돼지 피부 조직을 세척하고, SDS를 포함하는 이소프로판올 용액, 또는 SDS를 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에서 1차 탈세포화하는 단계; (d) 1차 탈세포화된 돼지 피부 조직을 세척하고, 트리톤을 포함하는 이소프로판올 용액, 또는 트리톤을 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에서 2차 탈세포화하는 단계; (e) 2차 탈세포화된 돼지 피부 조직을 세척하고, 이소프로판올 용액으로 3차 탈세포화하는 단계; 및 (f) 3차 탈세포화된 상기 돼지 피부 조직을 세척하고, 동결 건조하는 단계;를 포함하는 돼지 피부 조직 탈세포화 방법이다.

Description

돼지 피부 조직 탈세포화 방법{Porcine skin tissue decellularization method}

본 발명은 조직공학 분야 적용을 위한 돼지 피부 ECM 탈세포화 방법에 관한 것이다.

탈세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix)은 조직공학으로 사용할 수 있는 이종 발생성의 골격(xenogenic scaffolds)을 대체할 수 있는 좋은 공급원이 될 수 있다.

ECM은 조직공학 및 생체재료 응용에 바람직한 특성을 지니고 있다. 또한, ECM은 기계적, 그리고 구조적으로 세포들을 돕는다. 합성 생체 물질로만으로 조달하고 유지하기 어려운 신호 작용, 성장 인자, 단백질로 구성되어 있는 ECM은 세포 이동, 접착, 증식을 위한 단서를 제공한다. 나아가서, 성장 요인을 끌어당기고 결합할 수 있다.

탈세포화는 ECM의 구조적 및 기능적 특성을 유지하면서, 세포 및 핵 구성물을 효과적으로 제거하여 ECM의 잠재능력을 최대치로 끌어올렸다. 탈세포화된 ECM은 조직공학 분야에서 새로운 물질이다. 이 ECM은 분말, 코팅, 주입식 하이드로겔 및 하이드로겔 등으로 응용할 수 있다.

피부, 심장, 간, 신장, 근육, 점막밑층, 신경, 힘줄, 인대 및 혈관과 같은 기관으로부터의 ECM이 탈세포화되어 조직공학 분야에 활용되었다. 돼지 피부는 인간의 피부와 화학적 그리고 구조적으로 유사하기 때문에 조직 공학에 적합한 생체 물질로 여겼다. 그러나, 피부 조직은 밀도가 높고, 구조가 복잡하고, 지질 함량이 높기 때문에 탈세포화하기 더 어려운 경향이 있어, 이를 해결하기 위한 다양한 연구가 진행중이다.

등록특허 제10-1029887호(2011.04.11.)

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 돼지 피부 조직을 효과적으로 탈세포화시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 (a) 돼지 피부 조직을 준비하는 단계; (b) 상기 돼지 피부 조직을 세척하고, 트립신 및 EDTA를 함유하는 수용액에서 처리하는 단계; (c) 수용액에서 처리된 돼지 피부 조직을 세척하고, SDS를 포함하는 이소프로판올 용액, 또는 SDS를 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에서 1차 탈세포화하는 단계; (d) 1차 탈세포화된 돼지 피부 조직을 세척하고, 트리톤을 포함하는 이소프로판올 용액, 또는 트리톤을 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에서 2차 탈세포화하는 단계; (e) 2차 탈세포화된 돼지 피부 조직을 세척하고, 이소프로판올 용액으로 3차 탈세포화하는 단계; 및 (f) 3차 탈세포화된 상기 돼지 피부 조직을 세척하고, 동결 건조하는 단계;를 포함하는 돼지 피부 조직 탈세포화 방법이다.

상기 (b) 단계에서 트립신의 농도는 0.1~0.5%(w/v)일 수 있다.

상기 (c) 단계에서, 상기 이소프로판올 용액에 포함된 SDS의 농도는 0.01~0.3%(w/v)이고, 이소프로판올의 농도는 50~80%(w/v)이고, 상기 SDS를 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에 포함된 SDS의 농도는 0.01~0.3%(w/v)이고, EDTA의 농도는 0.01~0.5%(w/v)이고, 트리스의 농도는 0.1~1%(w/v)인일 수 있다.

상기 (d) 단계에서, 상기 이소프로판올 용액에 포함된 트리톤의 농도는 0.5~3%(w/v)이고, 이소프로판올의 농도는 50~80%(w/v)이고, 상기 트리톤을 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에서, 트리톤의 농도는 0.5~3%(w/v)이고, EDTA의 농도는 0.01~0.5%(w/v)이고, 트리스의 농도는 0.1~1%(w/v)일 수 있다.

상기 (e) 단계에서 이소프로판올의 농도는 90~100%(w/v)일 수 있다.

상기 (f) 단계에서 상기 동결건조는 1~5일 동안 진행될 수 있고, 온도는 -30~-10℃일 수 있다.

본 발명은 돼지 피부 조직을 효과적으로 탈세포화 시킬 수 있으며, 탈세포화 효율을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 높은 양의 혈관 내피 성장 인자를 정량화시킬 수 있으며, 높은 양의 골 형성단백질을 보존하고, 세포 침투율을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 세포와 지질을 효과적으로 제거할 수 있다.

도 1A는 DNA 함량 및 지질 함량을 나타낸 도면이다.
도 1B는 H&E 염색, Hoechst 염색 및 엘라스틴 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 2A는 콜라겐 함량, 도 2B는 sGAG 함량, 도 2C는 α-엘라스틴 함량, 도 2D는 SDS-Page에 의한 단백질 무게를 측정한 결과, 도 2E는 VEGF의 성장인자 함량, 도 2F는 BMP-2의 함량을 나타낸 도면이다.
도 3A는 스캐닝 전자 현미경 사진, 도 3B는 FTIP 분석결과를 나타낸 도면이다.
도 4A는 세포적합성 분석결과를 나타낸 도면, 도 4B는 대사활성평가 결과를 나타낸 도면, 도 4C는 면역 형광 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 H&E 염색된 숙주 반응 결과(Determination of host's response)를 나타낸 도면이다.
도 6은 탈세포화 후, 7일 및 21일 후에 추출된 세포의 H&E 염색 도면이다.
도 7A는 피하 임플란트의 혈관을 보여주는 H&E 염색된 조직 섹션, 도 7B는 21일 후, 혈관 정량화를 나타낸 도면이다.
도 8은 이식된 탈세포화 시료에 침투한 다양한 유형의 대식세포를 나타낸 면역 형광 염색 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 구체적인 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

상기 (a) 단계는 돼지 조직을 준비하는 단계이며, 상기 돼지 조직은 탈세포화의 대상이 된다.

상기 (b) 단계는 돼지 조직을 세척하고, SDS를 포함하는 이소프로판올 용액에서 교반하는 단계로서, 구체적으로, 상기 돼지 조직 세척은 증류수를 이용하여 2~5회 수행될 수 있고, 이후, 3,000~4,000rpm으로 1~10분 동안 원심분리할 수 있다. 이후, 원심분리된 돼지 피부 조직을 0.1~0.5%(w/v)의 트립신 및 0.1~0.5%(w/v)의 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)를 함유하는 수용액에서 넣고, 온도 35~40℃ 및 4~8시간동안 처리한다.

상기 (c) 단계는 돼지 피부 조직을 1차 탈세포화하는 단계로서, 상기 돼지 피부 조직을 증류수를 이용하여 세척하고, SDS를 포함하는 이소프로판올 용액, 또는 SDS를 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에서 처리한다.

상기 (c) 단계에서, 상기 SDS의 농도는 0.01~0.3%(w/v)일 수 있고, 상기 이소프로판올의 농도는 50~80%(w/v)일 수 있으며, 상기 1차 탈세포화는 온도 35~40℃에서 4~8시간동안 진행된다.

또한, 상기 (c) 단계에서 SDS를 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에 포함된 SDS의 농도는 0.01~0.3%(w/v)이고, EDTA의 농도는 0.01~0.5%(w/v)이고, 트리스의 농도는 0.1~1%(w/v)일 수 있고, 상기 1차 탈세포화는 온도 35~40℃에서 4~8시간동안 진행된다.

상기 (d) 단계는 1차 탈세포된 돼지 피부 조직을 2차 탈세포화하는 단계로서, 상기 돼지 피부 조직을 증류수를 이용하여 세척하고, 트리톤을 포함하는 이소프로판올(Isopropanol) 용액, 또는 트리톤을 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에서 처리하는 단계이며, 상기 트리톤은 Triton X-100일 수 있다.

상기 (d) 단계에서, 상기 트리톤의 농도는 0.5~3%(w/v)일 수 있고, 상기 이소프로판올의 농도는 50~80%(w/v)일 수 있으며, 상기 2차 탈세포화는 온도 35~40℃에서 10~14시간동안 진행된다.

또한, 상기 (d) 단계에서, 트리톤을 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에서 트리톤의 농도는 0.5~3%(w/v)이고, EDTA의 농도는 0.01~0.5%(w/v)이고, 트리스의 농도는 0.1~1%(w/v)일 수 있고, 상기 2차 탈세포화는 온도 35~40℃에서 10~14시간동안 진행된다.

상기 (e) 단계는 2차 탈세포된 돼지 피부 조직을 3차 탈세포화하는 단계로서, 상기 돼지 피부 조직을 증류수를 이용하여 세척하고, 이소프로판올 용액으로 처리한다. 상기 (e) 단계에서 이소프로판올의 농도는 90~100%(w/v)일 수 있으며, 35~40℃에서 10~14시간 동안 진행된다.

상기 (f) 단계는 3차 탈세포화된 돼지 피부 조직을 세척하고, 동결 건조하는 단계이며, 상기 동결 건조는 -30~-10℃에서 1~5일 동안 진행될 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 구체적인 실시예를 들어 설명한다.

비교예

시장에서 구입한 돼지 피부를 증류수를 이용하여 3회 세척한다. 세척 후, 수술용 블래이드로 표피를 제거하고, 5mm 스트립으로 절단하였다. 절단된 피부는 균질의 혼합물을 얻기 위하여, 푸드 프로세서(food processor)에서 균질화되었다. 균질화된 피부를 증류수로 세척하여 응고된 조직을 제거하고, 3500rpm에서 5분간 원심 분리하고, 지방이 있는 상층은 버리고 가라앉은 표피층을 사용하였다.

이후, 아무런 처리를 하지 않은 돼지 피부 조직을 네이티브 ECM(Native ECM)으로 명명하였다.

실시예 1(방법 : 프로토콜 1)

이후, 원심분리된 돼지 피부를 증류수로 세척하고, 0.25%(w/v)의 트립신 및 0.26%(w/v)의 EDTA를 포함하는 용액에 돼지 피부를 넣고, 37℃에서 6시간 동안 처리하였다. 이후, 증류수로 세척한 후, 0.1%(w/v) SDS를 포함하는 0.26%(w/v) EDTA 및 0.69%(w/v) 트리스(Tris)를 혼합한 용액에 돼지 피부를 넣고 37℃에서 6시간 동안 1차 탈세포화한다. 이후, 증류수로 세척하고, 1%(w/v) 트리톤-X100을 포함하는 0.26%(w/v) EDTA 및 0.69%(w/v) 트리스(Tris)를 혼합한 용액에 돼지 피부를 넣고 37℃에서 12시간 동안 2차 탈세포화한다. 이후, 증류수로 세척하고, 100%(w/v) 이소프로판용액에 넣고, 37℃에서 12시간동안 3차 탈세포화한다. 이후, 증류수로 세척하고, 3일 동안 -20℃에서 동결 건조시켜 시료를 준비하고, 이를 프로토콜 1 ECM(protocol 1 ECM)으로 명명한다.

실시예 2(방법 : 프로토콜 2)

이후, 원심분리된 돼지 피부를 증류수로 세척하고, 0.25%(w/v)의 트립신 및 0.26%(w/v)의 EDTA를 포함하는 용액에 돼지 피부를 넣고, 37℃에서 6시간 동안 처리하였다. 이후, 증류수로 세척한 후, 0.1%(w/v) SDS를 포함하는 70%(w/v)의 이소프로판올 용액에 돼지 피부를 넣고 37℃에서 6시간동안 1차 탈세포화한다. 이후, 증류수로 세척하고, 1%(w/v) 트리톤-X100을 포함하는 70%(w/v)의 이소프로판올 용액에 돼지 피부를 넣고 37℃에서 12시간동안 2차 탈세포화한다. 이후, 증류수로 세척하고, 100%(w/v) 이소프로판용액에 넣고, 37℃에서 12시간동안 3차 탈세포화한다. 이후, 증류수로 세척하고, 3일 동안 -20℃에서 동결 건조시켜 시료를 준비하고, 이를 프로토콜 2 ECM(protocol 2 ECM)으로 명명하였다.

실험예

1 : 탈세포화 효율

1.1 DNA 정량화(DNA quantification)

비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 건조된 100mg ECM 시료는, 0.5M EDTA, 5M NaCl, 1 M Tris-HCl(ph 8.0) 및 20(w/v)% SDS를 포함하는 1.2ml lysis 완충액과 혼합하고, 55℃에서 24시간 동안 Teflon 균질제를 사용하여 균질화하였다.

이후, DNA 추출 후, 시료가 들어 있는 튜브는 10분 동안 10,000rpm에서 원심 분리하였다. 상층액은 두 개의 튜브로 나뉘었고, 동일한 양의 이소프로판올이 각 튜브에 첨가되었다. 1,300rpm에서 30분간 원심 분리 후 상층액을 폐기하고 70(w/v)% 에탄올을 펠릿에 첨가했으며, 다시 5분간 3,500rpm에서 원심분리했다. 상층액 폐기 후, 펠릿은 공기로 건조되었고 또 15분간 냉동 동결되었다. 그 후 1μl의 물을 추가하여 펠릿을 용해시키고 나노광도계로 분석되었다(n=4).

1.2 지질함량의 반정량화(Semi quantification of lipid content by Oil Red O)

Oil Red O를 이용하여 비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 시료의 지질 함량을 반정량화하였다. 3.5mg의 Oil Red O 염료를 이소프로판올에 용해시켜 Oil Red O 스톡 용액을 조제했다. 작업 용액은 Oil Red O stock 용액을 증류수에 3:2 비율로 혼합하여 준비되었다. 비교예, 실시예 1 및 실시예 2에서 건조된 시료는 파라포름알데히드 4%에 1시간 동안 고정되었고 흐르는 물로 10분간 세척하였다. 파라포름알데히드 고정 이후, 시료 100mg을 증류수로 세척하고 Oil Red O 작업용액으로 15분간 염색하였다. 시료(n=4)는 증류수로 4회 세척됐다. 그 후 이소프로판올 0.5ml를 각 시료에 추가한 후 10분 동안 기계식 믹서로 혼합하여 Oil Red O 염색물을 추출했다. 이소프로판올 결과물은 96개의 웰 플레이트(well plate)로 전달되었고, Infinite 50 microplate reader를 사용하여 490nm 파장에서의 흡광도 값을 판독하였다.

1.3 조직학적 염색(Histological staining)

탈세포화된 비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 시료에서 형태학적 구조와 핵 제거는 헤마토실린과 에오신(H&E)으로 염색된 세포 조직을 사용하여 조사되었다. 시료는 실온에서 10% 포르말린 용액으로 고정되었고 알코올 계열로 탈수되어, 자일렌 계열에 적셔??고 섹션 분할을 위해 파라핀에 내장되었다. 그런 다음 마이크로톰을 이용하여 5μm 단위로 절단하고 헤마토실린과 에오신(H&E; Sigma Aldrich, USA)으로 염색되었다. H&E는 핵을 파랑으로, 콜라겐은 옅은 분홍색으로 염색시켰다. 염색된 H&E 조직은 올름푸스 현미경(Olympus BX53 system microscope)으로 시각화되었다.

1.4. 형광 염색(Fluorescent staining)

비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 시료는 4% 파라포름알데히드로 고정되었고, 0.5% Triton x-100으로 투과되었으며, Triton-X 잔여물을 제거하기 위해 PBS로 세척되었다. 그 후 시료는 Bovine serum albumin으로 차단되고 5분 동안 Hoechst 33342로 염색되었다. 마이크로그래프는 Fluoview FV10i로 촬영되었고 FV10i-ASW 3.0 뷰어 소프트웨어로 분석되었다.

1.5. 엘라스틴 염색(Elastin staining)

VVG(Verhoeff-Van Gieson) 염색 프로토콜은 탈세포화 전후 ECM의 탄력소 함량을 결정하는데 활용되었다. 파라핀에 밀착된 비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 시료는 자일렌에서 탈파라핀화되었고 알코올 계열로 탈수되었다. 슬라이드는 1시간 동안 Verhoeff 용액으로 염색되었고, 2분 동안 염화제2철 2%로 구별되었으며, 분화를 막기 위해 흐르는 물로 세척되었고, 1분 동안 티오황산나트륨 5%로 처리되었다. 슬라이드들은 물로 재세척되고, 3~5분간 Van Gieson 용액에서 대비염색되었다. 그 후 95% 에탄올과 100% 알코올이 함유된 자일렌 용액으로 탈수되었다. 탄성 섬유는 검정색으로 염색되었고, 콜라겐은 분홍색으로 염색되었다.

2 : 매트릭스 함량 평가 (Matrix content assessment)

2.1. 콜라겐 정량화(Collagen quantification)

콜라겐 함량은, 비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 시료를 0.5M 아세트산에 넣고, 4℃에서 24시간 동안 사용하여 추출되었고, Sirius Red Total Detection 키트로 정량화되었다. 튜브들은 그 후 원심 분리되어 상층액을 얻어내었다. 콜라겐 함량은 제조업체의 포로토콜을 기반으로 분석되었다. 프르토콜을 요약하면, 100μl 상층액을 새 튜브로 옮기고, 500μl의 염료 시약을 튜브에 추가한 후, 20분간 실온에서 배양했다. 세척으로 세척 후, 추출 버퍼를 튜브에 추가했다. 샘플의 흠광도(n=5)는 Infinite 50 microplate reader를 이용해 540nm의 파장에서 측정되었다. 콜라겐 함량은 표준곡선을 사용하여 계산되었다.

2.2. 황화 글리코사미노글리칸(sGAG) 정량화 (Sulfated glycosaminoglycan (sGAG) quantification)

황화 글리코사미노글리칸 함량은 영상 65℃에서 24시간 동안 인산나트륨 완충액을 사용하여, 건조된 비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 샘플에서 추출된 후, Blyscan sGAG 검사 키트를 사용하여 정량화되었다. 그 후 튜브를 12,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 구했다. sGAG 함량은 제조업체의 프로토콜을 기반으로 분석되었다. 간단히 프로토콜을 설명하자면, 100μl 상층액을 새 튜브로 옮긴 다음 500μl의 염료 시약을 튜브에 첨가하고, 실온에서 30분간 배양했다. 그런 다음 튜브를 12,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 펠릿을 방해하지 않은 채 상층액을 제거했다. 그런 다음 추출 버퍼가 튜브에 추가되었다. 샘플의 흡광도(n=5)는 Infinite 50 microplate reader를 사용하여 620nm의 파장에서 측정되었다.

2.3. 알파 엘라스틴 정량화(α-Elastin quantification)

알파 탄력소 함량은 영상 65℃에서 1 M의 옥살산을 사용하여 건조된 비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 샘플에서 추출하고, Fastin Elastin Assay(Biocolor, UK)를 사용하여 정량화했다. 그런 다음 튜브들을 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 알파 엘라스틴의 함량은 제조사 프로토콜에 따라 분석되었다. 간단히 설명하면, 100μl의 상층액을 새 튜브로 옮기고 500μl의 염료 시약을 튜브에 추가한 후 90분간 상온에서 배양했다. 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리 후 상층액을 신중히 제거하고 추출 버퍼를 첨가했다. 그런 다음 시료의 흡광도(n=4)를 Infinite 50 microplate reader를 사용하여 513nm의 파장에서 측정했다. 알파 엘라스틴의 함량은 표준 곡선을 사용하여 계산되었다.

2.4. 성장인자 분석을 위한 우레헤파린 추출물 준비(Urea heparin extract preparation for growth factor assays)

단백질 추출물은 Reing에 의해 공개된 프로토콜에 기초하여 준비되었다. 비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 샘플 400 mg 검체의 무게를 측정하여 15ml의 원심분리 튜브로 이동시켰다. 그 후 pH 7.4의 단백분해효소 억제제(1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF, Sigma Aldrich), 5 mM benzamidine (Sigma Aldrich, USA), and 10 mM N-ethylmaleimide (NEM, Sigma Aldrich, USA)와 함께, 50mM Tris 안에 2M 요소(urea)와 5mg/ml 헤파린이 들어 있는 6ml의 우레헤파린 버퍼가 튜브에 첨가되었고 밤새 실온에서 흔들어지며 배양되었다. 그 후 상층액을 얻기 위해, 튜브들은 5000 rpm에서 5분간 원심분리되었다. 또 다른 6ml의 우레아 헤파린 버퍼를 샘플이 포함된 튜브에 첨가한 후, 실온에서 24시간 동안 혼합한 다음, 5분간 5000 rpm에서 원심분리했다. 그리고 나서 ECM 샘플의 단백질 함량을 BCA 검사를 사용하여 정량화했다(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA).

2.5. 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE))

감압 전후의 비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 분자량 변화를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 수행했다. 건조된 네이티브 ECM, 프로토콜 1 및 프로토콜 2로부터 나온 단백질 추출물(n=3)은 8% SDS-PAGE에 의해 분석 후, Gel Code Blue 안전 단백질로 염색되었다.

2.6. 성장인자 분석(Growth factor assays)

VEGF 농도는 VEGF Quantikine Kit(R&D Systems)를 사용하여 측정되었다. Infinite microplate reader를 사용하여 비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 샘플의 흡광도(n=4)를 450 nm의 파장에서 측장했다. VEGF 함량은 표준 곡선을 사용하여 계산되었다.

BMP-2 농도는 BMP-2 Quantikine Kit (R&D Systems)를 사용하여 정량화되었다. 비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 샘플의 흡광도(n=4)를 Infinite 50 microplate reader를 사용하여 450nm의 파장에서 측정했다. VEFG 함량은 표준 곡선을 사용하여 계산되었다.

2.7. ECM시료의 형태학적 및 화학적 특성(Morphological and chemical characterization of ECM samples)

비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 샘플은 HMDS(Sigma)를 사용하는 임계점 건조로 건조되었다. 그 후 샘플을 알코올 계열로 탈수시키고, 스퍼터 코팅기 (sputter coater, Cressington Scientific Instruments, UK)로 백금 코팅을 진행한 후, 전자 현미경 관찰을 진행하였다. 스캐닝 전자 현미경(SEM, JEOL, JSM-6701F, Japan)은 표면 형태학 및 마이크로아키텍처 관찰에 사용되었다. 푸리에 변환 적외선 분석 (FTIR)은 네이티브 ECM을 대조군으로 삼으며 탈세포화 전후에 건조된 ECM 샘플의 화학 성분 변화를 확인하였다. FTIR 스펙트럼은, 4,000에서 700cm^-1의 범위(NicoletiS10 - Smart iTR, Thermo Fisher Scientific, USA) 내 에서 4cm^-1 해상도로 16개의 스캔이 얻어지는 Transmittance Mode를 사용해 수집되었다. 시료 분석 이전에 대기의 배경 스펙트럼(background spectrum) 자료를 수집했다. FTIR 스펙트럼은 화학 그룹과 관련된 주요 대역으로 평가되었다.

2.8. 체외연구(In vitro studies)

토끼 중간엽줄기세포(rBMSC), pre-osteoblast 세포(MC3T3-E1), 섬유아세포 세포(L929)의 세 가지 세포는, MTT 분석에 의해 결정되는 탈세포화된 비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM 검체의 세포적합성 (cytocompatibility)을 평가하기 위해 사용되었다. 3가지 세포주의 대사 활동은 WST 검사와 형광 영상으로 평가되었다.

2.9. 세포 구조(Cell culture)

쥐의 MC3T3-E1 세포는 American Type Culture Collection (ATCC-2593)에서 구했다. 세포는 10% 소태아 혈청(FBS, HyClone, Utah, USA)과 1% 페니실린-스트렙토마이신 (PS antibiotics, Lonza Bio-Whittaker)가 보충된 알파 최소 필수 배지(α-MEM, HyClone, Utah, USA)로 배양되었으며, 37℃ 온도와 이산화탄소 농도 5%의 가습 인큐베이터에서 배양되었다.

rBMSC는 앞에서 설명한 프로토콜을 사용하여 분리되었다. BMSC의 aspirate는 쥐의 대퇴골(Samtako Bio, Korea)에서 분리되었다. 세포는 cell strainer filter (100 μm nylon, Falcon, NJ)를 사용하여 분리되었고, 이후 1,500rpm에서 5분간 원심 분리되었다. 세포 펠릿은 10%의 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum, Life Technologies)과 1%의 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin,-streptomcin, Life Technologies)으로 보충된 알파 최수 필수 배지(α-Minimum Essential Medium, Life Technologies)에 재현탁(suspend)되었다. 적혈구 제거를 위해 세포들은 5% 아세트산에 현탁되었고 트리판 블루 제외 방법으로 수를 세었다. 세포 수 1.0 X 10⁷개의 rBMSC는 배양 접시(150mn)에 뿌려졌고 가습 배양기 내의 단일층에서 10~14일간 배양되었고, 배양기는 온도 37℃, 이산화탄소 농도 5%의 상태였다. 세번째 통과 세포는 후속 실험에 사용되었다.

쥐의 L929 섬유아세포는 American Type Culture Collection(ATCC-CCL1)에서 공수했다. 세포들은 Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM, Corning, USA)에서 배양되었으며, 10% 말 혈청(Horse Serum, HyClone, Utah, USA)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin Streptomycin, Lonza Bio-Whittaker)으로 보충되었으며, 온도 37℃, 이산화탄소 농도 5%의 가습 배양기에서 유지되었다.

2.10. 비교예의 네이티브 ECM, 실시예 1 및 2의 탈세포화된 ECM의 추출물(Extracts from native and decellullarized ECM)

배지 추출물은 비교예의 네이티브 ECM을 대조군으로 하여 10mg의 실시예 1 및 2의 탈세포화된 ECM 샘플을 얻어 준비되었으며, UV 조사로 멸균되었다. 계량된 건조 샘플(10 % w / v)을 10 % HS 또는 FBS 및 1 % PS가 보충된 적절한 배지에서 1일 및 7 일 동안 37℃에서 5% CO₂로 인큐베이터에서 배양했습니다. 그 후, 배지 추출물(n=3)을 지정된 시간이 지난 후 수집하고, 큰 미립자 물질을 제거하기 위해 5,000rpm에서 5분간 원심 분리되었으며, 추후 사용을 위해 4℃에서 보관했다.

2.11. 세포적합성 연구(Cytocompatibility studies)

비교예, 실시예 1 및 실시예 2의 ECM의 세포적합성은 ISO 10993-5에 따라 평가되었다. 세포 생존 가능성 평가를 위해 세가지 세트의 샘플이 준비되었다.

첫번째 그룹의 경우, rBMSC 세포는 6 X 10⁴ 세포수의 농도로 24-웰 플레이트에 시딩되었고 1일 동안 가습 배양기에 배양되었다. 배양 1일 후, 배지(culture media)는 10% FBS와 1% PS가 보충된 100% 배지 추출물로 1일 및 7일에 교체되었다. 배지 추출물 노출 24시간 후 MTT 분석을를 통해 세포 생존성(n=3)을 평가했습니다.

두 번째 그룹의 경우, MC3T3-E1 전조골세포(pre-osteoblast)는 6 X 10⁴ 세포수의 농도로 24-웰 플레이트에 시딩되었고, 가습 배양기에서 1일 동안 배양되었다. 하루 동안의 배양 이후, 배지(culture media)는 FBS 10%과 1% PS가 보충된 100% 배지 추출물로 1일 및 7일에 교체되었다. 착생 MC3T3-E1 전조골세포(Adherent MC3T3-E1 pre-osteoblast cells)는 액체 ECM 추출물에 노출되어 24시간 동안의 세포 생존성(n=3)을 평가했다.

세번째 그룹의 경우, L929 세포는 6 X 10⁴세포수 농도로 24-웰 플레이트에 시딩되어 가습 인큐베이터에서 1일 동안 배양되었다. 배양 하루 후 배양 배지는 1 일 및 7일에 100% 배지 추출물로 교체되었고 10% HS와 1% PS로 보충되었다. 착생 L929 세포(Adherent L929 cells)는 10% HS와 1% PS가 보충된 액체 ECM 추출물에 24시간 동안 노출되었으며, MTT 분석으로 세포생존성(n=3)을 평가했다.

MTT 분석에서는, 100 μl of MTT 시약, 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-yl)-2, 5-디페닐테트라졸리윰 브롬화물(Sigma Aldridge, USA)이 각 배양판에 첨가되었고 보라색 포르마잔염으로 디벨럽(Developed)되도록 4시간동안 배양되었다. 그 후 배지와 MTT 용액을 제거하고 각 배양판에 DMSO(Samchun Pure Chemical Co., Ltd., Korea)를 첨가한 후 1시간 동안 상온에서 배양하여 포르마잔 염을 용해했다.

결과물인 보라색 포르마잔염 용액은 96개의 웰 플레이트로 이동되었다. 각 배양판의 흡광도는 microplate reader를 사용하여 595nm의 파장에서 측정되었다. 대상활성 및 생존세포는 MTT를 흡광도가 500~600 nm인 보라색 포르마잔 염으로 감소시켰다. 죽은 세포는 MTT를 포르마잔으로 변환하는 능력이 없으므로, 광학적 밀도 (optical density)는 독자 생존 가능한 세포수이다.

2.12. 신진대사량 평가(Evaluation of metabolic activity)

ECM 시료에 노출될 때 세포의 대사 활동을 추가로 결정하기 위해, 발표된 프로토콜에 기초하여WST 검사(EZ-CYTOX, Dogen, Korea)를 사용했다. 프로콜을 요약하면, 세포들(1X10⁴ cells/ml)은 FBS 또는 HS 및 1% PS로 보충된 적절한 배지에서 비교예, 실시예 1 및 2의 ECM 시료에 시딩되었고, 배양 접시를 대조군로 하여 1일 및 7일 동안 배양했다. 지정 시간 경과 후, ECM(n=3) 시료와 함께, 각 배양 접시에 100μl 의 WST 용액을 첨가했고 2시간 동안 배양했다. 배양 후, 용액을 96-웰 플레이트로 ?グ弱?, ELISA 판독기를 사용해, 기준 파장 620nm의 기준 파장으로 흡광도를 450nm로 측정했다.

그런 다음 시료는 지정된 시간이 지난 뒤 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정되고 10% Triton-X(Sigma Aldrich, USA)로 투과시키고, 인산염 완충 식염수(PBS; Sigma Aldrich, USA)로 세척하여 잔여 Triton-X를 제거되었으며 1% 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA; Siga Aldrich, USA)으로 차단되었다. 그리고 액틴 필라멘트을 시각화 하기 위해 플루오레세인이소티오시안산염이 활용된 팔로이딘(fluorescein isothiocyanate-conjugated Phalloidin (FITC, Sigma-Aldrich))으로 염색하였고, 핵을 핵을 Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich)로 대조 염색했습니다. 마이크로그래프는 Fluoview FV10i (Olympus, Japan)을 사용하여 촬영되었고 FV10i-ASW 3.0 뷰어 소프트웨어로 분석되어 세포 분포를 확인하는 데에 활용되었다

2.13. 피하 이식(Subcutaneous implantation)

총 16마리의 Sprague Dawley 실험 쥐가 실험에 사용되었고, 실험쥐는 두 그룹으로 나뉘었다.

그룹 1에는 실시예 1의 프로토콜 1 ECM이, 그룹 2에는 실시예 2의 프로토콜 2 ECM이 이식되었다.

각각의 탈세포화된 ECM 샘플을 각 실험쥐에 이식했다. Sprague Dawley 실험쥐는 온도 조절이 가능한 환경에 수용되었다. 음식과 물은 순천향대학교 동물보호센터의 지침에 따라 공급되었다.

ECM 샘플(100mg)은 UV 조사로 계량 및 멸균되었다. 실험 쥐는 이소플루란(Piramal, USA)을 사용하여 마취되었다. 건조된 탈세포화 ECM을 얻어 복부 피하에 이식했고, 진피에 봉합했다. 7일 및 21일 후, 쥐는 펜토바르비탈(pentaorbital) 남용으로 사망했고, 주변 조직과 함께 탈세포화된 ECM이 수거되었다. 수거된 탈세포화 ECM은 조직학적 및 면역조직화학 분석을 위해 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정되었다.

파라핀 포매(paraffin embedded) 시료는 헤마토실린과 에오신(H&E)으로 염색되었다. H&E 염색 조직의 마이크로그래프는 Olympus-BX53 현미경으로 촬영되었다. 염색된 H&E 조직 슬라이드는 혈관에 대해 형태학적으로 평가되었다. 단면 영상은 20배율일 때 15개의 필드로부터, 최종 배율 200배까지를 거쳐 얻어졌다. 그 후 Image J software를 사용해 혈관 수를 셌다.

피하 이식으로부터 7일 및 21 후 탈세포화된 시료의 염증 반응은, 공개된 프로토콜에 따라, 면역 형광 염색(immune-fluorescence staining)에 의해 결정되었다. 이식된 탈세포화 ECM 시료의 조직 섹션은 1차 항체로 염색되었다. 대식세포(CD68 an-macrophages), 토끼 단일 클론 항체(rabbit monoclonal), 염소 다클론 항체(goat polyclonal CD206)가 해당된다. 상응하는 2차 항체는 Alexa FluorV R donkey anti-mouse 350 (Invitrogen), Alexa FluorV R goat anti-rabbit 568 (Invitrogen), and Alexa FluorV R donkey anti-goat 488 (Invitrogen)이다. 염색된 슬라이드는 원초점 스캔 현미경으로 관찰되었다(CLSM, FV10i, Olympus, Japan).

2.14. 통계 분석(Statistical analysis)

모든 데이터는 평균±표준 편차로 표시되어 있다. 본페로니(Bonferroni)의 사후(post hoc)검사를 통한 일방향 분산 분석(ANOVA)는 DNA, 지질함량의 반정량화, 콜라겐, sGAG, 알파 엘라스틴, VEGF 및 BMP-2 정량에 사용되었다. 한편, 본페로니(Bonferroni)의 사후(post hoc)검사를 통한 양 방향 분산 분석은 Prism 5 (GraphPad Software Inc.)를 사용하여 세포독성 및 생체적합성 분석, 그리고 혈관 정량화에 사용되었다. 차이는 통계적으로 유의미한 것으로 나타났다(p<0.05).

3. 결과

3.1. 탈세포화 효율(Decellularization efficiency)

DNA 함량은 비교예를 대조군으로 사용하여 탈세포화 과정의 효율성을 결정하기위해 정량화되었다.

실험 결과, 프로토콜 1(0.12 ± 0.019 ng/mg sample)과 프로토콜 2(0.121 ± 0.17 ng/mg sample) 모두 네이티브 ECM(115.27 ± 0.75 ng/mg sample)과 비교했을 때 DNA 함량이 크게 감소했음을 나타내었다.

Oil Red O는 비교예를 대조군으로 하여 탈세포화된 ECM에서의 잔류 지질 함량을 반정량적(semi-quantitatively) 측정했다. Oil Red O는 트라이아실글리세롤(지질 방울)과 결합하여, 분광 광도계를 사용하여 정량화할 수 있는 호박(jacinth) 지질 방울을 방출시킬 수 있는 아조(azo) 염로이다.

프로토콜 1 및 프로토콜 2 ECM에 대한 Oil Red O 염료의 흡광도 값이 네이티브 ECM(2.32 ± 0.08 absorbance at 492 nm)에 비해 현저히 감소했다. 낮은 Oil Red O의 흡광도는, 프로토콜 1 ECM과 비교했을 때, 프로토콜 2 ECM에서 분명했다. 흡광도 값은 프로토콜 1에 비해 프로토콜 2에서 지질 제거가 더 효과적인 것을 시료의 지질 함량과 직접적으로 일치하였다(도 1A).

탈세포화는 프로토콜 1과 프로토콜 2의 H&E 염색 조직 부분에서 추가로 확인되었다. 네이티브 ECM과 비교했을 때, 프로토콜 1 및 프로토콜 2 ECM 모두에서 세포 구성 요소가 보이지 않았다. 세포 잔재는 프로토콜 2 ECM에는 없고, 네이티브 ECM의 Hoechst 33342 염색 현미경 사진에서는 뚜렷하게 나타난다. 결과에 따르면 프로토콜 2 ECM과 비교하여, 프로토콜 1 ECM에서 세포 구성 요소가 효과적으로 제거되지 않았다. ECM 샘플의 엘라스틴 함량에 대해 탈세포화가 미치는 영향을 결정짓기 위해, 탈세포화 전후에 엘라스틴 염색이 이루어졌다. 검정색으로 염색된 엘라스틴 섬유는 프로토콜 1과 비교했을 때, 프로토콜 2 ECM에서 더 나타났으며, 이는 더 높은 엘라스틴 섬유가 탈세포화 후 유지되었음을 알 수 있다(도 1B).

3.2. 세포간질 함유량 평가(Matrix content assessment)

콜라겐은 ECM에 물리적 및 기계적 특성을 제공하며, 세포부착을 위한 스캐폴드 단백질(scaffolding)을 제공하는 반면, 엘라스틴은 ECM의 기계적 특성에 기여한다. 도 2A를 참조하면, 네이티브 ECM(117.63 ± 8.13 μg/mg sample)과 달리, 프로토콜 1 및 2에서는 콜라겐 함량이 유의하게 제거되었다.

그러나, 프로토콜 1 ECM(56.31 ± 1.48 μg/mg sample)과 비교했을 때, 프로토콜 2 ECM(92.75 ± 10.97 μg/mg sample)에 더 많은 콜라겐 함량이 보존되었다. 콜라겐 함량은 프로토콜 1 및 2 ECM 전부 감소했다.

황화 글리코사미노글리칸(sGAG) 함량도 탈세포화 후 정량화되었다(도2B).

실험 결과는 프로토콜 1(3.89 ± 1.98 μg/ mg sample)에서 황화 글리코사미노글리칸(sGAG)의 함량이 감소되었고, 프로토콜 2(7.44 ± 1.30 μg/mg sample)에서는 유의한 감소가 나타나지 않았다. 프로토콜 2의 황화 글리코사미노글리칸(sGAG) 함량은 네이티브 ECM(7.99 ± 0.32 μg/mg)과 크게 다르지 않았다. 결과에 따르면 프로토콜 2 ECM에서 황화 글리코사미노글리칸(sGAG)의 함량이 잘 보존되어 있는 것으로 나타났다.

프로토콜 1 ECM(118.05 ± 8.07 μg/mg sample)의 알파 엘라스틴 함량은 탈세포화 후 프로토콜 2 ECM(142.32 ± 6.74 μg/mg sample)보다 크게 감소하였다. 프로토콜 2의 알파 엘라스틴 함량은 네이티브 ECM(148.32 ± 3.12 μg/mg sample; 도 2C)과 크게 다르지 않았다.

SDS-PAGE 분석은 탈세포화 전후에 ECM에 존재하는 단백질의 분자량을 결정하기 위해 수행되었다(도 2D). SDS-PAGE 분석 결과 프로토콜 1과 프로토콜 2 ECM 모두에 대하여, 70kDA, 60 kDA, 50 kDA, 48 kDA, 42 kDA, 25 kDA에서 단백질 밴드가 나타났으며, 이는 탈세포화 후 분자량이 낮은 단백질 성분이 보존된 것을 보여준다.

피부에는 조직공학 분야에 매우 바람직하고, 다양한 성장 요인이 포함되어 있다. 탈세포화 전후의 혈관 내피성장인자(VEGF)와 골형성 2(BMP-2)를 정량화했다.

혈관 내피성장인자는 혈관신생을 조절하며, 뼈 형성, 상처 치유 및 발달에 중요한 생리학적 기능을 가지고 있다. VEGF 함량은 프로토콜 1 ECM(0.20 ± 0.04 pg/mg sample)에서 크게 감소했지만 프로토콜 2 ECM(11.21 ± 0.24 pg/mg sample)에서는 크게 보존되었다. 대조적으로, 프로토콜 2 ECM의 VEGF 함량은 네이티브 ECM과 크게 다르지 않았다(11.26 ± 0.44 pg/mg sample; 도 2E).

반면, 골형성 단백질 2(BMP-2)는 다른 신체 조직의 세포 증식, 분화, 세포 분화를 조절하여 세포 분화를 조절하는 변형성장인자-베타(TGF-β) 상과(superfamily)에 속한다. BMP-2는 골형성을 유도하고 배양에서의 섬유아세포와 골세포의 자극을 촉진한다. BMP-2 함량은 두 프로토콜 모두 보존되었고, 프로토콜 2 ECM(0.84 ± 0.10 pg/mg sample)의 BMP-2 함량이 프로토콜 1 ECM(0.21 ± 0.03 pg/mg sample)보다 높았다. 네이티브 ECM(3.96 ± 0.76 pg/mg sample)과 비교했을 때 두 프로토콜 모두에서 BMP-2 함량은 크게 감소했다(도 2F).

3.3. ECM 특성화(ECM characterization)

주사전자현미경은 형태학적 구조의 변화를 관찰하기 위해 사용되었다. SEM 현미경 사진은 프로토콜 1 또는 프로토콜 2 ECM에 비해 네이티브 ECM이 가시공극률이 없고 더 빽빽한 미세 구조를 가지고 있다는 것을 보여 준다. 공극률 및 미세섬유는 프로토콜 1보다 프로토콜 2에 더 정의되어 있다(도 3A).

FTIR(Nicolleti S10-Smart ITR, Thermo Fisher Scientific, USA)는 네이티브 ECM을 대조군으로 삼아탈세포화 전후의 기능적 구성요소를 결정하기 위해 수행되었다(도 3B). 네이티브 ECM의 스펙트럼에 나타난 3293cm^-1과 2921cm^-1의 피크는 인지질, 당지질 및 지방산의 아미드 A 및 아미드 B N-H 스트레칭 때문에 드러나는 것이다. 1742 cm^-1 및 1742cm^-1의 피크는 단백질 및 펩타이드의 아미드 I과 아미드 II 때문이다. 1633cm^-1의 피크는 인산, 당지질, 지방산의 CH2 가위질 때문이다. 1389cm^-1과 1087cm^-1의 피크는 콜라겐의 아미드 III과 인산염 핵산, DNA 및 RNA의 대칭 P02 스트레치 때문이다. 프로토콜 1 ECM에서 3293cm^-1과 2921cm^-1의 피크는 펩타이드와 단백질의 아미드 A 및 아미드 B의 N-H 스트레칭 때문이다. 1742cm^-1과 1633cm^-1의 피크는 펩타이드와 단백질의 아미드 I과 아미드 II에서 기인한다. 1532cm^-1과 1237cm^-1의 피크는 인산, 당지질, 지방산의 CH2 가위질 및 콜라겐의 아미드 III 때문이다. 1083cm^-1의 피크는 인산염 핵산 DNA와 RNA의 대칭 PO2 스트레치에서 기인한다.

프로토콜 2 ECM에서, 3295cm^-1 및 2918cm^-1의 피크는 펩타이드의 아미드 A와 아미드 B의 N-H의 스트레칭으로 인해 발생했다. 1743cm^-1과 1640cm^-1의 피크는 펩타이드와 단백질의 아미드 I과 아미드 II 때문이다. 1546cm^-1와 1167cm^-1의 피크는 인지질, 당지질, 지방산의 CH2 가위질, 그리고 콜라겐의 아미드 III으로 인한 것이다. 997cm^-1의 피크는 인산염 핵산 DNA와 RNA의 대칭 PO2 스트레칭으로 인한 것이다. 인지질, 펩타이드, 단백질, 당지질, 지방산 및 DNA/RNA로 인한 피크는 모든 ECM 샘플에서 뚜렷하게 확인되었다.

3.4. 체외 연구(In vitro studies)

네이티브 ECM을 대조군으로 하는 프로토콜 1 ECM 및 프로토콜 2 ECM의 세포 호환성은 MTT 분석(도 4A)에 의해 결정되었다. 다양한 조직공학 분야에서의 응용을 위해, 골수 중산엽 줄기세포(rBMSC), MC3T3-E1 전조골세포 및 L929 세포가 탈세포화된 돼지 피부에 미치는 영향을 확인하였다. 처리되지 않은 부착 rBMSC 세포의 생존률은 100%였다. 네이티브 및 프로토콜 1 ECM을 1일 배양 및 7일 배양 추출물에 24시간 노출시킨 결과, 3개의 세포주의 생존율이 크게 저하되었다. 그러나 프로토콜 2 ECM 추출물에 24시간 노출시킨 후, L929 세포와 MC3T3-E1 세포의 생율이 크게 증가했다. 위의 결과는, 네이티브 ECM 및 프로토콜 1 ECM 추출물이 이러한 세포들에 대해 세포독성이 있으며, 분해 시 독성이 있는 부산물을 포함할 수 있음을 나타낸다. 프로토콜 2와 달리, 추출물은 독성이 없었고 세포의 생존능력에 영향을 미치지 않았다.

WST 분석 결과, 네이티브 ECM 및 프로토콜 1 ECM과 대조했을 때, 프로토콜 2 ECM에서 배양된 3개의 세포주 모두 세포 증식이 증가한 것으로 나타났다. 위의 결과는 프로토콜 2 ECM이 네이티브 ECM 및 프로토콜 1 ECM과 비교하여 세포독성이 없음을 나타낸다(도 4B). 배양 1일 및 7일 후의 세포 증식을 확인하기 위해, 형광 염색 검체를 공초점형 현미경으로 관찰했다(도 4C). 프로토콜 1 ECM 및 네이티브 ECM에서 배양된 3가지 세포주 모두, 7일간의 배양 후 증식에 실패했다. 이와 달리, 프로토콜 2 ECM 시료에서 7일간 배양한 경우, 세가지 세포주 모두 세포 증식을 보였다.

3.5. 숙주 반응(Determination of host's response)

실험용 쥐 피하 주머니에 이식된, 탈세포화 ECM 샘플은 이식 후 7일 및 21일 이후에 추출되었으며, 프로토콜 1 ECM과 프로토콜 2 ECM 모두 심각한 면역 반응과 세포 침투가 나타나지 않았다는 것을 H&E 염색으로 알 수 있다(도 5).

이식 후 7일 및 21일 후에 추출한 탈세포화 조직은 조직 발달 및 대식 세포 반응 관찰을 위해 사용되었다. 7일 동안의 초기 관찰은, 이식된 샘플에서의 다양한 조직 반응을 잘 나타났다.

프로토콜 1 ECM(그림 6A)의 염색된 조직 섹션은 임플란트 인터페이스를 따라, 대식세포 골재(거대세포)가 형성되고(도 6A1), 이식 물질 내의 세포 침투가 감소했음을 보여주었다.

프로토콜 2 ECM(도 6B)으로 처리된 시료는 임플란트 인터페이스를 따라, 더 높은 세포 침투율과 적은 양의 거대 세포를 보여주었다(도 6B1). 21일 경과된 임플란트의 현미경 사진은, 프로토콜 1(도 6C)로 처리된 샘플이 중첩 조직(overlaying tissue)을 분리하는 조밀한 섬유층 형성 및 이물질 반응을 나타내는 대식세포 집합체의 지속성(도 6C1)을 나타내는, 임플란트 인터페이스를 보여주었다. 프로토콜 2로 처리된 시료는 21일 후 세포 침투가 크게 증가하지 않았다. 프로토콜 2의 부분들(도 6D)은 임플란트 인터페이스를 따라 연조직이 더 잘 이루어졌음을 보여주었다. 섬유 조직은 매끄러운 임플란트 인터페이스를 보여주었다. 그리고 이 연조직 이식 및 통합이 향상되었음을 나타낸다. 대식세포가 임플란트 인터페이스를 따라 보이기는 했지만, 일반적인 이물질 반응에서 나타나는, 통합적 행동을 보여주지는 않았다(도 6D1).

혈관신생 또는 혈관 형성은 상처 치유와 이식된 의료기기 또는 생체물질의 최종 기능결정에 중 요한 역할을 한다. 이식 7일 후, 프로토콜 1(9.65 ± 0.54 blood vessels/field)과 비교했을 때 프로토콜 2(13.73 ± 4.26 blood vessels/field)에서 혈관이 증가했다. 21일 후, 프로토콜 1 ECM(7.83 ± 04.85 blood vessels/field; 도 7)과 프로토콜 2 ECM(9.60 ± 1.81 blood vessels/field)에서는 혈관이 더 높았지만, 크게 다르지는 않았다.

면역 형광 염색 결과는, 이식된 탈세포화 시료에 침투한, 다양한 유형의 대식세포를 보여주었다. 각 시점의 이식된 모든 ECM 시료에서, 판-대식세포를 나타내는 CD68 발현의 세포 침투는, 현미경 사진으로 나타나 있다. 프로토콜 1 그룹은 7일 및 21일 후 이식 부위에서 CD 68, CCR7(M1) 및 CD206(M2) 대식세포 표현형이 혼합되어 있음을 보여주었다. 반면, 프로토콜 2 그룹에 침투한 세포는 7일 및 21일 후, M1과 M2 공동표현으로 CD68 표시로 염색되어 있었다(그림8).

이와 같이, 탈세포화된 ECM으로 만들어진 스캐폴드 단백질은, 조직공학에서 본질적인 특성과 복잡한 단백질 구성으로 인해, 미래에 유망한 물질이다. 스캐폴드 단백질은 세포 신호, 세포 부착, 세포 이동 및 증식에 필수적인 기능적 특성과 구조적 특성을 모두 가진 단백질로 구성되어 있다. ECM의 세포 및 세포핵 성분을 최적화는 동시에, 많은 양의 ECM 기능단백질을 보존하기 위해, 다양한 탈세포화 절차가 고안되었고 개발되었다.

본 발명은, 돼지 피부 탈세포화를 위한 이소프로판올-계면활성제 탈세포화 과정을 이용하여, 저렴하고 효과적인 탈세포화 프로토콜을 고안했다. 돼지 피부는 밀도가 높고 컴팩트한 구조를 가지고 있으며, 다량의 지질 성분로 인해 탈세포화된 ECM을 생성하는 것이 어렵다. 프로토콜 1의 물 계면활성제는 탈세포화(37℃)에서 사용되는 높은 온도 및 지속적인 기계적교반(stirring, 흔듦)에도 불구하고 지질 성분을 완전히 제거하지 못했다. ECM 내의 지질은, Hoechst 33342 염색(도 1C)에 나타났듯이, 탈세포화 작용제가 ECM에 효율적으로 침투해 세포 구성 요소를 효과적으로 제거할 수 없도록 하는 장벽 역할을 했다. 반면, 프로토콜 2에서 이소프로판올/계면활성제를 사용한 탈세포화 과정은 탈세포화 후의 ECM 세포 성분뿐만 아니라 지질 성분도 효과적으로 제거했다. 탈세포화 중 ECM이 이소프로판올에 더 오래 노출되면, 세포 용해가 빨라지고, 탈세포화 과정에서 어려운 점성 및 소수성을 띄는 지질 성분 제거가 효과적으로 이루어지며, 계면활성제의 조직 침투가 향상되고, 연속 세척을 통해 더욱 제거될 수 있습니다. 알코올, 특히 이소프로판올은 리파아제보다 효과적으로 지질 성분을 제거할 수 있다. 그러나, 알코올은 일반적으로 세포 조직 망 장기의 고정제로 작용하기 때문에, 이소프로판올 농도가 70%를 넘으면 알코올이 세포 조직과 장기의 고정 및 탈수를 일으킬 수 있다.

ECM 단백질과 성장 인자를 유지하는 것은 탈세포화의 주요 관심사이다. 세포외기질에는 콜라겐, 알파 엘라스틴, 황산화 글리코사미노글리칸, 그리고 VEGF 및 BMP-2와 같은 성장인자와 같은 조직공학 응용에 필요한 단백질을 포함하고 있다. sGAG, 엘라스틴, VEGF와 같이, 두 프로토콜에 사용된 처리 시간, 시약 농도 및 노출 시간이 동일함에도 불구하고, 프로토콜 2는 프로토콜 1에 비해 목표 ECM 단백질을 효과적으로 보존했다.

프로토콜 2에서 ECM 단백질의 높은 보존율은 이소프로판올의 고정하려는 성질 때문일 수 있다. 이소프로판올에 노출될 경우, 주요 단백질 구성 요소를 ECM에 고정하여 탈세포화 시 계면활성제의 영향을 줄일 수 있다.

프로토콜 1에 사용되는 물 계면활성제는 ECM 내의 초미세구조 붕괴, 교란 및 분리, 성장 인자 제거와 같은 단점이 있다. 탈세포화 과정에서, 대부분의 엘라스틴 함량이 저하된 수성 계면활제 프로토콜과 비교했을 때, 이소프로판올 계면 활성제 프로토콜에서 탄력소 함량이 더 보존되는 것을 확인했다. 물 계면활성제 프로토콜을 사용한 ECM의 탈세포화는, 네이티브 세포 조직에 비해 탄력소 함량을 크게 감소시키고 있다. 프로토콜 2에서 엘라스틴 함량의 높은 보존율 또한 수용액에서의 낮은 용해도에서 기인할 수 있다. 엘라스틴 네트워크 내의 소수성 영역은, 탄성 특성에 영향을 미치며, 수용액에서 효소 분해 및 용해도에 대해 내성을 높인다. 그러나, 콜라겐 함량은 두 프로토콜 모두 크게 줄어들었다. 이는 탈세포화 이전의 균질화 때문일 수도 있다. 잇따른 헹굼(rinsing) 중에 탄력이 적은 콜라겐이 씻겨나갔을 수도 있다. 또한, 두 프로토콜 모두 BMP-2 함량이 크게 제거되었으며, 이는 BMP-2가 표피와 피부 모낭에 위치해 있기 때문일 수도 있다. 표피와 모낭은, 많은 양의 지질과 면역 반응에 중요한 역할을 갖는 각질세포를 포함했기 때문에, 탈세포화 전에 제거되어야 한다. 적은 양으로라도 보존된 ECM 단백질 성분과 성장 인자가 존재한다는 것은, 세포이동, 부착 및 증식에 필요한 단서를 제공한다. 또한 합성 물질과 비교했을 때, 함성 물질과 달리 특수한 생체재료를 제조할 수 있게끔 하는 변조기(modulator)가 될 수 있다. 보존된 단백질 성분은, 추출된 ECM 단백질을 위한 SDS-PAGE에 의해 확인되었다. 또한 이 단백질 성분은 프로콜 2에서 더 많은 양의 단백질과 성장 인자를 산출했지만, 지질 성분의 양은 더 낮았다.

실험예에서 알 수 있듯이, 프로토콜 2 ECM의 생체 적합성과 분해 시 세포 및 지질 구성 요소를 제거시킬 때 나오는 유독성 부산물을 포함하지 않는다는 것이다. 그러나, 프로토콜 1 ECM은 잔류항원성을 포함한다. 돼지 ECM에서 나온 세포 파편(cellular debris)과 지질 잔여물을 완전히 제거하지 못하기 때문이다. ECM의 세포 구성 요소에는, 면역 매개성 임플란트 거부반응 및 완전히 제거되지 않았을 때 염증 반응을 일으키는 항원 물질이 포함되어 있다. 지질 성분은 돼지 피부에 풍부하다. 그리고 이 지질 성분은 돼지 피부의 컴팩트한 구조 때문에 제거하기 어렵다. 탈세포화된 ECM의 지질 잔해물이 신체에 이식되거나 생체재료로 사용될 경우 면역 반을을 일으킬 수 있기 때문에, 지질 제거는 필수이다. ECM에 세제 또는 알코올 흔적이 남지 않도록 ECM 시료를 광범위하게 세척했다. 증류수로 추가 세척을 하는 것도, 물질들의 생체적합성에 영향을 미칠 수 있는 세제 및 알코올 흔적을 제거하는 데 중요하다.

체내 피하 삽입 후, 두 ECM 프로토콜은 탈세포화 후의 DNA 함량이 제거되었기 때문에, 심각한면역 반응을 일으키지 않았다. 그러나, 고배율 현미경 사진은, 프로토콜 1은 세포 침투가 감소했고, 대식세포 집적에 따른 이물 반응 및 빽빽한 섬유층의 형성을 보였다. 프로토콜 2 ECM에서는 이물 반응이 없는 것이 세포 침투의 증가로 관찰되었지만, 고배율 현미경 사진에서는 대식세포 수 감소 및 원활한 주입 집적화(implant integration)가 관찰되었다.

대식세포는 M2로부터의 신진대사 기능을 변경시키고, 살해/억제를 수용하는 M1의 치유/성장 촉진이 가능한 인조 세포군이다. M1 및 M2 대식세포 모두 7일과 21일 후 프로토콜 1 ECM 세포기질에 존재하고 있었으며, 이는 염증 반응을 의미한다. 7일 및 21일이 경과된 M1 및 M2 대식세포의 공동표현과 함께, 프로토콜 2 ECM 세포기질에 침투한 세포들은 해소기 대식세포일 수 있다. 해소기 대식세포는 독특한 표현형이다. 이 대식세포는 염증전(pro-inflammatory)의 M1 세포 및 M2 표식을 나타낸다. Italiani 및 기타 인물들의 연구에 따르면, 해소기 대식세포는 염증 자극에는 반응하지 않지만, 손상된 세포 및 세포 조직의 구성요소를 적적으로 제거하며, 조직 개조(tissue remodeling), 혈관신생, 세포증식, 그리고 세포기질 퇴적(matrix deposition)을 촉진시킨다.

본 발명은 서로 다른 세포 조직과 장기의 처리를 위한 기본 원칙들을 제공할 수 있다. 또한, 알코올 이탈세포화 효율과 ECM의 단백질 성분 유지에 미치는 영향에 대한 개요를 제공한다. 향후 연구에는, 미리 형성된 하이드로겔, 주입식 하이드렉, 뼈 및 피부 조직 재생을 위한 일렉트로스펀 메트(electrospun mats) 등 다양한 형태로 탈세포화된 돼지 피부를 처리하는 과정을 포함한다.

결과적으로, 이소프로판올 내의 Triton-X와 SDS로 고안한 프로토콜 2는, 돼지 피부 탈세포화에 저렴하고 효과적인 방법을 제공했다. 프로토콜 2는 물/계면활셍제를 활용한 프로토콜 1에 비해서, 많은 양의 ECM 단백질을 유지하는 동시에 빽빽한 돼지 피부의 탈세포화에 효과적이라는 것이 입증되었다. 생체 내의 연구에서, 세포독성 부산물 없이 생체적합성이 증가했다는 것이 밝혀졌으며, 체내 연구에서 실험용 쥐의 피하주머니에 이식했을 때 면역 반응을 일으키지 않았다. 프로토콜 2를 통해 탈세포화된 ECMS은, 세포독성 없이 다른 형태로 처리될 수 있으며, 이식용 생체재료로 사용될 때 면역 반응을 일으키지 않는다.

이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

(a) 돼지 피부 조직을 준비하는 단계;
(b) 상기 돼지 피부 조직을 세척하고, 트립신 및 EDTA를 함유하는 수용액에서 처리하는 단계;
(c) 수용액에서 처리된 돼지 피부 조직을 세척하고, SDS를 포함하는 이소프로판올 용액, 또는 SDS를 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에서 1차 탈세포화하는 단계;
(d) 1차 탈세포화된 돼지 피부 조직을 세척하고, 트리톤을 포함하는 이소프로판올 용액, 또는 트리톤을 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에서 2차 탈세포화하는 단계;
(e) 2차 탈세포화된 돼지 피부 조직을 세척하고, 이소프로판올 용액으로 3차 탈세포화하는 단계; 및
(f) 3차 탈세포화된 상기 돼지 피부 조직을 세척하고, 동결 건조하는 단계;
를 포함하는 돼지 피부 조직 탈세포화 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 트립신의 농도는 0.1~0.5%(w/v)인 것을 특징으로 하는 돼지 피부 조직 탈세포화 방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서,
상기 이소프로판올 용액에 포함된 SDS의 농도는 0.01~0.3%(w/v)이고, 이소프로판올의 농도는 50~80%(w/v)이고,
상기 SDS를 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에 포함된 SDS의 농도는 0.01~0.3%(w/v)이고, EDTA의 농도는 0.01~0.5%(w/v)이고, 트리스의 농도는 0.1~1%(w/v)인 것을 특징으로 하는 돼지 피부 조직 탈세포화 방법.
제1항에 있어서,
상기 (d) 단계에서,
상기 이소프로판올 용액에 포함된 트리톤의 농도는 0.5~3%(w/v)이고, 이소프로판올의 농도는 50~80%(w/v)이고,
상기 트리톤을 포함하는 EDTA 및 트리스(Tris)를 포함하는 용액에서, 트리톤의 농도는 0.5~3%(w/v)이고, EDTA의 농도는 0.01~0.5%(w/v)이고, 트리스의 농도는 0.1~1%(w/v)인 것을 특징으로 하는 돼지 피부 조직 탈세포화 방법.
제1항에 있어서,
상기 (e) 단계에서, 이소프로판올의 농도는 90~100%(w/v)인 것을 특징으로 하는 돼지 피부 조직 탈세포화 방법.
제1항에 있어서,
상기 (f) 단계에서 상기 동결건조는 -30~-10℃ 온도에서 1~5일 동안 진행되는 것을특징으로 하는 돼지 피부 조직 탈세포화 방법.