CN115607733A - 一种矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于骨组织工程技术领域，具体涉及一种矿化胶原蛋白‑多糖骨修复支架材料、制备方法和应用，所述骨修复支架材料由矿化胶原蛋白、多糖均匀混合后，由交联剂交联得到；所述矿化胶原蛋白和多糖的浓度比为10‑80wt％：1‑20wt％，余量为水；所述矿化胶原蛋白由0.1‑10wt％胶原蛋白、0.0334‑3.34mol/L钙盐和0.02‑2mol/L磷酸盐反应获得；本发明所述的骨修复支架材料可以很好的仿生天然骨骼的组成和结构，并显著促进BMSCs细胞的增殖、粘附和分化，具有良好的骨诱导作用；本发明提供的矿化胶原蛋白‑多糖骨修复支架材料，具有高生物活性和骨诱导性，在骨组织工程领域有巨大的应用潜力。

Description

一种矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料、制备方法和应用
技术领域
本发明属于骨组织工程技术领域，具体涉及一种矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料、制 备方法和应用。
背景技术
骨骼是人体的框架结构，它具有一种持续的适应性，可以修复小范围内的骨缺损，但超 过临界尺寸阈值(通常>2cm)的骨缺损很难自我修复。由于交通事故、机体老化、肿瘤切 除或者先天性因素造成的严重骨缺损疾病，需要通过临床治疗。生物支架材料因其良好的生 物相容性和生物活性，被广泛用来治疗骨缺损，临床上称为颅骨成形术。
目前已开发生物陶瓷、金属合金、高分子聚合物、水凝胶等不同类型的生物支架材料， 但如何仿生天然骨骼的组成、结构和功能，依然是巨大挑战。矿化胶原蛋白(MC)是胶原蛋 白与纳米羟基磷灰石的复合物，它是天然骨骼的主要结构单元。因此，利用具有良好微观形 貌和生物活性的MC，来制备骨修复支架材料，一直备受关注。中国专利CN104096268A公 开了一种MC-聚乳酸的骨修复支架，但是该支架材料缺乏连通的网孔结构，可能为细胞生长 提供欠佳的生长环境；发明专利CN106421927A公开了一种MC-聚乳酸/聚己内酯骨修复支架 及其制备方法，但是该支架材料降解周期过长，并且存在有机溶剂残留导致的细胞毒性风险。
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料、制 备方法和应用；所述骨修复支架材料由矿化胶原蛋白、多糖均匀混合后，由交联剂交联得到； 所述矿化胶原蛋白-海藻酸钠骨修复支架材料，形成相互连通的网孔结构，孔径约135μm，孔 隙率约82％；所述骨修复支架材料具有良好的生物相容性和生物活性，能显著促进BMSCs 细胞的增殖、粘附和分化；所述骨修复支架材料在治疗临界尺寸颅骨缺损的动物实验中，MRI 和Micro-CT结果表明，MRCHA支架材料具有良好的成骨诱导作用，并具有骨传导性；H& E和Masson染色结果表明，MRCHA支架材料在术后12周完全降解，并可以显著促进骨组 织再生；本发明提供的矿化胶原蛋白-海藻酸钠骨修复支架材料，具有优异的骨缺损治疗效果， 在骨组织工程领域有巨大的应用潜力。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料，所述的骨修复支架材 料由矿化胶原蛋白、多糖均匀混合后交联得到，所述的矿化胶原蛋白和多糖的浓度比为10-80 wt％：1-20wt％，余量为水。
优选的，所述多糖为海藻酸钠、硫酸软骨素、透明质酸中的一种或几种。
优选的，所述多糖为海藻酸钠。
优选的，所述矿化胶原蛋白材料由0.1-10wt％胶原蛋白、0.0334-3.34mol/L钙盐和0.02-2 mol/L磷酸盐反应获得。
优选的，所述的矿化胶原蛋白材料由1wt％胶原蛋白、0.1336mol/L钙盐和0.08mol/L 磷酸盐反应获得。
优选的，所述的胶原蛋白为重组胶原蛋白和/或动物胶原蛋白，所述的动物胶原蛋白包括 Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型中的一种或几种。
优选的，所述的胶原蛋白为重组胶原蛋白。
优选的，所述钙盐为无水氯化钙溶液、葡萄糖酸钙溶液、磷酸二氢钙溶液、硝酸钙溶液 或碳酸氢钙溶液；所述磷酸盐为磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钾溶液、磷酸 二氢铵溶液或磷酸溶液。
优选的，所述的矿化胶原蛋白的制备方法如下：
(1)按比例配置钙盐溶液和胶原蛋白溶液的水溶液，混合反应10-120min后，按比例滴 加磷酸盐溶液，得混合溶液；
(2)将步骤(1)所述混合溶液调节pH，搅拌反应，水浴静置，离心，洗涤，获得白色胶状物的矿化胶原蛋白。
优选地，步骤(1)中混合反应的时间为30-120min。
优选的，步骤(2)所述pH为7.4，搅拌反应12-36hrs，37℃恒温静置12-96hrs。
优选的，步骤(2)所述的搅拌反应24hrs，静置72hrs；
本发明的第二目的是提供所述骨修复支架材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)按比例将矿化胶原蛋白与多糖溶液混合，均质，注模，真空脱气，冷冻干燥；
(2)将步骤(1)制备得到的材料浸泡在含有交联剂的乙醇溶液中交联，洗涤，冷冻干 燥，得到骨修复支架材料。
优选的，步骤(2)所述的洗涤用去离子水，所述的交联剂为EDC-NHS。
1.本发明的第三目的是提供所述的骨修复支架材料用于制备人工骨修复、生物材料、医 疗器械中的应用。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料，很好的仿生天然骨骼的组成、结 构和功能，并形成相互连通的网孔结构，孔径约135μm，孔隙率约82％；
(2)本发明所述矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料具有良好的生物相容性和生物活性，能显 著促进BMSCs细胞增殖和粘附；所述骨修复支架材料中成骨分化标记基因的表达量显著 增加，表明骨修复支架材料在体外具有良好的骨诱导性；
(3)将本发明所述矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料，移植到SD大鼠颅骨缺损模型中，MRI 和Micro-CT结果表明骨修复支架材料具有良好的成骨诱导作用，并具有骨传导性；H& E和Masson染色结果表明，骨修复支架材料在术后12周完全降解，并可以显著促进骨组织再生；
(4)本发明提供的矿化胶原蛋白-海藻酸钠骨修复支架材料，具有优异的骨缺损治疗效果，在 骨组织工程领域有巨大的应用潜力。
附图说明
图1矿化重组胶原蛋白的表征
(a)矿化重组胶原蛋白的XRD图；(b)矿化重组胶原蛋白的TEM图(插图：选择性区域电 子衍射图(SAED))；(c)EDX光谱；(d)HAADF-STEM图；(e)矿化重组胶原蛋白C、O、P 和Ca的EDS映射图。
图2矿化重组胶原蛋白-海藻酸钠骨修复支架材料的表征
(a-d)重组胶原蛋白-海藻酸钠骨修复支架材料的SEM图和元素分布图；(e)重组胶原蛋白 -海藻酸钠骨修复支架材料的TGA图；(f)重组胶原蛋白-海藻酸钠骨修复支架材料的DTA图。
图3支架材料的微观形貌和体外降解性能
(a1-a2)RCHA；(b1-b2)MRCHPCL；(c1-c2)MCHA；(d1-d2)MRCHA。(a1-c1)支架 材料的实物照片图；(a2-c2)支架材料的FESEM图(插图：支架材料的孔径分布图)；(e) 支架材料在PBS溶液中体外降解不同时间后支架材料的质量；(f)支架材料在PBS溶液中体 外降解不同时间后降解介质的pH。
图4支架材料的细胞活性
(a)支架材料浸提液的细胞毒性；(b)CCK-8法检测BMSC细胞增殖；(c)BMSC细胞在支架材料上培养1和4天后的活细胞和死细胞染色；(d)BMSC细胞在支架材料上培养4天 时的CLSM图。(☆表示差异显著，p<0.05)。
图5支架材料的体外成骨性能
(a)BMSC细胞在支架材料上培养1、4、7和11天时，使用pNPP测定法检测ALP活 性；(b-e)RT-qPCR检测BMSC细胞在支架材料上培养7和14天后表达的成骨标志物；(f) ARS定量；(g)ARS法评估BSC细胞的成骨能力；(☆表示差异显著，p<0.05)。
图6支架材料修复SD大鼠临界尺寸颅骨缺损的MRI检测
图7支架材料修复SD大鼠临界尺寸颅骨缺损的Micro-CT检测
(a)冠状面和矢状面扫描图像；(b)骨矿物质密度(BMD)；(c)骨体积分数；(d)骨小梁数 量(☆表示显着差异，p<0.05)。
图8支架材料修复SD大鼠临界尺寸颅骨缺损的组织染色
(a)H&E染色；(b)Masson染色。
具体实施方案
下面将结合说明书附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅是本发明的一部分，而不是发明的全部。基于本发明中的实施例，本领域普 通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
以下实施中所述的重组胶原蛋白是利用转基因技术和基因重组技术在动物、植物或者微 生物表达体系中获得的胶原蛋白。
以下实施例中所述的重组胶原蛋白为大肠杆菌发酵获得的重组胶原蛋白，但不局限于上 述方法，也可以为其他方法制备的重组胶原蛋白，包括毕赤酵母发酵的重组胶原蛋白、重组 源胶原蛋白等。
以下实施例中，化学交联指在光、热、高能辐射、机械力、超声波和交联剂等作用下， 大分子链间通过化学键联结起来，形成网状或体形结构高分子的过程。
实施例一、矿化重组胶原蛋白的制备和表征
1.矿化重组胶原蛋白的制备
配制1wt％重组胶原蛋白、0.1336mol/L Ca2+和0.08mol/LPO4 3-的混合溶液，用氢氧化钠 调节反应体系的pH为7.4，搅拌反应24hrs，37℃水浴中静置72hrs，离心收集白色胶状物， 用超纯水洗涤沉淀三次，除去可溶性盐，得到矿化重组胶原蛋白(MRC)。
2.矿化动物胶原蛋白的制备
配制1wt％牦牛胶原蛋白、0.1336mol/L Ca2+和0.08mol/LPO4 3-的混合溶液，用氢氧化钠 调节反应体系的pH为7.4，搅拌反应24hrs，37℃水浴中静置72hrs，离心收集白色胶状物， 用超纯水洗涤沉淀三次，除去可溶性盐，得到矿化牦牛胶原蛋白(MC)。
3.表征
对所述矿化重组胶原蛋白，进行粉末X射线多晶衍射(XRD)、透射电镜(TEM)、电子衍 射以及能量散射X射线表征。
结果如图1所示，其中a为矿化重组胶原蛋白的XRD谱图，2θ＝25.52°和31.95°的衍射 峰对应羟基磷灰石(HA)的(002)和(211)结晶面，表明以重组胶原蛋白为生物模板，成功制备纳米羟基磷灰石；b为TEM图，矿化胶原蛋白呈现良好的纳米纤维结构；相关的选择性区域电子衍射(SAED)图显示羟基磷灰石晶体(211)，(112)和(310)的晶面，表明纳 米羟基磷灰石的排列是非常有序的；c为能量色散X射线能谱(EDS)的元素映射结果，表 明C、O、P和Ca元素的存在，其中C元素来自重组胶原蛋白，O、P和Ca元素来自羟基磷 灰石；d为高角环形暗场扫描TEM(HAADF-STEM)图，表明合成的矿化胶原蛋白具有良好的 纤维结构；e为电子衍射(EDX)图，进一步表明C、O、P和Ca元素均匀分布在矿化胶原 蛋白中。这些结果表明，成功制备具有良好纤维形貌的重组胶原蛋白-纳米羟基磷灰石复合物， 即矿化胶原蛋白。
实施例二、骨修复支架材料MRCHA的表征
1.骨修复支架材料MRCHA的制备
MRCHA：将2％的海藻酸钠溶液与40％的矿化重组胶原蛋白混合，用实验室高剪切均 质乳化机将混合熔浆均质，使其形成均一、粘稠的浆液，将浆液注入聚四氟乙烯的模具中， 真空脱气，-20℃过夜预冷，冷冻干燥。将冻干的样品浸泡在含有EDC-NHS的95％的乙醇溶液中交联，用去离子水洗涤支架材料，去除多余的交联剂和交联产生的副产物，冷冻干燥。
2.骨修复支架材料MRCHA的内部结构
对骨修复支架材料MRCHA，进行带能量色散谱分析的扫描电子显微镜(SEM-EDS)检测表征。
结果如图2a-d所示，其中a为骨修复支架材料截面的空间结构的FESEM图，表明骨修 复支架材料内部为相互连通的孔状结构；c，d为骨修复支架材料的EDS图，表明骨修复支架材料中Ca/P比为1.67，与骨骼中羟基磷灰石中的Ca/P相同。
3.骨修复支架材料MRCHA的热重分析
对所述骨修复支架材料MRCHA，进行热重分析表征。
结果如图2e-f所示，图2e为骨修复支架材料MRCHA的TGA图，图2f为支架材料的DTA图。从DTA图中观察到三个温度转变阶段，第一阶段是温度低于100℃时，主要是由 于H2O的蒸发引起的失重，图2f中表明此阶段中骨修复支架材料的重量损失为2-4％；在 250-300℃出现第二个重量损失阶段，此阶段重量的损失主要是由于骨修复支架材料中有机 成分(胶原蛋白和海藻酸钠)的热分解造成的，图2f中表明其重量损失为15-20％；第三个 温度转变阶段是530℃，这个阶段主要是羟基磷灰石中结合水的损失引起的质量降低，图2f中表明羟基磷灰石的含量大约为60-70％。以上结果表明制备的骨修复支架材料MRCHA中有机组分和无机组分的含量约为15-20％和60-70％，很好的仿生了天然骨骼的组成。
实施例三、支架材料的合成和微观形貌的表征
1.支架材料的制备
RCHA：将2％的海藻酸钠溶液与40％的医用羟基磷灰石-重组胶原蛋白的混合物混合， 用实验室高剪切均质乳化机将混合熔浆均质，使其形成均一、粘稠的浆液，将浆液注入聚四 氟乙烯的模具中，真空脱气，-20℃过夜预冷，冷冻干燥。将冻干的样品浸泡在含有EDC-NHS 的95％的乙醇溶液中交联，用去离子水洗涤支架材料，去除多余的交联剂和交联产生的副产 物，冷冻干燥。
MRCHPCL：将2％的聚己内酯(PCL)溶液与40％的矿化重组胶原蛋白混合，用实验室高剪切均质乳化机将混合熔浆均质，使其形成均一、粘稠的浆液，将浆液注入聚四氟乙烯的模具中，真空脱气，-20℃过夜预冷，冷冻干燥。将冻干的样品浸泡在含有EDC-NHS的 95％的乙醇溶液中交联，用去离子水洗涤支架材料，去除多余的交联剂和交联产生的副产物，冷冻干燥。
MCHA：将2％的海藻酸钠溶液与40％的矿化牦牛胶原蛋白混合，用实验室高剪切均质 乳化机将混合熔浆均质，使其形成均一、粘稠的浆液，将浆液注入聚四氟乙烯的模具中，真 空脱气，-20℃过夜预冷，冷冻干燥。将冻干的样品浸泡在含有EDC-NHS的95％的乙醇溶液中交联，用去离子水洗涤支架材料，去除多余的交联剂和交联产生的副产物，冷冻干燥。
MRCHA：将2％的海藻酸钠溶液与40％的矿化重组胶原蛋白混合，用实验室高剪切均 质乳化机将混合熔浆均质，使其形成均一、粘稠的浆液，将浆液注入聚四氟乙烯的模具中， 真空脱气，-20℃过夜预冷，冷冻干燥。将冻干的样品浸泡在含有EDC-NHS的95％的乙醇溶液中交联，用去离子水洗涤支架材料，去除多余的交联剂和交联产生的副产物，冷冻干燥。
2.支架材料的微观形貌
将混合均匀的浆液注入聚四氟乙烯的圆形模具中，冷冻干燥制成直径为1.5cm，厚度为 1.2cm的圆柱体。
图3a1-d1是RCHA、MRCHPCL、MCHA和MRCHA四种支架材料的实物照片。RCHA 支架材料表面可以看到明显的羟基磷灰石的颗粒，且容易脱落，圆柱体有一些形变。 MRCHPCL、MCHA和MRCHA支架材料表面光滑，圆柱体结构保持良好。
3.支架材料的微观形貌和孔径分布
使用Hitachi S-4800场发射扫描电子显微镜对上述制备得到的支架材料的微观形貌进行 表征。通过像素测量软件(E-ruler)从多个FESEM图像中计算出每组的孔径，并随机选取每 组50个数据点来描述孔径的范围和分布。采用液体置换法来定量测量不同支架材料的孔隙 率。冻干状态的支架材料的质量和体积分别标记为m1和V1。在真空下用超纯水浸润支架材 料，获得材料湿重标记为m2，通过计算得到材料中水的重量标记为m3(m3＝m2-m1)， 支架的孔体积
Figure BDA0003763552420000071
则支架的孔隙率为
Figure BDA0003763552420000072
每个样品平行测定三次，并且 数据表示为平均值±标准差(SD)。
图3a2-d2是RCHA、MRCHPCL、MCHA和MRCHA支架材料的微观形貌的FESEM图。
其中图3a2是支架材料RCHA的FESEM图，表明支架材料没有形成孔状结构，RCH颗粒在海藻酸钠中分散不均匀，存在明显的RCH颗粒的团聚；RCHA支架材料比较松散，在切割 时容易坍塌；RMCHPCL支架材料的FESEM形貌如图3b2所示，呈相互连通的孔状结构， 孔径分布在16-50μm之间，孔隙率约为29.2±3.3％；图3c2-d2是MCHA和MRCHA支架 材料的FESEM图，呈相互连通的孔状结构，孔径分别分布在50-165μm和50-160μm之间(见 插图)，孔隙率分别82.3±3.4％和82.6±2.2％；同时，MCH和MRCH纳米颗粒均匀地分散 在海藻酸钠中。
4.支架材料的体外降解
将支架材料切割成直径为12mm，高度为10mm的圆柱。称重(W0)后浸泡在20mL0.01M pH＝7.4的PBS缓冲溶液中,放入37℃摇床中，转速为60r/min。在整个12W的体外降解实 验中，每周更换PBS缓冲溶液，每2W为一个降解期。在每一个降解期结束，取出三个样品，用蒸馏水彻底冲洗，真空冷冻干燥(Wt)降解率表示为支架材料的质量损失 Wloss＝(W0-Wt)/W0×100％。降解过程中的pH值也在设定的时间点测量。
结果如图3e所示，RCHA、MRCHPCL、MCHA和MRCHA四种支架材料均可以降解， 然而，MCHA和MRCHA支架材料的降解率要明显高于RCHA和MRCHPCL支架材料；12 周时RCHA、MRCHPCL、MCHA和MRCHA的剩余质量分别为76.58±3.09％，85.27±3.13％， 52.03±4.67％和51.99±3.23％。结果表明，MRCHA和MCHA支架材料具有理想的降解速 率。对支架材料降解过程中降解产物的pH值进行检测，结果如图3f所示，随着降解时间的 延长，RCHA、MCHA和MRCHA支架材料的pH值一直在7.4左右，保持有益于细胞生长 的生理环境；而MRCHPCL支架材料的pH值从7.4显著降低到6.7，不利于细胞的生长。
这些结果表明，MRCHA和MCHA支架材料具有理想的微观形貌、孔状结构和降解性能。
实施例四、支架材料的细胞活性
1.支架材料的细胞毒性
将多孔支架材料在α-MEM培养基中浸泡1和4天，收集浸提液，采用CCK-8法评估支架材料浸提液的体外细胞毒性。将100μLBMSCs细胞悬浮液以每孔5×105个细胞的密度置于96孔细胞培养板中，培养24hrs使其贴壁。然后加入100μL各种支架材料的浸提液。其他孔加入等体积的α-MEM培养液作为对照组。培养24hrs后，每孔中加10μL CCK-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，再将96孔板置于细胞培养箱中 孵育2hrs。用Tecan Infinite F200/M200多功能酶标仪(Tecan,Mannedorf，Switzerland)测量450 nm处的吸光度。细胞存活率的计算方法为每种条件的三次测量值的平均吸收值除以对照组的 平均吸收值。
结果如图4a所示，RCHA、MRCHPCL和MRCHA支架材料在α-MEM培养基中浸泡1 天和4天的浸提液均无细胞毒性，表明合成的支架材料具有高生物相容性。
2.支架材料的细胞增殖
采用CCK-8法检测BMSCs细胞在支架材料中的增殖。将BMSCs细胞以每孔5×105个细 胞的密度接种在96孔板中。观察在第1天、4天、7天和11天的细胞增殖情况，期间每 两天换一次液，培养到实验日期，培养基更换为含10％(v/v)CCK-8试剂的基础培养基，然 后继续培养6hrs。用Tecan Infinite F200/M200多功能酶标仪(Tecan，Mannedorf，瑞士)在450nm处测量100μL上清液的吸光度。
结果如图4b所示，MRCHA支架材料组的CCK-8法结果显示在450nm处的吸收值从0.38增加到3.03；MRCHPCL支架材料组的结果显示从0.38增加到2.62，其细胞的增殖效果明显高于RCHA(0.38到2.42)和空白组(0.36到1.54)。
图4c是支架材料活细胞-死细胞染色实验，在第一天时，RCHA，MRCHPCL和MRCHA 支架材料上活细胞和死细胞的数量没有显著差异，这时细胞刚刚贴壁，处于适应期。植入细胞四天后，支架材料上的细胞数量产生显著差异，MRCHPCL和MRCHA支架材料细胞的数 量明显多于RCHA，表明MRCHPCL和MRCHA支架材料能够促进细胞增殖。
3.支架材料的免疫荧光实验
将支架材料的薄片置于载玻片上，将BMSCs细胞以密度400cells/mm2植入到支架材料 中，37℃孵育24hrs。PBS洗涤三次，除去没有粘附的细胞。然后，将粘附的细胞用4％的多聚甲醛固定10min，并用0.1％Triton X-100通透5min，然后用1％牛血清白蛋白(BSA) 封闭30min。将细胞与鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸酯37℃孵育1hrs，然后加入DAPI(Sigma-Aldrich)在37℃下孵育10min，用于细胞肌动蛋白细胞骨架和细胞核染色，在荧光显 微镜上获取图像。
图4d是BMSCs细胞与支架材料共培养4天时的CLSM图，结果表明RCHA支架材料 上，细胞呈纺锤形多边方形，扩散面积较小，数量较少；MRCHPCL支架材料中细胞数量较 多，扩散面积较大；与RCHA和MRCHPCL支架材料相比，MRCHA支架材料上的细胞最多， 呈纺锤形，扩散面积最大。这些结果表明，支架材料可以显著促进BMSCs细胞的粘附和扩 散。细胞毒性，增殖和粘附的结果表明，MRCHA支架材料具有优异的生物相容性和生物活 性。
实施例五、支架材料的体外成骨性能
1.支架材料的ALP活性检测
将BMSCs细胞以1×105的密度接种于支架材料上，培养1天、4天、7天和11天后，使用BCA试剂盒和ALP试剂盒测定细胞总蛋白和ALP活性，根据试剂盒说明书，ALP的活性 归一化至总蛋白水平。在每一个时间点，用胰酶将接种细胞的支架材料消化3-4min，加入胎 牛血清终止消化，用移液枪缓慢吹打，使粘附在支架材料上的细胞完全脱落，将所得液体转入EP管，600r/min离心8min，收集细胞。用PBS洗涤细胞，除去胰酶。细胞用PBS重新 悬浮，加入细胞裂解液，使细胞完全裂解。上清液以3000rpm/min离心10min去除所有不溶 性碎片。取50μL的样品添加到96孔板，加入50μL的基质液，37℃孵育10min，再加入 100μL的终止液，在405nm处测定各孔的OD值。
结果如图5a所示，定量分析的结果表明，培养1至11天时，MRCHA支架材料上细胞的ALP活性从0.46增加到2.37；MRCHPCL支架材料上细胞的ALP活性从0.51增加到2.17；RCHA支架材料上细胞的ALP活性从0.36增加到1.37，结果表明，MRCHA支架材料上ALP 的活性明显高于RCHA和MRCHPCL支架材料。
2.支架材料特定成骨基因表达
将BMSCs细胞以1×105的密度接种于固定支架材料的24孔板中，培养7天和14天后， 用实时定量PCR评估成骨细胞的特定基因(Runx-2、ALP、OCN、Collagen I、β-Actin)的相对 表达量。用PBS洗涤细胞-支架复合物，加入1mL的RNAex，缓慢摇动培养板，使用移液枪反复吹打使细胞脱落，将上清液转移至EP管中，室温静置5min。加入200μL的氯仿震荡混匀，室温静置5min，12000g、4℃离心15min，小心将上清液转移至新的离心管中，加入 500μL的异丙醇，充分混匀，室温下静置10min。12000g、4℃离心10min，弃上清收集沉 淀，干燥，溶解于DEPC处理水中，测量RNA的浓度。反转录得到cDNA，在Thermal Cycler Dice Real TimeSystem标准反应条件下进行Real Time PCR反应。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线，使用2-ΔΔCt计算每个目标基因 的相对于前一个时间点的表达水平。对引物的扩增效率进行验证，定量比较基因表达。
结果如图5b-e所示，7和14天时，Runx-2、ALP、Col-I和OCN四种成骨相关基因在MRCHA支架材料上的表达量显著高于RCHA和MRCHPCL支架材料中。14天时，Runx-2 基因在MRCHA支架材料上的表达量分别达到RCHA和MRCHPCL支架材料的1.5倍和1.3 倍；ALP达到1.8倍和1.6倍；Col-I达到2.3倍和2.1倍；OCN则达到1.7倍和1.5倍。
3.支架材料的细胞矿化
将BMSCs细胞以1×105的密度接种于固定支架材料的24孔板中，置于37℃，5％CO2的培养箱进行培养，7天和14天后，吸走孔板中的培养液，用PBS缓冲溶液洗涤3次。用 4％的多聚甲醛固定30min，用PBS缓冲溶液洗涤3次。加入茜素红S染色液，室温染色30min， 去离子水充分洗涤，在倒置显微镜镜下观察。
结果如图5g所示，7天和14天，RCHA支架材料组中红色矿化结核数量增多；MRCHPCL支架材料组相对于RCHA支架材料组结核数量较多，但都表现为矿化小点；而在MRCHA支 架材料组中观察到呈红色、形状不规则的矿化结核小点逐渐增大形成红棕色的结点。通过检测560nm处的吸收强度，定量分析支架材料中BMSCs细胞的矿化能力，结果如图5f所示。 在14天时，MRCHA支架材料组的560nm处的吸收强度为0.825明显高于RCHA(0.274)和 MRCHPCL(0.496)支架材料组，吸收强度越高表示钙基质释放量越多，即矿化能力越高。这 些结果表明，MRCHA支架材料具有良好的矿化诱导能力，可显著促进成骨分化。
实施例六、多孔支架材料的体内成骨性能
1.支架材料修复SD大鼠临界尺寸颅骨缺损的MRI检测
术后4周、8周和12周后按之前的分组，在扫描前，大鼠腹腔内注射10％(w/v)戊巴比妥钠(0.3mL/100g)进行麻醉，减少呼吸运动；麻醉后大鼠保持仰卧位，头部及腹部用皮带直接固定于线圈；使用西门子MAGNETOM Skyro 3.0T，线圈使用70mm孔径8通道老鼠 专用线圈(中国上海晨光医疗技术)
MRI结果如图6所示，术后4-12周，空白组缺损区域组织影像几乎没有变化，骨创区域 无明显的高密度影像出现，表明大尺寸的颅骨缺损无法自愈；RCHA，MRCHPCL和MRCHA 支架材料在植入4-12周修复时间内，缺损区域有密度增高影像，表明有新骨组织的形成；MRCHA支架材料组骨缺损区域的组织影像与周围骨一致，再生区域与外周骨界几乎完全融合，表明成熟再生骨数量显著增加。
2.支架材料修复SD大鼠临界尺寸颅骨缺损的Micro-CT检测
术后4周、8周和12周后按之前的分组，在全身麻醉下对动物实施安乐死，收集颅骨并 固定在4％的多聚甲醛溶液中。用动物微型CT扫描仪(bruker skyscan1176，美国)以高分辨 率扫描模式评估重建颅骨的形态。
Micro-CT结果如图7所示，空白组在术后8周和12周时临界尺寸缺损区有少量骨形成。 在RCHA材料组观察到与空白组相似的结果，即在缺损边缘观察到少量的新骨形成。在12 周时MRCHA支架材料组显示出比其他三组更多的新形成的骨组织。从矢状面扫描图像中观 察到不同大小的间隙，其中MRCHA支架材料组的间隙最小。利用Micro-CT分析系统进行定量形态学分析，结果如图7b-d所示。各组间骨密度(BMD)随着时间的延长，都呈增长趋势。在术后12周，MRCHA组(0.1585±0.0195g/cc)的BMD明显高于RCHA组(0.0839±0.0107 g/cc)、MRCHPCL组(0.11069±0.02813g/cc)和对照组(0.0125±0.00762g/cc)(P<0.05)。此外，MRCHA组的骨体积分数(BV/TV)(89.01±10.67％)也明显高于RCHA组(52.71±8.28％)、MRCHPCL组(66.07±11.25％)和对照组(27.46±5.33)(P<0.05)。骨小梁数(Tb.N)显示出与BV/TV相同的趋势。这些结果表明，MRCHA支架材料可显著增强骨组织再生。
3.支架材料修复SD大鼠临界尺寸颅骨缺损的组织染色
术后4、8和12周后按之前的分组麻醉处死大鼠，将处死大鼠颅骨标本做组织病理学分 析。取大鼠颅骨及上颌骨，剥除头部皮肤及脑组织，使用刀片截取骨缺损部位及软组织，组 织样本浸泡于4％的多聚甲醛溶液中固定24hrs；将样本用PBS冲洗，浸泡于脱钙液中进行脱 钙。定期检查脱钙情况，针头可以无阻力的穿透骨组织时证明脱钙完全；对脱钙完全的样本 进行梯度脱水，分别依次用50％，75％，95％和100％乙醇脱水两次，每次10min；用石蜡 对脱水后的组织进行包埋，再用石蜡切片机制成5μm后的组织切片；分别用苏木素&伊红和 Masson对组织石蜡切片进行染色，镜下观察。
H&E组织染色结果如图8a所示，术后4-12周，空白组形成大量的纤维组织，仅有少量 的粉红色染色结构。RCHA支架材料组骨组织比空白组稍多。在MRCHPCL材料组观察到明显未降解的材料，阻碍新骨组织的形成。MRCHA支架材料组硬脑膜邻近区域和支架中心均有骨样组织占据，可见明显的骨小梁。MRCHA支架材料几乎完全降解并被再生的成熟骨组织取代，与天然骨组织具有相似的形态。
颅骨横切面Masson三色染色图像结果如图8b所示，未成熟的初生骨呈蓝色，成熟的 初生骨呈红色。所有组新形成的骨组织都随时间逐渐增加，且MRCHA支架材料组的缺损处 观察到的新骨组织明显多于其他组。H&E染色和Masson染色结果表明，MRCHA支架材料的具有优异的成骨活性，可以显著促进骨组织再生。
综上所述，本发明提供了一种矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料，很好的仿生天然骨骼 的组成、结构和功能，并形成相互连通的网孔结构；所述矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料 具有良好的生物相容性和生物活性，能显著促进BMSCs细胞的增殖、粘附和分化，在体外 具有良好的骨诱导性；所述矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料移植到SD大鼠颅骨缺损模型 后，MRI和Micro-CT结果表明其具有良好的成骨诱导作用，并具有骨传导性；H&E和Masson 染色结果表明，其在术后12周完全降解，并可以显著促进骨组织再生；本发明提供的矿化胶 原蛋白-海藻酸钠骨修复支架材料，具有优异的骨缺损治疗效果，在骨组织工程领域有巨大的 应用潜力。

Claims (10)

1.一种矿化胶原蛋白-多糖骨修复支架材料，其特征在于，所述的骨修复支架材料由矿化胶原蛋白、多糖均匀混合后化学交联得到，所述的矿化胶原蛋白和多糖的浓度比为10-80wt％：1-20wt％，余量为水。
2.如权利要求1所述的骨修复支架材料，其特征在于，所述多糖为海藻酸钠、硫酸软骨素、透明质酸中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的骨修复支架材料，其特征在于，所述矿化胶原蛋白由0.1-10wt％胶原蛋白、0.0334-3.34mol/L钙盐和0.02-2mol/L磷酸盐反应获得。
4.如权利要求3所述的骨修复支架材料，其特征在于，所述的胶原蛋白为重组胶原蛋白和/或动物胶原蛋白，所述的动物胶原蛋白包括Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型中的一种或几种。
5.如权利要求3所述的骨修复支架材料，其特征在于，所述钙盐为无水氯化钙溶液、葡萄糖酸钙溶液、磷酸二氢钙溶液、硝酸钙溶液或碳酸氢钙溶液；所述磷酸盐为磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钾溶液、磷酸二氢铵溶液或磷酸溶液。
6.如权利要求3-5任一项所述的骨修复支架材料，其特征在于，所述的矿化胶原蛋白的制备方法如下：
(1)按比例配置钙盐溶液和胶原蛋白溶液的水溶液，混合反应10-120min后，按比例滴加磷酸盐溶液，得混合溶液；
(2)将步骤(1)所述混合溶液调节pH，搅拌反应，水浴静置，离心，洗涤，获得白色胶状物的矿化胶原蛋白。
7.如权利要求6所述的骨修复支架材料，其特征在于，步骤(2)所述pH为7.4，搅拌反应12-36hrs，37℃恒温静置12-96hrs。
8.如权利要求1-5任一项所述骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按比例将矿化胶原蛋白与多糖溶液混合，均质，注模，真空脱气，预冷，冷冻干燥；
(2)将步骤(1)制备得到的材料浸泡在含有交联剂的乙醇溶液中交联，洗涤，冷冻干燥，得到骨修复支架材料。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的预冷为-20℃过夜预冷；步骤(2)所述的洗涤用去离子水，所述的交联剂为EDC-NHS。
10.如权利要求1-5任一项所述的骨修复支架材料在制备人工骨、生物材料、医疗器械中的应用。
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