CN108473963A - 用于异种移植的多重转基因猪 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及转基因动物（例如转基因猪动物），所述转基因动物包含有利地使这些动物作为合适的异种移植供体的多重遗传修饰。本发明延伸至源自这些动物的器官、器官块、组织及细胞，以及它们的治疗用途。本发明进一步延伸至制备所述动物的方法。在某些实施方案中，所述转基因动物（例如转基因猪动物）缺乏α gal的表达，且在至少两种启动子的调控下掺入和表达至少四种转基因。

Description

用于异种移植的多重转基因猪
本申请要求2015年9月9日提交的美国临时专利申请62/216,225和2015年11月16日提交的美国临时专利申请62/256,068的权益，这两个专利申请的内容通过引用整体并入本文。
背景技术
猪已经成为异种移植中大多数研究的焦点，这是因为猪与人共有许多解剖和生理特性。猪还具有相对短的妊娠期，可以在无病原体环境下育种，并且可不呈现与通常不用作食物来源的动物（例如灵长类动物）相同的有关伦理问题。猪至灵长类动物异种移植领域中的科学知识和专业知识经过过去十年已快速增长，导致救命的猪异种移植物的灵长类动物受体显著延长的存活（Cozzi等人，Xenotransplantation，16:203-214. 2009）。近来，在器官异种移植领域中已报道显著成就（Ekser等人，2009，Transplant Immunology Jun，21(2):87-92）。
克服猪器官在临床前模型中应用的生物屏障已取得显著进步，器官功能持久，在一些心脏和肾系列中受体存活达到数月至数年（Mohiuddin MM, 等人，Am J Transplant2014; 14:488-489；Iwase H, 等人，Xenotransplantation 2015; 22:302-309；Higginbotham L 等人，Xenotransplantation 2015; 22:221-230）。然而，迄今对于心脏和肾的显著进步尚未达到转化为人类的程度。另外，其他器官，例如肺，表现出甚至更大的挑战。例如，在灵长类动物中支持生命的肺异种移植物存活限于数天（Laird 等人，June2016, www.cotransplantation.com, 卷21，第3期）。
肺移植对于晚期肺疾病是被接受的治疗。自1963年实施的首例，全世界已经进行了超过32,000例的肺移植。大多数操作是尸体移植，其中从脑死亡但仍处于生命维持中的患者获得供体肺。在二十世纪九十年代，尸体供体肺数量的限制导致活供体叶肺移植（LDLLT）的发展，其中两名或更多名活患者捐赠其一段（叶）肺。然而，供体池仍相对匮乏，移植的长期结果仍旧受到免疫抑制用药的阻碍。
异种移植（来自不同物种供体的器官、组织和细胞的移植）可以有效解决人供体材料的短缺。有利地，异种移植（i）在可以预测的、非紧急的基础上供应；（ii）在受控的环境下生产；和（iii）可以在移植前用于表征和研究。然而，与其他器官相比，肺的解剖结构独特，具有大表面积与肺泡上皮紧密相连的血管内皮、强健的免疫监督以及快速反应系统，使得触发炎症，极易受其后果影响（den Hengst WA 等人，Am J Physiol Heart Circ Physiol2010; 299:H1283-H1289；Ranieri VM 等人，JAMA 1999; 282:54-61）。
虽然异种移植在许多方面是有利的，但是比同种异体移植产生更复杂的免疫学情况。猪至灵长类动物异种移植最大的障碍是免疫级联机制对移植器官的排斥，所述排斥分三个时期：超急性排斥（HAR）、急性体液异种移植物排斥（AHXR）和T细胞介导的细胞排斥。HAR是非常快速的事件，其导致在移植物再灌注后数分钟至数小时内不可逆的移植物损害和丢失。
相当大的努力已经针对通过供体动物遗传修饰来解决异种移植产生的免疫屏障。缺乏α 1,3-Gal表位（触发猪至灵长类动物异种移植物HAR的主要异种抗原）的遗传修饰猪被认为是进一步遗传修饰的基础，所述进一步的遗传修饰可以解决其他排斥机制和猪与灵长类动物血凝系统之间的不相容性。尽管多重遗传修饰对于成功的异种移植可能是必要的，但是其提出了挑战，包括生产相关的挑战。显然，稳定表达多重免疫调节转基因的转基因猪的产生对于克服异种移植排斥是必要的。
已经利用通过包含单转基因的猪进行传统育种产生多重转基因猪，由此取得巨大成功（Ekser等人，2009, Transplant Immunology Jun 21(2):87-92；Laird 等人，June2016, www.cotransplantation.com, 卷21，第3期）。然而，育种耗时、昂贵，并且转基因表达水平一致可能是随时间产生的问题。
最近，已经开发多顺反子表达系统的应用以将多重转基因插入不同细胞类型和动物。使用这些系统产生多重转基因猪的可行性已有推荐。
Deng 等人，（PLOS ONE, www.plosone.org, May 2011, 卷6，第5期，e19986）使用2A肽双顺反子系统和通过转基因随机整合的核转移产生表达四种荧光蛋白的转基因猪。
Jeong 等人，（PLOS ONE, www.plosone.org, May 2013, 卷8，第5期, e63241）报道了使用IRES介导的三顺反子载体系统和核转移产生表达补体调节因子CD59和H转移酶基因的转基因猪。事实上，Jeong 等人，尝试使用此三顺反子系统表达三种基因，然而，尽管第三种基因CD55存在于IRES载体，但在猪中不表达。
Hurh 等人，(PLOS ONE，www.plosone.org, July 2013, 卷8，第7期, e70486)使用双顺反子T2A表达系统生成转基因猪成纤维细胞，并使用此系统分析转基因猪的表达。他们报道了如果上游基因表达有效则可以实现下游基因的有效表达。
尚未产生导致转基因稳定、充足整合和表达的使用多顺反子表达系统的多重转基因猪。由此，此策略是否表现为对于通常用于生成多重转基因猪的传统育种方法的可行替代方式仍有待确定。
仍需要用于异种移植治疗的改进的供体动物。
具体地，仍需要可以提供具有改进的功能性的肺异种移植物的供体动物。
发明内容
本发明涉及转基因动物（例如转基因猪动物），所述转基因动物包含有利地使这些动物作为合适的异种移植供体的多重遗传修饰。本发明延伸至源自这些动物的器官、器官块、组织及细胞，以及它们的治疗用途。本发明进一步延伸至制备所述动物的方法。
在第一方面，本发明提供了一种转基因猪，所述转基因猪包含至少四种转基因，其中，所述至少四种转基因在至少两种启动子调控下在单基因座掺入和表达，其中所述猪缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达。
所述单基因座可以为任何合适的基因座。在一种实施方案中，单基因座是未修饰的天然基因座。在一种可选的实施方案中，所述单基因座是修饰的天然基因座。所述基因座可以通过任何合适方式修饰，包括但不限于由基因编辑工具介导的插入、缺失或取代。在某些实施方案，所述修饰的天然基因座包含转基因DNA。所述转基因DNA可以为例如选择性标记基因。在其他实施方案中，所述转基因DNA是本文进一步描述的着陆台（landing pad）。
在具体实施方案中，所述单基因座是AAVS1、ROSA26、CMAH、ß4GalNT2或GGTA1。根据此实施方案，所述基因座可以为天然的或修饰的。
在一种例示性实施方案中，所述单基因座是天然GGTA1或修饰的天然GGTA1。在某些实施方案中，所述修饰的天然GGTA1基因座包含选择性标记基因，例如neo。在其他实施方案中，所述修饰的天然GGTA1基因座包含由基因编辑工具介导的插入、缺失或置换。在其他实施方案中，所述修饰的天然GGTA1基因座包含有利于基因靶向的着陆台。
所述启动子可以有所不同。在例示性实施方案中，所述启动子为内源性、外源性或它们的组合。在例示性实施方案中，所述启动子为组成型或可调节性或它们的组合。在某些实施方案中，所述启动子中的至少一种为可调节性（例如，组织特异性或可诱导性启动子）。
在一种例示性实施方案中，所述转基因猪包含四种转基因，其中所述四种转基因作为第一和第二多顺反子表达，其中第一启动子调控所述第一多顺反子的表达，第二启动子调控所述第二多顺反子的表达。
在一种例示性实施方案中，所述转基因猪包含四种转基因，其中所述至少四种转基因中的每一种由专属启动子调控。
在一种具体实施方案中，所述转基因猪包含至少四种转基因，其中所述至少四种转基因在至少两种启动子调控下在单基因座掺入并表达，其中所述启动子中的至少一种为组成型（例如CAM），所述启动子中的至少一种为组织特异性（例如，诸如ICAM-2的内皮特异性启动子），其中所述猪缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达。
在另一种具体实施方案中，所述转基因猪包含至少四种转基因，其中所述至少四种转基因在至少两种启动子调控下在单基因座掺入并表达，其中所述启动子中的至少两种为组成型，其中所述猪缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达。
所述转基因可以有所不同。在例示性实施方案中，所述转基因为抗凝剂、补体抑制剂、免疫调节剂、细胞保护转基因或它们的组合。
在某些实施方案中，所述转基因中的至少一种为抗凝剂。在一种实施方案中，所述抗凝剂为TBM、TFPI、EPCR或CD39。在一种具体实施方案中，所述转基因中的至少两种为抗凝剂。
在某些实施方案中，所述转基因中的至少一种为诸如补体抑制剂的补体调节剂。在一种实施方案中，所述补体抑制剂为CD46、CD55或CD59。
在某些实施方案中，所述转基因中的至少一种为免疫调节剂。所述免疫调节剂可以为例如免疫抑制剂。在一种实施方案中，所述免疫抑制剂为猪CLTA4-IG或CIITA-DN。在一种具体实施方案中，所述转基因中的至少一种为CD47。
在例示性实施方案中，所述转基因动物包含至少一种另外的遗传修饰，即除了多重转基因表达和缺乏αGal表达以外。
所述另外的遗传修饰可以有所不同。在例示性实施方案中，所述至少一种遗传修饰是基因敲除，基因敲入，基因置换，点突变，基因、基因片段或核苷酸的缺失、插入或取代，大基因组插入，或它们的组合。
在某些实施方案中，所述单基因座不是GGTA1，所述至少一种另外的遗传修饰包含α 1,3半乳糖基转移酶基因敲除。
在其他实施方案中，所述另外的遗传修饰包括至少一种另外的转基因的掺入和表达。在一种实施方案中，所述另外的转基因是人CD46基因、人HLA-3和/或人源化vWF，或嵌合猪-人vWF基因。
在某些实施方案中，至少一种另外的遗传修饰是猪vWF基因座的修饰，以减轻或消除人血小板的自发性聚集。
在某些实施方案中，至少一种另外的遗传修饰是猪基因的敲除。在某些实施方案中，所述猪基因可以为ß4GalNT2、CMAH、异红细胞糖苷脂3合酶、Forrsman合酶或vWF。
在某些实施方案中，至少一种另外的遗传修饰包括至少两种或更多种另外的转基因的掺入和表达。在一种实施方案中，所述两种或更多种另外的转基因在单个的第二基因座掺入和表达。
在一种例示性实施方案中，所述转基因猪包含至少六种转基因，其中，（i）至少四种转基因在至少两种启动子的调控下在第一单基因座（例如，GGTA1）掺入和表达，和（ii）至少两种转基因在至少一种启动子的调控下在第二单基因座（例如ß4GalNT2或CMAH）掺入和表达，其中，所述猪缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达。
在第二方面，本发明是源自本发明第一方面所述基因猪的器官或器官块。
在例示性实施方案中，所述器官是肺、肝、心脏或胰腺。
在例示性实施方案中，所述器官块是肺块、肝块、心脏块或胰腺块。
在第三方面，本发明是源自本发明第一方面的所述转基因猪的组织。
在例示性实施方案中，所述组织是上皮组织或结缔组织。
在第四方面，本发明是源自本文公开的所述转基因猪的细胞。
在例示性实施方案中，所述细胞是胰岛细胞。
在第五方面，本发明是一种制备表达至少四种转基因但缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达的转基因猪的方法，所述方法包括：（i）在至少两种启动子的调控下在猪基因组中单基因座掺入至少四种转基因，以提供多基因猪的基因组；（ii）允许包含所述多基因猪的基因组的细胞成熟为转基因猪。
在一种例示性实施方案中，所述猪基因组是体细胞猪基因组，所述细胞是猪受精卵，其中，所述猪受精卵通过体细胞核转移（SCNT），并且通过微注射至重构的SCNT受精卵而转移多基因猪基因组提供。任选地，所述体细胞基因组和/或所述多基因猪基因组可以包含一种或多种另外的遗传修饰。在一种实施方案中，所述至少一种遗传修饰选自基因敲除，基因敲入，基因置换，点突变，基因、基因片段或核苷酸的缺失、插入或取代，大基因组插入，或它们的组合。
在一种例示性实施方案中，所述猪基因组选自配子猪基因组、受精卵猪基因组、胚胎猪基因组或胚泡猪基因组组成的组。任选地，所述猪基因组或所述多基因猪基因组包含至少一种另外的遗传修饰。在一种实施方案中，所述至少一种遗传修饰选自基因敲除，基因敲入，基因置换，点突变，基因、基因片段或核苷酸的缺失、插入或取代，大基因组插入，或它们的组合。
所述掺入的方法可以有所不同。在例示性实施方案中，掺入包括生物转染、化学转染、物理转染、病毒介导的转导或转化，或它们的组合。在一种具体实施方案中，掺入包括细胞质微注射。在另一种具体实施方案中，掺入包括原核微注射。
所述单基因座可以有所不同，这与本发明的第一方面一致。
在例示性实施方案中，所述单基因座包括转基因DNA。在一种具体实施方案中，所述转基因DNA是着陆台，包括对于至少一种多核苷酸修饰酶的一个或多个识别位点。所述多核苷酸修饰酶可以有所不同。在某些实施方案中，所述多核苷酸修饰酶是工程化的核酸内切酶、位点特异性重组酶、整合酶，或它们的组合。
在一种实施方案中，所述工程化的核酸内切酶是锌指核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶、或成簇规律间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶。
在一种实施方案中，所述位点特异性重组酶是λ整合酶、Cre重组酶、FLP重组酶、γ-δ解离酶、Tn3解离酶、ΦC31整合酶、Bxb1整合酶、R4整合酶，或它们的组合。
在一种实施方案中，所述单基因座是选自GGTA1、CMAH、ß4GalNT2、AAVS1基因座和Rosa26的天然或修饰的基因座。
在所述单基因座不是GGTA1的实施方案中，所述另外的遗传修饰包含α 1,3半乳糖基转移酶基因敲除。本发明所考虑作为另外的遗传修饰的其他敲除包括猪ß4GalNT2基因、CMAH基因、ß4GalNT2基因、vWF或它们的组合的敲除。
在例示性实施方案中，所述至少一种另外的遗传修饰包括至少一种另外的转基因的掺入和表达。在某些实施方案中，所述转基因是人CD46、人HLA-E、人源化vWF、嵌合猪-人vWF、或全人vWF。
在第六方面，本发明是由本发明第五方面的方法产生的转基因猪或生产群。
在第七方面，本发明是一种将本发明所述转基因猪培育成第二转基因猪的方法，其中所述第二转基因猪通过一种或多种遗传修饰表征。
在例示性实施方案中，所述第二转基因猪通过一种或多种遗传修饰表征，例如，基因敲除，基因敲入，基因置换，点突变，基因、基因片段或核苷酸的缺失、插入或取代，大基因组插入，或它们的组合。
第八方面，本发明是由本发明第七方面的方法产生的转基因猪或生产群。
第九方面，本发明提供了一种通过将至少一种源自本发明的所述转基因猪的器官、器官块、组织或细胞植入有需要的受试者而治疗所述受试者的方法。
在例示性实施方案中，所述器官或器官块是肺或肺块、肾或肾块、肝或肝块、胰腺或胰腺块，或它们的组合。
在一种具体实施方案中，所述器官是肺。在另一种具体实施方案中，所述器官块是肺块。在一种例示性实施方案中，在患有晚期肺疾病的受试者中移植所述肺或肺块。
在一种例示性实施方案中，在患有与慢性阻塞性肺病（COPD）、特发性肺纤维化（IPD）、囊性纤维病（CF）、α1-抗胰蛋白酶疾病或原发性肺动脉高压有关的晚期肺疾病的受试者中移植所述肺或肺块。
在某些实施方案中，所述方法包括将一种或多种另外的治疗剂施用于受试者。所述一种或多种治疗剂可以有所不同。在一种实施方案中，所述治疗剂是抗排斥剂、抗炎剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗微生物剂、抗病毒剂以及它们的组合。
在第十方面，本发明提供了具有猪vWF基因座的遗传修饰和缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达的转基因猪。所述转基因猪可以包含一种或多种另外的遗传修饰。
在一种例示性实施方案中，所述转基因猪具有猪vWF基因座的遗传修饰，掺入和表达至少四种转基因，以及缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达。
附图说明
图1A描述可以用于本发明的载体的双顺反子单元，所述单元由通过2A肽序列连接的两种转基因组成。图1B描述了可以用于本发明的停靠载体，包括侧接和分离由独立的启动子/增强子驱动的两个双顺反子单元的插入位点的珠蛋白隔离子。
图2通过流式细胞术描述6GE猪（GTKO.CD46.TBM.CD39.EPCR.DAF）中的基因表达，表现α-Gal表达缺乏，和五种人转基因包括CD46、CD55(DAF)、EPCR、TFPI以及CD47的强劲表达。
图3描述使用针对6GE猪（GTKO.CD46.TBM.CD39.EPCR.DAF）中的EPCR、DAF、TFPI以及CD47的荧光标记抗体进行的肺切片免疫组织化学染色。
图4A和4B描述根据本发明设计和产生的多顺反子载体（MCV）。使用6种遗传修饰产生猪，包括用于补体调节基因hCD46和CD55的表达盒，结合抗凝基因血栓调节蛋白（TBM）、内皮蛋白C受体（EPCR）、CD39以及组织因子途径抑制剂（TFPI）、免疫抑制基因猪细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（pCTLA4Ig）、显性失活II类主要组织相容性复合物（CIITA-DN）和/或抗炎转基因亚铁血红素加氧酶-1（HO1）、A20、CD47的内皮特异性或遍在性表达。
图5描述肺中pREV941转基因的表达分析。
图6描述肺中pREV971转基因的表达分析。
图7描述肺中pREV967转基因的表达分析。
图8描述941 HDR载体（MCV载体pREV941，具有人转基因EPCR、DAF、TBM和CD39）；特异性靶向GTKO细胞中修饰的αGal 基因座的500bp同源臂。
图9描述来自阴性对照野生型猪和941HDR靶向猪的肺切片中EPCR、DAF、TBM以及CD39转基因的免疫组织化学染色。对于所有4种人转基因观察到表达。此MCV中来自强组成型CAG启动子的转基因（EPCR和DAF）表达比所观察到的在内皮特异性pICAM-2启动子调控下的转基因（TBM和CD39）表达要强。
图10描述来自941HDR靶向猪的心脏、肝、肺以及肾组织裂解物的蛋白质印迹分析。优化对TBM（在内源特异性pICAM2启动子调控下）及EPCR和DAF（共有CAG启动子）的特异性抗人单克隆抗体用于检测来自MCV转基因猪的组织中转基因表达（此情况下具体为941HDR）。在所有组织中对于EPCR和DAF观察到在α Gal基因座整合环境中的表达，以及TBM的较弱表达（除了肺中高），表明在基因组中，重要的是在活猪中，此预定位点中多重转基因的良好表达。
图11A描述多品系TBM转基因MCV猪中人血栓调节蛋白表达的ELISA检测，包括靶向αGal基因座的941 HDR（猪875-5）。
图11B描述胎MVEC细胞中来自靶向αGal基因座的pREV971的所有转基因的流式细胞术表达。
图12描述通过CRISPR增强敲入和使用作为cDNA的人等同外显子22-28置换猪外显子22-28，猪vWF基因座的人源化。在步骤1中，在使用两个CRISPR和包含两个猪同源臂、侧邻人外显子22-28并且具有GFP-Puro的内选择盒的靶向载体转染猪成纤维细胞之后。在步骤2中，CRISPR诱导的双链断裂起始位于猪外显子22和外显子28的接头处的链交换和同源依赖性修复，具有人vWF序列的插入。然后，使用位点特异性转座子处理具有证实的双等位基因置换的胎细胞以去除选择盒，留下猪-人序列的框内融合。
图13描述接头（5’和3’）的序列分析，显示当人外显子22-28的敲入和插入时猪和人VWF序列的完美对齐。
图14描述通过血小板集合度测定时猪vWF编辑全血的正常功能。
图15描述人血小板暴露的vWF编辑猪乏血小板血浆无自发聚集。使用两步离心方案从柠檬酸盐抗凝猪血样制备猪乏血小板血浆（PPP）。从新鲜抽取的人血样（柠檬酸盐抗凝）制备人富血小板血浆（PRP）。在试管中将人PRP与猪PPP 1:1混合，立即使用Chrono-log全血集合度计记录血小板的聚集。
图16描述本发明所述的双顺反子 CD46/CD55 (DAF)载体。
图17描述通过使用人vWF取代进行的猪vWF修饰。
图18显示高水平的根据本发明的转基因猪的多重转基因、更具体地是六种遗传修饰（GTKO.CD46.EPCR.CD55.TBM.CD39）的表达和五种转基因(CD46.EPCR.CD55.TBM.CD39)的掺入表达。
具体实施方案
本发明涉及特别可以用作异种移植的器官、器官块、组织或细胞来源的转基因动物。具体地，本发明涉及转基因有蹄动物，更具体地涉及可以用作异种移植的器官、器官块、组织或细胞来源的转基因猪动物（猪）。本发明延伸至源自所述供体动物的器官、器官块、组织或细胞，制备所述供体动物的方法，以及源自所述动物的器官、器官块、组织或细胞在治疗疾病和病症中的用途。
有利地，所述供体动物提供在移植（tx）背景中功能性优于本领域已知的器官、器官块、组织以及细胞的器官、器官块、组织以及细胞。不希望受任何特定理论的限制，认为本发明的器官、器官块、组织以及细胞具有改进的存活和/或功能性，这是由于当前在非协调性异种移植之后观察到消耗性凝血病（还称为播散性血管内凝血（DIC））和血栓形成性微血管病显著减轻。
所述器官或器官块可以为任何合适的器官，例如，肺、心脏、肝火胰腺。所述组织可以为任何合适的组织，例如，上皮或结缔组织。所述细胞可以为任何合适的细胞。所述细胞可以为任何合适的细胞，例如，胰岛细胞。
在例示性实施方案中，本发明提供一种特别可以用作肺异种移植的器官（即肺）、器官块、组织或细胞的来源的转基因动物（例如有蹄动物，猪动物），本发明延伸至源自所述转基因动物的器官（即肺）、器官块、组织以及细胞，以及制备所述转基因动物的方法和将源自所述转基因动物的器官、组织以及细胞用于肺异种移植的方法。
有利地，源自所述转基因动物的器官、器官块、组织或细胞在异种移植之后产生低水平至无水平的下列物质中的一种或多种：超急性排异（HAR）、急性体液排斥（AHXR/DXR）和/或急性细胞异种移植物排斥（ACXR）。
在一种实施方案中，源自所述转基因动物的器官、器官块、组织或细胞在异种移植之后产生低水平至无水平的HAR和AHXR。在另一种实施方案中，源自所述转基因动物的器官、器官块、组织或细胞在异种移植之后产生低水平至无水平的HAR、AHXR以及ACXR。
在例示性实施方案中，所述转基因动物是缺乏功能性α 1,3半乳糖基转移酶（αGal）任何表达（作为遗传修饰或其他方面的结果）和掺入至少几种另外的遗传修饰（例如，基因敲除，基因敲入，基因置换，点突变，缺失、插入或取代（即基因、基因片段或核苷酸的），大基因组插入，或它们的组合）的猪动物。所述遗传修饰可以由任何合适的技术介导，包括例如同源重组或基因编辑方法。
在例示性实施方案中，所述转基因动物是缺乏功能性α 1,3半乳糖基转移酶（αGal）任何表达（作为遗传修饰或其他方面的结果）和在至少两种启动子的调控下在单基因座掺入和表达至少四种转基因的猪动物。在某些实施方案中，一种启动子调控一种转基因的表达，例如，至少四种转基因中的各转基因的表达受单个（专属）启动子调控。在可选的实施方案中，一种启动子调控多于一种的转基因的表达，例如，一种启动子调控两种转基因的表达。有利地，在培育过程中，所述四种或更多种转基因共整合、共表达以及共分离。所述单基因座可以有所不同。在某些实施方案中，所述单基因座是天然基因座或修饰的天然基因座。所述修饰的天然基因座可以通过任何合适的技术修饰，包括但不限于CRISP诱导的插入或缺失（indel），引入选择性标记基因（例如neo），或引入大基因组插入片段（例如着陆台），旨在有利于掺入一种或多种转基因。在一种具体实施方案中，所述单基因座是天然或修饰的GGTA1基因座。所述GGTA1基因座通过掺入或表达至少四种转基因而灭活，例如通过同源重组、应用基因编辑或重组酶技术。所述单基因座还可以为，例如AAVS1、ROSA26、CMAH、或ß4GalNT2。任选地，所述转基因动物可以具有一种或多种另外的遗传修饰，和/或一种或多种另外的猪基因的表达可以通过遗传修饰以外的机制来修饰。
在例示性实施方案中，所述转基因动物是缺乏功能性α 1,3半乳糖基转移酶（αGal）的任何表达（作为遗传修饰或其他方面的结果）并且在单基因座掺入和表达至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种或更多种转基因的猪动物。在某些实施方案中，所述至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种或更多种转基因的表达由至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种或更多种启动子调控。在某些实施方案中，所述启动子专属于所述转基因，即，一种启动子调控一种转基因的表达，而在可选的实施方案中，一种启动子调控多于一种的转基因的表达，例如，一种启动子调控两种转基因的表达。有利地，在培育过程中，所述两种或更多种另外的转基因共整合、共表达以及共分离。所述单基因座可以有所不同。在某些实施方案中，所述单基因座是天然基因座或修饰的天然基因座。所述修饰的天然基因座可以通过任何合适的技术修饰，包括但不限于CRISP诱导的插入或缺失（indel），引入选择性标记基因（例如neo），或引入大基因组插入片段（例如着陆台），旨在有利于掺入一种或多种转基因。在一种具体实施方案中，所述单基因座是天然或修饰的GGTA1基因座。所述GGTA1基因座通过掺入或表达至少四种转基因而灭活，例如通过同源重组、应用基因编辑或重组酶技术。所述单基因座还可以为，例如AAVS1、ROSA26、CMAH、或ß4GalNT2。任选地，所述供体动物可以具有另外的遗传修饰，和/或一种或多种另外的猪基因的表达可以通过遗传修饰以外的机制来修饰。
在例示性实施方案中，所述转基因动物是缺乏功能性α 1,3半乳糖基转移酶（αGal）的任何表达（作为遗传修饰或其他方面的结果）并且在单基因座（即基因座1）掺入和表达至少四种转基因且还在第二单基因座（即基因座2）掺入和表达一种或多种另外的转基因的猪动物。在某些实施方案中，一种启动子调控一种转基因的表达，例如，在基因座1或基因座2的所述至少四种转基因中的各转基因的表达受单个（专属）启动子调控。在可选的实施方案中，一种启动子调控多于一种的转基因的表达，例如，在基因座1一种启动子调控两种转基因的表达。具体的基因座可以有所不同。在一种具体实施方案中，第一单基因座是GGTA1，第二单基因座是，例如CMAH、B4GalNT2或vWF。在一种具体实施方案中，在各单基因座(即基因座1和基因座2)掺入和表达至少四种转基因以产生在两个不同和独立的基因座表达八种或更多种转基因的动物。在某些实施方案中，所述单基因座是天然基因座或修饰的天然基因座。所述修饰的天然基因座可以通过任何合适的技术修饰，包括但不限于CRISP诱导的插入或缺失（indel），引入选择性标记基因（例如neo），或引入大基因组插入片段（例如着陆台），旨在有利于掺入一种或多种转基因。任选地，所述供体动物可以具有另外的遗传修饰，和/或一种或多种另外的猪基因的表达可以通过遗传修饰以外的机制来修饰。有利地，在培育过程中，所述两种或更多种另外的转基因共整合、共表达以及共分离。
所述至少两种启动子可以有所不同。所述启动子可以为外源性或天然启动子。在例示性实施方案中，所述启动子为组成型或可调节性（例如，组织特异性、可诱导性）。在一种实施方案中，在供体动物中两种启动子均可以为组成型或遍在性表达（例如来自CAG或相似启动子）。在另一种使用两种启动子的实施方案中，一种启动子可以允许转基因以组织特异性方式表达（例如内皮特异性表达），而第二种启动子可以允许一种或多种转基因（在相同整合位点）以组成型或遍在性方式表达（例如，来自CAG或相似启动子）。
在某些实施方案中，所述另外的遗传修饰（即，除了上述的多重转基因掺入和表达以外）可以导致特定猪基因灭活，包括但不限于猪血管假性血友病因子（vWF）基因，或一些或所有猪vWF基因被来自人vWF基因的等同对应物置换。其他与另外的遗传修饰结合而可以灭活的基因包括，例如，CMP-NeuAc羟化酶（CMAH)、异红细胞糖苷脂3合酶、ß4GalNT2、Forrsman合酶或它们的组合。在某些实施方案中，所述用于转基因掺入的单基因座不是GGTA1，所述另外的遗传修饰包括GGTA1灭活。
在某些实施方案中，所述另外的遗传修饰是，例如基因编辑诱导的缺失/插入或基因取代（INDEL）。
在某些实施方案中，所述另外的遗传修饰（即，除了上述的多重转基因掺入和表达以外）可以导致一种或多种转基因在第二基因座掺入和表达。
在一种实施方案中，本发明是缺乏功能性α 1,3半乳糖基转移酶（αGal）的任何表达（作为遗传修饰或其他方面的结果）并且进一步包含猪血管假性血友病因子（vWF）基因灭活或一些或所有猪vWF基因被来自人vWF基因的等同对应物置换的猪动物。任选地，所述猪动物包含一种或多种另外的遗传修饰。在某些实施方案中，所述动物可以与包含一种或多种遗传修饰的第二动物一起培育。
本发明还延伸至制备和使用所述转基因动物（或源自所述转基因动物的器官、组织或细胞）的方法。
在例示性实施方案中，本发明提供一种制备表达至少四种转基因但缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达的转基因猪的方法，所述方法包括：（i）在至少两种启动子的调控下在猪基因组中单基因座掺入至少四种转基因，以提供多基因猪的基因组；（ii）允许包含所述多基因猪的基因组的细胞成熟为转基因猪。
在某些实施方案中，所述猪基因组是体细胞猪基因组，所述细胞是猪受精卵。
在某些实施方案中，所述猪基因组选自配子猪基因组、受精卵猪基因组、胚胎猪基因组或胚泡猪基因组组成的组。
在例示性实施方案中，掺入包括选自生物转染、化学转染、物理转染、病毒介导的转导或转化或它们的组合组成的组。
在某些实施方案中，掺入包括细胞质微注射和原核微注射。
在例示性实施方案中，所述方法包括使用使得所述转基因共整合和共表达具有功能性和/或产生优点的双顺反子或多顺反子载体，包括利用2A技术的多顺反子载体。在一种优选的实施方案中，在包含至少四种转基因的多顺反子载体中，各顺反子在其自身启动子的调控下，一种启动子或两种启动子均可以导致两种或多种基因的组成型表达，而第二种启动子可以导致两种或多种基因的组织特异性表达。这些载体与基因编辑工具联合使用，包括编辑核酸酶和/或位点特异性整合酶。
本发明还延伸至使用源自本发明的转基因动物的器官、器官块、组织或细胞治疗有需要的受试者的方法。在例示性实施方案中，所述器官是肺、肾、心脏、胰腺或其他实体器官。本发明考虑的组织的实例包括但不限于上皮和结缔组织。
本发明还考虑了包括多于一种的器官或器官块的移植。例如，本发明考虑了包括肺（或肺块）和心脏（或心脏块）的移植。
定义
如本文使用的，术语“不良事件”是与医学产品的使用暂时相关的任何不利和非故意的体征（包括例如异常实验室发现）、症状或疾病，无论是否视为与医学产品相关。
如本文使用的，术语“动物”是指哺乳动物。在具体实施方案中，动物为至少六月龄。在某些实施方案中，动物活过断奶龄。在某些实施方案中，动物存活至达到育种年龄。本发明的动物是“遗传修饰的”或“转基因的”，这意指它们具有加入或掺入的转基因或其他外源DNA，或修饰包括靶向、重组、中断、缺失、破坏、替代、抑制、增强或以其他方式改变的内源基因，以介导在动物的至少一种细胞中且一般在动物的至少一种种系细胞内的基因型或表型效应。在一些实施方案中，动物可以具有在其基因组的一个等位基因上整合的转基因（杂合转基因的）。在其他实施方案中，动物可以具有在两个等位基因上的转基因（纯合转基因的）。
如本文使用的，术语“培育”或“育种”指任何繁殖方法，包括天然和人工方法。
如本文使用的，术语“育种群”或“生产群”是指由本发明方法产生的转基因动物群。在一些实施方案中，遗传修饰可以在动物中进行鉴定，所述动物随后一起培育，以形成具有所需遗传修饰组（或单遗传修饰）的动物群。参见WO 2012/112586; PCT/US2012/025097。这些后代可以进一步培育，以在其后代中产生不同或相同遗传修饰组（或单遗传修饰）。只要需要，关于具有所需遗传修饰的动物的这个育种循环就可以继续。在这个背景下的“群”可以包含随着时间过去产生的具有相同或不同的一种或多种遗传修饰的多代动物。“群”还可以指具有相同或不同的一种或多种遗传修饰的单代动物。
如本文使用的，术语“CRISPR”或“成簇规律间隔的短回文重复序列”、或“SPIDR”或“间隔区分散的直接重复序列”是指通常为特定细菌种类特异性的DNA基因座家族。CRISPR基因座包括在大肠杆菌中识别的不同类别的分散的短重复序列（SSR）（Ishino等人，J.Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]; 和Nakata等人，J. Bacteriol., 171:3553-3556[1989]），以及相关基因。CRISPR/Cas分子是功能性与真核RNA干扰类似的原核适应性免疫系统的组分，其使用RNA碱基配对以指导DNA或RNA裂解。指导DNA DSB需要两种组分：作为核酸内切酶发挥作用的Cas9蛋白，和有助于指导Cas9/RNA复合物靶向DNA序列的CRISPR RNA（crRNA）和示踪RNA（(tracrRNA)序列（Makarova等人，Nat Rev Microbiol, 9(6):467-477,2011）。单靶向RNA的修饰可以足以改变Cas蛋白的核苷酸靶。在一些情况下，crRNA和tracrRNA可以作为单cr/tracrRNA杂种被工程化以指导Cas9裂解活性（Jinek等人，Science, 337(6096):816-821, 2012）。CRISPR/Cas系统可以用于细菌、酵母菌、人以及斑马鱼，如他处所描述（参见例如Jiang等人，Nat Biotechnol, 31(3):233-239, 2013;Dicarlo等人，Nucleic Acids Res, doi:10.1093/nar/gkt135, 2013; Cong等人，Science, 339(6121):819-823, 2013; Mali等人，Science, 339(6121):823-826, 2013;Cho等人，Nat Biotechnol, 31(3):230-232, 2013; 和Hwang等人，Nat Biotechnol, 31(3):227-229, 2013）。
如本文使用的，术语“临床相关的免疫抑制方案”是指在如本文揭示的遗传修饰的猪的器官、组织或细胞移植后，给患者提供的临床可以接受的免疫抑制药物方案。测定临床关联性要求通常通过FDA平衡可以接受的危险与潜在利益进行的判断访问（judgmentcall），使得保持人安全，同时维持药物或治疗的功效。
如本文使用的，术语“组成型”启动子是指当操作性与编码或指定基因产物的多核苷酸连接时导致细胞中基因产物在细胞的大部分或所有生理条件下产生的核苷酸序列。
如本文使用的，术语“供体”意欲包括任何非人动物，其可以充当用于异种移植的供体器官、组织或细胞的来源。供体可以处于任何发育阶段，包括但不限于胎儿、新生儿、幼体和成体。
如本文使用的，核酸序列和动物有关的术语“内源”是指天然存在于所述动物基因组的任何核酸序列。内源核酸序列可以包括一种或多种基因序列、基因间序列、基因序列或基因间序列的部分，或它们的组合。
如本文使用的，术语“内皮特异性”、“内皮组织中的特异性转基因表达”、“内皮组织中特异性表达至少一种转基因”等，应当理解这些术语是指在内皮特异性调控元件的调控下的转基因，其允许转基因在内皮组织和/或细胞中的有限表达。转基因功能和表达限于内皮组织和/或细胞。
如本文使用的，术语“内皮”是由被覆内部体腔的薄的扁平细胞单层组成的中胚层起源的上皮。例如，心脏的浆膜腔或内部含有内皮细胞被覆，并且“血管内皮”是被覆血管的内皮。
如本文使用的，术语 “内皮特异性调控元件”等是指启动子、增强子或它们的组合，其中所述启动子、增强子或它们的组合驱动转基因在内皮组织和/或细胞中的有限表达。调控元件提供了限于内皮组织和/或细胞的转基因功能和表达。
如本文使用的，术语“增强子”是指旨在促进转基因以组织特异性方式表达增加的核苷酸构建体。增强子是急剧改变基因转录效率的外部元件（Molecular Biology of theGene, 第4版，第708-710页，Benjamin Cummings Publishing Company, Menlo Park, CA© 1987）。在某些实施方案中，在与增强子元件组合的启动子的调控下动物表达转基因。在一些实施方案中，启动子与增强子元件组合使用，所述增强子元件是与启动子固有结合或共定位的DNA的非编码或内含子区。
如本文使用的，“表达”是指自DNA模板转录多核苷酸的过程（诸如转录为mRNA或其他RNA转录物）和/或所转录的mRNA后续翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多肽源自基因组DNA，表达可以包括在真核细胞内剪接mRNA。
本发明广泛使用的术语“基因”是指DNA的与生物功能相关的任何片段。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需的调节序列。基因还可以包括非表达DNA片段，例如形成其他蛋白的识别序列的非表达DNA片段。基因可以获自多种来源，包括自感兴趣的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可以包括被设计成具有所需参数的序列。
如本文使用的。术语“基因编辑”是指其中使用基因编辑工具插入、置换或自基因组去除DNA的基因工程类型。基因编辑工具的示例包括但不限于锌指核酸酶、TALEN以及CRISPR。
如本文使用的，术语“基因编辑介导的”或相似术语是指涉及使用基因编辑/基因编辑工具的基因修饰（例如，缺失、取代、重排）。
如本文使用的，术语“基因敲除”是指破坏染色体基因座中编码的遗传信息而产生的遗传修饰。
如本文使用的，术语“基因敲入”是使用不同DNA序列置换染色体基因座中编码的遗传信息而产生的遗传修饰。
如本文使用的，术语“遗传修饰”是指核酸的一种或多种改变，所述核酸例如生物体基因组内的核酸。例如，遗传修饰可以指基因的改变、添加（即基因敲入）和/或缺失（例如基因敲除）。
如本文使用的，表达水平相关的术语“高”是指视为足以提供表型（可以检测的表达或治疗利益）的表达水平。通常，“高”水平的表达足以能够减少移植物排斥，包括超急性排斥（HAR）、急性体液异种移植物排斥（AHXR）、T细胞介导的细胞排斥和直接血液介导的炎症应答（IBMIR）。
如本文使用的，术语“同源性驱动的重组”或“同源性指导配对”或“HDR”用于指由DNA中双链断裂（DSB）的存在起始的同源重组事件（Liang 等人，1998），当与已知创造高效和靶向双链断裂的任何基因组编辑技术组合时HDR的特异性可以受调控，并且允许靶向细胞的基因组精确编辑，例如CRISPR/Cas9系统（Findlay 等人，2014; Mali 等人，February2014; 以及Ran 等人，2013）。
如本文使用的，术语“增强的同源性驱动的插入或敲入”被描述为插入DNA构建体，更具体地与同源臂侧接的大DNA片段或构建体或与双链断裂具有同源性的DNA片段，其利用同源性驱动的重组联合已知创造高效和靶向双链断裂的任何基因组编辑技术，并且允许靶向细胞基因组精确编辑，例如CRISPR/Cas9 系统（Mali 等人，Feb 2013）。
如本文使用的，术语“人源化”是指这样的核酸或蛋白质，即，其结构（即核苷酸或氨基酸序列）包含与在非人动物中天然存在的特定基因或蛋白质的结构基本或相同对应的部分，还包含不同于在相关特定非人基因或蛋白质中存在的而与相应的人基因或蛋白质中存在的相当结构较近似地对应的部分。在一些实施方案中，“人源化”基因是编码基本上具有人多肽的氨基酸序列的多肽的基因（例如，人蛋白质或其部分--例如，其特征性部分）。术语“超急性排斥”是指在移植之后最初24小时内发生或开始的移植材料或组织的排斥。
本文使用的术语“移植”（“implant”或 “transplant”或“graft”）应理解为是指在允许组织或器官变得血管化的条件下将组织或器官植入受试者，还指所植入（即“implanted”或“transplanted”或“grafted”）的组织或器官。有利于移植物在哺乳动物中血管化的条件包括在移植物部位具有广泛血管供应网络的集中的组织床。
如本文使用的，术语“免疫调节剂”是指具有调节免疫反应能力的转基因。在例示性实施方案中， 本发明所述的免疫调节剂可以为补体抑制剂或免疫抑制剂。在具体实施方案中，免疫调节剂是补体抑制剂。补体抑制剂可以为CD46（或MCP）、CD55 CD59和/或CRI。在一种具体实施方案中，可以表达至少两种补体抑制剂。在一种实施方案中，补体抑制剂可以为CD55和CD59。在另一种实施方案中，免疫调节剂可以为II类反式激活因子或其突变体。在某些实施方案中，免疫调节剂可以为II类反式激活因子显性失活突变体（CIITA-DN）。在另一种具体实施方案中，免疫调节剂为免疫抑制剂。免疫抑制剂可以为CTLA4-Ig。其他免疫调节剂可以选自但不限于CIITA-DN、PDL1、PDL2、或肿瘤坏死因子-α-相关凋亡诱导配体（TRAIL）、Fas配体（FasL、CD95L）、称为整联蛋白结合蛋白质（CD47）的CD47、HLA-E、HLA-DP、HLA-DQ、和/或HLA-DR。
如本文使用的，术语“可诱导性”启动子是在环境或发育调节下的启动子。
如本文使用的，术语“着陆台”或“工程化着陆台”是指包含由诸如位点特异性重组酶和/或靶向核酸内切酶的特异性多核苷酸修饰酶选择性结合和修饰的至少一种识别序列的核苷酸序列。通常，在待修饰的基因组中非内源性存在着陆台序列中的识别序列。靶向整合的速率可以通过选择用于高效核苷酸修饰酶的识别序列而改进，所述识别序列非内源性存在于靶向细胞的基因组中。选择非内源性存在的识别序列还减少潜在的脱靶整合。另一方面，使用细胞中天然的识别序列可以为合乎需要的。例如，在多重识别序列应用于着陆台序列中时，一种或多种可以为外源性，而一种或多种可以为天然的。多重识别序列可以存在于单着陆台，允许着陆台被两种或多种多核苷酸修饰酶顺序靶向，使得两种或多种独特序列可以被嵌入。可以选地，着陆台中的多重识别序列的存在允许多拷贝的相同序列被嵌入着陆台。着陆台可以包含至少一种识别序列。例如，外源性核酸可以包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或更多的识别序列。在包含多于一种的识别序列的实施方案中，所述识别序列可以为彼此独特的（即由不同多核苷酸修饰酶识别），相同的重复序列，或重复序列和独特序列的组合。任选地，着陆台可以包括编码诸如抗生素抗性基因、代谢性选择性标记或荧光素蛋白的选择性标记的一种或多种序列。还可以存在其他序列，例如转录调节和调控元件（即启动子、部分启动子、启动子包载、起始密码、增强子、内含子、隔离子以及其他表达元件）。
如本文使用的，术语 “大靶向载体”或“LTVEC”包括用于真核细胞的大靶向载体，其衍生自比通常旨在进行真核细胞中的同源基因靶向的其他方法使用的较大的克隆基因组DNA片段。LTVEC的实例包括但不限于细菌人工染色体（BAC）、人类人工染色体（HAC）以及酵母菌人工染色体（YAC）。
如本文使用的，术语“基因组座”或“基因座”（多基因座）是染色体上的基因或DNA序列的特定位置，可以包含特定基因的内含子和外显子。“基因”是指DNA或RNA的序列段，其编码在生物体中起到功能性作用并因此为活生物体中遗传分子单位的多肽或RNA链。出于本发明的目的，可以考虑基因包含调节基因产物产生的区域，不管所述调节序列是否侧接编码和/或转录序列。因此，基因包括但不一定限于内含子、外显子、启动子序列、终止子、诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点的翻译调节序列、增强子、沉默子、隔离子、边界元件、5’或3’ 调节序列、复制起点、基质附着位点以及基因座调控区。
如本文使用的，术语“肺移植”是指其中患者的病肺被来自供体的肺部分或全部代替的外科操作。肺移植可以为其中受体两侧肺中仅一侧肺被来自供体的单个肺代替的“单”肺移植，或其中涉及去除两侧（每侧一个）肺并使用来自供体的肺代替两侧肺的“双”肺移植。在某些实施方案中，将肺与心脏一起移植。
如本文使用的，术语“肺维持”是指从肺获取时起直至发生受体中的移植维持和保护供体肺的过程。
如本文使用的，本发明使用的术语“移植功能丧失”是指供体动物中器官或组织表现出正常过程的任何生理破坏或机能障碍。
如本文使用的，术语“哺乳动物”是指任何非人哺乳动物，包括但不限于猪、绵羊、山羊、牛（牛科）、鹿、骡、马、猴、犬、猫、大鼠和小鼠。在某些实施方案中，所述动物是至少300磅的猪动物。在具体实施方案中，哺乳动物是母猪并已经生育至少一次。在某些实施方案中，哺乳动物是非人灵长类动物，例如猴或狒狒。
如本文使用的，术语“标记”或“选择性标记”是允许从群体中大多数受处理的细胞分离稀少的表达标记的转染细胞的筛选标记。所述标记的基因包括但不限于新霉素磷酸转移酶和潮霉素B磷酸转移酶，或诸如GFP的荧光蛋白。
如本文使用的，术语“核苷酸”、“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”以及“寡核苷酸”可以互换使用。它们是指任何长度核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或它们的类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，可以发挥任何功能，这些是已知或未知的。下列是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或肺编码区，从连锁分析定义的一个或多个基因座，外显子，内含子，信使RNA（mRNA），转移RNA，核糖体RNA，短干扰RNA（siRNA），短发夹RNA（shRNA），微小RNA（miRNA），核酶，cDNA，重组多核苷酸，分枝多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离DNA，任何序列的分离RNA，核酸探针，以及引物。此术语还包括具有合成骨架的核酸样结构，见例如，Eckstein, 1991; Baserga等人，1992; Milligan,1993; WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, 1997; Strauss-Soukup, 1997; andSamstag, 1996。多核苷酸可以包括一种或多种修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。可以在聚合物装配之前赋予对核苷酸结构的修饰（如果存在的话）。核苷酸序列可以通过非核苷酸组分间断。多核苷酸可以进一步在聚合之后被修饰，例如通过使用标记组分缀合。
如本文使用的，术语“操作性连接”包括其中组分以预期方式操作性连接功能的关系。在一种情况下，编码蛋白质的核酸序列可以操作性连接调节序列（例如启动子、增强子、沉默序列等）以保持合适的转录调节。
本文使用的术语“器官”是指以结构单位连接以发挥共同功能的组织集合体。器官可以为实体器官。实体器官是具有固定组织一致性的内脏器官，非中空（例如胃肠道器官）也非液体（例如血液）。实体器官的实例包括心脏、肾、肝、肺、胰腺、脾以及肾上腺。
如本文使用的，术语“灵长类动物”是指灵长目的多种哺乳动物，其由狐猴、懒猴、新世界猴、旧世界猴以及猿包括人类组成，通过手和足上的指甲（趾甲）、短吻以及大脑表征。在某些实施方案中，灵长类动物是非人灵长类动物。在其他实施方案中，灵长类动物是人类。
如本文使用的，术语“启动子”是指至少部分调控转录的起始和水平的DNA区，通常是编码区的上游（5'）。本文以其最广泛背景提及“启动子”，包括传统基因组基因的转录调节序列，包括TATA盒或非TATA盒启动子，以及响应发育和/或环境刺激或以组织特异性或细胞类型特异性方式改变基因表达的另外的调节元件（即激活序列、增强子以及沉默子）。启动子通常但非必定位于其所调节表达的结构基因的上游或5'。另外，包含启动子的调节元件通常位于基因转录起始位点的2 kb内，但是它们还可以为许多kb之远。启动子可以含有另外的特异性调节元件，其位于起始位点更远的位置以进一步增强细胞内的表达，和/或改变其操作性连接的结构基因表达的时限或可诱导性。
如本文使用的，术语“猪”、“猪动物”、“猪”和“猪类”是指相同类型动物的一般术语，与性别、大小或品种无关。
如本文使用的，术语“识别位点”或“识别序列”是指由结合和指导DNA骨架位点特异性裂解的核酸酶或其他酶识别的特异性DNA序列。
如本文使用的，术语“重组位点”是指由位点特异性重组酶识别和可以用作重组事件基质的核苷酸序列。
如本文使用的，术语“调节元件”和“表达调控元件”可以互换使用，是指可以在特定环境中影响操作性连接的编码序列的转录和/或翻译的核酸分子。这些术语被广义使用，涵盖启动或调节转录的所有元件，包括启动子、用于RNA聚合酶和转录因子基础相互作用的核心元件、上游元件、增强子以及应答元件（参见例如Lewin, "Genes V" (OxfordUniversity Press, Oxford)，第847-873页）。原核细胞中的例示性调节元件包括启动子、操作序列和核糖体结合位点。用于真核细胞的调节元件可以包括但不限于启动子、增强子、剪接信号和多腺苷酸化信号。
如本文使用的，术语“可调节性启动子”是指可以调节动物、组织或器官中肽是否表达的启动子。可调节性启动子可以为组织特异性和仅在特异性组织中表达，或短暂可调节性（在发育期驱动的特定时间启动），或可诱导性，使得仅由可以诱导元件调控下启动或关闭（表达或不表达）（还可以为诸如免疫可以诱导启动子和细胞因子应答启动子的可以诱导启动子，例如受干扰素γ、TNF-α、IL-1、IL-6或TGF-β诱导）。例如，当器官或组织为猪的部分时可以阻止表达，但一旦猪已被移植至人，则诱导表达一段时间以克服细胞免疫应答。另外，表达水平可以受可调节性启动子系统调控以确保不发生受体免疫系统的免疫抑制。
如本文使用的，术语“调节序列”、“调节元件”以及“调控元件”可以互换使用，是指处于待表达的多核苷酸靶的上游（5'非编码序列）、内部或下游（3'非翻译序列）的多核苷酸序列。调节序列影响例如转录的时限、转录的量或水平、RNA加工或稳定性、和/或相关结构核苷酸序列的翻译。调节序列可以包括激活因子结合序列、增强子、内含子、多腺苷酸化识别序列、启动子、阻抑物结合序列、茎-环结构、翻译起始序列、翻译前导序列、转录终止序列、翻译终止序列、引物结合位点等。
本文使用的术语“安全港”基因座是指基因组中的位点，其中可以无损伤添加转基因DNA（例如构建体）并产生水平一致的表达。在某些实施方案中，本发明涉及转基因DNA的掺入和表达，包括安全港基因座内的转基因的掺入和表达。
如本文使用的，术语“位点特异性重组酶”是指可以有利于“重组位点”之间重组的酶组，其中两个重组位点在单核酸分子内被物理分开或位于分开的核酸分子上。“位点特异性重组酶”的实例包括但不限于phiC31、att、Bxb1、R4（整合酶）和/或Cre、Flp和Dre重组酶。
如本文使用的，术语“受试者”是指任何动物（例如哺乳动物），包括但不限于人类、非人灵长类动物、啮齿类动物等（例如，有待为特定治疗（例如移植）的受体，或为移植的供体）。除非本文另有指明（例如其中受试者为移植供体），涉及人受试者的术语“受试者”和“患者”可以互换使用。
如本文使用的，术语“靶向载体”是指重组DNA构建体，其通常包含与侧接靶基因或靶序列的关键元件的基因组DNA具有同源性的剪接DNA臂。当靶向载体被引入细胞中时，其通过同源重组整合至细胞基因组中。“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列，即，当操作性连接编码或指定基因产物的多核苷酸时导致细胞内显著产生基因产物，只要所述细胞是对应于启动子的组织类型的细胞。
如本文使用的，术语“组织”是指细胞与器官之间细胞组织水平中间物。组织是来自相同起源一起发挥特定功能的相似细胞总体。然后通过多个组织功能性聚集形成器官。本发明考虑的组织的实例包括但不限于结缔组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织以及矿化组织。血液、骨骼、腱、韧带、脂肪以及蜂窝组织为结缔组织的实例，其还可以被分为纤维结缔组织、骨骼结缔组织以及流体结缔组织。肌肉组织被分为三种不同类别：内脏或平滑肌，存在于器官内壁；骨骼肌，通常附着于骨骼，产生大幅度运动；以及心肌，存在于心脏，其收缩以将血液泵出通过生物体。包含中枢神经系统和外周神经细胞的细胞被归类为神经的（或神经）组织。在中枢神经系统中，神经组织形成脑和脊髓。在外周神经系统中，神经组织形成脑神经和脊神经，包括运动神经元。
本文使用的术语“转录激活子样效应物核酸酶”或“TALEN”是指通过将TAL效应物DNA结合结构域与DNA裂解结构域融合而产生的人工限制性酶。这些试剂使得进行有效、可以程序化和特异性的DNA裂解，表现为用于原位基因组编辑的有力工具。类转录激活因子效应物（TALE）可以被快速工程化以实际结合任何DNA序列。如本文所使用的，术语TALEN是广义的，包括可以裂解双链DNA而不借助于另一个TALEN的单体TALEN。术语TALEN还用于指被工程化以一起工作以在相同位点裂解DNA的TALEN对的一个或两个成员。一起工作的TALEN可以被称为左TALE和右TALE，参考DNA的左利或右利。参见美国序列号12/965,590; 美国序列号13/426,991 (美国专利号8,450,471); 美国序列号13/427,040 (美国专利号8,440,431); 美国序列号13/427,137 (美国专利号8,440,432); 以及美国序列号13/738,381，所有这些文献通过引用整体并入本文。
如本文使用的，术语“转染”或“转化”或“转导”是指外源性核酸被转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”细胞是被使用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括受试者原代细胞及其子代。
“转基因”是已从一种生物转移到另一种生物的基因或遗传材料。当转基因被转移至生物中时，则该生物可以被称为转基因生物。通常，该术语描述含有基因序列的DNA区段，所述基因序列已从一种生物中分离且引入不同生物内。DNA的这个非天然区段可以保留转基因生物中产生RNA或蛋白质的能力，或其可以改变转基因生物的遗传密码的正常功能。通常，将DNA掺入生物种系内。例如，在高等脊椎动物中，这可以通过将外源DNA注射到受精卵的核内或通过体细胞核转移来完成，在所述体细胞核转移中，将具有所需转基因掺入宿主基因组的体细胞转移至去核的卵母细胞，导致在移植至代理母亲之后产生活的子代。当插入细胞内时，转基因可以为作为mRNA（信使RNA）的拷贝的cDNA（互补DNA）区段，或停留在基因组DNA的原始区域中的基因自身。转基因可以为基因组序列，特别是当作为大克隆引入BAC（细菌人工染色体）或粘粒中时，或者转基因可以为“小基因”形式，其常通过基因组DNA（包括内含子区，例如内含子1）、5’或3’调节区连同cDNA区的组合来表征。除非另有说明，在本说明书的背景中的转基因“表达”意指来自非天然核酸的肽序列在宿主中的至少一种细胞中表达。肽可以由掺入宿主基因组中的转基因表达。转基因可以包含编码蛋白质或其片段（例如功能性片段）的多核苷酸。蛋白质片段（例如功能性片段）可以包含至少或至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或99% 的蛋白质氨基酸序列。蛋白质片段可以为蛋白质的功能性片段。蛋白质的功能性片段可以保持蛋白质的部分或所有功能。
如本文使用的，术语“移植耐受”被定义为无需进行药理学免疫抑制的供体特异性无应答。移植耐受可以消除许多与免疫抑制剂相关的副作用。这样，诱导耐受可以导致异种移植接受性改进。在一种实施方案中，诱导耐受可以通过异种移植排斥的临床症状减轻得以鉴定。在另一种实施方案中，诱导耐受可以缓解或预防与异种移植相关的代谢性、炎症性以及增殖性病症或疾病。在又另一种实施方案中，诱导耐受可以缓解或减轻或预防与用于预防异种移植排斥的施用免疫抑制治疗相关的不良临床病症或疾病。在还另一种实施方案中，诱导耐受可以促进异种移植物存活。在不同的实施方案中，诱导耐受可以预防表现这些疾病或病症的患者的复发。
术语“有蹄动物”指有蹄的哺乳动物。偶蹄动物是偶数蹄（偶蹄的）有蹄动物，包括羚羊、骆驼、牛、鹿、山羊、猪和绵羊。奇蹄动物是奇数蹄有蹄动物，这包括马、斑马、犀牛和貘。如本文使用的，术语有蹄动物是指成体、胚胎或胎儿有蹄动物。
如本文使用的，术语“载体”是指能够将多核苷酸转移至宿主细胞的部分。载体包括但不限于单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离端、无游离端（例如环状）的核酸分子；包含DNA、RNA或二者的核酸分子；本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，是指环状双链DNA环，其中可以通过例如标准分子克隆技术插入另外的DNA片段。另一种类型的载体是病毒载体，其中载体中存在病毒衍生的DNA或RNA序列用于包装进病毒（例如，逆转录病毒、复制缺陷逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷腺病毒以及腺病毒相关病毒）。病毒载体还包含由病毒携带的用于转染至宿主细胞中的多核苷酸。某些载体能够在其所引入的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其他载体（例如非附加型哺乳动物载体）当引入宿主细胞时被整合至宿主细胞基因组中，由此与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导其操作性连接的基因的表达。本文中这样的载体被称为“表达载体”。重组DNA技术中具有实用性的常用表达载体通常为质粒形式。重组表达载体可以包含适于宿主细胞中核酸表达的形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包含一种或多种调节元件，可以基于待用于表达的宿主细胞进行选择，操作性连接待表达的核酸序列。在重组表达载体中，“操作性连接”意指目的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式连接调节元件（例如，在体内转录/翻译系统中或当载体引入宿主细胞中时在宿主细胞中）。关于重组和克隆方法，提及美国专利申请序列号10/815,730，其内容通过引用整体并入本文。优选地，所述载体是DNA载体，更优选地，根据本发明能够表达编码蛋白质的RNA。本领域记载了许多种合适的载体，其实例可以参见分子克隆：实验室手册，第2版，Sambrook等，1989, 冷泉港实验室出版社，或分子克隆：实践方法, 卷II:表达系统, D. M. Glover 编辑（IRL Press, 1995）。
如本文使用的，术语“锌指核酸酶”或“ZFN”是指包含锌指DNA结合结构域和DNA裂解结构域的人工（工程化）DNA结合蛋白。锌指结构域可以被工程化以靶向特定的所需DNA序列，这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。它们通过在用户特定部位的DNA中产生双链断裂而有利于基因组的靶向编辑。各ZFN包含两个功能性结构域：a.) DNA结合结构域，其包含两指模块的链，各模块识别DNA的独特六聚物（6 bp）序列。两指模块被缝在一起形成锌指蛋白，各模块具有≥ 24 bp的特异性。b.) DNA裂解结构域，其包含Fok I的核酸酶结构域。当DNA结合结构域和DNA裂解结构域融合在一起时，产生“基因组剪”的高特异性对。ZFN是基因编辑工具。
A. 转基因动物
本发明提供一种转基因动物（例如转基因猪动物），所述转基因动物用作用于异种移植供体的器官、器官块、组织或细胞的来源。本发明延伸至源自所述转基因动物以及所述动物的群、例如生产群的器官、组织及细胞。
所述动物可以为任何合适的动物。在例示性实施方案中，所述动物是有蹄动物，更具体地，猪动物或猪。
所述转基因供体动物（例如有蹄动物、猪动物或猪）被遗传修饰，更具体地，包含多重转基因，例如，在单基座的多重转基因。在某些实施方案中，转基因供体动物被遗传修饰以表达第一基因座（即基因座1）和第二基因座（即基因座2）之间分隔的多重转基因。
基因座可以为天然或修饰的天然基因座。本文描述了多种用于修饰天然基因座以有利于靶向的策略。
在例示性实施方案中，本发明提供一种转基因动物（例如转基因猪动物），所述转基因动物包含在至少两种启动子（例如外源性启动子，或外源性启动子和天然启动子的组合）调控下在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中，所述猪缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达。任选地，所述转基因动物包含一种或多种另外的遗传修饰，包括但不限于基因添加和/或缺失，包括敲除和敲入，以及基因取代和重排。
在一种具体实施方案中，本发明提供一种转基因猪动物，所述转基因猪动物包含在单基因座掺入和表达的至少四种转基因，其中所述至少四种转基因的表达受专属的启动子调控，即，一种启动子驱动各单独的转基因的表达。例如，当所述转基因动物在单基因座掺入和表达四种转基因时，那些转基因的表达受四种启动子驱动，其中各启动子对于具体的转基因具有特异性。在可选的实施方案中，给定的启动子调控超过一种转基因（例如两种转基因、三种转基因）的表达。例如，当所述转基因动物掺入和表达四种转基因时，所述四种转基因中的两种作为第一启动子调控的多顺反子表达，而所述四种转基因中的另两种则作为第二启动子调控的多顺反子表达。
在例示性实施方案中，所述至少四种转基因选自免疫调节剂（例如免疫抑制剂）、抗凝剂、补体抑制剂以及细胞保护转基因组成的组。
在例示性实施方案中，所述单基因座是天然基因座。在其他实施方案中，所述单基因座是修饰的天然基因座，例如转基因的基因座。所述转基因座可以为，例如包含选择性标记基因的基因座或包含着陆台的基因座。
在例示性实施方案中，所述至少四种转基因以多顺反子载体（MCV）提供，通过随机整合或利用基因编辑工具而掺入。任选地，所述转基因动物可以具有一种或多种另外的遗传修饰。另外的遗传修饰可以为，例如基因敲除或基因敲入。在具体实施方案中，另外的遗传修饰包括嵌合猪-人vWF。
在另一种实施方案中，本发明提供一种转基因动物（例如猪），所述转基因动物包含至少五种遗传修饰，导致(i) 缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达（即αGal无），和(ii) 在单基因座掺入和表达至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种转基因。所述转基因的表达受启动子驱动，所述启动子为专属启动子或调控两种或更多种转基因表达的启动子。所述启动子可以为外源性启动子或外源性启动子和天然启动子的组合。
在某些实施方案中，如果多于四种添加的转基因，可能涉及在多于一种的基因座上掺入转基因，以更好地调控转基因组合的表达（例如，在GGTA1整合的至少两种启动子调控下整合至少四种转基因，和在第二基因座（例如 CMAH或ß4GalNT2或AAVS1或Rosa26）的第二多顺反子整合）。在其中第二基因座被遗传修饰的某些实施方案中，所述第二基因座可以被修饰以灭活另一种猪基因表达（例如通过应用基因编辑和/或同源重组技术）。在例示性实施方案中，在第二基因座掺入和表达的多重转基因选自免疫调节剂、补体抑制剂、抗凝剂以及细胞保护转基因组成的组。在例示性实施方案中，所述第二基因座是天然基因座、修饰的天然基因座或转基因的基因座（例如着陆台）。在例示性实施方案中，所述第二基因座的至少两种转基因以MCV提供，并利用基因编辑工具掺入。任选地，所述转基因动物可以具有一种或多种另外的遗传修饰。
在一种实施方案中，本发明提供一种转基因动物（例如猪），所述转基因动物包含至少四种遗传修饰，导致(i) α 1,3半乳糖基转移酶表达减少，和(ii) 在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中所述四种转基因在至少两种启动子（例如外源性启动子，或外源性启动子和天然启动子的组合）的调控下表达。在例示性实施方案中，所述转基因选自免疫调节剂、抗凝剂、补体抑制剂以及细胞保护转基因组成的组。在例示性实施方案中，所述单基因座是天然基因座、修饰的天然基因座或转基因的基因座（例如着陆台）。在例示性实施方案中，至少两种转基因以MCV提供并利用提高同源重组或同源独立性配对效率的基因编辑工具（例如，CRISPR/cas9、TALEN或ZFN）掺入。任选地，所述转基因动物具有一种或多种另外的遗传修饰。
在另一种实施方案中，本发明提供一种转基因动物（例如猪），所述转基因动物包含至少五种遗传修饰，导致(i) 缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达（即αGal无），和(ii) 在单基因座或两个基因座间隔掺入和表达至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种转基因。在例示性实施方案中，所述转基因选自免疫调节剂、抗凝剂、补体抑制剂以及细胞保护转基因组成的组。在例示性实施方案中，所述单基因座是天然基因座、修饰的天然基因座或转基因的基因座（例如着陆台）。在例示性实施方案中，至少两种转基因以MCV提供并利用提高同源重组或同源独立性配对效率的基因编辑工具（例如，CRISPR/cas9、TALEN或ZFN）掺入。任选地，所述转基因动物具有一种或多种另外的遗传修饰。
在例示性实施方案中，所述转基因动物缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达（即αGal无），并且包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或更多种遗传修饰。任选地，除了转基因整合之外，另外的敲除还包括ß4GalNT2基因或CMAH基因敲除（因为先天性免疫和异种移植排斥而涉及的两种基因）。
在例示性实施方案中，所述转基因动物的α 1,3半乳糖基转移酶表达减少，并且包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或至少七种另外的遗传修饰。
在某些实施方案中，α 1,3半乳糖基转移酶的表达减少约10 %、约 20%、约 30%、约40%、约 50%.、约 60%、约 70%、约 80%、约 90%或约 95%。
在例示性实施方案中，所述转基因动物包含：(i) 导致α 1,3半乳糖基转移酶表达缺乏的遗传修饰，和(ii) 至少四种另外的遗传修饰，或更具体地四种另外的遗传修饰。这些另外的遗传修饰可以为任何合适的遗传修饰，包括但不限于CRISPR诱导的缺失/插入或基因取代（INDEL），包括在其他基因座（例如B4GalNT2、CMAH、vWF）敲除或敲入。
在例示性实施方案中，所述转基因动物包含：(i) 导致α 1,3半乳糖基转移酶表达减少的遗传修饰，和(ii) 至少四种另外的遗传修饰，或更具体地四种另外的遗传修饰。
在例示性实施方案中，所述转基因动物包含：(i) 导致α 1,3半乳糖基转移酶表达缺乏的遗传修饰，和(ii) 至少五种另外的遗传修饰，或更具体地五种另外的遗传修饰。
在例示性实施方案中，所述转基因动物包含：(i) 导致α 1,3半乳糖基转移酶表达减少的遗传修饰，和(ii) 至少五种另外的遗传修饰，或更具体地五种另外的遗传修饰。
在例示性实施方案中，所述转基因动物包含：(i) 导致α 1,3半乳糖基转移酶表达缺乏的遗传修饰，和(ii) 至少六种另外的遗传修饰，或更具体地六种另外的遗传修饰。
在例示性实施方案中，所述转基因动物包含：(i) 导致α 1,3半乳糖基转移酶表达减少的遗传修饰，和(ii) 至少六种另外的遗传修饰，或更具体地六种另外的遗传修饰。
在一种具体实施方案中，所述供体动物（例如有蹄动物、猪动物或猪）包含导致如下结果的遗传修饰：(i) α 1,3半乳糖基转移酶表达缺乏，和(ii) 掺入和表达至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种或更多种转基因。
在例示性实施方案中，本发明提供一种猪动物，所述猪动物包含导致如下结果的遗传修饰：(i) α 1,3半乳糖基转移酶表达缺乏，和(ii) 掺入和表达至少四种另外的转基因。
在例示性实施方案中，本发明提供一种猪动物，所述猪动物包含导致如下结果的遗传修饰：(i) α 1,3半乳糖基转移酶表达缺乏，和(ii) 掺入和表达至少五种另外的转基因，或更具体地五种另外的遗传修饰。
在例示性实施方案中，本发明提供一种猪动物，所述猪动物包含导致如下结果的遗传修饰：(i) α 1,3半乳糖基转移酶表达缺乏，和(ii) 掺入和表达至少六种另外的转基因，或更具体地六种另外的遗传修饰。
在一种具体实施方案中，所述供体动物（例如有蹄动物、猪动物或猪）包含导致如下结果的遗传修饰：(i) α 1,3半乳糖基转移酶表达减少，和(ii) 掺入和表达至少四种、至少五种或至少六种或更多种转基因，或更具体地四种、五种、或至少六种另外的转基因。
在一种例示性实施方案中，所述供体动物（例如有蹄动物、猪动物或猪）包含导致如下结果的遗传修饰：(i) α 1,3半乳糖基转移酶表达减少，和(ii) 掺入和表达五种另外的转基因。任选地，所述供体动物可以包含更多种另外的遗传修饰。
在一种例示性实施方案中，所述供体动物（例如有蹄动物、猪动物或猪）包含导致如下结果的遗传修饰：(i) α 1,3半乳糖基转移酶表达减少，和(ii) 掺入和表达六种另外的转基因。任选地，所述供体动物可以包含一种或多种另外的遗传修饰（敲除、敲入、INDEL、猪vWF修饰）。
B. 转基因表达
所述转基因的表达可以为任何水平，但在具体实施方案中，表达为高水平。
根据所需的水平和组织特异性表达，可以使用多种启动子/增强子元件。根据所需表达模式，启动子/增强子可以为组成型或可诱导性。启动子可以为外源性或天然启动子，或外源性和天然启动子的组合。
在某些实施方案中，所述转基因由组成型或遍在性启动子表达。在某些其他实施方案中，所述转基因由组织特异性或细胞类型特异性启动子、或可诱导性启动子表达，并且可以包括另外的调节元件，例如增强子、隔离子、基质附着区（MAR）等。
在例示性实施方案中，所述四种或更多种转基因为共表达。在例示性实施方案中，所述四种或更多种转基因以接近的分子当量表达。
在例示性实施方案中，所述转基因由主要在内皮细胞中具有活性的启动子表达。在某些实施方案中，所述转基因的表达由猪Icam-2增强子/启动子调控。
在某些实施方案中，所述转基因的表达由组成型CAG启动子调控。
在某些实施方案中，所述转基因动物被遗传修饰以导致掺入和表达两种或更多种转基因，其中至少一种转基因受组成型启动子调控，至少一种转基因由组织特异性启动子、更具体地主要在内皮细胞中具有活性的启动子调控。
在例示性实施方案中，所述转基因动物被遗传修饰以导致在单基因座掺入和表达四种或更多种转基因，其中至少一种转基因受组成型启动子调控，至少一种转基因由组织特异性启动子、更具体地主要在内皮细胞中具有活性的启动子调控。
所述转基因可以为适用于修饰用于异种移植的供体动物（例如猪动物）的任何转基因。在例示性实施方案中，所述转基因选自免疫调节剂（例如补体调节剂、补体抑制剂、免疫抑制剂）、抗凝剂、细胞保护基因或它们的组合。在某些实施方案中，所述转基因的序列为人序列。
在某些实施方案中，所述转基因是免疫调节剂。
在某些实施方案中，所述转基因是补体调节剂，或更具体地补体抑制剂。所述补体抑制剂可以包括但不限于CD46 (MCP)、CD59或CR1。补体抑制剂的序列可以为人序列。
在某些实施方案中，所述转基因是补体途径抑制剂（即补体抑制剂）的抑制剂。所述补体抑制剂可以包括但不限于CD55、CD59、CR1以及CD46 (MCP)。所述补体抑制剂的序列可以为人序列。
在某些实施方案中，所述转基因是免疫抑制剂。
补体抑制剂可以为人CD46（hCD46），其中表达通过小基因构建体（参见Loveland等人，Xenotransplantation，11（2）:171-183. 2004）。
在某些实施方案中，转基因为具有T细胞介导的效应例如CTLA4-Ig的免疫抑制剂基因，或II类MHC（CIITA）的显性失活抑制剂，或调节B细胞或T细胞介导的免疫功能的表达的其他基因。在进一步的实施方案中，此类动物可以进一步修饰，以消除影响免疫功能的基因的表达。在某些实施方案中，免疫抑制剂是CD47。
在某些实施方案中，转基因是抗凝剂，所述抗凝剂可以包括但不限于组织因子途径抑制剂（TFPI）、水蛭素、血栓调节蛋白（TBM）、内皮蛋白C受体（EPCR）和CD39。抗凝剂的序列可以为人序列。
所述转基因动物还可以包含一种或多种另外的遗传修饰。
在一种实施方案中，所述动物可以被遗传修饰，以抑制CMP-Neu5Ac羟化酶基因（CMAH）（参见例如，美国专利公开2005-0223418）、iGb3合酶基因（参见例如，美国专利公开2005-0155095）和/或Forssman合酶基因（参见例如，美国专利公开2006-0068479）的表达。此外，动物可以进行遗传修饰，以减少促凝血剂的表达。特别地，在一种实施方案中，动物进行遗传修饰，以减少或消除促凝血剂例如FGL2（纤维蛋白原样蛋白质2）基因的表达（参见例如，Marsden等人（2003）J din Invest. 112:58-66；Ghanekar等人（2004）J Immunol. 172:5693-701；Mendicino等人（2005）Circulation.112:248-56；Mu等人（2007）PhysiolGenomics. 31（1）:53-62）。
在另一种实施方案中，所述动物可以被遗传修饰以抑制ß-1,4 N-乙酰半乳糖胺基转移酶2（ß4GalNT2）的表达。
C. 特异性遗传学
1. α 1,3半乳糖基转移酶（αGal）
在一种实施方案中，本发明提供了一种适合用作异种移植器官、组织和细胞来源的转基因动物，其中所述供体动物缺乏αGal表达，或其表达减少。缺乏αGal表达（即αGal无）的转基因动物具有一种或多种另外的遗传修饰，在某些实施方案中至少四种另外的遗传修饰、至少五种另外的遗传修饰或至少六种另外的遗传修饰。这些遗传修饰可以为例如掺入或表达转基因。在一种具体的实施方案中，所述转基因动物具有至少三种遗传修饰，导致(i) αGal表达缺乏，和(ii) 在单基因座掺入和表达至少两种转基因。在某些实施方案中，所述单基因座是修饰的αGal。
已实施多种策略以消除或调节由异种移植引起的抗Gal体液应答，包括表位由α-半乳糖苷酶的酶促去除（Stone等人，Transplantation 63：640-645，1997）、特异性抗gal抗体去除（Ye等人，Transplantation 58：330-337,1994）、表位由其他碳水化合物部分的戴帽，这未能消除αGT表达（Tanemura等人，J. Biol. Chem. 27321：16421-16425，1998和Koike等人，Xenotransplantation 4：147-153，1997）和补体抑制蛋白质的诱导（Dalmasso等人，Clin.Exp.Immunol. 86:31-35，1991，Dalmasso等人Transplantation 52:530-533（1991））。C. Costa等人（FASEB J 13，1762（1999））报道在转基因猪中αGT的竞争性抑制导致表位数目中的仅部分减少。类似地，S. Miyagawa等人（J. Biol. Chem 276，39310（2000））报道封闭N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III转基因猪中的gal表位表达的尝试，还导致gal表位数目的仅部分减少，且未能显著延长灵长类动物受体中的移植物存活。
在猪细胞和活动物中αGal基因座的单等位基因敲除已得到报道。Denning等人（Nature Biotechnology 19：559-562，2001）报道在绵羊中αGT基因的一个等位基因的靶向基因缺失。Harrison等人（Transgenics Research 11：143-150，2002）报道杂合αGT敲除体细胞猪胎儿成纤维细胞的产生。在2002年，Lai等人（Science 295：1089-1092，2002）和Dai等人（Nature Biotechnology 20：251-255，2002）报道猪的产生，其中αGT基因的一个等位基因被成功致使失活，且其中αGal的失活通过标记基因新霉素磷酸转移酶（Neo）的靶向插入进行，其破坏αGal基因编码区（Ramsoondar等人（Biol of Reproduc 69，437-445（2003））报道还表达人α-1,2-岩藻糖基转移酶（HT）的杂合αGT敲除猪的生成，其表达HT和αGal表位。给予The Curators of the University of Missouri的PCT公开号WO 03/055302证实用于在异种移植中使用的杂合αGal敲除微型猪的产生，其中与野生型比较，在敲除猪中功能αGT的表达减少。
Austin Research Institute的PCT公开号WO 94/21799和美国专利号5,821,117；Bresatec的PCT公开号WO 95/20661；和BioTransplant，Inc.和The General HospitalCorporation的PCT公开号WO 95/28412、美国专利号6,153,428、美国专利号6,413,769和US公开号2003/0014770提供了基于αGT基因的cDNA产生αGT阴性猪细胞的讨论。在异种移植领域中的近期重大突破是缺乏αGal的任何功能表达的首批活猪的产生（Phelps等人Science299:411-414（2003）；还参见Revivicor，Inc.的PCT公开号WO 04/028243和ImmergeBiotherapeutics，Inc.的PCT公开号WO 04/016742）。
在一种实施方案中，提供来自包含至少四种转基因的动物的动物（及源于所述动物的器官、组织和细胞），其中所述四种转基因在至少两种启动子的调控下在单基因座掺入和表达，其中所述猪缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达。在一种例示性实施方案中，在修饰的αGal基因座掺入和表达转基因。在某些实施方案中，所述至少两种启动子为外源性启动子，天然启动子、或外源性启动子和天然启动子的组合。
在一种实施方案中，提供如下的动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞）：(i) 缺乏功能性αGal的任何表达，和(ii) 在单基因座掺入和表达至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种或更多种转基因。在一种例示性实施方案中，在修饰的αGal基因座掺入和表达所述转基因。
在某些实施方案中，所述动物可以包含一种或多种另外的遗传修饰。这些遗传修饰可以导致在相同基因座或不同基因座掺入和表达一种或多种另外的转基因。
在一种实施方案中，提供功能性αGal的任何表达缺乏及掺入和表达至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种另外的转基因的动物（及源自所述动物的器官、组织以及细胞）。
在另一种实施方案中，提供具有功能性αGal表达水平减少及掺入和表达至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种另外的转基因的动物、器官、组织以及细胞。功能αGal的表达可以减少例如至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％。
功能αGT表达缺乏或水平减少可以通过任何合适的方法来实现。在一种实施方案中，提供了其中αGal基因的一个等位基因经由遗传靶向事件灭活的动物（例如，有蹄动物、猪动物）。在另一种实施方案中，提供了其中αGal基因的两个等位基因经由遗传靶向事件灭活的猪动物。在一种实施方案中，基因可以经由同源重组靶向。在其他实施方案中，基因可以为被破坏的，即遗传编码的部分可以被改变，从而影响那个基因区段的转录和/或翻译。例如，基因的破坏可以通过置换、缺失（“敲除”）或插入（“敲入”）技术出现，包括破坏αGal基因编码区的择性标记基因（例如neo）的靶向插入。可以插入关于所需蛋白质的另外基因或调节现有序列转录的调节序列。
在某些实施方案中，αGal基因的等位基因是致使失活的，从而使得所得到的αGal酶可以不再在细胞表面上生成Gal。在一种实施方案中，αGal基因可以转录成RNA，但不翻译成蛋白质。在另一种实施方案中，αGal基因可以以截短形式转录。此类截短的RNA可以不被翻译或可以翻译成无功能的蛋白质。在一种可选的实施方案中，αGal基因可以以这样的方式灭活，使得不出现基因的转录。在一种进一步的实施方案中，αGal基因可以被转录且随后翻译成无功能的蛋白质。
在一些实施方案中，活性αGal基因的表达可以通过使用替代方法减少，例如靶向基因转录或翻译的那些。例如，表达可以通过使用靶向天然αGT基因或其mRNA的反义RNA或siRNA得到减少。在其他实施方案中，位点特异性重组酶用于靶向基因组的区域用于重组。此类系统的实例是CRE-lox系统和Flp-Frt系统。
具有αGal基因的两个失活等位基因的猪不是天然存在的。先前发现在通过遗传靶向事件尝试敲除αGal基因的第二个等位基因时，鉴定了阻止第二个等位基因产生功能性αGal酶的点突变。
因此，在本发明的另一个方面，αGal可以通过至少一个点突变致使失活。在一种实施方案中，αGal基因的一个等位基因可以通过至少一个点突变致使失活。在另一种实施方案中，αGal基因的两个等位基因均可以通过至少一个点突变致使失活。在一种实施方案中，此点突变可以经由遗传靶向事件出现。在另一种实施方案中，此点突变可以为天然存在的。在一种进一步的实施方案中，突变可以经由诱变剂在αGal基因中诱导。
2. ß4GaINT2
在一种实施方案中，本发明提供了一种适合用作异种移植器官、组织和细胞来源的转基因动物，其中所述供体动物缺乏β1,4 N-乙酰半乳糖胺基转移酶 2（ß4GALNT2）表达，或其表达减少。缺乏ß4GALNT2表达（即ß4GALNT2无）的转基因动物具有一种或多种另外的遗传修饰，这些遗传修饰可以为例如掺入或表达转基因。在一种具体的实施方案中，所述缺乏β1,4N-乙酰半乳糖胺基转移酶 2（ß4GALNT2）表达或其表达减少的还可以通过如下进行表征：(i) αGal表达缺乏，和(ii) 在至少两种启动子的调控下在单基因座掺入和表达至少四种转基因。
ß4Gal-NT2产生的葡聚糖为许多人类的异种抗原。Estrada JL 等人，Xenotransplantation 2015: 22: 194–202。在人类的小鼠，ß4GALNT2催化N-乙酰半乳糖胺添加至唾液酸修饰的乳糖胺以产生Sda血型抗原GalNAc b1-4(Neu5Ac a2-3) Gal b1-4GlcNAc b1-3Gal。在猪的可移植的器官（肾、心脏、肝、肺以及胰腺）和内皮细胞中此基因是功能性的。约5%的人具有无活性的ß4GalNT2，由此形成针对此基因产生的SDa和CAD碳水化合物的抗体。参见Byrne GW 等人，Transplantation 2011; 91: 287–292; Byrne GW, 等人，Xenotransplantation 2014; 21: 543–554。
任何合适的方法可以用于产生其基因组缺乏内源性ß4GALNT2表达或其表达减少的猪。在内源性猪ß4GALNT2核酸序列中任何位点可以定位断裂。断裂的实例包括但不限于天然基因序列的缺失和异源核酸序列插入天然基因序列。插入的实例包括但不限于与终止密码子耦合的人工剪接受体或与诸如GFP的融合配对耦合的剪接供体。敲除构建体可以包含与内源性ß4GALNT2核酸序列具有同源性或与侧接内源性ß4GALNT2核酸序列的序列具有同源性的序列。在某些情况下，敲除构建体可以包含与调控序列（例如启动子）操作性连接的编码选择性标记（例如抗生素抗性、荧光报告子（例如GFP或YFP）或酶（例如β-半乳糖苷酶））的核酸序列。敲除构建体可以包含其他核酸序列，例如重组序列（例如loxP序列，参见Sendai, 等人， Transplantation, 81(5):760-766 (2006)），剪接受体序列，剪接供体序列，转录起始序列以及转录终止序列。内源性ß4GALNT2核酸序列中的断裂可以导致基因表达减少或非功能性截短或编码多肽的融合。
在一种实施方案中，本发明提供一种ß4GALNT2表达减少或无表达的转基因动物（例如猪动物），任选地，所述动物包含一种或多种另外的遗传修饰。
在一种例示性实施方案中，本发明提供一种在至少两种启动子的调控下掺入和表达至少四种转基因的转基因动物（例如猪动物），其中所述动物缺乏ß4GALNT2表达或其表达减少。任选地，所述动物包含一种或多种另外的遗传修饰。
在一种实施方案中，本发明提供一种转基因动物（例如猪动物），所述转基因动物由猪ß4GALNT2产生的Sda或SDa样葡聚糖表达减少或不表达。任选地，所述动物包含一种或多种另外的遗传修饰。
在一种例示性实施方案中，本发明提供一种在至少两种启动子的调控下掺入和表达至少四种转基因的转基因动物（例如猪动物），其中所述动物由猪ß4GALNT2产生的Sda或SDa样葡聚糖表达减少或不表达。任选地，所述动物包含一种或多种另外的遗传修饰。
3. CMAH
在一种实施方案中，本发明提供了一种适合用作异种移植器官、组织和细胞来源的转基因动物，其中所述供体动物缺乏胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMAH）表达，或其表达减少。缺乏CMAH表达（即CMAH无）的转基因动物具有一种或多种另外的遗传修饰，这些遗传修饰可以为例如掺入或表达转基因。在一种具体的实施方案中，所述转基因动物具有导致如下结果的至少四种另外的遗传修饰：(i) αGal表达缺乏，和(ii) 在单基因座掺入和表达至少四种转基因。
猪动物表达不存在于人细胞中的胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMAH）。CMAH将唾液酸N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）转化为N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）。这样，当猪组织被移植至人时，在移植后此表位立即引发来自人患者的抗体介导的排斥。参见Varki A.Am J Phys Anthropol 2001; (Suppl. 33):54–69; Zhu A. Xenotransplantation,2002; 9: 376–381; Miwa Y. Xenotransplantation 2004; 11: 247–253; Tahara H. JImmunol 2010; 184: 3269–3275。
任何合适的方法可以用于产生其基因组缺乏内源性CMAH表达或其表达减少的猪。在内源性猪CMAH核酸序列中任何位点可以定位断裂。断裂的实例包括但不限于天然基因序列的缺失和异源核酸序列插入天然基因序列。插入的实例包括但不限于与终止密码子耦合的人工剪接受体或与诸如GFP的融合配对耦合的剪接供体。敲除构建体可以包含与内源性CMAH核酸序列具有同源性或与侧接内源性CMAH核酸序列的序列具有同源性的序列。在某些情况下，敲除构建体可以包含与调控序列（例如启动子）操作性连接的编码选择性标记（例如抗生素抗性、荧光报告子（例如GFP或YFP）或酶（例如β-半乳糖苷酶））的核酸序列。敲除构建体可以包含其他核酸序列，例如重组序列（例如loxP序列，参见Sendai, 等人，Transplantation, 81(5):760-766 (2006)），剪接受体序列，剪接供体序列，转录起始序列以及转录终止序列。内源性CMAH核酸序列中的断裂可以导致基因表达减少或非功能性截短或编码多肽的融合。
在一种实施方案中，本发明提供一种CMAH半乳糖基转移酶表达减少或无表达的转基因动物（例如猪动物），任选地，所述动物包含一种或多种另外的遗传修饰。
在一种例示性实施方案中，本发明提供一种在至少两种启动子的调控下掺入和表达至少四种转基因的转基因动物（例如猪动物），其中所述动物缺乏CMAH表达或其表达减少。任选地，所述动物包含一种或多种另外的遗传修饰。
4. vWF
冯维勒布兰德因子（vWF）基因是大的复杂基因，具有多重结构域，编码多聚糖蛋白。（Ulrichts,H, Udvardy M, Lenting PJ, Pareyn I 等人， Shielding of the A1 domainby the D’D3 domains of von Willebrand Factor Modulates Its interaction withPlatelet Glycoprotein 1b-IX-V. (2006) JBC 281, 4699-4707.; Zhou Y-F, Eng ET,Zhu J, Lu C 等人，l. Sequence and structure relationships within vonWillebrand factor. (2012) Blood 120, 449-458）。多聚糖蛋白冯维勒布兰德因子（vWF）的主要功能是血小板粘附结缔组织和皮下组织，以及作为vWF结合血小板糖蛋白Ib（GPIb）的功能的血小板聚集。然而，当受体血小板对于捐献的器官存活具有破坏作用时此现象在异种移植过程中较不有利。举例而言，猪肺（及其他器官）移植至人或非人灵长类动物导致人血小板自发聚集和鳌合。这可以通过在消除这种猪vWF对于人血小板的自发结合的努力中通过对于猪vWF基因进行“人源化”而得以避免。
通常，猪vWF基因的人源化或修饰需要缺失与人血小板自发聚集相关的基因序列，并使用不产生自发聚集的人基因对应物置换。这可以包括缺失所有或部分猪vWF基因，使用所有或部分人vWF基因置换。
旨在消除自发血小板聚集反应的猪vWF的修饰可以包括已知与hvWF（D3结构域）中GP1b结合位点的折叠和螯合相关的D3（部分）、A1、A2、A3（部分）内的区域，以及与GP1b受体（A1结构域）和ADAMTS13裂解位点（A2结构域）有关的区域。外显子22-28包含这些区域。人血小板在正常压力下的猪血液存在下自发聚集。为了避免这种对于成功异种移植的潜在威胁，并且由于人vWF在血液正常剪切力的情况下不诱导自发血小板聚集，与vWF蛋白折叠有关的人vWF基因的区域和与GPib结合、胶原结合（两个区域之一）以及ADAMTS13裂解相关的区域可以用于置换猪vWF基因（和所产生的嵌合人/猪蛋白）中的基因组同源性。以此方式，可以使用来自人vWF基因的单cDNA或基因组片段提供可隐藏或掩盖vWF上的GP1b结合位点及A结构域中的人源化受体位点的交替折叠。这可以通过同源重组或基因靶向实现，其中这样的机制利用例如基因编辑方法加强。CRISPR辅助的同源重组可用于将人vWF片段整合至猪vWF基因座。此人片段置换上述参与自发血小板聚集的区域，可以为来自人vWF基因的cDNA或基因组片段形式。
在例示性实施方案中，有关人vWF基因序列的插入可通过当前用于基因组编辑的任何方法实现，包括但不限于CRISPR/CAS9、TALEN核酸酶。猪vWF的修饰可以通过使用hvWF仅置换猪vWF基因的有关区域或可选地置换整个pvWF基因而实现。
在一种实施方案中，猪vWF基因的区域可使用人对应物（E22-E28）置换。可选地，使用位点特异性重组系统（即CRE-LOX重组系统）和/或通过特异性核酸碱基对改变以使用人对应物置换猪vWF基因组序列中的核苷酸，所述转基因动物可具有vWF基因完全敲除和人vWF基因的基因合成序列的完全置换。
在一种实施方案中，本发明是缺乏αGal表达和对猪vWF基因进行遗传修饰的转基因动物（例如猪转基因动物），所述修饰可以为，例如猪vWF基因敲除和使用人源化或嵌合vWF基因置换。所述转基因动物可以包含一种或多种另外的遗传修饰。在一种实施方案中，所述转基因动物可以进一步包含掺入和表达CD46。
所述转基因动物还可以被培育为包含一种或多种另外的遗传修饰的第二转基因动物。例如，本发明是缺乏αGal表达和对猪vWF基因进行遗传修饰的转基因动物（例如猪转基因动物），所述转基因动物可以被培育为在单基因座包含至少四种转基因、或在单基因座包含至少四种转基因且在第二基因座包含至少两种转基因，由此提供包含多重转基因修饰的动物。
在一种实施方案中，本发明是一种转基因动物（例如猪转基因动物），所述转基因动物缺乏αGal表达和对猪vWF基因进行遗传修饰（例如嵌合人-猪vWF）以及在至少两种启动子调控下在单基因座进行至少四种转基因修饰。所述基因座可以有所不同。在例示性实施方案中，所述基因座是天然基因座或修饰的天然基因座。所述基因座可以为例如AAVS1、ROSA26、CMAH、ß4GalNT2以及GGTA1。所述至少四种转基因可以通过同源重组或基因编辑工具掺入。
5. 转基因
引入本发明转基因动物的基因组的转基因可以为任何合适的转基因。
（i）免疫调节剂
在一种实施方案中，所述转基因是免疫调节剂。在例示性实施方案中，所述供体动物被遗传修饰，结果导致：(i) αGal表达缺乏或减少，和 （ii）在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中至少两种转基因中的至少一种是免疫调节剂。
所述免疫调节剂可以为任何合适的免疫调节剂。在例示性实施方案中，所述免疫调节剂是补体调节剂（例如补体抑制剂）或免疫抑制剂。
A. 补体调节剂
在一种实施方案中，本发明提供了一种适合用作异种移植器官、组织和细胞来源的转基因动物（例如猪动物），其中所述供体动物被遗传修饰以掺入和表达至少一种补体调节剂，例如补体抑制剂。在例示性实施方案中，所述供体动物被遗传修饰，结果导致：(i) αGal表达缺乏或减少，和 (ii) 在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中至少一种转基因是免疫调节剂，或更具体地补体抑制剂。
补体是用于一系列血液蛋白质的集合术语，且是免疫系统的主要效应机制。补体激活及其在靶结构上的沉积可以导致直接补体介导的细胞裂解，或由于炎症的有力调节剂的生成以及免疫效应细胞的召募和激活，可以间接导致细胞或组织破坏。介导组织损伤的补体激活产物在补体途径的各个点上生成。在宿主组织上的不适当补体激活在许多自身免疫和炎性疾病的病理学中起重要作用，并且还负责与例如心肺炎症和移植排斥后的生物不相容性相关的许多疾病状态。在宿主细胞膜上的补体沉积通过在细胞表面上表达的补体抑制蛋白质阻止。
补体系统包含约30种蛋白质的集合，且是免疫系统的主要效应机制之一。补体级联主要经由经典（通常是抗体依赖性的）或替代（通常是抗体不依赖性的）途径激活。经由任一途径的激活导致C3转化酶的生成，所述C3转化酶是级联的关键酶促复合物。C3转化酶将血清C3切割成C3a和C3b，其中后者与激活部位共价结合且导致C3转化酶的进一步生成（扩增环）。激活产物C3b（以及仅经由经典途径生成的C4b）及其分解产物是重要的调理素，并且涉及促进靶细胞的细胞介导的裂解（通过吞噬细胞和NK细胞）以及免疫复合物转运和溶解。C3/C4激活产物及其在免疫系统的多种细胞上的受体在调节细胞免疫应答中也是重要的。C3转化酶参与C5转化酶的形成，所述C5转化酶是切割C5以获得C5a和C5b的复合物。C5a具有强大的促炎和趋化性质，并且可以召募且激活免疫效应细胞。C5b的形成起始末端补体途径，导致补体蛋白质C6、C7、C8和（C9）n的顺次装配，以形成膜攻击复合物（MAC或C5b-9）。在靶细胞膜中MAC的形成可以导致直接的细胞裂解，但还可以引起细胞激活和多种免疫调节剂的表达/释放。
存在膜补体抑制剂的两个广泛类别：补体激活途径的抑制剂（抑制C3转化酶形成）和末端补体途径的抑制剂（抑制MAC形成）。补体激活的膜抑制剂包括补体受体1（CR1）、衰变加速因子（DAF或CD55）和膜辅因子蛋白质（MCP或CD46）。它们都具有这样的蛋白质结构，其由不同数目的约60-70个氨基酸的重复单位（称为短共有重复序列（SCR））组成，这是C3/C4结合蛋白质的共有特征。已鉴定了人补体激活抑制剂的啮齿类动物同系物。啮齿类动物蛋白质Cr1是与DAF和MCP类似起作用的补体激活的广泛分布抑制剂。啮齿类动物还表达DAF和MCP，尽管Cr1看起来在功能上是啮齿类动物中补体激活的最重要调节剂。尽管在人中未发现Cr1的同系物，但Cr1的研究及其在动物模型中的用途是临床上相关的。
末端补体途径的调控和宿主细胞膜中的MAC形成主要通过CD59的活性出现，所述CD59是通过糖基化磷脂酰肌醇（GPI）锚与质膜附着的广泛分布的20 kD糖蛋白。CD59在装配MAC中与C8和C9结合且阻止膜插入。
通过膜结合的补体调节蛋白质如DAF、MCP和CD59，宿主细胞受保护免于其自身补体。当器官移植到另一个物种内时，受体中的天然抗体结合供体器官的内皮且激活补体，从而起始快速排斥。先前已暗示与人细胞形成对比，猪的那些对人补体非常敏感，并且认为这是因为猪细胞表面补体调节蛋白质针对人补体是无效的。当器官移植到另一个物种内时，受体中的天然抗体结合供体器官的内皮且激活补体，从而起始快速排斥。几个策略已显示阻止或延迟排斥，包括IgM天然抗体的去除和全身性去补体或使用sCR1、肝素或C1抑制剂的补体抑制。
对于排斥问题的替代方法是在转基因猪中表达人、膜结合的补体调节分子。已生成了表达衰变加速因子DAF（CD55）、膜辅因子蛋白质MCP（CD46）和反应性裂解的膜抑制剂MIRL（CD59）的转基因猪。（参见Klymium等人Mol Reprod Dev（2010）77:209–221）。这些人抑制剂已显示在猪血管内皮上是丰富表达的。来自对照动物的心脏由人血液的离体灌注引起在数分钟内补体介导的器官破坏，然而得自转基因动物的心脏对补体是抗拒的且存活数小时。
如上概述的关于在猪器官中表达人补体调节蛋白质以使其“人源化”的原理基于下述假定：内源猪调节蛋白质在抑制人补体方面无效，并且从而在异种移植的背景中很少促成器官存活。（Cantarovich等人，Xenotransplantation 9:25，2002；Kirchhof等人，Xenotransplantation 11（5），396，2004；Tjernberg等人，Transplantation. 2008 Apr27；85（8）：1193-9）。此外，可溶性补体抑制剂可以在体外阻止补体介导的岛裂解（Bennet等人，Transplantation 69（5）:711，2000）。
给予Morgan等人的美国专利号7,462,466描述了几种人补体调节蛋白质（CRP）的猪类似物的分离和表征。研究举例说明表达人补体调节蛋白质分子的猪器官对补体损害是抗性的，不是因为它们表达人CRP分子，而是因为它们表达极大增加量的功能CRP分子。Morgan等人发现猪CRP的表达增加可以在保护供体器官不受导致超急性排斥的补体损害中与表达人补体调节蛋白质的供体器官是同样有效的。
CD46已表征为具有调节性质的蛋白质，其能够保护宿主细胞不受经由经典和替代途径激活的补体介导的攻击（Barilla-LaBarca，M. L.等人，J. Immunol. 168，6298-6304（2002））。在由低水平的天然或诱导的抗Gal或抗非Gal抗体介导的炎症和体液排斥过程中，人CD46（hCD46）可以提供不受补体裂解的保护。因此，更多的岛能够移入且随后更好地保护不受排斥，从而减少免疫抑制需要。
在本发明的一种实施方案中，提供一种动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其缺乏功能性αGal表达（或αGal表达减少）和被遗传修饰以掺入和表达至少一种、至少两种、至少三种获至少四种或更多种补体抑制剂。补体抑制剂的表达可以为遍在的或在组织特异性启动子的调控下。
在例示性实施方案中，补体调节剂是膜补体抑制剂。膜补体抑制剂可以是补体激活途径的抑制剂（抑制C3转化酶形成）或末端补体途径的抑制剂（抑制MAC形成）。补体激活的膜抑制剂包括补体受体1（CR1）、衰变加速因子（DAF或CD55）、膜辅因子蛋白质（MCP或CD46）等。末端补体途径的膜抑制剂可以包括CD59等。
在例示性实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物包含导致如下结果的遗传修饰：(i) αGal表达缺乏，和 (ii) 在至少两种启动子调控下在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中至少两种转基因中的至少一种转基因是补体调节剂，更具体地补体抑制剂，甚至更具体地膜补体抑制剂。所述单基因座可以选自天然的基因座，修饰的天然基因座或转基因的基因座。在例示性实施方案中，所述至少四种转基因以MCV提供，整合可以为随机整合或通过遗传靶工具促进。任选地，所述转基因动物可以具有一种或多种另外的遗传修饰，包括但不限于天然猪vWF、B4GalNT2、CMAH或Forsmann基因的修饰。
在例示性实施方案中，本发明提供了包含至少四种转基因的动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其中所述四种转基因在至少两种启动子调控下在单基因座掺入和表达，其中所述猪缺乏α 1,3半乳糖基转移酶，其中所述至少四种转基因包含至少一种补体调节剂，更具体的地至少一种补体抑制剂。另外的转基因可以为例如免疫抑制剂、细胞保护基因或它们的组合。所述单基因座可以选自天然基因座、修饰的天然基因座或转基因的基因座。在例示性实施方案中，所述至少四种转基因以MCV提供，整合可以为随机整合或通过遗传靶工具促进。任选地，所述转基因动物保护一种或多种另外的遗传修饰。
在例示性实施方案中，本发明提供了动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其缺乏αGal的表达（或其表达减少），且被遗传修饰以掺入和表达至少四种另外的转基因，起始所述至少四种另外的转基因的至少两种转基因中的至少一种转基因是补体抑制剂，更具体地至少两种膜补体抑制剂。
在例示性实施方案中，本发明提供了动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其缺乏功能性αGal（或其表达减少），且被遗传修饰以：(i) 掺入和表达至少两种补体抑制剂，更具体地至少两种膜补体抑制剂，和 (ii) 掺入和表达选自抗凝剂、免疫抑制剂、细胞保护基因或它们的组合的至少两种另外的转基因。
在一种实施方案中，本发明提供了动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其缺乏功能性αGal（或其表达减少），且被遗传修饰以：(i) 掺入和表达CD46和CD55，和(ii) 掺入和表达至少两种另外的转基因。在某些实施方案中，所述另外的转基因选自抗凝剂、免疫抑制剂、细胞保护基因或它们的组合。
在一种具体实施方案中，本发明提供了动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其缺乏功能性αGal（或其表达减少），且被遗传修饰以在至少两种启动子调控下掺入和表达至少四种转基因，其中所述转基因中的至少一种是CD46且其表达受外源性启动子调控。
在另一种实施方案中，本发明提供了动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其缺乏功能性αGal（或其表达减少），且被遗传修饰以：(i) 掺入和表达CD46和CD55，和(ii) 掺入和表达至少三种另外的转基因。在某些实施方案中，所述另外的转基因选自抗凝剂、免疫抑制剂、细胞保护基因或它们的组合。在例示性实施方案中，所述至少三种另外的转基因包括至少两种抗凝剂。在一种例示性实施方案中，所述至少三种另外的转基因包括至少两种抗凝剂和一种免疫抑制剂。
在另一种实施方案中，本发明提供了动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其缺乏功能性αGal（或其表达减少），且被遗传修饰以：(i) 掺入和表达CD46和CD55，和(ii) 掺入和表达至少四种另外的转基因。在某些实施方案中，所述另外的转基因选自抗凝剂、免疫抑制剂、细胞保护基因或它们的组合。在一种例示性实施方案中，所述至少四种另外的转基因包括至少两种抗凝剂。在一种例示性实施方案中，所述至少四种另外的转基因包括至少两种抗凝剂和一种免疫抑制剂。在一种例示性实施方案中，所述至少四种另外的转基因包括至少三种抗凝剂。
在另一种实施方案中，本发明提供了动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其缺乏功能性αGal（或其表达减少），且被遗传修饰以：(i) 掺入和表达CD46和CD55，和(ii) 掺入和表达至少五种另外的转基因。在某些实施方案中，所述另外的转基因选自抗凝剂、免疫抑制剂、细胞保护基因或它们的组合。在一种例示性实施方案中，所述至少五种另外的转基因包括至少两种抗凝剂和一种免疫抑制剂。在一种例示性实施方案中，所述至少五种另外的转基因包括至少三种抗凝剂和至少一种免疫抑制剂。在一种例示性实施方案中，所述至少五种另外的转基因包括至少两种抗凝剂和至少两种免疫抑制剂。在一种实施方案中，动物可以被修饰，以表达补体调节剂肽、其生物学活性片段或衍生物。在一种实施方案中，补体调节剂肽是全长补体调节剂。在一种进一步的实施方案中，补体调节剂肽可以含有小于全长的补体调节剂蛋白质。
本领域技术人员已知的任何人或猪补体调节序列或其生物学活性部分或片段可以为根据本发明的组合物和方法。在另外的实施方案中，任何共有补体调节剂肽可以根据本发明使用。在另一种实施方案中，核酸和/或肽序列与本文描述的补体调节剂肽和核苷酸序列至少80％、85％、90％或95％同源。在进一步的实施方案中，可以使用显示出与补体调节剂相似的活性的任何片段或同源序列。
任选地，表达至少四种转基因中的至少一种补体调节剂（例如补体抑制剂）并缺乏α 1,3半乳糖基转移酶的动物具有至少一种另外的遗传修饰。
B. 免疫抑制剂
在一种实施方案中，本发明提供了一种适合用作异种移植器官、组织和细胞来源的转基因动物，其中所述供体动物被遗传修饰以掺入和表达至少一种免疫抑制剂。所述转基因动物通常具有一种或多种另外的遗传修饰，更具体地五种或更多种另外的遗传修饰，甚至更具体地六种或更多种另外的遗传修饰。
“免疫抑制剂”转基因能够下调免疫应答。对于任何类型的移植程序，在功效和毒性之间的平衡是关于其临床接受的关键因素。就岛移植而言，进一步的关注是许多目前免疫抑制剂特别是糖皮质激素或钙神经素抑制剂例如他克莫司损害β细胞或诱导外周胰岛素抗性（Zeng等人Surgery（1993）113：98-102）。包括西罗莫司、低剂量他克莫司和针对IL-2受体的单克隆抗体（mAb）的无类固醇免疫抑制方案（“Edmonton方案”）已在单独用于具有1型糖尿病的患者的岛移植试验中使用（Shapiro，A. M. J.等人，（2000），N. Eng. J. Med.，343：230-238）。使用“Edmonton方案”的近期成功已更新了关于使用岛移植以治疗糖尿病的热情。然而，关于他克莫司毒性的顾虑可能限制这种治疗在人中的应用。
封闭关键T细胞共刺激信号特别是CD28途径的生物学试剂是保护岛的潜在替代物。封闭CD28途径的试剂的实例包括但不限于可溶性CTLA4，包括突变型CTLA4分子。
T细胞激活涉及移植排斥的发病机理。T细胞的激活需要至少2组发信号事件。第一种通过与抗原呈递细胞（APC5）上的主要组织相容性复合物（MHC）分子组合的经由抗原肽的T细胞受体的特异性识别起始。第二组信号是抗原非特异性的，且通过与其在APC上的配体相互作用的T细胞共刺激受体递送。在不存在共刺激的情况下，T细胞激活受损或取消，这可以导致克隆无反应的抗原特异性无反应状态，或通过凋亡死亡的缺失。因此，T细胞共刺激的封闭可以提供用于以抗原特异性方式抑制不希望有的免疫应答，同时保存正常免疫功能的方法（Dumont，F. J. 2004 Therapy 1，289-304）。
在迄今为止鉴定的几个T细胞共刺激途径中，最突出的是CD28途径。CD28，在T细胞上表达的细胞表面分子，及其在树突细胞、巨噬细胞和B细胞上存在的反受体，B7.1（CD8O）和B7.2（CD86）分子，已得到表征且鉴定为用于中断T细胞共刺激信号的有吸引力的靶。与CD28同源的第二种T细胞表面分子称为细胞毒性T淋巴细胞结合蛋白质（CTLA4）。CTLA4是细胞表面发信号分子，但与CD28的作用相反，CTLA4负面调节T细胞功能。CTLA4对于B7配体具有比CD28高20倍的亲和力。关于人CTLA4的基因在1988年克隆且在1990年染色体作图（Dariavach等人，Eur. J. Immunol. 18:1901-1905（1988）；Lafage-Pochitaloff等人，Immunogenetics 31:198-201（1990）；美国专利号5,977,318）。
CD28/B7途径已变成用于破坏T细胞共刺激信号的有吸引力的靶。CD28/B7抑制剂的设计已采用这种系统的内源负调节剂CTLA4。CTLA4-免疫球蛋白（CTLA4-Ig）融合蛋白已作为抑制T细胞共刺激的方法广泛研究。对于任何免疫抑制治疗必须达到困难的平衡；必须提供足够的抑制以克服疾病或排斥，但过度免疫抑制将抑制整个免疫系统。CTLA4-Ig的免疫抑制活性已在器官移植和自身免疫病的动物模型的临床前研究中得到证实。可溶性CTLA4近期已在具有肾衰竭、银屑病和类风湿性关节炎的人患者中进行测试，并且已配制为由Bristol-Myers Squibb开发的药物（阿巴西普，可溶性CTLA4-Ig），所述药物已批准用于治疗类风湿性关节炎。这种药物是选择性T细胞共刺激调节剂的新类别中的第一个。Bristol-Myers Squibb也用贝拉西普（LEA29Y）执行用于同种异体移植肾移植物的II期临床试验。LEA29Y是突变形式的CTLA4，其已改造为对于B7受体具有比野生型CTLA4更高的亲和力，与免疫球蛋白融合。Repligen Corporation也用其CTLA4-Ig执行用于特发性血小板减少性紫癜的临床试验。名称为“Methods for protecting allogeneic islettransplant using soluble CTLA4 mutant molecules”的美国专利U5,730,403描述了可溶性CTLA4-Ig和CTLA4突变分子保护同种异体移植岛移植物的用途。
尽管来自一个生物的CTLA-4能够与来自另一个生物的B7结合，但对于同种异体移植B7发现最高亲合力。因此，虽然来自供体生物的可溶性CTLA-4因此可以与受体B7（在正常细胞上）和供体B7（在异种移植的细胞上）结合，但它优先结合在异种移植物上的B7。因此，在包含用于异种移植的猪动物或细胞的本发明的一种实施方案中，猪CTLA4是一般的。通过Imperial College的PCT公开号WO 99/5 7266描述了猪CTLA4序列和可溶性CTLA4-Ig的施用用于异种移植治疗。Vaughn A.等人，J Immunol（2000）3175-3181描述了可溶性猪CTLA4-Ig的结合和功能。猪CTLA4-Ig结合猪（而不是人）B7，封闭在受体T细胞上的CD28且致使这些局部T细胞无反应，而不引起总体T细胞免疫抑制（参见Mirenda等人，Diabetes 54:1048-1055，2005）。
关于CTLA4-Ig作为免疫抑制剂的许多研究已集中于将可以溶形式的CTLA4-Ig施用于患者。改造为表达CTLA4-Ig的转基因小鼠已被制备且实施几个系列的实验。Ronchese等人检查了一般地在小鼠中表达CTLA4-Ig后免疫系统功能（Ronchese等人J Exp Med（1994）179：809；Lane等人J Exp Med.（1994）March 1；179（3）:819）。Sutherland等人（Transplantation. 2000 69（9）:1806-12）描述了在小鼠中通过转基因胎儿胰腺同种异体移植分泌的CTLA4-Ig的保护效应，以测试转基因表达的CTLA4-Ig对同种异体岛移植物的作用。Lui等人（J Immunol Methods 2003 277：171-183）报道了在哺乳动物特异性启动子的调控下表达CTLA4-Ig的转基因小鼠的产生，以在用于用作生物反应器的转基因动物的乳中诱导可溶性CTLA4-Ig的表达。
Alexion Phamaceuticals Inc.的PCT公开号WO 01/30966描述了含有与补体蛋白质CD59附着的T细胞抑制剂CTLA-4的嵌合DNA构建体，以及含有其的转基因猪细胞、组织和器官。PCT公开号WO2007035213（Revivicor）描述了已遗传修饰为表达CTLA4-Ig的转基因猪动物。
免疫抑制剂可以在动物、组织和细胞中表达。例如，在小鼠中已灭活以产生无免疫应答表型的基因可以被克隆且在猪中通过基因靶向被破坏。在小鼠中已靶向且可以靶向以产生无免疫应答的猪的某些基因包括β2-微球蛋白（MHI I类缺陷，Koller等人，Science，248:1227-1230）、TCRα、TCRβ（Mombaerts等人，Nature，360:225-231）、RAG-1和RAG-2（Mombaerts等人，（1992）Cell 68，869-877，Shinkai等人，（1992）Cell 68，855-867，US专利号5,859,307）。
在一种实施方案中，供体动物被修饰以转基因表达细胞毒性T淋巴细胞结合的蛋白质4-免疫球蛋白（CTLA4）。动物或细胞可以进行修饰，以表达CTLA4肽或其生物学活性片段（例如细胞外结构域、其中至少跨膜结构域已被去除的截短形式的肽）或其衍生物。肽可以为例如人或猪的。CTLA4肽可以为突变的。突变的肽可以对于猪和/或人B7分子具有比野生型更高的亲和力。在一个具体实施方案中，突变的CTLA4可以为CTLA4（Glu104，Tyr29）。CTLA4肽可以这样进行修饰，使得它在细胞内表达。CTLA4肽的其他修饰包括内质网停留信号对于N或C末端的添加。内质网停留信号可以为例如序列KDEL。CTLA4肽可以与肽二聚化结构域或免疫球蛋白（Ig）分子融合。CTLA4融合肽可以包括可以连接2种肽的连接序列。在另一种实施方案中，根据本发明产生的缺乏功能免疫球蛋白的表达的动物可以施用作为药物的CTLA4肽或其变体（pCTLA4-Ig或hCTLA4-Ig（阿巴西普/Orencia，或贝拉西普），以抑制其T细胞应答。如本文使用的，CTLA4用于指这些变体中的任一种或本领域已知的那些变体，例如，CTLA4-Ig。
在一种实施方案中，CTLA4肽是全长CTLA4。在一个进一步的实施方案中，CTLA4肽可以含有小于全长CTLA4蛋白质。在一种实施方案中，CTLA4肽可以含有CTLA-4肽的细胞外结构域。在一种具体实施方案中，CTLA4肽是CTLA4的细胞外结构域。在再进一步的实施方案中，本发明提供了突变形式的CTLA4。在一种实施方案中，突变形式的CTLA4可以对于猪和/或人B7具有比野生型更高的亲和力。在一个具体实施方案中，突变的CTLA4可以为人CTLA4（Glu104，Tyr29）。
在一种实施方案中，CTLA4可以为截短形式的CTLA4，其中蛋白质的至少跨膜结构域已被去除。在另一种实施方案中，CTLA4肽可以这样进行修饰，使得它在细胞内表达。在一种实施方案中，高尔基保留信号可以加入CTLA4肽的N或C末端。在一种实施方案中，高尔基保留信号可以为序列KDEL，这可以加入CTLA4肽的N或C末端。在进一步的实施方案中，CTLA4肽可以与肽二聚化结构域融合。在一种实施方案中，CTLA4肽可以与免疫球蛋白（Ig）融合。在另一种实施方案中，CTLA4融合肽可以包括连接2种肽的连接序列。
本领域技术人员已知的任何人CTLA4序列或其生物学活性部分或片段可以为根据本发明的组合物和方法。非限制性实例包括但不限于下述Genbank登记号，其描述人CTLA4序列：NM005214.2；BC074893.2；BC074842.2；AF414120.1；AF414120；AY402333；AY209009.1；BC070162.1；BC069566.1；L15006.1；AF486806.1；AC010138.6；AJ535718.1；AF225900.l；AF225900；AF411058.l；M37243.1；U90273.1；和/或AF316875.l。编码CTLA4肽的进一步核苷酸序列可以选自包括但不限于来自EST数据库的下述Genbank登记号的那些：CD639535.1；A1733018.1；BM997840.1；BG536887.1；BG236211.1；BG058720.l；A1860i99.l；AW207094.l；AA210929.1；A1791416.1；BX113243.1；AW515943.1；BE837454.1；AA210902.1；BF329809.1；A1819438.1；BE837501.1；BE837537.1；和/或AA873138.1。
在另外的实施方案中，任何共有CTLA4肽可以根据本发明使用。在另一种实施方案中，核酸和/或肽序列与天然CTLA4肽和核苷酸序列至少80％、85％、90％或95％同源。在进一步的实施方案中，可以使用显示出与CTLA4相似的活性的任何片段或同源序列。
在其他实施方案中，显示出T细胞抑制活性的氨基酸序列可以为猪CTLA4序列的氨基酸38 – 162或人CTLA4序列的氨基酸38 – 161（参见例如，PCT公开号WO 01/30966）。在一种实施方案中，使用的部分应具有至少约25％且优选至少约50％的母体分子活性。
在其他实施方案中，本发明的CTLA4核酸和肽可以与免疫球蛋白基因及其分子或片段或区域融合。提及本发明的CTLA4序列包括与免疫球蛋白融合的那些序列。在一种实施方案中，Ig可以为人Ig。在另一种实施方案中，Ig可以为IgG，特别是IgG1。在另一种实施方案中，Ig可以为IgG的恒定区。在一种具体实施方案中，恒定区可以为IgG1的Cγ1链。在本发明的一种具体实施方案中，猪CTLA4的细胞外结构域可以与人Cγ1 Ig融合。在另一种具体实施方案中，人CTLA4的细胞外结构域可以与IgG1或IgG4融合。在一个进一步特定的实施方案中，突变的CTLA4（Glu 104，Tyr 29）的细胞外结构域可以与IgG1融合。
在一种实施方案中，所述转基因中的至少一种是B7-H4，也称为B7x。B7-4H于2003年被鉴定，属于免疫球蛋白B7家族。参见Sica, GL Immunity, 卷18, 849–861, June,2003。
在一种实施方案中，所述供体动物被修饰以转基因表达II类反式激活因子（CIITA）及其突变体PDL1、PDL2、肿瘤坏死因子-α-相关凋亡诱导配体（TRAIL）、Fas配体（FasL、CD95L）、整联蛋白结合蛋白质（CD47）、HLA-E、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR。
II类反式激活因子（CIITA）是双功能结构域或多功能结构域蛋白质，其充当转录激活子且在MHC II类基因的表达中起关键作用。先前已证实编码缺乏氨基末端151个氨基酸的蛋白质的突变形式的人CIITA基因充当HLA II类表达的有力显性失活抑制剂（Yun等人，Int Immunol. 1997 October；9（10）:1545-53）。猪MHC II类抗原是通过人CD4+ T细胞的直接T细胞识别的有力刺激物，并且因此可能在临床异种移植中对于转基因猪供体的排斥应答中起重要作用。据报道一种突变的人CIITA构建体在猪细胞中是有效的，显著抑制IFN[γ]诱导的以及组成型猪MHC II类表达。此外，携带突变的人CIITA构建体的稳定转染的猪血管内皮细胞系未能刺激通过纯化CD4+ T人细胞的直接T细胞异种识别（Yun等人，Transplantation. 2000 Mar 15；69（5）:940-4）。来自CIITA-DN转基因动物的器官、组织和细胞可以在人受体中诱导减少得多的T细胞排斥应答。与其他转基因组合，突变的CIITA的转基因表达可以使长期异种移植存活成为可能，具有临床上可以接受水平的免疫抑制。
在一种实施方案中，本发明提供一种转基因动物（例如猪），其包含导致如下结果的遗传修饰：(i) αGal 表达缺乏，和(ii) 在单基因座掺入和表达至少两种转基因，其中至少四种转基因包括至少一种免疫抑制剂。所述单基因座可以选自天然的基因座，修饰的天然基因座或转基因的基因座。任选地，所述转基因动物包含一种或多种另外的遗传修饰。
在例示性实施方案中，本发明提供一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物包含导致如下结果的遗传修饰：(i) αGal表达缺乏，和 (ii) 在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中至少两种转基因中的至少两种转基因是免疫抑制剂。所述单基因座可以选自天然的基因座，修饰的天然基因座或转基因的基因座。所述至少四种转基因可以以MCV提供并利用基因编辑工具掺入基因座。任选地，所述转基因动物具有一种或多种另外的遗传修饰。
在一种例示性实施方案中，本发明提供了动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其缺乏αGTαGal的表达（或其表达减少），且被遗传修饰以：(i) 在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中所述至少四种转基因包括至少一种免疫抑制剂。所述免疫抑制剂可以为例如CIITA-DN或CLTA4-IG。所述至少四种转基因可以包括选自补体抑制剂、抗凝剂或它们的组合的另外的转基因。所述单基因座可以选自天然的基因座，修饰的天然基因座或转基因的基因座。至少三种转基因可以以MCV提供并利用基因编辑工具掺入基因座。任选地，所述转基因动物具有一种或多种另外的遗传修饰。
在一种例示性实施方案中，本发明提供了动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其缺乏αGTαGal的表达（或其表达减少），且被遗传修饰以：(i) 在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中所述至少四种转基因包括至少两种免疫抑制剂。所述免疫抑制剂可以为例如CIITA-DN或CLTA4-IG。所述至少四种转基因还可以包括补体抑制剂、抗凝剂或它们的组合。所述单基因座可以选自天然的基因座，修饰的天然基因座或转基因的基因座。至少三种转基因可以以MCV提供并利用基因编辑工具掺入基因座。任选地，所述转基因动物具有一种或多种另外的遗传修饰。
C. 其他免疫调节剂
PDL1, PDL2：关于T细胞激活的典型共刺激分子是CD80/86或CD40。除经过过去数年的这些阳性共刺激途径外，已发现了介导负信号且对于调节T细胞激活重要的新共刺激途径。这些较新途径之一是由程序性死亡1（PD-1）受体及其配体PD-L1和PD-L2组成的途径。PD-1受体在静止细胞中不表达，但在T和B细胞激活后上调。PD-1含有基于细胞质免疫受体酪氨酸的转换基序，并且PD-L1或PD-L2与PD-1的结合导致T细胞中的抑制信号。近期数据暗示PD1/PD配体途径可能在显示出调节活性的T细胞亚群的调控中起作用。在小鼠中，PD-1信号已显示是调节性T细胞（Treg）的抑制活性和适应性Treg的生成所需的。这些观察暗示PD-1/PDLig和相互作用不仅抑制T细胞应答，还可以引发免疫调节。几个证据系证实PD-1/PD配体途径可以控制同种异体移植物的移入和排斥，暗示这些分子是关于在器官移植后的免疫调节的有利靶。事实上，同种异体移植物存活的延长可以通过在大鼠移植模型中PDL1Ig基因转移至供体心脏获得。此外，通过注射PD-L1Ig增强PD-1发信号也已报道为在小鼠中保护移植物不受排斥。近期数据还显示在小鼠中PD-L1IG在岛移植物上的过表达可以部分延长岛移植物存活。人PD-L1或PD-L2在猪细胞和组织中的转基因表达应减少经由致敏作用的直接途径起始的早期人抗猪T细胞应答（Plege等人，Transplantation. 2009 Apr 15；87（7）:975-82）。通过Treg的诱导，可能还可以通过达到长效耐受所需的间接途径控制对于异种移植物致敏的T细胞。
在一种具体实施方案中，缺乏αGal的表达且在至少两种启动子调控下掺入和表达至少四种转基因的转基因动物包含掺入和表达PDL1或PDL2。
TRAIL / Fas L：凋亡诱导配体例如Fas配体（FasL、CD95L）或肿瘤坏死因子-α-相关凋亡诱导配体（TRAIL、Apo-2L）的表达可以消除攻击异种移植物的T细胞。TRAIL是具有与其他肿瘤坏死因子家族成员的那种同源的细胞外结构域的II型膜蛋白质，显示与FasL的最高氨基酸同一性（28％）。TRAIL优先对肿瘤细胞发挥其凋亡诱导作用。在正常细胞中，TRAIL受体的结合不导致细胞死亡。近期研究已显示免疫细胞包括T细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞和树突细胞的细胞毒性效应至少部分通过TRAIL介导。人TRAIL在转基因猪中的表达可以提供合理策略，用于在异种移植至灵长类动物后保护猪组织不受细胞介导的排斥。人TRAIL的稳定表达已在转基因猪中达到，并且表达的TRAIL已显示在体外是生物学功能的（Klose等人，Transplantation. 2005 Jul 27；80（2）:222-30）。（d）CD47：CD47，称为整联蛋白结合蛋白质，是遍在表达的50-kDa细胞表面糖蛋白，其充当关于信号调节蛋白质（SIRP）α（也称为CD172a、SHPS-1）的配体，在巨噬细胞上的免疫抑制受体。CD47和SIRPα构成在多种细胞过程中起重要作用的细胞间通信系统（CD47-SIRPα系统），所述细胞过程包括细胞迁移、B细胞粘附和T细胞激活。此外，CD47-SIRPα系统牵涉通过巨噬细胞的吞噬作用的负调节。通过与抑制性巨噬细胞受体SIRPα的结合，在几个细胞类型（即红细胞、血小板或白血病）表面上的CD47可以保护不受通过巨噬细胞的吞噬作用。CD47-SIRPα相互作用在自身识别和吞噬作用的抑制中的作用已通过下述观察举例说明：原代、野生型小鼠巨噬细胞快速吞噬得自CD47缺陷小鼠的未受调理素作用的RBC，而不是来自野生型小鼠的那些。已报道通过其SIRPα受体，CD47抑制Fcγ和补体受体介导的吞噬作用。已证实猪CD47在人巨噬细胞样细胞系不诱导SIRPα酪氨酸磷酸化，并且可溶性人CD47-Fc融合蛋白抑制人巨噬细胞针对猪细胞的吞噬活性。还指出用于表达人CD47的猪细胞操作根本上减少细胞对通过人巨噬细胞的吞噬作用的敏感性（Ide等人，Proc Natl Acad Sci USA. 2007 Mar 20；104（12）:5062-6）。人CD47在猪细胞上的表达可以提供对于人巨噬细胞上的SIRPα的抑制信号，提供阻止巨噬细胞介导的异种移植物排斥的方法。
在一种具体实施方案中，缺乏αGal的表达且在至少两种启动子调控下掺入和表达至少四种转基因的转基因动物包含掺入和表达TRAIL或Fas L。
NK细胞应答。HLA-E / β2微球蛋白和HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR：人天然杀伤（NK）细胞代表成功的猪至人异种移植的潜在障碍，因为它们浸润离体由人血液灌注的猪器官，并且在体外直接和在人血清的存在下通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性裂解猪细胞。NK细胞自身反应性通过在正常自体细胞上抑制性NK受体的主要组织相容性复合物（MHC）I类配体的表达阻止。在大多数激活的人NK细胞上表达的抑制性受体CD94/NKG2A与人白细胞抗原（HLA）-E特异性结合。非经典人MHC分子HLA-E是关于荷有CD94/NKG2A的NK细胞的有力抑制配体，并且与经典MHC分子不同，不诱导同种异体T细胞应答。HLA-E在内质网中装配且作为稳定的三聚复合物转运至细胞表面，所述三聚复合物由HLA-E重链、β2-微球蛋白（β2m）和衍生自某些MHC I类分子的前导序列的肽组成。HLA-E的表达已显示提供针对异基因人NK细胞细胞毒性的部分保护（Weiss等人，Transplantation. 2009 Jan 15；87（1）:35-43）。HLA-E在猪器官上的转基因表达具有基本上减轻人NK细胞介导的猪异种移植物排斥的潜力，而无同种异体应答的危险。此外，已成功地生成了携带其他HLA基因的转基因猪，目标是“人源化”猪器官、组织和细胞（Huang等人，Proteomics. 2006 November；6（21）:5815-25，还参见美国专利号6,639,122）。
在一种具体实施方案中，缺乏αGal的表达且在至少两种启动子调控下掺入和表达至少四种转基因的转基因动物包含掺入和表达HLA-3。
CD47: CD47（分化抗原簇47），也称为整合素相关蛋白（IAP），是一种人类中由CD47基因编码的跨膜蛋白。已知CD47既是免疫抑制剂和免疫调节剂，又对SIRPɑ信号传导具有耐受性。
在一种例示性实施方案中，本发明提供了动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其缺乏功能性αGTαGal的表达（或其表达减少），且被遗传修饰以：(i) 在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中所述至少四种转基因中的一种是CD47。所述至少四种转基因可以包括选自补体抑制剂、抗凝剂或它们的组合的另外的转基因。所述单基因座可以选自天然的基因座，修饰的天然基因座或转基因的基因座。至少三种转基因可以以MCV提供并利用基因编辑工具掺入基因座。任选地，所述转基因动物具有一种或多种另外的遗传修饰。
在一种例示性实施方案中，本发明提供了动物（及源于所述动物的器官、组织以及细胞），其缺乏功能性αGTαGal的表达（或其表达减少），且被遗传修饰以：(i) 在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中所述至少四种转基因中的一种是CD7。所述至少四种转基因可以包括选自补体抑制剂、抗凝剂或它们的组合的另外的转基因。所述单基因座可以选自天然的基因座，修饰的天然基因座或转基因的基因座。至少三种转基因可以以MCV提供并利用基因编辑工具掺入基因座。任选地，所述转基因动物具有一种或多种另外的遗传修饰。
（ii）抗凝剂
在一种实施方案中，本发明提供了一种适合用作异种移植器官、组织和细胞来源的转基因动物，其中所述供体动物被遗传修饰以掺入和表达至少一种抗凝剂。所述动物通常具有另外的遗传修饰，更具体地，至少五种另外的遗传修饰，甚至更具体地，至少六种另外的遗传修饰。在例示性实施方案中，本发明是一种转基因动物，所述转基因动物包含导致如下结果的遗传修饰：(i) αGal表达缺乏，和(ii) 在至少两种启动子的调控下在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中至少一种转基因是抗凝剂。
所述抗凝剂可以为任何合适的抗凝剂。表达可以是遍在的或组织特异性的。在一种具体实施方案中，表达受主要在内皮细胞具有活性的启动子调控。
合适的抗凝剂转基因的典型非限制性实例包括组织因子途径抑制剂、水蛭素、血栓调节蛋白、内皮蛋白C受体（EPCR）、CD39以及它们的组合。
组织因子途径抑制剂（TFPI）是单链多肽，其可以可逆地抑制因子Xa（Xa）和凝血酶（因子IIa），并且因此抑制TF依赖性凝血。关于TFPI的综述，请参见Crawley和Lane（Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008，28（2）:233-42）。Dorling和同事生成了表达融合蛋白的转基因小鼠，所述融合蛋白由与人CD4的跨膜/细胞质结构域连接的人TFPI的3个Kunitz结构域，具有P-选择素尾用于靶向Weibel-Palade细胞内贮存颗粒（Chen D等人Am JTransplant 2004；4：1958-1963.）。所得到的在内皮上TFPI的激活-依赖性展示足以完全抑制小鼠心脏异种移植物通过环孢菌素治疗的大鼠的血栓形成介导的急性体液排斥。还存在凝血的有效调节可能阻止慢性排斥的建议。类似结果用表达水蛭素/CD4/P-选择素融合蛋白的转基因小鼠心脏获得，指出凝血酶生成或活性的抑制是这个模型中的保护的关键。
水蛭素是在医用水蛭（例如欧洲医用水蛭（Hirudo medicinalis））的唾液腺中天然存在的肽，并且是凝血酶的有力抑制剂。Dorling和同事（Chen等人，J Transplant. 2004December；4（12）:1958-63）还生成了表达膜栓系的水蛭素融合蛋白的转基因小鼠，并且将其心脏移植到大鼠内（小鼠-大鼠Xeno-Tx）。与在3天内全部排斥的对照非转基因小鼠心脏比较，来自转基因小鼠的两个品系的100％器官对体液排斥是完全抗性的，并且当T细胞介导的排斥通过施用环孢菌素A抑制时，存活超过100天。Riesbeck等人，（Circulation. 1998Dec 15；98（24）:2744-52）还探究了在哺乳动物细胞中表达水蛭素融合蛋白作为用于阻止细胞内血栓形成的策略。在细胞中的表达减少局部凝血酶水平且抑制纤维蛋白形成。因此，水蛭素是用于阻止异种移植中存在的血栓形成效应的另一种抗凝剂目的转基因。
通过与凝血酶形成1:1化学计量复合物，血栓调节蛋白（TM）在抗凝剂途径中凝血酶诱导的蛋白质C激活中充当辅因子。内皮细胞蛋白质C受体（EPCR）是增强蛋白质C激活的N糖基化I型膜蛋白质。这些蛋白质在蛋白质C抗凝剂系统中的作用由Van de Wouwer等人，Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004 August；24（8）:1374-83综述。这些及其他抗凝剂转基因的表达已通过多个团体探究，以潜在解决对于异种移植的凝血屏障（由Cowan和D'Apice，Cur Opin Organ Transplant. 2008 April；13（2）:178-83综述）。Esmon和同事（Li等人，J Thromb Haemost. 2005 July；3（7）:1351-9在转基因小鼠的内皮上超表达EPCR，并且显示此类表达保护小鼠不受血栓形成攻击。Iino等人，（J Thromb Haemost. 2004 May；2（5）:833-4），暗示经由基因治疗在供体岛中离体超表达TM作为阻止岛移植中的血栓并发症的方法。
CD39是主要血管三磷酸核苷二磷酸水解酶（NTPDase）且将ATP和ADP转换为AMP且最终为腺苷。细胞外腺苷在血栓形成和炎症中起重要作用，并且因此已就其在移植中的有利作用进行研究（由Robson等人Semin Thromb Hemost. 2005 April；31（2）:217-33综述）。近期研究已显示CD39在减少炎症应答中具有主要效应（Beldi等人，Front Biosci，2008，13:2588-2603）。表达hCD39的转基因小鼠显示出在心脏移植模型中受损的血小板聚集、延长的出血时间和对于全身性血栓栓塞的抗性（Dwyer等人，J Clin Invest. 2004 May；113（10）:1440-6）。他们还显示在胰岛上表达CD39，并且当与人血液一起温育时，与野生型岛比较，这些岛显著延迟凝血时间（Dwyer等人，Transplantation. 2006 Aug 15；82（3）:428-32）。在转基因猪中由组成型启动子系统以高水平表达hCD39的初步努力显示高出生后致死率（Revivicor，Inc.，未公开的数据）。然而，CD39的内皮细胞特异性表达显示为被转基因猪更好地耐受。因此，存在以这样的方式在猪中表达某些抗凝剂转基因的需要，所述方式不损害动物的健康，仍提供足够水平的表达用于在临床异种移植中利用。
在例示性实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物具有导致如下结果的遗传修饰：(i) αGal表达缺乏（或表达减少），和 (ii)在至少两种启动子调控下在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中至少两种转基因中的至少一种转基因是抗凝剂剂。在一种实施方案中，所述抗凝剂选自组织因子途径抑制剂、水蛭素、血栓调节蛋白（TBM）、内皮蛋白C受体（EPCR）、CD39以及它们的组合。所述单基因座可以是天然基因座、修饰的天然基因座或转基因的基因座。所述天然基因座可以为GGTA1、B4GalNT2、CMAH、Rosa26、AAVS1或其他可以赋予整合的转基因有益表达特征的外源性基因座。在至少两种启动子调控下的至少四种转基因可以以MCV提供，掺入可以包括基因编辑工具。所述编辑可以包括靶向插入预定位点（例如着陆台），所述预定位点作为“安全港”（以破坏基因组中的任何必需基因），和/或提供给整合位点特异性的所需特征。在对于防止异种移植排斥重要的基因座插入的情况下，多重转基因的插入还可以具有灭活参与诱导灵长类动物中异种反应的猪基因的结果。（即，灭活αGal、CMAH或B4GalNT2或其他（iGB3,Forssman））。任选地，所述动物可以包含在多于一个的基因座一种或多种另外的遗传修饰，其中，所述至少四种基因座在一个基因座插入，另一组两种或更多种转基因（在至少两种启动子调控下）可以在第二位点共整合。一种可选的实施方案提供了在一个基因座的MCV插入，在不同的基因座的靶向灭活，其中所述灭活可以通过基因编辑工具促进。
在例示性实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物具有导致如下结果的遗传修饰：(i) αGal表达缺乏（或表达减少），和 (ii)在单基因座掺入和表达至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种或更多种转基因，其中至少一种、至少两种或至少三种转基因是抗凝剂剂。
在一种实施方案中，所述抗凝剂选自组织因子途径抑制剂、水蛭素、血栓调节蛋白、内皮蛋白C受体（EPCR）、CD39以及它们的组合。所述至少四种转基因可以以MCV提供，掺入可以包括基因编辑工具。所述单基因座可以是天然基因座、修饰的天然基因座或转基因的基因座。任选地，所述转基因动物具有一种或多种另外的遗传修饰。
在一种实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物缺乏αGal的表达（或表达减少），和被遗传修饰以掺入和表达至少三种抗凝剂。在某些实施方案中，所述抗凝剂选自组织因子途径抑制剂（TFPI）、水蛭素、血栓调节蛋白、内皮蛋白C受体、CD39以及它们的组合。在某些实施方案中，所述至少三种抗凝剂中的至少一种由主要在内皮细胞中具有活性的启动子表达调控。在某些实施方案中，所述至少三种抗凝剂中的至少两种由主要在内皮细胞中具有活性的启动子表达调控。
在例示性实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物缺乏αGal的表达（或表达减少），和被遗传修饰以掺入和表达至少三种抗凝剂，其中所述至少三种抗凝剂中的一种是EPCR。
在例示性实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物缺乏αGal的表达（或表达减少），和被遗传修饰以掺入和表达至少三种抗凝剂，其中所述至少三种抗凝剂包括EPCR和TBM。
在一种实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物缺乏αGal的表达（或表达减少），和被遗传修饰以掺入和表达至少四种另外的转基因，其中所述至少四种另外的转基因包括至少一种抗凝剂。在某些实施方案中，所述至少一种抗凝剂选自组织因子途径抑制剂、水蛭素、血栓调节蛋白、内皮蛋白C受体、CD39以及它们的组合。在一种实施方案中，至少一种抗凝剂是EPCR。
在一种实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物缺乏αGal的表达（或表达减少），和被遗传修饰以掺入和表达至少四种另外的转基因，其中所述至少四种另外的转基因包括至少两种抗凝剂。在某些实施方案中，所述至少两种抗凝剂选自组织因子途径抑制剂、水蛭素、血栓调节蛋白、内皮蛋白C受体、CD39以及它们的组合。在一种实施方案中，所述至少两种抗凝剂包括EPCR和TBM。在一种实施方案中，所述至少两种抗凝剂包括EPCR和TFPI。
在一种实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物缺乏αGal的表达（或表达减少），和被遗传修饰以掺入和表达至少四种另外的转基因，其中所述至少四种另外的转基因包括至少三种抗凝剂。在某些实施方案中，所述至少三种抗凝剂选自组织因子途径抑制剂、水蛭素、血栓调节蛋白、内皮蛋白C受体、CD39以及它们的组合。在一种实施方案中，所述至少三种抗凝剂包括EPCR、TBM以及TFPI。在另一种实施方案中，所述至少三种抗凝剂包括EPCR、TBM以及CD39。
在一种实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物缺乏αGal的表达（或表达减少），和被遗传修饰以掺入和表达至少五种另外的转基因，其中所述至少五种另外的转基因包括至少两种抗凝剂。在某些实施方案中，所述至少两种抗凝剂选自组织因子途径抑制剂、水蛭素、血栓调节蛋白、内皮蛋白C受体、CD39以及它们的组合。在一种实施方案中，所述至少两种抗凝剂包括EPCR和TBM。在另一种实施方案中，所述至少三种抗凝剂包括EPCR和TFPI。
在一种实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物缺乏αGal的表达（或表达减少），和被遗传修饰以掺入和表达至少五种另外的转基因，其中所述至少五种另外的转基因包括至少三种抗凝剂。在某些实施方案中，所述至少三种抗凝剂选自组织因子途径抑制剂、水蛭素、血栓调节蛋白、内皮蛋白C受体、CD39以及它们的组合。在一种实施方案中，所述至少三种抗凝剂包括EPCR、TBM以及TFPI。在另一种实施方案中，所述至少三种抗凝剂包括EPCR、TBM以及CD39。
在一种实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物缺乏αGal的表达（或表达减少），和被遗传修饰以掺入和表达至少六种另外的转基因，其中所述至少六种另外的转基因包括至少两种抗凝剂。在某些实施方案中，所述至少两种抗凝剂选自组织因子途径抑制剂、水蛭素、血栓调节蛋白、内皮蛋白C受体、CD39以及它们的组合。在一种实施方案中，所述至少两种抗凝剂包括EPCR和TBM。在另一种实施方案中，所述至少三种抗凝剂包括EPCR和TFPI。任选地，所述至少六种另外的转基因还包括至少一种免疫抑制剂。
在一种实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如，有蹄动物、猪动物），所述转基因动物缺乏αGal的表达（或表达减少），和被遗传修饰以掺入和表达至少六种另外的转基因，其中所述至少六种另外的转基因包括至少三种抗凝剂。在某些实施方案中，所述至少三种抗凝剂选自组织因子途径抑制剂、水蛭素、血栓调节蛋白、内皮蛋白C受体、CD39以及它们的组合。在一种实施方案中，所述至少三种抗凝剂包括EPCR、TBM以及TFPI。在另一种实施方案中，所述至少三种抗凝剂包括EPCR、TBM以及CD39。
（iii）细胞保护转基因
在一种实施方案中，本发明提供了一种适合用作异种移植器官、组织和细胞来源的转基因供体动物（例如猪动物），其中所述供体动物被遗传修饰以掺入和表达至少一种细胞保护转基因（“细胞保护剂”）。在例示性实施方案中，本发明提供了一种转基因动物（例如猪），其包含导致如下结果的遗传修饰：(i) αGal表达缺乏，和 (ii) 在单基因座掺入和表达至少四种转基因，其中所述至少四种转基因中的至少一种是细胞保护转基因。
细胞保护剂转基因考虑包括抗凋亡剂、抗氧化剂和抗炎剂。实例包括：
（a）A20：A20提供抗炎和抗凋亡活性。血管化的移植器官可以受保护不受通过抗炎、抗凝剂和/或抗凋亡分子的内皮细胞激活和细胞损害。在具有用于调节急性血管排斥（AVR）的巨大潜力的基因中有人A20基因（hA20），其首先鉴定为在人脐静脉内皮细胞中的肿瘤坏死因子（TNF）-α诱导因子。分别地经由几个级联的封闭和转录因子核因子-κB，通过保护内皮细胞不受TNF介导的凋亡和炎症，人A20具有双重细胞保护功能。已产生了活的A20转基因小猪，并且在这些动物中，hA20的表达局限于骨骼肌、心脏和PAEC，其通过hA20表达保护不受TNF介导的凋亡和至少部分不受CD95（Fas）L介导的细胞死亡。此外，来自hA20转基因克隆的猪的心肌细胞部分受保护不受心脏病发作（Oropeza等人，Xenotransplantation. 2009November；16（6）:522-34）。
（b）HO-1：HO提供抗炎、抗凋亡和抗氧化剂活性。血红素氧化酶（HO），血红素分解代谢中的限速酶，也命名为HSP32，属于热休克蛋白质成员，其中血红素环切割成亚铁离子、一氧化碳（CO）和胆绿素，其随后通过胆绿素还原酶转换为胆红素。已克隆了HO的3种同种型，包括HO-1、HO-2和HO-3。HO-1的表达是高度可以诱导的，而HO-2和HO-3是组成型表达的（Maines M D等人，Annual Review of Pharmacology & Toxicology 1997；37:517-554，和Choi A M等人，American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology 1996；15:9-19）。HO-1−/−小鼠的分析暗示编码HO-1的基因调节铁稳态，并且充当具有潜在抗氧化剂、抗炎和抗凋亡效应的细胞保护基因（Poss K D等人，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 1997；94:10925-10930，PossK D等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 1997；94:10919-10924，和Soares M P等人，Nature Medicine 1998；4:1073-1077）。类似发现近期在人中HO-1缺陷的病例报告中描述（Yachie A等人，Journal ofClinical Investigation 1999；103:129-135）。负责HO-1的细胞保护效应包括抗炎、抗氧化和抗凋亡的分子机制由其反应产物介导。HO-1表达可以在体外和体内通过具有不同金属的原卟啉介导。钴原卟啉（CoPP）和铁原卟啉（FePP）可以上调HO-1的表达。相比之下，锡原卟啉（SnPP）和锌原卟啉（ZnPP）抑制HO-1在蛋白质水平的活性。近来，已证明HO-1的表达抑制小鼠至小鼠心脏移植的排斥（Sato K等人，J. Immunol. 2001；166:4185-4194），保护岛细胞不受凋亡，并且改善在移植后岛细胞的体内功能（Pileggi A等人，Diabetes 2001；50：1983-1991）。还已证明HO-1通过基因转移的施用提供不受氧过多诱导的肺损伤的保护（Otterbein L E等人，J Clin Invest 1999；103：1047-1054）、HO-1的上调保护遗传上肥胖的Zucker大鼠肝不受缺血/再灌注损伤（Amersi F等人，J Clin Invest 1999；104：1631-1639），并且HO-1基因的取消或表达调节顺铂诱导的肾小管凋亡（Shiraishi F等人，Am JPhysiol Renal Physiol 2000；278:F726-F736）。在转基因动物模型中，显示HO-1的超表达阻止对于低氧的肺炎症和血管应答（Minamino T等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA2001；98:8798-8803），并且保护心脏不受缺血和再灌注损伤（Yet S F等人，Cir Res 2001；89:168-173）。已产生了携带HO-1转基因的猪，然而，与其在异种移植中的使用相关的临床效应未得到报道（US7,378,569）。
（c）FAT-1：FAT-1提供了抗炎活性。多不饱和脂肪酸（PUFA）在抑制（n-3类别）炎症中起作用。哺乳动物细胞缺乏将n-6转换为n-3 PUFA的去饱和酶。因此，必需n-3脂肪酸必须由饮食供应。然而，与哺乳动物不同，自由生活的线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）表达n-3脂肪酸去饱和酶，其在烃链的n-3位置上将双键引入n-6脂肪酸内，以形成n-3 PUFA。已产生了转基因小鼠，其表达秀丽隐杆线虫fat-1基因，并且因此能够将6系列的饮食PUFA有效转换为3系列的PUFA，例如EPA（20:5 n-3）和DHA（22-6 n-3）。（Kang等人，Nature. 2004 Feb 5；427（6974）:504）。另一个团体产生了转基因小鼠模型，其中fat-1cDNA的密码子就在哺乳动物系统中的有效翻译进一步最佳化；n-3 PUFA的内源产生通过超表达秀丽隐杆线虫n-3脂肪酸去饱和酶基因mfat-1达到。这个团体显示通过mfat-1的转基因表达的n-3 PUFA细胞增加和n-6 PUFA减少在小鼠分离的胰岛中增强葡萄糖-、氨基酸-和GLP-1-刺激的胰岛素分泌，并且致使岛对细胞因子诱导的细胞死亡强烈抗性（Wei等人，Diabetes. 2010 February；59（2）:471-8）。
（d）可溶性TNF-α受体（sTNFR1）：肿瘤坏死因子（TNF、恶液质素（cachexin）或恶病质素，并且以前称为肿瘤坏死因子-α）是涉及全身炎症的细胞因子，并且是刺激急性期反应的一组细胞因子的成员。TNF的主要作用是在免疫细胞的调节中。TNF能够诱导凋亡性细胞死亡，诱导炎症。可溶性TNF-α受体1（sTNFR1）是TNFR1的细胞外结构域和TNF-α的拮抗剂（Su等人，1998. Arthritis Rheum. 41，139–149）。sTNFR1在异种移植物中的转基因表达可能具有有利的抗炎效应。
具有相关抗氧化剂性质的其他细胞保护剂包括但不限于SOD和过氧化氢酶（Catalyse）。氧是关于好氧生物的必需分子，并且在ATP生成中起占优势的作用，即氧化磷酸化。在这个过程期间，活性氧（ROS）包括超氧化物阴离子（O（2）（-））和过氧化氢（H（2）O（2））作为副作用产生。在人中，抗氧化剂防御系统平衡ROS的生成。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶是具有抗氧化剂性质的2种酶。SOD催化超氧化物自由基至过氧化氢的歧化，后者通过过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶转换为水。起因于ROS生成的细胞损害可以在转基因背景中出现。因为减少的抗氧化剂防御，胰腺β细胞对于自由基和炎症损害是特别易受影响的。常用的抗排斥药物在抑制适应性免疫应答方面是极佳的；然而，大多数对于岛是有害的，并且无法充分保护不受起因于岛分离和缺血再灌注损伤的活性氧和炎症。因此，存在用抗氧化剂离体处理岛，或经由在供体组织中的基因治疗或转基因表达来表达抗氧化剂基因的兴趣。EC-SOD和过氧化氢酶的离体基因转移在抗原诱发性关节炎的大鼠模型是抗炎的（Dai等人，Gene Ther. 2003 April；10（7）:550-8）。此外，EC-SOD和/或过氧化氢酶基因通过门静脉的递送显著减弱在小鼠模型中的肝I/R损伤（He等人，Liver Transpl. 2006December；12（12）:1869-79）。在近期小鼠研究中，与未经处理的对照比较，在同基因、亚最佳同基因或异基因移植前，用催化抗氧化剂处理的胰岛显示出极佳的功能。在这个相同研究中，催化抗氧化剂处理的同种异体岛的糖尿病鼠受体显示出移植后改善的升糖控制，并且证实同种异体移植物排斥中的延迟（Sklavos等人，Diabetes. 2010 July；59（7）:1731-8. Epub 2010 Apr 22）。在另一个小鼠研究中，超表达MnSOD的岛移植物比对照移植物起作用长约50％（Bertera等人，Diabetes. 2003 February；52（2）:387-93）。
此外，某些抗凝剂也提供抗炎活性，包括血栓调节蛋白、EPCR和CD39。
在例示性实施方案中，本发明提供一种转基因动物（例如猪），所述转基因动物包含导致如下结果的遗传修饰：(i) αGal表达缺乏，和(ii) 在单基因座掺入和表达至少四种另外的转基因（在至少两种启动子调控下），其中所述至少四种转基因中的至少一种是细胞保护转基因。所述单基因座是天然基因座、修饰的天然基因座或转基因的基因座。至少两种转基因可以以MCV提供，掺入可以包括基因编辑工具。任选地，所述动物可以具有一种或多种另外的遗传修饰。
在例示性实施方案中，本发明提供一种转基因动物（例如猪），所述转基因动物包含导致如下结果的遗传修饰：(i) αGal表达缺乏，和(ii) 在单基因座掺入和表达至少五种、至少六种、至少七种或至少八种转基因，或在一个基因座掺入和表达至少四种转基因和在第二基因座掺入和表达一种或更多种转基因，其中所述至少一种转基因是细胞保护转基因，其中所述至少四种转基因在至少两种启动子调控下，所述启动子可以为组成型、遍在性、组织特异性或可诱导性调节的启动子系统。所述转基因可以以MCV提供，掺入可以包括基因编辑工具。所述单基因座可以是天然基因座、修饰的天然基因座或转基因的基因座。任选地，所述动物可以具有一种或多种另外的遗传修饰。
D. 转基因动物的产生
转基因动物可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，所述方法包括但不限于选择育种，核转移，DNA引入卵母细胞、精子、受精卵或卵裂球内，或经由胚胎干细胞的使用。如本文进一步所述的，也可以利用基因编辑工具。
在一些实施方案中，可以在动物中鉴定遗传修饰，所述动物随后一起育种，以形成具有遗传修饰的所需组（或单一遗传修饰）的动物群。这些后代可以进一步育种，以在其后代中产生不同或相同组的遗传修饰（或单一遗传修饰）。只要需要，对于具有一种或多种所需遗传修饰的动物的这种育种循环就可以继续。在这个背景中的“群”可以包含随着时间过去产生的具有一种或多种相同或不同遗传修饰的多代动物。“群”还可以指具有一种或多种相同或不同遗传修饰的单代动物。
对于遗传修饰（经由例如但不限于同源重组、随机插入/整合、核酸酶编辑、锌指加TALEN核酸酶、CRISPR/Cas 9核酸酶）有用的细胞包括例如上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角化细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、淋巴细胞（B和T淋巴细胞）、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、单个核细胞、成纤维细胞、心肌细胞及其他肌细胞等。此外，用于产生遗传修饰动物的细胞（经由例如但不限于核转移）可以得自不同器官，例如皮肤、肺、胰腺、肝、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾、尿道及其他泌尿器官等。细胞可以得自身体的任何细胞或器官，包括所有体细胞或生殖细胞。
另外，可以进行遗传修饰的动物细胞可以得自多种不同器官和组织，例如但不限于皮肤、间充质、肺、胰腺、心脏、肠、胃、膀胱、血管、肾、尿道、生殖器官，和完整或部分胚胎、胎儿或成体动物的分解制备物。在本发明的一种实施方案中，细胞可以选自但不限于上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角化细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、淋巴细胞（B和T）、巨噬细胞、单核细胞、单个核细胞、心肌细胞、其他肌细胞、粒层细胞、卵丘细胞、表皮细胞、内皮细胞、郎格罕氏岛细胞、血细胞、血液前体细胞、骨细胞、骨前体细胞、神经干细胞、原始干细胞、成人干细胞、间充质干细胞、肝细胞、角化细胞、脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、微血管内皮细胞、成纤维细胞、肝星形细胞、主动脉平滑肌细胞、心肌细胞、神经元、枯否细胞、平滑肌细胞、许旺细胞和上皮细胞、红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脂肪细胞、软骨细胞、胰岛细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、耳下腺细胞、肿瘤细胞、神经胶质细胞、星形细胞、红细胞、白细胞、巨噬细胞、上皮细胞、体细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、毛细胞、膀胱细胞、肾细胞、视网膜细胞、视杆细胞、视锥细胞、心细胞、起搏细胞、脾细胞、抗原呈递细胞、记忆细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、肌细胞、卵巢细胞、子宫细胞、前列腺细胞、阴道上皮细胞、精细胞、睾丸细胞、生殖细胞、卵细胞、莱迪希（leydig）细胞、管周细胞、睾丸支持细胞、黄体素细胞、子宫颈细胞、子宫内膜细胞、乳房细胞、滤泡细胞、粘液细胞、纤毛细胞、非角质化上皮细胞、角质化上皮细胞、肺细胞、杯状细胞、柱状上皮细胞、鳞状上皮细胞、骨细胞、成骨细胞和破骨细胞。在一种可选的实施方案中，可以使用胚胎干细胞。可以采用胚胎干细胞系，或可以从宿主例如猪动物中新鲜获得胚胎干细胞。细胞可以在合适的成纤维细胞滋养层上生长，或在白血病抑制因子（LIF）的存在下生长。
胚胎干细胞是优选生殖细胞类型，可以采用胚胎干细胞系，或可以从宿主例如猪动物中新鲜获得胚胎干细胞。细胞可以在合适的成纤维细胞滋养层上生长，或在白血病抑制因子（LIF）的存在下生长。
在其他谱系中，特别有利的细胞包括干细胞例如造血干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞等，郎格罕氏岛，可以分泌多巴胺的肾上腺髓质细胞，成骨细胞，破骨细胞，上皮细胞，内皮细胞，白细胞例如B和T淋巴细胞，骨髓单核细胞等，神经元，神经胶质细胞，神经节细胞，视网膜细胞，肝脏细胞例如肝细胞，骨髓细胞，角化细胞，毛囊细胞和成肌细胞（肌）细胞。
在一种具体实施方案中，细胞可以为成纤维细胞或具有与成纤维细胞无法区分的形态或表型的成纤维细胞样细胞，或在老化前至少10或至少12或至少14或至少18或至少20天的寿命，或足以允许同源重组和非衰老核的核转移的寿命；在一个具体实施方案中，细胞可以为胎儿成纤维细胞。成纤维细胞是合适的体细胞类型，因为它们可以大量得自发育中的胎儿和成年动物。这些细胞可以在体外以快速倍增时间容易地繁殖，并且可以克隆繁殖用于在基因靶向程序中使用。待使用的细胞可以来自胎儿动物，或可以为新生儿或来自起源中的成体动物。细胞可以为成熟或未成熟的且是分化或非分化的。
（i）同源重组
同源重组允许内源基因中的位点特异性修饰，并且从而新改变可以改造到基因组内。同源重组中的主要步骤是DNA链交换，这涉及具有含有互补序列的至少一条DNA链的一对DNA双链体，以形成含有异源双链体DNA的中间重组结构（参见例如，Radding，C. M.（1982）Ann. Rev. Genet. 16：405；美国专利号4,888,274）。异源双链体DNA可以采取几个形式，包括含有三联体形式的三条DNA链，其中单条互补链侵入DNA双链体内（Hsieh等人（1990）Genes and Development 4：1951；Rao等人，（1991）PNAS 88:2984）），并且当2条互补DNA链与DNA双链体配对时，可以形成经典Holliday重组连接或卡形结构（Holliday，R.（1964）Genet. Res. 5：282），或双重-D环（于1991年9月4日提交的“Diagnostic Applications ofDouble-D Loop Formation”美国序列号07/755,462）。形成后，异源双链体结构可以通过链断裂和交换分辨，从而使得所有或部分侵入DNA链剪切成受体DNA双链体，加入或替换受体DNA双链体的区段。可选地，异源双链体结构可以导致基因转换，其中使用侵入链作为模板，侵入链的序列通过错配碱基修复转移至受体DNA双链体（Genes，第3版（1987）Lewin，B.，John Wiley，New York，N.Y.；Lopez等人（1987）Nucleic Acids Res. 15：5643）。无论是通过断裂和再连接的机制还是通过基因转换的一种或多种机制，在同源配对关节上异源双链体DNA的形成可以作用于将遗传序列信息从一个DNA分子转移到另一个。
同源重组（基因转换和典型链断裂/再连接）在DNA分子之间转移遗传序列信息的能力致使靶向同源重组成为基因工程和基因处理中的有力方法。
在同源重组中，进入的DNA与基因组中的位点相互作用且整合到基因组的位点内，所述位点含有基本上同源的DNA序列。在非同源（“随机”或“不正当”）整合中，进入的DNA在基因组中的同源序列上未发现，而是在其他地方在大量潜在位置之一上整合。一般而言，用高等真核生物细胞的研究已揭示同源重组的频率远远小于随机整合的频率。这些频率的比具有用于“基因靶向”的直接牵涉，所述“基因靶向”取决于经由同源重组的整合（即在基因组中在外源“靶向DNA”和相应“靶DNA”之间的重组）。本发明可以使用同源重组以灭活基因或插入片段，并且上调或激活细胞例如上文描述的细胞中的基因。DNA可以包含在特定基因座上一种或多种基因的至少部分，伴随一种或多种天然基因引入至少一个、任选两个拷贝内的改变，以便阻止功能基因产物的表达。改变可以为插入、缺失、替换、突变或其组合。当改变引入待灭活基因的仅一个拷贝内时，具有靶基因的单个未突变拷贝的细胞扩增，并且可以实施第二个靶向步骤，其中改变可以与第一个改变相同或不同，通常不同，并且当涉及缺失或替换时，可以重叠至少部分最初引入的改变。在这个第二个靶向步骤中，可以使用具有相同臂（arms）的同源性但含有不同哺乳动物选择性标记的靶向载体。所得到的转化体就功能靶抗原的不存在进行筛选，并且细胞的DNA可以进一步筛选，以确保野生型靶基因的不存在。可选地，关于表型的纯合性可以通过育种对于突变杂合的宿主来达到。
许多文件描述在哺乳动物细胞中同源重组的使用。这些文件的举例说明是Kucherlapati等人（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3153-3157；Kucherlapati等人（1985）Mol. Cell. Bio. 5:714-720；Smithies等人（1985）Nature 317:230-234；Wake等人（1985）Mol. Cell. Bio. 8:2080-2089；Ayares等人（1985）Genetics 111:375-388；Ayares等人（1986）Mol. Cell. Bio. 7:1656-1662；Song等人（1987）Proc. Natl. Acad.Sci. USA 84:6820-6824；Thomas等人（1986）Cell 44:419-428；Thomas和Capecchi,（1987）Cell 51：503-512；Nandi等人（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3845-3849；和Mansour等人（1988）Nature 336:348-352；Evans和Kaufman,（1981）Nature 294:146-154；Doetschman等人（1987）Nature 330:576-578；Thoma和Capecchi,（1987）Cell 51:503-512；Thompson等人（1989）Cell 56:316-321。
在一种实施方案中，本发明所述转基因动物中掺入和表达的所述至少四种转基因通过同源重组引入。在另一种实施方案中，本发明所述转基因动物中掺入和表达的所述至少四种转基因中的至少一种通过同源重组引入。
（ii）随机插入
在一种实施方案中，编码转基因序列的DNA可以随机插入细胞的染色体内。随机整合可以起因于本领域技术人员已知的将DNA引入细胞内的任何方法。这可以包括但不限于电穿孔，声孔作用，基因枪的使用，脂转染，磷酸钙转染，树枝状聚合物（dendrimers）的使用，微注射，病毒载体包括腺病毒、AAV和逆转录病毒载体的使用，和II组核酶。在一种实施方案中，编码DNA可以设计为包括报道基因，从而使得转基因或其表达产物的存在可以经由报道基因的激活检测到。可以使用本领域已知的任何报道基因，例如上文描述的那些。所述报道基因还可以为被添加至细胞的转基因（例如DAF或CD46或EPCR或CD47）中的一种，使得所述转基因的细胞表面表达可以与流式细胞术（和所述转基因的特异性荧光抗体）一起使用作为基因转移和后续的转基因表达（和共插入的转基因组合）的富集工具。通过在细胞培养中选择其中报道基因已激活的那些细胞，可以选择含有转基因的细胞。在其他实施方案中，编码转基因的DNA可以经由电穿孔引入细胞内。在其他实施方案中，DNA可以经由脂转染、感染或转化引入细胞内。在一种实施方案中，电穿孔和/或脂转染可以用于转染成纤维细胞。在一种具体实施方案中，转染的成纤维细胞可以用作用于核转移的核供体，以如本领域已知的和下文描述的生成转基因动物。
已对报道基因的存在进行染色的细胞随后可以通过FACS分选，以富集细胞群体，从而使得我们具有更高百分比的含有编码目的转基因的DNA的细胞。在其他实施方案中，FACS分选的细胞随后可以培养一段时间例如12、24、36、48、72、96或更多小时，或此类时间段，以允许DNA整合以获得稳定转染的细胞群体。
在一种实施方案中，在一种实施方案中，本发明所述转基因动物中掺入和表达的所述至少四种转基因通过随机整合引入。在另一种实施方案中，本发明所述转基因动物中掺入和表达的所述至少四种转基因中的至少一种通过随机整合引入。例如，包含至少两种转基因的双顺反子载体通过随机整合掺入基因组。
（iii）靶向基因组编辑
在例示性实施方案中，利用基因组编辑工具将转基因掺入动物。这些工具包括但不限于核酸酶和位点特异性重组酶。在例示性实施方案中，插入方法通过利用基因编辑工具的基因组编辑方法来促进，所述基因编辑工具例如但不限于整合酶（重组酶）、CRISPR/CAS 9核酸酶、TALAN核酸酶、锌指核酸酶。
所述转基因可以靶向选自天然基因座、修饰的天然基因座或转基因的基因座（例如着陆台）的单基因座。所述天然基因座可以为例如GGTA1、ß4GalNT2、CMAH、ROSA26、AAVS1。所述天然基因座可以被修饰，即为修饰的天然基因座，例如修饰的GGTA1、ß4GalNT2或CMAH。
在例示性实施方案中，所述转基因可以靶向着陆台和/或停靠位点或其他稳定的表达位点。在一种实施方案中，着陆台和/或停靠载体可以被插入任何目的基因座，例如GGTA1、CMAH、ß4Gal、ROSA26、AAVS1，或转基因可以靶向任何已知的“安全港”基因座，或可以提供有益基因表达模式的任何预定的基因座，或其中预定的基因座还可以灭活其中同时插入和敲除对移植结果有益的优选基因。在另一种实施方案中，可以利用基因编辑以产生双链断裂，这起始了DNA修复机制已产生小的插入、缺失或核酸取代（INDEL），导致靶位点基因灭活或敲除，在这些情况下，在一个预定基因座（例如GGTA1、CMAH、B4GalNT2）的INDEL可以与在另一个基因座的多顺反子载体的基因编辑增强的敲入在细胞或所产生的克隆猪中同时产生。
在一种具体的实施方案中，基因编辑用于同时（使用多重Crispr-Cas9指导的RNA、TALEN或ZFN（或它们的组合））灭活猪基因组中的一个、两个或三个内源性基因座（例如GGTA1、CMAH、B4GalNT2中的一个或所有），其中这些基因编辑增强的修饰中的一种或多种还导致多顺反子载体的靶向插入，在所述天然基因座或修饰的天然基因座中的一种或多种上至少四种转基因在至少两种启动子的调控下。
A. 锌指核酸酶/TALEN
在一种实施方案中，利用锌指核酸酶（ZFN）掺入转基因。锌指核酸酶为非特异性DNA裂解基序与具有序列特异性锌指蛋白的融合物。核酸酶活性衍生于FokI细菌限制性核酸内切酶，能够产生单链破坏。使用两种FokI酶对两个DNA结合结构域二聚化进行ZFN操作以产生具有18bp 特异性的双链断裂。
在另一种实施方案中，使用转录激活子样效应物核酸酶（TALEN）掺入转基因。
类似ZFN发挥作用，TALEN通过将FokI 核酸内切酶栓系于DNA结合结构域而产生双链断裂。在此过程中，TALEN指导的致突变的靶向效率据报道有达到73.1%，有27.8%的双等位基因敲除率。TALEN和ZFN的区别在于其基因设计容易、成本降低以及稍改进的靶向频率。
在一种实施方案中，本发明利用将ZFN和TALEN直接注射至猪受精卵，这能够引入外源性基因或小的插入或缺失或核苷酸取代，产生具有所需遗传修饰的猪仔。
B. CRISPR/CAS9核酸酶
在另一种实施方案中，利用CRISPR/CAS9核酸酶掺入转基因。CRISPR/Cas9衍生自通过RNA指导的靶向裂解外源性DNA 的细菌防御机制。在细菌中，外源性DNA被消化并插入CRISPR基因座，由此而制备CRISPR RNA（crRNA）。这些短RNA序列然后与基因组中的同源性（预测外源性）序列结合。当同源性基因组序列之后是3’端合适的“原型间隔序列侧接基序（PAM）”，Cas9核酸内切酶产生双链断裂。PAM间隔序列有助于防止CRISPR基因座自身被靶向。CRISPR/Cas9系统已被证实在细菌外有用，在2013年首次用于从猪基因组去除αGal。最常用的系统源于化脓链球菌，其具有NGG的3’ PAM序列，其中N表示任何核苷酸。此系统允许在GN19NGG组成的任何猪基因组序列中产生突变事件。
CRISPR/Cas9系统还可以连同同源性指导的修复（HDR）一起使用，所述同源性指导的修复（HDR）为天然存在的核酸修复系统，由DNA中的双链断裂（DSB）的存在启动（Liang 等人，1998）。更具体地，CRISPR/Cas9系统可以用于产生靶向的双链断裂，其可以用于调控HDR基因组工程技术的特异性（Findlay 等人，2014; Mali 等人，February 2014; Ran 等人，2013），用于修饰许多生物体包括哺乳动物和人的基因组（Sander和Joung, 2014）。
在RNA指导的DNA特异性位点裂解以产生双链断裂之后，可插入感兴趣的DNA片段或DNA构建体。此供体模板、片段或构建体具有所需的插入或修饰，侧接与裂解的DNA钝末端具有同源性的DNA片段。由此，细胞的天然DNA修复机制可用于插入所需的遗传材料，其编辑具有高精确性的靶细胞的基因组，联合已知的任何基因组编辑技术利用同源性驱动的重组以产生高靶向双链断裂。以此方式进行的基因组修饰可用于插入新型基因（被称为“增强的同源性驱动的插入或敲入”被描述为DNA插入），和同时敲除现有的基因（Mali 等人，Feb2013）。
CRISPR/Cas系统比先前的位点特异性核酸酶要提供数个优点。首先，Cas9核酸内切酶表现为DNA裂解的第一无约束方法。其自由与多重指导RNA结合，由此使得单转染内的数个基因座的同时靶向。这使得单细胞上多重基因敲除有效组合。2013年，GGTA1、GGTA1/iGb3S、GGTA1/CMAH以及GGTA1/iGb3S/CMAH纯合敲除细胞的产生以单反应实现。CRISPR/Cas9系统已成功用于在多种脊椎动物中产生转基因动物，包括斑马鱼、猴、小鼠、大鼠以及猪，参见Withworth 等人，Biol. Reprod. 91(3):78, 第1–13页 [2014]，和Li 等人;Xenotransplantation 22(1), 第20-31页 [2015]。
靶向效率或所需实现的突变的百分比是评估基因组编辑工具的最重要的参数之一。Cas9的靶向效率有利地与更多确立的方法例如TALEN或ZFN具有可比性。例如，在人细胞中，专门设计的ZFN和TALEN可以仅实现范围为1%至50%的效率。相比之下，已报道Cas9系统在斑马鱼和植物中具有达>70%的效率，在诱导的多能干细胞中效率范围为2–5%。
在一种实施方案中，本发明可以利用CRISPR/Cas9系统通过将特定设计靶向目的基因的CRISPR微注射至“体内”衍生的受精卵而产生转基因猪（例如有蹄动物、猪动物）。
在另一种实施方案中，本发明可以利用CRISPR/Cas9系统通过使用特定设计靶向目的基因的CRISPR之后是SCNT来修饰供体体细胞而产生转基因猪（例如有蹄动物、猪动物）
在另一种实施方案中，本发明可以利用CRISPR/Cas9系统通过靶向具有现有遗传修饰的特定区域/序列而产生转基因猪。在更具体的实施方案中，靶向新霉素基因序列的序列。
在另一种实施方案中，本发明可以利用基因组编辑系统例如TALEN、锌指或CRISPR/Cas9系统通过靶向具有现有遗传修饰的特定区域/序列而产生转基因猪（例如有蹄动物、猪动物）。在更具体的实施方案中，靶向可以为天然基因座、修饰的天然基因座或转基因的基因座（例如着陆台）的单基因座。
在另一种实施方案中，利用同源性驱动的重组，经由插入侧接与双链断裂具有同源性的DNA臂或片段的大DNA片段或构建体，通过靶向具有现有遗传修饰的特定区域/序列，CRISPR/Cas9 系统可以用于产生转基因动物（例如有蹄动物、猪动物）。
C. 位点特异性重组酶
在例示性实施方案中，利用位点特异性重组酶掺入转基因。位点特异性重组酶技术广泛用于在细胞DNA的特异性位点实施缺失、插入、易位或倒置。其使得DNA修饰靶向特异性细胞类型或通过特异性外部刺激引发。其在真核细胞和原核细胞系统中均实施。现有高效用于遗传工程策略的数种重组系统。Flp-FRT和Cre-loxP重组酶系统是可逆的，由此有利于位点特异性整合和切除。整合酶介导基因组整合过程，催化高度位点特异性重组反应，导致DNA精确整合、切除和/或倒置。丝氨酸（ФC31, Bxb1, R4）和酪氨酸整合酶（ʎ, P22, HP1）为目前应用于基因组工程的两个主要的整合酶家族。广义上，位点特异性重组过程包括重组酶结合重组酶底物，通过蛋白质-蛋白质相互作用使它们极为接近。在此过程中，底物被裂解，DNA末端在链交换反应中被识别，使得DNA骨架再结合产生重组产物。在大多数情况下，丝氨酸重组酶使用简单的att位点催化高度有效的可逆的重组。
为了利用位点特异性重组酶的高效，停靠点或着陆台包含用于重组酶底物结合的附着点，例如att位点，或者，重组系统例如 Flp-FRT和Cre-loxP可以在细胞系和/或动物品系的所需基因座被引入。这种停靠载体插入靶基因组是随机的或通过同源重组实现。这使得实现连续数轮的质粒整合，其中，质粒或载体可以包含不同的转基因和/或另外的DNA序列。反过来，重组系统例如Flp/FRT可以用于去除不想要的载体和标记序列。
（iv）用于产生转基因动物的载体
核酸靶向载体构建体可以设计为在细胞中达到同源重组。在一种实施方案中，靶向载体使用“启动子陷阱”进行设计，其中在靶向的基因座的整合允许所插入的转基因的开放阅读框利用外源性或天然启动子以驱动所插入的基因（或所插入的选择性标记，例如Neo或Puro）表达。在具体的实施方案中，使用“多聚腺苷酸陷阱”设计靶向载体。与启动子陷阱不同，多聚腺苷酸陷阱载体捕获更广谱的基因，包括在靶细胞（即成纤维细胞或ES细胞）中不表达的那些。多聚腺苷酸陷阱载体包括驱动缺乏多聚腺苷酸信号的选择性标记基因表达的组成型启动子。替换多聚腺苷酸信号的是设计为剪接到下游外显子内的剪接供体位点。在这个策略中，选择性标记基因的mRNA可以在捕获内源基因的多聚腺苷酸信号后得到稳定，与其在靶细胞中的表达状态无关。在一种实施方案中，构建了包含选择性标记的靶向载体，所述选择性标记缺乏关于多聚腺苷酸的信号。
这些靶向载体可以通过任何合适方法引入哺乳动物细胞内，所述方法包括但不限于转染、转化、病毒介导的转导、或用病毒载体感染。在一种实施方案中，靶向载体可以含有与目的基因组序列同源的3'重组臂和5'重组臂（即侧接序列）。3'和5'重组臂可以这样进行设计，从而使得它们侧接基因组序列的至少一个功能区的3'和5'末端。功能区的靶向可以致使其失活，这导致细胞不能产生功能蛋白质。在另一种实施方案中，同源DNA序列可以包括一个或多个内含子和/或外显子序列。除核酸序列外，表达载体可以含有选择性标记序列，例如增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因序列、起始和/或增强子序列、多聚腺苷酸尾序列、和/或提供构建体在原核和/或真核宿主细胞中的表达的核酸序列。选择性标记可以位于5'和3'重组臂序列之间。
细胞的靶向基因座的修饰可以通过将DNA引入细胞内产生，其中DNA具有与靶基因座的同源性并且包括标记基因，允许选择包含整合构建体的细胞。在靶载体中的同源DNA将与在靶基因座上的染色体DNA重组。标记基因可以在两侧上由同源DNA序列3'重组臂和5'重组臂侧接。用于构建靶向载体的方法已在本领域中描述，参见例如，Dai等人，NatureBiotechnology 20：251-255，2002；WO 00/51424。在此实例中，选择性标记基因可以为无启动子的新霉素磷酸转移酶（Neo）基因，其不仅导致Neo的靶向插入和表达（通过捕获和利用内源性猪αGal基因启动子），而且导致来自所述靶向插入的靶基因座（例如GGTA1）功能性灭活和GGTA1催化结构域破坏。
多种酶可以催化外源DNA插入宿主基因组内。病毒整合酶、转座酶和位点特异性重组酶介导病毒基因组、转座子或噬菌体整合到宿主基因组内。具有这些性质的酶的广泛集合可以衍生自广泛多样的来源。逆转录病毒组合几个有用特征，包括其基因组的相对简单性、易于使用及其整合到宿主细胞基因组内的能力，允许在转导的细胞或其后代中的长期转基因表达。因此，它们已用于大量基因治疗方案中。基于慢病毒载体的载体已成为用于基因治疗和转基因应用的有吸引力的候选物，如腺伴随病毒（sdeno-associated virus）一样，其为连同辅助病毒一起在哺乳动物细胞中共复制的小DNA病毒（细小病毒属），所述辅助病毒例如腺病毒、单纯疱疹病毒或人巨细胞病毒。病毒基因组基本上由仅两个ORF（rep，非结构蛋白质，和cap，结构蛋白质）组成，通过可以变剪接和可以变启动子使用由所述ORF衍生（至少）7种不同多肽。在辅助病毒的存在下，rep蛋白质介导AAV基因组的复制。整合和因此潜伏病毒感染在不存在辅助病毒的情况下出现。转座子也是有利的。这些是可以在多种生物中发现的移动DNA的区段。尽管活跃转座子在许多原核系统和昆虫中发现，但在脊椎动物中不存在功能天然转座子。果蝇P元件转座子已作为基因组改造工具使用多年。睡美人转座子（sleeping beauty transposon）由在类鲑鱼中发现的无功能转座子拷贝建立，并且在哺乳动物细胞中比原核和昆虫转座子明显更活跃。位点特异性重组酶是催化在DNA区段之间的DNA链交换的酶，所述DNA区段仅具有有限程度的序列同源性。它们与长度30 – 200个核苷酸的识别序列结合，切割DNA主链，交换涉及的两个DNA双螺旋且再连接DNA。在一些位点特异性重组系统中，简单多肽足以执行所有这些反应，而其他重组酶需要不同数目的辅助蛋白质以实现这些任务。位点特异性重组酶可以分类为具有不同生物化学性质的两个蛋白质家族，即酪氨酸重组酶（其中DNA与酪氨酸残基共价附着）和丝氨酸重组酶（其中共价辅助在丝氨酸残基上出现）。用于基因组修饰方法的最流行的酶是Cre（衍生自大肠杆菌噬菌体P1的酪氨酸重组酶）和phiC3l整合酶（衍生自链霉菌属（Streptomyces）噬菌体phiC3l的丝氨酸重组酶）。几个其他噬菌体衍生的位点特异性重组酶（包括Flp、λ整合酶、噬菌体HK022重组酶、噬菌体R4整合酶和噬菌体TP901-1整合酶以及bxb1整合酶）已成功地用于介导稳定基因插入哺乳动物基因组内。近来，位点特异性重组酶已从链霉菌属噬菌体纯化。phiC31重组酶是解离酶家族的成员且介导噬菌体整合。在这个过程中，噬菌体attP位点与细菌基因组中的相应attP位点重组。交换生成两个位点，attL和attR，在不存在辅助蛋白质的情况下，其不再是关于重组酶作用的靶。反应还在哺乳动物细胞中发生，并且因此可以用于介导治疗基因的位点特异性整合。酪氨酸重组酶的位点特异性已难以通过直接蛋白质工程修饰，因为催化结构域和DNA识别结构域是紧密交织的。因此，特异性中的变化通常伴随活性中的丧失。丝氨酸重组酶可能更顺应改造，并且Tn3解离酶的活性过多的衍生物已通过天然DBD交换人锌指转录因子Zif268的锌指结构域进行修饰。所得到的嵌合蛋白质称为Z-解离酶的DNA位点特异性已转变为Zif268的那种。锌指蛋白质可以通过体外蛋白质进化进行修饰，以识别任何DNA序列，因此这种方法可以使得嵌合重组酶的开发成为可能，其可以将治疗基因整合到精确基因组位置内。用于增强或介导重组的方法包括AAV载体介导的位点特异性重组和同源重组的组合，和锌指核酸酶介导的重组（参考：Geurts等人，Science，325：433，2009）。
如本文使用的，术语“载体”指对插入的核酸提供有用的生物学或生物化学性质的核酸分子（优选DNA）。根据本发明，“表达载体”包括在载体转化到细胞内后，能够增强一种或多种分子的表达的载体，所述分子已插入或克隆到载体内。此类表达载体的实例包括噬菌体、自主复制序列（ARS）、着丝粒、和能够在体外或细胞中复制或待复制或将所需核酸区段传输至动物的细胞内的所需位置的其他序列。在本发明中有用的表达载体包括染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒或噬菌体的载体，和衍生自其组合的载体，例如粘粒和噬菌粒或基于病毒例如腺病毒、AAV、慢病毒的载体。载体可以具有一个或多个限制性核酸内切酶识别位点，在其上序列可以以可以确定方式切割，而不丧失载体的必需生物学功能，并且核酸片段可以剪接到其内以便造成其复制和克隆。载体可以进一步提供引物位点，例如用于PCR、转录和/或翻译起始和/或调节位点、重组信号、复制子、选择性标记等。明确的是，还可以应用插入所需核酸片段的方法，所述方法不需要使用同源重组、转座子或限制性酶（例如但不限于PCR片段的UDG克隆（美国专利号5,334,575），TA Cloning.RT-PCR克隆（Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.）），以将核酸克隆到根据本发明待使用的载体内。
在靶向基因座上纯合的细胞可以通过将DNA引入细胞内产生，其中DNA与靶基因座具有同源性并且包括标记基因，允许选择包含整合的构建体的细胞。在靶载体中的同源DNA将与染色体DNA重组在靶基因座上。标记基因可以在两侧上由同源DNA序列3'重组臂和5'重组臂侧接。用于构建靶向载体的方法已在本领域中描述，参见例如，Dai等人（2002）NatureBiotechnology 20：251-255；WO 00/51424，图6；和Gene Targeting：A PracticalApproach. Joyner，A. Oxford University Press，USA；第2补充版，2000年2月15日。
可以制备多种构建体用于在靶基因座上的同源重组。通常，构建体可以包括与靶基因座同源的至少25 bp、50 bp、100 bp、500 bp、1kbp、2 kbp、4 kbp、5 kbp、10 kbp、15kbp、20 kbp或50 kbp序列。
在测定靶DNA序列的同源性程度中可以涉及多种考虑，例如靶基因座的大小、序列的可以用性、在靶基因座上双交换事件的相对效率和靶序列与其他序列的相似性。靶向DNA可以包括其中DNA基本上同基因侧接所需序列修饰的序列，具有待修饰的基因组中的相应靶序列。基本上同基因的序列可以与相应靶序列（除所需序列修饰外）至少约95％、97-98％、99.0-99.5％、99.6-99.9％或100％等同。靶向DNA和靶DNA优选可以共享100％等同的至少约75、150或500个碱基对的DNA段。相应地，靶向DNA可以衍生自与待靶向的细胞系紧密相关的细胞；或靶向DNA可以衍生自与待靶向的细胞相同细胞系或动物的细胞。
合适的选择性标记基因包括但不限于：赋予在特定培养基底物上生长的能力的基因，例如tk基因（胸苷激酶）或赋予在HAT培养基（次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷）上生长的能力的hprt基因（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶）；允许在MAX培养基（霉酚酸、腺嘌呤和黄嘌呤）上生长的细菌gpt基因（鸟嘌呤/黄嘌呤磷酸核糖转移酶）。参见Song等人（1987）Proc. Nat’lAcad. Sci. U.S.A. 84:6820-6824。还参见Sambrook等人（1989）Molecular Cloning--ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，参见第16章。选择性标记的其他实例包括：赋予对于化合物例如抗生素的抗性的基因，赋予对于在所选底物上生长的能力的基因，编码产生可以检测信号例如发光的蛋白质的基因，例如绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白（eGFP）。广泛多样的此类标记是已知且可以获得的，包括例如抗生素抗性基因例如新霉素抗性基因（neo）（Southern，P.和P. Berg,（1982）J.Mol. Appl. Genet. 1:327-341）；和潮霉素抗性基因（hyg）（Nucleic Acids Research 11:6895-6911（1983），和Te Riele等人（1990）Nature 348:649-651）。在本发明的方法中有用的另外报道基因包括乙酰羟酸合酶（AHAS）、碱性磷酸酶（AP）、β半乳糖苷酶（LacZ）、β葡糖醛酸糖苷酶（GUS）、氯霉素乙酰转移酶（CAT）、绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、青色荧光蛋白（CFP）、辣根过氧化物酶（HRP）、萤光素酶（Luc）、胭脂碱合酶（NOS）、章鱼碱合酶（OCS）及其衍生物。多重选择性标记是可以获得的，其赋予对于下述的抗性：氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可以霉素、杀稻瘟菌素、zeocin、氨甲蝶呤、草丁磷（phosphinothricin）、嘌呤霉素和四环素。测定报道基因的抑制的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于荧光法（例如荧光光谱法、荧光激活细胞分选（FACS）、荧光显微镜检查）、抗生素抗性测定。
还可以使用选择性标记的组合。为了使用标记的组合，可以这样克隆HSV-tk基因，使得它在靶向DNA外（需要时，另一种选择性标记可以置于相反侧面上）。在将DNA构建体引入待靶向的细胞内时，细胞可以在合适抗生素上进行选择。选择性标记还可以用于阴性选择。阴性选择性标记一般杀死它们在其中表达的细胞，因为表达本身是毒性的或产生导致毒性代谢产物的催化剂，例如单纯疱疹病毒I型胸苷激酶（HSV-tk）或白喉毒素A。一般地，阴性选择性标记这样掺入靶向载体内，从而使得它在精确重组事件后丧失。类似地，常规选择性标记例如GFP可以用于使用例如FACS分选所选择的转基因的阴性选择，所述所选择的转基因如果在细胞表面以显著水平表达则可用作功能获取或丧失的“选择性标记”。所插入或靶向的转基因用作选择工具使得在不使用所添加的荧光标记（例如GFP、RFP）或抗生素选择基因的情况下进行阳性选择。在某些情况下，转基因的靶向插入可以灭活靶基因座，致使功能的丧失可以被监测或选择。例如，GGTA1基因座的灭活会消除或减弱靶向细胞与凝集素(IB4)的结合，或B4GalNT2的灭活会消除或减弱DBA凝集素与靶向细胞的结合，在各情况下，在缺乏所述凝集素结合的细胞中，靶向的整合可以被分选或富集。
缺失可以为至少约50 bp，更通常是至少约100 bp，并且一般不超过约20 kbp，其中缺失通常可以包括编码区的至少部分，包括一个或多个外显子的部分、一个或多个内含子的部分，并且可以包括或不包括侧接非编码区的部分，特别是5'非编码区（转录调节区）。因此，同源区域可以延伸超过编码区进入5'非编码区内，或可选地进入3'非编码区内。插入片段可以一般不超过10 kbp，通常不超过5 kbp，一般是至少50 bp，更通常至少200 bp。
一个或多个同源性区域可以包括提供移码或改变关键氨基酸的突变，其中突变可以进一步灭活靶基因，或突变可以校正功能失调的等位基因等。通常，突变可以为精细改变，不超过约5％的同源侧接序列或甚至单个核苷酸变化例如在外显子的活性位点中的点突变。当需要基因的突变时，标记基因可以插入内含子内，以便在转录后从靶基因中切除。
在测定靶DNA序列的同源性程度中可以涉及多种考虑，例如靶基因座的大小、序列的可以用性、在靶基因座上双交换事件的相对效率和靶序列与其他序列的相似性。靶向DNA可以包括其中DNA基本上同基因侧接所需序列修饰的序列，具有待修饰的基因组中的相应靶序列。基本上同基因的序列可以与相应靶序列（除所需序列修饰外）至少约95％、或至少约97％或至少约98％或至少约99％或在95 - 100％之间、97-98％、99.0-99.5％、99.6-99.9％或100％等同。在一种具体实施方案中，靶向DNA和靶DNA可以共享100％等同的至少约75、150或500个碱基对的DNA段。相应地，靶向DNA可以衍生自与待靶向的细胞系紧密相关的细胞；或靶向DNA可以衍生自与待靶向的细胞相同细胞系或动物的细胞。
构建体可以依照本领域已知的方法进行制备，多个片段可以集合、引入合适载体内、克隆、分析且随后进一步处理，直至已获得所需构建体。可以对序列做出多种修饰，以允许限制性分析、切除、探针的鉴定等。需要时，可以引入沉默突变。在各个阶段时，可以采用限制性分析、测序、用聚合酶链反应的扩增、引物修复、体外诱变等。
构建体可以使用细菌载体包括原核复制系统进行制备，例如可以由大肠杆菌识别的起点，在每个阶段时，构建体可以进行克隆且分析。可以采用与用于插入的标记相同或不同的标记，所述标记可以在引入靶细胞内之前去除。含有构建体的载体已完成后，它可以进一步处理，例如通过细菌序列的缺失、线性化、在同源序列中引入短缺失。在最后处理后，构建体可以引入细胞内。
可以用于允许DNA或RNA构建体进入宿主细胞内的技术包括磷酸钙/DNA共沉淀、DNA微注射到核内、电穿孔、与完整细胞的细菌原生质体融合、转染、脂转染、感染、粒子轰击、精子介导的基因转移、或本领域技术人员已知的任何其他技术。DNA或RNA可以为单或双链，线性或环状，松弛或超螺旋的DNA。对于用于转染哺乳动物细胞的多种技术，参见例如，Keown等人，Methods in Enzymology，第185卷，第527-537页（1990）。
提供下述载体作为实例。细菌的：pBs、pQE-9（Qiagen）、phagescript、PsiXl74、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（Stratagene）；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR54O、pRIT5（Pharmacia）。真核的：pWLneo、pSv2cat、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）pSVK3、pBPv、pMSG、pSVL（Pharmiacia）。此外，可以使用任何其他质粒和载体，只要它们是在宿主中可以复制和活的。本领域已知的载体和商购可以得的那些（及其变体或衍生物）可以依照本发明进行改造，以包括一个或多个重组位点用于在本发明的方法中使用。此类载体可以得自例如Vector Laboratories Inc.、Invitrogen、Promega、Novagen、NEB、Clontech、Boehringer Mannheim、Pharmacia、EpiCenter、OriGenes TechnologiesInc.、Stratagene、PerkinElmer、Pharmingen和Research Genetics。其他目的载体包括真核表达载体例如pFastBac、pFastBacHT、pFastBacDUAL、pSFV和pTet-Splice（Invitrogen）、pEUK-C1、pPUR、pMAM、pMAMneo、pBI101、pBI12l、pDR2、pCMVEBNA和pYACneo（Clontech）、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110和pKK232-8（Pharmacia，Inc.）、p3'SS、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo和pOG44（Stratagene，Inc.）和pYES2、pAC360、pBlueBacHis A、B和C、pVL1392、pBlueBaclll、pCDM8、pcDNA1、pZeoSV、pcDNA3 pREP4、pCEP4和pEBVHis（Invitrogen、Corp.），及其变体或衍生物。
其他载体包括pUC18、pUC19、pBlueScript、pSPORT、粘粒、噬菌粒、YAC's （酵母人工染色体）、BAC's（细菌人工染色体）、P1（大肠埃希杆菌（Escherichia coli）噬菌体）、pQE70、pQE60、pQE9（quagan）、pBS载体、PhageScript载体、BlueScript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A（Stratagene）、pcDNA3（Invitrogen）、pGEX、pTrsfus、pTrc99A、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）、pSPORT1、pSPORT2、pCMVSPORT2.0和pSY-SPORT1（Invitrogen），及其变体或衍生物。还可以使用病毒载体，例如慢病毒载体（参见例如，WO 03/059923；Tiscornia等人PNAS 100:1844-1848（2003））。
另外的有利载体包括来自Invitrogen的pTrxFus、pThioHis、pLEX、pTrcHis、pTrcHis2、pRSET、pBlueBacHis2、pcDNA3.1/His、pcDNA3.1（-）/Myc-His、pSecTag、pEBVHis、pPIC9K、pPIC3.5K、pAO81S、pPICZ、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pGAPZA、pGAPZB、pGAPZC、pBlueBac4.5、pBlueBacHis2、pMelBac、pSinRep5、pSinHis、pIND、pIND（SP1）、pVgRXR、pcDNA2.1、pYES2、pZErO1.1、pZErO-2.1、pCR-Blunt、pSE280、pSE380、pSE420、pVL1392、pVL1393、pCDM8、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pcDNA3.1、pcDNA3.1/Zeo、pSe、SV2、pRc/CMV2、pRc/RSV、pREP4、pREP7、pREP8、pREP9、pREP 10、pCEP4、pEBVHis、pCR3.1、pCR2.1、pCR3.1 -Uni和pCRBac；来自Pharmacia的λ ExCell、λ gt11、pTrc99A、pKK223-3、pGEX-1 λ T、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pEZZ18、pRIT2T、pMC1871、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110、pKK232-8、pSL1180、pNEO和pUC4K；来自Novagen的pSCREEN-1b（+）、pT7Blue（R）、pT7Blue-2、pCITE-4-abc（+）、pOCUS-2、pTAg、pET-32L1C、pET-30LIC、pBAC-2cp LIC、pBACgus-2cp LIC、pT7Blue-2 LIC、pT7Blue-2、λ SCREEN-1、λ BlueSTAR、pET-3abcd、pET-7abc、pET9abcd、pET11abcd、pET12abc、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b-pET-l7xb、pET-19b、pET-20b（+）、pET-21abcd（+）、pET-22b（+）、pET-23abcd（+）、pET-24abcd（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28abc（+）、pET-29abc（+）、pET-30abc（+）、pET-31b（+）、pET-32abc（+）、pET-33b（+）、pBAC- 1、pBACgus-1、pBAC4x-1、pBACgus4x-1、pBAC-3 cp、pBACgus-2 cp、pBACsurf-1、plg、Signalplg、pYX、Selecta Vecta-Neo、Selecta Vecta-Hyg和Selecta Vecta-Gpt；来自Clontech的pLexA、pB42AD、pGBT9、pAS2-1、pGAD424、pACT2、pGAD GL、pGAD GH、pGAD10、pGilda、pEZM3、pEGFP、pEGFP-1、pEGFP-N、pEGFP-C、pEBFP、pGFPuv、pGFP、p6xHis-GFP、pSEAP2-Basic、pSEAP2-Contral、pSEAP2-Promoter、pSEAP2-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Control、pβgal-Promoter、pβgal-Enhancer、pCMV、pTet-Off、pTet-On、pTK-Hyg、pRetro-Off、pRetro-On、pIRES1neo、pIRES1hyg、pLXSN、pLNCX、pLAPSN、pMAMneo、pMAMneo-CAT、pMAMneo-LUC、pPUR、pSV2neo、pYEX4T-1/2/3、pYEX-S1、pBacPAK-His、pBacPAK8/9、pAcUW31、BacPAK6、pTriplEx、2.λgt10、λgt11、pWE15和λTriplEx；来自Stratagene的Lambda ZAP II、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II KS +/-、pBluescript II SK +/-、pAD-GAL4、pBD-GAL4 Cam、pSurfscript、Lambda FIX II、Lambda DASH、Lambda EMBL3、Lambda EMBL4、SuperCos、pCR-Scrigt Amp、pCR-Script Cam、pCR-Script Direct、pBS +/-、pBC KS +/-、pBC SK +/-、Phagescript、pCAL-n-EK、pCAL-n、pCAL-c、pCAL-kc、pET-3abcd、pET-11abcd、pSPUTK、pESP-1、pCMVLacI、pOPRSVI/MCS、pOPI3 CAT,pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pMC1neo PolyA、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415和pRS416。
另外的载体包括例如pPC86、pDBLeu、pDBTrp、pPC97、p2.5、pGAD1-3、pGAD10、pACt、pACT2、pGADGL、pGADGH、pAS2-1、pGAD424、pGBT8、pGBT9、pGAD-GAL4、pLexA、pBD-GAL4、pHISi、pHISi-1、placZi、pB42AD、pDG202、pJK202、pJG4-5、pNLexA、pYESTrp，及其变体或衍生物。
在一种例示性实施方案中，所述载体是双顺反子载体。所述双顺反子载体包括启动子和两种转基因。在一种具体的实施方案中，所述双顺反子载体包括启动子和2A序列侧接的两种转基因。此实施方案使得来自单转录物的多重功能性转基因共表达。更具体地，此实施方案利用短（18-24aa）裂解肽“2A”，所述短裂解肽“2A”使得连接的开放阅读框共表达以自单转录物2A载体系统表达功能性转基因。
在一种例示性实施方案中，所述载体是多顺反子载体（MCV）。在一种实施方案中，MCV包含启动子和至少四种转基因。在一种具体实施方案中，MCV包含在至少两种启动子调控下与2A肽序列连接的四种转基因。此实施方案使得多重功能性转基因自单转录物共表达。更具体地，此实施方案利用短（18-24aa）裂解肽“2A”，所述短裂解肽“2A”使得连接的开放阅读框共表达以自单转录物2A载体系统表达功能性转基因。
在一种例示性实施方案中，所述载体是包含至少两个双顺反子单元的2A-肽MCV载体，其中各双顺反子单元包含2种转基因。在一种具体的实施方案中，一个双顺反子单元受组成型或遍在性启动子（例如CAG）调控，第二双顺反子单元受内皮或组织特异性或可诱导启动子系统调控。在某些实施方案中，仅至少四种转基因在单基因座插入，但其中各转基因受其自身启动子调控或每单基因座插入共至少两种启动子。
在一种例示性实施方案中，所述载体是四基因MCV，其包含至少两种抗凝剂，更具体地，至少三种抗凝剂。
在一种例示性实施方案中，所述载体是四基因MCV载体，其包含至少两种抗凝剂和一种补体抑制剂，更具体地，三种抗凝剂和一种补体抑制剂。
在一种例示性实施方案中，所述载体是四基因MCV载体，其包含两种抗凝剂，一种补体抑制剂和一种免疫抑制剂。
启动子
用于产生本发明的动物的载体构建体可以包括与序列可操作地连接的调节序列（包括但不限于启动子-增强子序列）、“2A”肽技术以及停靠载体。大量合适载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是商购可以得的。
在具体实施方案中，本发明提供了在内皮细胞中表达至少一种转基因（联合在第二相同或不同启动子调控下的至少一种转基因），更具体地至少两种、至少三种或至少四种转基因的动物、组织以及细胞。为了靶向特定组织的表达，使用包含对于内皮细胞表达具有特异性的启动子的载体开发所述动物。在一种具体实施方案中，通过主要在内皮中具有活性的启动子调控表达。
在一种实施方案中，核酸构建体含有与待表达的转基因序列可以操作地连接的调节序列。在一种实施方案中，调节序列可以为启动子序列。在一种实施方案中，启动子可以为可以调节启动子。在此类系统中，药物例如可以用于调节肽是否在动物、组织或器官中表达。例如，当器官或组织是猪的部分时，表达可以被阻止，但一旦猪已移植至人一段时间，表达就被诱导，以克服细胞免疫应答。此外，表达水平可以通过可以调节启动子系统控制，以确保受体的免疫系统的免疫抑制不出现。可以调节启动子序列可以选自但不限于下述基因系统：可以通过金属例如铜诱导的金属硫蛋白启动子（参见Lichtlen和Schaffner，SwissMed Wkly.，2001，131（45-46）:647-52）；四环素调节的系统（参见Imhof等人，J Gene Med.，2000，2（2）:107-16）；蜕皮激素调节的系统（参见Saez等人，Proc Natl Acad Sci USA.，2000，97（26）:14512-7）；细胞色素P450诱导型启动子，例如CYP1A1启动子（参见Fujii-Kuriyama等人，FASEB J.，1992，6（2）:706-10）；米非司酮可以诱导的系统（参见Sirin和Park，Gene.，2003，323:67-77）；香豆素激活的系统（参见Zhao等人，Hum Gene Ther.，2003，14（17）：1619-29）；大环内酯可以诱导的系统（响应大环内酯抗生素例如雷帕霉素、红霉素、克林霉素和罗红霉素）（参见Weber等人，Nat Biotechnol.，2002，20（9）:901-7；Wang等人，Mol Ther.，2003，7（6）:790-800）；和乙醇诱导的系统（参见Garoosi等人，J Exp Bot.，2005，56（416）:163542；Roberts等人，Plant Physiol.，2005，138（3）:1259-67）；链阳性菌素可以诱导的系统（参见Fussenegger等人，Nat Biotechnol.，2000 18（11）:1203-8）；亲电体可以诱导的系统（参见Zhu和Fahl，Biochem Biophys Res Commun.，2001，289（1）:212-9）；和尼古丁可以诱导的系统（参见Malphettes等人，Nucleic Acids Res.，2005，33（12）:e107），免疫可诱导启动子，细胞因子应答启动子（例如，由IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-6或TGF-β（或其他二级途径）诱导，由此可与免疫或炎症反应相关或响应免疫或炎症反应而启动或上调的启动子）。
在一种具体的实施方案，双顺反子载体包含两种转基因和主要在内皮细胞中具有活性的启动子或在所有器官、组织和细胞中遍在表达转基因的组成型启动子。在其他实施方案中，多顺反子载体（MCV）中的至少四种转基因在至少两种启动子的调控下。所述启动子可以为外源性、天然或外源性和天然的组合。
在一种具体的实施方案中，双顺反子载体包含两种转基因和在所有器官、组织和细胞中遍在表达转基因的组成型启动子。
在一种具体的实施方案中，双顺反子载体包含两种转基因和在器官、组织和细胞中调控表达的组织特异性启动子。
在一种例示性实施方案中，所述载体是四基因MCV，其包含在内皮特异性启动子调控下的至少两种抗凝剂。
在一种例示性实施方案中，所述载体是四基因MCV，其包含在组成型启动子调控下的至少一种补体抑制剂转基因和在内皮细胞特异性启动子调控下的至少一种抗凝剂。
在一种例示性实施方案中，所述载体是四基因MCV，其包含在组成型启动子调控下的至少一种补体抑制剂转基因和在第二组成型启动子调控下的至少一种抗凝剂。
在一种例示性实施方案中，所述载体是四基因MCV载体，其包含在内皮细胞启动子调控下的抗凝剂转基因和免疫抑制剂转基因。
在一种例示性实施方案中，所述载体是两基因MCV载体，其包含在至少两种分开的启动子调控下总共两种基因。或者在一种可选的实施方案中，所述载体在链中具有多重转基因，各转基因具有其自身的启动子，所有转基因整合至单基因座中。
在其他实施方案中，在核酸构建体中使用增强子元件，以促进转基因以组织特异性方式增加的表达。增强子是彻底改变基因转录的效率的外部元件（Molecular Biologyof the Gene，第4版，第708-710页，Benjamin Cummings Publishing Company，MenloPark，Calif. .COPYRGT. 1987）。在一种具体实施方案中，pdx-1增强子（也称为IPF-1、STF-1和IDX1（Gerrish K等人，Mol. Endocrinol.，2004，18（3）：533；Ohlsson等人，EMBO J.1993 Nov，12（11）:4251-9；Leonard等人，Mol. Endocrinol.，1993，7（10）:1275-83；Miller等人，EMBO J.，1994，13（5）:1145-56；Serup等人，Proc Natl Acad Sci USA.，1996，93（17）:9015-20；Melloul等人，Diabetes.，2002，51 Suppl 3:S320-5；Glick等人，J BiolChem.，2000，275（3）:2199-204；GenBank AF334615.））与ins2启动子组合使用，用于一种或多种转基因的胰腺特异性表达。在某些实施方案中，动物在与增强子元件组合的启动子的调控下表达转基因。在具体实施方案中，动物包含内皮特异性启动子，例如猪ICAM-2或小鼠Tie-2启动子，且进一步包含增强子元件（例如小鼠Tie-2增强子或CMV增强子）。在其他实施方案中，启动子可以为遍在启动子元件，其进一步包含增强子元件。在特定的元件中，遍在启动子是与内皮特异性Tie-2增强子元件联合使用的CAG（CMV增强子，鸡β-肌动蛋白启动子，兔β-珠蛋白内含子）（Tie2-CAG）。对于Tie2-CAG，预期转基因以组成型和遍在性方式表达，但在内皮细胞核其他体细胞中以甚至更高的水平表达。在一些实施方案中，所述启动子与增强子元件联合使用，所述增强子元件为DNA固有相关或与启动子共定位的非编码区或内含子区。在另一种具体的实施方案中，所述增强子元件是与ICAM-2启动子联合使用的ICAM-2。其他遍在性启动子包括但不限于下列启动子：如CMV和SV40的病毒启动子，以及鸡β-肌动蛋白启动子和γ-Actin启动子、GAPDH启动子、H2K、CD46启动子、GGTA1、泛素和ROSA启动子。
（v）遗传修饰细胞的选择
在某些情况下，转基因细胞具有其为靶向转基因插入或整合（即经由同源重组）到细胞基因组内的结果的遗传修饰。在某些情况下，转基因细胞具有其为非靶向（随机）整合到细胞基因组内的结果的遗传修饰。细胞可以在适当选择的培养基中生长，以鉴定提供合适整合的细胞。显示所需表型的那些细胞随后可以通过限制性分析、电泳、DNA分析、聚合酶链反应或本领域已知的另一种技术进一步分析。通过鉴定显示在靶基因位点的合适插入（或在非靶向应用中，其中随机整合技术已产生所需结果）的片段，可以鉴定其中已出现同源重组（或所需非靶向整合事件）以灭活或以其他方式修饰靶基因的细胞。
选择性标记基因或其他阳性选择剂或转基因的存在确定靶构建体整合到宿主基因组内。显示所需表型的那些细胞随后可以通过限制性消化分析、电泳、DNA分析、聚合酶链反应等进一步分析，以分析DNA，以便确定同源或非同源重组是否出现。这可以通过下述进行测定：采用关于插入片段的探针，并且随后当此类缺失引入时，就延伸超过构建体的侧翼区的基因的存在测序侧接插入片段的5'和3' 区域或鉴定缺失的存在。还可以使用与在构建体内的序列互补且与在构建体外和在靶基因座上的序列互补的引物。如果同源重组已出现，那么以这种方式，可以仅获得具有在互补链中存在的2种引物的DNA双链体。例如，通过证实引物序列或预期大小序列的存在，支持同源重组的出现。
用于筛选同源重组事件的聚合酶链反应在Kim和Smithies,（1988）Nucleic AcidsRes. 16:8887-8903；和Joyner等人（1989）Nature 338:153-156中描述。
得自第一轮靶向（或来自非靶向（随机）整合到基因组内）的细胞系可能对于整合的等位基因是杂合的。其中两个等位基因都被修饰的纯合性可以以许多方式达到。一种方法是生长其中一个拷贝已被修饰的大量细胞，且随后使用不同选择性标记对这些细胞实施另一轮靶向（或来自非靶向（随机）整合）。可选地，纯合子可以通过育种对于经修饰的等位基因杂合的动物获得。在某些情况下，可以希望具有两个不同修饰的等位基因。这可以通过基因靶向（或随机整合）的序贯循环或通过育种杂合子来达到，所述杂合子各自携带所需经修饰的等位基因之一。具有有效靶向双链断裂的基因组编辑事件允许频繁的双等位基因靶向事件，这样，在单转染（或胚胎或受精卵靶向策略）中，可以实现具有高频率的纯合子敲除或敲入事件。这样的基因编辑增强（例如Crispr-CAS9核酸酶）的基因靶向或同源性依赖性修复事件可以包括单等位基因或杂合子、和双等位基因或纯合子敲除（经小核苷酸插入、缺失、取代、或描述为INDEL的其他），以及基因插入，包括单转基因、多重转基因串（在其自身启动子或双顺反子或多顺反子下的转基因串）、或多顺反子载体（包括在至少两种启动子调控下的四转基因多顺反子载体，其中所述启动子可以为组成型或组织特异性，例如，CAG和Icam-2）的单等位基因和双等位基因插入/敲入。可选地，通过使用多重基因编辑核酸酶（例如Crispr/Cas9），可以预期有效产生具有碱基基因型组合（即GGTA1敲除或GGTA1/CD46）的细胞（经转染或感染）或受精卵（同时经微注射），其中一种遗传修饰可以包括四基因MCV敲入（例如在GGTA1）或随机插入（在至少两种启动子调控下），同时核酸酶介导的INDEL在另一基因座（单等位基因或双等位基因，例如在GGTA1或CMAH或B4GalNT2）敲入或随机插入，或在一种优选的实施方案中，多重转基因载体（双顺反子或四基因MCV）在两种不同基因座（着陆台、“安全港”或GGTA1、B4GalNT2、CMAH、ROSA26、AAVS1，或其他预定的基因座，包括天然或修饰的天然基因座）靶向插入，例如在GGTA1的四基因MCV的靶向插入连同在第二基因座（例如CMAH或B4GalNT2）的双顺反子或四基因MCV靶向同源重组（或基因编辑增强的）插入。在某些实施方案中，通过暴露于极高水平的选择试剂，选择技术用于获得来自杂合细胞的同源敲除细胞。此类选择可以例如通过使用抗生素例如遗传霉素（G418）。
已转染或以其他方式接受合适载体的细胞随后可以经由遗传型或表型分析进行选择或鉴定。在一种实施方案中，细胞进行转染，在适当选择的培养基中生长，以鉴定含有整合的载体的细胞。选择性标记基因的存在指出在经转染的细胞中转基因构建体的存在。显示所需表型的那些细胞随后可以通过限制性分析、电泳、DNA分析、聚合酶链反应等进一步分析，以分析DNA，以便证实一种或多种转基因整合到宿主细胞的基因组内。还可以使用与一种或多种转基因序列互补的引物。用于筛选同源重组和随机整合事件的聚合酶链反应是本领域已知的，参见例如，Kim和Smithies，Nucleic Acids Res. 16:8887-8903，1988；和Joyner等人，Nature 338:153-156，1989。通过Thomas和Capecchi，同上，1987；Nicholas和Berg（1983），Teratocarcinoma Stem Cell，编辑Siver，Martin和Strikland（Cold SpringHarbor Lab.，Cold Spring Harbor，N.Y.（第469-497页）；和Linney和Donerly，Cell 35:693-699，1983，突变型多瘤增强子和胸苷激酶启动子以驱动新霉素基因的特异性组合已显示在胚胎干细胞和EC细胞中是活跃的。
已经历同源重组的细胞可以通过许多方法进行鉴定。在一种实施方案中，选择方法可以检测针对细胞的免疫应答的不存在，例如通过人抗gal抗体。在一种优选的实施方案中，选择方法可以利用插入的或靶向的转基因作为允许阳性选择的选择工具，而不使用添加的荧光标记（例如GFP、RFP）或抗生素选择基因。在某些情况下，转基因的靶向插入可以产生细胞表面蛋白，使用所述细胞表面蛋白，可以选择所需转基因阳性表达的合适的转基因特异性荧光标记细胞。可选地，可以灭活靶基因座，致使功能的丧失可以被监测或选择。例如，GGTA1基因座的灭活会消除或减弱靶向细胞与凝集素（IB4）的结合，或B4GalNT2的灭活会消除或减弱DBA凝集素与靶向细胞的结合，在各情况下，在缺乏所述凝集素结合的细胞中，靶向的整合可以被分选或富集。在各情况下，细胞表面的转基因表达使得细胞的选择用于进一步的分析。
在其他实施方案中，选择方法可以包括评估当暴露于细胞或组织时，人血液中的凝血水平。经由抗生素抗性的选择已最通常地用于筛选。这种方法可以检测到在靶向载体上抗性基因的存在，但不直接指出整合是靶向重组事件还是随机整合。可选地，标记可以为荧光标记基因例如GFP或RFP，或经由细胞分选或FACs分析在细胞表面上可以检测的基因。特定技术例如多聚腺苷酸和启动子陷阱技术增加靶向事件的概率，但再次不给出已达到所需表型的直接证据。此外，阴性形式的选择可以用于选择靶向整合；在这些情况下，关于对于细胞致命的因子（例如Tk或白喉A毒素）的基因以这样的方式插入，使得仅靶向事件允许细胞避免死亡。通过这些方法选择的细胞随后可以就基因破坏、载体整合和最后基因耗尽进行测定。在这些情况下，因为选择基于靶向载体整合而不是在改变的表型上的检测，所以可以检测到仅靶向敲除，而不是点突变、基因重排或平截或其他此类修饰。
表征可以进一步通过下述技术完成，包括但不限于：PCR分析、DNA印迹分析、RNA印迹分析、特异性凝集素结合测定和/或测序分析。还可以完成表型表征，包括通过在多种测定中抗小鼠抗体的结合，所述测定包括免疫荧光、免疫细胞化学、ELISA测定、流式细胞术、蛋白质印迹、通过RT-PCR就细胞中的RNA转录的测试。可以通过DNA印迹分析和PCR来确定表型。通过PBMC和内皮细胞的流式细胞术，免疫组织化学（细胞和器官中）、Q-PCR（定量聚合酶链反应）以及蛋白质印迹分析来监测基因表达。转基因的生物活性测定定量和表征补体抑制、血小板聚集、激活的蛋白C形成、ATP酶活性、因子Xa裂解、混合的淋巴细胞反应（MLR）以及细胞凋亡。
在其他实施方案中，GTKO动物或细胞含有另外的遗传修饰。遗传修饰可以包括超过仅同源靶向，但还可以包括外源基因的随机整合，单基因座的基因群或基因串的共整合，任何种类的基因的突变、缺失和插入。通过进一步遗传修饰得自本文描述的转基因细胞和动物的细胞，或通过使本文描述的动物与已进一步遗传修饰的动物育种，可以做出另外的遗传修饰。此类动物可以进行修饰，以消除αGT基因、CMP-Neu5Ac羟化酶基因（参见例如，美国专利号7,368,284）、iGb3合酶基因（参见例如，美国专利公开号2005/0155095）、和/或β1,4 N-乙酰半乳糖胺基转移酶 2基因（ß4GalNT2; 参见例如Estrada JL 等人，Xenotransplantation 22:194-202 [2015]）和Forssman合酶基因（参见例如，美国专利公开号2006/0068479）的至少一个等位基因的表达。
在另外的实施方案中，本文描述的动物还可以含有表达感兴趣的转基因的遗传修饰，所述转基因更具体地来自免疫调节剂、抗凝剂以及细胞保护转基因组成的组的人转基因。在一种优选的实施方案中，除了多重转基因整合（靶向或随机，但超过至少四种基因，其中所述至少四种基因由至少两种启动子调控），还可以实现猪vWF基因座的遗传修饰，包括基因组中猪vWF序列的敲除（功能缺乏）、INDEL以及同时敲除，或包括对一些或所有限定的猪vWF外显子（例如外显子22-28）以来自人vWF基因序列的其人外显子22-28对应物进行靶向敲入和置换。
为了达到这些另外的遗传修饰，在一种实施方案中，细胞可以进行修饰，以含有多重遗传修饰。在其他实施方案中，动物可以一起育种，以达到多重遗传修饰。在一个具体实施方案中，根据本文描述的过程、序列和/或构建体产生的动物例如猪可以与缺乏αGal的表达的动物例如猪育种（例如，如WO 04/028243中所述）。
在另一种实施方案中，负责异种移植物排斥的另外基因的表达可以被消除或减少。此类基因包括但不限于CMP-NEUAc羟化酶基因（CMAH）、β-4GalNT2、异红细胞糖苷酯3（iGb3）合酶基因和Forssman合酶基因。
此外，还可以在本发明的动物和组织中表达负责补体介导的裂解的抑制，编码补体相关蛋白质的基因或cDNA。此类基因包括但不限于CD59、DAF（CD55）和CD46（参见例如，WO99/53042；Chen等人Xenotransplantation，第6卷Issue 3 第194页- 1999年8月，其描述了表达CD59/DAF转基因的猪；Costa C等人，Xenotransplantation. 2002 January；9（1）:45-57，其描述了表达人CD59和H-转移酶的转基因猪；Zhao L等人；Diamond L E等人Transplantation. 2001 Jan. 15；71（1）:132-42，其描述了人CD46转基因猪）。
另外的修饰可以包括化合物的表达，例如下调通过细胞的细胞粘附分子表达的抗体，例如名称为“Suppression of xenograft rejection by down regulation of a celladhesion molecules”的WO 00/31126中所述，和其中例如通过给器官受体施用来自异基因供体生物的可以溶形式的CTLA-4阻止通过信号2的共刺激的化合物，例如如名称为“Immunosuppression by blocking T cell co-stimulation signal 2（B7/CD28interaction）”的WO 99/57266中所述。
（vi）核转移
本文描述的遗传修饰或转基因的动物例如有蹄动物或猪可以使用本领域已知的任何合适技术产生。这些技术包括但不限于微注射（例如原核的和或细胞质的）、卵子或受精卵的电穿孔、和/或体细胞核转移（SCNT）。
本领域已知的任何另外技术可以用于将转基因或多重转基因或MCV载体引入动物内。此类技术包括但不限于原核微注射（参见例如，Hoppe，P. C.和Wagner，T. E.，1989，美国专利号4,873,191）；细胞质微注射（参见例如，Whitworth等人，2014）逆转录病毒介导的基因转移到种系内（参见例如，Van der Putten等人，1985，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA82:6148-6152）；在胚胎干细胞中的基因靶向（参见例如，Thompson等人，1989，Cell 56:313-321；Wheeler，M. B.，1994，WO 94/26884）；胚胎的电穿孔（参见例如，Lo，1983，MolCell. Biol. 3:1803-1814）；细胞枪；转染；转导；逆转录病毒感染；腺病毒感染；腺伴随病毒感染；脂质体介导的基因转移；裸露DNA转移；和精子介导的基因转移（参见例如，Lavitrano等人，1989，Cell 57:717-723）；等。关于此类技术的综述，参见例如，Gordon，1989，Transgenic Anithals，Intl. Rev. Cytol. 115:171-229。在具体实施方案中，CTLA4和/或CTLA4-Ig融合基因在有蹄动物中的表达可以经由这些技术完成。
在一种实施方案中，编码转基因的构建体的微注射可以用于产生转基因动物。在一种实施方案中，核酸构建体或载体可以微注射到受精卵的原核内。在一种实施方案中，构建体或载体可以注射到受精卵的雄性原核内。在另一种实施方案中，构建体或载体可以注射到受精卵的雌性原核内。在一种进一步的实施方案中，构建体或载体、CRISPR、编码Cas9和gRNA（单指导RNA）信使RNA（mRNA）可以被注射至受精卵的细胞质以实现源于错误修复之后使用基因编辑酶处理的基因敲除或基因灭活（插入、缺失、取代），或可以用于实现所述受精卵中转基因或多重基因载体的靶向敲入，导致遗传修饰的稳定传递（参考Whitworth2014）。在另一种实施方案中，可以使用现有的转基因体细胞起始核转移，在胚胎重构和融合之后，可以将基因编辑的核酸酶（例如Crispr/Cas9）注射至具有或不具有转基因载体、多基因载体或MCV的重构的核转移胚胎，这样在二倍体胚胎和后续的胚胎转移之后的转基因猪中发生基因编辑事件。
转基因构建体或载体的微注射可以包括下述步骤：供体雌性的超排卵；卵的手术取出，卵的受精；转基因转录单位注射到受精后的受精卵的细胞质中（例如，推定的在受精后约14小时的受精卵）；和转基因胚胎引入假孕宿主母亲的生殖道内，其通常具有相同物种。参见例如，美国专利号4,873,191，Brinster等人1985. PNAS 82:4438；Hogan等人，in“Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual”. Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986. Robertson，1987，in Robertson，编辑“Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells a Practical Approach” IRL Press，Evnsham. Oxford，England. Pedersen等人，1990. “Transgenic Techniques in Mice--AVideo Guide”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y。转基因猪照常规通过转基因构建体或载体微注射到猪胚胎内产生，参见Withworth等人，Biol.Reprod. 91(3):78, 1–13 [2014]。在一种实施方案中，转基因的存在可以通过下述进行检测：从来自每个小猪的尾部的组织中分离基因组DNA，且用转基因特异性探针对约5微克这种基因组DNA实施核酸杂交分析。在一种具体实施方案中，转基因动物可以根据本领域技术人员已知的任何方法产生，例如如Bleck等人，J. Anim. Sci.，76:3072 [1998]中公开的；以及美国专利号6,872,868；6,066,725；5,523,226；5,453,457；4,873,191；4,736,866；和/或PCT公开号WO/9907829中描述的。
在一种实施方案中，原核微注射方法可以包括例如如本文公开的，将本发明的含至少约50、100、200、300、400或500个拷贝的转基因构建体或载体与选择的启动子连接，并且随后外源DNA可以通过精制玻璃针注射到受精卵内。在一种实施方案中，DNA可以注射到受精卵的雄性原核内。猪受精卵是不透明的并且核结构的显现可以为困难的。在一种实施方案中，猪受精卵的原核或核可以在离心例如以15000 g共3 mm后显现。原核的注射可以在放大下和使用微注射仪器执行。受精卵可以通过钝圆容纳吸管保持，并且透明带、质膜和原核包膜可以通过注射吸管穿透。钝圆容纳吸管可以具有小直径，例如约50 um。注射吸管可以具有比容纳吸管更小的直径，例如约15 um。DNA整合在复制过程中因为宿主DNA的修复功能出现。根据本领域技术人员已知的任何技术，含有外源DNA的这些卵随后可以植入替身母亲内用于胚胎的孕育。
在一些实施方案中，原核微注射可以对受精后12小时的受精卵执行。此类基因的摄取可以延迟数个细胞周期。这个的后果是取决于摄取的细胞周期，仅某些细胞谱系可以携带转基因，导致镶嵌后代。需要时，镶嵌动物可以进行育种，以形成真正的种系转基因动物。
在一种例示性实施方案中，细胞质微注射方法可以通过精细玻璃针将靶向至少一种或多种靶向天然基因的CRISPR、或修饰的天然基因座、编码Cas9和gRNA的mRNA注射至受精卵中。在一种具体实施方案中，靶向至少一种或多种靶向基因（例如GGTA1、B4GalNT2、CMAH，包括多重指导RNA，连同编码Cas9和gRNA的mRNA）可以被注射至受精卵的细胞质中。
体细胞核转移
在其他实施方案中，含有转基因的有蹄动物细胞例如猪细胞可以用作供体细胞，以提供核用于核转移到去核卵母细胞内，以产生克隆的转基因动物。在一种实施方案中，有蹄动物细胞无需表达转基因蛋白质，以便用作供体细胞用于核转移。在一种实施方案中，猪细胞可以进行改造，以表达来自含有启动子的核酸构建体或载体的转基因。可选地，猪细胞可以进行改造，以通过同源重组在内源启动子的调控下表达转基因。在一种实施方案中，转基因核酸序列可以在组织特异性启动子、组织特异性增强子或两者的调控下插入基因组内。在另一种实施方案中，转基因核酸序列可以在组成型启动子的调控下插入基因组内。在具体实施方案中，提供了靶向载体，其设计为允许在体细胞中的靶向同源重组。这些靶向载体可以转化到哺乳动物细胞内，以经由同源重组靶向目的内源基因。在一种实施方案中，靶向构建体将转基因核苷酸序列和选择性标记基因插入内源基因内，以便与上游序列一起在读码框中且产生活性融合蛋白。使用本发明的方法，细胞可以用构建体进行转化，并且借助于选择性标记进行选择，且随后筛选重组体的存在。
本发明提供了经由SCNT用于克隆含有特定转基因的有蹄动物例如猪的方法。一般而言，猪可以通过包含下述步骤的核转移过程产生：获得所需分化的猪细胞以用作供体核的来源；从猪中获得卵母细胞；去核所述卵母细胞；例如通过输注或注射，将所需分化的细胞或细胞核转移到去核卵母细胞内，以形成SCNT单位；激活所得到的SCNT单位；且将所述培养的SCNT单位转移至宿主猪，从而使得SCNT单位发育成胎儿。
核转移技术或核移植技术是本领域已知的（参见例如，Dai等人NatureBiotechnology 20:251-255；Polejaeva等人Nature 407:86-90（2000）；Campbell等人，Theriogenology 68 Suppl 1:S214-3 1（2007）；Vajta等人，Reprod Fertil Dev 19（2）：403-23（2007）；Campbell等人（1995）Theriogenology，43:181；Collas等人（1994）Mol.Report Dev.，38:264-267；Keefer等人（1994）Biol. Reprod.，50:935-939；Sims等人（1993）Proc. Natl. Acad. Sci.，USA，90:6143-6147；WO 94/26884；WO 94/24274和WO 90/03432，美国专利号4,944,384、5,057,420、WO 97/07669、WO 97/07668、WO 98/30683、WO00/22098、WO 004217、WO 00/51424、WO 03/055302、WO 03/005810、美国专利号6,147,276、6,215,041、6,235,969、6,252,133、6,258,998、5,945,577、6,525,243、6,548,741和Phelps等人（Science 299:411-414（2003））。
已修饰为含有本发明的转基因的供体细胞核转移至受体猪卵母细胞。这种方法的使用不限于特定供体细胞类型。供体细胞可以如Wilmut等人（1997）Nature 385:810；Campbell等人（1996）Nature 380:64-66；或Cibelli等人（1998）Science 280:1256-1258中所述。原则上可以采用可以成功地用于核转移中具有正常核型的所有细胞，包括胚胎、胎儿和成体体细胞。胎儿成纤维细胞是特别有用类别的供体细胞。核转移的一般合适方法在下述中描述：Campbell等人（1995）Theriogenology 43:181，Collas等人（1994）Mol. Reprod.Dev. 38:264-267，Keefer等人（1994）Biol. Reprod. 50:935-939，Sims等人（1993）Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA 90:6143-6147，WO-A-9426884，WO-A-9424274，WO-A-9807841，WO-A-9003432，美国专利号4,994,384和美国专利号5,057,420，Campbell等人，（2007）Theriogenology 68 Suppl 1，S214-231，Vatja等人，（2007）Reprod Fertil Dev 19，403-423）。还可以使用分化或至少部分分化的供体细胞。供体细胞还可以但无需在培养中且可以为静止的。静止的核供体细胞是可以诱导为进入静止或在体内以静止状态存在的细胞。现有技术方法也已在克隆程序中使用胚胎细胞类型（参见例如，Campbell等人（1996）Nature，380:64-68）和Stice等人（1996）Biol. Reprod.，20 54:100-110）。在一种具体实施方案中，成纤维细胞例如猪成纤维细胞可以遗传修饰为含有目的转基因。
用于分离卵母细胞的方法是本领域众所周知的。基本上，这可以包含从猪的卵巢或生殖道中分离卵母细胞。猪卵母细胞的可以容易获得来源是屠宰场材料。对于诸如猪IVF（体外受精）、SCNT的技术组合，在这些细胞可以用作受体细胞用于核转移前，并且在它们可以通过精细胞受精以发育成胚胎前，卵母细胞一般必须在体外成熟。这个过程一般需要收集来自哺乳动物卵巢的未成熟（前期I）卵母细胞，例如在屠宰场获得的牛卵巢，且在受精或去核前在成熟培养基中使卵母细胞成熟，直至卵母细胞达到中期II阶段，在牛卵母细胞的情况下，这一般在吸出后约18-24小时出现，并且在猪的情况下，一般在约35-55小时出现。这个时间段称为成熟期。
中期II阶段卵母细胞可以为受体卵母细胞，在这个阶段时，认为卵母细胞可以为或足够“激活”，以处理引入的核，如受精精子一样。已在体内成熟的中期II阶段卵母细胞已成功地用于核转移技术中。基本上，在动情期发作后或在人绒毛膜促性腺激素（hCG）或相似激素注射后35-48或39-41小时，可以从非超排卵或超排卵的猪手术收集成熟的中期II卵母细胞。
在固定时间成熟期后，卵母细胞可以为去核的。在去核前，卵母细胞可以被取出，并且在去除卵丘细胞前，置于合适培养基例如含有1毫克/毫升玻璃酸酶的HECM或TCM199中。条带状卵母细胞随后可以就极体进行筛选，并且如通过极体的存在测定的，所选中期II卵母细胞随后用于核转移。随后去核。
去核可以通过例如美国专利号4,994,384中所述的已知方法执行。例如，中期II卵母细胞可以置于含有7-10微克/毫升细胞松弛素B的HECM或TCM199中，用于立即去核，或可以置于合适培养基中，例如胚胎培养基例如PZM或CR1aa加上10％动情期牛血清，且随后去核例如不超过24小时后或16-18小时后。
去核可以使用微量吸管显微手术完成，以去除极体和邻近细胞质。随后可以筛选卵母细胞，以鉴定已成功去核的那些。筛选卵母细胞的一种方法是在合适保留培养基中用3-10微克/毫升33342 Hoechst染料染色卵母细胞，且随后在小于10秒的紫外线照射下显现卵母细胞。已成功去核的卵母细胞随后可以置于合适的维持培养基例如HECM或TCM 199中。
与去核卵母细胞相同物种的单一哺乳动物细胞随后可以转移到用于产生NT单位的去核卵母细胞的卵周隙内。根据本领域已知的方法，哺乳动物细胞和去核卵母细胞可以用于产生NT单位。例如，细胞可以通过电融合进行融合。电融合通过提供电脉冲完成，所述电脉冲足以引起质膜的瞬时分解。质膜的这种分解是极短的，因为膜快速重新形成。因此，如果两个邻近膜被诱导分解，且在重新形成后，脂质双层掺和，那么小通道可以在两个细胞之间打开。由于此类小开口的热力学不稳定性，它扩大直至两个细胞变成一个。参见例如，通过Prather等人的美国专利号4,997,384。可以使用多种电融合介质，包括例如蔗糖、甘露醇、山梨糖醇和磷酸盐缓冲溶液。例如，融合培养基可以包含甘露醇的280毫摩尔（mM）溶液，含有0.05 mM MgCl2和0.001 mM CaCl2（Walker等人，Cloning and Stem Cells. 2002；4（2）:105-12）。融合还可以使用仙台病毒作为融合剂完成（Graham，Wister Inot. Symp.Monogr.，9，19，1969）。此外，核可以直接注射到卵母细胞内而不是使用电穿孔融合。参见例如，Collas和Barnes,（1994）Mol. Reprod. Dev.，38:264-267。在融合后，将所得到的融合的NT单位随后置于合适培养基例如HECM或TCM 199培养基中，直至1-4小时后激活。一般地，激活可以在其后不久实现，例如对于牛NT，小于24小时后或约4-9小时后，且对于猪NT，1-4小时后。
NT单位可以通过已知方法激活。此类方法包括例如在亚生理学温度培养NT单位，本质上通过对于NT单位应用冷，或实际上冷温度休克。这可以通过在室温培养NT单位最方便地完成，所述室温相对于胚胎通常暴露于其的生理学温度条件是冷的。可选地，激活可以通过已知激活试剂的应用达到。例如，在受精过程中卵母细胞通过精子的穿透已显示激活开端（prelusion）卵母细胞，以在核转移后获得更大数目的活妊娠和多个遗传等同的小牛。此外，处理例如电和化学休克可以用于在融合后激活NT胚胎。参见例如，给予Susko-Parrish等人的美国专利号5,496,720。另外，通过同时或序贯增加在卵母细胞中的二价阳离子水平，和减少在卵母细胞中的细胞蛋白质磷酸化，可以实现激活。这一般可以通过将二价阳离子引入卵母细胞细胞质内实现，例如镁、锶、钡或钙，例如以离子载体的形式。增加二价阳离子水平的其他方法包括电休克的使用、用乙醇处理和用螯合的（caged）螯合剂处理。磷酸化可以通过已知方法减少，例如通过加入激酶抑制剂，例如丝氨酸-酪氨酸激酶抑制剂，例如6-二甲基-氨基嘌呤、星形孢子素、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。可选地，细胞蛋白质的磷酸化可以通过将磷酸酶例如磷酸酶2A和磷酸酶2B引入卵母细胞内得到抑制。
激活的NT单位随后可以进行培养，直至它们达到合适大小用于转移至雌性受体，或可选地，它们可以立即转移至雌性受体。适合于胚胎培养和成熟的培养基是本领域众所周知的。可以用于胚胎培养和维持的已知培养基的实例包括Ham氏 F-10+10％胎牛血清（FCS）、组织培养基-199（TCM-199）+10％胎牛血清、Tyrodes-白蛋白-乳酸盐-丙酮酸盐（TALP）、Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（PBS）、Eagle氏 Whitten氏培养基、PZM、NCSU23和NCSU37。参见Yoshioka K，Suzuki C，Tanaka A，Anas I M，Iwamura S. Biol Reprod.（2002）January；66（1）:112-9和Petters R M，Wells K D. J Reprod Fertil Suppl.1993；48:61-73。
然后，可以将一个或多个培养的NT单位洗涤且随后置于在孔板中含有的合适培养基中，所述孔板可以任选含有合适的汇合滋养层。合适的滋养层包括例如成纤维细胞和上皮细胞。NT单位在滋养层上培养，直至NT单位达到适合于转移至雌性受体的大小，或用于获得可以用于产生细胞集落的细胞。NT单位可以培养直至至少约2 – 400个细胞、约4至128个细胞、或至少约50个细胞。可选地，NT单位可以立即转移至雌性受体。
在本发明中用于胚胎转移和受体动物管理的方法是在胚胎转移工业中使用的标准程序。同步转移对于本发明的成功是重要的，即NT胚胎的阶段与雌性受体的动情周期同步。参见例如，Siedel，G. E.，Jr.（1981）“Critical review of embryo transferprocedures with cattle in Fertilization and Embryonic Development in Vitro，L.Mastroianni，Jr.和J. D. Biggers，编辑，Plenum Press，New York，N.Y.，第323页。猪胚胎转移可以根据本领域已知的方法进行。关于参考文献，参见Youngs等人“FactorsInfluencing the Success of Embryo Transfer in the Pig,” Theriogenology（2002）56：1311-1320。
多重转基因动物育种群
本发明的动物（或胎儿）可以根据下列方法生殖，包括但不限于选自SCNT、天然育种、使用来自现有细胞系、胎儿或动物作为细胞核供体的细胞通过SCNT再衍生-任选地在NT之前添加另外的转基因至这些细胞、顺序核转移、人工生殖技术（ART）、或这些方法的任何组合或本领域其他已知方法。通常，“育种”或“培育”是生殖的任何方法，包括天然和人工方法。另外，本发明提供了由本文所述方法产生的动物的所有子代。应理解在某些实施方案中，所述子代可以成为本文所述基因的纯合子代。
在一种实施方案，可以将通过多顺反子载体设计产生的遗传修饰动物培育成通过不同多顺反子载体产生的动物。具体地，各多顺反子载体会包含四种不同的转基因和具有两种不同的启动子/增强子的系统。
在另一种实施方案中，具有不同多顺反子载体由此具有不同转基因的转基因动物可以一起培育，其具有等于八个不同转基因的基因所有组分，其中这些基因的表达在其不同启动子/增强子的系统的调控下。
E. 遗传修饰的器官、器官块、组织或细胞
在一种实施方案中，本发明是源自本文揭示的转基因动物（例如猪动物）的器官、器官组织或细胞。
在某些实施方案中，所述器官是肺。在某些实施方案中，所述组织是肺组织。
在可选的实施方案中，所述器官是肾、心脏或肝。在其他实施方案中，所述组织源自肝（包括分离的肝细胞或肝源性干细胞）、脂肪（包括脂肪细胞或间充质干细胞）、心脏组织（包括心脏瓣膜、心包、心脏血管，或其他衍生物（有活力或无活力）），所述其他衍生物源自皮肤、真皮或结缔组织、骨骼、骨骼衍生物或其他骨科组织、硬膜、血管、或任何其他组织，包括来自有活力或无活力的其他器官的组织。
肺是哺乳动物中优化的大的海绵器官，用于血液和空气之间的气体交换。在哺乳动物更复杂的生命形式中，两侧肺位于心脏两侧的骨骼附近。各侧肺由称为肺叶的部分组成。人类右侧肺具有三叶，左侧肺具有两叶。哺乳动物的肺（包括人类的肺）为具有上皮的蜂窝状，总体表面积比肺自身外部表面积大的多。猪肺具有与人类肺相当的细胞谱系和组成。
供体猪（例如猪动物）可以在任何发育阶段，包括但不限于胎儿、新生儿、幼体和成体。在某些实施方案中，器官或组织从成体猪转基因动物中分离。在可选的实施方案中，器官或组织从胎儿或新生儿猪转基因动物中分离（参见例如Mandel（1999）J. Mol. Med. 77:155-60；Cardona等人（2006）Nat. Med. 12:304-6）。
在例示性实施方案中，供体动物可以处于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1岁年龄。在一种实施方案中，器官或组织或组织从处于6岁年龄的转基因动物中分离。在另一种实施方案中，器官或组织从处于3岁年龄的转基因动物中分离。供体动物可以为0 - 2岁、2 - 4岁、4- 6岁、6 - 8岁或8 - 10岁之间的任何年龄。在某些情况下，供体猪大于10岁。在另一种实施方案中，器官或组织从新生儿到2岁大的转基因动物中分离。在一种实施方案中，器官或组织从胎儿到2岁大的转基因动物中分离。在一种具体实施方案中，器官或组织从6月龄到2岁大的转基因动物中分离，并且在一个更具体的实施方案中，从7月龄到1岁大的转基因动物。在另一种实施方案中，器官或组织分离自在体重（非年龄）上匹配的转基因动物以为人移植受体提供最佳尺寸的器官或组织，使得从为受体/患者年龄、体重和/或性别定制的供体动物获得所述猪器官或组织。
在某些实施方案中，手术移除供体转基因肺或组织。在手术移除之后，可以在移植之前进一步处理或评估供体肺或组织。
“异种肺预调节”或免疫调节
移植肺的长期存活优于其他器官，包括心脏、肾以及肝。此肺移植后的优越性结果与局部缺血和再灌注（IRI）损伤（一种炎症损伤，由主要产生于心跳停止后处于脑死亡的供体的局部缺血引发）的多种因素有关，但包括诸如获取过程中器官恢复的持续时间、器官冷藏等。之后，当血流恢复时肺组织的再氧合加重IRI。进一步的创伤至损伤是与其他移植器官相比，手术后新移植的肺继续暴露于环境抗原，可以因存活率而部分受谴责。移植肺近乎持续暴露于环境抗原被提出创造了其中免疫识别途径被激活、导致排斥和或许对炎症、组织损伤以及IRI的结果敏感性增加的独特形式，这应解释为增加存活率。在一种例示性实施方案中，考虑采取肺移植耐受诱导的策略，经过离体肺灌注再调节肺的非限制性实例，更具体地使用添加AdhIL-10的STEEN溶液作为作为基因治疗灌注肺以提高移植肺的长期存活率。在一种进一步的实施方案中，可以经对于从具有或不具有CD47的胸骨、胸腺的骨髓进行“混合嵌合”而诱导耐受。
离体肺灌注
离体肺灌注（EVLP）可以用于评估和再调节从供体移除后的肺，这样边缘/损伤肺的功能可以得到改进，在受体移植之前可以鉴定显著的持续机能障碍。
将肺置于离体回路（Toronto XVIVOTM系统）并使用Steen SolutionTM在正常温度下灌注2至4小时用于生理再评价。关于肺利用的决定，在离体灌注评价过程中具有δpO2（pO2肺静脉pO2 - 肺动脉pO2）> 400mmHg的肺被认为是可以移植的。如果pO2 < 400mmHg或它们在任何下列功能参数中表现>10%的衰退：肺循环血管阻力（PVR）、动态顺应性或气道压力，则将肺排除用于移植。如果基于肺移植手术的临床诊断认为肺不合适，则也将其排除用于移植。
在一种实施方案中，使用高渗无细胞血清通过从血管外腔室吸引流体而对水肿肺脱水而灌注肺，这样可以改进气体交换，使得起始被判断为不适于移植的肺可以使用。另外，可以将抗炎细胞因子输入肺以促进损伤修复，和利用载体介导的白细胞介素（IL）-10转移以减少致炎细胞因子产生，促进细胞间肺泡上皮紧密连接恢复，改进氧合，并减少血管阻。也可以输注抗生素以抑制/消除感染。
基于离体肺灌注的基因治疗-白细胞介素-10 (IL-10)
另外，可以将抗炎细胞因子输入肺以促进损伤修复，和利用载体介导的白细胞介素（IL）-10转移以减少致炎细胞因子产生，促进细胞间肺泡上皮紧密连接恢复，改进氧合，并减少血管阻。也可以输入抗生素以抑制/消除感染。
在一种实施方案中，离体肺灌注活性用作递送机制以递送IL-10（从腺病毒-IL10载体一致性表达）至异种肺。通过在常规免疫抑制的较低暴露下提供对早期炎症的良好控制，此实施方案促进从转基因动物移植肺。另外，可以在具有常规免疫抑制的肺抑制剂提供抗IL6r（抗生素），并与耐受调节方案一起重复一段时间（~ 4个月），作为使得成功消退常规免疫抑制的方法。
耐受
异种肺和耐受：混合嵌合的诱导在移植前的5-7天过程中使用集中的非清髓性调节方案，缩短此时期以适应减少的供体配置的需要的努力是极其有害的且不易耐受。尽管尚未在临床上得以证实，通过消耗CD8+记忆T细胞然后对骨髓移植定时以使致炎细胞因子最小化的“延迟”耐受诱导已用于非人灵长类动物肾移植试验。
F. 治疗方法
本文描述的方法包括对于本文所述器官、器官块、组织或细胞进行异种移植的方法。在一种例示性实施方案中，所方法包括但不限于将本文所述的供体动物的器官、器官块、组织或细胞施用于受试者。所述供体动物可以为猪。受试者或宿主可以为灵长类动物，例如，非人灵长类动物（NHP），包括但不限于狒狒。宿主可以为人，具体地患有可以通过移植治疗性影响的疾病或病症的人。
在一种例示形式实施方案，所述方法包括但不限于将来自本文所述供体动物的肺或肺组织施用于宿主。所述供体动物可以为猪。宿主可以为灵长类动物，例如，非人灵长类动物（NHP），包括但不限于狒狒。宿主可以为人，具体地患有可以通过移植治疗性影响的疾病或病症的人。
有利地，本发明提供的转基因肺和肺组织相对于本领域已知的异种移植具有改进的功能性。在一种实施方案中，在猪-人异种移植离体模型中所述转基因肺具有改进的存活。在一种具体实施方案中，所述转基因肺存活至少约90、至少约120、或至少约150、至少约180、至少约210、至少约240、至少约270、至少约300、至少约330、至少约360分钟或更多。在另一种具体实施方案，转基因肺存活是未修饰的猪肺的至少约2倍、至少约4倍、至少8倍、至少约10倍长或至少约20倍长。
在另一种实施方案，在维持生命的体内模型中，所述转基因肺具有改进的功能和存活率。在一种具体实施方案中，在维持生命的模型的狒狒中，本发明提供的肺或肺组织维持生命至少约10小时、至少约20小时、至少约30小时、或约30小时或更多。在另一种具体实施方案，所述转基因肺存活是未修饰的猪肺的至少约2倍、至少约4倍、至少8倍、至少约10倍长或至少约20倍长。
本发明的另一种方法是一种异种移植方法，其中将本发明提供的转基因的肺或肺组织移植至灵长类动物，所述移植的肺或组织存活1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周或至少约12周或更多。
本发明的进一步的方法是一种异种移植方法，其中将本发明提供的转基因的肺或肺组织移植至灵长类动物，所述移植的肺或组织存活1月、至少2月、至少3月、至少4月、至少5月、至少6月、至少7月、至少8月、至少9月、至少10月、至少11月或至少约12月或更多。
本发明的另一种方法是一种异种移植方法，其中将本发明提供的转基因的肺或肺组织移植至灵长类动物，所述移植的肺或组织存活如上所述的一段时间。在一种实施方案中，维持生命的肺移植型用于评估肺功能。在一种实施方案，维持生命的模型包括从灵长类动物移除一侧肺并将来自本发明的猪供体的单肺移植至灵长类动物受体。在另一种实施方案，维持生命的模型包括从灵长类动物移除双侧肺并将来自本发明的猪供体的双侧肺移植至灵长类动物受体。在一种进一步的实施方案中，可以从灵长类动物移除肺和心脏，并使用本发明的猪肺和心脏取代。在本发明的实施方案中，可以在灵长类动物中评价维持生命的肺功能的持续时间。
为了评估维持生命的肺功能的持续时间，可以从猪获取本发明的遗传修饰的猪肺。可以切除心脏-肺区，制备一侧肺、两侧肺、或两侧肺和心脏用于移植至灵长类动物中。可以全麻下对灵长类动物受体进行镇静并维持。然后，可以使用本领域已知的方法从灵长类动物移除所述一侧肺、两侧肺、或两侧肺和心脏（参见例如，Nguyen 等人，The Journalof Thoracic and Cardiovascular Surgery May 2007; 133: 1354-63 and Kubicki 等人，International Journal of Surgery 2015: 1-8）移植至灵长类动物中，然后可以对灵长类动物进行再灌注。在移植物再灌注之前和置换，可以在预定时间点顺序采集血液和组织活检标本用于体外分析。主动脉上和左肺动脉上的血管流量探针（Transonic SystemsInc, Ithaca, NY）分别可以连续测量移植器官的心输出量和心流量。在仅移植一侧肺而另一侧肺仍为天然灵长类动物的肺的模型中，可以渐进性闭塞天然肺的血流量以评估所移植的肺维持生命的能力。可以将移植物存活定义为维持生命的肺功能的持续时间。对于长期的存活试验，置于主动脉和一侧肺动脉上的流量探针允许通过肺移植监测血流。国际心肺移植协会已推荐诸如此类的模型中实现维持生命功能的3个月，以考虑人体试验（Kubicki等人，International Journal of Surgery 2015: 1-8）。
本发明的一种方法是一种异种移植方法，其中，将本发明提供的转基因肺或肺组织移植至灵长类动物，在移植之后灵长类动物需要减少的或不需要免疫抑制治疗。减少的或无免疫抑制治疗包括但不限于，与由其他方法需要的那种比较，一种或多种免疫抑制药物/试剂的剂量中的减少（或完全消除）；与由其他方法需要的那种比较，一种或多种免疫抑制药物/试剂的类型数目中的减少（或完全消除）；与由其他方法需要的那种比较，免疫抑制处理的持续时间中的减少（或完全消除）；和/或与由其他方法需要的那种比较，维持免疫抑制中的减少（或完全消除）。
本发明的方法还包括治疗或预防肺疾病的方法，其中，将本发明提供的转基因肺或肺组织移植至灵长类动物，在移植后灵长类动物具有改进的肺功能。当与移植前的水平比较时或当与使用其他方法达到的水平比较时，移植的灵长类动物具有改进的肺功能。
本发明的方法还包括治疗或预防转基因肺或肺组织移植后的疾病的方法，存在与移植程序、免疫抑制方案和/或耐受诱导方案相关的并非众多或严重的威胁生命的并发症。
在一些实施方案中，所述方法减少对于宿主施用抗炎剂的需要。在其他实施方案中，该方法减少对于宿主施用抗凝剂的需要。在某些实施方案中，该方法减少对于宿主施用免疫抑制剂的需要。在一些实施方案中，在施用器官（例如肺）、组织或细胞后，给宿主施用抗炎剂小于30天、或小于20天、或小于10天、或小于5天、或小于4天、或小于3天、或小于2天、或小于1天。在一些实施方案中，在施用器官（例如肺）、组织或细胞后，给宿主施用抗凝剂小于30天、或小于20天、或小于10天、或小于5天、或小于4天、或小于3天、或小于2天、或小于1天。在一些实施方案中，在施用器官（例如肺）、组织或细胞后，给宿主施用免疫抑制剂小于30天、或小于20天、或小于10天、或小于5天、或小于4天、或小于3天、或小于2天、或小于1天。
在移植时，受体（宿主）可以为部分或完全免疫抑制的或完全不是。在移植时间前、过程中和/或后可以使用的免疫抑制剂/药物是本领域技术人员已知的任何，并且包括但不限于MMF（霉酚酸酯（Cellcept））、ATG（抗胸腺细胞球蛋白）、抗CD154（CD40L）、抗CD20抗体、抗CD40抗体（2C10R4抗体治疗）（参见Mohiuddin MM. 等人，Apr 5;7:11138. [2016]）、阿仑珠单抗（Campath）、CTLA4-Ig（阿巴西普/ Orencia）、贝拉西普（LEA29Y）、西罗莫司（Rapimune）、他克莫司（Prograf）、达克珠单抗（Zenapax）、巴利昔单抗（Simulect）、英夫利昔单抗（Remicade）、环孢素、脱氧精胍菌素、可溶性补体受体1、眼镜蛇蛇毒、甲泼尼龙、FTY720、依维莫司、抗CD154-Ab、来氟米特、抗IL-2R-Ab、雷帕霉素和人抗CD154单克隆抗体。一种或超过一种免疫抑制剂/药物可以一起或序贯使用。一种或超过一种免疫抑制剂/药物可以用于诱导治疗或用于维持治疗。相同或不同药物可以在诱导和维持阶段过程中使用。在一种实施方案中，达克珠单抗（Zenapax）用于诱导治疗，并且他克莫司（Prograf）和西罗莫司（Rapimune）用于维持治疗。在另一种实施方案中，达克珠单抗（Zenapax）用于诱导治疗，并且低剂量他克莫司（Prograf）和低剂量西罗莫司（Rapimune）用于维持治疗。在一种实施方案中，阿仑珠单抗（Campath）用于诱导治疗。参见Teuteberg等人，Am JTransplantation，10（2）:382-388. 2010；van der Windt等人，2009，Am. J.Transplantation 9（12）:2716-2726. 2009 ,；Shapiro，The Scientist，20（5）:43. 2006；Shapiro等人，N Engl J Med. 355:1318-1330. 2006。免疫抑制还可以使用非药物方案来达到，包括但不限于全身照射、胸腺照射、和完全和/或部分脾切除术、从胸骨、胸腺采集的骨髓的“混合嵌合”（Sachs, 2014）。这些技术还可以与一种或多种免疫抑制药物/试剂组合使用。
当人的肺不能再实施其交换氧气和二氧化碳的关键功能时，则人需要肺移植。肺移植候选者具有晚期肺疾病，预期活不过2年。他们常常需要持续氧气，因缺氧极其疲乏。他们的肺患病严重而在医疗上无法处理，没有其他种类的手术能帮助他们。
单肺移植
如果受体进行单肺移植，根据哪侧肺要被置换，他/她将在其右侧或其左侧进行胸廓切开术。在供体肺达到手术室时，外科医生会移除病肺。受体会使用另一侧肺通气。如果剩下的肺不能交换足够的氧气，外科医生可以将受体置于心肺分流术。其血液将通过体外的机器过滤，所述机器将氧气输送至其血液并去除二氧化碳。
三个连接将用于附着新肺。这些连接被称为“吻合”。首先，将来自供体肺的主支气管与受体的支气管连接。然后连接血管——首先是肺动脉，然后是肺静脉。最后，封闭切口，将受体带至集中监护病房，其中他/她将睡眠约12至24小时。
双侧或双肺移植
如果双肺均移植（双侧移植），外科医生会制作各侧胸下的切口（称为前侧剖胸术）或胸基底从右侧至左侧的切口。这称为横向胸骨切开术切口。在双侧肺移植中，各肺分开置换。外科医生通过移除具有最差功能的肺开始移植。受体使用其剩下的肺通气，除非需要部分心肺分流术。一旦第一个肺被移除，将使用三个连接来附着肺。首先，将来自供体的支气管与受体的主支气管连接。然后连接血管——首先是肺动脉，然后是肺静脉。以相同方式移除受体另一侧病肺并连接另一侧新肺。一旦另一侧肺完全连接，则血流恢复。
可以使用本领域已知的任何方法移植转基因肺、肺组织或心-肺移植。
提供了允许移入的足够时间（例如1周、3周等），并且使用本领域技术人员已知的任何技术测定成功的移入。这些技术可以包括但不限于供体C肽水平的评价、组织学研究、静脉内葡萄糖耐量测试、外源胰岛素需求测试、精氨酸刺激测试、胰高血糖素刺激测试、IEQ/kg（胰岛当量/kg）需求的测试、关于血糖量正常在受体中的持久性的测试、免疫抑制需求的测试、和关于移植的岛的功能性的测试（参见Rood等人，Cell Transplantation，15:89-104. 2006；Rood等人，Transplantation，83:202-210. 2007；Dufrane和Gianello,Transplantation，86:753-760. 2008；van der Windt等人，2009，Am. J.Transplantation，9（12）:2716-2726. 2009）。
一种或多种技术可以用于测定移入是否是成功的。成功的移入可以指的是相对于无治疗，或在某些实施方案中，相对于用于移植的其他方法（即，移入比当使用用于移植的其他方法/组织时更成功）。在某些情况下，成功的移入通过供体C肽水平的评价进行测定，包括具有添加的免疫抑制的生命维持功能。
在一种实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的肺疾病或病症的方法，所述方法包括将源自本发明的转基因猪的肺或其部分移植至所述受试者。所述肺疾病可以为晚期肺疾病。在一种实施方案中，所述晚期肺疾病与原发性肺动脉高压（PAH）、慢性阻塞性肺病（COPD）、间质性肺病（ILD）、肉状瘤病、支气管扩张、特发性肺纤维化（IPD）、囊性纤维病（CF）、α1-抗胰蛋白酶缺乏病有关。
本领域技术人员应理解，原发性肺动脉高压（PAH）是指肺动脉中的高血压。
本领域技术人员应理解，囊性纤维病是指退行性遗传的遗传病，意指双亲均需具有缺陷基因。约30,000美国人具有CF，约1200万人携带此基因但不受其影响。CF患者常具有呼吸问题，包括支气管炎、支气管扩张、肺炎、鼻窦炎（鼻窦的炎症）、鼻息肉（鼻内的生长物）或气胸（塌陷肺）。CF的症状包括喘息频繁或肺炎，具有稠粘液的慢性咳嗽，持续腹泻，皮肤含盐以及发育不全。
本领域技术人员应理解，慢性阻塞性肺病（COPD）是指可以由哮喘、慢性支气管炎或肺气肿导致。患有COPD的个体随时间渐渐丧失其呼吸能力。COPD的症状范围从慢性咳嗽和痰液产生至严重无力的呼吸急促。
本领域技术人员应理解，α1-抗胰蛋白酶疾病/α1-抗胰蛋白酶缺乏是其中α1-抗胰蛋白酶（一种保护肺的蛋白质）缺乏导致早发肺疾病的遗传病。抽烟增加此风险。α-1相关的肺气肿通常出现在20至40岁之间的年龄，包括活动后呼吸急促、锻炼功能减弱以及喘鸣。
本领域技术人员应理解，间质性肺病（ILD）是通用术语，包括多种慢性肺病症，例如特发性肺纤维化、肉状瘤病、嗜酸细胞性肉芽肿、Goodpasture氏综合征、特发性肺含铁血黄素沉积症以及Wegener氏肉芽肿病。当人患有ILD时，其肺以如下四种方式受影响：1) 肺组织变得损害，2) 肺中的肺泡壁发炎, 3)间质（肺泡之间的组织）中开始瘢痕化，以及4)肺变得坚硬。
本领域技术人员应理解，肉状瘤病是指涉及可在多个器官中形成根瘤的炎症细胞异常聚集（肉芽肿）。肉芽肿最常位于肺或其相关的淋巴结中。
本领域技术人员应理解，支气管扩张是指不可逆的气道增宽。由于气道增宽，其变得较不坚固，较易于塌陷。其还变得较难清除分泌物。支气管扩张可以存在于出生时，或其可以后来由损伤或其他疾病（最常见的是囊性纤维化）导致。其可以发生于任何年龄，但最常开始于儿童。支气管扩张的症状包括咳嗽、发热、虚弱、体重减轻以及疲乏。
在一种实施方案中，所述方法进一步包括给受试者施用一种或多种治疗剂。
在一种具体实施方案中，一种或多种治疗剂选自抗排斥剂、抗炎剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗微生物剂、抗病毒剂以及它们的组合。
移植可以包括单肺或双肺（双侧肺）。
移植还可以包括心肺移植或心-肺移植，其同时外科手术置换患有晚期心脏和肺疾病的患者的心脏和肺。此程序仍是处于特定疾病状态的患者的可行治疗选择。必需心肺移植的晚期心肺衰竭的原因范围由先天性心脏病至特发性病因，包括如下：具有肺动脉高压的不可修复的先天性心脏畸形（Eisenmenger氏复合病），具有不可逆右心衰竭的原发性肺动脉高压，仅涉及心脏和肺的肉状瘤病。
实施例
实施例1：使用双顺反子载体进行载体构建和产生猪
载体构建
合成由2A肽序列连接的共享单一启动子的两（2）种转基因组成的多重双顺反子单元。利用两种形式的2A序列P2A（66bp）和T2A（55bp）并连接大量两种转基因单元以允许两种基因从一种启动子共表达。启动子是组成型CAG启动子（CMV增强子，鸡肌动蛋白启动子，兔β-珠蛋白内含子1）、内皮特异性猪ICAM-2启动子或Tie2内皮特异性增强子与CAG启动子的组合。构建人转基因对（由2A序列连接），包括血栓调节蛋白（TBM）、CD39、EPCR、DAF、A20、CD47、CIITA、HO1、TFPI，在某些双顺反子载体中还包括猪CTLA4-Ig。
使用在a) 猪ICAM-2 增强子/启动子和b) 组成型CAG启动子后的克隆位点，对多顺反子载体进行工程化。参见附图1。此载体允许插入两个双顺反子单元，在这些单位之间和侧翼具有隔离。构建数种多顺反子载体（MCV），其中各双顺反子由其自身启动子调节，其从2A肽序列配对和连接的机械学相关基因的库获取。
使用双顺反子载体产生猪
基因型：GTKO.CD46.cagEPCR.DAF.cagTFPI.CD47.
产生具有双顺反子载体（在CAG启动子调控下）的猪。在某些品系中，将两种双顺反子掺入αGal敲除（GTKO）猪成纤维细胞（通过转染和随机整合），对于人CD46补体抑制剂基因，所述成纤维细胞也是转基因的（GTKO.CD46）。这样的多基因成纤维细胞用于体细胞核转移（SCNT）以产生克隆的转基因猪。在CAG启动子调控下强劲表达作为两种双顺反子的所有4MCV基因的转基因猪单品系（CAG-EPCR.DAF和CAG-TFPI.CD47）用于产生数种用于非人灵长类动物（狒狒）中器官移植实验的猪。
具有基因型“CAG-EPCR.DAF和CAG-TFPI.CD47”的多重转基因猪已在肾、心脏以及肺移植中表现出功效。在体内肺治疗模型中多重猪提供>30h的生命维持。
与在过去使用具有三种遗传修饰（GTKO.CD46.TBM）的猪的实验中常见的进行性异种移植损伤和生理干扰（腹水，容积和收缩力需求提高、天然（狒狒）肺水肿）相比，接受来自具有基因型“GTKO.hCD46.hDAF.hEPCR.hCD47.hTFPI”的猪的肺的狒狒仅表现中度的流体滞留（水肿）和收缩力需求。来自这些存活最长的实验的猪肺显示肉眼和显微镜下非常正常，无排斥征象。
在其他猪器官至狒狒移植的研究中，此6GE基因型延长心脏移植的存活时间（在异位Tx中>6个月的存活），和在两种用于各器官模型（心脏和肾）的连续移植中正位肾Tx的存活时间（>8个月）。相比较而言，对于正位肾Tx模型的生命维持，当使用来自三基因GTKO.CD46.TBM猪（3GE）的肾时仅实现<3个月的存活。
通过主动脉内皮细胞的流式细胞术（参见图2），或通过分别使用各人转基因蛋白的特异性荧光抗体的免疫组织化学（图3）和染色，此六基因品系（6GE）具有所有MCV转基因的强表达。最近使用成熟的健康1岁龄公猪（当前被培育成GTKO.CD46雌性）证实此品系对成熟的成活力。
将此品系培育成三GE猪，即GTKO.CD46.TBM或GTKO.CD46.CIITA或GTKO.CD46.CMAH-KO，以从多种组合产生七GE猪（7GE）群，所述基因型的雄性和雌性用于进一步的品系扩增。
实施例2：用于产生遗传修饰的猪的多顺反子载体的构建
多顺反子“2A”载体（MCV）用于产生6-GE猪，这应用转染至良好表征的GTKO.hCD46细胞中的四基因载体（在各MCV中两种启动子调控下的两种双顺反子），所述细胞然后用于体细胞核转移。通过DNA印迹分析测定基因型。通过PBMC和内皮细胞的流式细胞术、在细胞和器官中通过免疫组织化学、Q-PCR（定量聚合酶链反应）以及蛋白质印迹分析监测基因表达。进行转基因特异性生物活性测定以定量和表征补体抑制、血小板聚集、活化的蛋白C形成、ATP酶活性、因子Xa裂解、混合淋巴细胞反应（MLR）以及细胞凋亡。在这些测定中鉴定具有预期基因型和所有转基因强劲表达的猪，并将其用于异种移植的离体和体内模型。
多顺反子载体的类型：
产生十八种多顺反子载体，将其用于产生具有这些生物活性转基因不同组合的猪（参见图4）。在大多数情况下，一对基因在内源特异性pICAM-2启动子调控下表达，在相同载体中，两种其他基因（在第二双顺反子中）通过组成型CAG启动子表达。然而，在MCV载体pREV999中，利用的两种启动子均是CAG。所述双顺反子由隔离子序列分离和侧接（在图4中由双箭头表示）以最小化与基因组整合位点相关的任何效应，并且还限制各双顺反子中存在的调节序列之间的串扰。
图4显示用于产生具有6种遗传修饰的猪的表达盒，所述遗传修饰包括GTKO、补体调节基因hCD46或CD55，联合抗凝基因血栓调节蛋白（TBM）、内皮蛋白C受体（EPCR）、CD39以及组织因子途径抑制剂（TFPI）、免疫抑制基因猪细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（pCTLA4Ig）、显性失活II类主要组织相容性复合物（CIITA-DN）和/或抗炎转基因亚铁血红素加氧酶-1（HO1）、A20、CD47的内皮特异性或遍在性表达。
实施例3：具有六种遗传修饰（6GE）的猪动物的产生
将线性MCV的4基因片段（参见例如图4）转染至具有GTKO（α1,3半乳糖基转移酶敲除）或GTKO.CD46（α1,3半乳糖基转移酶敲除和CD46遍在性表达）平台遗传学的猪胎儿成纤维细胞。通过荧光激活的细胞分选（FAC）选择转染的细胞在CAG启动子之后表达的两个基因，这些分选的细胞用作体细胞核转移（SCNT或克隆）的核供体。将融合的胚胎转移至多只受体小母猪（8-10只小母猪/MCV），监测妊娠直至分娩。
从数个基因组合产生表达这些MCV元件的猪。在活猪中提供强劲表达的四个4基因MCV组合包括：
pREV941: EPCR-CD55-TBM-CD39
pREV971: EPCR-HO-1-TBM-CD47
pREV967: EPCR-HO-1-TBM-TFPI
pREV958: EPCR-CD55-TFPI-CD47
根据载体结构，TBM、TFPI、CD39和CD47、HO-1的表达由内皮特异性启动子猪Icam-2驱动。EPCR、DAF以及HO-1的表达由组成型CAG启动子驱动。
这些6GE猪的遗传学如下：
pREV941: GTKO.CD46.EPCR.CD55.TBM.CD39
pREV971: GTKO.CD46.EPCR.HO-1.TBM.CD47
pREV967: GTKO.CD46.EPCR.HO-1.TBM.TFPI
pREV958: GTKO.CD46.EPCR.CD55.TFPI.CD47
实施例4：来自6GE猪的器官的存活和功能
pREV941： GTKO.CD46.EPCR.CD55.TBM.CD39. 产生具有此6基因表型的数种起始猪，并将其用于肺、心脏以及肾移植。在猪至非人灵长类动物（NHP）体内肺模型中，一种起始猪提供十二（12）小时的生命维持。在体内肺Tx模型中，第二种起始猪提供七（7）小时的生命维持。在非人灵长类动物中，第三种起始猪提供持续大于五（5）个月的心脏。将具有所有六（6）种基因优良表达的起始猪（见图4）中的一种进行再克隆，子代中的数只用作狒狒模型中体内移植（Tx）的器官供体，包括持续10个月的异位心脏移植。此品系用于体内肺移植，具有七（7）小时的生命维持功能。
pREV971: GTKO.CD46.EPCR.HO-1.TBM.CD47. 使用此基因型产生三种起始猪及三种再克隆猪。具有此基因型的另外的猪在子宫内。在肺移植（Tx）的体内模型中，具有所有6种基因表达的起始猪中的一种提供约24小时的生命维持。未报道有水肿或血栓。通过SCNT从获自起始动物的肾细胞产生此高表达品系的再克隆。进行移植研究以检测Tx之前和在移植过程中的免疫抑制治疗。另外的治疗与免疫抑制药物联合使用，例如施用人α-1-抗胰蛋白酶（hAAT）以减轻炎症，和施用氯膦酸盐脂质体以在移植至狒狒模型中之前耗竭供体肺的残留巨噬细胞。
pREV967: GTKO.CD46.EPCR.HO-1.TBM.TFPI. 产生八种活的起始猪。使用对这些猪中的一种进行再克隆建立两种另外的妊娠。
pREV958: GTKO.CD46.EPCR.CD55.TFPI.CD47. 构建基因型“pREV958”的4基因MCV形式（参见图4）(其利用pICAM-2启动子以驱动TFPI+CD47表达和利用CAG启动子以驱动EPCR+DAF表达)，并用于产生相似表型，但作为具有在一个基因座整合的所有4种基因的4基因MCV。移植后，对接受源自具有pREV958基因的猪的猪肺的两只受体狒狒进行恢复和拔管，跟踪观察表现至多八（8）天的存活。这是非人灵长类动物体内异种肺的最长记录存活。
实施例5：寡核苷酸“着陆台”靶向插入Gal基因座
预期用于CRISPR增强靶向整合至αGal基因座的合成DNA片段进行工程化，用于在此GTKO.CD46转基因猪品系中修饰的天然αGal基因座埋入的Neor选择性标记基因的靶向（参见Dai等人，2002. Nature Biotechnology）。此“着陆台”片段是100bp，含有用于重组酶/整合酶介导的位点特异性重组的两个位点（即phi-C31和BxbI attP位点），并侧接在修饰的αGal靶向整合的特异性50bp同源臂。特定的MCV中（侧接所述att位点）携带和之后整合至αGal基因座的多重转基因在育种过程中不仅与MCV中的其他转基因，还与αGal敲除基因型一起共分离。
将此着陆台寡核苷酸连同被设计以在修饰的Gal基因座中引入双链断裂的CRISPR/Cas9 DNA载体转染至GTKO.CD46成纤维细胞中。
通过长距离PCR分析鉴定在αGal具有CRISPR辅助的此重组酶/整合“着陆台”片段的靶向整合的两种GTKO.CD46胎儿成纤维细胞克隆，证实其携带双等位基因靶向的整合。使用这种克隆中的一种进行至六个受体的核转移，用于胎儿采集和证实此~200bp片段的精确整合。
使用其中此小着陆台片段插入Gal基因座的细胞系产生源于一只孕猪的两只胎儿。从两只胎儿分离DNA，产生表现插入片段和在两侧的侧接序列的扩增子的长距离PCR证实两只胎儿携带在Gal基因座的着陆台的双等位基因整合（phiC31和BxbI attP位点的纯合敲入）。
实施例6：GTKO.CD46hom + TBM.CD39.EPCR.DAF，具有Gal同源臂（941HDR）
位于修饰的αGal基因座中的neo基因用作着陆台。已知αGal基因座在猪的大多数细胞谱系和所有器官和组织中具有强表达。旨在4种转基因的稳定和一致表达，使用CRISPR辅助的同源重组将4基因MCV载体成功靶入Gal基因座。这样的重组还称为同源驱动的重组（HDR）。此片段由侧接~500bp Neor基因同源臂（位于修饰的Gal基因座内）的pREV941 MCV组成，其中此载体中还包含ΦC31和Bxb1 attP位点以允许重组酶介导的MCV换出（swap-out）用于未来的修饰（见图7）。将941hdr载体连同Neo-Gal CRISPR指导DNA载体一起转染至GTKO.CD46胎儿成纤维细胞。通过5’和3’连接PCR和对具有证实的MCV941片段的精确整合的连接进行DNA测序鉴定两种细胞克隆。一种基因编辑的细胞系具有14kb pREV941 MCV单等位基因靶向插入至αGal基因座，第二细胞克隆具有14kb pREV941 MCV双等位基因靶向插入至αGal基因座。混合两种细胞克隆并将其用于SCNT，进行九个胚胎转移。从3只孕猪产生9只活猪，αGal基因座上具有DNA序列证实的pREV941 MCV的双等位基因整合。未产生源自单等位基因整合的靶向的猪。
对一只猪进行安乐死，来自此猪的样品通过肺免疫组织化学（IHC）用于表征转基因表达（图9），并且在多个器官通过蛋白质印迹分析用于表征转基因表达（图10）。余下的具有αGal基因座上的此pREV941 MCV的靶向整合的8只猪茁壮成长。
实施例7：GTKO.CD46hom + EPCR.HO-1.TBM.CD47，具有Gal同源臂（pREV971HDR）
对多个MCV载体进行修饰以携带侧接的同源臂以允许利用基因编辑工具，包括pREV958、pREV 941、pREV971以及pREV954。鉴定携带pREV971靶向插入的两种细胞克隆，如LR-PCR、连接PCR（至αGal基因座）以及DNA测序所指示的。靶向971 HDR集落群（Icam-TBM.2A.CD47-CAG.EPCR.2A.HO）用于SCNT，将重构的胚胎引入12个受体。由此努力产生六只孕猪，其中一只用于胎儿分离。通过长距离PCR分析来自一只孕猪的所有八只胎儿，测定对于pREV971 MCV载体是单等位基因靶向敲入。
另外，如在出生的活猪中对于表达的可预测性，基于观察早产猪中的MCV基因胎儿表达的可能性，胎儿采集用于此类推定的敲入事件。在pREV971-HDR靶向的胎儿中通过流式细胞术证实肺微血管内皮细胞（MVEC）中TBM和CD47的表达，与阴性对照相比HO1和EPCR为较高水平表达。还进行ELISA测定以比较随机整合MCV猪（具有pREV941的猪756.1和具有pREV971的猪830-3）和pREV941-HDR（猪875-5）的TBM表达，其中除了756-1的所有与这些基因在人内皮细胞（HUVEC）中的表达相当。
实施例8：vWF修饰
进行猪vWF的修饰以提供对于参与猪vWF对自发性人血小板激活的特定区域的“人源化”。选择D3（部分）、A1、A2、A3（部分）结构域内的区域以修饰hvWF中与GP1b结合位点折叠和螯合相关的猪vWF区（D3结构域），以及与胶原结合（两个区域中的一个）、GP1b受体（A1结构域）以及ADAMTS13裂解位点（A2结构域）相关的区域。外显子22-28包含这些区域，由此这七个人外显子被作为cDNA片段（无人内含子）提供，以同时通过基因靶向去除相当的猪基因组区域。所产生的基因置换策略生成vWF的嵌合人-猪外显子22-28区，而不另外修饰猪vWF基因座（参见图17）。
合成编码人外显子22-28的DNA片段，其在5’端侧接与猪vWF内含子21具有同源性的基因组DNA同源臂和在3’端与猪vWF内含子28具有同源性的基因组DNA同源臂。此靶向载体还包含GFP和博罗霉素抗性基因以选择和富集靶向载体的整合。将CRISPR/Cas9质粒设计成结合和切割与待换出和置换的片段的两个末端紧邻的猪基因组序列以产生双链断裂。通过使用两种CRISPR载体连同vWF靶向载体在猪GTKO.CD46成纤维细胞中共转染，将CRISPR辅助的同源重组用于将人外显子22-28 vWF片段整合至猪vWF基因座（参见图12）。通过连接PCR、长距离PCR筛选博罗霉素抗性集落，对5’和3’靶向连接区进行测序以证实合适的靶向。将人vWF区单等位基因敲入二倍体成纤维细胞中仅一种猪vWF是可期待的结果，然而，发明人惊讶于获得一种具有22-28区双等位基因置换（猪基因组DNA缺失并且使用人区域置换）的细胞系。参与如上所述自发性血小板聚集的此人片段置换区和人源化外显子是cDNA形式，而非基因组片段。双等位基因敲入细胞系（对于外显子22-28基因置换是纯合的）用于SCNT，获得孕猪，采集d35胎儿以获得胎儿细胞。在存储用于后续步骤的胎儿细胞系中证实了合适的双等位基因靶向的置换。为了精确框架内融合人-猪DNA，使用精确切除埋于靶向载体中的选择因子（GRP和博罗霉素）的转座酶处理hvWF敲入细胞。通过荧光激活的细胞分选通过GFP基因缺失来监测猪-人嵌合vWF区的切除和合适的框内融合。切除的成纤维细胞群用于SCNT，产生五只孕猪。对两只孕猪进行流产，并将其用于制备用于进一步基因分型分析和再克隆的胎儿细胞。在所获得的八只胎儿中，四只对于切除事件为单等位基因的，四只为双等位基因，其中，所有测序的切除事件指示人序列与侧接的猪vWF基因组序列的完美框内对齐（参见图13），和选择因子的完全切除。两只孕猪足月，导致三只健康活猪出生。基因分型指示猪中的两只为单等位基因切除，猪中的一只具有双等位基因切除，两个等位基因均在外显子22-28为人-猪融合。
设计基因型上人源化嵌合vWF。对于单体切除的猪，一个等位基因是无效的，这是由于猪vWF基因被仍在（具有52个外显子的基因的）外显子22整合的GFP-puro选择盒中断，而其他等位基因具有修饰的嵌合vWF等位基因。使用与人和猪vWF均交叉反应的抗体进行的蛋白质印迹分析显示在单等位基因和双等位基因切除的猪的血液中制备了全长vWF蛋白，但其中由于非切除等位基因的灭活，切除的单等位基因仅制备50%水平的vWF。
使用Chrono-log全血集合度计检测来自VWF编辑（人源化嵌合vWF）和对照GTKO.hCD46动物的新鲜抽取的柠檬酸盐猪全血。使用胶原激动剂（2ug/mL）处理导致vWF编辑血聚集，证实VWF编辑基因型在其产生结合胶原和刺激血小板聚集的vWF蛋白的能力方面具有功能性（n=3）。同时，检测GTKO.hCD46全血（正常vWF），显示比单等位基因VWF编辑血多50%的聚集（n=2）。参见图14。
另外，未鉴定出人血小板的自发性聚集。使用两步离心方案从柠檬酸盐抗凝猪血样品制备暴露的vWF编辑猪乏血小板血浆（PPP）。从新鲜抽取的人血样品（柠檬酸盐抗凝）制备人富血小板血浆（PRP）。将人PRP与猪PPP在试管中1:1混合，立即使用Chrono-log全血集合度计记录血小板聚集。当将来自动物871.2（一种vWF编辑基因型）的PPP与人PRP一起混合时，无自发性血小板聚集（n=1）。相比之下，当将来自具有GKO.hCD46基因型（未修饰的猪vWF）的动物的PPP与人PRP一起混合时，具有人血小板的自发性聚集（n=2）。当与来自人源化嵌合vWF编辑猪的血浆一起时，人血小板自发性聚集的明显缺乏提供了期望表型的直接功能性证据。可以使用离体肺灌注（使用人血）和在狒狒体内的非人灵长类动物移植中的猪的器官（肺和其他器官）检测人源化嵌合vWF编辑猪。
当将来自动物871.2（一种VvWF编辑基因型）的PPP与人PRP混合时，无自发性血小板聚集（n=1）。相比之下，当将来自具有GKO.hCD46基因型（未修饰的猪vWF）的动物的PPP与人PRP混合时，存在人血小板自发性聚集（n=2）。当与来自人源化嵌合vWF编辑猪的血浆一起使用时，人血小板自发性聚集的这样的明显缺乏提供了预期表型的直接功能性证据，这可以使用离体肺灌注（使用人血）和在狒狒体内的非人灵长类动物移植中的这样的人源化猪的器官（肺和其他器官）检测，以测定临床前模型中修饰的功效。
GTKO.CD46背景上具有pREV971随机整合的高表达六（6）GE品系的再克隆可用于重复这些较晚期遗传学中vWF基因座的人源化，这使用用于人外显子22-28靶向敲入的相同方法。另外，对于上述例示的三（3）GE vWF敲入品系（GTKO.CD46.vWF敲入），展示嵌合人-猪vWF基因型（和所需表型），不同的MCV载体（例如pREV954、pREV971或pREV999）可以在这些品系中作为另一种通过crispr增强插入4种转基因至Gal着陆台的方法和在现有vWF修饰的品系中，进行至修饰的Gal基因座的靶向插入。
实施例9：ß4galNT2 KO（在GTKO.CD46.HLA-E背景上）
使用GTKO.CD46和用于表达人HLA-E连同作为三聚物的人β2-微球蛋白的基因组转基因(用于防止针对异种移植的天然杀伤（NK）细胞应答)，产生3基因猪（3GE）。HLA-E 3基因猪在离体肺移植模型中显示防止NK细胞活化的功效。可以检测具有另外的猪ß4galNT2基因敲除的HLAE猪以在异种肺移植过程中提供另外的针对宿主NHP中产生的异种抗体应答的保护。生成CRISPR/Cas9载体以敲除GTKO.CD46.HLAE转基因成纤维细胞中的ß4galNT2基因。HLAE背景上显示携带双等位基因ß4galNT2 KO’s（B4KO）的细胞克隆群用于核转移。八只胎儿源自所产生的七只孕猪中的一只，这些胎儿中的四只不仅在ß4galNT2基因座具有双等位基因插入或缺失（INDEL），而且具有ß4galNT2的功能性敲除（B4KO），这通过DBA凝集素（FL-1031,Vector Labs）染色的完全缺乏证实。可以在离体和体内Tx模型中检测具有B4KO的3基因HLAE品系。
另外，已使用αGal基因座的特异性同源臂（各末端500bp）构建MCV载体，使得通过CRISPR辅助的诸如EPCR.HO-1.TBM.CD47（971HDR，参见实施例7）的MCV靶向插入对这些GTKO.CD46.HLAE.B4KO细胞系进一步修饰。
实施例10：pREV999: GTKO.CD46.cagEPCR.DAFcagTFPI.CD47
另一种显示在猪永生内皮细胞中表达所有基因的MCV构建体提供一组基因的遍在和强劲表达，其在体内肺Tx模型中提供优良生命支持，但其中转基因被作为基因组中独立位置的两种双顺反子而随机整合。使用具有αGal或猪ß4galNT2同源臂的pREV999 MCV（参见图2）生成载体。可以生成在GTKO和CD46背景添加的B4GALNT2 KO的此MCV以提供在肺Tx中提高的生命维持。将具有Gal基因座靶向臂的pREV999载体转染至GTKO成纤维细胞，通过LRPCR和对整合位点接头测序来鉴定靶向集落。靶向细胞用于SCNT，至得到的六（6）个受体和孕猪中。
实施例11：在GTKO成纤维细胞中实现具有αGal同源臂的pREV954 MCV（EPCR.DAF.TBM.A20）的靶向敲入，具有在Gal基因座上954 MCV单等位基因敲入的细胞系用于SCNT。
已生成用于具有B4GALNT2臂的pREV954的载体。可以将这些臂取代为靶向CMAH基因座、猪ROSA26或AAVS1的同源臂。此MCV插入具有MCV敲入联合GTKO和CD46背景上B4GALNT2KO的第二着陆台（与Gal基因座相对）可以在肺Tx中提供大大提高的生命维持。
实施例12：在αGal基因座具有两种补体抑制剂基因（CD46 + DAF/CD55）的靶向插入的GTKO猪的产生
已构建载体以检测另外的基因组着陆台的转基因表达能力。所述另外的基因组着陆台是CMAH和ß4GalNT2，由此实现同时的基因敲除和转基因整合。
已使用促进这两种补体抑制剂转基因的Gal基因座的crispr介导的敲入的元件构建双顺反子CD46/CD55（DAF）载体，所述敲入旨在减少靶向/整合事件（即，与CD46/DAF转基因共分离的αGal敲除）的数量，以促进用于生产和临床用途的这样的多重转基因猪品系的育种。此载体掺入由两种不同启动子驱动的转基因，所述启动子为用于hCD46的内源性启动子和用于补体抑制剂DAF的组成型CAG启动子。可选地，还考虑构建具有在单CAG启动子调控下的CD46和DAF基因的双顺反子载体（还具有用于靶向修饰的Gal基因座的同源臂）。
此双顺反子靶向GTKO猪中的Gal位点，以提供强劲保护免于在Tx过程中与补体固定相关的非gal抗体。
通过插入MCV，例如GTKO.CD46.EPCR.DAF.TBM.A20（pREV954）与在另一着陆台（例如分别为猪ß4galNT2或CMAH基因座）中的B4GALNT2或CMAH臂，进一步修饰具有此修饰（在αGal着陆台整合的CD46/DAF双顺反子）的细胞系，由此利用用于相同细胞系中的多重基因编辑的两种着陆台以产生7基因猪（7GE），或如果使用靶向两种着陆台的两种4基因MCV，在GTKO背景上产生9基因修饰的猪（9GE）。

Claims (112)

1. 一种转基因猪，所述转基因猪包含至少四种转基因，其中所述至少四种转基因在至少两种启动子的调控下在单基因座掺入和表达，并且其中所述猪缺乏α 1,3半乳糖基转移酶的表达。
2.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述单基因座是天然基因座。
3.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述单基因座是修饰的天然基因座。
4.根据权利要求3所述的转基因猪，其中所述修饰的天然基因座包含基因编辑介导的插入、缺失或取代。
5.根据权利要求3所述的转基因猪，其中所述修饰的天然基因座包含转基因DNA。
6.根据权利要求5所述的转基因猪，其中所述转基因DNA包含选择性标记基因。
7.根据权利要求5所述的转基因猪，其中所述转基因DNA包含着陆台。
8.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述单基因座选自AAVS1、ROSA26、CMAH、ß4GalNT2以及GGTA1组成的组。
9.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述单基因座是天然GGTA1基因座。
10.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述单基因座是修饰的GGTA1基因座。
11.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述单基因座是转基因的GGTA1基因座。
12.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述启动子中的至少一种是组成型启动子。
13.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述启动子中的至少一种为可调节性启动子。
14.根据权利要求13所述的转基因猪，其中所述可调节性启动子是组织特异性启动子或可诱导性启动子。
15.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述启动子中的至少一种是外源性启动子。
16.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述至少四种转基因作为第一多顺反子和第二多顺反子表达，并且其中所述至少两种启动子包含调控所述第一多顺反子表达的第一启动子和调控所述第二多顺反子表达的第二启动子。
17.根据权利要求1所述的转基因猪，其包含至少四种启动子，其中所述至少四种转基因中的每一种由专属启动子调控。
18.根据权利要求16所述的转基因猪，其中所述第一启动子是组成型启动子，所述第二启动子是组织特异性启动子。
19.根据权利要求18所述的转基因猪，其中所述组织特异性启动子是内皮细胞特异性启动子。
20.根据权利要求16所述的转基因猪，其中所述第一启动子和所述第二启动子是组成型启动子。
21.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述至少两种启动子包括CAG和ICAM-2。
22.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述至少四种转基因选自抗凝剂、补体抑制剂、免疫调节剂、细胞保护转基因以及它们的组合组成的组。
23.根据权利要求22所述的转基因猪，其中所述抗凝剂选自TBM、TFPI、EPCR、CD39以及它们的组合组成的组。
24.根据权利要求22所述的转基因猪，其中所述补体抑制剂选自CD46、CD55、CD59以及它们的组合组成的组。
25.根据权利要求22所述的转基因猪，其中所述免疫调节剂是免疫抑制剂。
26.根据权利要求25所述的转基因猪，其中所述免疫抑制剂选自猪CLTA4-IG、CIITA-DN以及它们的组合组成的组。
27.根据权利要求22所述的转基因猪，其中所述免疫调节剂是CD47。
28.根据权利要求22所述的转基因猪，其中所述细胞保护转基因选自HO-1、A20以及它们的组合组成的组。
29.根据权利要求1所述的转基因猪，其中所述转基因中的至少两种是抗凝剂。
30.根据权利要求29所述的转基因猪，其中所述转基因中的至少一种是细胞保护转基因。
31.根据权利要求30所述的转基因猪，其中所述转基因中的至少一种是免疫调节剂。
32.根据权利要求31所述的转基因猪，其中所述转基因中的至少一种是补体抑制剂。
33.根据权利要求1所述的转基因猪，其进一步包含至少一种另外的遗传修饰。
34.根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰选自：基因敲除；基因敲入；基因置换；点突变；基因、基因片段或核苷酸的缺失、插入或取代；大基因组插入；或它们的组合组成的组。
35. 根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述单基因座不是GGTA1，所述至少一种另外的遗传修饰包含α 1,3半乳糖基转移酶基因的敲除。
36.根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括人CD46的掺入和表达。
37.根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括猪vWF基因座的修饰，以减轻或消除人血小板的自发性聚集。
38.根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括嵌合猪-人vWF的掺入和表达。
39.根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括猪vWF基因的靶向灭活，和人vWF基因片段的掺入和表达。
40.根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括人HLA-E的掺入和表达。
41.根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括ß4GalNT2基因敲除。
42.根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括CMAH基因敲除。
43.根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括至少两种另外的转基因的掺入和表达。
44.根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括至少两种另外的转基因在第二单基因座的掺入和表达。
45.根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括至少四种另外的转基因在第二单基因座的掺入和表达。
46.根据权利要求44所述的转基因猪，其中所述单基因座是GGTA1，所述第二单基因座是ß4GalNT2。
47.根据权利要求44所述的转基因猪，其中所述单基因座是GGTA1，所述第二单基因座是CMAH。
48.根据权利要求33所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰导致消除或减少至少一种天然基因的表达。
49.根据权利要求48所述的转基因猪，其中所述至少一种天然基因选自CMP-NeuAc羟化酶、异红细胞糖苷脂3合酶、ß4GalNT2、vWF、Forrsman合酶或它们的组合组成的组。
50.一种器官，其源自权利要求1-49所述的转基因猪。
51.一种肺或肺块，其源自权利要求1-49所述的转基因猪。
52.一种组织，其源自权利要求1-49所述的转基因猪。
53.一种细胞，其源自权利要求1-49所述的转基因猪。
54. 一种制备表达至少四种转基因但缺乏α 1,3半乳糖基转移酶表达的转基因猪的方法，所述方法包括：（i）在至少两种启动子的调控下在猪基因组中单基因座掺入至少四种转基因，以提供多基因猪基因组；（ii）允许包含所述多基因猪基因组的细胞成熟为转基因猪。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述猪基因组是体细胞猪基因组，所述细胞是猪受精卵，并且其中所述猪受精卵通过体细胞核转移（SCNT）提供，并且通过微注射至重构的SCNT受精卵而转移多基因猪基因组。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述体细胞猪基因组包含至少一种另外的遗传修饰。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述至少一种另外的遗传修饰选自：基因敲除；基因敲入；基因置换；点突变；基因、基因片段或核苷酸的缺失、插入或取代；大基因组插入；或它们的组合组成的组。
58.根据权利要求55所述的方法，其进一步包括将至少一种另外的遗传修饰引入所述多基因猪基因组。
59.根据权利要求56或58所述的方法，其中所述至少一种另外的遗传修饰选自：基因敲除；基因敲入；基因置换；点突变；基因、基因片段或核苷酸的缺失、插入或取代；大基因组插入；或它们的组合组成的组。
60.根据权利要求54所述的方法，其中所述猪基因组选自配子猪基因组、受精卵猪基因组、胚胎猪基因组或胚泡猪基因组组成的组。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述猪基因组包含至少一种另外的遗传修饰。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述至少一种另外的遗传修饰选自：基因敲除；基因敲入；基因置换；点突变；基因、基因片段或核苷酸的缺失、插入或取代；大基因组插入；或它们的组合组成的组。
63.根据权利要求60所述的方法，其进一步包括将至少一种另外的遗传修饰引入多基因猪基因组。
64.根据权利要求61或63所述的方法，其中所述至少一种遗传修饰选自：基因敲除；基因敲入；基因置换；点突变；基因、基因片段或核苷酸的缺失、插入或取代；大基因组插入；或它们的组合组成的组。
65.根据权利要求54所述的方法，其中所述掺入包括选自生物转染、化学转染、物理转染、病毒介导的转导或转化或它们的组合组成的组的方法。
66.根据权利要求54所述的方法，其中所述掺入包括细胞质微注射和原核微注射。
67.根据权利要求54所述的方法，其中所述单基因座是天然基因座。
68.根据权利要求54所述的方法，其中所述单基因座是修饰的天然基因座。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述修饰的天然基因座包含基因编辑介导的插入、缺失或取代。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述修饰的天然基因座包含转基因DNA。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述转基因DNA包含选择性标记基因。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述转基因DNA包含着陆台。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述转基因DNA包含对于多核苷酸修饰酶的一种或多种识别序列。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述多核苷酸修饰酶选自工程化的核酸内切酶、位点特异性重组酶、整合酶或它们的组合组成的组。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述工程化的核酸内切酶选自锌指核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶以及成簇规律间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶组成的组。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述位点特异性重组酶选自λ整合酶、Cre重组酶、FLP重组酶、γ-δ解离酶、Tn3解离酶、ΦC31整合酶、Bxb1整合酶、R4整合酶或它们的组合组成的组。
77.根据权利要求54所述的方法，其中所述单基因座是天然GGTA1基因座。
78.根据权利要求54所述的方法，其中所述单基因座是修饰的GGTA1基因座。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述修饰的GGTA1基因座是转基因的GGTA1基因座。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述转基因的GGTA1基因座包含选择性标记基因。
81.根据权利要求79所述的方法，其中所述转基因的GGTA1基因座包含工程化的着陆台。
82.根据权利要求54所述的方法，其中所述单基因座是选自CMAH、ß4GalNT2、AAVS1基因座和Rosa26组成的组的天然基因座。
83.根据权利要求54所述的方法，其中所述单基因座是选自CMAH、ß4GalNT2、AAVS1基因座和Rosa26组成的组的修饰的基因座。
84. 根据权利要求56或61所述的方法，其中所述单基因座不是GGTA1基因座，所述另外的遗传修饰包含α 1,3半乳糖基转移酶基因敲除。
85.根据权利要求56、58、61或63所述的方法，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括CD46的掺入和表达。
86.根据权利要求56、58、61或63所述的方法，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括人HLA-E的掺入和表达。
87.根据权利要求56、58、61或63所述的方法，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括猪vWF基因座的修饰，以减轻或消除人血小板的自发性聚集。
88.根据权利要求56、58、61或63所述的方法，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括嵌合猪-人vWF的掺入和表达。
89.根据权利要求56、58、61或63所述的方法，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括猪vWF基因的靶向灭活和人vWF基因片段的插入和表达。
90.根据权利要求56、58、61或63所述的方法，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括通过天然vWF基因内的核苷酸取代、或通过天然vWF基因的敲除和用完全人vWF基因置换而产生的猪vWF的修饰。
91.根据权利要求56、58、61或63所述的方法，其中所述至少一种遗传修饰包括选自ß4GalNT2基因、CMAH基因、ß4GalNT2基因以及GGTA1基因组成的组的基因的敲除。
92.一种转基因动物或生产群，其通过权利要求54或61所述的方法产生。
93.根据权利要求54或60所述的方法，其进一步包括将所述转基因猪培育成第二转基因猪，其中所述第二转基因猪包含至少一种遗传修饰。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述至少一种遗传修饰包括至少一种转基因的掺入和表达。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述至少一种转基因选自抗凝剂、补体抑制剂、免疫调节剂、细胞保护转基因以及它们的组合组成的组。
96.根据权利要求93所述的方法，其中所述至少一种遗传修饰包括至少一种猪基因的敲除。
97.根据权利要求93所述的方法，其中所述至少一种遗传修饰包括嵌合猪-人vWF的掺入和表达。
98.根据权利要求94所述的方法，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括猪vWF基因座的修饰，以减轻或消除人血小板的自发性聚集。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述修饰的猪vWF通过天然vWF基因内的核苷酸取代、或天然vWF基因的敲除和使用完全人vWF基因置换而产生。
100.一种转基因动物或生产群，其通过权利要求94所述的方法产生。
101.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括将源自权利要求1-53所述的转基因猪的至少一种器官、器官块、组织或细胞移植至所述受试者。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述至少一种器官选自肺、心脏、肾、肝、胰腺或它们的组合组成的组。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述至少一种器官是肺。
104.根据权利要求101所述的方法，其中所述至少一种器官块选自肺块、心脏块、肾块、胰腺块或它们的组合。
105.根据权利要求101所述的方法，其中所述受试者患有晚期肺疾病，并移植肺或肺块。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述晚期肺疾病与慢性阻塞性肺病（COPD）、特发性肺纤维化（IPD）、囊性纤维病（CF）、α1-抗胰蛋白酶病或原发性肺动脉高压有关。
107.根据权利要求101所述的方法，其进一步包括给所述受试者施用一种或多种治疗剂。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述治疗剂选自抗排斥剂、抗炎剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗微生物剂、抗病毒剂以及它们的组合。
109. 一种转基因猪，所述转基因猪包含猪vWF基因座的遗传修饰，其中所述猪缺乏α1,3半乳糖基转移酶表达。
110.根据权利要求109所述的转基因猪，其进一步包含至少一种另外的遗传修饰。
111.根据权利要求110所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰选自：基因敲除；基因敲入；基因置换；点突变；基因、基因片段或核苷酸的缺失、插入或取代；大基因组插入；或它们的组合组成的组。
112.根据权利要求110所述的转基因猪，其中所述至少一种另外的遗传修饰包括至少四种转基因的掺入和表达。
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