CN115176020A - 具有一个或多个用于增强异种移植物存活和/或耐受性的经修饰基因的细胞、组织、器官和/或动物 - Google Patents

具有一个或多个用于增强异种移植物存活和/或耐受性的经修饰基因的细胞、组织、器官和/或动物 Download PDF

Info

Publication number
CN115176020A
CN115176020A CN202080050306.1A CN202080050306A CN115176020A CN 115176020 A CN115176020 A CN 115176020A CN 202080050306 A CN202080050306 A CN 202080050306A CN 115176020 A CN115176020 A CN 115176020A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tissue
animal
organ
cell
transgene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080050306.1A
Other languages
English (en)
Inventor
杨璐菡
高杨滨
马克·桂尔
坎沂南
秦文宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Qihan Biotech Co Ltd
E Create Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Qihan Biotech Co Ltd
E Create Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/CN2019/087314 external-priority patent/WO2020228043A1/en
Priority claimed from PCT/CN2019/087310 external-priority patent/WO2020228039A1/en
Priority claimed from PCT/CN2019/112038 external-priority patent/WO2021072777A1/en
Priority claimed from PCT/CN2019/112039 external-priority patent/WO2021072778A1/en
Application filed by Hangzhou Qihan Biotech Co Ltd, E Create Biotechnology Co ltd filed Critical Hangzhou Qihan Biotech Co Ltd
Publication of CN115176020A publication Critical patent/CN115176020A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
    • C12N15/8778—Swine embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A01K2267/025—Animal producing cells or organs for transplantation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Abstract

本公开文本涉及具有一个或多个用于增强异种移植物存活和/或耐受性的经修饰基因的细胞、组织、器官和/或动物。此外，本公开文本涉及制备和使用具有一个或多个所述经修饰基因的所述细胞、组织、器官和/或动物的方法。

Description

具有一个或多个用于增强异种移植物存活和/或耐受性的经 修饰基因的细胞、组织、器官和/或动物
相关申请的交叉引用
出于所有目的，本申请并入2019年5月16日提交的PCT/CN19/87310、2019年5月16日提交的PCT/CN19/87314、2019年10月18日提交的PCT/CN19/112038和2019年10月18日提交的PCT/CN19/112039的全部公开内容。
序列表的交叉引用
将与此一起以电子方式提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：EGEN_037_00WO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2020年5月14日，文件大小：189千字节)。
背景技术
在过去的几十年中，用于移植的人体器官和组织的短缺日益严重，并且是最重要的未满足的医疗需求之一。异种移植有潜力几乎无限制地供应用于慢性器官衰竭患者的移植器官。器官大小和生理上的相似性，再加上基因工程消除分子不相容性，使猪成为了肾异种移植的首选供体。临床前研究表明，猪肾异种移植可以延长非人灵长类动物接受者数周至数月的生命(Higginbotham 2015,Iwase 2015b)。然而，由于猪与人之间的进化距离，猪器官以多种形式触发了人免疫系统的排斥反应，包括(i)超急性排斥反应；(ii)急性体液排斥反应，由血栓调节失调和II型内皮细胞(EC)激活伴白细胞募集组成；(iii)血栓性微血管病，由血管内血栓形成伴血小板消耗以及EC激活、纤维蛋白沉积和由于缺乏血栓调节而引起的血栓形成组成，以及(iv)慢性血管病。这些不良事件至少部分是由于供体与接受者之间的分子不相容性，特别是关于参与补体、凝血、炎症和免疫应答系统的基因。异种器官(例如，猪)的临床使用被这些免疫学不相容性阻碍，所述不相容性迄今已阻止了猪细胞、组织和血管化猪器官在临床异种移植中的使用。
在过去的二十年中，已鉴定了减少猪与人之间的种间不相容性的几种基因修饰。然而，这些先前鉴定的基因修饰尚未实现长期异种移植物存活。此外，大规模基因组工程的技术局限性阻碍了这些修饰在单个动物中的整合。
发明内容
需要开发具有新颖的基因修饰组合的猪细胞、组织、器官和/或猪动物，用于异种移植和开发相关方法。
因此，本公开文本提供了包含导致增强的免疫学相容性的基因修饰的细胞、组织、器官和动物，以及用于产生这些细胞、组织、器官和动物的载体和方法，以及这些细胞、组织、器官和动物在异体移植中的用途。在某些实施方案中，引起增强的免疫学相容性的基因修饰包括一个或多个补体应答基因(在本文中可互换地称为补体毒性基因)、凝血反应基因(在本文中可互换地称为凝血基因)、炎症反应基因(在本文中可互换地称为凋亡/炎症基因)、免疫应答基因(在本文中可互换地称为细胞毒性基因)和/或免疫调节基因。
在一些方面，本公开文本提供了经分离的细胞、组织、器官和动物，其包含选自炎症反应转基因、免疫应答转基因、免疫调节转基因或其组合的至少两种类型的多个转基因。在一些方面，本公开文本提供了包含多个转基因的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述多个转基因包括至少一个炎症反应转基因、至少一个免疫应答转基因和至少一个免疫调节转基因。在一些实施方案中，所述多个转基因包括选自炎症反应转基因、免疫应答转基因、免疫调节转基因或其组合的至少三个转基因。在一些实施方案中，炎症反应转基因选自肿瘤坏死因子α诱导的蛋白质3(A20)、血红素加氧酶(HO-1或HMOX1)、分化簇47(CD47)及其组合。在一些实施方案中，免疫应答转基因选自人白细胞抗原-E(HLA-E)、β-2微球蛋白(B2M)及其组合。在一些实施方案中，免疫调节转基因选自程序性死亡配体1(PD-L1)、Fas配体(FasL)及其组合。在一些实施方案中，所述多个转基因进一步包括至少一个凝血反应转基因。在一些实施方案中，凝血反应转基因选自分化簇39(CD39)、血栓调节蛋白(THBD、TBM或TM)、组织因子途径抑制剂(TFPI)及其组合。在一些实施方案中，所述多个转基因进一步包括至少一个补体应答转基因。在一些实施方案中，补体应答转基因选自人膜辅因子蛋白(hCD46或简称CD46)；人补体衰变加速因子(hCD55或简称CD55)、人MAC抑制剂因子(hCD59或简称CD59)及其组合。
在一个方面，本公开文本提供了包含一个或多个转基因的经分离的细胞、组织、器官和动物，所述转基因各自独立地选自补体应答转基因(例如，CD46、CD55、CD59)；凝血反应转基因(例如，CD39、THBD或TBM、TFPI)；炎症反应转基因(例如，A20、HO-1、CD47)；免疫应答转基因(例如，HLA-E、B2M)；和/或免疫调节转基因(例如，PD-L1、FasL)。在某些实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物可以进一步包含来自其他基因类别的一个或多个另外的转基因。
在某些实施方案中，本文提供的经分离的细胞、组织、器官和动物包含一个或多个选自hCD46、hCD55和hCD59的补体应答转基因。在这些实施方案的一些中，一种或多种所述补体应答转基因的表达由泛在启动子驱动。
在某些实施方案中，本文提供的经分离的细胞、组织、器官和动物包含一个或多个选自CD39、THBD和TFPI的凝血反应转基因。在这些实施方案的一些中，一种或多种所述凝血反应转基因的表达由组织特异性启动子驱动。在这些实施方案的某些中，所述组织特异性启动子是内皮特异性启动子，并且在这些实施方案的某些中，所述内皮特异性启动子是低表达内皮特异性启动子。
在某些实施方案中，本文提供的经分离的细胞、组织、器官和动物包含一个或多个选自A20、HO-1和CD47的炎症反应转基因。在这些实施方案的一些中，一种或多种所述炎症反应转基因的表达由泛在启动子、组织特异性启动子(如内皮特异性启动子)或其任何组合驱动。
在某些实施方案中，本文提供的经分离的细胞、组织、器官和动物包含一个或多个选自HLA-E和B2M的免疫应答转基因。在这些实施方案的一些中，一种或多种所述免疫应答转基因的表达由泛在启动子驱动。
在某些实施方案中，本文提供的经分离的细胞、组织、器官和动物包含一个或多个免疫调节转基因，包括但不限于PD-L1、FasL或两者。
在所述细胞、组织、器官或动物中以临床有效水平表达这些转基因中的至少六个导致增强的免疫学相容性。因此，在某些实施方案中，本文提供的经分离的细胞、组织、器官和动物包含六个或更多个转基因，例如6、7、8、9、10、11或12个转基因，其选自补体应答、凝血反应、炎症反应、免疫基因和免疫调节转基因。在这些实施方案的某些中，所述细胞、组织、器官或动物可以包含来自每个类别的至少一个转基因。在其他实施方案中，可以排除某些类别的转基因。在某些实施方案中，补体应答、凝血反应、炎症反应、免疫应答和/或免疫调节转基因均可以同时以可检测和/或临床有效水平表达。在其他实施方案中，仅转基因的特定子集可以在某些时间点或响应于某些信号以临床有效水平表达。在这些实施方案中，一种或多种所述转基因的表达可以在某些时间点下降到可检测和/或临床有效水平以下。
在某些实施方案中，本文提供的经分离的细胞、组织、器官和动物包含转基因CD46、CD55、HLA-E、CD47、CD39、THBD和TFPI。
在某些实施方案中，本文提供的经分离的细胞、组织、器官和动物包含转基因CD46、CD55、CD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD和TFPI。
在某些实施方案中，本文提供的经分离的细胞、组织、器官和动物包含转基因CD46、CD55、CD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1。
本文所指的蛋白质或基因可以是根据下表的那些。序列通过引用并入。
Figure BDA0003463330150000041
Figure BDA0003463330150000051
在某些实施方案中，本文公开的经分离的细胞、组织、器官和动物进一步包含对补体应答基因、凝血反应基因、炎症反应基因、免疫应答基因和/或免疫调节基因的一个或多个修饰。例如，在其中所述细胞、组织、器官或动物是猪的某些实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物可以包含血管性血友病因子(vWF)基因的改变，在一些情况下包括导致所述基因人源化的改变。
在某些实施方案中，本文公开的细胞、组织、器官和动物进一步包含对其他类别基因的一个或多个修饰。这些修饰可以包括，例如，所述基因全部或部分的缺失或切除(即敲除)，或任何其他失活、破坏或改变。例如，在某些实施方案中，所述细胞、组织、器官和动物可以包含脱唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)的敲除、失活或破坏。在某些实施方案中，可以对所述细胞、组织、器官和动物进行基因修饰以表现出降低的碳水化合物抗原应答。例如，所述细胞、组织、器官或动物可以包含一个或多个碳水化合物抗原产生基因(例如，糖蛋白α-半乳糖基转移酶1(GGTA)、β1,4N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(B4GalNT2)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH))的敲除、失活或破坏。
在某些实施方案中，本文提供的经分离的细胞、组织、器官和动物包含转基因CD46、CD55、HLA-E、CD47、CD39、THBD和TFPI，并且进一步包含GGTA、B4GalNT2和CMAH的敲除、失活或破坏。在某些实施方案中，所述经分离的细胞、组织、器官和动物进一步包含转基因CD59和B2M，并且在那些实施方案的某些中，所述经分离的细胞、组织、器官和动物进一步包含转基因A20、PD-L1和HO-1。在某些实施方案中，这些细胞、组织、器官和动物表现出增强的免疫相容性，包括减少的碳水化合物抗原应答和增强的凝血、补体、炎症和/或免疫应答。
在一些实施方案中，本文提供的经分离的细胞、组织、器官和动物是猪，即猪细胞、猪组织、猪器官或猪或其后代。在这些实施方案的某些中，所述细胞、组织、器官或动物不含猪内源性逆转录病毒(“不含PERV”)。在这些实施方案的某些中，“不含PERV”的细胞、组织、器官或动物不产生异嗜性PERV病毒粒子。在这些实施方案的某些中，“不含PERV”的细胞、组织、器官或动物不产生PERV病毒粒子。在这些实施方案的某些中，“不含PERV”的细胞、组织、器官或动物不产生感染性PERV病毒粒子。在这些实施方案的某些中，不含PERV的细胞、组织、器官和动物包含转基因CD46、CD55、HLA-E、CD47、CD39、THBD和TFPI，并且任选地进一步包含GGTA、B4GalNT2和/或CMAH的敲除、失活或破坏。在其他实施方案中，不含PERV的细胞、组织、器官和动物包含转基因CD46、CD55、CD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD和TFPI，并且任选地进一步包含GGTA、B4GalNT2和/或CMAH的敲除、失活或破坏。在仍其他实施方案中，不含PERV的细胞、组织、器官和动物包含转基因CD46、CD55、CD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1，并且任选地进一步包含GGTA、B4GalNT2或CMAH的敲除、失活或破坏。
在本文提供的经分离的细胞和组织的某些实施方案中，所述细胞或组织是肾脏或肝脏细胞或组织。在本文提供的经分离的器官的某些实施方案中，所述器官是肾脏或肝脏。
在另一方面，本公开文本提供了载体，其包含选自炎症反应转基因、免疫应答转基因、免疫调节转基因或其组合的至少两种类型的多个转基因。在一些实施方案中，所述多个转基因包括选自炎症反应转基因、免疫应答转基因、免疫调节转基因或其组合的三种类型。在一些方面，本公开文本提供了包含多个转基因的载体，其中所述多个转基因包括至少一个炎症反应转基因、至少一个免疫应答转基因和至少一个免疫调节转基因。在一些实施方案中，所述炎症反应转基因选自A20、HO-1、CD47及其组合。在一些实施方案中，所述免疫应答转基因选自HLA-E、B2M及其组合。在一些实施方案中，所述免疫调节转基因选自PD-L1、FasL及其组合。在一些实施方案中，所述多个转基因进一步包括至少一个凝血反应转基因。在一些实施方案中，所述凝血反应转基因选自CD39、THBD、TFPI及其组合。在一些实施方案中，所述多个转基因进一步包括至少一个补体应答转基因。在一些实施方案中，所述补体应答转基因选自CD46、CD55、CD59及其组合。
在其他方面，本公开文本提供了用于基因修饰细胞、组织、器官或动物以产生本文提供的细胞、组织、器官或动物的载体，包括例如用于插入(即敲入)一个或多个补体应答、凝血反应、炎症反应、免疫应答和/或免疫调节转基因的载体。在这些实施方案的某些中，所述载体包含所述转基因中的至少6、7、8、9、10、11或12个。在这些实施方案的一些中，所述转基因中的至少六个是从单个基因座表达的。本文还提供了用于基因修饰细胞、组织、器官或动物以产生本文提供的细胞、组织、器官或动物的其他组分，包括例如基于CRISPR的编辑组分，如指导RNA(gRNA)或核酸内切酶。
在某些实施方案中，本文提供的载体包含转基因CD46、CD55、HLA-E、CD47、CD39、THBD和TFPI。在这些实施方案的某些中，所述载体进一步包含转基因CD59和B2M。在这些实施方案中的某些中，所述载体进一步包含转基因A20、PD-L1和HO-1，并且在这些实施方案的某些中，所述载体包含如图17-图20、图31或图48-图50所示的组分。在某些实施方案中，所述载体包含如SEQ ID NO:212-214中任一个所示的序列。
在某些实施方案中，本文还提供了产生本文提供的经分离的细胞、组织、器官和动物的方法。在这些实施方案的某些中，所述方法包括引入一种或多种本文提供的载体。因此，在某些实施方案中，本文提供的细胞、组织、器官和动物包含一种或多种本文公开的载体。
在一些实施方案中，本文公开和描述的方法包括通过转座进行的单拷贝多顺反子转基因整合、通过重组酶介导的盒交换(RMCE)进行的单/双等位基因位点特异性整合、基因组替代、内源基因人源化或其任何组合。
在本文提供的方法的某些实施方案中，其中所产生的细胞、组织、器官和动物是猪，所述方法进一步包括敲除或以其他方式破坏或灭活一个或多个PERV基因，例如PERVpol，并且在这些实施方案的某些中，所得的猪细胞、组织、器官或动物不含PERV。
在另一方面，本公开文本提供了当暴露于非猪血液时具有减少的肝脏损害和/或稳定的凝血的转基因猪肝脏，其中通过确定胆汁产生、一种或多种代谢酶和/或一种或多种血清电解质的水平来评估减少的肝脏损害，并且其中通过确定凝血酶原时间(PT)和国际标准化比率(PT-NIR)、纤维蛋白原水平(FIB)和/或较低的激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的水平来评估稳定的凝血。在一些实施方案中，所述代谢酶选自丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和白蛋白(ALB)。在一些实施方案中，所述血清电解质是钾(K)和/或钠(Na)。
在一些实施方案中，本文公开和描述的转基因猪肝脏包含选自丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和白蛋白(ALB)的天然代谢酶。
附图说明
图1A-图1C是显示补体因子3敲除(“C3-KO”)猪的基因分型结果的图表。图1A示出了引入的缺失的大小。图1B示出了插入缺失的位置。图1C列出了产生的插入缺失的序列(SEQ ID NO:253-289)。
图2是描述主要组织相容性复合物I类(“MHC I类”)替代策略的方案的框图，其中含有SLA-1、SLA-2和SLA-3基因的基因座侧接有loxP位点。
图3A和图3B是显示主要组织相容性复合物(MHC)II类敲除(“MHCII-KO”)猪基因型，特别是MHCII基因DQA的基因分型结果的图表。图3A示出了在扩增子的位置126和位置127中具有两个1bp插入的插入缺失的位置和大小。图3B示出了插入之一的位置。
图4A和图4B是显示另一种MHC II类-KO猪基因型，特别是MHCII基因DRA的基因分型结果的图表。图4A示出了在扩增子的位置106和位置107中具有1两个bp插入的插入缺失的位置和大小。图4B示出了插入(SEQ ID NO:290-327)之一的位置。
图5包括六个图表，示出了MHCII-KO猪(“H3-9P01”)和野生型(“WT”)猪的荧光辅助细胞分选(FACS)分析结果。
图6是描绘与MHCII-KO表型相关的一个或多个表型的一系列图像。
图7是示出用于改变PD-L1基因的方案的一系列框图。
图8是示出如使用两个扩增子通过qPCR所测量的PD-L1表达的图表。
图9是示出猪(SEQ ID NO:329)和人(SEQ ID NO:328)vWF蛋白的比对的序列表。A1结构域在方框中突出显示，而侧翼区域中的潜在糖基化位点则用划线标记。pvWF中缺失的人特有残基用水平线标记。被人源化的A1和侧翼区域用半括号标记。
图10描绘了靶向pvWF和两个sgRNA(SEQ ID NO:5和6)的同源性定向修复(“HDR”)载体的设计。
图11示出了经由SphI和BspEI消化对HDR的筛选结果。
图12A和图12B示出了从图11获得的双等位基因HDR克隆(其中vWF被靶向)的测序结果(SEQ ID NO:330-333)。两个测序结果的色谱图用一行重叠序列说明。人源化A1和侧翼区域用半括号标记。
图13是描绘通过剪切应力诱导并通过光透射监测从WT(猪A1结构域)或HDR靶向(人A1结构域)猪分离的血小板的物种特异性血小板聚集反应的图。
图14是猪MHC I类基因座的示意图。所有经典的MHCI基因均用颜色编码。紧邻MHCI基因的UTR的独特侧翼区域被标记为绿色括号。还示出了选自这些区域的四个高活性sgRNA(SEQ ID NO:1-4)。
图15描绘了使用图14中的sgRNA诱导的MHCI经典簇的片段缺失。图15A示出了sgRNA转染的细胞群体中MHCI 5'、3'和5'-3'缺失连接的独特区域的PCR扩增子。图15B示出，对5'-3'连接PCR进行TOPO克隆，并且将测序结果与由MHC5'_sg1和MHC3'_sg2产生的预计MHCI 5'-3'连接比对(SEQ ID NO:335-343)。
图16示出了使用猪特异性SLA-1抗体富集MHCI阴性细胞。
图17示出了根据本文公开和描述的实施方案，用于表达多个转基因(例如人源化转基因)的转基因表达载体。有效载荷5(猪2.1)：12个转基因，泛在表达。
图18示出了根据本文公开和描述的实施方案，用于表达多个转基因(例如人源化转基因)的转基因表达载体。有效载荷9(猪2.2)：12个转基因，内皮特异性。
图19示出了根据本文公开和描述的实施方案，用于表达多个转基因(例如人源化转基因)的转基因表达载体。有效载荷10(猪2.3)：12个转基因，内皮/胰岛特异性。
图20示出了根据本文公开和描述的实施方案，用于表达多个转基因(例如人源化转基因)的转基因表达载体。有效载荷10-Exo(猪2.4)：12个转基因，内皮/胰岛特异性，进行胰腺外分泌消融。
图21是示出本文所述的基因工程来源供体猪的系谱的示意图。
图22表明，与人组织的相容性增强的基因工程猪成纤维细胞显示出对人抗体的结合亲和力显著降低。
图23展示了来自本文所述的基因工程猪原代成纤维细胞或内皮细胞的组织特异性mRNA表达。图23A是使用分子克隆技术组装的转基因构建体的示意图。将CD46、CD55和CD59盒置于泛在EF1α启动子的控制下，将HLA-E、B2M和CD47盒置于泛在CAG启动子的控制下，将A20、PD-L1、HO-1盒置于胰岛特异性NeuroD启动子的控制下，并将THBD、TFPI和CD39盒置于内皮特异性ICAM2启动子的控制下。将转基因构建体电穿孔至猪原代成纤维细胞(图23B)或永生化的猪主动脉内皮细胞系(PEC-A)(图23C)中，并通过qRT-PCR确定mRNA表达。
图24描绘了猪2.0(“3KO+12TG”)脾和成纤维细胞中的转基因蛋白表达。
图25表明，与人细胞相容性增强的基因工程猪成纤维细胞表现出明显较低水平的补体介导的细胞死亡。
图26表明，经基因工程化以表达人HLA-E的猪成纤维细胞表现出对NK介导的裂解的敏感性降低。
图27表明，源自GGTAKO+CD55KI猪的内皮细胞表现出凝血酶-抗凝血酶III(TAT)复合物的形成减少。
图28表明，与野生型(WT)肝脏相比，从4-7头猪分离并灌注人血的肝脏具有增加的胆汁产生。
图29表明，与WT肝脏相比，如通过肝脏损害和血清电解质水平的标记所评估，从4-7头猪分离并灌注人血的肝脏具有改善的肝脏功能。
图30表明，与WT肝脏相比，从4-7头猪分离并灌注人血的肝脏具有改善的凝血。
图31示出了根据本文公开和描述的实施方案的转基因表达载体。有效载荷13(猪2.5)：10个转基因，双顺反子。
图32A-图32B表明，移植有从有效载荷9(图32A)和有效载荷10(图32B)供体猪分离的肾脏的宿主猴子表现出稳定的血清肌酐水平。
图33A-图33B示出了移植有从有效载荷9(图33A)和有效载荷10(图33B)供体猪分离的肾脏的宿主猴子中的血细胞比容水平。
图34A-图34B示出了移植有从有效载荷9(图34A)和有效载荷10(图34B)供体猪分离的肾脏的宿主猴子中的血小板计数。
图35A-图35B示出了移植有从有效载荷9(图35A)和有效载荷10(图35B)供体猪分离的肾脏的宿主猴子中白细胞(WBC)计数的波动。
图36示出了RNAseq表达数据，其显示补体和细胞毒性基因在从有效载荷9和有效载荷10猪收集的样品中表达。
图37示出了FACS数据，其显示在从有效载荷5、有效载荷9和有效载荷10猪收集的样品中表达的补体和细胞毒性蛋白。
图38A-图38I示出了猪到狒狒原位肝脏异种移植(OLTx)后的临床实验室。
图39A-图39F是来自OLTx的H+E染色肝脏样品的代表性图像。
图40A-图40E展示了用人全血对经基因修饰的猪肝脏进行离体异种灌注后的临床实验室。
图41A-图41H是异种灌注猪肝脏的H+E染色的代表性图像。
图42表明，相对于GalTKO.hCD55肺，在灌注了人血的‘未处理’猪2.0(“3KO+12TG”)肺中，肺血管阻力(PVR)的上升显著减弱和延迟。
图43A-图43D展示了一组人血清与人T细胞(图43A)和B细胞(图43C)的结合，表明高PRA血清比低PRA更可能染色人细胞，以及一组人血清与猪T细胞(图43B)和B细胞(图43D)的结合。来自低PRA患者和高PRA患者两者的血清均显示出与猪靶标的高水平结合。
图44示出了一组高PRA人血清，与野生型细胞(WT pAEC)相比，其显示出与经基因修饰的猪主动脉内皮细胞(猪2.0(“3KO+12TG”)pAEC)的结合水平显著降低。所述猪2.0细胞缺少aGal、Neu5Gc和Sda。
图45A-图45C展示了用在不同时间点取自异种移植接受者动物的肾脏(图45A)、心脏(图45B)和肝脏(图45C)的血清对猪2.0(“3KO+12TG”)pAEC的染色。移植后采集的血清样品显示出降低的结合水平，尤其是肝脏异种移植后。
图46A-图46C展示了人血清与野生型(WT)和猪2.0(“3KO+12TG”)pAEC的结合(图46A)，人血清(图46B)或食蟹猴血清(图46C)在IdeS处理前后与pAEC的结合。IdeS有效减少人和食蟹猴IgG结合，而对完整IgM的结合没有影响。
图47示出了根据本文公开和描述的实施方案的转基因表达载体(SEQ ID NO:344和345)。有效载荷12F：12个转基因。
图48示出了根据本文公开和描述的实施方案的转基因表达载体。有效载荷12G：12个转基因。
图49示出了根据本文公开和描述的实施方案的转基因表达载体。有效载荷13A：10个转基因。
图50示出了RNAseq结果，表明补体和细胞毒性基因的表达。
图51A示出了CRISPR基因敲除和PiggyBac整合的方案。将靶向2个拷贝的GGTA1基因、2个拷贝的CMAH基因和4个拷贝的B4GALNT2基因的CRISPR/Cas9用于产生3KO，并且将靶向猪2.0(“3KO+9TG”)中PERV拷贝的CRISPR/Cas9用于产生PERV-KO细胞。将PiggyBac介导的随机整合用于将9个转基因插入猪基因组中。所述转基因在3个盒中表达，其中每个盒表达通过猪2A(P2A)肽连接的3个基因。
图51B示出了GGTA1(SEQ ID NO:346-348)、CMAH(SEQ ID NO:349-351)和B4GALNT2(SEQ ID NO:352-356)敲除的测序结果。全基因组测序分析揭示，在猪2.0(3KO+9TG)和猪3.0(3KO+9TG)中，i)GGTA1基因在一个等位基因中具有-10bp缺失，并且在另一个基因中具有转基因载体插入，ii)CMAH基因在一个等位基因中具有-391bp缺失，并且在另一个等位基因中具有2bp(AA)插入，以及iii)B4GALNT2在B4GALNT2基因的4个等位基因的每一个中具有-13、-14、-13、-14。所有修饰均发生在gRNA靶位点处，表明所述修饰是由所使用的CRISPR/Cas9的靶活性介导的。
图51C示出了PERV敲除的测序分析结果。猪2.0(3KO+9TG)(约2,000X)和3.0(约20,000X)的原始读段在示意性PERV基因结构下方示出。读段按其序列组成分组，并按其覆盖度成比例地示出。覆盖度轨迹中红色、蓝色、绿色和橙色的垂直线分别表示从参考等位基因到T、C、A、G的单个核苷酸变化。
图51D示出了9TG整合的PCR分析。猪2.0(3KO+9TG)和猪3.0(3KO+9TG)的转基因整合已通过PCR在基因组DNA(gDNA)水平上得到验证。PCR凝胶图像显示，来自猪2.0和猪3.0胎儿成纤维细胞的gDNA中存在9个人转基因，而WT猪胎儿成纤维细胞和NTC(不添加gDNA)组用作阴性对照。
图51E示出了猪2.0(3KO+9TG)和3.0(3KO+9TG)细胞的正常核型。使用基于Giemsa染色的G带技术对猪2.0(A)和猪3.0(B)成纤维细胞进行核型分析。使用SmartType软件分析中期扩散。猪2.0和猪3.0两者均显示正常的[36+XY]核型。
图52A示出了9个转基因的表达的热图。通过RNA-Seq在HUVEC内皮、PUVEC内皮、猪2.0(3KO+9TG)PUVEC内皮、猪2.0耳成纤维细胞和猪3.0胎儿成纤维细胞中测量转基因表达。每行表示一个转基因，并且每列表示一个样品。表达水平用蓝色-黄色-红色进行着色编码，以表示低-中-高。每个样品的组织类型和有效载荷信息在热图的顶部标记为颜色条。
图52B示出了通过FACS对3KO和9TG表达的分析。猪2.0(3KO+9TG)和猪3.0(3KO+9TG)的基因修饰(KO和TG)已通过FACS在蛋白质水平上得到验证。除了hCD39(高于人内源性)和hTHBD(低于人内源性)之外，猪2.0和猪3.0PUVEC总体上显示与人内源性(HUVEC)相当的TG表达水平。
图52C示出了3KO和9TG表达的免疫荧光分析。猪2.0(3KO+9TG)和猪3.0(3KO+9TG)的基因修饰(KO和TG)已通过免疫荧光(IF)在肾脏冷冻切片中在蛋白质水平上得到验证。
图53A示出了人抗体与猪2.0(3KO+9TG)和3.0(3KO+9TG)细胞的结合。与它们的WT对应物相比，猪2.0和猪3.0PUVEC实质上减弱了抗体与人IgG和IgM的结合。通过FACS分别测量合并的人血清与PUVEC和HUVEC(阳性对照)的抗体结合。误差条表示平均值±s.d。(n＝3)。
图53B示出了对WT猪、猪2.0(3KO+9TG)、猪3.0(3KO+9TG)和HUVEC细胞的补体毒性。与HUVEC相比，猪2.0和猪3.0PUVEC显示出相当的抗体依赖性补体毒性，其与WT PUVEC相比明显更低。误差条表示平均值±s.d。(n＝4)。
图53C示出了对WT猪、猪2.0(3KO+9TG)、猪3.0(3KO+9TG)和HUVEC细胞的NK介导的细胞毒性。与它们的WT对应物相比，猪2.0和猪3.0PUVEC显示出显著降低的NK介导的细胞毒性。误差条表示平均值±s.d。(n＝3)。
图53D示出了人巨噬细胞对猪2.0(3KO+9TG)和3.0(3KO+9TG)脾细胞的吞噬作用。猪2.0和猪3.0脾细胞显示出人巨噬细胞系的吞噬作用降低。将CFSE标记的猪2.0和猪3.0脾细胞(靶细胞，T)分别与CD11b标记的人巨噬细胞系(效应细胞，E)在37℃下孵育4小时。以2种不同的E:T比进行，即1:1和1:5。CFSE标记的靶标的吞噬作用通过FACS进行测量，其中非吞噬巨噬细胞的区域在左上象限(Q1)中示出，而吞噬巨噬细胞的区域在右上象限(Q2)中示出。吞噬活性计算为Q2/(Q1+Q2)x 100％。
图53E示出了WT猪、猪2.0(3KO+9TG)、猪3.0(3KO+9TG)和HUVEC细胞的凝血酶-抗凝血酶(TAT)形成的水平。在与全人血孵育指定的时间后，猪2.0和猪3.0PUVEC介导非常低水平的凝血酶-抗凝血酶(TAT)形成，其与HUVEC相当，但显著低于WT PUVEC。误差条表示平均值±s.d。(n＝4)。
图53F示出了CD39转基因的ADP酶活性。与WT PUVEC和HUVEC相比，猪2.0(3KO+9TG)和猪3.0(3KO+9TG)PUVEC显示出明显更高的CD39 ADP酶生化活性。(A)在猪2.0和猪3.0中，人转基因CD39 mRNA的表达高于内源性CD39。(B)FACS揭示，猪2.0和猪3.0具有高于WTPUVEC和HUVEC的人CD39蛋白表达。(C)当与ADP孵育时，猪2.0和猪3.0PUVEC具有明显较高的CD39的ADP酶生化活性，如通过磷酸盐浓度所测量。较高的CD39 ADP酶生化活性与其在猪2.0和猪3.0中较高的CD39蛋白表达水平一致。误差条表示标准差(n＝6)。
图53G示出了3.0细胞中的TFPI功能。在体外，激活的猪2.0(3KO+9TG)和猪3.0(3KO+9TG)PUVEC在细胞表面上表达人TFPI，并且与WT PUVEC和HUVEC相比，显示出显著更高的与人Xa的结合能力。(A)RNA-Seq揭示，猪2.0PUVEC表达的人TFPI多于TFPI在HUVEC中的内源性水平以及WT PUVEC中的猪TFPI水平(n＝2)。(B)在体外，与WT PUVEC和HUVEC相比，激活的猪2.0PUVEC显示出显著更高的Xa结合能力。左图：标准曲线测量人重组TFPI(rTFPI)蛋白浓度与未结合的Xa水平之间的线性回归。右图：使用左侧的标准曲线从未结合的Xa水平投影的tTFPI水平测量了在进行和未进行PMA激活的情况下，猪2.0EC、WT PUVEC和HUVEC中的TFPIXa结合能力。PMA(1μM)：PUVEC和HUVEC被PMA激活6小时，这导致hTFPI从胞质溶胶易位到细胞膜。误差条表示标准差(n＝4)。
图54A、图54B、图54C、图54D和图54E示出了猪1.0和2.0猪(3KO+9TG)的正常表型。在全血细胞计数(A)、肝脏(B)、心脏(C)和肾脏功能(D)以及凝血功能(E)方面，与WT猪相比，猪1.0和猪2.0显示出相似的病理生理。猪1.0、猪2.0和WT猪的样品数分别为18、16和21。“无显著性(no sig)”表示通过student's t检验，猪1.0、猪2.0和WT组之间无统计学显著性。
图55示出了PERV-KO的孟德尔遗传。PERV-KO的基因修饰可以在自然交配生产过程中遵循孟德尔遗传学进行遗传。x轴表示按插入的总和减去缺失的总和计算出的移位碱基的总数。y轴表示读段的百分比。红色和绿色分别指示移码或不移码。将一头猪1.0猪与野生型巴马猪交配，并产生11头仔猪。通过高通量DNA测序与亲本成纤维细胞一起分析了一头后代仔猪的肝脏、肾脏和心脏组织，以评估PERV-KO修饰的遗传。猪1.0的PERV拷贝100％待敲除，而WT猪中约80％的PERV拷贝的大小与WT长度相同(插入-缺失＝0)。值得注意的是，WT样品中的一些PERV拷贝可能不起作用或带有KO。相比之下，后代猪的肝脏、肾脏和心脏仅具有约50％的PERV拷贝来携带敲除。组织之间的模式相似，表明PERV-KO修饰在不同组织之间遵循孟德尔遗传学稳定地遗传。
图56A、图56B和图56C示出了9TG构建体和3KO在整个育种期间的孟德尔遗传。如在基因组DNA(A)、mRNA(B)和蛋白质水平(C)上得到验证，猪2.0的此迭代的基因修饰(3KO和9TG)可以通过自然交配生产遵循孟德尔遗传学传递给下一代。我们分别将9头WT猪与猪2.0交配，并且将11头3KO猪与猪2.0交配，并检测到F1后代中存在3KO和9TG。(A)对于9TG，猪2.0x WT猪和猪2.0x 3KO猪的后代中的大约一半在基因组中携带所述转基因。对于GGTA1、CMAH和B4GALNT2，猪2.0X WT猪的后代全部为杂合敲除，并且猪2.0X 3KO猪的后代全部为纯合敲除。值得注意的是，由于包含了其高度同源的假基因，B4GALNT2被分析为具有四个等位基因。(B)猪2.0X 3KO猪的后代中的大约一半(5/11)在其mRNA转录物中携带对应于9TG的mRNA。(C)FACS分析验证了猪2.0X 3KO和猪2.0X WT猪的3KO和9TG的遗传为细胞表面聚糖的减少或不存在或者人蛋白的存在。
具体实施方式
I.定义
术语“猪(pig)”、“猪(swine)”和“猪(porcine)”在本文中可互换使用，是指与家猪物种野猪(Sus scrofa)的各种品种有关的任何动物。
当用于指代蛋白质或多肽的片段或衍生物时，术语“生物活性”意指所述片段或衍生物保留了参考全长蛋白质或多肽的至少一种可测量和/或可检测的生物活性。例如，CRISPR/Cas9蛋白的生物活性片段或衍生物可能能够结合gRNA，有时在本文中也称为单指导RNA(sgRNA)，当与指导RNA复合时结合靶DNA序列，和/或切割一条或多条DNA链。
当在疾病、损伤或障碍的情况下使用时，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“减轻”等在本文中通常意指获得希望的药理学和/或生理学作用，并且还可以用于指代改善、减轻和/或降低所治疗病症的一种或多种症状的严重性。就完全或部分延迟疾病、病症或其症状的发作或复发而言，所述作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病或病症和/或可归因于所述疾病或病症的不利作用而言，所述作用可以是治疗性的。如本文所使用，“治疗”涵盖对哺乳动物，特别是人的疾病或病症的任何治疗，并且包括：(a)在可能易患疾病或病症但尚未被诊断为患有所述疾病或病症的受试者中预防所述疾病或病症发生；(b)抑制疾病或病症(例如，阻止其发展)；或(c)缓解疾病或病症(例如，使疾病或病症消退，从而改善一种或多种症状)。
本文中使用的术语“同时”是指与另一事件同时发生的事件，如与另一事件的发生相比，在数秒、数毫秒、数微秒或更短的时间内发生。
本文中使用的术语“敲除(knockout)”(“KO”)或“敲除(knocking out)”是指猪或其他动物或者猪或其他动物中的任何细胞中的基因或缺陷基因的缺失、失活或消融。如本文所用，KO还可以指代执行或已执行了基因或其部分的缺失、失活或消融的方法。
本文中使用的术语“敲入(knockin)”(“KI”)或“敲入(knocking in)”是指猪或其他动物或者猪或其他动物中的任何细胞中的基因的一个或多个核苷酸的添加、替代或突变。如本文所用，KI还可以指代执行或已执行了基因或其部分的一个或多个核苷酸的添加、替代或突变的方法。
II.细胞、组织、器官和动物
猪异种移植物与人器官大小和生理学广泛相容，并且在伦理上被美国普通人群所接受。然而，异种移植的猪组织引发一系列复杂的事件，导致移植物排斥反应，包括：由于存在针对猪抗原的预先形成的抗体而导致的超急性排斥反应，补体激活和高凝状态，以及由于分子不相容性而导致的先天性和适应性免疫应答增强。本公开文本使用基因工程方法来解决当前异种移植的缺点。
具体地，存在许多免疫和功能挑战，涉及先天性和适应性免疫功能。补体和凝血介导的功能障碍是由于供体猪组织与人体生理之间的分子不相容性而引起的，并导致了急性异种移植失败。预先形成的针对α-1,3-半乳糖基-半乳糖(αGal)表位的抗体通过激活补体来启动超急性移植排斥反应。糖蛋白α-半乳糖基转移酶1基因(GGTA1)的遗传失活可以减少这种快速的移植物破坏。通过人补体调节蛋白(hCRP)CD46(膜辅因子蛋白)、CD55(补体衰变加速因子)和CD59(MAC抑制蛋白)基因的过表达，保护作用得到进一步改善。
大多数非Gal异种抗体均识别唾液酸N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，其是由胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸水解酶(CMAH)基因合成的。此基因在人体中是无活性的，因此，猪Neu5Gc在人体中具有免疫原性。因此，猪CMAH可能必须被灭活以在异种移植中取得临床成功。尽管补体调节子的表达和GGTA1的敲除(GTKO)减少了超急性排斥反应，但这些基因修饰并不影响急性血管排斥反应(AVR)。
凝血功能障碍，包括血栓性微血管病和全身性消耗性凝血病，甚至在GTKO和hCRP过表达的情况下也持续存在，这主要是由于猪与非人灵长类动物(NHP)之间的凝血系统的分子不相容性所致。
尽管其他人试图产生用于安全异种移植的转基因猪，但由于构建能力的限制和转基因之间的转录干扰，这些转基因猪仅携带有限数量的转基因。这些方法被证明不足以克服异种移植物不相容性。例如，美国专利公开号2018/0249688利用了具有不同转基因组合的多顺反子表达载体。重要的是，这些多顺反子载体仅包含4个转基因，并被用于产生具有6个基因修饰(包括αGal的KO(GTKO))的猪。在本公开文本中，利用了KO、KI和基因组替代策略的组合。首次产生了从单个基因座表达多于6个转基因的不含PERV的猪。
本文描述和公开的例子表明，猪补体因子可以被KO，并且可以生产具有以下的活猪：一个或多个经修饰的MHC I类基因、MHC II类基因的失活、PD-L1的KI以降低基于适应性免疫的排斥反应、经修饰的猪vWF以调节血小板聚集，以及猪MHC I类基因的缺失。这些例子提供了一个平台，用于在同一头猪内实现更大数量的基因修饰。通过这项工作，将猪细胞用多于六个转基因进行基因修饰，以产生免疫相容的细胞、组织、器官、猪和后代。使用CRISPR-Cas9，功能上敲除了多个基因，包括GGTA1、CMAH和B4GALNT2，以消除由预先形成的人抗猪抗体识别的聚糖。此外，将九个或十二个人转基因整合到猪基因组中的单个多转基因盒中。具体地，通过以下方式来产生猪：利用CRISPR介导的非同源末端连接(NHEJ)来破坏3个主要的异种碳水化合物抗原产生基因(“3KO”；GGTA1、B4GALNT2和CMAH)，并与PiggyBAC介导的将9个转基因CD46、CD55、CD59、CD39、CD47、HLA-E、B2M、THBD和TFPI或12个转基因(CD46、CD55、CD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1)随机整合到猪基因组中结合。进一步的进步是使用在不含PERV背景下具有3KO和9T或12TG修饰的源供体猪。从那里，还将对源供体猪进行基因工程化以使其携带另外的基因修饰，尤其包括vWF基因的人源化以及脱唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)和内源性B2M基因的缺失或破坏。
本公开文本提供了具有多个经修饰基因的细胞、组织、器官和动物，以及产生它们的方法。在一些实施方案中，所述细胞、组织、器官获自动物或者是动物。在一些实施方案中，所述动物是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是非人哺乳动物，例如马、灵长类动物、猪、牛、绵羊、山羊、犬或猫。在一些实施方案中，所述哺乳动物是猪。
根据本公开文本的基因的修饰用于改善供体与接受者之间的分子相容性并减少不良事件，包括超急性排斥反应、急性体液排斥反应、血栓性微血管病和慢性血管病。例如，超急性排斥反应发生在非常短的时间跨度内，通常在移植后的几分钟到几小时内发生，并且是由激活补体和移植内皮细胞的预先形成的抗体引起的，进而导致促凝变化，其导致止血并最终破坏移植器官。在某些实施方案中，所述细胞、组织、器官和动物产生减少的超急性排斥反应。
在一些实施方案中，本公开文本提供了具有多个经修饰基因的一种或多种细胞、组织、器官或动物。在一些实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物已被基因修饰，使得多个基因已被添加、缺失、灭活、破坏，其部分已被切除，或者基因序列已被改变。在一些实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个已被修饰的基因。在一些实施方案中，已被修饰的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个基因是从单个基因座表达的。在一些实施方案中，已被修饰的5、10或12个基因是从单个基因座表达的。在一些实施方案中，已被修饰的12个基因是从单个基因座表达的。在一些实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物具有多于20、多于15、多于10、多于5、多于3、或2个已被修饰的基因。在一些实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物具有多于10、多于5、多于3、多于2或多于1个已被修饰的基因。在一些实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物具有所述经修饰基因的一个拷贝，并且在其他实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物具有所述一个或多个经修饰基因的多于一个拷贝，如所述经修饰基因的多于2、多于3、多于4、多于5、多于6、多于7、多于8、多于9、多于10、多于15、多于20、多于25、多于30、多于35、多于40、多于50、多于60、多于70、多于80、多于90或多于100个拷贝。在一些实施方案中，所述细胞具有一个或多个经修饰基因的100个拷贝至约1个拷贝、90个拷贝至约1个拷贝、80个拷贝至约1个拷贝、约70个拷贝至约1个拷贝、60个拷贝至约1个拷贝、约50个拷贝至约1个拷贝、约40个拷贝至约1个拷贝、约30个拷贝至约1个拷贝、约20个拷贝至约5个拷贝、约15个拷贝至约10个拷贝或约5个拷贝至约1个拷贝。
在一些实施方案中，本公开文本提供了具有一个或多个经修饰基因的多个拷贝的一种或多种细胞、组织、器官或动物。例如，所述细胞、组织、器官或动物可以具有一个或多个经修饰基因的2、3、4、5、6、7、8、9、约10、约15、约20、约25、约30或更多个拷贝。
在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是体细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是出生后细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是成年细胞(例如，成年耳成纤维细胞)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是胎儿/胚胎细胞(例如，胚胎卵裂球)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是种系细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是卵母细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是来自原代细胞系的细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞选自：上皮细胞、肝脏细胞、颗粒细胞、脂肪细胞。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞是成纤维细胞。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是雌性胎儿成纤维细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是在体外的。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是在体内的。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是单细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是细胞集落的成员。
在一些实施方案中，所述一种或多种细胞是猪细胞。猪细胞起源或衍生的品种的非限制性例子包括任何以下猪品种：美国长白猪(American Landrace)、美国约克夏猪(American Yorkshire)、Aksai Black Pied猪、昂格尔恩鞍背猪(Angeln saddleback)、阿巴拉契亚英国猪(Appalachian English)、阿拉帕瓦岛猪(Arapawa Island)、奥克兰群岛猪(Auckland Island)、澳大利亚约克夏猪(Australian Yorkshire)、Babi Kampung猪、巴川猪(Ba Xuyen)、班图猪(Bantu)、巴斯克猪(Basque)、巴兹纳猪(Bazna)、北京黑猪(BeijingBlack)、白俄罗斯黑杂色猪(Belarus Black Pied)、比利时长白猪(Belgian Landrace)、孟加拉棕Shannaj猪(Bengali Brown Shannaj)、本特海姆黑斑豬(Bentheim Black Pied)、巴克夏猪(巴克夏猪)、比萨罗猪(Bisaro)、班古尔猪(Bangur)、黑斯拉夫尼亚猪(BlackSlavonian)、黑色加那利猪(Black Canarian)、Breitovo猪、英国长白猪(BritishLandrace)、英国罗布泊猪(British Lop)、英国白肩猪(British Saddleback)、保加利亚白猪(Bulgarian White)、Cambrough猪、广东猪(Cantonese)、凯尔特猪(Celtic)、查托穆尔西亚猪(Chato Murciano)、切斯特白猪(Chester White)、清迈黑猪(Chiangmai Blackpig)、乔克托猪(Choctaw Hog)、克里奥尔猪(Creole)、捷克改良白猪(Czech Improved White)、丹麦长白猪(Danish Landrace)、丹麦Protest猪(Danish Protest)、杂色猪(DermantsiPied)、Li Yan猪、杜洛克猪(Duroc)、荷兰长白猪(Dutch Landrace)、东长白猪(EastLandrace)、东巴尔干猪(East Balkan)、埃塞克斯猪(Essex)、爱沙尼亚培根猪(EstonianBacon)、枫泾猪(Fengjing)、芬兰长白猪(Finnish Landrace)、林山猪(Forest Mountain)、法国长白猪(French Landrace)、加斯科涅猪(Gascon)、德国长白猪(German Landrace)、格洛斯特郡花猪(Gloucestershire Old Spots)、哥廷根小型猪(Gottingen minipig)、格莱斯猪(Grice)、几内亚猪(Guinea Hog)、汉普郡猪(Hampshire)、汉特猪(Hante)、赫里福德猪(Hereford)、Hezuo猪、霍根猪(Hogan Hog)、亨廷顿黑猪(Huntington Black Hog)、伊比利亚猪(Iberian)、意大利长白猪(Italian Landrace)、日本长白猪(Japanese Landrace)、济州黑猪(Jeju Black)、金华猪(Jinhua)、卡克黑提安猪(Kakhetian)、可乐猪(Kele)、克麦罗沃猪(Kemerovo)、韩国本土猪(Korean Native)、克斯烤普捷猪(Krskopolje)、库内昆猪(Kunekune)、拉孔布猪(Lamcombe)、大黑猪(Large Black)、大黑白猪(Large Black-White)、大白猪(Large White)、拉脱维亚白猪(Latvian White)、Leicoma猪、立陶宛本土猪(Lithuanian Native)、立陶宛白猪(Lithuanian White)、林肯郡卷毛猪(LincolnshireCurly-Coated)、利夫内猪(Livny)、Malhado de Alcobaca猪、曼加利察猪(Mangalitsa)、梅山猪(Meishan)、中白猪(Middle White)、民猪(Minzhu)、Minokawa Buta猪、蒙开猪(MongCai)、Mora Romagnola猪、莫拉猪(Moura)、Mukota猪、缪尔福特猪(Mulefoot)、穆罗姆猪(Murom)、米尔霍罗德猪(Myrhorod)、Nero dei Nebrodi猪、内江猪(Neijiang)、新西兰猪(New Zealand)、宁乡猪(Ningxiang)、北高加索猪(North Caucasian)、北西伯利亚猪(North Siberian)、挪威长白猪(Norwegian Landrace)、挪威约克夏猪(NorwegianYorkshire)、Ossabaw岛猪(Ossabaw Island)、牛津桑迪黑猪(Oxford Sandy and Black)、Pakchong 5猪、菲律宾本土猪(Philippine Native)、皮特兰猪(Pietrain)、波中猪(PolandChina)、红垂猪(Red Wattle)、Saddleback猪、Semirechensk猪、西伯利亚黑斑猪(SiberianBlack Pied)、小黑猪(Small Black)、小白猪(Small White)、斑点猪(Spots)、SurabayaBabi猪、施韦比施哈尔猪(Swabian-Hall)、瑞典长白猪(Swedish Landrace)、燕腹燕子曼加利察猪(Swallow Belied Mangalitza)、太湖猪(Taihu pig)、塔姆沃思猪(Tamworth)、Thuoc Nhieu猪、藏猪(Tibetan)、东京-X猪(Tokyo-X)、齐维利斯克猪(Tsivilsk)、Turopolje猪、乌斑草原猪(Ukrainian Spotted Steppe)、乌白草原猪(Ukrainian WhiteSteppe)、乌尔茹姆猪(Urzhum)、越南大肚猪(Vietnamese Potbelly)、威尔士猪(Welsh)、威赛克斯白肩猪(Wessex Saddleback)、西法白猪(West French White)、Windsnyer猪、五指山猪(Wuzhishanm)、雅南猪(Yanan)、约克夏猪和约克夏蓝白猪(Yorkshire Blue andWhite)。在一些实施方案中，所述猪细胞是约克夏和尤卡坦猪细胞。
在一些实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已被基因修饰，使得一个或多个基因已通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分而被修饰，或者所述基因序列的部分已被改变。
在一些实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物包含使一个或多个基因失活的一个或多个突变。在一些实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物包含一个或多个突变或表观遗传变化，其导致具有所述一个或多个突变的一个或多个基因的表达减少或消除。在一些实施方案中，通过对存在于所述细胞、组织、器官或动物中的核酸进行基因修饰来使所述一个或多个基因失活。在一些实施方案中，一个或多个基因的失活通过测定来证实。在一些实施方案中，所述测定是感染性测定、逆转录酶PCR测定、RNA-seq、实时PCR或连接PCR定位测定。
特定基因型
为了保证细胞、组织、器官和动物对人临床使用是安全且有效的，对本公开文本的细胞、组织、器官和动物(例如，供体猪)进行了基因工程化，以使其具有增强的补体(即补体毒性)、凝血、炎症(即细胞凋亡/炎症)、免疫(即细胞毒性)和/或免疫调节系统，使它们在人体中相容。敲除(KO)、敲入(KI)(在本文中也称为转基因(TG))和/或基因组替代策略的新颖组合提供了增强的补体、凝血、炎症、免疫和/或免疫调节系统。
例如因基因KO而缺乏主要异种碳水化合物抗原表达的细胞、组织、器官和动物在异种移植过程中减少或消除体液排斥反应。三种主要的异种碳水化合物抗原包括通过糖基转移酶/糖基水解酶GGTA1、CMAH和B4GALNT2产生的那些抗原。这些基因的功能丧失的目的是减少和/或消除预先形成的抗猪抗体与猪移植物内皮的结合。
将关键补体、凝血、炎症、免疫和/或免疫调节因子插入一个或多个基因组基因座，例如安全港基因组基因座(如AAVS1)中，将有助于调节人补体系统以及自然杀伤(NK)、巨噬细胞和T细胞功能。非限制性例子包括通过KI使hCD46、hCD55和hCD59过表达以抑制人补体级联；将vWF人源化以防止未调节的血小板封存和血栓性微血管病，例如通过人源化猪vWF序列的A1结构域和/或侧翼区域；B2M-HLA-E SCT的KI，以提供针对人NK细胞细胞毒性的保护和猪细胞的人源化；以及CD47、CD39、THBD、TFPI、A20的KI，以起到免疫抑制剂、免疫调节剂和/或抗凝剂的作用。
在一些实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已被基因修饰，使得一个或多个基因已通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分而被修饰，或者所述基因序列的部分已被改变。在一些实施方案中，本公开文本提供了具有多个经修饰基因的经分离的细胞、组织、器官或动物。在一些实施方案中，所述经修饰基因包括以下中的一个或多个：α1,3,半乳糖基转移酶(GGTA)、β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺基转移酶2(B4GalNT2)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)、THBD、TFPI、CD39、HO-1、CD46、CD55、CD59、主要组织相容性复合物I类E单链三聚体(HLA-E SCT)、A20、PD-L1、CD47、猪白细胞抗原1(SLA-1)、SLA-2、SLA-3、vWF、B2M、DQA、DRA和CD47。
在一些实施方案中，所述经修饰基因是GGTA、B4GalNT2、CMAH或其任何组合。在一些实施方案中，所述GGTA、B4GalNT2和/或CMAH是遗传上KO的。在一些实施方案中，所述经修饰基因是THBD、TFPI、CD39，HO-1或其任何组合。在一些实施方案中，所述THBD、TFPI、CD39和/或HO-1是遗传上KI的。在一些实施方案中，所述经修饰基因是CD46、CD55、CD59、B2M-HLA-E SCT、A20、PD-L1、CD47或其任何组合。在一些实施方案中，所述CD46、CD55、CD59、B2M-HLA-E SCT、A20、PD-L1和/或CD47是遗传上KI的。在一些实施方案中，所述经修饰基因是SLA-1、SLA-2、SLA-3、B2M或其任何组合。在一些实施方案中，所述经修饰基因是DQA和/或DRA。在一些实施方案中，所述经修饰基因是PD-L1、外源vWF、HLA-E、HLA-G、B2M、CIITA-DN和/或其任何组合。在一些实施方案中，所述经修饰基因是TBM、PD-L1、HLA-E、CD47或其任何组合。在一些实施方案中，所述TBM、PD-L1、HLA-E和/或CD47是遗传上KI的。在一些实施方案中，所述经修饰基因是MHC-I基因SLA-1、SLA-2和SLA-3，MHC-II基因DQA和DRA，内源性vWF，CD9，脱唾液酸糖蛋白受体，至少一种补体抑制剂基因(例如，C3、CD46、CD55和CD59)及其任何组合。在一些实施方案中，所述CD46、CD55和/或CD59是遗传上KI的。
在一个实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已用转基因表达载体进行了基因修饰，所述转基因表达载体包含B2M、HLA-E SCT、CD47、THBD、TFPI、CD39、A20、PD-L1、FasL、CD46、CD55、CD59或其任何组合。在一个实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已用转基因表达载体进行了基因修饰，所述转基因表达载体包含B2M、HLA-E SCT、CD47、THBD、TFPI、CD39、A20、PD-L1、FasL、CD46、CD55和CD59中的每一个。转基因表达载体的一个实施方案在图17中描绘。在一个实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已被进一步基因修饰以具有GGTA、B4GalNT2、CMAH或其任何组合的降低的表达或无表达，例如通过基因KO来修饰。
在一个实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已用转基因表达载体进行了基因修饰，所述转基因表达载体包含B2M、HLA-E SCT、CD47、THBD、TFPI、CD39、A20、PD-L1、HO-1、CD46、CD55、CD59或其任何组合。在一个实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已用转基因表达载体进行了基因修饰，所述转基因表达载体包含B2M、HLA-E SCT、CD47、THBD、TFPI、CD39、A20、PD-L1、HO-1、CD46、CD55和CD59中的每一个。转基因表达载体的一个实施方案在图18中描绘。在一个实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已被进一步基因修饰以具有GGTA、B4GalNT2、CMAH或其任何组合的降低的表达或无表达，例如通过基因KO来修饰。
在一个实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已用转基因表达载体进行了基因修饰，所述转基因表达载体包含B2M、HLA-E SCT、CD47、PD-L1、HO-1、THBD、TFPI、CD39、A20、CD46、CD55、CD59或其任何组合。在一个实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已用转基因表达载体进行了基因修饰，所述转基因表达载体包含B2M、HLA-E SCT、CD47、PD-L1、HO-1、THBD、TFPI、CD39、A20、CD46、CD55和CD59中的每一个。转基因表达载体的一个实施方案在图19中描绘。在一个实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已被进一步基因修饰以具有GGTA、B4GalNT2、CMAH或其任何组合的降低的表达或无表达，例如通过基因KO来修饰。
在一个实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已用转基因表达载体进行了基因修饰，所述转基因表达载体包含CD46、CD55、CD59、A20、THBD、TFPI、CD39、HO-1、2xFKBP(FK506结合蛋白的融合物)、h半胱天冬酶8、PD-L1、B2M、HLA-E SCT、CD47或其任何组合。在一个实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已用转基因表达载体进行了基因修饰，所述转基因表达载体包含CD46、CD55、CD59、A20、THBD、TFPI、CD39、HO-1、2xFKBP、h半胱天冬酶8、PD-L1、B2M、HLA-E SCT和CD47中的每一个。转基因表达载体的一个实施方案在图20中描绘。在一个实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已被进一步基因修饰以具有GGTA、B4GalNT2、CMAH或其任何组合的降低的表达或无表达，例如通过基因KO来修饰。
本公开文本的细胞、组织、器官或动物可以通过任何方法进行基因修饰。用于本文公开和描述的敲除(KO)、敲入(KI)和/或基因组替代策略的合适方法的非限制性例子包括使用Cas9、Cas12a(Cpf1)或其他CRISPR核酸内切酶、Argonaute核酸内切酶、转录激活因子样(TAL)效应子和核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、表达载体、转座子系统(例如PiggyBac转座酶)或其任何组合的CRISPR介导的基因修饰。
本公开文本的细胞、组织、器官或动物可以进一步被修饰成不含PERV。本公开文本的细胞、组织、器官或动物可以被进一步修饰以使PERV拷贝从其基因组中功能性缺失。本公开文本的细胞、组织、器官或动物可以被进一步修饰以使PERV拷贝在其基因组中功能性失活。如果将猪细胞、组织或器官移植到人接受者中，则PERV表示危险因素。PERV从正常猪细胞中释放出来并具有感染性。PERV-A和PERV-B是感染几个物种细胞的多嗜性病毒，所述物种中包括人(例如，它们是异嗜性的)；而PERV-C是仅感染猪细胞的嗜亲性病毒。功能性缺失PERV拷贝的非限制性方法披露且描述于Niu 2017和WIPO公开号WO2018/195402中，两者均通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，将猪基因工程化为不含PERV-A、PERV-B或PERV-C(或其任何组合)。
在一些实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物的另外的基因已通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分而被修饰，或者所述基因序列的部分已被改变。在一些实施方案中，所述经修饰基因包括缺失以下基因中的一个或多个：MHC-I基因SLA-1、SLA-2和SLA-3，MHC-II基因DQA和DRA，内源性vWF，CD9，脱唾液酸糖蛋白受体，和C3，以及表达以下转基因中的一个或多个：PD-L1、外源性vWF、HLA-E、HLA-G、B2M和CIITA-DN。在一些实施方案中，所述经修饰基因包括缺失以下基因中的一个或多个：α半乳糖基转移酶1、β1,4N-乙酰半乳糖胺基转移酶和胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶，以及表达以下转基因中的一个或多个：CD46、CD55、CD59、CD47、HO-1、A20、TNFR1-Ig、CD39、THBD、TFPI、EPCR、PD-1、CTLA-Ig、CD73、SOD3、CXCL12、FasL、CXCR3、CD39L1、GLP-1R、M3R、IL35、IL12A和EB13。在一些实施方案中，所述经修饰基因是CD46、CD55、CD59、CD47、HO-1、A20、TNFR1-Ig、CD39、THBD、TFPI、EPCR、PD-1、CTLA-Ig、CD73、SOD3、CXCL12、FasL、CXCR3、CD39L1、GLP-1R、M3R、IL35、IL12A和EB13。
在一些实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已被基因修饰，使得一个或多个基因已通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分而被修饰，基因序列的部分已被改变，或者引入转基因或其部分。在一些实施方案中，本公开文本提供了具有一个或多个经修饰基因的经分离的细胞、组织、器官或动物。在一些实施方案中，所述经修饰基因是MHC I类基因。在一些实施方案中，所述经修饰的MHC I类基因包括以下SLA-1、SLA-2、SLA-3和B2M中的一个或多个。在一些实施方案中，所述经修饰基因是SLA-1、SLA-2和/或SLA-3。在一些实施方案中，所述经修饰基因是B2M。在一些实施方案中，所述经修饰的MHC I类基因包括以下SLA-1、SLA-2、SLA-3和B2M中的一个或多个。在一些实施方案中，将所述经修饰的B2M、SLA-1、SLA-2和/或SLA-3基因和/或其部分用人HLA-E基因、人HLA-G基因、人B2M基因和/或人(显性阴性突变II类反式激活因子)CIITA-DN基因和/或其部分替代。在一些实施方案中，所述经修饰基因是条件性和/或诱导性修饰的。在一些实施方案中，将条件性启动子和/或诱导型启动子用于条件性和/或诱导性修饰所述一个或多个经修饰基因。在一些实施方案中，所述经分离的细胞、组织、器官或动物包括条件性改变B2M、SLA-1、SLA-2或SLA-3基因或其任何组合，以及用人HLA-E基因、人HLA-G基因、人B2M基因和/或人CIITA-DN基因的至少部分替代所述条件性改变的基因。
在一些实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已被基因修饰，使得一个或多个基因已通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分而被修饰，基因序列的部分已被改变，或者引入转基因或其部分。在一些实施方案中，本公开文本提供了具有一个或多个经修饰基因的经分离的细胞、组织、器官或动物。在一些实施方案中，所述经修饰基因是MHC II类基因。在一些实施方案中，所述经修饰的MHC II类基因是DRQ、DRA或其任何组合。在一些实施方案中，DRQ和/或DRA通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分而被修饰，所述基因序列的部分已被改变。在一些实施方案中，所述经修饰基因是条件性和/或诱导性修饰的。在一些实施方案中，将条件性启动子和/或诱导型启动子用于条件性和/或诱导性修饰所述一个或多个经修饰基因。在一些实施方案中，所述经分离的细胞、组织、器官或动物包括条件性改变DRQ和/或DRA基因或其任何组合。
在一些实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已被基因修饰，使得一个或多个基因已通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分而被修饰，基因序列的部分已被改变，或者引入转基因或其部分。在一些实施方案中，本公开文本提供了具有经修饰的vWF基因的经分离的细胞、组织、器官或动物。在一些实施方案中，所述经修饰基因是vWF基因和vWF相关基因。在一些实施方案中，将所述经修饰的vWF基因和/或其部分用人vWF基因和/或其部分替代。在一些实施方案中，将所述经修饰的vWF基因、经修饰的vWF相关基因和/或其一个或多个部分用人vWF基因、一个或多个人vWF相关基因和/或其部分替代。在一些实施方案中，所述经修饰的vWF基因和/或vWF相关基因是条件性和/或诱导性修饰的。在一些实施方案中，将条件性启动子和/或诱导型启动子用于条件性和/或诱导性修饰所述一个或多个经修饰基因。在一些实施方案中，所述经分离的细胞、组织、器官或动物包括条件性改变vWF、vWF相关基因、其一个或多个部分或其任何组合，以及用人vWF基因、人vWF基因的至少部分、一个或多个其他人vWF相关基因、一个或多个人vWF相关基因的至少部分或其任何组合替代所述条件性改变的基因。在一些实施方案中，所述vWF基因使用gRNA进行修饰，所述gRNA设计用于在内源性猪基因组中启动HDR替代，并在将被人序列替代的区域附近切割。合适的gRNA的非限制性例子是SEQ ID NO:5-157中的任何一个或多个。
在一些实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已被基因修饰，使得一个或多个基因已通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分而被修饰，基因序列的部分已被改变，或者引入转基因或其部分。在一些实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已通过将一个或多个外源性基因或其部分(如转基因)引入所述细胞、组织、器官或动物中而被基因修饰。在一些实施方案中，本公开文本提供了具有一个或多个经修饰基因的经分离的细胞、组织、器官或动物。在一些实施方案中，所述经修饰基因是程序性死亡基因。在一些实施方案中，所述经修饰基因是PD-L1。在一些实施方案中，所述细胞、组织、器官或动物被修饰以表达外源性PD-L1基因或其部分，如转基因。在一些实施方案中，所述经修饰基因是条件性和/或诱导性修饰的。在一些实施方案中，将条件性启动子和/或诱导型启动子用于条件性和/或诱导性修饰所述一个或多个经修饰基因。在一些实施方案中，所述经分离的细胞、组织、器官或动物包括条件性改变PD-L1。在一些实施方案中，所述PD-L1包含SEQ IDNO:211中描述的序列或其任何变体或部分。
在一些实施方案中，本公开文本的细胞、组织、器官或动物已被基因修饰，使得一个或多个基因已通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分而被修饰，基因序列的部分已被改变，或者引入转基因或其部分。在一些实施方案中，本公开文本提供了具有一个或多个经修饰基因的经分离的细胞、组织、器官或动物。在一些实施方案中，所述经修饰基因是补体基因。在一些实施方案中，所述经修饰基因是C3。在一些实施方案中，C3通过添加、缺失、失活、破坏、切除其部分而被修饰，所述基因序列的部分已被改变。在一些实施方案中，所述经修饰的C3基因和/或补体相关基因是条件性和/或诱导性修饰的。在一些实施方案中，将条件性启动子和/或诱导型启动子用于条件性和/或诱导性修饰所述一个或多个经修饰基因。在一些实施方案中，所述经分离的细胞、组织、器官或动物包括条件性改变C3、补体相关基因、其一个或多个部分或其任何组合。在一些实施方案中，所述C3基因使用gRNA进行修饰。合适的gRNA的非限制性例子包括SEQ ID NO:158-210中的任何一个或多个。
在一些实施方案中，所述经修饰基因是C3的敲除。在一些实施方案中，所述经修饰基因是PD-L1的敲入。在一些实施方案中，所述经修饰基因是猪vWF的人源化vWF。在一些实施方案中，所述经修饰基因是MHC-I基因SLA-1、SLA-2和SLA-3的条件性敲入。
在一些实施方案中，宿主对经基因修饰的细胞、组织或器官没有或基本上没有引发免疫应答。
在一些实施方案中，本公开文本提供了从本文所公开细胞中的任一种获得的核酸。在一些实施方案中，对所述细胞中的一种或多种核酸进行基因修饰，使得改变所述细胞中的一个或多个基因，或者另外修饰所述细胞的基因组。在一些实施方案中，使用本领域已知和/或本文公开的任何基因修饰系统对所述基因或其部分进行基因修饰。在一些实施方案中，所述基因修饰系统是TALEN、锌指核酸酶和/或基于CRISPR的系统。在一些实施方案中，所述基因修饰系统是CRISPR-Cas9系统。在一些实施方案中，所述基因修饰系统是II类II型CRISPR系统。在一些实施方案中，所述基因修饰系统是II类V型CRISPR系统。在一些实施方案中，对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞中的一个或多个基因或其部分失活，并且进一步对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞的一个或多个基因或其部分(如果将所述细胞(或从所述细胞克隆/衍生的组织或器官)移植到人体，所述基因或其部分会诱导免疫应答)的表达降低。在一些实施方案中，对所述细胞进行基因修饰以增加一个或多个人基因或其部分的表达。在一些实施方案中，对所述细胞进行基因修饰以增加一个或多个人源化基因或其部分的表达。在一些实施方案中，对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞中的一个或多个基因或其部分失活，并且进一步对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞的一个或多个基因(如果将所述细胞(或从所述细胞克隆/衍生的组织或器官)移植到人体，所述基因会抑制免疫应答)的表达增加。在一些实施方案中，对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞中的一个或多个基因或其部分失活，并且进一步对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞的一个或多个基因(如果将所述细胞(或从所述细胞克隆/衍生的组织或器官)移植到人体，所述基因会诱导免疫应答)的表达降低，并且进一步对所述细胞进行基因修饰，使得所述细胞的一个或多个基因(如果将所述细胞(或从所述细胞克隆/衍生的组织或器官)移植到人体，所述基因会抑制免疫应答)的表达增加。
在一些实施方案中，本公开文本提供了从经基因修饰的细胞克隆的胚胎。在一些实施方案中，从经基因修饰的细胞中提取一种或多种经基因修饰的核酸并将其克隆到不同的细胞中。例如，在体细胞核移植中，将来自经基因修饰细胞的经基因修饰的核酸引入去核卵母细胞中。在一些实施方案中，卵母细胞可以通过以下方式去核：在极体附近进行部分透明带解剖，然后在解剖区处压出细胞质。在一些实施方案中，使用具有锋利斜尖的注射移液管将经基因修饰的细胞注射至停滞在减数分裂2期的去核卵母细胞中。停滞在减数分裂2期的卵母细胞通常被称为“卵”。在一些实施方案中，通过融合和激活卵母细胞产生胚胎。这样的胚胎在本文中可以被称为“经基因修饰的胚胎”。在一些实施方案中，将所述经基因修饰的胚胎转移到接受者雌性猪的输卵管。在一些实施方案中，在激活后20至24小时，将所述经基因修饰的胚胎转移到接受者雌性猪的输卵管。参见例如，Cibelli 1998和美国专利号6,548,741。在一些实施方案中，在转移经基因修饰的胚胎后大约20-21天，检查接受者雌性的妊娠。
在一些实施方案中，使经基因修饰的胚胎生长成出生后基因修饰的动物。在一些实施方案中，所述出生后基因修饰的动物是新生基因修饰的动物。在一些实施方案中，所述经基因修饰的猪是幼年基因修饰的动物。在一些实施方案中，所述经基因修饰的动物是成年基因修饰的动物(例如，大于5-6个月)。在一些实施方案中，所述经基因修饰的动物是雌性基因修饰的动物。在一些实施方案中，所述动物是雄性基因修饰的动物。在一些实施方案中，将所述经基因修饰的动物用非基因修饰的动物繁殖。在一些实施方案中，将所述经基因修饰的动物用另一种经基因修饰的动物繁殖。在一些实施方案中，将所述经基因修饰的猪用具有减少的活性病毒或没有活性病毒的另一种经基因修饰的动物繁殖。在一些实施方案中，将所述经基因修饰的动物用第二种经基因修饰的动物繁殖，所述第二种经基因修饰的动物已进行基因修饰，使得来自所述第二种经基因修饰的动物的细胞、组织或器官如果移植到人体不太可能诱导免疫应答。
在一些实施方案中，所述经基因修饰的动物是具有一个或多个经修饰基因的动物，并在妊娠后至少一个月、至少6个月、至少1年、至少5年、至少10年维持相同或相似的一种或多种经修饰基因的表达或失活水平。在一些实施方案中，即使在从非病毒失活的代孕者分娩之后或在与其他非病毒失活的动物一起处于设施/空间中之后，所述经基因修饰的动物仍保持基因修饰，作为经基因修饰的猪具有一个或多个经修饰基因。
在一些实施方案中，本公开文本提供了从本文所述的任何出生后基因修饰的猪获得的细胞、组织或器官。在一些实施方案中，所述细胞、组织或器官选自肝脏、肾脏、肺、心脏、胰腺、肌肉、血液和骨骼。在特定实施方案中，所述器官是肝脏、肾脏、肺或心脏。在一些实施方案中，来自所述出生后基因修饰的猪的细胞选自：胰岛、肺上皮细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝脏细胞、非实质肝脏细胞、胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝脏血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦细胞、脉络丛细胞、成纤维细胞、支持细胞、神经元细胞、干细胞和肾上腺嗜铬细胞。在一些实施方案中，已将经基因修饰的器官、组织或细胞与它们的自然环境分离(即，与它们正在其中生长的猪分离)。在一些实施方案中，与自然环境的分离意指与自然环境的总体物理分离，例如，从经基因修饰的供体动物中移出，以及改变经基因修饰的器官、组织或细胞与它们直接接触的邻近细胞的关系(例如，通过解离)。
III.产生细胞、组织、器官或动物的方法
本公开文本提供了产生具有本文公开的一个或多个经修饰基因的任何细胞、组织、器官或动物的方法。在一些实施方案中，本公开文本提供了在本文公开的任何细胞中灭活、缺失或以其他方式破坏一个或多个基因或其部分的方法，所述方法包括向所述细胞给予对基因具有特异性的基因编辑剂，其中所述试剂破坏所述基因的转录和/或翻译。在一些实施方案中，所述试剂靶向所述基因的起始密码子并抑制所述基因的转录。在一些实施方案中，所述试剂靶向所述基因中的外显子，并且所述试剂诱导所述基因中的移码突变。在一些实施方案中，所述试剂将失活突变引入所述基因中。在一些实施方案中，所述试剂抑制所述基因的转录。
在一些实施方案中，本公开文本提供了在体内改变一个或多个基因或其部分的方法，所述方法包括向所述细胞给予对基因具有特异性的基因编辑剂，其中所述试剂改变所述基因的序列，如通过使所述基因人源化或以其他方式改变所述基因的天然(例如野生型)序列。
在一些实施方案中，本公开文本提供了表达一个或多个基因或其部分，如转基因(例如，非天然基因)的方法，所述方法包括向所述细胞给予对所述转基因基因具有特异性的基因编辑剂，其中所述试剂引入所述转基因的序列。在一些实施方案中，所述试剂是核酸序列，如质粒、载体等。在一些实施方案中，所述核酸序列包括一个或多个核酸序列，如启动子、转基因和/或另外的基因。在一些实施方案中，所述核酸序列或其部分衍生自一个或多个物种和/或一个或多个来源。在一些实施方案中，所述物种是将接收经基因修饰的细胞、组织或器官的物种。在一些实施方案中，所述物种是人。在其他实施方案中，所述物种是非人的，如哺乳动物、动物、细菌和/或病毒。
在一些实施方案中，本文公开的任何试剂是多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸编码本文所述的核酸酶和/或切口酶和/或RNA或DNA分子中的一种或多种。在一些实施方案中，将所述多核苷酸试剂引入一个或多个细胞中。在一些实施方案中，以使得一个或多个细胞瞬时表达所述多核苷酸的方式将所述多核苷酸引入所述一个或多个细胞中。在一些实施方案中，以使得一个或多个细胞稳定表达所述多核苷酸的方式将所述多核苷酸引入所述一个或多个细胞中。在一些实施方案中，以使得所述多核苷酸稳定地并入细胞基因组中的方式引入所述多核苷酸。在一些实施方案中，将所述多核苷酸与一个或多个可转座元件一起引入。在一些实施方案中，所述可转座元件是编码转座酶的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述可转座元件是编码PiggyBac转座酶的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述可转座元件是可诱导的。在一些实施方案中，所述可转座元件是多西环素诱导的。在一些实施方案中，所述多核苷酸进一步包含可选标记。在一些实施方案中，所述可选标记是嘌呤霉素抗性标记。在一些实施方案中，所述可选标记是荧光蛋白(例如，GFP)。
在一些实施方案中，所述试剂是用于靶向细胞中的DNA的核酸酶或切口酶。在一些实施方案中，所述试剂特异性地靶向基因并抑制其表达。在一些实施方案中，所述试剂包含转录阻遏物结构域。在一些实施方案中，所述转录阻遏物结构域是Krüppel相关盒(KRAB)。
在一些实施方案中，所述试剂是任何可编程核酸酶。在一些实施方案中，所述试剂是天然归巢大范围核酸酶。在一些实施方案中，所述试剂是基于TALEN的试剂、基于ZFN的试剂或基于CRISPR的试剂，或其任何生物活性片段、融合物、衍生物或组合。基于CRISPR的试剂包括例如，II类II型和V型系统，包括例如Cas9和Cpf1的各种物种变体。在一些实施方案中，所述试剂是脱氨酶或编码脱氨酶的核酸。在一些实施方案中，将细胞基因工程化以稳定和/或瞬时表达基于TALEN的试剂、基于ZFN的试剂和/或基于CRISPR的试剂。
IV.治疗方法
在一些实施方案中，本文公开的任何经基因修饰的细胞、组织或器官可以用于治疗与经基因修饰的细胞不同物种的受试者。在一些实施方案中，本公开文本提供了将本文所述的任何经基因修饰的细胞、组织或器官移植到有需要的受试者中的方法。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者是非人灵长类动物。
在一些实施方案中，用于本文公开的任何方法的经基因修饰的器官可以选自经基因修饰的猪的心脏、肺、肝脏、眼睛、垂体、甲状腺、甲状旁腺、食道、胸腺、肾上腺、阑尾、膀胱、胆囊、小肠、大肠、小肠、肾脏、胰腺、脾、胃、皮肤和/或前列腺。在一些实施方案中，用于本文公开的任何方法的经基因修饰的组织可以选自经基因修饰的猪的软骨(例如，食道软骨、膝盖软骨、耳软骨、鼻子软骨)、肌肉(如但不限于平滑肌和心脏(例如心脏瓣膜))、腱、韧带、骨(例如，骨髓)、角膜、中耳和静脉。在一些实施方案中，用于本文公开的任何方法的经基因修饰的细胞包括血细胞、皮肤毛囊、毛囊和/或干细胞。还可以向器官或组织的任何部分(例如，眼睛的部分，如角膜)给予本公开文本的组合物。
在一些实施方案中，从猪分离心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺或脾，所述猪已被基因修饰以包含(a)GGTA1、CMAH和B4GALNT2的缺失或破坏；(b)从猪基因组中单个多转基因盒表达的CD46、CD55、CD59、CD39、CD47、A20、PD-L1、HLA-E、B2M、THBD、TFPI和HO转基因(例如其人或人源化拷贝)的添加；和(c)所有PERV拷贝的功能性缺失。在一些实施方案中，从猪分离心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺或脾，所述猪已被基因修饰以包含(a)GGTA1、CMAH和B4GALNT2的功能性破坏；(b)从猪基因组中单个多转基因盒表达的CD46、CD55、CD59、CD39、CD47、A20、PD-L1、HLA-E、B2M、THBD、TFPI和HO转基因(例如其人源化拷贝)的添加；和(c)所有PERV拷贝的功能性失活。在某些实施方案中，所述猪已被进一步基因修饰以具有人源化vWF、ASGR1的缺失和/或B2M基因的缺失。
在一些实施方案中，一旦异种移植到人或非人灵长类动物中，异种移植的器官(例如，心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺、脾)表现出持续的功能，持续超过约300天、超过约1年、超过约1.5年、超过约2年、超过约2.5年、超过约3年、超过约3.5年、超过约4年、超过约4.5年、超过约5年、超过约5.5年、超过约6年、超过约6.5年、超过约7年、超过约7.5年、超过约8年、超过约8.5年、超过约9年、超过约9.5年或超过约10年。
在一些实施方案中，本公开文本提供了对患有导致器官、组织或细胞功能受损、不足或缺乏的疾病、障碍或损伤的受试者的治疗。在一些实施方案中，所述受试者遭受了导致损害受试者的一个或多个细胞、组织或器官的损伤或创伤(例如，车祸)。在一些实施方案中，所述受试者遭受了火或酸灼伤。在一些实施方案中，所述受试者患有导致器官、组织或细胞功能受损、不足或缺乏的疾病或障碍。在一些实施方案中，所述受试者患有自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病选自：心脏病(例如，动脉粥样硬化)、扩张型心肌病、严重的冠状动脉疾病、瘢痕心脏组织、心脏的先天缺陷、I型或II型糖尿病、肝炎、囊性纤维化、肝硬化、肾脏衰竭、狼疮、硬皮病、IgA肾脏病、多囊性肾脏病、心肌梗塞、肺气肿、慢性支气管炎、闭塞性细支气管炎、肺动脉高压、先天性膈疝、先天性表面活性蛋白B缺乏症和先天性囊性肺气肿性肺病、原发性胆汁性胆管炎、硬化性胆管炎、胆道闭锁、酒精中毒、威尔逊病、血色沉着病和/或α-1抗胰蛋白酶缺乏症。
在一些实施方案中，将本公开文本的任何经基因修饰的细胞、组织和/或器官与经基因修饰的供体分离并给予非供体受试者宿主。在本文中使用的“给予(Administering)”或“给予(administration)”包括但不限于引入、施加、注射、植入、移植(grafting)、缝合和移植(transplanting)。根据本公开文本，可以通过导致本公开文本的器官、组织、细胞或组合物定位在所希望位点处的方法或途径来给予所述经基因修饰的细胞、组织和/或器官。可以通过任何合适的途径将本公开文本的器官、组织、细胞或组合物给予受试者，所述合适的途径导致将细胞递送至受试者中的所希望位置，其中所述细胞的至少一部分保持活力。在一些实施方案中，所述细胞的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(无论是单独还是作为组织或器官的部分给予)在给予受试者后保持活力。给予本公开文本的器官、组织、细胞或组合物的方法是本领域熟知的。在一些实施方案中，将所述细胞、组织和/或器官移植到宿主中。在一些实施方案中，将所述细胞、组织和/或器官注射至宿主中。在一些实施方案中，将所述细胞、组织和/或器官移植到宿主表面(例如，骨骼或皮肤)上。
在一些实施方案中，将已被基因修饰以含有以下的心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺或脾移植到宿主中：GGTA1、CMAH和B4GALNT2的缺失或破坏；来自猪基因组中单个多转基因盒的CD46、CD55、CD39、CD47、HLA-E、THBD和TFPI以及任选CD59、B2M、A20、PD-L1和HO-1中的一个或多个的表达；以及所有PERV拷贝的缺失。在一些实施方案中，将已被基因修饰以含有以下的心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺或脾移植到宿主中：GGTA1、CMAH和B4GALNT2的缺失；来自猪基因组中单个多转基因盒的CD46、CD55、CD39、CD47、HLA-E、THBD和TFPI以及任选CD59、B2M、A20、PD-L1和HO-1中的一个或多个的表达；以及所有PERV拷贝的功能性失活。在一些实施方案中，移植的心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺、脾或其部分存活并起作用持续约1天、约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约9个月、约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年或更久的时间段。
在一些实施方案中，将有必要保护经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官免受被给予所述经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官的宿主的免疫系统的影响。例如，在一些实施方案中，将经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官与基质或包衣(例如，明胶)一起给予，以保护所述经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官免受来自宿主的免疫应答的影响。在一些实施方案中，所述基质或包衣是可生物降解的基质或包衣。在一些实施方案中，所述基质或包衣是天然的。在其他实施方案中，所述基质或包衣是合成的。
在一些实施方案中，将所述经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官与免疫抑制化合物一起给予。在一些实施方案中，所述免疫抑制化合物是小分子、肽、抗体和/或核酸(例如，反义或siRNA分子)。在一些实施方案中，所述免疫抑制化合物是小分子。在一些实施方案中，所述小分子是类固醇、mTOR抑制剂、钙神经素抑制剂、抗增殖剂或IMDH抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子选自皮质类固醇(例如，强的松、布地奈德、泼尼松龙)、钙神经素抑制剂(例如，环孢霉素、他克莫司)、mTOR抑制剂(例如，西罗莫司、依维莫司)、IMDH抑制剂(硫唑嘌呤、来氟米特、霉酚酸酯)、抗生素(例如，放线菌素D、蒽环类、丝裂霉素C、博莱霉素、光神霉素)和甲氨蝶呤，或其盐或衍生物。在一些实施方案中，所述免疫抑制化合物是选自以下的多肽：CTLA4、抗b7抗体、阿巴西普、阿达木单抗、阿那白滞素、赛妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英夫利昔单抗、艾塞吉珠单抗、那他珠单抗、利妥昔单抗、苏金单抗、托珠单抗、优特克单抗、维多利珠单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗和莫罗单抗。
在一些实施方案中，待给予受试者的所述经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官已被进一步基因修饰，使得它们不太可能在受试者中诱导免疫应答。在一些实施方案中，所述经基因修饰的一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种器官已被进一步基因修饰，使得它们不表达功能性免疫刺激分子。
提供以下实施例以举例说明本公开文本，并且仅出于说明目的，并且不应将其解释为限制本公开文本的范围。
实施例
现已总体上描述本公开文本，其参考以下实施例将更容易地被理解，所述实施例仅出于说明本公开文本的某些方面和实施方案的目的被包括，并且不意图限制本公开文本。例如，本文公开的特定构建体和实验设计表示用于验证适当功能的示例性工具和方法。因此，将容易清楚的是，可以在本公开文本的范围内取代任何所公开的特定构建体和实验计划。
实施例1：敲除猪补体组分3(C3)以抑制补体系统
选择C3的高度保守的区域，并设计了两个靶向C3结构域的sgRNA。这两个gRNA序列的序列是TCTCCAGACGCAGGACGTTG(SEQ ID NO:158)和GGAGGCCCACGAAGGGCAAG(SEQ ID NO:159)。使用氖转染机和试剂，将C3 sgRNA与GGTAsgRNA(GAGAAAATAATGAATGTCAA(SEQ ID NO:210))质粒和cas9质粒一起瞬时转染到猪胎儿成纤维细胞中。使用GGTA抗体反选择方法选择缺乏C3的细胞(“C3-KO”)以共富集C3-KO细胞，然后对其进行单细胞分选和基因分型以确定使用深度测序敲低C3靶标的效率。
在筛选的156个克隆中，108个克隆是双等位基因C3-KO。双等位基因C3-KO细胞的敲低效率为69％。所得的C3-KO细胞系已被用于利用体细胞核移植方法产生猪。C3-KO猪存活63天，并且死于肝脏和肺感染。如图1A-图1C所示，C3-KO猪是100％NHEJ敲除的。图1A示出了引入C3中的缺失的大小，图1B示出了插入缺失的位置，并且图1C示出了在C3-KO猪中产生的插入缺失的序列。
预计上述C3-KO猪将不产生任何功能性C3蛋白。由于缺少功能性C3蛋白，因此将无法激活C3-KO猪的补体系统，从而降低C3-KO猪的先天免疫系统。此外，与野生型猪相比，预计C3-KO猪可能更容易受到细菌和/或病毒感染。此外，预计将C3-KO猪的细胞、组织和/或器官异种移植到人体内不会激活人补体系统。因此，这应使人对C3-KO猪异种移植物的天然免疫应答最小化。
实施例2：具有一个或多个经修饰的MHC I类基因的猪
将猪的MHC主要I类等位基因条件性地替代为人MHC次要I类等位基因(“MHC-I猪”)。为此，猪的基因组中含有SLA-1、SLA-2和SLA-3基因的区域被替代为人次要等位基因HLA-E的经修饰形式。
图2描绘了MHC I类替代策略的方案：使含有SLA-1、SLA-2和SLA-3基因的基因座侧接有loxP位点。在用Cre处理后，将SLA-1、SLA-2和SLA-3切除，并替代为人HLA-E，如HLA-E、HLA-G、B2M和CIITA-DN基因的各种组合。MHC-I猪是活的，并且免疫功能严重受损。因此，在收获细胞、组织和/或器官之前，使用了条件性敲除，并且用人HLA-E和其他人基因替代了SLA-1、SLA-2和SLA-3基因，而不是以通用方式用人基因替代SLA-1、SLA-2和SLA-3基因。
使用长读段技术对猪的MHC I区域进行测序。设计了捕获SLA-1、SLA-2和SLA-3基因的探针，并将其用于捕获MHC-I基因区域。将PacBio测序和10X测序用于准确地确定MHC-I基因区域。SLA-1、SLA-2和SLA-3的构造在图9中示出。设计了两个具有侧接MHC-I区的loxP位点的盒。盒1含有启动子、loxP位点和选择剂(即，嘌呤霉素)。盒2含有第二标记(GFP)、loxP位点和无启动子的基因(包括HLA-E、B2M和CIITA-DN)盒。
使用Golden Gate组装策略(New England BioLabs)从单个组分合成盒1和盒2，并用对应于插入位点的800bp同源序列侧接。使用连续两轮的CRISPR-cas9来插入两个位点17。使用嘌呤霉素选择和GFP FACS分选来分离克隆，并使用连接PCR来验证插入。
用Cre重组酶转染细胞，并诱导Cre重组酶的表达。进行单细胞分选，并使用连接PCR筛选经分选的细胞，以分离具有用人MHC-1双等位基因替代SLA-1、SLA-2和SLA-3的细胞。
对于体内Cre切除，已设计了可替代的盒1，其包括在组织特异性启动子或诱导型启动子控制下的Cre重组酶。通过使用组织特异性启动子或诱导型启动子，将在目的细胞、组织和/或器官中切除SLA-1、SLA-2和SLA-3基因，或者可以在收获细胞、组织和/或器官之前在动物中诱导切除。可以通过体细胞核移植(SCNT)产生SLA-1、SLA-2和SLA-3被人MHC-I替代的猪，并且可以产生编码条件性和/或组织特异性条件性替代的基因的仔猪。
实施例3：MHC II类失活
通过以下方式产生缺乏MHC-IIα链表达的猪(“MHC-II KO猪”)：在猪细胞中使用已建立的gRNA技术切除DQA基因并使DRA基因失活，然后将所述猪细胞经由SCNT转移到宿主猪中。简而言之，在gRNA转移到猪细胞中之后，对基因组进行了测序，并鉴定MHC-II基因座处的变异。将Cas9递送至这些细胞，然后对所述细胞进行分选以分离单细胞。对这些单细胞进行测序以对靶向的DQA和DRA基因进行基因分型。在具有DQA和DRA失活的单细胞中，在SCNT之后产生胚胎，随后将其植入猪中以产生MHC-II KO猪。在出生后四周，MHC-II KO猪保持健康。
图3A和图3B基于DQA基因示出了MHC-II KO的基因型。通过DQA基因的基于外显子靶向的扩增和测序以及DRA基因测序对MHC-II KO猪进行基因分型。如左图所示，插入缺失的大小和位置位于DRA基因中。如右图所示，DRA基因的失活是由于在DRA扩增子的位置126和127各自的两个单核苷酸插入造成的。
图4A和图4B示出了MHC-II KO猪的另一种基因型。使用DRA基因的基于外显子靶向的扩增和测序确定DRA基因型。来自DRA的外显子靶向区已被扩增和测序。如左图所示，插入缺失的大小和位置位于DRA基因中。如右图所示，DRA基因的失活是由于在DRA扩增子的位置106和107各自的两个单核苷酸插入造成的。
与缺乏MHC-II表达的人相似，MHC-II KO猪的CD4+T细胞群体减少，然而，CD8+T细胞群体保持完整(图5)。此外，除其他问题外，MHC-II KO猪受到免疫抑制，具有增强的自身免疫力和淋巴样缺陷。已知这些表型与MHC-II KO表型相关，并且已在缺乏MHC-II表达的小鼠中观察到。这些相似性证实了MHC-II KO猪是有效的MHC-II KO，而不是活性基因修饰(图6)。
实施例4：减少基于适应性免疫的排斥反应的PD-L1敲入
将人PD-L1基因(例如，PD-L1转基因)递送至猪基因组。参见图7中的结构示意图。使用两个不同的PD-L1扩增子通过qPCR确认了人PD-L1转基因的表达(图8)。
在异种移植后，表达PD-L1的猪组织可能具有减少的宿主(如人)的排斥反应。
实施例5：猪血管性血友病因子的基因修饰以调节血小板聚集
设计并构建了含有来自pvWF的同源臂、A1结构域和来自hvWF的侧翼区域中的某些残基的HDR载体。(图10)。还设计以下两种sgRNA，以启动内源性猪基因组中的HDR替代，并在待被人序列替代的区域附近切割：TCTCACCTGTGAAGCCTGCG(SEQ ID NO:5)和CACAGTGACTTGGGCCACTA(SEQ ID NO:6)。
HDR载体由来自猪vWF的约1kb同源臂和人A1和侧翼结构域以及sgRNA切割位点中的失活突变构成，以防止sgRNA切割供体和经修饰的猪基因组。HDR载体还在sgRNA切割位点附近含有SphI和BspEI位点，所述SphI和BspEI位点可以将HDR载体与内源性猪基因组区分开。
使用Neon转染系统(Invitrogen)用8μg Cas9、1μg sgRNA1和1μg sgRNA2以及10μgHDR载体转染猪原代成纤维细胞。在转染后两天，使用FACS对细胞进行单细胞亚克隆。将单细胞再培养12天，直到游离形式的HDR载体在细胞分裂过程中消失。使用侧翼引物扩增hvWF的A1和侧翼区域。对PCR产物进行SphI和BspEI顺序消化，以筛选具有HDR替代的克隆，所述HDR替代将在顺序消化后向具有700bp、323bp和258bp大小的片段的PCR产物添加新颖的SphI和BspEI位点(图11)。完整的双等位基因HDR消除了1281bp的野生型产物以及大于700bp的任何部分消化产物。
从约150个单细胞集落分离出具有双等位基因HDR的细胞(图11)。如通过测序证实的，猪A1结构域和侧翼区域的等位基因均被人对应物替代(图12A和图12B)。A1结构域突出显示，而侧翼区域中的潜在糖基化位点则用划线标记。在pvWF中缺失的人特有残基用条形标记，并且人源化A1结构域和侧翼区域用半括号标记。这种经分离的细胞已扩增成细胞系，并且可以用于通过SCNT产生经基因修饰的猪。
表达A1人源化pvWF的细胞在血小板激活测定期间具有显著降低的针对人血小板的聚集反应(图13)。简而言之，将细胞与人血小板一起孵育，并通过剪切应力诱导聚集。表达A1人源化pvWF的细胞显示出较温和且可诱导的聚集曲线，而表达野生型pvWF的细胞对人血小板的聚集反应更强。因此，与表达pvWF的猪器官相比，具有A1 hvWF的猪器官可能在人血中诱导更温和的凝血反应，并且可能改善在猪到人异种移植中观察到的血管不相容性。
这些数据一起表明，用来自人对应物(hvWF)的对应残基替代内源性猪pvWF的A1结构域和一个或多个侧翼结构域中的某些残基，可以调节异种移植过程中发生的血小板聚集反应(图9)。
实施例6：猪经典MHCI抗原的基因组缺失以防止CD8+T细胞激活
MHC I类分子通过其到CD8+T细胞的肽呈递，在同种异体移植的排斥反应中起着至关重要的作用。在这里，测试了在猪原代成纤维细胞中整个约200kb经典MHC I类基因座的缺失是否阻止异种移植中CD8+T细胞介导的毒性。
经典MHC I类基因编码在细胞表面广泛表达的高多态性蛋白质。它们将外源肽呈递至CD8+T淋巴细胞，从而导致靶细胞裂解。另外，错配的MHCI分子在移植中也充当抗原。已探索了在用于异种移植的供体猪器官中去除经典MHCI分子的不同策略。在一次尝试中，Tector组使用Cas9和3个sgRNA敲除了SLA-1、SLA-2和SLA-3分子的保守外显子4(Reyes2014)。然而，此外显子也被其他经典和非经典MHCI分子共享，并且其可能产生无法预测的脱靶效应。另外，其余外显子1-3仍可以作为细胞表面抗原存在。在另一次尝试中，使用TALEN敲除了异二聚体伴侣B2M(Wang 2016)。此方法也可能影响非经典MHCI分子，并且其余MHCI仍可能在细胞表面上呈现解构的蛋白质。在异种移植的情况下，通常在MHCI缺陷细胞中补充人HLA-E/B2M分子，以防止NK细胞介导的毒性。人B2M可能与猪SLA二聚化并恢复其在B2M敲除猪中的抗原性。
对于此实施例，为了特异性和完全去除经典MHCI抗原，首先鉴定猪基因组中具有独特侧翼序列的MHC经典I类簇(图14)。这种约200kb的簇含有所有8个经典MHCI基因，而没有任何其他蛋白质编码基因。然后，鉴定出独特的侧翼区域中的sgRNA(SEQ ID NO 1-4)以诱导这种整个基因簇的片段缺失。由于约200kb片段缺失的频率相对较低，因此还设计了富集策略来分离双等位基因缺失克隆。
使用Neon转染系统(Invitrogen)用1.25μg TrueCut Cas9蛋白和7.5nmol crRNA/tracrRNA双链体(Invitrogen)转染猪原代成纤维细胞。在转染后三天，从经转染的细胞收获基因组DNA，并使用图15A所示的指定引物对进行PCR。使用侧接预计缺失连接的引物检测片段缺失。使用基于拓扑异构酶的克隆(“TOPO克隆”)亚克隆此PCR产物，并对单独TOPO克隆进行Sanger测序，以确认缺失连接的序列。将所述序列与图15B中所示的预计连接进行比对。同时，用猪特异性SLA-1抗体将细胞的等分试样染色。MHCI阴性细胞的部分在图16中示出。
在单细胞亚克隆后，含有双等位基因缺失的细胞可以用于经由体细胞核移植产生经典MHCI敲除猪。预期所述猪完全缺乏所有经典MHCI分子，并且富含可能涉及能育性和其他生理功能的非经典MHCI分子。其余B2M分子不可能具有抗原性，因为它们是非多态的，并且对人对应物来说是高度保守的。另外，人HLA-E/B2M的外源性表达不能挽救经典MHCI分子的缺乏。与先前的报告相比，所得的猪应具有最干净的经典MHCI敲除背景。
实施例7：免疫学上相容的猪细胞、组织、器官、猪和后代的产生
尽管其他人进行了许多尝试来产生用于安全异种移植的转基因猪，但由于构建体的相容性和转基因之间的转录干扰，迄今为止，用于异种移植的最先进的转基因猪携带的转基因数量也是有限的。在这里，将KO、KI和基因组替代的组合用于产生供体猪的几次迭代。图21概述了供体猪世代通过顺序基因编辑的进程。如下所述，在猪2.0(3KO+12TG)的情况下，这些基因编辑包括三个敲除和12个转基因敲入，它们被设计用于解决免疫、凝血和物种不相容性。
将CRISPR-Cas9介导的NHEJ用于功能性敲除三个主要的产生碳水化合物的糖基转移酶/糖基水解酶基因GGTA1、CMAH和B4GALNT2。结合野生型猪组织的预先形成的抗体是异种移植的主要初始免疫学障碍，并且这三个基因已被鉴定为主要负责产生由这些抗体靶向的异种抗原(Byrne 2014,Lai 2002,Lutz 2013,Martens 2017,Tseng 2006)。因此，预测这些基因的功能丧失将在很大程度上消除预先形成的抗猪抗体与猪移植物内皮的结合。这通过流式细胞术结果得到确认，所述结果表明宿主抗体与靶猪2.0(3KO+12TG)成纤维细胞的结合降低(图22)。为了表明抗体结合减少，将基因工程猪成纤维细胞与合并的人血清孵育，并用缀合的第二抗人抗体检测结合的人IgM和IgG，并通过流式细胞术进行分析。与野生型猪成纤维细胞(红色等高线图)形成对比，这三个基因的消除导致抗体结合显著减少(绿色和棕色等高线图，降低约98％)。
经由PiggyBAC转座子介导的随机整合将十二个人转基因(CD46、CD55、CD59、CD39、CD47、A20、PD-L1、HLA-E、B2M、THBD、TFPI、HO-1)整合到猪基因组中的单个多转基因盒中，以产生猪2.0(3KO+12TG)的第一次迭代(参见图17-图20、图31、图47-图49；SEQ ID NO:212-214)。将转基因布置到具有所希望的泛在或组织特异性启动子的4个不同的顺反子中。将每个顺反子内的转基因用核糖体跳跃2A肽分开，以确保以相似的摩尔比表达。此外，引入了顺式元件(如泛染色质开放元件(UCOE))的组合，以防止转基因沉默；并引入具有强聚腺苷酸化位点和终止子的隔离子，以最小化转基因之间以及转基因与侧翼染色体之间的相互作用。
使用qPCR确定转基因表达水平和组织特异性启动子驱动表达(图23)，并使用基于反向PCR的连接捕获确定整合位点和拷贝数。作为原理验证，相邻顺反子中的所有转基因在成纤维细胞和内皮细胞系中均展示出所希望的组织特异性，而没有可检测的转录干扰。此外，所有转基因在具有不同基因组整合位置的克隆之间均显示出高度一致的表达水平，这表明转基因表达与染色体背景无关。如所预计的，在泛在启动子控制下插入的六个基因(包括补体调节基因(CD46、CD55和CD59；EF1α启动子)以及B2M、HLA-E和CD47(CAG启动子))在成纤维细胞和内皮细胞两者中表达。相比之下，在组织特异性启动子(NeuroD或ICAM2)调节下表达的六个基因(A20、PD-L1、HO1、THBD、TFPI和CD39)展示出相对于在内皮细胞中的表达较低的在成纤维细胞中的表达水平。与qPCR数据一致，观察到蛋白质的细胞表面表达由猪脾细胞以及猪成纤维细胞中插入的人转基因表达(图24)。简而言之，分离出猪2.0(3KO+12TG)脾细胞或成纤维细胞，并与识别所示特定人蛋白的抗体一起孵育，并使用流式细胞术分析经染色的细胞。在图24的每个图中，左侧的峰表示用同种型对照染色的细胞，并且右侧的峰表示用特异性抗体染色的细胞。
对于临床前实验，使用PiggyBac转座酶将转基因敲入随机整合到基因组中，并将具有单拷贝整合到基因间区域且无可预测后果的克隆用于猪生产。对于临床开发，在扩大育种和生产源供体猪之前，将通过双等位基因位点特异性转基因整合到安全港(例如，AAVS1基因组基因座)中产生纯合的雌性/雄性猪。
先天性和适应性免疫细胞功能以及补体和凝血级联的另外的体外评估将包括抗体反应性谱分析、混合淋巴细胞反应、补体依赖性细胞毒性、NK细胞毒性、巨噬细胞吞噬作用以及对凝血因子和血小板聚集的影响。
为了维持猪移植物功能并保护供体器官免受补体介导的毒性影响，人补体调节蛋白被过表达。简而言之，将基因工程猪成纤维细胞和猪脾细胞与25％人补体孵育一小时。用碘化丙啶染色细胞，并通过流式细胞术分析以定量细胞死亡。在用人补体培养后，野生型成纤维细胞和脾细胞展示出最高的细胞死亡百分比。4-7P和4-7H细胞源自猪2.0(3KO+12TG)仔猪；4-7F细胞(3KO+12TG)源自猪2.0(3KO+12TG)胎儿。3-9是三重碳水化合物抗原产生酶KO、HLA-DQAKO、HLA-DRA KO和人补体调节因子C3 KO。如图25所示，与对照人成纤维细胞相比，经基因工程化以表达人CD46、CD55和CD59的猪成纤维细胞和脾细胞表现出明显更低水平的补体介导的细胞死亡。
靶细胞上的MHC I与天然杀伤(NK)细胞上的杀伤抑制受体(KIR)连接抑制NK细胞介导的靶细胞杀伤。猪MHC I无法通过人NK KIR传递信号，并且因此，猪细胞对NK细胞的靶向细胞杀伤敏感。为了克服NK介导的细胞死亡，使连接人NK KIR受体的人HLA-E在猪细胞中过表达。百分之七十的WT猪成纤维细胞和K562细胞(人MHC缺陷型细胞系)被NK细胞的杀伤所靶向。如图26所示，人HLA-E+工程猪成纤维细胞展示出明显降低的NK介导的细胞杀伤。相比之下，HLA-E+猪成纤维细胞展示出明显降低的NK细胞杀伤，这表明HLA-E的表达保护了这些细胞免于裂解。
人CD55在猪细胞中的过表达降低了补体介导的毒性，这可能会减少凝血并提高异种移植物存活。凝血的激活最终导致凝血酶的形成，其通过在稳定的凝血酶-抗凝血酶(TAT)复合物中结合抗凝血酶而失活。简而言之，用人血培养野生型、CD55 KI+GGTA1缺陷型细胞和人内皮细胞。如图27所示，单独的人血或与人内皮细胞一起孵育60min的人血产生了大约10ng/mL TAT蛋白。此外，人血与野生型猪内皮细胞的共培养激活了凝血，并使TAT复合物形成增加至58ng/mL。相比之下，与CD55 KI+GGTA缺陷型猪内皮细胞共培养导致TAT复合物形成的显著减少。这些数据表明人CD55表达能够调节凝血激活。
对从用有效载荷9或有效载荷10进行基因修饰的猪分离的样品进行RNAseq。结果显示几种有效载荷免疫修饰转基因，即补体转基因，以及细胞毒性基因(B2M、HLA-E、CD47)的表达增加(图36)。
实施例8：异种移植中的抗体和酶切割防止功能性结合的潜力
抗体介导的排斥反应在历史上一直是开发异种移植作为终末期器官衰竭的可行治疗的主要阻碍。然而，近来的遗传学进步已允许开发多基因敲除猪，这些猪缺乏已建立的异种抗原靶标。敲除aGal、Neu5Gc和SDa与提高移植物存活有关。然而，需要进一步的工作来充分了解残留抗体与其他异种抗原靶标结合的影响，以及这些抗原的去除是否能保护组织免受高度敏化的人血清的侵害。在这里，研究了异种抗原敲除是否降低了高PRA血清结合以及酶促降解是否降低了功能性抗体结合。
使用Ficoll分离从外周血收集人和猪PBMC。从WT猪和实施例7的经基因修饰的猪2.0(3KO+12TG)加工猪主动脉内皮细胞(pAEC)。匿名的高和低PRA血清样品由马萨诸塞州总医院HLA实验室慷慨提供。从心脏、肝脏和肾脏异种移植接受者收集血清。通过IdeS(Genovis Inc.)酶促切割血清抗体。
低PRA人血清显示出与人PBMC靶细胞的结合最少，而高PRA人血清以高水平与相同人PBMC结合(图43A)。相比之下，高和低PRA血清均强烈结合猪PBMC(图43B)。高PRA血清还显示出与猪主动脉内皮细胞(pAEC)的显著结合。基因修饰显著(>95％)降低了所有人血清的结合(图44)。重要的是，使用来自猪2.0(3KO+12TG)的心脏、肝脏和肾脏异种移植物的体内异种移植实验显示，通过减少来自移植后取样的接受者血清的抗体结合来封存猪特异性抗体(图45)。这些数据表明存在低水平的残留异种抗体。图46A-图46C显示，IgG特异性蛋白酶IdeS将来自人和食蟹猴血清的功能性IgG的结合有效地降低至背景水平。
去除已知异种抗原靶标的基因修饰降低了人和灵长类动物血清与猪细胞的结合，但保留了低水平的异种抗体结合。高和低PRA血清相似，表明结合可能与HLA-SLA交叉反应性无关。对来自高度敏化患者的血清的IdeS处理展示了与猪2.0(3KO+12TG)细胞的负交叉匹配。保护异种移植物靶标免受具有未知靶标的抗体影响的其他方法是使用另外的基因修饰来防止下游后遗症，如补体激活和血栓形成。此数据首次表明，酶促抗体切割可以成功地减少残留IgG的功能结合，这表明此处理还可能是减少预先形成的异种抗体结合的影响的方法。
实施例9：不含PERV且免疫学上相容的猪细胞、组织、器官、猪和后代的产生
猪器官被认为是异种移植的有利资源，因为它们的大小和功能与人体器官相似，并且可以大量繁殖猪。然而，猪内源性逆转录病毒(PERV)传递的潜在风险以及免疫学上的不相容性阻碍了猪器官的临床使用。PERV是在所有猪品系的基因组中发现的γ逆转录病毒。猪基因组含有PERV元件的几个至几十个拷贝(Lee 2011)。与其他动物传染病病原体不同，PERV是猪基因组的整体部分。因此，不能通过生物安全育种消除它们(Schuurman2009)。尽管迄今为止尚无研究显示PERV在临床环境中传递给人，但已表明PERV可以在人细胞中通过“复制粘贴”机制感染和繁殖。在细胞培养中，已显示病毒颗粒可以被释放并可以感染人细胞并且随机整合到人基因组中，优先地整合在基因内区域和活跃的染色质重塑区中(Armstrong 1971,Moalic 2006,Niu 2017,Patience 1997)。还已表明PERV-A和PERV-B两者均可以感染人细胞。尽管PERV-C是嗜亲性的，但重组病毒类型(A/C)展示出最大的感染性。此外，一旦PERV通过延长LTR序列适应新的宿主基因组环境，感染性潜力可能会增加。PERV还可以从经感染的人细胞水平传递到与猪细胞没有接触的其他人细胞。在体内，在免疫受损的小鼠中，已表明PERV可以从猪细胞传递到小鼠细胞(Clémenceau 2002)。如对其他逆转录病毒所报道的，PERV整合可能潜在地导致免疫缺陷和肿瘤发生。基因工程的最新突破已表明了永生化猪细胞系中PERV的全基因组失活(Yang 2015；PCT公开号WO 17/062723)和不含PERV的猪的产生(Niu 2017；PCT公开号WO 18/195402)。
利用CRISPR-Cas9技术，实现了PERV元件的所有62个拷贝从PK15猪肾脏上皮细胞基因组的完全消除(Yang 2015)，和所有25个拷贝从猪胎儿成纤维细胞的完全消除，以及随后产生了所有PERV元件均失活的活猪(Niu 2017)。这一成功表明，现在有可能衍生出不含PERV的猪，这可以为异种移植提供安全的供体库。
为了确定PERV是否在人细胞中保持活性并繁殖，在PERV感染的HEK293T-GFP细胞(iHEK293T-GFP)的群体和克隆中监测PERV拷贝数大于4个月。如通过ddPCR所确定的，观察到PERV拷贝数随时间增加(Pinheiro 2012)。
已进行了研究以确定破坏猪基因组中PERV pol的所有拷贝是否可以消除PERV从猪到人细胞的体外传递(Niu 2017)。在高度工程化的PERV胎儿成纤维细胞克隆的细胞培养上清液中未检测到逆转录酶活性，表明经修饰的细胞产生极少(如果有的话)PERV颗粒。具有>97％PERV pol靶向的PK15克隆表现出PERV感染减少多达1000倍，与背景水平相似。这些结果由具有与PK15克隆的接触史的人胚肾293(HEK293)细胞的连续稀释物的PCR扩增证实。从猪的各种组织分离的总RNA已证实，在mRNA水平上，约100％的PERV失活。
迄今为止，已从约克夏品种生产了具有100％PERV KO的多个克隆，并且正在进行猪克隆。PERV失活的猪生产稳健，并且已生产了63头PERV失活的仔猪，其中47头为雌性且16头为雄性。迄今为止，最老的健康动物已存活了两年。目前43头PERV KO猪正在成熟以进行育种。与用于克隆猪的细胞的正常核型一致，在PERV失活的猪中未检测到异常的染色体结构变化。
正在进行长期研究，以监测PERV失活和基因编辑对大型动物的影响。这项技术正在应用于另外的猪品系，包括美国的约克夏猪和尤卡坦猪两者。源供体猪将在所有PERV元件失效的背景线下进行基因工程化。
不含PERV和免疫学相容的猪的形式迭代。已进行了研究，以工程化在基因组中不具有任何活性PERV的供体猪，以及具有增强的与人组织相容的免疫、炎症和凝血系统的猪。关于前者，在猪中，猪基因组中所有PERV的功能已通过以下方式来根除：使用CRISPR-Cas9工程来破坏PERV元件中逆转录酶基因(pol)的催化结构域(使用如Niu 2017和WIPO公开号WO 2018/195402中描述的方法)，并使用敲除(KO)、敲入(KI)和基因组替代的组合来提供人组织相容性器官。关于后者，如本文所述产生如下猪：其中触发体液排斥反应的三个主要异种碳水化合物抗原产生基因/酶(即，GGTA1、CMAH和β1,4N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(B4GALNT2))已被基因灭活。预期这些基因的功能丧失将在很大程度上消除预先形成的抗猪抗体与猪移植物内皮的结合。此外，将关键的免疫调节因子插入到不含PERV的猪基因组内的单个基因座处，以调节例如人补体系统(hCD46、hCD55和hCD59)、凝血系统(例如hCD39、hTHBD和hTFPI)、炎症反应(例如hA-20、hCD47和hHO-1)和NK(例如PD-L1)和T细胞应答(例如hHLA-E、hB2M)。将通过转座进行的单拷贝多顺反子转基因整合用于敲入这些人源化基因。
预期可以产生既不含PERV又带有免疫相容性有效载荷的猪，所述猪将具有多种希望的特性。为了实现这一目标，通过基因修饰的多次迭代产生了供体猪。图21概述了供体猪世代通过顺序基因编辑的进程。在第一次迭代中，使用CRISPR-Cas9介导的非同源性末端连接(NHEJ)对猪1.0的猪成纤维细胞进行了基因工程化，以使所有PERV拷贝从基因组功能性缺失或在其内失活。通过CRISPR介导的NHEJ产生了猪2.0，以缺失3个主要的异种碳水化合物抗原产生基因(3KO；GGTA1、B4GALNT2和CMAH)，并与PiggyBAC介导的选自CD46、CD55、CD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1的多达12个所选择转基因或敲入的随机整合结合，所述转基因或敲入将异种免疫应答的各种成分修饰至猪基因组中。对于猪3.0迭代，然后在不含PERV的背景下产生源供体猪以携带3KO和多达12个指定的转基因。预期下一代源供体猪(猪3.1、3.2等)将被基因工程化以携带另外的修饰，如vWF基因的人源化以及脱唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)和内源性B2M基因的缺失。
一旦不含PERV的3KO+TG猪(猪3.0，图21)被基因工程化，则这些猪将进行杂交育种以产生后代和/或猪的漂移、驱赶、产仔和/或发声。
细胞工程和SCNT以产生猪。3.0并入免疫相容性有效载荷、异种抗原破坏和PERV破坏
为了生产不含PERV的猪3.0，首先产生了具有异种相容性修饰的猪2.0(3KO+9TG)。猪2.0(3KO+9TG)包括转基因hCD46、hCD55、hCD59、hB2M、hHLA-E、hCD47、hTHBD、hTFPI和hCD39。为了产生用于体细胞核移植(SCNT)的供体细胞以产生猪2.0，首先用以下两种试剂对野生型猪耳成纤维细胞进行电穿孔：a)靶向GGTA、CMAH和B4GALNT2基因的CRISPR-Cas9试剂；以及b)有效载荷质粒，其带有(i)PiggyBac转座酶盒(ii)由组织成3个可表达顺反子的九种人转基因(hCD46、hCD55、hCD59、hB2M、hHLA-E、hCD47、hTHBD、hTFPI和hCD39)组成的转基因构建体(参见图51)。产生成纤维细胞的单细胞克隆并通过以下方式进行筛选：a)片段分析/全基因组测序以鉴定具有所希望基因组修饰的克隆(参见图51C)和b)常规PCR(参见图51D)。然后将带有所希望修饰的克隆用作供体，以通过SCNT产生猪2.0。
使用从猪2.0(3KO+9TG)的蹄子分离的细胞，将使用CRISPR-Cas9系统的PERV工程化用于产生具有异种相容性修饰且也不含PERV的细胞。将猪2.0成纤维细胞用CRISPR-Cas9试剂电穿孔，所述试剂靶向PERV元件的所有基因组拷贝共有的逆转录酶(Pol)基因。产生了经电穿孔细胞的单细胞克隆，并且通过深度测序筛选这些克隆以鉴定其中Pol基因的催化核心被破坏的克隆(参见图51C)。然后对具有所希望的Pol破坏的克隆进行核型分析(参见图51E)；然后将具有正常核型的那些克隆用于SCNT中，以产生猪3.0(3KO+9TG)胚胎和猪。
猪3.0基因组、生化和表型特征的表征
A)转基因和敲除完整性的评估
在产生了猪3.0(3KO+9TG)后，我们接下来试图仔细检查其中的基因修饰的中靶和脱靶效应。为此，我们对WT成纤维细胞以及以上产生的猪2.0和猪3.0成纤维细胞进行了10倍全基因组测序(WGS)。与为了筛选进行的深度测序一致，WGS证实引入PERV pol和GGTA/B4GALNT2/CMAH基因的基因组拷贝中的突变均为移码插入或缺失，预计它们将转化为经修饰基因拷贝的功能性敲除(参见图51A和图51C)。此外，我们证实了所有九个转基因在猪基因组中的存在，并且令人惊讶地，发现所述转基因构建体已在CRISPR-Cas9靶向位点处整合到GGTA1等位基因之一中。
关于CRISPR编辑的潜在混淆脱靶效应，我们没有发现预计将干扰我们希望的编辑的功能或具有对猪健康的预计有害影响的伪像。我们在WT与猪2.0(3KO+9TG)之间或在猪2.0(3KO+9TG)与猪3.0(3KO+9TG)之间未观察到结构变体的任何差异，表明这些猪的总体基因组稳定性。关于较小的基因组变化，如小插入缺失，我们检查了所使用指导RNA的所有1,211个预测脱靶位点，并且发现与WT相比，猪2.0中B4GALNT2 gRNA脱靶位点中有两个小插入；然而，所述插入均不影响蛋白质编码序列。此外，当我们将猪3.0细胞与猪2.0细胞进行比较时，我们没有观察到预计重要的另外的基因组改变；我们仅发现了两个PERV gRNA脱靶位点内的两个缺失和一个插入，这两者均发生在蛋白质编码区域之外，并且可能实际上表示体细胞突变(参见Kim 2014)。考虑到缺乏功能性意义以及我们的猪的大量正常病理生理学数据，我们得出结论，所选择的猪3.0保持了基因组稳定性。
在DNA水平上确认了基因组修饰后，我们进一步使用RNA表达和免疫测定方法检查了猪3.0(3KO+9TG)是否具有适当的三重敲除和9TG表达。我们首先进行了RNA-seq，并且发现猪2.0和猪3.0两者均以与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)相当的水平表达了所有转基因(图52A)。此外，我们在猪的脐静脉内皮细胞(PUVEC)和成纤维细胞两者中观察到了相当的转基因表达谱和水平，表明转基因在这些细胞类型中普遍表达。接下来，我们表征了工程猪中的蛋白表达。我们在细胞表面上观察到了α-Gal、Neu5GC和SDa的聚糖标记的减少，这表明在猪2.0(3KO+9TG)细胞和猪3.0细胞二者中功能性消除了负责合成这些聚糖表位的3个基因(分别为GGTA、CMAH和B4GALNT2)(图52B)。通过PUVEC的FACS分析，我们观察到猪2.0和猪3.0两者均在蛋白质水平上表达所有转基因。实际上，九个转基因中的八个以与HUVEC相当的水平稳健表达。有趣的是，THBD表达是可检测的，但水平低得多。与FACS分析一致，IHC研究显示猪3.0肾脏缺乏三种聚糖抗原(图52C)。同样与FACS染色一致，我们检测到猪3.0肾脏中8个转基因的表达，除了THBD之外(图52C)。综上所述，我们从RNA表达和免疫测定数据得出结论，我们的三重敲除和9TG基因修饰在工程猪中在细胞和组织水平上成功转化为RNA和蛋白质表达。
B)猪3.0细胞的异种相容性特征的评价
接下来，我们检查了经基因组修饰的猪是否获取了异种相容性功能。我们首先测试了基因修饰是否允许经修饰的猪细胞逃避预先形成的人抗体结合。与WT PUVEC相比，猪2.0和猪3.0PUVEC表现出与人IgG和IgM的抗体结合降低了超过90％，这证实了可以通过3KO大大减轻针对异种移植的抗体障碍(图53A)。此外，当与来自合并的人血清的人补体一起孵育时，表达人补体调节剂CD46、CD55和CD59的具有三重敲除的猪3.0PUVEC展示出最小的体外人补体毒性，类似于它们的人HUVEC对应物(图53B)。综上所述，这些结果表明，当移植时，由于显著降低的抗体结合和补体激活，预计猪3.0衍生的异种移植物对体液损伤和超急性排斥反应较不敏感。
此外，我们检查了猪3.0是否对由人先天细胞免疫介导的损伤抗性更强。当进行离体测定时，与WT PUVEC相比，表达HLA-E/B2M的猪3.0展示出对NK介导的细胞杀伤的明显更强的抗性(图53C)。综上所述，这些结果表明，当移植时，预计猪3.0细胞对人先天免疫的攻击抗性更强。
最后，我们检查了猪3.0(3KO+9TG)是否可以减弱异种移植中经常观察到的失调的血小板激活和凝血级联。当将血管化的WT猪器官移植到人体内时，预先形成的抗体、补体和先天免疫细胞可以诱导内皮细胞激活并触发凝血和炎症。来自猪内皮细胞的凝血调节因子与人血之间的不相容性导致异常的血小板激活和凝血酶形成，从而加剧损害。此外，猪与人之间的凝血调节剂(例如，组织因子途径抑制剂，TFPI)的分子不相容性使得外部凝血调节无效。
为了解决这些异种凝血问题，我们在猪3.0中使以下两者作为我们用于猪3.0的多转基因构建体的一部分过表达：a)人CD39(抵消ADP在凝血级联中的血栓形成效应的ADP水解酶)和b)人TFPI(在内皮细胞激活后易位到细胞表面的因子)。然后，我们进行了各种体外和离体测定，以验证这些转基因在移植到猪细胞时正确发挥功能并调节凝血途径的能力。体外ADP酶生化测定显示当与WT PUVEC和HUVEC相比时，猪3.0PUVEC中CD39活性明显更高，与其更高的来自转基因的mRNA和蛋白表达一致(图53F)。类似地，激活的猪3.0PUVEC显示出有效结合并中和人Xa的能力，其可以减轻凝血并减少凝血酶-抗凝血酶(TAT)复合物的形成(图53G)。最后，在使用与猪3.0PUVEC共培养的人全血的离体凝血测定中，形成了最小的TAT(凝血酶抗凝血酶)，并且TAT的形成水平与HUVEC相似(图53E)，表明猪3.0获得了增强的与人因子的凝血相容性。
总的来说，这些异种相容性实验的结果表明，猪3.0(3KO+9TG)获得了增强的与人免疫系统的相容性，如通过减弱的人抗体结合、补体毒性、NK细胞毒性、吞噬作用和恢复的凝血调节所证明。
C)猪3.0祖先/原理验证猪的生理表型
为了评估工程猪的总体健康状况，我们检查了工程猪的生理学、能育性以及基因修饰对后代的传递。我们观察到尽管在PERV元件、免疫学和凝血途径上进行了广泛工程化，但猪1.0和2.0(3KO+9TG)两者均显示正常的血细胞计数，包括总白细胞和血小板、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞计数(图54A)。我们还观察到工程猪的正常生命器官功能(肝脏、肾脏和心脏)(图54B、图54C和图54D)。此外，与WT猪相比，工程猪具有相似的凝血酶原和凝血酶时间(图54E)。
此外，我们发现猪1.0和2.0可育，并且产生的正常平均产仔数为七。用WT猪育种猪1.0的后代在其肝脏、肾脏和心脏组织中携带约50％的PERV失活等位基因，表明PERV-KO等位基因是遵循孟德尔遗传学稳定地遗传的(图55)。类似地，猪2.0和WT猪的所有后代对于3KO均是杂合的(图56A)，并且大约一半携带9TG，其表达在mRNA(图56B)和蛋白质水平(图56C)两者上得到验证。这表明基因修饰没有被正常育种扫除。因此，我们得出结论，工程猪表现出正常的生理、能育性和经编辑等位基因的种系传递。
D)结论
基因工程猪在解决未满足的器官短缺的医疗需求方面具有广阔的前景。在本报告中，我们工程化了猪3.0(3KO+9TG)，其42个基因组基因座被修饰以根除PERV活性并增强人免疫相容性。猪3.0的广泛分析显示，工程猪细胞表现出降低的人抗体结合、补体毒性、NK细胞毒性和凝血失调。我们还检查并验证了我们的工程猪的正常病理生理、能育性和基因遗传性。猪3.0的成功产生增强了为临床移植提供安全且有效的器官的能力。
猪3.0(3KO+9TG)的成功产生表明了合成生物学在大型动物中广泛工程化基因组并赋予新颖功能的能力。在猪3.0中，我们缺失了PERV元件的25个拷贝、异种基因的8个等位基因，并同时将9个人转基因表达至生理相关水平。从而将在大型动物模型中进行基因组修饰的记录扩展到42个。凭借以这种规模执行复杂基因工程的能力，我们能够工程化另外的编辑，并最终选择具有最适合异种移植的组合的猪。此外，借助这些工具，我们设想可以对猪3.0进行进一步工程化，以实现另外的新颖功能，如免疫耐受、器官寿命和病毒免疫。
E)方法
CRISPR-Cas9 gRNA设计
我们使用R库DECIPHER设计特定的gRNA(PERV-3N：5'-TCTGGCGGGAGCCACCAAAC-3'，PERV-5N：5'-GGCTTCGTCAAAGATGGTCG-3'，PERV-9N：5'-TTCTAAGCAGTCCTGTTTGG-3')以特异性靶向猪2.0基因组中的所有pol催化序列。此外，我们使用了特定的gRNA(GGTA1：5'-GCTGCTTGTCTCAACTGTAA-3'，CMAH：5'-GAAGCTGCCAATCTCAAGGA-3'，B4GALTN2：5'-GATGCCCGAAGGCGTCACAT-3')分别靶向GGTA1、CMAH和B4GALNT2。
细胞培养
将猪胎儿成纤维细胞和成纤维细胞FFF3维持在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM，Invitrogen)高葡萄糖和丙酮酸钠中，其补充有15％胎牛血清(Invitrogen)、1％青霉素/链霉素(Pen/Strep，Invitrogen)和1％HEPES(Thermo Fisher Scientific)。将所有细胞保持在38℃和5％CO2、90％N2和5％O2的加湿三气培养箱中。
从脐静脉新鲜分离猪脐静脉内皮细胞(PUVEC)，并在补充有10％胎牛血清(Gibco)、1％青霉素/链霉素(Pen/Strep，Invitrogen)和1％HEPES(Thermo FisherScientific)的PriGrow II培养基(abm)中培养。将人脐静脉内皮细胞(HUVEC，ATCC，PCS-100-010)在补充有内皮细胞生长试剂盒-BBE(ECG试剂盒，ATCC)的血管细胞基础培养基(ATCC)中培养。将人NK-92细胞系在补充有12.5％胎牛血清(Gibco)、12.5％胎马血清(FES，Solarbio)和1％青霉素/链霉素(Pen/Strep，Invitrogen)的最低必需培养基α(α-MEM，Gibco)中培养。将人巨噬细胞系THP-1在补充有10％胎牛血清(Gibco)和1％青霉素/链霉素(Pen/Strep，Invitrogen)的RPMI 1640(BI)中培养。在62.5nM佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA，Sigma)中经3天实现THP-1细胞的分化，并通过将这些细胞附着到组织培养塑料进行确认。
PiggyBac-Cas9/2gRNA构建和细胞系建立
与先前描述的程序(Yang 2015)类似，我们合成了编码U6-gRNA1-U6-gRNA2的DNA片段(Genewiz)，并将其并入先前构建的PiggyBac-cas9质粒中。为了建立具有PiggyBac-Cas9/2gRNA整合的FFF3细胞系，我们使用Neon转染系统，根据由供应商(Thermo FisherScientific)提供的说明，用14.3μg PiggyBac-Cas9/2gRNA质粒和5.7μg Super PiggyBac转座酶质粒(System Biosciences)转染了5×105个FFF3细胞。为了选择携带整合的构建体的细胞，将2μg/mL嘌呤霉素施加至经转染的细胞。基于将嘌呤霉素施加至野生型FFF3细胞的阴性对照，我们确定嘌呤霉素选择在4天内完成。此后，用2μg/mL嘌呤霉素维持FFF3-PiggyBac细胞系，并施加2μg/ml多西环素以诱导多西环素可诱导FFF3-PiggyBac细胞系的Cas9表达持续一周。
为了避免在FFF3细胞系中的组成型Cas9表达，我们通过使用Lipofectamine 2000试剂用3μg PiggyBac仅切除转座酶载体转染5×105个细胞，从FFF3基因组中进行PiggyBac-Cas9/2gRNA切除。然后，将经PiggyBac-Cas9/2gRNA切除的FFF3细胞单细胞分选到96孔板中，进行克隆生长和基因分型。
单细胞和单细胞克隆的基因分型
首先，对FFF3-PiggyBac-Cas9/2gRNA细胞系进行嘌呤霉素选择，随后进行PiggyBac切除。然后将细胞分选成单细胞，进入96孔PCR板进行直接基因分型，并进入96孔细胞培养板进行菌落生长。为了在不进行克隆扩增的情况下对单个FF细胞进行基因分型，我们从经分选的单细胞直接扩增PERV基因座。我们还对从经分选的单细胞生长的克隆进行了基因分型。基因分型的程序根据Yang等人,(6)的方法。简而言之，我们将单细胞分选到96孔PCR板中，其中每个孔携带5μl裂解混合物，所述混合物含有0.5μl 10×KAPA表达提取缓冲液(KAPA Biosystems)、0.1μl 1U/μl KAPA表达提取酶和4.4μl水。我们将裂解反应在75℃下孵育15min，并在95℃下使所述反应失活5min。然后将所有反应添加到含有1x KAPA 2Gfast(KAPA Biosystems)、0.2μM PERV Illumina引物的20μl PCR反应中(方法表2)。将反应在95℃下孵育3min，随后进行30次(对于单细胞)或25次(对于单细胞克隆)以下循环：95℃，20s；59℃，20s和72℃，10s。为了添加Illumina序列衔接子，然后将3μl反应产物添加到20μlPCR混合物中，所述混合物含有1×KAPA 2G fast(KAPA Biosystems)和0.3μM携带Illumina序列衔接子的引物。将反应在95℃下孵育3min，随后进行20次(对于单细胞)或10次(对于单细胞克隆)以下循环：95℃，20s；59℃，20s和72℃，10s。在EX 2％凝胶(Invitrogen)上检查PCR产物，随后从凝胶中回收约360bp靶产物。然后将这些产物以大致相同的量混合，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒)，并用MiSeq个人测序仪(Illumina)进行测序。然后，我们分析了深度测序数据，并使用CRISPR-GA确定PERV编辑效率(5)。
PERV pol基因分型中使用的引物
Illumina_PERV_pol正向：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGACTGCCCCAAGGGTTCAA-3'
Illumina_PERV_pol反向：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTCTCCTGCAAATCTGGGCC-3'
体细胞显微注射以产生SCNT胚胎并进行胚胎移植用于猪克隆
体细胞显微注射程序是根据Wei等人。所有动物实验均在中国云南农业大学动物保护委员会的批准下进行。除非另外说明，否则所有化学品均购自Sigma Chemical Co.(美国密苏里州圣路易斯)。从Hongteng屠宰场(中国云南省昆明Chenggong Ruide Food Co.,Ltd)采集猪卵巢。将卵巢在补充有75mg/mL青霉素G钾和50mg/mL硫酸链霉素的0.9％(w/v)NaCl溶液中于25℃至30℃下运送到实验室。从直径3-6mm的卵泡分离卵丘细胞-卵母细胞复合物(COC)，并且然后在具有5％CO2的加湿气氛(APC-30D，ASTEC，日本)中，在200μL补充有0.1mg/mL丙酮酸、0.1mg/mL L-半胱氨酸盐酸盐一水合物、10ng/mL表皮生长因子、10％(v/v)猪卵泡液、75mg/mL青霉素G钾、50mg/mL硫酸链霉素和10IU/mL eCG和hCG(Teikoku ZoukiCo.，日本东京)的TCM-199培养基中于38.5℃下培养。在体外成熟38至42小时后，通过重复吸取0.1％(w/v)透明质酸酶中的COC，去除COC中膨胀的卵丘细胞。
如先前所述地进行SCNT。简而言之，将挤出具有完整膜的第一极体的卵母细胞在补充有0.1mg/mL秋水仙胺、0.05M蔗糖和4mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的NCSU23培养基中培养0.5至1小时，用于核突出。然后，在0.1mg/mL秋水仙胺和5mg/mL细胞松弛素B的存在下，在补充有10μM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮和10％FBS的Tyrode乳酸盐培养基中，通过使用斜口移液管(直径为大约20μm)将突出的核连同极体一起去除。将WT或不含PERV的成纤维细胞用作核供体。将单个供体细胞注射到无核卵母细胞的卵周隙中。
在含有0.25M D-山梨醇、0.05mM Mg(C2H3O2)2、20mg/mL BSA和0.5mM HEPES(游离酸)的融合培养基中，通过使用胚胎细胞融合系统(ET3，日本东京的Fujihira IndustryCo.Ltd.)以200V/mm持续20μs的单直流脉冲将供体细胞与接受者细胞质融合。将重建的胚胎在PZM-3溶液(van't Veer 1997)中培养2小时，以允许核重编程，然后在含有0.25M D-山梨醇、0.01mM Ca(C2H3O2)2、0.05mM Mg(C2H3O2)2和0.1mg/mL BSA的激活介质中以150V/mm持续100μs的单脉冲激活。然后，将经激活的胚胎在具有5％CO2、5％O2和90％N2的加湿气氛(APM-30D用于进一步激活，ASTEC，日本)中，在补充有5mg/mL细胞松弛素B的PZM-3中于38.5℃下培养2小时。然后将重建的胚胎转移到新的PZM-3培养基中，并于38.5℃下在含有5％CO2、5％O2和90％N2的加湿空气中分别培养2天和7天，以检测卵裂和胚泡发育率。
将具有一次分娩史的杂交育种(大白/长白杜洛克)母猪用作所构建胚胎的代孕母亲。每天上午9:00和下午6:00对它们进行发情检查。将激活后培养6小时的SCNT胚胎通过手术转移到代孕者的输卵管。在胚胎移植后23天，使用超声波扫描仪(HS-101V，HondaElectronics Co.Ltd.，日本Yamazuka)检查妊娠。
通过免疫荧光表征蛋白质表达
对WT、猪2.0和猪3.0的新生儿(3-6日龄)猪肾脏冷冻切片进行免疫荧光，以在组织水平上表征基因修饰(3KO和9TG)。将冷冻切片用冰冷的丙酮固定，封闭，然后使用一步式直接免疫荧光技术或两步式间接免疫荧光技术染色。所使用的一抗和二抗在补充表2中汇总。使用ProLong Gold DAPI(Thermo Fisher，P36931)进行核染色。使用Leica荧光显微镜对切片成像，并使用ImageJ软件进行分析。所有照片均在相同条件下拍摄，以允许正确比较WT、猪2.0和猪3.0冷冻切片之间的荧光强度。
人抗体与猪内皮细胞的结合
如先前所述(Xenotransplantation,Methods and Protocols,编辑：Costa,Cristina,
Figure BDA0003463330150000551
Rafael,ISBN 978-1-61779-845-0)，通过流式细胞术评估人IgG和IgM抗体与猪和人内皮细胞的抗体结合。简而言之，收集猪2.0、猪3.0、WT PUVEC和HUVEC，洗涤两次并重悬于染色缓冲液(含有1％BSA的PBS)中。将正常人男性AB血清(InnovativeResearch，IPLA-SERAB-H26227)于56℃下热灭活30min，并在染色缓冲液中以1:4稀释。将猪2.0、猪3.0、WT PUVEC和HUVEC(每个测试1×105个细胞)分别与经稀释的人血清于37℃下孵育30min。然后用冷的染色缓冲液洗涤细胞，并与山羊抗人IgG Alexa Fluor 488(Invitrogen，A11013，1:200稀释)和山羊抗人IgM Alexa Fluor 647(Invitrogen，A21249，1:200稀释)于4℃下孵育30min。在用冷的染色缓冲液洗涤后，将细胞重悬于含有7-AAD(BD，559925，1:100稀释)的染色缓冲液中，以便包括死/活门控。在CytoFLEX S流式细胞仪上获取荧光，并使用FlowJo分析软件分析数据。对于每个样品，在活细胞门中收集5,000个事件，并绘制为通过“测试MFI(IgG或IgM)-对照(仅二抗)MFI”产生的特定中值荧光强度(MFI)。
人补体细胞毒性测定
收获猪2.0、猪3.0、WT PUVEC和HUVEC，用PBS洗涤两次，并重悬于无血清培养基中。将细胞(每个测试1x105个细胞)与不同浓度(0％、25％、50％和75％)的人血清补体(Quidel，A113)的统一池在37℃和5％CO2下孵育45min。之后，将细胞用碘化丙锭(Invitrogen，P3566，1:500稀释)染色5min，并使用CytoFLEX S流式细胞仪进行分析。对于每个样品收集了5,000个事件，并且将PI阳性细胞的百分比用作由人补体介导的细胞死亡的百分比。
NK细胞毒性测定
将PUVEC和HUVEC用作靶细胞并分别用抗猪CD31-FITC抗体(Bio-Rad)和抗人CD31-FITC抗体(BD)标记。同时，将人NK 92细胞用作效应细胞并用抗人CD56-APC抗体(eBioscience)标记。将效应子(E)和靶细胞(T)在37℃和5％CO2下以3的E/T比共培养4小时。将细胞用碘化丙啶染色5min，然后进行FACS分析。将CD31+门中PI阳性细胞的百分比用于计算杀伤的靶细胞的百分比。
吞噬作用测定
通过62.5μM佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)经3天实现人巨噬细胞系THP-1的分化，并通过将这些细胞附着到组织培养塑料进行确认。根据制造商的规程，用荧光染料5/6-CFSE(Molecular Probes)对猪脾细胞(靶细胞)进行染色。将CFSE标记的靶细胞与人分化的THP-1细胞(效应细胞)分别以1:1和1:5的E/T比于37℃下孵育4小时。用抗人CD11b抗体复染巨噬细胞，并通过FACS测量CFSE标记的靶标的吞噬作用。如先前所述(Ide 2007)地计算吞噬活性。
CD39生化ADP酶测定
在测定前1天，将猪2.0、猪3.0以及WT PUVEC和HUVEC以每孔2×104接种在96孔板中。将细胞与500μM ADP(Chrono-Log Corp，#384)在37℃和5％CO2下孵育30min。加入孔雀石绿(Sigma，MAK307)以终止反应，并在630nm处测量吸光度，以相对于KH2PO4的标准曲线确定磷酸盐产生的水平。
TFPI活性和人因子Xa结合测定
在测定之前，将细胞用1μM PMA处理6小时以诱导猪2.0和猪3.0PUVEC的细胞表面上的hTFPI表达。然后如先前所述地进行TFPI活性和人因子Xa结合测定(Xenotransplantation,Methods and Protocols,编辑：Costa,Cristina,
Figure BDA0003463330150000571
Rafael,ISBN 978-1-61779-845-0)。一式四份地进行所有测定。
TAT形成测定
将猪2.0、猪3.0以及WT PUVEC和HUVEC以每孔3×105接种在6孔板中。在1天后，在平缓振荡下，将细胞与1mL新鲜的全人血(含有0.5U/mL肝素)于37℃下孵育。在不同的指示时间点，抽血，从中分离血浆。通过使用凝血酶-抗凝血酶复合物人ELISA试剂盒(Abcam，ab108907)测量血浆中的TAT含量。
来自全基因组测序数据的变体调用
通过BWA(v0.7.17-r1188)将配对的读段映射到野猪11.1基因组(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-91/fasta/sus_scrofa/dna/)。使用标准过滤器加上要求最小深度为10，遵循GATK最佳实践建议，使用GATK(v4.0.7.0)来调用变体(SNP和INDEL)。
中靶/脱靶位点的计算机预测
使用允许最多6个错配的R(v3.5.0)中的CRISPRSeek(v1.22.1)预测全基因组中靶和脱靶位点。输入基因组是野猪11.1(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-91/fasta/sus_scrofa/dna/)。
全基因组测序数据的脱靶调用
将落入通过CRISPRSeek(v1.22.1)预测的脱靶PAM位点侧翼20bp内的GATK的经过滤变体称为潜在的脱靶修饰。当亲本系WGS数据可用时，使用内部开发的统计检验过滤出等位基因频率明显偏离亲本系大于或小于0.5的变体。该检验假设两个等位基因同时被修饰的机会极小，因为脱靶突变是罕见的事件。
突变的功能影响分析
无论变体是脱靶突变还是种系突变，都应注释在转录水平上的序列变化和在蛋白质水平上的氨基酸变化，以使用VEP(变体效应预测器，v93.3)评估其潜在的功能影响。如果高影响突变会导致移码、起始增益/丢失、终止增益/丢失、剪接供体/受体移位或剪接区域变化，则应特别地选择高影响突变。只要有可能，突变将被注释，以表明它是否影响使用APPRIS数据库的原理或可替代转录物。
来自RNA-Seq的转录分析
在剪接感知模式下，使用STAR(v2.6.1a)将RNA-Seq读段与野猪11.1基因组进行比对。将猪转录组和转基因两者作为输入转录物，使用Salmon(v0.11.3)将表达水平量化为TPM(每百万转录物)。
通过Amplicon-Seq进行PERV敲除效率分析
在修剪低于Q20的3'末端低质量碱基后，如果配对读段的重叠超过100个碱基，则将其合并成片段。针对低于Q20的硬遮蔽低质量碱基进一步扫描合并的片段，并在剪接感知模式下使用STAR(v2.6.1a)与PERV扩增子靶序列进行比对。然后，通过内部R脚本(v3.5.0)对输出BAM文件进行分析，以消化比对模式，评估INDEL在PERV扩增子靶序列中的分布(相对于催化中心)并得出敲除效率。
通过Capture-Seq进行PERV敲除效率分析
首先在剪接感知模式下使用STAR(v2.6.1a)将配对的读段与PERV靶序列进行比对，随后通过Picard(v2.18.14)进行比对位置依赖性去重。然后，通过内部脚本将去重的配对读段合并成片段。然后在剪接感知模式下，使用STAR(v2.6.1a)将合并的片段与PERV捕获靶序列重新比对。然后，通过内部R脚本(v3.5.0)对输出BAM文件进行分析，以消化比对模式，评估INDEL在捕获靶序列中的分布并得出敲除效率。
通过Capture-Seq进行PERV单倍型分析
首先在剪接感知模式下使用STAR(v2.6.1a)将配对的读段与PERV靶序列进行比对。使用Mutect2(v4.1.2.0)调用体细胞变体，并过滤出等位基因频率超过给定阈值较少(MAF>0.01)的变体。合并来自多个样品的经过滤变体，以得出用于单倍型分型的变体位点的集合。接下来，通过内部脚本将正确比对的配对读段合并成片段。然后在剪接感知模式下，使用STAR(v2.6.1a)将合并的片段与PERV靶序列重新比对。对于覆盖目的区域的每个片段，我们提取等位基因用于收集变体位点，以定义片段的单倍型。最后，通过计数覆盖目的区域的所有片段，得出单倍型的分布。
使用全基因组测序数据鉴定有效载荷整合位点
在剪接感知模式下，使用STAR(v2.6.1a)将配对的读段与由野猪11.1基因组、PERV单倍型和有效载荷质粒序列构成的参考库进行比对。使用Lumpy(v0.2.13)从BAM文件调用结构变体(SV)，以检测DNA融合点。接下来，我们筛选在整合位点处将猪基因组和有效载荷序列与错配读段桥接的SV。
统计分析
所有统计分析均通过R(v3.5.0)和Excel(v2016)执行。除非另外指明，否则p值<0.05是显著的。当同时涉及多个检验时，遵循Benjamini-Hochberg程序执行p值校正，以控制总体错误发现率(FDR)。除非另外指明，否则通常使用FDR<0.05。
实施例10：用人血灌注免疫相容性猪肝脏
用从猪2.0(4-7；3KO+12TG)分离的免疫学相容性猪肝脏进行肝脏灌注实验，作为异种移植的替代实验，用于分析器官功能。从12个月龄的猪分离野生型肝脏和4-7肝脏(大约80kg)。用人全血和人新鲜冰冻血浆(FFP)灌注肝脏。表1概述了简要的肝脏灌注方案。
表1
Figure BDA0003463330150000591
Figure BDA0003463330150000601
在不同时间点从肝脏收集胆汁并进行分析。如图28所示，与WT肝脏相比，4-7肝脏中总胆汁产量增加了大约2倍。此外，4-7肝脏显示出稳定的代谢酶血清水平，所述代谢酶是肝脏损害的标记，包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和白蛋白(ALB)(图29A-图29C)。此外，4-7肝脏显示出稳定的血清电解质水平，包括钾(K)和钠(Na)(图29D-图29E)。还测试了4-7和WT肝脏的补体(C3)表达，与WT肝脏相比，4-7肝脏中的补体(C3)表达以更高、更稳定的水平持续(图29F)。当分析凝血时，4-7肝脏显示出稳定的凝血酶原时间(PT)和国际标准化比率(PT-NIR)、纤维蛋白原水平(FIB)和较低的激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)(图30A-图30D)。综上所述，这些数据表明4-7肝脏具有改善的肝脏功能。
实施例11：猪到非人灵长类动物(NHP)肾移植
在2014年之前，最长的猪到非人灵长类动物(NHP)肾异种移植物为90天，移植物存活>30天是非常不寻常的。诱导和维持免疫抑制治疗方案的最新进展与具有靶向宿主先天性和适应性免疫应答的基因改变的供体猪的可用性增加相结合，已导致移植物存活延长至>125天(Higginbotham 2015,Iwase 2015b)。补偿免疫、凝血、补体和炎症反应途径中的分子不相容性的进一步基因工程正在开始推进异种移植领域。尽管通过基因修饰以产生GTKO并使一种hCRP过表达，但凝血功能障碍(包括血栓性微血管病和全身性消耗性凝血病)仍持续存在，这主要是由于猪与NHP之间的分子不相容性所致。
临床前肾移植研究。对于临床前肾移植研究，将在NHP中进行安全性和功效研究。对于安全性和功效检查，将来自8至10周龄猪2.0供体的肾脏移植到NHP(食蟹猴)接受者，所述接受者将在移植时经历双侧肾脏切除术。异种移植物功能将通过血清肌酐值、全血细胞计数和尿液蛋白质分析以及一系列活检以及体重和总体健康状况的检查来监测。免疫抑制将由临床相关试剂组成，其组合和强度是在同种异体移植中可接受的。这些将包括使用类固醇、抗NHP胸腺细胞球蛋白、抗CD20诱导治疗，以及使用类固醇、抗CD40、MMF和雷帕霉素维持免疫抑制。将给予预防性抗病毒、抗细菌和抗凝血疗法，并且将基于血细胞比容水平按需给予补充的Epogen。
预期六个月功能良好的异种移植物存活将提供足够功效证据，所述异种移植物存活是通过正常肌酐和不存在蛋白尿或低水平蛋白尿以及不含抗体或细胞介导的急性损伤的活检来指示。
通过与同种异体移植类比，预计预先形成的抗体介导的损伤的最大风险期将在移植后的最初几周内，并且急性细胞介导的排斥反应最有可能在移植后的前三个月内发生，此后风险逐渐降低(Cowan 2014)。
同种异体移植物排斥反应。根据2016年12月修订的指南草案“Source Animal,Product,Preclinical,and Clinical Issues Concerning the Use ofXenotransplantation Products in Humans”(FDA 2016)，存在异种移植产物的排斥反应可能使接受者易于排斥随后的异种移植产物或同种异体移植物的可能性(第IX.C.1.g节)。
将在临床前模型中使用体外抗体反应性和混合淋巴细胞反应(MLR)测定来表明异种移植后反应性的缺乏。为了测试对异种移植物的反应与对随后的同种异体移植物的反应之间可能的交叉反应性，将使用雄性NHP的血清进行流式细胞术交叉匹配，所述雄性NHP接受来自正常猪和如上所述的猪2.0供体的肾脏移植物。将测试血清对来自一组NHP供体的淋巴细胞以及对来自猪供体的淋巴细胞的反应性。对猪细胞的反应将证实已通过抗猪抗体水平的升高发生了异种敏化事件。将来自移植前NHP(首次实验的)的样品与排斥反应后样品进行比较，以评估抗体与NHP淋巴细胞组结合的变化。同时，将评价移植前和移植后(排斥反应后)NHP接受者T细胞对一组同种异体刺激物的直接和间接T细胞应答，以确定细胞介导的同种异体反应是否在异种移植排斥反应后被增强(Baertschiger 2004,Cooper 2004,Ye1995)。
预期将在异种与同种异体反应之间观察到至少低水平的交叉反应性。然而，在提出的试验中应考虑这些结果。对于肾脏试验，计划对高度敏化患者进行移植，所述患者由于不能鉴定合适的匹配而无法接受移植。适度的额外敏化不太可能改变接受后续同种异体移植的机会的可能。此外，T细胞敏化尚未被鉴定为再移植的重要障碍，并且因此可能无法在临床上进行监测(Baertschiger 2004,Cooper 2015)。因此，异种细胞介导的敏化似乎不可能阻碍同种异体移植物存活。
生物分布。供体细胞在接受者中迁移到远端组织/器官仍然是异种移植的可能结果。嵌合体研究表明，这可能实际上增加移植的成功率，降低排斥反应的可能性(Starzl1993,Vagefi 2015)。然而，猪供体细胞迁移可能会产生未知的后果，并且因此开发出策略来确定是否发生细胞迁移。根据FDA指导性文件(包括Source Animal,Product,Preclinical,and Clinical Issues Concerning the Use of XenotransplantationProducts in Humans，2016年12月(第IX.C.5节；FDA 2016年12月)、Gene TherapyClinical Trials-Observing Subjects for Delayed Adverse Events，2016年11月(第IV.B.2节；FDA 2016年11月)，和Preclinical Assessment of Investigational Cellularand Gene Therapy Products，2013年11月(第V.C.5.节；FDA 2013))中概述的原则，将生物分布作为猪-NHP异种移植研究的一部分进行研究。
致瘤性。SCNT和辅助生殖设施中包括的所有动物将被常规监测，用于寻找肿瘤发生的证据。被发现垂死或死亡的所有动物将由兽医病理学家进行完整的尸检以及肉眼和微观病理学检查。所有基因工程动物健康和病理的记录都将得到维护和汇编，以确定由于特定或非预期的基因修饰而引起致瘤性潜力的风险。
实施例12：猪到人肾的移植
肾异种移植已被研究了几十年，并且已在早期临床试验中评估了猪异种移植物(Starzl 1964)。挑战是使异种移植程序能够提供等同于同种异体移植物存活的临床益处。
临床研究设计。所提出的临床研究群体将包括年龄为18-65岁的患有终末期肾疾病的移植患者，他们由于存在高水平的群体反应性抗HLA抗体(PRA)而不可能及时找到合适的肾脏供体。高PRA在匹配合适的已故或活体供体方面带来了巨大挑战，导致移植的等待时间延长，以及血液透析额外年限导致的发病率增加。尽管在等待名单上分配了优先级，但与不那么敏感的患者相比，>90％的PRA患者仍经历明显延长的等待时间。将以具有>90％针对HLA抗原的PRA敏化且表现与猪供体淋巴细胞(或内皮细胞)的负流交叉匹配的受试者为目标。
患者将接受120±10克的猪供体肾脏，其提供40-50mL/min/1.73m2的预计肾小球滤过率(GFR)。来自9至12个月龄供体的单个猪肾脏将以与用于同种异体肾移植相同的方式移植到右侧或左侧髂窝。主要终点将是移植后摆脱血液透析持续一年。将通过针对肌酐水平、尿蛋白的连续血液测试以及使用MDRD方程计算GFR来评估患者：GFR(mL/min/1.73m2)＝175×(Scr)-1.154×(年龄)-0.203×(如果是女性，0.742)×(如果是非裔美国人，1.212)。将每三个月进行方案指定的移植物活检，并且原因是基于肌酐从基线上升>20％，定义为移植后第一个月中最佳的连续三次肌酐测量的平均值，或者尿蛋白大于300mg/天。安全性测量将包括监测凝血参数、临床化学、血液学和外来感染。
用于猪-人肾移植的器官。数据表明，猪肾脏通过肾脏重量表现出与人肾脏相似的功能效力，因此允许依据与临床上用于同种异体移植物相当的移植物和接受者重量进行肾脏移植。在人体中，同种异体肾移植物的移植是在肾脏重量与接受者重量的宽范围内进行的。平均而言，成年男性肾脏重量为125-170克，并且成年女性肾脏重量为115-155克(Boron2003)。在针对肾脏重量与接受者重量的比率考虑给药上限时，没有证据表明肾功能过剩以任何方式有害。相反，可移植肾质量的上限受技术问题的限制。例如，可以成功移植到10kg婴儿中的单个成人肾脏相当于12-17克肾脏/kg，这是平均成人的肾质量比(3-4克肾脏/kg；Donati-Bourne 2014)的大约3-4倍。这种移植物重量与接受者重量比率的上限与以下详述的所提出的临床前研究有关。在实验性临床前研究中，来自8至10周龄猪供体的50-75克肾脏将被移植到5-12kg NHP接受者中(约10克肾脏/kg)。
肾小球滤过率(GFR；mL/min/1.73m2)是肾功能或肾脏效力的标准量度，用于对符合透析和/或移植条件的慢性肾脏疾病(CKD)和肾衰竭的进展进行分期。在针对肾脏重量与接受者重量确定给药下限时，目标是实现45-60mL/min/1.73m2的GFR(CKD 3A期；Levey2011)。GFR的该目标范围是基于数据的，所述数据表明，CKD 3A中的肾功能与在人体中通过单肾脏同种异体移植所实现的肾功能相当并且是稳定的，而CKD 3B期中的较低GFR(GFR30-45mL/min/1.73m2)与终末期肾疾病以及全因和心血管疾病死亡率增加相关(Sharma2010)。45-60mL/min/1.73m2的目标GFR范围与在人体中通过单肾脏同种异体移植所实现的GFR范围(50-65mL/min/1.73m2；Gourishankar 2003，Marcén 2010)相当。
考虑到人和猪肾脏在每肾质量的GFR方面的可比性，这将要求异种移植的肾脏质量与同种异体移植中常规使用的肾脏质量(115-170克)相当。应考虑到，由于用呈钙神经素抑制剂形式的肾毒性免疫抑制治疗接受者，部分肾功能可能在捐献过程中和移植后丧失。
药理学和毒理学信息。将以啮齿动物和NHP模型两者使用药理学研究来评价功效和安全性。将使用多种综合安全性终点，以及在基因工程供体猪组织中对临床病理学和病理生理学的评估。将采取分层方法，其涉及体外细胞和组织功能，以及在供体猪和NHP异种移植物中对临床病理学和组织病理学的评估。终点将包括移植物功能和排斥反应，以及与先天性和适应性免疫、炎症以及补体和凝血级联有关的接受者安全性。
基因工程供体猪的体细胞核移植和辅助生殖。出于安全性考虑，将通过全临床病理学(包括临床化学和血液学以及肉眼和微观组织病理学)定期监测基因工程供体猪。将监测并记录育种集落内所有供体猪的生殖能力、胚胎-胎儿发育、器官和组织发育以及潜在的肿瘤发生。
通过用永久性墨水印刷的独特耳标(在原产地放置)来标识动物。猪的流动包括隔离区，所述隔离区是具有刨花垫层的露天群居式畜栏。饲料槽是木制的，并且保持干净，没有碎片和废物。随时可经由乳头式饮水器获得自由选择的淡水。畜栏依靠室外风运动来循环空气，并且温度保持在高于10℃。生物安全性要求至少24小时没有其他猪接触、特定的畜栏服装，以及在接触畜栏之前和之后在消毒剂中浸泡靴子。隔离期包括35-40天的隔离，用Parvo Shield L5E、FluSure XP/ER Bac Plus、Ingelvac FLEX组合(圆环病毒和真菌病毒)和Dectomax进行疫苗接种，并且包括2次抽血，表明疾病抗体(PRRSV、PRRSX3)没有增加。在从隔离区清除后，将猪转移到所述设施的缓冲区。这个区是一个封闭式畜栏的群居式具有锯屑垫层的畜舍，每组最多12头。每周更换垫层。温度由恒温器控制的风扇和丙烷加热器控制在15-24℃的范围内。猪是以不锈钢槽喂养的，并且可随时经由乳头式饮水器获得自由选择的淡水。每天至少一次以及根据健康状况指示对猪进行观察。
将观察到健康问题的猪圈养在单个畜舍中进行个性化护理和关注，并按照主治兽医和胚胎学主任的引导进行处理。生物安全性要求至少24小时不与其他猪群接触。在接触畜栏之前和之后，用Virkon-S或Synergize对仅限在畜栏区中使用的连身工作服和靴子进行消毒。用于临床研究的源供体猪的产生将遵循所有相关的指导和规定。
基因工程的验证。将在基因组、mRNA和蛋白质水平上验证内源性基因KO和人转基因表达。对于基因KO，将进行Sanger测序或深度测序以确认预期靶位点处的基因突变。其次，将进行RNA-seq和/或RT-PCR以确保mRNA含有预期的突变，并经受无义介导的衰变。将进行RT测定以表明在PERV KO细胞中消除了RT活性。此外，将进行免疫组织化学(IHC)染色和/或流式细胞术以确保细胞中或细胞表面处不存在基因产物。
尽管在精确基因编辑领域中取得了进展，但脱靶突变仍可能存在，并且必须理解所述脱靶突变以便产生用于临床异种移植的安全有效的供体器官。为了查明CRISPR-Cas9基因编辑的潜在脱靶效应，已采用以下多分层评估方法：
1.经修饰的细胞克隆的核型，用于确定染色体结构完整性；
2.CIRCLE-Seq：一种灵敏的体外筛选策略，其全面地检测任何给定gRNA的全基因组CRISPR-Cas9脱靶突变。潜在的脱靶位点将使用随后的靶向扩增子测序在来自特定gRNA的任何衍生细胞系中进行审查；
3.全基因组测序(WGS)：用于检查基因工程细胞系或猪的单点突变以及小结构变异。表2列出了所采用检测方法的分辨率和灵敏度。
表2
Figure BDA0003463330150000651
Figure BDA0003463330150000661
对于转基因表达，将使用测序、RT-PCR/RNA-seq和IHC/流式细胞术技术在基因组、mRNA和蛋白质水平上验证人转基因的完整性和表达。此外，将通过基于反向PCR的连接捕获确定随机转基因整合的位置，并将通过连接PCR验证结果。
将选择如下克隆：其中单拷贝转基因整合到距任何已知基因和ncRNA至少10,000bp，并且距任何癌基因和肿瘤抑制因子至少50,000bp的基因间区域中。对于位点特异性整合和内源性基因人源化，将通过连接PCR和液滴数字式PCR(ddPCR)验证双等位基因位点特异性整合/替代。
实施例13：非人灵长类动物(NHP)肾移植
临床前移植研究。对于临床前移植研究，在NHP中进行了安全性和功效研究。将来自8-10周龄猪2.0供体的心脏、肾脏和肝脏用于移植的实体器官研究，并将肝脏和肺用于灌注器官研究。在5个月的跨度中，进行了15次器官移植和11次器官灌注。具体地，进行了7次肾脏移植、4次心脏移植、4次肝脏移植，同时进行了4次肝脏灌注和7次肺灌注，如表3中所汇总。
表3
Figure BDA0003463330150000662
肾脏移植的免疫抑制方案由临床相关试剂组成，其组合和强度是在同种异体移植中可接受的。临床监测包括：在第2、5、7、9、12和14天进行腹部超声检查，并在第2、5、7、9、12和14天以及每周进行临床实验室检查(CBC、Chem 17、凝血筛查、血清)。
分析了来自猪2.0供体和对照猪(GTKO.hCD55)的经移植肾脏的存活。表4提供了结果的总结。
表4
猪ID 供体品系 肾脏移植物存活(天)
33-7 GTKO.hCD55 15(aCD40)
32-2 GTKO.hCD55 11(aCD40)
53-5 GTKO.hCD55 76(aCD40L)
53-1 GTKO.hCD55 93(aCD40L)
1839 9 存活>190(aCD40L)
1841 9 20(aCD40L)
1844 9 72(aCD40L)
1848 9 15(aCD40L)
1850 9 6(aCD40L)
A10169 10M 2(aCD40L)
9956 10M 存活>30(aCD40L)
GTKO.hCD55猪肾脏的两个最长存活接受者存活直到第76天和第93天，此时它们分别由于肾衰竭和体重减轻而被安乐死。在这两者中，一者被发现患有血栓性微血管病(TMA)、慢性抗体介导的排斥反应(AMR)和临界性T细胞介导的排斥反应(TCMR)；而另一者具有C4d沉积，但原本没有明显排斥反应的组织学证据。其余七名接受者接受了来自猪2.0的肾脏。在这些猪中，调节免疫应答或补体激活的经转导人蛋白以高水平表达。这些经基因修饰的猪肾脏的NHP接受者在进行用于肾脏移植的免疫抑制方案的情况下存活>190、72、20、15和6天。
一名接受者目前在进行用于肾脏移植的免疫抑制方案的第190天表现良好，肾脏功能正常(肌酐0.6mg/dl)。多次活检未显示排斥反应或TMA的证据。
这些数据一起表明，在最小维持免疫抑制下实现具有三重异种抗原KO的肾脏异种移植物的长期存活，所述异种移植物具有编码先天性反应和补体途径中调节蛋白的人基因的多重转导，且无排斥反应或TMA。
猴子的健康受损导致了数只异种移植猴子的提前终止。并发症包括输血、注射部位脓肿和感染、创伤愈合。一些病例出现膀胱和/或输尿管出血，可能是由于过度抗凝所致。表5提供了猪2.0移植物的总结。
表5
Figure BDA0003463330150000681
对移植有从有效载荷9(A)和有效载荷10(B)供体猪分离的肾脏的宿主猴子的分析表明，宿主表现出稳定的血清肌酐水平(图32A和图32B)。几只宿主猴子还表现出稳定的或恢复的血细胞比容水平(图33A和图33B)。血小板计数在一些宿主猴子中是低的，但在其他宿主猴子中已恢复(图34A和图34B)。WBC的波动反映了免疫抑制方案和感染事件(图35A和图35B)。
肝脏异种移植。直到最近，猪到狒狒原位肝脏异种移植(OLTx)存活仍限于9天。给予人凝血因子使两名GTKO肝脏接受者的存活延长至25天和29天，但持续的存活仍难以确定。
在这里，进行了四个猪到狒狒OLTx。肝脏来自转基因猪的两个基因构建体，所述基因构建体缺乏异种抗体的靶标，并且含有人转基因以解决补体激活和先天性免疫细胞功能(第1组：B1、B2；第2组：B3、B4)。免疫抑制由ATG、利妥昔单抗、皮质类固醇、MMF和aCD154组成。所有接受者均接受了KCentra输注。与先前的研究不同，未进行脾切除术，并省略了眼镜蛇毒因子和他克莫司。B2和B4接受了GpIIb/IIIa抑制剂的连续输注。用每日化学、乳酸盐，CBC、INR和每周凝血概况评估移植物功能。
狒狒B1、B2和B4成功经历了具有维持生命移植功能的OLTx。LFT在所有狒狒中在POD1均达到峰值，并在POD4-7之间归一化(图38A-图38B)。每只狒狒表现出血小板减少症，且在B2中于POD8以及在B4中于POD4开始自发恢复(图38C)。输血要求(图38D)少于历史经验。凝血因子在OLTx之后立即发生消耗，随后以正常猪水平产生(图38E-图38I)。B1在POD8由于体液潴留和腹腔室隔综合征导致的呼吸衰竭而被安乐死。肝脏活检显示局灶性缺血、无排斥反应和阴性C4d(图38A-图38B)。B2顺利地恢复，并且在POD8的活检是正常的。咯血的发展和输血需求的增加，使得需要在POD14进行安乐死。尸检鉴定为肺出血。肝脏的H+E染色表现出弥漫性窦状嗜中性粒细胞浸润，表明感染并发症与排斥反应，B2为C4阴性，并且LFT自始至终保持正常(图38C-图38D)。B3在再灌注后出现术中低血压和低血氧，需要安乐死。尸检显示弥漫性肺出血，同时肝脏正常且脉管通畅。B4顺利地恢复。仅需要一次术后输血。在POD7，Tbili和LFT的上升促使了探索，其中鉴定出胆汁泄漏和肝动脉血栓形成(HAT)，需要安乐死。活检显示局灶性包膜下坏死和阴性C4d,且无排斥反应的证据，与HAT一致(图38E-图38F)。
使用新型经基因修饰的猪器官的OLTx的这些数据一起表明：减少的再灌注损伤，减少的RBC消耗，以及首次在不进行脾切除术或不使用CVF的情况下无抗体介导的排斥反应的存活。不存在明显的排斥反应表明，这种猪品系适合于进一步的OLTx研究。
肝脏异种灌注。成功进行异种猪肝脏移植的障碍包括预先形成的异种抗体的超急性排斥反应、导致补体失调的分子不相容性、凝血以及先天性和适应性免疫。经基因修饰的猪可以避开这些障碍，并且将需要快速有效的模型来评价不同基因构建体的有效性。在这里，使用以人血液和血浆(hWB+P)灌注的野生型(WT)和经基因修饰的猪肝脏的离体肝脏异种灌注(EVLXP)报告初步结果。
简而言之，研究了来自猪2.0(EG组，n＝3)、WT(n＝2)和GTKO.hCD55(n＝4)肝脏的肝脏。在37℃下用新鲜的肝素化hWB+P进行EVXLP。EVXLP期间的失败被定义为由于血管阻力升高、严重代谢紊乱或严重坏死引起的血流减少。进行了CBC、血清临床化学和血气分析。将组织活检用H+E并针对IgG、IgM和补体的沉积(C4d)染色。
所有组均表现出进行性血流减少，同时血管阻力相应上升。与EG肝脏相比，WT和GTKO.CD55中的血流动力学恶化更早发生并且进展更快(图39A-图39B)，并且与更长的EG肝脏存活相关。WT的平均肝脏存活为5小时(范围为5-7小时)，GTKO.CD55为4.5小时(范围为4-6小时)并且在EG肝脏中为13小时(范围为11-14小时)。在所有组中，血小板和嗜中性粒细胞快速减少，其中对WT观察到最大的损失，但差异未达到统计学显著性(图39C-图39D)。RBC计数对于EG在整个灌注过程中被保持，并显著高于WT肝脏，并且倾向于高于GTKO.CD55(图39E)。
EG肝脏组织活检基于H+E表现出保留的肝构造，伴有轻度弥漫性门脉和窦状炎症(图41A)。WT肝脏基于H+E表现出局灶性缺血性坏死和淤血(图41E)，伴有针对IgM和IgG的强染色(图41F-图41G)和C4d阳性(图41H)。相比之下，EG肝脏显示出弥漫性轻度窦状IgG和IgM沉积(图41B-图41C)，伴有阴性C4d(图41D)，这可能表明预先形成的抗原的减少和通过增加人补体调节蛋白表达来改善补体调节导致了较少的损伤。
与WT或GTKO.CD55异种移植物相比，缺乏异种特异性抗原并含有与补体激活和免疫细胞功能相关的人源化转基因的来自转基因猪的异种肝脏实现了显著延长的存活，以及不太严重的血小板封存、保持的RBC质量以及减少的抗体和补体沉积。此模型是模拟猪到人异种移植并评价特定基因修饰的功效的有效信息工具。
肺异种灌注。用人血进行离体肺灌注是评价转基因组合的影响的标准化方法。在这里报告了在参考群组的情况下评价的与新颖转基因猪系相关的结果。
简而言之，用新鲜收集的肝素化人血离体灌注来自猪的八对肺，所述猪具有组合的Gal1,3αGal、β4Gal和Neu5Gc敲除(TKO)，并且含有解决补体激活中的分子不相容性以及先天性和适应性免疫细胞功能的人转基因。GalTKO.hCD55肺作为参考组。在来自每头猪的成对肺中，使血液保持“未被处理”(对于猪2.0，n＝5，且对于参考，n＝3)，或者血液被1-BIA(一种血栓素合酶抑制剂和组胺受体阻滞剂)“处理”(对于猪2.0，n＝7；对于参考，n＝4)。在预定时间点收集组织和血液样品，并且如果肺没有提前衰竭，则在灌注8小时后选择性地终止实验。
猪2.0肺的中位存活时间在未处理组中为450min(范围为300-480min)与参考肺的30min(范围为20-300min)(P＝0.04)，并且在经处理群组中为480min(范围为360-480min)与300min(范围为145-360min)(P＝0.009)。相对于GalTKO.hCD55肺，‘未处理’猪2.0肺中的肺血管阻力(PVR)上升明显减弱和延迟(图42)。在猪2.0和参考组两者中，使用1-BIA和H-阻滞剂的另外的血液处理减弱了PVR上升。嗜中性粒细胞和血小板封存通常发生在灌注的5-15min内，并且与猪2.0多转基因肺相关未减弱。
这些数据表明，新颖猪2.0供体遗传学保护肺免受PVR上升和肺损伤的影响，并且在此严格模型中与显著改善的肺存活相关。如先前关于其他肺遗传学所描述，白细胞(Leukocyte)和白细胞(white cell)封存并没有被阻止。由猪2.0肺表达的转基因组合可能有助于成功完成肺和其他器官的异种移植。
转基因表达。RNAseq表达数据显示补体和细胞毒性基因在从有效载荷9和有效载荷10猪2.0猪收集的样品中表达(图36)。FACS数据显示补体和细胞毒性蛋白在从有效载荷5、有效载荷9和有效载荷10猪收集的样品中表达(图37)。所有三个有效载荷均表达补体(CD46、CD55和CD59)和细胞毒性相关蛋白(例如，B2M、HLA-E、CD47)。此外，有效载荷5表达CD39，而有效载荷10表达PDL1。尽管在NHP中的表现差异很大，但在五头携带有效载荷5的猪之间基因表达谱是相似的。
除非另外明确指出，否则在本申请中指定的数值的使用表述为在规定范围内指定的最小值和最大值的近似值，并且放在单词“约”之后。范围的公开文本旨在作为连续的范围，包括所列举的最小值与最大值之间的每个值以及可以通过此类值形成的任何范围。本申请中提出的数值表示本公开文本的各种实施方案。
本公开文本并不旨在穷举或将本技术限制为本文公开的精确形式。尽管出于说明性目的本文公开了特定实施方案，但如相关领域的普通技术人员将认识到的，在不脱离本技术的情况下，各种等效修改是可能的。在一些情况下，未详细示出和/或描述熟知的结构和功能，以避免不必要地使本技术的实施方案的描述模糊。尽管方法的步骤可以以特定顺序在本文中呈现，但在替代实施方案中，所述步骤可以具有另一种合适的顺序。类似地，在特定实施方案的情况下公开的本技术的某些实施方案可以在其他实施方案中被组合或消除。此外，虽然与某些实施方案相关的优点可能已在那些实施方案的情况下公开了，但其他实施方案也可以表现出此类优点，并且并非所有实施方案都需要表现出此类优点或本文公开的其他优点，以落入本技术的范围内。因此，本公开文本和相关技术可以涵盖本文未明确示出和/或描述的其他实施方案。
根据上述内容应了解，本公开文本的特定实施方案已出于说明目的在本文中描述，但可以在不背离本公开文本的范围的情况下进行各种修改。因此，除了所附权利要求书外，本公开内容不受限制。
虽然已讨论了主题公开文本的多个具体实施方案，但是以上说明书是说明性的并且不是限制性的。通过回顾本说明书和以下权利要求，本公开文本的多种变型对于本领域的技术人员而言将变得明显。应通过参考权利要求、连同它们的等效物的全部范围、以及说明书、连同此类变化，确定本公开文本的全部范围。
缩写
急性血管排斥反应(AVR)；激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)；腺相关病毒整合位点1(AAVS1)；丙氨酸转氨酶(ALT)；白蛋白(ALB)；α1,3-半乳糖基-半乳糖(Gal或αGal)；抗体介导的排斥反应(AMR)；抗胸腺细胞球蛋白(ATG)；脱唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)；天冬氨酸转氨酶(AST)；β1,4N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(B4GalNT2)；β-2微球蛋白(B2M)；分化簇39(CD39)；分化簇47(CD47)；成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)；II类反式激活显性负性(CIITA-DN)；CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)；补体因子3(C3)；补体因子3敲除(C3-KO)；全血细胞计数(CBC)；C-X-C基序趋化因子受体3(CXCR3)；C-X-C基序趋化因子受体12(CXCR12)；胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)；细胞毒性T淋巴细胞相关免疫球蛋白(CTLA-Ig)；脱氧核糖核酸(DNA)；DQα(DQA)；DRα(DRA)；液滴数字式pCR(ddPCR)；外-5'核苷酸酶(CD73)；延伸因子1α(EF1α)；内皮细胞(EC)；内皮蛋白C受体(EPCR)；离体肝脏异种灌注(EVLXP)；Fas配体(FasL)；纤维蛋白原水平(FIB)；荧光激活细胞分选(FACS)；新鲜冷冻血浆(FFP)；绿色荧光蛋白(GFP)；肾小球滤过率(GFR)；胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)；糖蛋白IIb/IIIa(GpIIb/IIIa)；糖蛋白α-半乳糖基转移酶1(GGTA)；GGTA敲除(GTKO)；指导核糖核酸(gRNA)；苏木精和曙红(H+E)；肝动脉血栓形成(HAT)；人胚胎肾脏293(HEK293)；血红素加氧酶(HO-1)；同源定向修复(HDR)；人血液和血浆(hWB+P)；人膜辅因子蛋白(hCD46)；人补体衰变加速因子(hCD55)；人补体调节蛋白(hCRP)；人白细胞抗原(HLA)；人白细胞抗原-E(HLA-E)；人MAC抑制因子(hCD59)；免疫球蛋白G(IgG)；酿脓链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)；免疫球蛋白M(IgM)；免疫组织化学(IHC)；肌苷单磷酸脱氢酶(IMDH)；白介素12(IL12)；白介素35(IL35)；国际标准化比率(INR)；细胞内粘附分子-2(ICAM2)；杀伤抑制受体(KIR)；敲入(KI)；敲除(KO)；Krüppel相关盒(KRAB)；肝脏功能测试(LFT)；长末端重复序列(LTR)；主要组织相容性复合物I类(MHC I类)；主要组织相容性复合物II类(MHC II类)；主要组织相容性复合物I类E单链三聚体(HLA-ESCT)；雷帕霉素(mTOR)的机制性靶标；信使核糖核酸(mRNA)；肾病饮食改进(MDRD)；混合淋巴细胞反应(MLR)；霉酚酸酯(MMF)；自然杀伤(NK)；N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)；神经源性分化1(NeuroD)；非人灵长类动物(NHP)；非同源末端连接(NHEJ)；原位肝脏异种移植(OLTx)；群体反应性抗体(PRA)；外周血单核细胞(PBMC)；猪肾脏-15细胞(PK15)；猪内源性逆转录病毒(PERV)；猪内源性逆转录病毒敲除(PERV KO)；程序性死亡配体1(PD-L1)；聚合酶链反应(PCR)；猪主动脉内皮细胞系(PEC-A或pAEC)；钾(K)；凝血酶原时间(PT)和国际标准化比率(PT-NIR)；定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)；重组酶介导的盒交换(RMCE)；红细胞(RBC)；核糖核酸测序(RNAseq)；逆转录聚合酶链反应(RT-PCT)；sgRNA(单指导RNA)；小干扰核糖核酸(siRNA)；钠(Na)；体细胞核移植(SCNT)；超氧化物歧化酶3(SOD3)；猪白细胞抗原(SLA)；T细胞介导的排斥反应(TCMR)；凝血酶-抗凝血酶III(TAT)；血栓调节蛋白(THBD、TBM或TM)；血栓性微血管病(TMA)；组织因子途径抑制剂(TFPI)；拓扑异构酶(TOPO)；总胆红素(Tbili)；转录激活因子样(TAL)效应子和核酸酶(TALEN)；肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(A20)；肿瘤坏死因子受体1免疫球蛋白(TNFR1-Ig)；泛在染色质开放元件(UCOE)；血管性血友病因子(vWF)；全基因组测序(WGS)；野生型(WT)；锌指核酸酶(ZFN)。
参考文献
·Ahlborg et al.N Engl J Med 349(4):327-334(July 24,2003)(PMID:12878739；DOI:10.1056/NEJMoa022464)
·Armstrong et al.J Gen Virol 10(2):195–198(Feb.1971)(PMID:4324256；DOI:10.1099/0022-1317-10-2-195)
·Baertschiger et al.Xenotransplantation 11(1):27-32(Jan.2004)(PMID:14962290；DOI:10.1111/j.1399-3089.2004.00075.x)
·Boron&Boulpaep,Medical Physiology:A Cellular and MolecularApproach,Elsevier/Saunders(1st ed.,2003)
·Byrne et al.Xenotransplantation 21(6):543-554)(Nov-Dec.2014)(PMID:25176027；DOI:10.1111/xen.12124)
·Cibelli et al.Science 280(5367):1256-1258(May 22,1998)(PMID:9596577)
·Clémenceau et al.Diabetologia 45(6):914-923(June 2002)(PMID:12107737；DOI:10.1007/s00125-002-0832-7)
·Cooper et al.Transplantation 77(1):1-5(Jan.15,2004)(PMID:14724427；DOI:10.1097/01.TP.0000105116.74032.63)
·Cooper et al.Int J Surg 23(Pt B):211-216(Nov.2015)(PMID:26159291；DOI:10.1016/j.ijsu.2015.06.068)
·Cowan et al.Kidney Int 85(2):265-275(Feb.2014)(PMID:24088952；DOI:10.1038/ki.2013.381)
·Davis et al.Transplantation 98(9):931-936(Nov.15,2014)(PMID:25286057；DOI:10.1097/TP.0000000000000446)
·Donati-Bourne et al.J Transplant 204:317574(2014)(PMID:24688785；DOI:10.1155/2014/317574)
·Dunn et al.FASEB J 29(Suppl 1):LB761(Apr.1,2015)
·Eggers Am J Kidney Dis 15(5):414-421(May 1990)(PMID:2185627)
·Ekser et al.Int J Surg 23(Pt B):197-198(Nov.2015)(PMID:26318503；DOI:10.1016/j.ijsu.2015.08.036)
·FDA Guidance for Industry:Source Animal,Product,Preclinical,andClinical Issues Concerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans(Apr.2003,revised Dec.2016)
·FDAGuidance for Industry:Gene Therapy Clinical Trials–ObservingSubjects for Delayed Adverse Events(Nov.2006)
·FDA Guidance:Preclinical Assessment of Investigational Cellular andGene Therapy Products(Nov.2013)
·Fiebig et al.Virology 307(2):406-413(Mar.15,2003)(PMID:12667808)
·Fischer et al.Sci Rep 6:29081(Jun 29,2016)(PMID:27353424；DOI:10.1038/srep29081)
·Gourishankar et al.J Am Soc Nephrol 14(9):2387-2394(Sept.2003)(PMID:12937318)
·Grams et al.Transplantation 94(7):750-756(Oct.15,2012)(PMID:22932116；DOI:10.1097/TP.0b013e31826205b9)
·Higginbotham et al.Xenotransplantation 22(3):221-230(May-June 2015)(PMID:25847130；DOI:10.1111/xen.12166)
·Ide et al.Proc Natl Acad Sci USA 104:5062-5066(2007)
·Iwase et al.Xenotransplantation 22(4):302-309(Jul-Aug.2015)(PMID:26130164；DOI:10.1111/xen.12174)
·Iwase&Kobayashi Int J Surg 23(Pt B):229-233(Nov.2015)(PMID:26305729；DOI:10.1016/j.ijsu.2015.07.721)
·Kasiske et al.Am J Kidney Dis 56(5):947-960(Nov.2010)(PMID:20801565；DOI:10.1053/j.ajkd.2010.06.020)
·Kim et al.Genome Res 24(6):1012-1019(June 2014)(PMID:24696461；DOI:10.1101/gr.171322.113)
·Kim et al.Am J Transplant 17 Suppl 1:174-251(Jan.2017)(PMID:28052604；DOI:10.1111/ajt.14126)
·Lai et al.Science 295(5557):1089-1092(Feb.8,2002)(PMID:11778012；DOI:10.1126/science.1068228)
·Lee et al.Anim Biotechnol 22(4):175-180(Oct.2011)(PMID:22132811；DOI:10.1080/10495398.2011.595294)
·Levey et al.Kidney Int 80(1):17-28(July 2011)(PMID:21150873；DOI:10.1038/ki.2010.483)
·Lilienfeld Xenotransplantation 14(2):126-134(Mar.2007)(PMID:17381687；DOI:10.1111/j.1399-3089.2007.00378.x)
·Loveland et al.Xenotransplantation 11(2):171-183(Mar.2004)(PMID:14962279；DOI:10.1046/j.1399-3089.2003.00103.x)
·Lutz et al.Xenotransplantation 20(1):27-35(Jan-Feb.2013)(PMID:23384142；DOI:10.1111/xen.12019)
·Marcén et al.NDT Plus 3(Suppl_2):ii2-ii8(June 2010)(PMID:20508857；DOI:10.1093/ndtplus/sfq063)
·Martens et al.Transplantation 101(4):e86-e92(Apr.2017)(PMID:28114170；DOI:10.1097/TP.0000000000001646)
·McGregor et al.Transplantation 93(7):686-692(Apr.15,2012)(PMID:22391577；DOI:10.1097/TP.0b013e3182472850)
·Moalic et al.J Virol 80(22):10980-10988(Nov.2006)(PMID:16928752；DOI:10.1128/JVI.00904-06)
·Mohiuddin et al.Nat Commun 7:11138(Apr.5,2016)(PMID:27045379；DOI:10.1038/ncomms11138)
·Niu et al.Science 357(6357):1303-1307(Sept.22,2017)(PMID:28798043；DOI:10.1126/science.aan4187)
·Ojo et al.Transplantation 71(1):82-90(Jan.15,2001)(PMID:11211201)
·Patience et al.Nat Med 3(3):282-286(Mar.1997)(PMID:9055854)
·Patience et al.J Virol 75(6):2771-2775(Mar.2001)(PMID:11222700；DOI:10.1128/JVI.75.6.2771-2775.2001)
·Pinheiro et al.Anal Chem 84(2):1003-1011(Jan.17,2012)(PMID:22122760；DOI:10.1021/ac202578x)
·Ramsoondar et al.Xenotransplantation 16(3):164-180(May-June 2009)(PMID:19566656；DOI:10.1111/j.1399-3089.2009.00525.x)
·Reyes et al.J Immunol 193(11):5751-5757(Dec.1,2014)(PMID:25339675；DOI:10.4049/jimmunol.1402059)
·Robson et al.Xenotransplantation 7(3):166-176(Aug.2000)(PMID:11021661)
·Schuurman Xenotransplantation 16(4):215-222(July-Aug.2009)(PMID:19799761；DOI:10.1111/j.1399-3089.2009.00541.x)
·Semaan et al.Xenotransplantation 19(2):112-121(Mar-Apr 2012)(PMID:22497513；DOI:10.1111/j.1399-3089.2012.00683.x)
·Semaan et al.PLoS One 10(4):e0122059(Apr.24,2015)(PMID:25909512；DOI:10.1371/journal.pone.0122059)
·Sharma et al.Br J Gen Pract 60(575):e266-e276(June 2010)(DOI:10.3399/bjgp10X502173)
·Shen et al.Transplant Proc 43(5):1994-1997(June 2011)(PMID:21693314；DOI:10.1016/j.transproceed.2011.03.037)
·Starzl et al.Transplantation 2:752-756(Nov.1964)(PMID:14224657)
·Starzl et al.Hepatology 17(6):1127-1152(June 1993)(PMID:8514264)
·Tanabe et al.Am J Transplant 17(7):1778-1790(July 2017)(PMID:28117931；DOI:10.1111/ajt.14210)
·Tseng et al.Transplantation 81(7):1058-1062(Apr.15,2006)(PMID:16612284；DOI:10.1097/01.tp.0000197555.16093.98)
·Vagefi et al.Int J Surg 23(Pt B):291-295(Nov.2015)(PMID:26296932；DOI:10.1016/j.ijsu.2015.07.720)
·van’t Veer et al.J Biol Chem 272(12):7983-7994(Mar.21,1997)(PMID:9065469；DOI:10.1074/jbc.272.12.7983)
·Wang et al.Sci Rep 6:38854(Dec.16,2016)(PMID:27982048；DOI:10.1038/srep38854)
·Yang et al.Nucleic Acids Res 41(19):9049-9061(Oct.2013)(PMID:23907390；DOI:10.1093/nar/gkt555)
·Yang et al.Science 350(6264):1101-1104(Nov.27,2015)(PMID:26456528；DOI:10.1126/science.aad1191)
·Ye et al.Transplantation 60(1):19-22(July 15,1995)(PMID:7624938)
Figure BDA0003463330150000781
Figure BDA0003463330150000791
Figure BDA0003463330150000801
Figure BDA0003463330150000811
Figure BDA0003463330150000821
Figure BDA0003463330150000831
Figure BDA0003463330150000841
Figure BDA0003463330150000851
序列表
<110> E开创生物技术股份有限公司
杭州启函生物科技有限公司
<120> 具有一个或多个用于增强异种移植物存活和/或耐受性的经修饰基因的细胞、组织、器官和/或动物
<130> EGEN-037/00W0
<150> PCT/CN2019/112039
<151> 2019-10-18
<150> PCT/CN2019/112038
<151> 2019-10-18
<150> PCT/CN2019/087314
<151> 2019-05-16
<150> PCT/CN2019/087310
<151> 2019-05-16
<160> 356
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
tcaacacaaa catatctttg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
tgtttgtgtt gatacgtcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
gaaactgact aggatccatg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
ctcagtgggt taactatccg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
tctcacctgt gaagcctgcg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
cacagtgact tgggccacta 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
tctcacctgt gaagcctgcg cgg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
cacagtgact tgggccacta ggg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
tcctcctgca gtcactgtga tgg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
ggtgcccccc acagaaggcc cgg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
cagccccacc acaccctacg agg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
cttcttctgc agcaaacttc tgg 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
cggctctgac aagctgtccg agg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
cgaggccctg aaggtcttcg tgg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
ctcccagaag cacatccgcg tgg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
ccacgcctac atctcgctcc agg 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
gaaagcggcc ctcggagctg cgg 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
cgccagccag gtgaagtacg cgg 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
cgaggtggct tccatcagcg agg 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
tacacgctct tccaaatctt tgg 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
ccgtatagcc ctgctgctca tgg 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
cagccaggag ccacgccggc tgg 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
gaacttggcc cgctacctcc agg 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
gaagaaggtc accgtgattc cgg 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
gatccgcctc atcgagaagc agg 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
cccggagaac aaagcctttg tgg 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
ctacctctgc gacctcgccc cgg 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
ccctacgcgg cgccccctag tgg 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
actgtggcgc ctgagctccc cgg 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
gctcgaaccc aagaagagaa tgg 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
atcacagtga ctgcaggagg agg 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
cggttccgcg caggcttcac agg 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
ctgaccgggc cttctgtggg ggg 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
cctcctcgta gggtgtggtg ggg 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
aagtcgtgca gcggcggctc tgg 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
agccgtccag caggaagacc agg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
cagggcctcg aagtcggcct cgg 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
tgtgcttctg ggagatgtgc agg 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
ggtactccac caccgccacg cgg 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
ctggagcgag atgtaggcgt ggg 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
gcagctccga gggccgcttt cgg 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
gcccgcgtac ttcacctggc tgg 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
gtacttcaaa acctcgctga tgg 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
ggtcgaccct gccaaagatt tgg 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
agggctatac gggaggcttc ggg 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
cagccggcgt ggctcctggc tgg 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
gaggtagcgg gccaagttct ggg 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
cggtgacctt cttcttcttc agg 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
acgtggggtc cgatgcccac cgg 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
cgatgaggcg gatctgcttg agg 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
cacaaaggct ttgttctccg ggg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
cttccggggc gaggtcgcag agg 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
agggggcgcc gcgtaggggc ggg 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
ctcaggcgcc acagtgactt ggg 23
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
gttcgagcgt tgaaaccccg ggg 23
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
atccaagacc attctcttct tgg 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
accatcacag tgactgcagg agg 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
gacaccatca cagtgactgc agg 23
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 59
ctgtgaagcc tgcgcggaac cgg 23
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
ggggggcacc ggttccgcgc agg 23
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
agggtgtggt ggggctgacc ggg 23
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
gaaccggtgc cccccacaga agg 23
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
gggccttctg tggggggcac cgg 23
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
gctgaccggg ccttctgtgg ggg 23
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 65
tcctcctcgt agggtgtggt ggg 23
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 66
ggctgaccgg gccttctgtg ggg 23
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 67
gtcctcctcg tagggtgtgg tgg 23
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 68
gggctgaccg ggccttctgt ggg 23
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 69
cgtgtcctcc tcgtagggtg tgg 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 70
ggggctgacc gggccttctg tgg 23
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 71
tagggtgtgg tggggctgac cgg 23
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 72
tctggcgtgt cctcctcgta ggg 23
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 73
cagaagaagt cgtgcagcgg cgg 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 74
ctctggcgtg tcctcctcgt agg 23
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 75
ctgcagaaga agtcgtgcag cgg 23
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 76
ctgcagcaaa cttctggacc tgg 23
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 77
tctggacctg gtcttcctgc tgg 23
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 78
gacctggtct tcctgctgga cgg 23
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 79
gctgtccgag gccgacttcg agg 23
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 80
ggtcttcgtg gtgggcatga tgg 23
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 81
gcttgtcaga gccgtccagc agg 23
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
ggccgacttc gaggccctga agg 23
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
gaccttcagg gcctcgaagt cgg 23
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 84
gcccaccacg aagaccttca ggg 23
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
ggccctgaag gtcttcgtgg tgg 23
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
gccctgaagg tcttcgtggt ggg 23
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
tgcccaccac gaagaccttc agg 23
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
cgccacgcgg atgtgcttct ggg 23
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 89
tgtaggcgtg ggagccgtcg tgg 23
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 90
ccgagggccg ctttcggtcc tgg 23
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 91
ccagaagcac atccgcgtgg cgg 23
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 92
gaagcacatc cgcgtggcgg tgg 23
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 93
gcacatccgc gtggcggtgg tgg 23
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 94
gcggtggtgg agtaccacga cgg 23
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 95
tctcgctcca ggaccgaaag cgg 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 96
gctgcggcgc atcgccagcc agg 23
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 97
gaagtacgcg ggcagcgagg tgg 23
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
tcggtcctgg agcgagatgt agg 23
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 99
gcgatgcgcc gcagctccga ggg 23
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 100
cgctgcccgc gtacttcacc tgg 23
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 101
ggcgatgcgc cgcagctccg agg 23
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
gccagccagg tgaagtacgc ggg 23
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
ggtgaagtac gcgggcagcg agg 23
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
cgctcttcca aatctttggc agg 23
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 105
gctcttccaa atctttggca ggg 23
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
aaatctttgg cagggtcgac cgg 23
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 107
ctatacggga ggcttcgggc cgg 23
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 108
ctggctggcc atgagcagca ggg 23
<210> 109
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 109
aagttctggg ccagccggcg tgg 23
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 110
cttcaggccc tggaggtagc ggg 23
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 111
tccgatgccc accggaatca cgg 23
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 112
atctgcttga ggctgacgtg ggg 23
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 113
gggcctgctt ctcgatgagg cgg 23
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 114
gtccacaccg ctgaccacaa agg 23
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 115
cagggctata cgggaggctt cgg 23
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 116
gagcagcagg gctatacggg agg 23
<210> 117
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 117
catgagcagc agggctatac ggg 23
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 118
cctgctgctc atggccagcc agg 23
<210> 119
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 119
acgccggctg gcccagaact tgg 23
<210> 120
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 120
ccagggcctg aagaagaaga agg 23
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 121
accgtgattc cggtgggcat cgg 23
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 122
tggccagcca ggagccacgc cgg 23
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 123
gggccagccg gcgtggctcc tgg 23
<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 124
gggccaagtt ctgggccagc cgg 23
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 125
tcttcttctt caggccctgg agg 23
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 126
ggaggtagcg ggccaagttc tgg 23
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 127
aacttggccc gctacctcca ggg 23
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 128
tcttcaggcc ctggaggtag cgg 23
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 129
gaaggtcacc gtgattccgg tgg 23
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 130
aaggtcaccg tgattccggt ggg 23
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 131
gatctgcttg aggctgacgt ggg 23
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 132
ccggggcctg cttctcgatg agg 23
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 133
ggatctgctt gaggctgacg tgg 23
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 134
aacaaagcct ttgtggtcag cgg 23
<210> 135
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 135
accacaaagg ctttgttctc cgg 23
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 136
agcctttgtg gtcagcggtg tgg 23
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 137
ggtcagcggt gtggacgagc tgg 23
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 138
cggaagtgcc cgcccctacg cgg 23
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 139
cctagtggcc caagtcactg tgg 23
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 140
gggcgggcac ttccggggcg agg 23
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 141
cagtgacttg ggccactagg ggg 23
<210> 142
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 142
gttgaaaccc cggggagctc agg 23
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 143
tccaagacca ttctcttctt ggg 23
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 144
cgtaggggcg ggcacttccg ggg 23
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 145
gcgtaggggc gggcacttcc ggg 23
<210> 146
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 146
cgcgtagggg cgggcacttc cgg 23
<210> 147
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 147
tagggggcgc cgcgtagggg cgg 23
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 148
cactaggggg cgccgcgtag ggg 23
<210> 149
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 149
gccactaggg ggcgccgcgt agg 23
<210> 150
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 150
gctcaggcgc cacagtgact tgg 23
<210> 151
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 151
acagtgactt gggccactag ggg 23
<210> 152
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 152
ctgtggcgcc tgagctcccc ggg 23
<210> 153
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 153
tgtggcgcct gagctccccg ggg 23
<210> 154
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 154
ggttcgagcg ttgaaacccc ggg 23
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 155
gggttcgagc gttgaaaccc cgg 23
<210> 156
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 156
acccaagaag agaatggtct tgg 23
<210> 157
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 157
gaagagaatg gtcttggatg tgg 23
<210> 158
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 158
tctccagacg caggacgttg ggg 23
<210> 159
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 159
ggaggcccac gaagggcaag ggg 23
<210> 160
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 160
tgcctagcat ctcgtgcccc tgg 23
<210> 161
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 161
cacccccaac gtcctgcgtc tgg 23
<210> 162
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 162
gagtgaggag atggtggtgt tgg 23
<210> 163
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 163
acgaagggca aggggatatt cgg 23
<210> 164
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 164
ggtcaccgtc catgacttcc cgg 23
<210> 165
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 165
cctgagcacc gtcaacatca agg 23
<210> 166
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 166
tcccaggggc acgagatgct agg 23
<210> 167
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 167
aactgcggga ggggaggacg agg 23
<210> 168
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 168
caggacgttg ggggtgatta tgg 23
<210> 169
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 169
aatatcccct tgcccttcgt ggg 23
<210> 170
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 170
cttggccggg aagtcatgga cgg 23
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 171
gttcagcgtc gtggtctcgc tgg 23
<210> 172
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 172
gacggtgctc aggtagttgt tgg 23
<210> 173
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 173
ggggtggggc ttcagcggtc cgg 23
<210> 174
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 174
gcctagcatc tcgtgcccct ggg 23
<210> 175
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 175
gcgtagagct gtcatcccag ggg 23
<210> 176
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 176
tggtgtaact gcgggagggg agg 23
<210> 177
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 177
ctccagacgc aggacgttgg ggg 23
<210> 178
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 178
ggcgtagagc tgtcatccca ggg 23
<210> 179
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 179
aggcgtagag ctgtcatccc agg 23
<210> 180
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 180
ttatggtgta actgcgggag ggg 23
<210> 181
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 181
attatggtgt aactgcggga ggg 23
<210> 182
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 182
gattatggtg taactgcggg agg 23
<210> 183
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 183
ggtgattatg gtgtaactgc ggg 23
<210> 184
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 184
ctctccagac gcaggacgtt ggg 23
<210> 185
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 185
gggtgattat ggtgtaactg cgg 23
<210> 186
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 186
actctccaga cgcaggacgt tgg 23
<210> 187
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 187
cgtcctgcgt ctggagagtg agg 23
<210> 188
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 188
gtggtgttgg aggcccacga agg 23
<210> 189
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 189
gcaaggggat attcgggttt cgg 23
<210> 190
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 190
tgacttcccg gccaagagac agg 23
<210> 191
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 191
tctcctcact ctccagacgc agg 23
<210> 192
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 192
gcgtctggag agtgaggaga tgg 23
<210> 193
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 193
tggtgttgga ggcccacgaa ggg 23
<210> 194
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 194
tctggagagt gaggagatgg tgg 23
<210> 195
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 195
ttggaggccc acgaagggca agg 23
<210> 196
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 196
tgaggagatg gtggtgttgg agg 23
<210> 197
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 197
tggaggccca cgaagggcaa ggg 23
<210> 198
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 198
gaatatcccc ttgcccttcg tgg 23
<210> 199
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 199
cgaagggcaa ggggatattc ggg 23
<210> 200
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 200
gtctcttggc cgggaagtca tgg 23
<210> 201
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 201
acagcacctg tctcttggcc ggg 23
<210> 202
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 202
gacagcacct gtctcttggc cgg 23
<210> 203
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 203
gttggcgttg ttcagcgtcg tgg 23
<210> 204
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 204
gctggacagc acctgtctct tgg 23
<210> 205
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 205
gagcaccgtc aacatcaagg tgg 23
<210> 206
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 206
cgcgcccacc ttgatgttga cgg 23
<210> 207
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 207
agcaccgtca acatcaaggt ggg 23
<210> 208
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 208
aggtgggcgc gctcaacagc cgg 23
<210> 209
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 209
aagaaggggt ggggcttcag cgg 23
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 210
gagaaaataa tgaatgtcaa 20
<210> 211
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 211
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 212
<211> 31097
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 有效载荷12F序列
<400> 212
ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg cgtaaaattg 60
acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa tagatattaa 120
gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt tatttatgtt 180
tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta acaaaacttt 240
tatgagggac agcccccccc caaagccccc agggatgtaa ttacgtccct cccccgctag 300
ggggcagcag cgagccgccc ggggctccgc tccggtccgg cgctcccccc gcatccccga 360
gccggcagcg tgcggggaca gcccgggcac ggggaaggtg gcacgggatc gctttcctct 420
gaacgcttct cgctgctctt tgagcctgca gacacctggg gggatacggg gaaaaggcct 480
ccacggccat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atagaatgga aggttgtgtt 540
gaagcgcggg gacagccccc ccccaaagcc cccagggatg taattacgtc cctcccccgc 600
tagggggcag cagcgagccg cccggggctc cgctccggtc cggcgctccc cccgcatccc 660
cgagccggca gcgtgcgggg acagcccggg cacggggaag gtggcacggg atcgctttcc 720
tctgaacgct tctcgctgct ctttgagcct gcagacacct ggggggatac ggggaaaatg 780
tgtctgagcc tgcatgtttg atggtgtctg gatgcaagca gaaggggtgg aagagcttgc 840
ctggagagat acagctgggt cagtaggact gggacaggca gctggagaat tgccatgtag 900
atgttcatac aatcgtcaaa tcatgaaggc tggaaaagcc ctccaagatc cccaagacca 960
accccaaccc acccaccgtg cccactggcc atgtccctca gtgccacatc cccacagttc 1020
ttcatcacct ccagggacgg tgaccccccc acctccgtgg gcagctgtgc cactgcagca 1080
ccgctctttg gagaaggtaa atcttgctaa atccagcccg accctcccct ggcacaacgt 1140
aaggccatta tctctcatcc aactccagga cggagtcagt gagggcacac cttttgttta 1200
tggtgtaaga caagggtctg atttcatttc attttgaggg tttcaccctc tcatataata 1260
aaattcttct atataccctt ctatcatcac ttattactga ttatatgcct tgatttcaga 1320
atcttgccaa ctagattcag aatttgactg ggagagagga caaggaccac ttgagactca 1380
tattttattt ccagaatcta gcatctacct acctaggtat tgaataagaa aaatgaagtt 1440
aaggtggttg atggtaacac tatgctaata actgcagagc cagaagcacc ataagggaca 1500
tgataaggga gccagcagac ctctgatctc ttcctgaatg ctaatcttaa acatcctgag 1560
gaagaatggg acttccattt ggggtgggcc tatgacaggg taataagaca gtagtgaata 1620
tcaagctaca aaaagccgcc tttcaaattc ttctcagtcc taacttttca tactaagccc 1680
agtccttcca aagcagactg tgaaagagtg atagttccgg gagactagca ctgcagattc 1740
cgggtcactg tgagtggggg aggcagggaa gaagggctca caggacagtc aaaccatgac 1800
ccctgttttt ccttcttcaa gtagacctct ataagacaac agagacaact aaggctgagt 1860
ggccaggcga ggagaaacca tctcgccgta aaacatggaa ggaacacttc aggggaaagg 1920
tggtatctct aagcaagaga actgagtgga gtcaaggctg agagatgcag gataagcaaa 1980
tgggtagtga aaagacattc atgaggacag ctaaaacaat aagtaatgta aaatacagca 2040
tagcaaaact ttaacctcca aatcaagcct ctacttgaat ccttttctga gggatgaata 2100
aggcatatgc atcaggggct gttgccaatg tgcattagct gtttgcagcc tcaccttctt 2160
tcatggagtt taagatatag tgtattttcc caaggtttga actagctctt catttcttta 2220
tgttttaaat gcactgacct cccacattcc ctttttagta aaatattcag aaataattta 2280
aatacatcat tgcaatgaaa ataaatgttt tttattaggc agaatccaga tgctcaaggc 2340
ccttcataat atcccccagt ttagtagttg gacttaggga acaaaggaac ctttaataga 2400
aattggacag caagaaagcg agcttatcac atagcataca gaccaacagc aacagtagca 2460
accaggaaag acagggtcag aacccatctt aataaaggag cctgagatct ggtgttcaga 2520
ggaggtttac ctctaggggt ttcaactgga gcagagtcct gaactttgtt agaagccctt 2580
tgtcttaaac cgggagccct agatggagac tggtctttgg tgtcatgggt cagtagttcc 2640
tgtaattctt caaacagttg gatgttcagt aggaaagctg ttttagcttc ttcaataact 2700
ctttgcctaa cagcgggggt catttccaga gagttcatcc tagacctgta cagttgtttg 2760
aatttggtag cagaagctat gtttgggaag gtgaagaaag ccagaccttc accagaagaa 2820
ggtaggtcca gagctttctg agctattttt ttcagaacct gaccaccaga caggtcaccc 2880
aggtatctgg tgtaagcatg agcaaccagt aattctggtt ctgtcctacc aacttcatga 2940
agtcttttaa catacctttg catagcgggg gtgtatggga taacttcctg ccatctagga 3000
ccataccaga aagccaggtc ctgttccaga gcagctttcc tgtgtagttc ttctgggaag 3060
taaactggag caaaaacagg agattctttg tttctttcta tttcttcttc cagagcaaca 3120
tagatgtggt acagagaagc cataaccagt ttgaaaccat ctctggtaac ctgacctttc 3180
tggaagtttc tcatgaattc agcattttca gcctgggtgt gaacttcttt ggtagcttct 3240
ttcagtgctt cagacaggtc ttgtggcata gaatctggtt gtggcctttc aggcccgggg 3300
ttctcctcga cgtcaccggc ctgtttcagt agtgagaaat tggtggcgcc gctgccaacc 3360
atgtctttcc agaagtaaga tggtttgtgg aagatcagta gacctatgat agcaacggtg 3420
aacagaacca gagagaacag aaccatcagg aaaacatagg tagagtgaga cagtggggta 3480
gacagaggtt gttcagcggg gatcatgttg gtcaggttca gcatgtaacc cagggtccaa 3540
ccagcatcag aaccctggat tttaccgatg aagtggatgt gttcccaaga gtcagcagtg 3600
aagtggtaac cttgcagtaa taaagacagg atgtaggtac cagagaaaca gtattcagac 3660
aggtattttt ctttaacacc agcataagag gttttgattt cttcccaggg ttgagcacag 3720
aattttttca tcatttcagt aactttttcc tgagaaactt tttcagaggt caggttcagg 3780
aatttcataa caaagtagaa agcagagaaa gcaccaaagt caccctgtag aggaggtaag 3840
aagataccat tgaaagcaca ctgagagtag ggacagtaag aggtgttgaa cagttccagg 3900
atagactggt gacactgttg gtagttacca ataccctgga tttcaaactg ttggaagggt 3960
aaggtcattt caaatctttt ggtacaaggg gttttgtaca ggtcagaaac attaacaact 4020
tttttgtaac cagggtggaa acaagggtcc ctaaggattt cattagaagc aacctggatg 4080
tctttagcca gtttctgcca cagagcctgg tctttaccat aacacaggaa agagtgggtg 4140
taaacattgt agtctttacc atacagtctg aactgtagag cattgtcagg agattcaatg 4200
gtctggttct gaggaacaaa ggtaacctgg gtagaagcac cacccaggtc cagagcacca 4260
aaggtttcct ggttgttggt ttcatatgga actatagaga accacctggt tttctgagag 4320
aatttaccca gaaggtagtt gatggtgatc caaccataag caccttcttc ctgacctgtg 4380
atgatcctag caccctggaa gtcaaagggg tagttagaca gagatctttc aacaacatcc 4440
agaactctgt cagccagttc ttcagattcc attcttagta atctcatacc agcagtagca 4500
cccaggtaaa cgggggtttc ctggtgttgc gaacgaggga taacttccct agctctttcc 4560
atacagtcag tcaggtagat accaatttca ttaactttct gaacaaattt agagatacca 4620
ggacctttaa ctctacattc ttcaacctgg tgaacaacac ctgtgtcatt ttctttttca 4680
gcgggccatt tgtagatgta cagagaggtg tgagaagaac cagcatccag aacaatacca 4740
tatttaacat tttcaggtaa agctttgttc tgggtcagac caacagccag taaagcaata 4800
acagcaatga tagaagagaa acccaggata gccaggatgt ttttagaaca gaaagtttta 4860
acattagatt ctttggtatc ctccataggc ccaggattct cctccacgtc cccagcctgt 4920
ttcagaaggc taaagttggt cgctccgctg ccaggagagg ggtcaaaagc agcattggtg 4980
aaaacaccat aggtacccag gtgagagtgt gggttcagtg gacatttacc atcatctttc 5040
tgacggaacc ttttgatctg agacattctt tcagcctgtc tccttctgtg tcgacaccta 5100
acacagaaga agatacccag acctatgaac agaagaagcc cagcaacacc acccagaaca 5160
atcagagcca ttggttgaac aggggtagac caggtaggaa gaactttgat gttagattcc 5220
agtaaaacct gaccagagtc agacagcagg cactgccaca taccagcttc tgggttcaga 5280
acccaaacag ctttttctct tttagaaact ttagcttctt tgttttccag tttcagagac 5340
agcatcagtt ttggagaggt tggaccccaa acttcacagg tcaggttttt ctgaagttgg 5400
gtagctctca taacaaccag gttaacttcc tggtgtagtt taccagtttt agcttccaga 5460
gccagggtca ggttaccaga accagcatac tgtggaagag cctgtggtag ggtcaggtga 5520
agaggtaatt ttttacccat ctgtaatttt gggtcctggg taaccctttt aacagaaact 5580
tctttgtttt tcaggtcaaa ggtgatccaa gatttagaag aagaagccct ttcagcctgc 5640
caccacagtt caccagaacc agtcagtttt tcaacagtga aagccagtgg gaaagagaat 5700
tcaacctgtt caccttcttt tttgtaaact atagaagaag ctttctggaa agccagaaca 5760
actatgtcta ttttgaattc aacttttttc tggttctgta gaactgtaca ggtccaggta 5820
ccagagtcct gaagttccag ttgagaaaca gacagggttt taccatttct acaaccacca 5880
gaaccacccc caccggaccc tcctccccct gaacctccca gttcctgtaa gtacatgttt 5940
ttaacaaaga tttcttcata agctatttta actctttgtt tttttctttt tcttttggtt 6000
ttgatcagac cacctttaga gattctttgg atgaaacctt ttttacaagc ccttaaacat 6060
tcctgtttag aggtgaagtt gttttcatta ccaccacaac cagagtattt gaagggtcta 6120
catttaccta taacagagtt gtagtagaac ctgttttcat tagctctaca cagacctctg 6180
tcagcagggg tcagacacca agaaggacca tggaattcaa acagagaggg aactttggta 6240
gactgagggg tcagagagtt gttaacagca ttcagttggg taccatagtt gtcaacctgg 6300
aaaccattgg gaccatcttc acagatgttt ttacattctt ccagggtttc aaagttgttc 6360
atgttaccca gacaaccacc atatttgaat ctttcacact gtttggtctg gttgttgtag 6420
aagtacctgg tgatgtaacc tctacagata ccaggatcct cttccaggaa acagaagtct 6480
ggtttttcct gttgtagggt ggttttgatg atcctgttag cattgtccct ggtacacatt 6540
ttcttacatt cttccagaga ttcaaatctg ttctggttac cttcacaacc accatagatg 6600
aattcttcac actgtctggt gaagatgttg aagaagaacc ttttcatgat agctttacaa 6660
ggaccatcat cagctttgaa agcacagaaa gagtgcatca gtttcagtgg aggaagttca 6720
gtgtctgtga tgatggtgtg ttcttcatct tcttcagagt cagcattcag aggagcagga 6780
gccaggttca gaagtaaaca aacagaggcc cataaagcat gtactttttt catagtgtag 6840
ataggccctg gattctcctc cacgtccccg gcctgcttaa ggagcgaaaa gttggtcgcg 6900
ccgctgccca gcctttgagg ggtcctttca gtcctaacat gttgtaaaac aacttcttta 6960
gatggagcag cacatttgta ttccatttta gccctagcag caccctgttt tttcctaagg 7020
tgacacagta gagccagtag agcaacaacc agacacagag aagctataga gatacctatc 7080
agtagaccag agtgaaccag accaacagct ggtggggtca gggtagaacc gggggttgga 7140
gagggaggag gttcaccaga accagagtca ccaccatcaa ctttaccaga gtcacagtct 7200
gtaccaatgt gtctagccag agcagagtcg ggaccacaga tacattcaaa ggtaccggga 7260
aggttgtgac aaacaccaga acagaaacca ccattttcac attcatcaat gtctgtacag 7320
atgaaaccat catccaggat gtaaccttct ggacattcac aagaagcctg ggtgttaggg 7380
tcacagtcag cgggacaagc tgtctggtta cagaacatct gacacctgtg aggttcatga 7440
gggattggag caaaaccttc agcacaaaca cacaggtaag aggtctggtt cagaggttga 7500
cactggtatt cacagttagc cctgaaacag gggtcaacgg gttcaacaca ttcaccatca 7560
accaggtcat agttagggta acagtgacat tcaaaaccac cctgggtgtt aacacagcgt 7620
tgtggacatg gagagggttc caggatacag tcatcaacat cttcacatct gtgttggtca 7680
gcggccagtc tgtaacctgt ttcacacata caagagtaag aaccgggttg gtcggggttg 7740
ggaacacaga agtgttcaca caggtcatta caagactggg tagcagaagc agtacaagat 7800
ctaccatcag cctgaagagc agcaccagca ggacactgac acctaggagc accagggata 7860
gcattacaag catgttcaca accaccattt tcaacagaac agtcccaagc accgggagct 7920
tctctagccc agtgaccctg aacagcaccg ggtggagctg tacacatcag ttgtaagccc 7980
agaggagcaa cagcagcaga agaaccaact ggtagagcct ggaagtcagc acctctagca 8040
gcaaaagggg taccataggt gatagaaaca gcagcagcag cagcaccggg ttcaacagcc 8100
agtggtctac aggtagcggg gaagtggaat tcacacagga aaccatcagc tttaacttca 8160
cactgttgtt cttcccagat aggttcagaa ggaacagtag cttcagcagc agaaacagca 8220
acacacagag gaccacacag aggagcacca ttcaggtcca gtctagccca tctagagtaa 8280
gaggtgttgt tgtcacctgt aacccactgg aaacctctaa gaggacccag tcttttaggg 8340
tcaccacaac ctggtggtag ttgcagtcca atccacagtc tcctcctacc aacaccacca 8400
tcaccattca gtaataaaga gataacatca gcagcaacag agctgcgaac tgtcatcagg 8460
tgacccctaa gaccatcaca gatctgagaa gcattcagga aggtagcggg accggggtac 8520
agagcaaaac agtcatgttc aacacactga gaaccacctg gttgtggttc agcaggagcg 8580
gggaaaccta aacctgccag agccagtgca ccaagaacca gaacacctaa catggtggca 8640
ttgctttgaa ttagcggtgg ttttcacaac acctaaaaaa gggtttaaaa gatacctttg 8700
aaccgctaag aagcccgaga attagctccg ctcaaaactc aaggggacaa attccaaaaa 8760
tgacttccag cgccaggctg gcctgactag tctccaccca ccaaatgtga acaaactcca 8820
acgccattac atcccctccc cccgccgcga ctagccgtgc tcaaaagccc gaggtgacta 8880
ttgcggccga taggaccacg gggtcacagg aagcagcagc cggtgaggga ccaggccctc 8940
ttcctttgtg tgggtgactc acccgcccgc tccaccgggc tgccgcgtcc tccattttga 9000
gctccttgca acagggcccg ggagcggcca tctttccacg cacgcaactg gtgccggacg 9060
ggatggcctc accctagtta gggaggcagg gcaacgcggc gccgccaagc cagatcgtgc 9120
cgggtgctgg ggccacatgg cctcggcacg ctaaccccag cctggttgct tcgggaaaaa 9180
ccccaggcct cgccccatcc aggtggcgtc ggacatgtgc tccgaaggcg ggcgggcccc 9240
agccgccact cctgtccctc cattcctccc caaccatgac ctctccgggc tccgggcgag 9300
caagccccgc accctccctt tgttagcccc tattgctgaa cggcaatcga aggcagcagg 9360
gcaacaacaa caaaaaaaaa aaagaccaga gtgcggccgg agtagcacgc ggcggcggcg 9420
cggacaccac gctaggcctc aagccggaca cgaggcgagg ctacggggtt gccgctaggc 9480
ctcgcactct gcctcccgcg ccgcccgcaa ctcgaagcgg gaatgctcgc agctaatccc 9540
cgccgacgac agcggggccc ggcccgctcg gagcaggacc tccagctcgg cggcccgcgg 9600
aagccacacc cgcccctcac ctgcgttctg acggcaaacc cgttgcgaaa aagaacgtcc 9660
aaggcgactg ccgcacttat ataccgttct cccccaccct cgggaagagg gcggagccag 9720
cacacgacac cgctttccca gtttgccccg cgccagctcc ccggtcctcc cccccacgac 9780
cagggtctat gagcttgtgt gctctgctct ccccgcgctc agccctgagc gcatgctcct 9840
cgcgctgtcg tggggcggct acagggattt gggtctgtga gaatttaggg acggtccctg 9900
ggctctcccc ttgcgaaggc gatccctcct tttgtatgaa ttactctcgg ctccggcgcg 9960
ccgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 10020
cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 10080
ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 10140
caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 10200
ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 10260
tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 10320
ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 10380
cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc 10440
tgattttaaa ataactatac cagcaggagg acgtccagac acagcatagg ctacctggcc 10500
atgcccaacc ggtgggacat ttgagttgct tgcttggcac tgtcctctca tgcgttgggt 10560
ccactcagta gatgcctgtt gaattcctgg gcctagggct gtgccagctg cctcgtcccg 10620
tcaccttctg gcttcttctc tccctccata tcttagctgt tttcctcatg agaatgttcc 10680
aaattcgaaa tttctattta accattatat atttacttgt ttgctattat ctctgccccc 10740
agtagattgt tagctccaga agagaaagga tcatgtcttt tgcttatcta gatatgccca 10800
tctgcctggt acaatctctg gcacatgtta caggcaacaa ctacttgtgg aattggtgaa 10860
tgcatgaata gaagaatgag tgaatgaatg aatagacaaa aggcagaaat ccagcctcaa 10920
agagcttaca gtctggtaag aggaataaaa tgtctgcaaa tagccacagg acaggtcaaa 10980
ggaaggaggg gctatttcca gctgagggca ccccatcagg aaagcacccc agacttccta 11040
caactactag acacatctcg atgcttttca cttctctatc aatggatcgt ctccctggag 11100
aataatcccc aaagtgaaat tacttagcac gtccagttag gtagatcctt gtgtacttct 11160
tggttgttca gagatcatca accagtgcaa acaatccccc catcaataca cagcagtgcc 11220
tgcccctctc cccccgaggt cttccgaggc ccttcctccg tgcctgaacc ccctggacat 11280
atcatatggc aaactgaagt gtccaacgag atataggaag tgaaacacga tgtacactga 11340
aacgtgcaat acaaatatgc agcatgaagt gcctcggttc actaacccga gctacgctgg 11400
gtgcttcttt tctaccactt tccttaatgc ctatggacac ctcattctgt ggctgaagtt 11460
ccttgtgttc aattcccccc atcttcattg aacatcctgt gtagggacct cacccctgtc 11520
ctgctagctt tgcactgagg caagttctgt ccatgcctag tagtgccacc acctttacta 11580
gatgagactt ctaaagagct tggcatggaa ggaaagcccg ggggccttgg aagccatcac 11640
ttagaaactg ggagagctcc aggcaagcca cctcatctct ttgagcctca gtatcctcac 11700
tcacatccct atggtcagta gagtgccaag cacatggtgg acacgcagaa gtattgatca 11760
tcttcctcac ctcccctagg agagcccttg ggaatcccca tataatattc tctgaagacc 11820
tcaatccaat gagccaagta attgactcgg tagcaaactc atggaaagga cattagaagc 11880
caaaaggagg tagagtatgt cccagtacaa taaccagcct ctgatctcaa ggaagaaaga 11940
acagagctgc aggtgagaag tgtgcgcctc aaatcaccaa agtgagagtg gaaggagcac 12000
ccaccagtcc cttggaggcg atccctaaga ccggtgagaa tggcttcgaa aaatgtgatc 12060
gtcctcaacc ccacagtctt gaacctaaca ggagatcttg aagcctgaaa gacaccactt 12120
taggatcaac agcagatctg tgactttcca cagcaggcac acagaaccct agagttagtc 12180
gaggttggac ataggaaggg cttccaaaca cacagagaaa ttcatggatc ctaaattata 12240
aaggcaggtt ctttaaaaga accaagatga ttgtgagatt acgtagagtt tttttttgtt 12300
tttcttgata cagagtctcg ctctgttgcc caggcaggag tgcagtggca tgatctcagc 12360
tcgctacaac ctccacctcc cgggttcaag caattccctg ccacagccac ctgagtagct 12420
gggattacag gcacctacca ccatgcgcag ctaatttttc tatttctagt agagacggga 12480
tttcaccatc ttgaccaggt tggtcttgaa ctcctgacct catgatccac ccaccctggc 12540
ctcccaaagt ggtgggatta caggcatgag ccactgcgcc cggcctattc tgagcctttt 12600
gaagctgacg ccagaggcgc gaagcccagc ctctccccac tggccatgtg gaggctctcc 12660
ctgagtagtc tctcagcctg caggagccaa ggatctggac ccaagtgatg ccccaacagt 12720
gggcaacttc ccagtactgt taggagaatc ccaagtctaa tgcaaagttg attttttacc 12780
agcaatgaat gatagacatg gtctccattg ctcaaggctc tgggaagatc tagactagag 12840
aaaacgatca tcgacttcta cccacacctg agggcctcag ttcttccctc tggtccatgg 12900
ctgccatggt aaccccttat aaaggtgttt ccccaggggt ccctagagtc ctctgagtca 12960
ccataattct ggggtcaaca gaagtggaga ggtgagagga gacactcccc tgccctggct 13020
ggtcccacgt gttcctggca gtaacctgtc tggggagcct cgccacccct gtgcccacct 13080
gcggagttat gcagtggtcc ccaactaggg cccctgccac cctcattcct aaaggaggct 13140
ggagacttct tccatggccg aaaatccaca tctaagtccc cagcactggc taaaaggccc 13200
tgtcatgggg gctccctgtc ccagctgaca ttggaggaag gatggtgggg gaggcaggga 13260
ccttcttcta cttggagctc agggaccctc ttccattcgc acctggctcc tcctctttgc 13320
tggtgctgga aggagcaggg gaaagtggtg actccaccct cccttggccc catatttttc 13380
ggagctggta tcatcgatga cacccctctt ggatcctcac acaggcctgc ctggagaaca 13440
gctcacagca cagtgccctc ccagcaggtg atgagtctgg ggtgctggtc cggtaatgct 13500
tcaggagtga cggcagaaaa aggagctctg tcttcccctc tgaaagtagg gagatggcag 13560
ggccccagca ttcacatcct aggccacagg ggtgtgggtg ttcaatgttg gttgccaaca 13620
ccacagccaa tcacttctag aagcatttgc ttgtttgctt gcttgtgttt ctacagtgtc 13680
aagtgctaca tgctcttaaa ctcagggtgg gggaagattt caccactgga gagggtggtc 13740
tttcctgctc ttatccctgg gggcatctga tgcttgtgac ttccagatgg tatggaaata 13800
gccccaaccc tgggcaccag gagacaggag gctcagtcct ggccttctcc gcctcagcct 13860
tgtcctgctg tgaggtttcc acaaggcacc ccatgccact gggccattct cacctgggaa 13920
ttgagaaaga acaatctgcc ccttatggaa agacaaaatg aggcaaaggg cccctgtgtt 13980
gggggcagga tccctgcact cagagggatt tagaagctga aataactggg ttgggggcgg 14040
tgactcacgc cagtaatcta aggcgcgcca ggctttgatt tccttcactc tggaatatac 14100
tacagaatgt actaatataa atgtgcttgc ctatgtctaa tctagaatat aattatcctg 14160
aactctacat ggtattttag tctagaaagt actgtagctt ctctgagttc taaatcaaac 14220
caggaaacag cagagggcgc tggtgctgtg cttttgcaag tgagatgtgt gctcatttca 14280
agggtccaca aaattttctg gcatgctgtt tccatggaga ggaaagtagg tgttttcttt 14340
ttcttttttt ttttcagtca agccacctgc aaactaggcc agagtgaagg aaatcaaaac 14400
cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa 14460
acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 14520
ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 14580
tggtttgtcc aaactcatca atgaccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc 14640
tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt 14700
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 14760
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgaa ttaattcgcc 14820
ctttggttct ttccgcctca gaagccatag agcccaccgc atccccagca tgcctgctat 14880
tgtcttccca atcctccccc ttgctgtcct gccccacccc accccccaga atagaatgac 14940
acctactcag acaatgcgat gcaatttcct cattttatta ggaaaggaca gtgggagtgg 15000
caccttccag ggtcaaggaa ggcacggggg aggggcaaac aacagatggc tggcaactag 15060
aaggcacatt tatcaaccgt acatctgttt gaactggaaa cattcattac agtaaccatt 15120
acatttagca ttaccaaagt ggtcacaagc aggagctcta catctttgtt ttggaggatc 15180
ctctggagca ggttcacccc tgtgagcacc aggacccatt ctttggttag ggtgttgaca 15240
ttccatacac agttcttcag acctacaagc caggatgttt ttacaagaag ctctagcaca 15300
tttaggtcta gaggtagact gggtggtcct aggaacatct cttctttgag aagatctaag 15360
ttgttcttct gttcttttag cttcatggaa tctttggttc tgagcttcaa tgaaacattt 15420
ctgacagtaa ccttcaaaca tggtagaacc cagggtacca cattctctac ccagacatgg 15480
gatggtgttc tggaacctag aagctgtggg agaaacttta ccagaagcag cagcaaagtg 15540
tttgttttct ctgtattcta tgaaacacag ggtacagaaa cctttgtttt caggggtacc 15600
aaagtaaaca caaccagctt tcctacattt agaggtacct gttctgtcac cgggggtcct 15660
agcagcctga gacagacaac cagctggagc atcattacca gctctgtgac aagagtgtgg 15720
agaaggagat ctaaccagcc tagatgggtc agatttagac ctttggtgac aagagggtgg 15780
tagagaggta gacagagaag aagaagcttc agcagtggtc cttttgaaac aggtagaaca 15840
gataccattg aaggttctgg taacatcctg gaggcaagcc tgacatttac ctgggtccag 15900
gtgtctggtg tggtctggag catgagaagc atgaagttgt ctagcattgt gacatctttc 15960
acagaaacca ttgtgttgaa cattcagggt gaagggacaa ccaggactgc gacatttcat 16020
agcagtggtt tcagagaaca ggaaaggaga tggagctgtt ggaggagcag agtgtggacc 16080
accagtagat tcttcggggt tccaagccag aggttcataa gcttcacctc tagaagcacc 16140
cagagccata ccaggtaaac cttcgggacc aggtttagag ttcagttttg gaagtttgtt 16200
ctggtttttc tgccgacgtt cagaacattc atgacacagt ggttgggtgt taacagacat 16260
gaagaaggga cagttggggg tttcacattt aacatccatc agagacagtt gaggaacaga 16320
tggttccatg gggttctgag catgaccttc tcttctaccc tgttcagagt tttcctgcca 16380
ttttttgtat tcatgttgaa ccagttcaaa gtagtcatca accaggttga tttctttagg 16440
taagttagct tcatccagtt tagcagcatt gatcaggtgg gtggtaccat ggtcccaacc 16500
ctgaacaggg atttcaataa ccatcaggta ttctttcagt aatttttctt tcatttcatt 16560
ttctgggtct gtcaggaagt gaactttcag atcctcaaac ctacccctgt ctctgttaac 16620
cagaggaaca gccctgattt ctggaccaga gtctttcagg gtaaccagtg gaacaaagtg 16680
gtgagagtca taacccagaa ctatggggta tctgtaacat tcctgagctg gccagtgaag 16740
aggtaagtag ataccaccaa ctttcagagg agcaaagtta gaaccagatt ccagtgagcg 16800
aagcattttg tcagagataa ctatgattgg cctccgaagg atgttacaca gaacaaagat 16860
gtggatttct tccagagagt tgtactgtaa accagaccta gccatggggg tgtcagtaga 16920
agccattttg atcaggttgt cccattcatc attccagttt ctggtgtcat aacacagacc 16980
tgtttcaaca aattcctgag atttcagaga ttccagttgc cacctgaatt tgaagtttct 17040
ggtgtctgtt tctttcaggg tagagaacag agcttttctt agaaccaggt ctgtgtcctg 17100
aacaccccac atgtactgag aggtagcatg catcagacag ttaccatcac cattggtttt 17160
cagagcaacc agtttcctaa cttccctaca ccagttcagt tttttctgag attccagggt 17220
agcctggatg ttcctgtcta tcagagcttt gtggatgatt tccctgaact gtggacagaa 17280
ctgacaggtt ctgaacattt ccagggtgta tctgtgcatg gttttgaagt ggtggatgat 17340
accattggtt ggtttgaaga tatcctcagg ggtcctttct ctgattttta cagcttttct 17400
catgttagac aggtacagag cttgagggag aacttgttca gccattggtc cagggttctc 17460
ttccacatct ccagcttgtt tcagtaggct gaaatttgtt gcgccactgc ccgggtgtaa 17520
agaccaagca gcagccagga aaggggtaac cagtagaaga actgtttttt cagacagaga 17580
ggtaccacca ttttccagtt gttcattgaa gttacacagg tcttttttac aacagtagta 17640
ggtcagttca ttttctctta atctggtggt aacatcattg aagttacagt gttcaaattt 17700
ccaacatttg ttgtaaacct gcaggccagc tttggtgatc agacaagcat caaagtcaga 17760
agaacagtta acagctgttt tacagtcagc agtagggttg ggacagttgt aacactgaag 17820
agagtgacca gagtgacaga aaacagccag aaccagtaac agaccaaaca gaacagaacc 17880
accttggata cccataggcc ccgggttctc ctctacgtcc ccggcctgct tgagcaggct 17940
gaaattcgtg gctccgctgc cggtcagtag ccccatggta accagggtac ccagtagacc 18000
agtcagggtg aaacaggtgt gaccagacag aagcctggtg gtaccagagg tggtaccaga 18060
acctttgtta ggggtggttt catggaagtg tttggtggtc ctagaaacgg gggtagatct 18120
ggtagcctga gcattggggg tggtggtttt ggtggtggtt ttctgagagg tgggagaaac 18180
ttctgtggtg ggaacattaa ctgtggtagg tttctgaact gtaggaggaa ctttagaggt 18240
cagagattta cccctacatt cgggaggagg accagaccat tcaccttcat cattgttaac 18300
agtacagtag atagagtgtt caccaatcat ggtgaaacct ttgttacaag cataggtaac 18360
agactgcctg taaccatagt gatcacgttc accctggatg ataccattgt ctatctgagg 18420
aggagctgga cagtagattt ccctacattc gggtaaaggg tcagaccact gaacagaaga 18480
accagagatc agacagaaag aagaggtaga accaaacagt ttgtaaccag tgttacaaga 18540
gaaagagatg gtagcaccaa acaggatacc accaggaaca tcaatctgac cattcctgat 18600
ttcaccgggg ttgggacaag attttttttt acagaattca acagcagtag accatttcag 18660
gttctgtaga caggtcagtt tgggagacag agagggttct cttctgtaac caggtctaca 18720
ttcatattca acaacagtac caactgggaa gtagttctgg gtgatgtagg gttgtttcag 18780
agaagcagag ttcagcctgg tgggaacttc acaagatctg ttacagaatt cttctatgtc 18840
agaccactga gaacctttca gacagataac agagtctttt tcacctggga ttttaacaaa 18900
agattcttca catttgtagg tgataacagt atcctcaggg aaagaggttc taccttccag 18960
agcaggttga gcattaggaa catctggagg taaaccacag tcaccccaaa cagcagggag 19020
gcacagtaaa acaagtaata aaagtcttgg aagttcacct agaagtggga gtgctgctgg 19080
aacagatggc ctggctactg tcataggccc ggggttctcc tccacgtcgc cagcctgctt 19140
aaggagtgag aagttggtgg ctccactgcc cagagaggtg aatttaactt ctctgtgggt 19200
ttcatctgtc aggtaggtac cttttttttt tctcctttga aggtacctgt aaggaacaac 19260
acagataaca gcaacaccaa caacaatagc tataactata acagcaataa cccaaacatc 19320
cagagagtcc aggatacctt cttcaggttt agggtaacca gggtagttag aaacgggagg 19380
tttgtaggta ggtcttggac cagaagcaga agaagcagga gatttggtgg tagaagaggt 19440
agaaacagag tgagacagag cgggtggttt ggtagaagag ggtggtaaaa ctttcagaca 19500
tttgggaact ggtgggtccc aggtagagtt agagtcacaa acaatggtgt cagaaccatc 19560
caggtagaaa cctttgtcac attcaaacat aacagtagct ttgtagtaga attttttacc 19620
aaaaccagag atctgtttac cattttcaac aactgggaat ctacatttaa caactttaca 19680
ttctggagca gctctagacc aaacagagtt gtcaccacag tagatggtag attcaccaat 19740
cagagagaat gggtctggac caggagcagg gtcacaagag taggtaacag catccaggta 19800
ttcaaaaact tcaacttcag agaaggtgtg tttaccattt ttgattttgg gtggtggggt 19860
acacagaact ttttcacaga tgggaggttt accagaccag atagcaacag aacctttcag 19920
ttcacagtac aggatttctt cacctatcag gtagtaacct tcattacaga tgaagtgcat 19980
ctggtaacca aattcatagg taccattagc tggaacagcc tgaccattca gaggatctcg 20040
gatgtaggga caggtttccc tgtaacaagc atcatcagaa acaggtaacc aggtgtggtt 20100
tctgtcacag atggtgtggg tagccagagg tgggatgtag aagtaacctt ttttacattt 20160
gtagtcaact ctttcaccta tttcatagta tggttttggt ttaccgatca gttccatagc 20220
ttcaaaggtt ggtggttctt cacaagcatc agagaaagag tacagtaaaa gaaccatagc 20280
agccagtagt aaaccaggga atctccaaga tgggaaggga cactcccttc taccaggtgg 20340
ttccatggtg gctcacgaca cctgaaatgg aagaaaaaaa ctttgaacca ctgtctgagg 20400
cttgagaatg aaccaagatc caaactcaaa aagggcaaat tccaaggaga attacatcaa 20460
gtgccaagct ggcctaactt cagtctccac ccactcagtg tggggaaact ccatcgcata 20520
aaacccctcc ccccaaccta aagacgacgt actccaaaag ctcgagaact aatcgaggtg 20580
cctggacggc gcccggtact ccgtggagtc acatgaagcg acggctgagg acggaaaggc 20640
ccttttcctt tgtgtgggtg actcacccgc ccgctctccc gagcgccgcg tcctccattt 20700
tgagctccct gcagcagggc cgggaagcgg ccatctttcc gctcacgcaa ctggtgccga 20760
ccgggccagc cttgccgccc agggcggggc gatacacggc ggcgcgaggc caggcaccag 20820
agcaggccgg ccagcttgag actacccccg tccgattctc ggtggccgcg ctcgcaggcc 20880
ccgcctcgcc gaacatgtgc gctgggacgc acgggccccg tcgccgcccg cggccccaaa 20940
aaccgaaata ccagtgtgca gatcttggcc cgcatttaca agactatctt gccagaaaaa 21000
aagcgtcgca gcaggtcatc aaaaatttta aatggctaga gacttatcga aagcagcgag 21060
acaggcgcga aggtgccacc agattcgcac gcggcggccc cagcgcccag gccaggcctc 21120
aactcaagca cgaggcgaag gggctcctta agcgcaaggc ctcgaactct cccacccact 21180
tccaacccga agctcgggat caagaatcac gtactgcagc caggtggaag taattcaagg 21240
cacgcaaggg ccataacccg taaagaggcc aggcccgcgg gaaccacaca cggcacttac 21300
ctgtgttctg gcggcaaacc cgttgcgaaa aagaacgttc acggcgacta ctgcacttat 21360
atacggttct cccccaccct cgggaaaaag gcggagccag tacacgacat cactttccca 21420
gtttaccccg cgccaccttc tctaggcacc ggttcaattg ccgacccctc cccccaactt 21480
ctcggggact gtgggcgatg tgcgctctgc ccactgacgg gcaccggagc ctcaggcacc 21540
gaggagacac cgtggccccc gaagcagcgt gctttagaaa gggaataaga attcccgcct 21600
ccgcgcccca ctttcacccc agcggggcag cgtccgccat gtgaaagctc cccatccccc 21660
acccccagtg aagggaaatg gcgccgggag gctgagggtg gggaagctgt ttgtacgctc 21720
aggcctccgc tcaagacccc gttcataaac cttaagcccc actgctactg aattggtccg 21780
atttcctgcc tctctcccac ggaggcggct ggccgacttc cactgaggcg ccaacggcct 21840
cgccatgccc ttttcaataa ctcattgatt tcaaacccgt tacgtccatc gcggactcag 21900
tcgcttcagc ccgatttccc gcagccgagc gagatgagag agatcgatct ccgcggacga 21960
acacgaaccg gactcgtcct ggcgctgtag tgagaactgc cgctgctcga gaaacaactc 22020
tgcgaggagc acctccgcac gggacccggc gctgctgcta ctgccgctag agccgctgcc 22080
gccgcttttc tagaaccttc ccccccacta acgcgtcttc cgctacgtca ggccgtcgcg 22140
taaacgccct atccgccgcc aatggcggga aggctctacg ccccacctta cgccaaatgc 22200
gtactcctcc cacccttgcg gccagagaca gtacccgacg ttacttccgt aaatgcgctc 22260
aatgaattgc ggaaggctag agtcctgcta gttactacct cttggaatag ggtcccggcc 22320
cctgccttgg cgaaggcagg tgagaaacgt cgcgcagttt gaaattaacg ccgacgggag 22380
gggcttaatc cgcagcctgg agatccagcc ccctcaaccc gggaggtggt ccctgcagtt 22440
acgccaatga taacccccgc cagaaaaatc ttagtagcct tccctttttg ttttccgtgc 22500
cccaactcgg cggattgact cggccccttc cggaaacacc cgaatcaact tctagtcaaa 22560
ttattgttca cgccgcaatg acccacccct ggcccgcgtc tgtggaactg acccctggtg 22620
tacaggagag ttcgctgctg aaagtggtcc caaaggggta ctagttttta agctcccaac 22680
tccccctccc ccagcgtctg gaggattcca caccctcgca ccggcgggcg aggaagtggg 22740
cggagtccgg ttttggcgcc agccgctgag gctgccaagc agaaaagcca ccgctgagga 22800
gactccggtc actgtcctcg ccccgcctcc cccttccctc cccttgggga ccaccgggcg 22860
ccacgccgcg aacggtaagt gccgcggtcg tcggcgcctc cgccctcccc ctagggcccc 22920
aattcccagc gggcgcggcg ccggcccctc cccccgccgc gcgcgcgccc gctgccccgc 22980
ccttcgtggc cgcccggcgt gggcggtgcc acccctcccc ccggcggccc cgcgcgcagc 23040
tcccggctcc ctcccccttc ggatgtggct tgagctgtag gcgcggaggg ccagcgtcat 23100
tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 23160
gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa 23220
cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggacta tttacggtaa actgcccact 23280
tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta 23340
aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt 23400
acatctacgt attagtcatc gctattacca tgggtcgagg tgagccccac gttctgcttc 23460
actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta 23520
ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga 23580
ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg 23640
aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg 23700
gcgggcggga gtcgctgcgt tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgcgccg cctcgcgccg 23760
cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc 23820
tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctc gtttcttttc tgtggctgcg 23880
tgaaagcctt aaagggctcc gggagggccc tttgtgcggg ggggagcggc tcggggggtg 23940
cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggccc gcgctgcccg gcggctgtga 24000
gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcgtg tgcgcgaggg gagcgcggcc 24060
gggggcggtg ccccgcggtg cgggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 24120
tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcggcggt cgggctgtaa cccccccctg 24180
cacccccctc cccgagttgc tgagcacggc ccggcttcgg gtgcggggct ccgtgcgggg 24240
cgtggcgcgg ggctcgccgt gccgggcggg gggtggcggc aggtgggggt gccgggcggg 24300
gcggggccgc ctcgggccgg ggagggctcg ggggaggggc gcggcggccc cggagcgccg 24360
gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 24420
cgcagggact tcctttgtcc caaatctggc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac 24480
cccctctagc gggcgcgggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag 24540
ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccatc tccagcctcg gggctgccgc 24600
agggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga 24660
ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc 24720
tgggcaacgt gctggttgcc accatgtcta gatctgttgc tcttgctgtt cttgctctgt 24780
tgtctctgtc tggtctggaa gctgtgatgg caccgagaac cctcatcctc gggggcggag 24840
gttcaggagg cggtgggagc ggcggagggg gttccatcca aagaacccct aaaatccagg 24900
tttactctag gcacccagct gaaaacggca aatctaactt cctgaactgt tatgtttctg 24960
gtttccaccc ctctgacatt gaagttgact tactgaaaaa tggtgaaagg atagaaaaag 25020
ttgaacactc tgacctgtct ttctctaaag actggtcttt ctacttactg tactacactg 25080
aattcacccc tacagaaaaa gatgaatatg cttgtagagt taaccatgtt accctgtctc 25140
aaccaaaaat tgttaaatgg gacagagaca tgggtggcgg agggtctggc gggggtggaa 25200
gcgggggtgg aggctccgga ggtgggggca gtggtagtca ttccttaaag tacttccaca 25260
cctctgtttc ccgaccaggt aggggtgaac ctaggttcat ctctgttggg tatgttgatg 25320
atacccaatt tgtcagattt gataatgatg ctgcttctcc aagaatggtt ccaagggctc 25380
cttggatgga acaggaaggg tcagaatact gggacagaga aaccagatct gctagagaca 25440
ctgctcaaat attcagagtt aacttgagaa ctttaagagg ttattataat cagtctgagg 25500
caggttccca cactcttcaa tggatgcatg gttgtgaatt gggtccagat ggtagattcc 25560
tcaggggtta tgaacagttt gcctatgatg gaaaagatta tttgaccctt aatgaggacc 25620
taaggtcctg gactgcagtt gatacagcag cccagatttc agaacaaaag tctaatgatg 25680
cttctgaagc tgaacaccaa agagcgtatt tagaggatac ttgtgtagaa tggttacaca 25740
agtacttgga aaagggtaag gaaaccttac tacacttgga acctcctaag acccatgtca 25800
cacatcatcc aatctctgac catgaagcaa cactaaggtg ttgggcacta ggtttttacc 25860
ctgctgaaat taccctcacc tggcaacaag atggtgaagg tcacacccaa gacactgaac 25920
tagtagagac aagacctgct ggggatggta catttcaaaa atgggctgct gtggtagttc 25980
ctagtgggga agaacaaagg tatacctgtc atgttcaaca tgaggggtta ccagaaccag 26040
ttacccttag gtggaaacca gcttctcaac ctactattcc aattgttggt atcattgctg 26100
gtcttgtctt gttgggttct gttgtttctg gtgctgttgt ggcagcagtg atctggagga 26160
aaaaatcatc tggtggtaag ggtggttctt actctaaggc tgaatggtca gattcagctc 26220
aagggagtga atctcactct ttgggcagtg gcgccaccaa ttttagcctg ttaaagcagg 26280
ctggcgacgt ggaggagaat cctgggccta tgtggcctct ggtagcagca cttcttttag 26340
gttcagcatg ttgtggttca gctcaactac tgttcaacaa aaccaaatct gttgaattca 26400
ccttctgtaa tgacacagtt gttatcccat gttttgttac caacatggaa gctcagaaca 26460
ccacagaagt ttatgttaaa tggaaattca aaggtagaga catctacacc tttgatggtg 26520
ctctgaacaa atctacagtt cccactgact tctcttctgc taaaatagaa gtttctcaat 26580
tactgaaagg tgatgcttct ctgaaaatgg acaaatctga tgctgtttct cacacaggca 26640
actacacttg tgaagttaca gaactgacca gagaaggtga aaccatcatt gaactgaaat 26700
acagagttgt ttcttggttc tctcctaatg aaaacatcct gattgttatc ttccccatct 26760
ttgctatcct tctgttctgg ggtcagtttg gtatcaaaac cctgaaatac agatctggtg 26820
gtatggatga aaaaaccatt gctttactgg ttgctggtct ggttatcact gttatagtta 26880
tagttggtgc tatcctgttt gttccaggtg aatactctct gaaaaatgct acaggtctgg 26940
gtctgatagt tacctctact ggtatcctga tcttacttca ctactatgtt ttctctacag 27000
ctattggtct gacctctttt gttatagcta tcctggttat ccaggttatt gcttacatcc 27060
tggctgttgt tggtctgtct ctgtgtattg ctgcttgtat ccccatgcat ggtcctcttc 27120
tgatctctgg tctgtctatc ctggctctgg ctcaattact gggtctggtt tacatgaaat 27180
ttgttgcttc taaccaaaaa accatccaac cacctaggaa agctgttgaa gaacctctgc 27240
tttcaaagaa tctaaaggta tgatgaatac gaaggcagcg gcgccaccaa ctttagcttg 27300
ctgaagcaag caggggacgt cgaagagaat cctgggccta tgaggatctt tgctgttttt 27360
atcttcatga cgtactggca ccttctgaat gctttcacag ttactgttcc aaaagacctg 27420
tatgttgttg aatatggttc taacatgacc atagaatgta aattcccagt tgaaaaacaa 27480
ctggacctgg ctgctctgat tgtttactgg gaaatggagg ataaaaacat catccagttt 27540
gttcatggtg aagaggatct gaaagttcaa cactcttctt acagacaaag agctaggtta 27600
ctgaaagacc aactgtctct gggtaatgct gctctacaga tcacagatgt taaattacag 27660
gatgctggtg tttacagatg tatgatctct tatggtggtg ctgactacaa aaggatcaca 27720
gttaaagtta atgctcccta caacaaaatc aaccaaagaa tcctggttgt tgaccccgtt 27780
acctctgaac atgaactgac ctgtcaggct gaaggttacc ctaaagctga agttatctgg 27840
acctcttctg accaccaggt tctgtctggt aaaaccacca ccaccaactc taaaagggaa 27900
gaaaaactgt tcaatgttac ctctacctta agaatcaaca ccaccaccaa tgaaatcttc 27960
tactgtacct tcaggaggct ggacccagaa gaaaaccaca ctgctgaact ggttatccct 28020
gaattacctc tggctcaccc tcccaatgaa agaacccacc tggttatcct gggtgctatc 28080
ctactgtgtc tgggtgttgc tctgaccttc atcttcaggt taaggaaagg tagaatgatg 28140
gatgttaaaa aatgtggtat ccaggacacc aactctaaaa aacagtctga cacccacctg 28200
gaagaaacct gataaaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt tggttttttg 28260
tgtgaatcga tagtactaac atacgctctc catcaaaaca aaacgaaaca aaacaaacta 28320
gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtgca ggtgccagaa catttctctt gaggccaagt 28380
gtgactttgt ggtgtggctg ggttgggggc agcagagggt gaaccctgca ggagggtgaa 28440
ccctgcaaaa gggtggggca gtgggggcca acttgtcctt acccagagtg caggtgtgtg 28500
gagatccctc ctgccttgac attgagcagc cttagagggt gggggaggct caggggtcag 28560
gttcctgttc ctgcttattg gggagttcct ggcctggccc ttctatgtct ccccaggtac 28620
cccagttttt ctgggttcac ccagagtgca gatgcttgag gaggtgggaa gggactattt 28680
gggggtgtct ggctcaggtg ccatgcctca ctggggctgg ttggcacctg catttcctgg 28740
gagtggggct gtctcagggt agctgggcac ggtgttccct tgagtggggg tgtagtgggt 28800
gttcctagct gccacgcctt tgccttcacc tatgggatcg tggctgtcag ccttgagggt 28860
cagcctggcc caggctccca taggcttagg agaggccgca attcctacct gttcatccag 28920
acagaggggg acctggaatc aaagtcaagt tggggtaggg ggtccatggg gccatatctg 28980
gcctgcagac agctctggtt agctatgggc tgaggtctgg attctgcctt gtgactggag 29040
actgggcgcc atcccgtggc ctctgagggc ccagtttgtt cgtgacccat gctgcagagg 29100
gagataccca ggctcctgga cctcagggcc tgcctggcac tgcaggccag gttctctttt 29160
tatttctgag caggggtctt gtgttgccca ggctggagtg taatggcaca accatggctc 29220
actgcagcct caactttggg ctcaagcaat tctcctgcct cagcctccca agtagctgaa 29280
actacacagg catgccccag cacgcccagc tagttgcagg tcagattctc attgttctac 29340
agggccctga gttaaatact ctcgcaagaa gaaaccaagc ctggcctgcc ttccctctgc 29400
tagaagctgt gattgacacc agcagagaat gaaggaagaa aagggggtga ggatcccttg 29460
cagggatgcc gagtttgcag gtggcttgac tgaaaaaaaa aagaaaaaga aaacacctac 29520
tttcctctcc atggaaacag catgccagaa aattttgtgg acccttgaaa tgagcacaca 29580
tctcacttgc aaaagcacag caccagcgcc ctctgctgtt tcctggtttg atttagaact 29640
cagagaagct acagtacttt ctagactaaa ataccatgta gagttcagga taattatatt 29700
ctagattaga cataggcaag cacatttata ttagtacatt ctgtagtata ttccagagtg 29760
aaggaaatca aagtttatga ctcactgact ccgtcctgga gttggatgag agataatggc 29820
cttacgttgt gccaggggag ggtcgggctg gatttagcaa gatttacctt ctccaaagag 29880
cggtgctgca gtggcacagc tgcccacgga ggtggggggg tcaccgtccc tggaggtgat 29940
gaagaactgt ggggatgtgg cactgaggga catggccagt gggcacggtg ggtgggttgg 30000
ggttggtctt ggggatcttg gagggctttt ccagccttca tgatttgacg attgtatgaa 30060
catctacatg gcaattctcc agctgcctgt cccagtccta ctgacccagc tgtatctctc 30120
caggcaagct cttccacccc ttctgcttgc atccagacac catcaaacat gcaggctcag 30180
acacattttc cccgtatccc cccaggtgtc tgcaggctca aagagcagcg agaagcgttc 30240
agaggaaagc gatcccgtgc caccttcccc gtgcccgggc tgtccccgca cgctgccggc 30300
tcggggatgc ggggggagcg ccggaccgga gcggagcccc gggcggctcg ctgctgcccc 30360
ctagcggggg agggacgtaa ttacatccct gggggctttg ggggggggct gtccccgcct 30420
cacacgtacg cgtacgatgc ataacttcgt ataatgtgta ctatacgaag ttatataact 30480
tcgtatagga tactttatac gaagttatgt ttcagcggcc gcgattcctt ttttagggcc 30540
cattggtatg gctttttccc cgtatccccc caggtgtctg caggctcaaa gagcagcgag 30600
aagcgttcag aggaaagcga tcccgtgcca ccttccccgt gcccgggctg tccccgcacg 30660
ctgccggctc ggggatgcgg ggggagcgcc ggaccggagc ggagccccgg gcggctcgct 30720
gctgccccct agcgggggag ggacgtaatt acatccctgg gggctttggg ggggggctgt 30780
ccctgatatc tataacaaga aaatatatat ataataagtt atcacgtaag tagaacatga 30840
aataacaata taattatcgt atgagttaaa tcttaaaagt cacgtaaaag ataatcatgc 30900
gtcattttga ctcacgcggt cgttatagtt caaaatcagt gacacttacc gcattgacaa 30960
gcacgcctca cgggagctcc aagcggcgac tgagatgtcc taaatgcaca gcgacggatt 31020
cgcgctattt agaaagagag agcaatattt caagaatgca tgcgtcaatt ttacgcagac 31080
tatctttcta gggttaa 31097
<210> 213
<211> 26999
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 有效载荷12G序列
<400> 213
ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg cgtaaaattg 60
acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa tagatattaa 120
gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt tatttatgtt 180
tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta acaaaacttt 240
tatgagggac agcccccccc caaagccccc agggatgtaa ttacgtccct cccccgctag 300
ggggcagcag cgagccgccc ggggctccgc tccggtccgg cgctcccccc gcatccccga 360
gccggcagcg tgcggggaca gcccgggcac ggggaaggtg gcacgggatc gctttcctct 420
gaacgcttct cgctgctctt tgagcctgca gacacctggg gggatacggg gaaaaggcct 480
ccacggccat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atagaatgga aggttgtgtt 540
gaagcgcggg gacagccccc ccccaaagcc cccagggatg taattacgtc cctcccccgc 600
tagggggcag cagcgagccg cccggggctc cgctccggtc cggcgctccc cccgcatccc 660
cgagccggca gcgtgcgggg acagcccggg cacggggaag gtggcacggg atcgctttcc 720
tctgaacgct tctcgctgct ctttgagcct gcagacacct ggggggatac ggggaaaatg 780
tgtctgagcc tgcatgtttg atggtgtctg gatgcaagca gaaggggtgg aagagcttgc 840
ctggagagat acagctgggt cagtaggact gggacaggca gctggagaat tgccatgtag 900
atgttcatac aatcgtcaaa tcatgaaggc tggaaaagcc ctccaagatc cccaagacca 960
accccaaccc acccaccgtg cccactggcc atgtccctca gtgccacatc cccacagttc 1020
ttcatcacct ccagggacgg tgaccccccc acctccgtgg gcagctgtgc cactgcagca 1080
ccgctctttg gagaaggtaa atcttgctaa atccagcccg accctcccct ggcacaacgt 1140
aaggccatta tctctcatcc aactccagga cggagtcagt gagggcacac cggcgcgccg 1200
gagccgagag taattcatac aaaaggaggg atcgccttcg caaggggaga gcccagggac 1260
cgtccctaaa ttctcacaga cccaaatccc tgtagccgcc ccacgacagc gcgaggagca 1320
tgcgctcagg gctgagcgcg gggagagcag agcacacaag ctcatagacc ctggtcgtgg 1380
gggggaggac cggggagctg gcgcggggca aactgggaaa gcggtgtcgt gtgctggctc 1440
cgccctcttc ccgagggtgg gggagaacgg tatataagtg cggcagtcgc cttggacgtt 1500
ctttttcgca acgggtttgc cgtcagaacg caggtgaggg gcgggtgtgg cttccgcggg 1560
ccgccgagct ggaggtcctg ctccgagcgg gccgggcccc gctgtcgtcg gcggggatta 1620
gctgcgagca ttcccgcttc gagttgcggg cggcgcggga ggcagagtgc gaggcctagc 1680
ggcaaccccg tagcctcgcc tcgtgtccgg cttgaggcct agcgtggtgt ccgcgccgcc 1740
gccgcgtgct actccggccg cactctggtc tttttttttt tgttgttgtt gccctgctgc 1800
cttcgattgc cgttcagcaa taggggctaa caaagggagg gtgcggggct tgctcgcccg 1860
gagcccggag aggtcatggt tggggaggaa tggagggaca ggagtggcgg ctggggcccg 1920
cccgccttcg gagcacatgt ccgacgccac ctggatgggg cgaggcctgg ggtttttccc 1980
gaagcaacca ggctggggtt agcgtgccga ggccatgtgg ccccagcacc cggcacgatc 2040
tggcttggcg gcgccgcgtt gccctgcctc cctaactagg gtgaggccat cccgtccggc 2100
accagttgcg tgcgtggaaa gatggccgct cccgggccct gttgcaagga gctcaaaatg 2160
gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aagagggcct 2220
ggtccctcac cggctgctgc ttcctgtgac cccgtggtcc tatcggccgc aatagtcacc 2280
tcgggctttt gagcacggct agtcgcggcg gggggagggg atgtaatggc gttggagttt 2340
gttcacattt ggtgggtgga gactagtcag gccagcctgg cgctggaagt catttttgga 2400
atttgtcccc ttgagttttg agcggagcta attctcgggc ttcttagcgg ttcaaaggta 2460
tcttttaaac ccttttttag gtgttgtgaa aaccaccgct aattcaaagc aatgccacca 2520
tgttaggtgt tctggttctt ggtgcactgg ctctggcagg tttaggtttc cccgctcctg 2580
ctgaaccaca accaggtggt tctcagtgtg ttgaacatga ctgttttgct ctgtaccccg 2640
gtcccgctac cttcctgaat gcttctcaga tctgtgatgg tcttaggggt cacctgatga 2700
cagttcgcag ctctgttgct gctgatgtta tctctttatt actgaatggt gatggtggtg 2760
ttggtaggag gagactgtgg attggactgc aactaccacc aggttgtggt gaccctaaaa 2820
gactgggtcc tcttagaggt ttccagtggg ttacaggtga caacaacacc tcttactcta 2880
gatgggctag actggacctg aatggtgctc ctctgtgtgg tcctctgtgt gttgctgttt 2940
ctgctgctga agctactgtt ccttctgaac ctatctggga agaacaacag tgtgaagtta 3000
aagctgatgg tttcctgtgt gaattccact tccccgctac ctgtagacca ctggctgttg 3060
aacccggtgc tgctgctgct gctgtttcta tcacctatgg tacccctttt gctgctagag 3120
gtgctgactt ccaggctcta ccagttggtt cttctgctgc tgttgctcct ctgggcttac 3180
aactgatgtg tacagctcca cccggtgctg ttcagggtca ctgggctaga gaagctcccg 3240
gtgcttggga ctgttctgtt gaaaatggtg gttgtgaaca tgcttgtaat gctatccctg 3300
gtgctcctag gtgtcagtgt cctgctggtg ctgctcttca ggctgatggt agatcttgta 3360
ctgcttctgc tacccagtct tgtaatgacc tgtgtgaaca cttctgtgtt cccaaccccg 3420
accaacccgg ttcttactct tgtatgtgtg aaacaggtta cagactggcc gctgaccaac 3480
acagatgtga agatgttgat gactgtatcc tggaaccctc tccatgtcca caacgctgtg 3540
ttaacaccca gggtggtttt gaatgtcact gttaccctaa ctatgacctg gttgatggtg 3600
aatgtgttga acccgttgac ccctgtttca gggctaactg tgaataccag tgtcaacctc 3660
tgaaccagac ctcttacctg tgtgtttgtg ctgaaggttt tgctccaatc cctcatgaac 3720
ctcacaggtg tcagatgttc tgtaaccaga cagcttgtcc cgctgactgt gaccctaaca 3780
cccaggcttc ttgtgaatgt ccagaaggtt acatcctgga tgatggtttc atctgtacag 3840
acattgatga atgtgaaaat ggtggtttct gttctggtgt ttgtcacaac cttcccggta 3900
cctttgaatg tatctgtggt cccgactctg ctctggctag acacattggt acagactgtg 3960
actctggtaa agttgatggt ggtgactctg gttctggtga acctcctccc tctccaaccc 4020
ccggttctac cctgacccca ccagctgttg gtctggttca ctctggtcta ctgataggta 4080
tctctatagc ttctctgtgt ctggttgttg ctctactggc tctactgtgt caccttagga 4140
aaaaacaggg tgctgctagg gctaaaatgg aatacaaatg tgctgctcca tctaaagaag 4200
ttgttttaca acatgttagg actgaaagga cccctcaaag gctgggcagc ggcgcgacca 4260
acttttcgct ccttaagcag gccggggacg tggaggagaa tccagggcct atctacacta 4320
tgaaaaaagt acatgcttta tgggcctctg tttgtttact tctgaacctg gctcctgctc 4380
ctctgaatgc tgactctgaa gaagatgaag aacacaccat catcacagac actgaacttc 4440
ctccactgaa actgatgcac tctttctgtg ctttcaaagc tgatgatggt ccttgtaaag 4500
ctatcatgaa aaggttcttc ttcaacatct tcaccagaca gtgtgaagaa ttcatctatg 4560
gtggttgtga aggtaaccag aacagatttg aatctctgga agaatgtaag aaaatgtgta 4620
ccagggacaa tgctaacagg atcatcaaaa ccaccctaca acaggaaaaa ccagacttct 4680
gtttcctgga agaggatcct ggtatctgta gaggttacat caccaggtac ttctacaaca 4740
accagaccaa acagtgtgaa agattcaaat atggtggttg tctgggtaac atgaacaact 4800
ttgaaaccct ggaagaatgt aaaaacatct gtgaagatgg tcccaatggt ttccaggttg 4860
acaactatgg tacccaactg aatgctgtta acaactctct gacccctcag tctaccaaag 4920
ttccctctct gtttgaattc catggtcctt cttggtgtct gacccctgct gacagaggtc 4980
tgtgtagagc taatgaaaac aggttctact acaactctgt tataggtaaa tgtagaccct 5040
tcaaatactc tggttgtggt ggtaatgaaa acaacttcac ctctaaacag gaatgtttaa 5100
gggcttgtaa aaaaggtttc atccaaagaa tctctaaagg tggtctgatc aaaaccaaaa 5160
gaaaaagaaa aaaacaaaga gttaaaatag cttatgaaga aatctttgtt aaaaacatgt 5220
acttacagga actgggaggt tcagggggag gagggtccgg tgggggtggt tctggtggtt 5280
gtagaaatgg taaaaccctg tctgtttctc aactggaact tcaggactct ggtacctgga 5340
cctgtacagt tctacagaac cagaaaaaag ttgaattcaa aatagacata gttgttctgg 5400
ctttccagaa agcttcttct atagtttaca aaaaagaagg tgaacaggtt gaattctctt 5460
tcccactggc tttcactgtt gaaaaactga ctggttctgg tgaactgtgg tggcaggctg 5520
aaagggcttc ttcttctaaa tcttggatca cctttgacct gaaaaacaaa gaagtttctg 5580
ttaaaagggt tacccaggac ccaaaattac agatgggtaa aaaattacct cttcacctga 5640
ccctaccaca ggctcttcca cagtatgctg gttctggtaa cctgaccctg gctctggaag 5700
ctaaaactgg taaactacac caggaagtta acctggttgt tatgagagct acccaacttc 5760
agaaaaacct gacctgtgaa gtttggggtc caacctctcc aaaactgatg ctgtctctga 5820
aactggaaaa caaagaagct aaagtttcta aaagagaaaa agctgtttgg gttctgaacc 5880
cagaagctgg tatgtggcag tgcctgctgt ctgactctgg tcaggtttta ctggaatcta 5940
acatcaaagt tcttcctacc tggtctaccc ctgttcaacc aatggctctg attgttctgg 6000
gtggtgttgc tgggcttctt ctgttcatag gtctgggtat cttcttctgt gttaggtgtc 6060
gacacagaag gagacaggct gaaagaatgt ctcagatcaa aaggttccgt cagaaagatg 6120
atggtaaatg tccactgaac ccacactctc acctgggtac ctatggtgtt ttcaccaatg 6180
ctgcttttga cccctctcct ggcagcggag cgaccaactt tagccttctg aaacaggctg 6240
gggacgtgga ggagaatcct gggcctatgg aggataccaa agaatctaat gttaaaactt 6300
tctgttctaa aaacatcctg gctatcctgg gtttctcttc tatcattgct gttattgctt 6360
tactggctgt tggtctgacc cagaacaaag ctttacctga aaatgttaaa tatggtattg 6420
ttctggatgc tggttcttct cacacctctc tgtacatcta caaatggccc gctgaaaaag 6480
aaaatgacac aggtgttgtt caccaggttg aagaatgtag agttaaaggt cctggtatct 6540
ctaaatttgt tcagaaagtt aatgaaattg gtatctacct gactgactgt atggaaagag 6600
ctagggaagt tatccctcgt tcgcaacacc aggaaacccc cgtttacctg ggtgctactg 6660
ctggtatgag attactaaga atggaatctg aagaactggc tgacagagtt ctggatgttg 6720
ttgaaagatc tctgtctaac tacccctttg acttccaggg tgctaggatc atcacaggtc 6780
aggaagaagg tgcttatggt tggatcacca tcaactacct tctgggtaaa ttctctcaga 6840
aaaccaggtg gttctctata gttccatatg aaaccaacaa ccaggaaacc tttggtgctc 6900
tggacctggg tggtgcttct acccaggtta cctttgttcc tcagaaccag accattgaat 6960
ctcctgacaa tgctctacag ttcagactgt atggtaaaga ctacaatgtt tacacccact 7020
ctttcctgtg ttatggtaaa gaccaggctc tgtggcagaa actggctaaa gacatccagg 7080
ttgcttctaa tgaaatcctt agggaccctt gtttccaccc tggttacaaa aaagttgtta 7140
atgtttctga cctgtacaaa accccttgta ccaaaagatt tgaaatgacc ttacccttcc 7200
aacagtttga aatccagggt attggtaact accaacagtg tcaccagtct atcctggaac 7260
tgttcaacac ctcttactgt ccctactctc agtgtgcttt caatggtatc ttcttacctc 7320
ctctacaggg tgactttggt gctttctctg ctttctactt tgttatgaaa ttcctgaacc 7380
tgacctctga aaaagtttct caggaaaaag ttactgaaat gatgaaaaaa ttctgtgctc 7440
aaccctggga agaaatcaaa acctcttatg ctggtgttaa agaaaaatac ctgtctgaat 7500
actgtttctc tggtacctac atcctgtctt tattactgca aggttaccac ttcactgctg 7560
actcttggga acacatccac ttcatcggta aaatccaggg ttctgatgct ggttggaccc 7620
tgggttacat gctgaacctg accaacatga tccccgctga acaacctctg tctaccccac 7680
tgtctcactc tacctatgtt ttcctgatgg ttctgttctc tctggttctg ttcaccgttg 7740
ctatcatagg tctactgatc ttccacaaac catcttactt ctggaaagac atggttggca 7800
gcggcgccac caatttctca ctactgaaac aggccggtga cgtcgaggag aaccccgggc 7860
ctgaaaggcc acaaccagat tctatgccac aagacctgtc tgaagcactg aaagaagcta 7920
ccaaagaagt tcacacccag gctgaaaatg ctgaattcat gagaaacttc cagaaaggtc 7980
aggttaccag agatggtttc aaactggtta tggcttctct gtaccacatc tatgttgctc 8040
tggaagaaga aatagaaaga aacaaagaat ctcctgtttt tgctccagtt tacttcccag 8100
aagaactaca caggaaagct gctctggaac aggacctggc tttctggtat ggtcctagat 8160
ggcaggaagt tatcccatac acccccgcta tgcaaaggta tgttaaaaga cttcatgaag 8220
ttggtaggac agaaccagaa ttactggttg ctcatgctta caccagatac ctgggtgacc 8280
tgtctggtgg tcaggttctg aaaaaaatag ctcagaaagc tctggaccta ccttcttctg 8340
gtgaaggtct ggctttcttc accttcccaa acatagcttc tgctaccaaa ttcaaacaac 8400
tgtacaggtc taggatgaac tctctggaaa tgacccccgc tgttaggcaa agagttattg 8460
aagaagctaa aacagctttc ctactgaaca tccaactgtt tgaagaatta caggaactac 8520
tgacccatga caccaaagac cagtctccat ctagggctcc cggtttaaga caaagggctt 8580
ctaacaaagt tcaggactct gctccagttg aaacccctag aggtaaacct cctctgaaca 8640
ccagatctca ggctccttta ttaagatggg ttctgaccct gtctttcctg gttgctactg 8700
ttgctgttgg tctgtatgct atgtgataag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa 8760
aggttccttt gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag 8820
catctggatt ctgcctaata aaaaacattt attttcattg caatgatgta tttaaattat 8880
ttctgaatat tttactaaaa agggaatgtg ggaggtcagt gcatttaaaa cataaagaaa 8940
tgaagagcta gttcaaacct tgggaaaata cactatatct taaactccat gaaagaaggt 9000
gaggctgcaa acagctaatg cacattggca acagcccctg atgcatatgc cttattcatc 9060
cctcagaaaa ggattcaagt agaggcttga tttggaggtt aaagttttgc tatgctgtat 9120
tttacattac ttattgtttt agctgtcctc atgaatgtct tttcactacc catttgctta 9180
tcctgcatct ctcagccttg actccactca gttctcttgc ttagagatac cacctttccc 9240
ctgaagtgtt ccttccatgt tttacggcga gatggtttct cctcgcctgg ccactcagcc 9300
ttagttgtct ctgttgtctt atagaggtct acttgaagaa ggaaaaacag gggtcatggt 9360
ttgactgtcc tgtgagccct tcttccctgc ctcccccact cacagtgacc cggaatctgc 9420
agtgctagtc tcccggaact atcactcttt cacagtctgc tttggaagga ctgggcttag 9480
tatgaaaagt taggactgag aagaatttga aaggcggctt tttgtagctt gatattcact 9540
actgtcttat taccctgtca taggcccacc ccaaatggaa gtcccattct tcctcaggat 9600
gtttaagatt agcattcagg aagagatcag aggtctgctg gctcccttat catgtccctt 9660
atggtgcttc tggctctgca gttattagca tagtgttacc atcaaccacc ttaacttcat 9720
ttttcttatt caatacctag gtaggtagat gctagattct ggaaataaaa tatgagtctc 9780
aagtggtcct tgtcctctct cccagtcaaa ttctgaatct agttggcaag attctgaaat 9840
caaggcatat aatcagtaat aagtgatgat agaagggtat atagaagaat tttattatat 9900
gagagggtga aaccctcaaa atgaaatgaa atcagaccct tgtcttacac cataaacaaa 9960
aaggctttga tttccttcac tctggaatat actacagaat gtactaatat aaatgtgctt 10020
gcctatgtct aatctagaat ataattatcc tgaactctac atggtatttt agtctagaaa 10080
gtactgtagc ttctctgagt tctaaatcaa accaggaaac agcagagggc gctggtgctg 10140
tgcttttgca agtgagatgt gtgctcattt caagggtcca caaaattttc tggcatgctg 10200
tttccatgga gaggaaagta ggtgttttct ttttcttttt ttttttcagt caagccacct 10260
gcaaactagg ccagagtgaa ggaaatcaaa accacatttg tagaggtttt acttgcttta 10320
aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt 10380
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 10440
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgaccac 10500
atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca 10560
taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 10620
aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 10680
tttgtccaaa ctcatcaatg aattaattcg ccctttggtt ctttccgcct cagaagccat 10740
agagcccacc gcatccccag catgcctgct attgtcttcc caatcctccc ccttgctgtc 10800
ctgccccacc ccacccccca gaatagaatg acacctactc agacaatgcg atgcaatttc 10860
ctcattttat taggaaagga cagtgggagt ggcaccttcc agggtcaagg aaggcacggg 10920
ggaggggcaa acaacagatg gctggcaact agaaggcaca tttatcaacc gtacatctgt 10980
ttgaactgga aacattcatt acagtaacca ttacatttag cattaccaaa gtggtcacaa 11040
gcaggagctc tacatctttg ttttggagga tcctctggag caggttcacc cctgtgagca 11100
ccaggaccca ttctttggtt agggtgttga cattccatac acagttcttc agacctacaa 11160
gccaggatgt ttttacaaga agctctagca catttaggtc tagaggtaga ctgggtggtc 11220
ctaggaacat ctcttctttg agaagatcta agttgttctt ctgttctttt agcttcatgg 11280
aatctttggt tctgagcttc aatgaaacat ttctgacagt aaccttcaaa catggtagaa 11340
cccagggtac cacattctct acccagacat gggatggtgt tctggaacct agaagctgtg 11400
ggagaaactt taccagaagc agcagcaaag tgtttgtttt ctctgtattc tatgaaacac 11460
agggtacaga aacctttgtt ttcaggggta ccaaagtaaa cacaaccagc tttcctacat 11520
ttagaggtac ctgttctgtc accgggggtc ctagcagcct gagacagaca accagctgga 11580
gcatcattac cagctctgtg acaagagtgt ggagaaggag atctaaccag cctagatggg 11640
tcagatttag acctttggtg acaagagggt ggtagagagg tagacagaga agaagaagct 11700
tcagcagtgg tccttttgaa acaggtagaa cagataccat tgaaggttct ggtaacatcc 11760
tggaggcaag cctgacattt acctgggtcc aggtgtctgg tgtggtctgg agcatgagaa 11820
gcatgaagtt gtctagcatt gtgacatctt tcacagaaac cattgtgttg aacattcagg 11880
gtgaagggac aaccaggact gcgacatttc atagcagtgg tttcagagaa caggaaagga 11940
gatggagctg ttggaggagc agagtgtgga ccaccagtag attcttcggg gttccaagcc 12000
agaggttcat aagcttcacc tctagaagca cccagagcca taccaggtaa accttcggga 12060
ccaggtttag agttcagttt tggaagtttg ttctggtttt tctgccgacg ttcagaacat 12120
tcatgacaca gtggttgggt gttaacagac atgaagaagg gacagttggg ggtttcacat 12180
ttaacatcca tcagagacag ttgaggaaca gatggttcca tggggttctg agcatgacct 12240
tctcttctac cctgttcaga gttttcctgc cattttttgt attcatgttg aaccagttca 12300
aagtagtcat caaccaggtt gatttcttta ggtaagttag cttcatccag tttagcagca 12360
ttgatcaggt gggtggtacc atggtcccaa ccctgaacag ggatttcaat aaccatcagg 12420
tattctttca gtaatttttc tttcatttca ttttctgggt ctgtcaggaa gtgaactttc 12480
agatcctcaa acctacccct gtctctgtta accagaggaa cagccctgat ttctggacca 12540
gagtctttca gggtaaccag tggaacaaag tggtgagagt cataacccag aactatgggg 12600
tatctgtaac attcctgagc tggccagtga agaggtaagt agataccacc aactttcaga 12660
ggagcaaagt tagaaccaga ttccagtgag cgaagcattt tgtcagagat aactatgatt 12720
ggcctccgaa ggatgttaca cagaacaaag atgtggattt cttccagaga gttgtactgt 12780
aaaccagacc tagccatggg ggtgtcagta gaagccattt tgatcaggtt gtcccattca 12840
tcattccagt ttctggtgtc ataacacaga cctgtttcaa caaattcctg agatttcaga 12900
gattccagtt gccacctgaa tttgaagttt ctggtgtctg tttctttcag ggtagagaac 12960
agagcttttc ttagaaccag gtctgtgtcc tgaacacccc acatgtactg agaggtagca 13020
tgcatcagac agttaccatc accattggtt ttcagagcaa ccagtttcct aacttcccta 13080
caccagttca gttttttctg agattccagg gtagcctgga tgttcctgtc tatcagagct 13140
ttgtggatga tttccctgaa ctgtggacag aactgacagg ttctgaacat ttccagggtg 13200
tatctgtgca tggttttgaa gtggtggatg ataccattgg ttggtttgaa gatatcctca 13260
ggggtccttt ctctgatttt tacagctttt ctcatgttag acaggtacag agcttgaggg 13320
agaacttgtt cagccattgg tccagggttc tcttccacat ctccagcttg tttcagtagg 13380
ctgaaatttg ttgcgccact gcccgggtgt aaagaccaag cagcagccag gaaaggggta 13440
accagtagaa gaactgtttt ttcagacaga gaggtaccac cattttccag ttgttcattg 13500
aagttacaca ggtctttttt acaacagtag taggtcagtt cattttctct taatctggtg 13560
gtaacatcat tgaagttaca gtgttcaaat ttccaacatt tgttgtaaac ctgcaggcca 13620
gctttggtga tcagacaagc atcaaagtca gaagaacagt taacagctgt tttacagtca 13680
gcagtagggt tgggacagtt gtaacactga agagagtgac cagagtgaca gaaaacagcc 13740
agaaccagta acagaccaaa cagaacagaa ccaccttgga tacccatagg ccccgggttc 13800
tcctctacgt ccccggcctg cttgagcagg ctgaaattcg tggctccgct gccggtcagt 13860
agccccatgg taaccagggt acccagtaga ccagtcaggg tgaaacaggt gtgaccagac 13920
agaagcctgg tggtaccaga ggtggtacca gaacctttgt taggggtggt ttcatggaag 13980
tgtttggtgg tcctagaaac gggggtagat ctggtagcct gagcattggg ggtggtggtt 14040
ttggtggtgg ttttctgaga ggtgggagaa acttctgtgg tgggaacatt aactgtggta 14100
ggtttctgaa ctgtaggagg aactttagag gtcagagatt tacccctaca ttcgggagga 14160
ggaccagacc attcaccttc atcattgtta acagtacagt agatagagtg ttcaccaatc 14220
atggtgaaac ctttgttaca agcataggta acagactgcc tgtaaccata gtgatcacgt 14280
tcaccctgga tgataccatt gtctatctga ggaggagctg gacagtagat ttccctacat 14340
tcgggtaaag ggtcagacca ctgaacagaa gaaccagaga tcagacagaa agaagaggta 14400
gaaccaaaca gtttgtaacc agtgttacaa gagaaagaga tggtagcacc aaacaggata 14460
ccaccaggaa catcaatctg accattcctg atttcaccgg ggttgggaca agattttttt 14520
ttacagaatt caacagcagt agaccatttc aggttctgta gacaggtcag tttgggagac 14580
agagagggtt ctcttctgta accaggtcta cattcatatt caacaacagt accaactggg 14640
aagtagttct gggtgatgta gggttgtttc agagaagcag agttcagcct ggtgggaact 14700
tcacaagatc tgttacagaa ttcttctatg tcagaccact gagaaccttt cagacagata 14760
acagagtctt tttcacctgg gattttaaca aaagattctt cacatttgta ggtgataaca 14820
gtatcctcag ggaaagaggt tctaccttcc agagcaggtt gagcattagg aacatctgga 14880
ggtaaaccac agtcacccca aacagcaggg aggcacagta aaacaagtaa taaaagtctt 14940
ggaagttcac ctagaagtgg gagtgctgct ggaacagatg gcctggctac tgtcataggc 15000
ccggggttct cctccacgtc gccagcctgc ttaaggagtg agaagttggt ggctccactg 15060
cccagagagg tgaatttaac ttctctgtgg gtttcatctg tcaggtaggt accttttttt 15120
tttctccttt gaaggtacct gtaaggaaca acacagataa cagcaacacc aacaacaata 15180
gctataacta taacagcaat aacccaaaca tccagagagt ccaggatacc ttcttcaggt 15240
ttagggtaac cagggtagtt agaaacggga ggtttgtagg taggtcttgg accagaagca 15300
gaagaagcag gagatttggt ggtagaagag gtagaaacag agtgagacag agcgggtggt 15360
ttggtagaag agggtggtaa aactttcaga catttgggaa ctggtgggtc ccaggtagag 15420
ttagagtcac aaacaatggt gtcagaacca tccaggtaga aacctttgtc acattcaaac 15480
ataacagtag ctttgtagta gaatttttta ccaaaaccag agatctgttt accattttca 15540
acaactggga atctacattt aacaacttta cattctggag cagctctaga ccaaacagag 15600
ttgtcaccac agtagatggt agattcacca atcagagaga atgggtctgg accaggagca 15660
gggtcacaag agtaggtaac agcatccagg tattcaaaaa cttcaacttc agagaaggtg 15720
tgtttaccat ttttgatttt gggtggtggg gtacacagaa ctttttcaca gatgggaggt 15780
ttaccagacc agatagcaac agaacctttc agttcacagt acaggatttc ttcacctatc 15840
aggtagtaac cttcattaca gatgaagtgc atctggtaac caaattcata ggtaccatta 15900
gctggaacag cctgaccatt cagaggatct cggatgtagg gacaggtttc cctgtaacaa 15960
gcatcatcag aaacaggtaa ccaggtgtgg tttctgtcac agatggtgtg ggtagccaga 16020
ggtgggatgt agaagtaacc ttttttacat ttgtagtcaa ctctttcacc tatttcatag 16080
tatggttttg gtttaccgat cagttccata gcttcaaagg ttggtggttc ttcacaagca 16140
tcagagaaag agtacagtaa aagaaccata gcagccagta gtaaaccagg gaatctccaa 16200
gatgggaagg gacactccct tctaccaggt ggttccatgg tggctcacga cacctgaaat 16260
ggaagaaaaa aactttgaac cactgtctga ggcttgagaa tgaaccaaga tccaaactca 16320
aaaagggcaa attccaagga gaattacatc aagtgccaag ctggcctaac ttcagtctcc 16380
acccactcag tgtggggaaa ctccatcgca taaaacccct ccccccaacc taaagacgac 16440
gtactccaaa agctcgagaa ctaatcgagg tgcctggacg gcgcccggta ctccgtggag 16500
tcacatgaag cgacggctga ggacggaaag gcccttttcc tttgtgtggg tgactcaccc 16560
gcccgctctc ccgagcgccg cgtcctccat tttgagctcc ctgcagcagg gccgggaagc 16620
ggccatcttt ccgctcacgc aactggtgcc gaccgggcca gccttgccgc ccagggcggg 16680
gcgatacacg gcggcgcgag gccaggcacc agagcaggcc ggccagcttg agactacccc 16740
cgtccgattc tcggtggccg cgctcgcagg ccccgcctcg ccgaacatgt gcgctgggac 16800
gcacgggccc cgtcgccgcc cgcggcccca aaaaccgaaa taccagtgtg cagatcttgg 16860
cccgcattta caagactatc ttgccagaaa aaaagcgtcg cagcaggtca tcaaaaattt 16920
taaatggcta gagacttatc gaaagcagcg agacaggcgc gaaggtgcca ccagattcgc 16980
acgcggcggc cccagcgccc aggccaggcc tcaactcaag cacgaggcga aggggctcct 17040
taagcgcaag gcctcgaact ctcccaccca cttccaaccc gaagctcggg atcaagaatc 17100
acgtactgca gccaggtgga agtaattcaa ggcacgcaag ggccataacc cgtaaagagg 17160
ccaggcccgc gggaaccaca cacggcactt acctgtgttc tggcggcaaa cccgttgcga 17220
aaaagaacgt tcacggcgac tactgcactt atatacggtt ctcccccacc ctcgggaaaa 17280
aggcggagcc agtacacgac atcactttcc cagtttaccc cgcgccacct tctctaggca 17340
ccggttcaat tgccgacccc tccccccaac ttctcgggga ctgtgggcga tgtgcgctct 17400
gcccactgac gggcaccgga gcctcaggca ccgaggagac accgtggccc ccgaagcagc 17460
gtgctttaga aagggaataa gaattcccgc ctccgcgccc cactttcacc ccagcggggc 17520
agcgtccgcc atgtgaaagc tccccatccc ccacccccag tgaagggaaa tggcgccggg 17580
aggctgaggg tggggaagct gtttgtacgc tcaggcctcc gctcaagacc ccgttcataa 17640
accttaagcc ccactgctac tgaattggtc cgatttcctg cctctctccc acggaggcgg 17700
ctggccgact tccactgagg cgccaacggc ctcgccatgc ccttttcaat aactcattga 17760
tttcaaaccc gttacgtcca tcgcggactc agtcgcttca gcccgatttc ccgcagccga 17820
gcgagatgag agagatcgat ctccgcggac gaacacgaac cggactcgtc ctggcgctgt 17880
agtgagaact gccgctgctc gagaaacaac tctgcgagga gcacctccgc acgggacccg 17940
gcgctgctgc tactgccgct agagccgctg ccgccgcttt tctagaacct tcccccccac 18000
taacgcgtct tccgctacgt caggccgtcg cgtaaacgcc ctatccgccg ccaatggcgg 18060
gaaggctcta cgccccacct tacgccaaat gcgtactcct cccacccttg cggccagaga 18120
cagtacccga cgttacttcc gtaaatgcgc tcaatgaatt gcggaaggct agagtcctgc 18180
tagttactac ctcttggaat agggtcccgg cccctgcctt ggcgaaggca ggtgagaaac 18240
gtcgcgcagt ttgaaattaa cgccgacggg aggggcttaa tccgcagcct ggagatccag 18300
ccccctcaac ccgggaggtg gtccctgcag ttacgccaat gataaccccc gccagaaaaa 18360
tcttagtagc cttccctttt tgttttccgt gccccaactc ggcggattga ctcggcccct 18420
tccggaaaca cccgaatcaa cttctagtca aattattgtt cacgccgcaa tgacccaccc 18480
ctggcccgcg tctgtggaac tgacccctgg tgtacaggag agttcgctgc tgaaagtggt 18540
cccaaagggg tactagtttt taagctccca actccccctc ccccagcgtc tggaggattc 18600
cacaccctcg caccggcggg cgaggaagtg ggcggagtcc ggttttggcg ccagccgctg 18660
aggctgccaa gcagaaaagc caccgctgag gagactccgg tcactgtcct cgccccgcct 18720
cccccttccc tccccttggg gaccaccggg cgccacgccg cgaacggtaa gtgccgcggt 18780
cgtcggcgcc tccgccctcc ccctagggcc ccaattccca gcgggcgcgg cgccggcccc 18840
tccccccgcc gcgcgcgcgc ccgctgcccc gcccttcgtg gccgcccggc gtgggcggtg 18900
ccacccctcc ccccggcggc cccgcgcgca gctcccggct ccctccccct tcggatgtgg 18960
cttgagctgt aggcgcggag ggccagcgtc attagttcat agcccatata tggagttccg 19020
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 19080
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 19140
atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 19200
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 19260
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 19320
catgggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 19380
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 19440
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcggggg gggggggggg gcgaggcgga 19500
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 19560
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgttgc 19620
cttcgccccg tgccccgctc cgcgccgcct cgcgccgccc gccccggctc tgactgaccg 19680
cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt aattagcgct 19740
tggtttaatg acggctcgtt tcttttctgt ggctgcgtga aagccttaaa gggctccggg 19800
agggcccttt gtgcgggggg gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg 19860
agcgccgcgt gcggcccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg ctgcgggcgc ggcgcggggc 19920
tttgtgcgct ccgcgtgtgc gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg 19980
gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt gcgtgggggg gtgagcaggg 20040
ggtgtgggcg cggcggtcgg gctgtaaccc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga 20100
gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tgcggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc 20160
gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga 20220
gggctcgggg gaggggcgcg gcggccccgg agcgccggcg gctgtcgagg cgcggcgagc 20280
cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc agggacttcc tttgtcccaa 20340
atctggcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcgggcgaa 20400
gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt cgccgcgccg 20460
ccgtcccctt ctccatctcc agcctcgggg ctgccgcagg gggacggctg ccttcggggg 20520
ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag agcctctgct 20580
aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttgccacc 20640
atgtctagat ctgttgctct tgctgttctt gctctgttgt ctctgtctgg tctggaagct 20700
gtgatggcac cgagaaccct catcctcggg ggcggaggtt caggaggcgg tgggagcggc 20760
ggagggggtt ccatccaaag aacccctaaa atccaggttt actctaggca cccagctgaa 20820
aacggcaaat ctaacttcct gaactgttat gtttctggtt tccacccctc tgacattgaa 20880
gttgacttac tgaaaaatgg tgaaaggata gaaaaagttg aacactctga cctgtctttc 20940
tctaaagact ggtctttcta cttactgtac tacactgaat tcacccctac agaaaaagat 21000
gaatatgctt gtagagttaa ccatgttacc ctgtctcaac caaaaattgt taaatgggac 21060
agagacatgg gtggcggagg gtctggcggg ggtggaagcg ggggtggagg ctccggaggt 21120
gggggcagtg gtagtcattc cttaaagtac ttccacacct ctgtttcccg accaggtagg 21180
ggtgaaccta ggttcatctc tgttgggtat gttgatgata cccaatttgt cagatttgat 21240
aatgatgctg cttctccaag aatggttcca agggctcctt ggatggaaca ggaagggtca 21300
gaatactggg acagagaaac cagatctgct agagacactg ctcaaatatt cagagttaac 21360
ttgagaactt taagaggtta ttataatcag tctgaggcag gttcccacac tcttcaatgg 21420
atgcatggtt gtgaattggg tccagatggt agattcctca ggggttatga acagtttgcc 21480
tatgatggaa aagattattt gacccttaat gaggacctaa ggtcctggac tgcagttgat 21540
acagcagccc agatttcaga acaaaagtct aatgatgctt ctgaagctga acaccaaaga 21600
gcgtatttag aggatacttg tgtagaatgg ttacacaagt acttggaaaa gggtaaggaa 21660
accttactac acttggaacc tcctaagacc catgtcacac atcatccaat ctctgaccat 21720
gaagcaacac taaggtgttg ggcactaggt ttttaccctg ctgaaattac cctcacctgg 21780
caacaagatg gtgaaggtca cacccaagac actgaactag tagagacaag acctgctggg 21840
gatggtacat ttcaaaaatg ggctgctgtg gtagttccta gtggggaaga acaaaggtat 21900
acctgtcatg ttcaacatga ggggttacca gaaccagtta cccttaggtg gaaaccagct 21960
tctcaaccta ctattccaat tgttggtatc attgctggtc ttgtcttgtt gggttctgtt 22020
gtttctggtg ctgttgtggc agcagtgatc tggaggaaaa aatcatctgg tggtaagggt 22080
ggttcttact ctaaggctga atggtcagat tcagctcaag ggagtgaatc tcactctttg 22140
ggcagtggcg ccaccaattt tagcctgtta aagcaggctg gcgacgtgga ggagaatcct 22200
gggcctatgt ggcctctggt agcagcactt cttttaggtt cagcatgttg tggttcagct 22260
caactactgt tcaacaaaac caaatctgtt gaattcacct tctgtaatga cacagttgtt 22320
atcccatgtt ttgttaccaa catggaagct cagaacacca cagaagttta tgttaaatgg 22380
aaattcaaag gtagagacat ctacaccttt gatggtgctc tgaacaaatc tacagttccc 22440
actgacttct cttctgctaa aatagaagtt tctcaattac tgaaaggtga tgcttctctg 22500
aaaatggaca aatctgatgc tgtttctcac acaggcaact acacttgtga agttacagaa 22560
ctgaccagag aaggtgaaac catcattgaa ctgaaataca gagttgtttc ttggttctct 22620
cctaatgaaa acatcctgat tgttatcttc cccatctttg ctatccttct gttctggggt 22680
cagtttggta tcaaaaccct gaaatacaga tctggtggta tggatgaaaa aaccattgct 22740
ttactggttg ctggtctggt tatcactgtt atagttatag ttggtgctat cctgtttgtt 22800
ccaggtgaat actctctgaa aaatgctaca ggtctgggtc tgatagttac ctctactggt 22860
atcctgatct tacttcacta ctatgttttc tctacagcta ttggtctgac ctcttttgtt 22920
atagctatcc tggttatcca ggttattgct tacatcctgg ctgttgttgg tctgtctctg 22980
tgtattgctg cttgtatccc catgcatggt cctcttctga tctctggtct gtctatcctg 23040
gctctggctc aattactggg tctggtttac atgaaatttg ttgcttctaa ccaaaaaacc 23100
atccaaccac ctaggaaagc tgttgaagaa cctctgaatg ctttcaaaga atctaaaggt 23160
atgatgaatg acgaaggcag cggcgccacc aactttagct tgctgaagca agcaggggac 23220
gtcgaagaga atcctgggcc tatgaggatc tttgctgttt ttatcttcat gacgtactgg 23280
caccttctga atgctttcac agttactgtt ccaaaagacc tgtatgttgt tgaatatggt 23340
tctaacatga ccatagaatg taaattccca gttgaaaaac aactggacct ggctgctctg 23400
attgtttact gggaaatgga ggataaaaac atcatccagt ttgttcatgg tgaagaggat 23460
ctgaaagttc aacactcttc ttacagacaa agagctaggt tactgaaaga ccaactgtct 23520
ctgggtaatg ctgctctaca gatcacagat gttaaattac aggatgctgg tgtttacaga 23580
tgtatgatct cttatggtgg tgctgactac aaaaggatca cagttaaagt taatgctccc 23640
tacaacaaaa tcaaccaaag aatcctggtt gttgaccccg ttacctctga acatgaactg 23700
acctgtcagg ctgaaggtta ccctaaagct gaagttatct ggacctcttc tgaccaccag 23760
gttctgtctg gtaaaaccac caccaccaac tctaaaaggg aagaaaaact gttcaatgtt 23820
acctctacct taagaatcaa caccaccacc aatgaaatct tctactgtac cttcaggagg 23880
ctggacccag aagaaaacca cactgctgaa ctggttatcc ctgaattacc tctggctcac 23940
cctcccaatg aaagaaccca cctggttatc ctgggtgcta tcctactgtg tctgggtgtt 24000
gctctgacct tcatcttcag gttaaggaaa ggtagaatga tggatgttaa aaaatgtggt 24060
atccaggaca ccaactctaa aaaacagtct gacacccacc tggaagaaac ctgataaaat 24120
aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt tgtgtgaatc gatagtacta 24180
acatacgctc tccatcaaaa caaaacgaaa caaaacaaac tagcaaaata ggctgtcccc 24240
agtgcaagtg caggtgccag aacatttctc ttgaggccaa gtgtgacttt gtggtgtggc 24300
tgggttgggg gcagcagagg gtgaaccctg caggagggtg aaccctgcaa aagggtgggg 24360
cagtgggggc caacttgtcc ttacccagag tgcaggtgtg tggagatccc tcctgccttg 24420
acattgagca gccttagagg gtgggggagg ctcaggggtc aggttcctgt tcctgcttat 24480
tggggagttc ctggcctggc ccttctatgt ctccccaggt accccagttt ttctgggttc 24540
acccagagtg cagatgcttg aggaggtggg aagggactat ttgggggtgt ctggctcagg 24600
tgccatgcct cactggggct ggttggcacc tgcatttcct gggagtgggg ctgtctcagg 24660
gtagctgggc acggtgttcc cttgagtggg ggtgtagtgg gtgttcctag ctgccacgcc 24720
tttgccttca cctatgggat cgtggctgtc agccttgagg gtcagcctgg cccaggctcc 24780
cataggctta ggagaggccg caattcctac ctgttcatcc agacagaggg ggacctggaa 24840
tcaaagtcaa gttggggtag ggggtccatg gggccatatc tggcctgcag acagctctgg 24900
ttagctatgg gctgaggtct ggattctgcc ttgtgactgg agactgggcg ccatcccgtg 24960
gcctctgagg gcccagtttg ttcgtgaccc atgctgcaga gggagatacc caggctcctg 25020
gacctcaggg cctgcctggc actgcaggcc aggttctctt tttatttctg agcaggggtc 25080
ttgtgttgcc caggctggag tgtaatggca caaccatggc tcactgcagc ctcaactttg 25140
ggctcaagca attctcctgc ctcagcctcc caagtagctg aaactacaca ggcatgcccc 25200
agcacgccca gctagttgca ggtcagattc tcattgttct acagggccct gagttaaata 25260
ctctcgcaag aagaaaccaa gcctggcctg ccttccctct gctagaagct gtgattgaca 25320
ccagcagaga atgaaggaag aaaagggggt gaggatccct tgcagggatg ccgagtttgc 25380
aggtggcttg actgaaaaaa aaaagaaaaa gaaaacacct actttcctct ccatggaaac 25440
agcatgccag aaaattttgt ggacccttga aatgagcaca catctcactt gcaaaagcac 25500
agcaccagcg ccctctgctg tttcctggtt tgatttagaa ctcagagaag ctacagtact 25560
ttctagacta aaataccatg tagagttcag gataattata ttctagatta gacataggca 25620
agcacattta tattagtaca ttctgtagta tattccagag tgaaggaaat caaagtttat 25680
gactcactga ctccgtcctg gagttggatg agagataatg gccttacgtt gtgccagggg 25740
agggtcgggc tggatttagc aagatttacc ttctccaaag agcggtgctg cagtggcaca 25800
gctgcccacg gaggtggggg ggtcaccgtc cctggaggtg atgaagaact gtggggatgt 25860
ggcactgagg gacatggcca gtgggcacgg tgggtgggtt ggggttggtc ttggggatct 25920
tggagggctt ttccagcctt catgatttga cgattgtatg aacatctaca tggcaattct 25980
ccagctgcct gtcccagtcc tactgaccca gctgtatctc tccaggcaag ctcttccacc 26040
ccttctgctt gcatccagac accatcaaac atgcaggctc agacacattt tccccgtatc 26100
cccccaggtg tctgcaggct caaagagcag cgagaagcgt tcagaggaaa gcgatcccgt 26160
gccaccttcc ccgtgcccgg gctgtccccg cacgctgccg gctcggggat gcggggggag 26220
cgccggaccg gagcggagcc ccgggcggct cgctgctgcc ccctagcggg ggagggacgt 26280
aattacatcc ctgggggctt tggggggggg ctgtccccgc ctcacacgta cgcgtacgat 26340
gcataacttc gtataatgtg tactatacga agttatataa cttcgtatag gatactttat 26400
acgaagttat gtttcagcgg ccgcgattcc ttttttaggg cccattggta tggctttttc 26460
cccgtatccc cccaggtgtc tgcaggctca aagagcagcg agaagcgttc agaggaaagc 26520
gatcccgtgc caccttcccc gtgcccgggc tgtccccgca cgctgccggc tcggggatgc 26580
ggggggagcg ccggaccgga gcggagcccc gggcggctcg ctgctgcccc ctagcggggg 26640
agggacgtaa ttacatccct gggggctttg ggggggggct gtccctgata tctataacaa 26700
gaaaatatat atataataag ttatcacgta agtagaacat gaaataacaa tataattatc 26760
gtatgagtta aatcttaaaa gtcacgtaaa agataatcat gcgtcatttt gactcacgcg 26820
gtcgttatag ttcaaaatca gtgacactta ccgcattgac aagcacgcct cacgggagct 26880
ccaagcggcg actgagatgt cctaaatgca cagcgacgga ttcgcgctat ttagaaagag 26940
agagcaatat ttcaagaatg catgcgtcaa ttttacgcag actatctttc tagggttaa 26999
<210> 214
<211> 18447
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 有效载荷13A序列
<400> 214
ttttgtttat ggtgtaagac aagggtctga tttcatttca ttttgagggt ttcaccctct 60
catataataa aattcttcta tatacccttc tatcatcact tattactgat tatatgcctt 120
gatttcagaa tcttgccaac tagattcaga atttgactgg gagagaggac aaggaccact 180
tgagactcat attttatttc cagaatctag catctaccta cctaggtatt gaataagaaa 240
aatgaagtta aggtggttga tggtaacact atgctaataa ctgcagagcc agaagcacca 300
taagggacat gataagggag ccagcagacc tctgatctct tcctgaatgc taatcttaaa 360
catcctgagg aagaatggga cttccatttg gggtgggcct atgacagggt aataagacag 420
tagtgaatat caagctacaa aaagccgcct ttcaaattct tctcagtcct aacttttcat 480
actaagccca gtccttccaa agcagactgt gaaagagtga tagttccggg agactagcac 540
tgcagattcc gggtcactgt gagtggggga ggcagggaag aagggctcac aggacagtca 600
aaccatgacc cctgtttttc cttcttcaag tagacctcta taagacaaca gagacaacta 660
aggctgagtg gccaggcgag gagaaaccat ctcgccgtaa aacatggaag gaacacttca 720
ggggaaaggt ggtatctcta agcaagagaa ctgagtggag tcaaggctga gagatgcagg 780
ataagcaaat gggtagtgaa aagacattca tgaggacagc taaaacaata agtaatgtaa 840
aatacagcat agcaaaactt taacctccaa atcaagcctc tacttgaatc cttttctgag 900
ggatgaataa ggcatatgca tcaggggctg ttgccaatgt gcattagctg tttgcagcct 960
caccttcttt catggagttt aagatatagt gtattttccc aaggtttgaa ctagctcttc 1020
atttctttat gttttaaatg cactgacctc ccacattccc tttttagtaa aatattcaga 1080
aataatttaa atacatcatt gcaatgaaaa taaatgtttt ttattaggca gaatccagat 1140
gctcaaggcc cttcataata tcccccagtt tagtagttgg acttagggaa caaaggaacc 1200
tttaatagaa attggacagc aagaaagcga gcttactata ccatatcttt ccagaaatat 1260
gaaggcttgt gaaagataag caagcctatg atggccactg tgaaaaggac cagggagaat 1320
agaaccatga ggaagacata ggtggagtgg gagagaggtg tggacaatgg ttgctcagct 1380
gggatcatgt tggtcaggtt cagcatgtag cccaaagtcc agccggcgtc gctgccctgg 1440
atcttgccaa tgaaatggat gtgctcccag gaatcagctg tgaaatgata gccttgcaga 1500
aggagggaga gaatgtaggt accagaaaag cagtattcac tcaggtactt ctcctttact 1560
ccagcgtaag atgtttttat ctcctcccaa ggctgagcac agaacttttt catcatctca 1620
gtcacctttt cctgagagac tttctctgat gtcaagttta aaaacttcat cacaaagtaa 1680
aaagctgaaa atgccccaaa atccccctgg agtggtggca agaaaatccc attgaaggca 1740
cactgggagt aagggcagta actggtgttg aagagctcca ggatgctttg atggcattgt 1800
tgatagtttc caataccctg gatttcaaac tgctggaatg gaagagtcat ctcaaatctc 1860
ttggtgcagg gggtcttgta aaggtcactt acgttcacta ccttcttata tccaggatga 1920
aagcatgggt ccctgagaat ttcattactt gcaacctgaa tgtccttggc cagtttctgc 1980
cagagtgcct gatccttccc atagcacaag aagctatgtg tgtagacatt gtagtccttg 2040
ccatagaggc gaaattgcag agcattatct ggggactcga tagtctggtt ttggggtaca 2100
aaagtgactt gtgtagaggc tcccccaagg tccaaagctc caaaggtttc ctgattattg 2160
gtttcatatg ggactatgct gaaccacctt gttttctgac tgaatttgcc cagcagatag 2220
ttgatagtaa tccagccata ggcaccttcc tcttggccag taatgatcct ggcaccctgg 2280
aagtcaaagg ggtagttgct gaggctcctc tccaccacat ccagaaccct gtctgccaac 2340
tcttcacttt ccatcctgag caaccgcatg cctgccgtgg ctcccaggta aacgggtgtc 2400
tcttggtgct gggaccttgg aatcacttcc ctagctcttt ccatgcaatc agtcaggtaa 2460
atgcctattt catttacttt ctgaacaaat tttgagattc caggaccttt aaccctgcat 2520
tcttctactt gatgcaccac gcctgtgtca ttctcctttt ctgctggcca cttatagatg 2580
tataaacttg tgtgagaaga acccgcatcc agcacaatcc catacttaac gttttctggc 2640
aatgctttgt tctgggtcaa ccccacagca agcaaagcta tcacagctat gatagaggag 2700
aagccaagga tggctaggat attcttggag caaaatgtct tcacgttaga ctcctttgta 2760
tcttccatag gtccagggtt ctcctccacg tctccagcct gcttcagcag gctgaagtta 2820
gtagctccgc ttccaggact cgggtcaaat gcagcgtttg taaaaactcc atatgttcct 2880
aggtggctgt gaggattcaa ggggcatttc ccatcatctt tttgtctgaa acgcttgatc 2940
tgagacatcc gctctgcttg gcgccttcgg tgccggcacc tgacacagaa gaagatgcct 3000
agcccaatga aaagcaggag gccggcgacg ccccccagca caatcagggc cattggctgc 3060
accggggtgg accatgtggg cagaaccttg atgttggatt ccagcaggac ctgtcccgag 3120
tcactcagca gacactgcca catccccgcc tcagggttca gcacccacac cgccttctcc 3180
cgcttcgaga cctttgcctc cttgttctcc agtttcaaac tcagcatcag cttaggggag 3240
gtgggtcccc acacctcaca ggtcaaattt ttctggagct gagtggctct catcaccacc 3300
aggttcactt cctgatgcaa ctttcctgtt ttcgcttcaa gggccagggt gaggtttcca 3360
gagccagcat actgaggcaa ggcctggggc agggtgaggt ggagcgggag cttcttgccc 3420
atctggagct tagggtcctg ggtaacccgt tttacagaca cttccttgtt cttcaggtca 3480
aaggtgatcc aagacttgga ggaggaagcc ctctccgcct gccaccacag ctcgccactg 3540
cccgtcagct tttcaactgt aaaggcgagt gggaaggaga actccacctg ttccccctct 3600
ttcttataga ctatgctgga ggccttctgg aaagctagca ccacgatgtc tattttgaac 3660
tccaccttct tctggttctg caagacagtg catgtccagg tgccactatc ctggagctcc 3720
agctgagaca cggagagggt cttcccagat ccaccaccac cgcttccgcc tccgccactt 3780
cctccgccgc cagatcctcc gcctcccata tttttaacaa aaatttcttc atatgctatt 3840
ttcactctct gcttctttct ttttcttttg gttttaatta ggcctccttt tgatattctt 3900
tggatgaaac cttttttaca tgccctcaga cattcttgtt tggaagtaaa attgttttca 3960
tttcccccac atccactgta cttaaatggg cggcatttcc caatgactga attgtagtag 4020
aatctgttct cattggcacg acacaatcct ctgtctgctg gagtgagaca ccatgaggga 4080
ccgtgaaatt caaaaaggct gggaaccttg gttgattgcg gagtcaggga gttattcaca 4140
gcattgagct gggttccata attatccacc tggaaaccat tcggaccatc ttcacaaatg 4200
ttcttgcatt cttccagtgt ctcaaaattg ttcatattgc ccaggcatcc accatacttg 4260
aaacgttcac actgttttgt ctgattgtta taaaaatacc tggtaatata acctcgacat 4320
attccaggat cttcttccaa aaagcagaaa tctggctttt cttgttgcaa tgttgtcttt 4380
ataatcctgt ttgcattatc tcttgtacac atttttttgc actcttccag actttcaaat 4440
cgattctgat ttccttcaca tcccccatat ataaattctt cgcactgtcg agtgaaaata 4500
ttgaagaaaa atcttttcat gattgcttta catgggccat catccgcctt gaatgcacaa 4560
aatgaatgca taagtttcag tggtggcaac tccgtatctg tgataattgt gtgttcttca 4620
tcttcctcag aatcagcatt aagaggggca ggggcaagat taagcagcag gcatacagaa 4680
gcccaaagtg catgtacttt cttcattgtg taaatcatag gtccagggtt ctcctccacg 4740
tctccagcct gcttcagcag gctgaagtta gtagctccgc ttccgagtct ctgcggcgtc 4800
cgctcggtcc gcacgtgctg cagcactacc tccttggaag gggccgcgca cttgtactcc 4860
atcttggccc tggcggcgcc ctgcttcttg cgcaggtggc agaggagcgc caaaagcgcc 4920
accaccaggc acaggctcgc gatggagatg cctatgagca agcccgaatg cacgagcccc 4980
acggccggag gagtcaaggt ggagccgggc gtcgggctgg gcgggggctc gccagagccg 5040
ctgtcgccac cgtccacctt gccggagtca cagtcggtgc caatgtggcg ggcaagggcc 5100
gagtcgggcc cgcagatgca ctcgaaggta ccggggaggt tgtggcacac cccggagcag 5160
aagccgccgt tttcgcactc gtcgatgtcc gtgcagatga aaccgtcgtc caggatgtag 5220
ccttcagggc actcacagct agcctgggtg ttggggtcgc agtcggctgg acaggcagtc 5280
tggttgcaaa acatctggca cctgtgcggc tcgtggggaa tgggcgcgaa gccctcggcg 5340
cagacgcaga ggtagctagt ttggttcagg ggctggcact ggtactcgca gttggctctg 5400
aagcacgggt ccacgggctc cacacactcg ccgtccacca ggtcgtagtt agggtagcag 5460
tggcactcga agccaccctg tgtgttgaca cagcgctgcg gacacggact gggctccagt 5520
atgcagtcat ccacgtcctc gcaccggtgt tggtcggccg ccagccggta gccggtctcg 5580
cacatgcacg agtaggagcc cggctggtcg gggttgggaa cgcagaagtg ctcgcagagg 5640
tcgttgcagg actgcgtcgc ggatgcggtg caggagcgcc cgtctgcctg cagggcggcg 5700
ccggctgggc actggcagcg gggagcccca gggatcgcat tgcacgcgtg ctcgcagccg 5760
ccgttctcca cgctgcagtc ccaagcgccc ggcgcctccc tggcccagtg cccctggacc 5820
gctccgggcg gcgcggtgca cattagctgt aagccgaggg gagccaccgc ggcggagctg 5880
cccaccggca gcgcctggaa gtccgctccg cgggccgcga acggggtgcc gtaggtgatc 5940
gagacggcgg cagccgcggc gccgggctcc acagccagtg gcctgcaggt ggctgggaag 6000
tggaactcgc agaggaagcc atcggccttc acttcgcact gctgctcctc ccagatcggc 6060
tcgctgggca cagtggcctc agcagcggag acagcgacgc acaacgggcc gcagagggga 6120
gccccattga ggtcgagccg tgcccacctg ctatagctgg tgttgttgtc tcccgtaacc 6180
cactggaagc cgcgcagggg cccgaggcgc ttggggtcgc cgcagccggg tggcagctgc 6240
aggccgatcc agaggcgccg gcggccaacg ccgccgtcgc cgttcagtag caaggaaatg 6300
acatcggcag ccaccgagga gcgcactgtc attaggtggc cccgcagtcc gtcgcagatc 6360
tgactggcat tgaggaaggt cgcggggccc gggtagagcg cgaagcagtc gtgctcgacg 6420
cactggctgc cacccggctg cggctctgcg ggtgcgggga accccaggcc ggccagggcc 6480
agcgcgccaa ggaccaggac cccaagcatg ttacccaggc gttgctttga attagcggtg 6540
gttttcacaa cacctaaaaa agggtttaaa agataccttt gaaccgctaa gaagcccgag 6600
aattagctcc gctcaaaact caaggggaca aattccaaaa atgacttcca gcgccaggct 6660
ggcctgacta gtctccaccc accaaatgtg aacaaactcc aacgccatta catcccctcc 6720
ccccgccgcg actagccgtg ctcaaaagcc cgaggtgact attgcggccg ataggaccac 6780
ggggtcacag gaagcagcag ccggtgaggg accaggccct cttcctttgt gtgggtgact 6840
cacccgcccg ctccaccggg ctgccgcgtc ctccattttg agctccttgc aacagggccc 6900
gggagcggcc atctttccac gcacgcaact ggtgccggac gggatggcct caccctagtt 6960
agggaggcag ggcaacgcgg cgccgccaag ccagatcgtg ccgggtgctg gggccacatg 7020
gcctcggcac gctaacccca gcctggttgc ttcgggaaaa accccaggcc tcgccccatc 7080
caggtggcgt cggacatgtg ctccgaaggc gggcgggccc cagccgccac tcctgtccct 7140
ccattcctcc ccaaccatga cctctccggg ctccgggcga gcaagccccg caccctccct 7200
ttgttagccc ctattgctga acggcaatcg aaggcagcag ggcaacaaca acaacaaaaa 7260
aaaaaagacc agagtgcggc cggagtagca cgcggcggcg gcgcggacac cacgctaggc 7320
ctcaagccgg acacgaggcg aggctacggg gttgccgcta ggcctcgcac tctgcctccc 7380
gcgccgcccg caactcgaag cgggaatgct cgcagctaat ccccgccgac gacagcgggg 7440
cccggcccgc tcggagcagg acctccagct cggcggcccg cggaagccac acccgcccct 7500
cacctgcgtt ctgacggcaa acccgttgcg aaaaagaacg tccaaggcga ctgccgcact 7560
tatataccgt tctcccccac cctcgggaag agggcggagc cagcacacga caccgctttc 7620
ccagtttgcc ccgcgccagc tccccggtcc tcccccccat gaggctccgg tgcccgtcag 7680
tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga 7740
accggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc 7800
cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt 7860
ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg 7920
cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac gcccctggct 7980
gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc 8040
ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcttg ggcgctgggg 8100
ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct 8160
agccatttaa aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt 8220
aaatgcgggc caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg 8280
ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag 8340
aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc 8400
gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga 8460
aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg 8520
agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc 8580
ttcatgtgac tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt 8640
ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac 8700
tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt 8760
tgcccttttt gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt 8820
ttttcttcca tttcaggtgt cgtgaacccg gcgcgccatg accgtcgcgc ggccgagcgt 8880
gcccgcggcg ctgcccctcc tcggggagct gccccggctg ctgctgctgg tgctgttgtg 8940
cctgccggcc gtgtggggtg actgtggcct tcccccagat gtacctaatg cccagccagc 9000
tttggaaggc cgtacaagtt ttcccgagga tactgtaata acgtacaaat gtgaagaaag 9060
ctttgtgaaa attcctggcg agaaggactc agtgatctgc cttaagggca gtcaatggtc 9120
agatattgaa gagttctgca atcgtagctg cgaggtgcca acaaggctaa attctgcatc 9180
cctcaaacag ccttatatca ctcagaatta ttttccagtc ggtactgttg tggaatatga 9240
gtgccgtcca ggttacagaa gagaaccttc tctatcacca aaactaactt gccttcagaa 9300
tttaaaatgg tccacagcag tcgaattttg taaaaagaaa tcatgcccta atccgggaga 9360
aatacgaaat ggtcagattg atgtaccagg tggcatatta tttggtgcaa ccatctcctt 9420
ctcatgtaac acagggtaca aattatttgg ctcgacttct agtttttgtc ttatttcagg 9480
cagctctgtc cagtggagtg acccgttgcc agagtgcaga gaaatttatt gtccagcacc 9540
accacaaatt gacaatggaa taattcaagg ggaacgtgac cattatggat atagacagtc 9600
tgtaacgtat gcatgtaata aaggattcac catgattgga gagcactcta tttattgtac 9660
tgtgaataat gatgaaggag agtggagtgg cccaccacct gaatgcagag gaaaatctct 9720
aacttccaag gtcccaccaa cagttcagaa acctaccaca gtaaatgttc caactacaga 9780
agtctcacca acttctcaga aaaccaccac aaaaaccacc acaccaaatg ctcaagcaac 9840
acggagtaca cctgtttcca ggacaaccaa gcattttcat gaaacaaccc caaataaagg 9900
aagtggaacc acttcaggta ctacccgtct tctatctggg cacacgtgtt tcacgttgac 9960
aggtttgctt gggacgctag taaccatggg cttgctgact ggaagcggag ctactaactt 10020
cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct ggacctatgg gaatccaagg 10080
agggtctgtc ctgttcgggc tgctgctcgt cctggctgtc ttctgccatt caggtcatag 10140
cctgcagtgc tacaactgtc ctaacccaac tgctgactgc aaaacagccg tcaattgttc 10200
atctgatttt gatgcgtgtc tcattaccaa agctgggtta caagtgtata acaagtgttg 10260
gaagtttgag cattgcaatt tcaacgacgt cacaacccgc ttgagggaaa atgagctaac 10320
gtactactgc tgcaagaagg acctgtgtaa ctttaacgaa cagcttgaaa atggtgggac 10380
atccttatca gagaaaacag ttcttctgct ggtgactcca tttctggcag cagcctggag 10440
ccttcatccc ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga 10500
ggagaaccct ggacctatgg agcctcccgg ccgccgcgag tgtccctttc cttcctggcg 10560
ctttcctggg ttgcttctgg cggccatggt gttgctgctg tactccttct ccgatgcctg 10620
tgaggagcca ccaacatttg aagctatgga gctcattggt aaaccaaaac cctactatga 10680
gattggtgaa cgagtagatt ataagtgtaa aaaaggatac ttctatatac ctcctcttgc 10740
cacccatact atttgtgatc ggaatcatac atggctacct gtctcagatg acgcctgtta 10800
tagagaaaca tgtccatata tacgggatcc tttaaatggc caagcagtcc ctgcaaatgg 10860
gacttacgag tttggttatc agatgcactt tatttgtaat gagggttatt acttaattgg 10920
tgaagaaatt ctatattgtg aacttaaagg atcagtagca atttggagcg gtaagccccc 10980
aatatgtgaa aaggttttgt gtacaccacc tccaaaaata aaaaatggaa aacacacctt 11040
tagtgaagta gaagtatttg agtatcttga tgcagtaact tatagttgtg atcctgcacc 11100
tggaccagat ccattttcac ttattggaga gagcacgatt tattgtggtg acaattcagt 11160
gtggagtcgt gctgctccag agtgtaaagt ggtcaaatgt cgatttccag tagtcgaaaa 11220
tggaaaacag atatcaggat ttggaaaaaa attttactac aaagcaacag ttatgtttga 11280
atgcgataag ggtttttacc tcgatggcag cgacacaatt gtctgtgaca gtaacagtac 11340
ttgggatccc ccagttccaa agtgtcttaa agtgctgcct ccatctagta caaaacctcc 11400
agctttgagt cattcagtgt cgacttcttc cactacaaaa tctccagcgt ccagtgcctc 11460
aggtcctagg cctacttaca agcctccagt ctcaaattat ccaggatatc ctaaacctga 11520
ggaaggaata cttgacagtt tggatgtttg ggtcattgct gtgattgtta ttgccatagt 11580
tgttggagtt gcagtaattt gtgttgtccc gtacagatat cttcaaagga ggaagaagaa 11640
aggcacatac ctaactgatg agacccacag agaagtaaaa tttacttctc tctgataacc 11700
ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat 11760
atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct 11820
gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg 11880
ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta 11940
gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag 12000
ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg 12060
atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat 12120
gcccagaagg taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca 12180
tgtgtttagt cgaggttaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc 12240
tttgaaaaac acgatgatta tatggccaca accatggctg aacaagtcct tcctcaggct 12300
ttgtatttga gcaatatgcg gaaagctgtg aagatacggg agagaactcc agaagacatt 12360
tttaaaccta ctaatgggat cattcatcat tttaaaacca tgcaccgata cacactggaa 12420
atgttcagaa cttgccagtt ttgtcctcag tttcgggaga tcatccacaa agccctcatc 12480
gacagaaaca tccaggccac cctggaaagc cagaagaaac tcaactggtg tcgagaagtc 12540
cggaagcttg tggcgctgaa aacgaacggt gacggcaatt gcctcatgca tgccacttct 12600
cagtacatgt ggggcgttca ggacacagac ttggtactga ggaaggcgct gttcagcacg 12660
ctcaaggaaa cagacacacg caactttaaa ttccgctggc aactggagtc tctcaaatct 12720
caggaatttg ttgaaacggg gctttgctat gatactcgga actggaatga tgaatgggac 12780
aatcttatca aaatggcttc cacagacaca cccatggccc gaagtggact tcagtacaac 12840
tcactggaag aaatacacat atttgtcctt tgcaacatcc tcagaaggcc aatcattgtc 12900
atttcagaca aaatgctaag aagtttggaa tcaggttcca atttcgcccc tttgaaagtg 12960
ggtggaattt acttgcctct ccactggcct gcccaggaat gctacagata ccccattgtt 13020
ctcggctatg acagccatca ttttgtaccc ttggtgaccc tgaaggacag tgggcctgaa 13080
atccgagctg ttccacttgt taacagagac cggggaagat ttgaagactt aaaagttcac 13140
tttttgacag atcctgaaaa tgagatgaag gagaagctct taaaagagta cttaatggtg 13200
atagaaatcc ccgtccaagg ctgggaccat ggcacaactc atctcatcaa tgccgcaaag 13260
ttggatgaag ctaacttacc aaaagaaatc aatctggtag atgattactt tgaacttgtt 13320
cagcatgagt acaagaaatg gcaggaaaac agcgagcagg ggaggagaga ggggcacgcc 13380
cagaatccca tggaaccttc cgtgccccag ctttctctca tggatgtaaa atgtgaaacg 13440
cccaactgcc ccttcttcat gtctgtgaac acccagcctt tatgccatga gtgctcagag 13500
aggcggcaaa agaatcaaaa caaactccca aagctgaact ccaagccggg ccctgagggg 13560
ctccctggca tggcgctcgg ggcctctcgg ggagaagcct atgagccctt ggcgtggaac 13620
cctgaggagt ccactggggg gcctcattcg gccccaccga cagcacccag cccttttctg 13680
ttcagtgaga ccactgccat gaagtgcagg agccccggct gccccttcac actgaatgtg 13740
cagcacaacg gattttgtga acgttgccac aacgcccggc aacttcacgc cagccacgcc 13800
ccagaccaca caaggcactt ggatcccggg aagtgccaag cctgcctcca ggatgttacc 13860
aggacattta atgggatctg cagtacttgc ttcaaaagga ctacagcaga ggcctcctcc 13920
agcctcagca ccagcctccc tccttcctgt caccagcgtt ccaagtcaga tccctcgcgg 13980
ctcgtccgga gcccctcccc gcattcttgc cacagagctg gaaacgacgc ccctgctggc 14040
tgcctgtctc aagctgcacg gactcctggg gacaggacgg ggacgagcaa gtgcagaaaa 14100
gccggctgcg tgtattttgg gactccagaa aacaagggct tttgcacact gtgtttcatc 14160
gagtacagag aaaacaaaca ttttgctgct gcctcaggga aagtcagtcc cacagcgtcc 14220
aggttccaga acaccattcc gtgcctgggg agggaatgcg gcacccttgg aagcaccatg 14280
tttgaaggat actgccagaa gtgtttcatt gaagctcaga atcagagatt tcatgaggcc 14340
aaaaggacag aagagcaact gagatcgagc cagcgcagag atgtgcctcg aaccacacaa 14400
agcacctcaa ggcccaagtg cgcccgggcc tcctgcaaga acatcctggc ctgccgcagc 14460
gaggagctct gcatggagtg tcagcatccc aaccagagga tgggccctgg ggcccaccgg 14520
ggtgagcctg cccccgaaga cccccccaag cagcgttgcc gggcccccgc ctgtgatcat 14580
tttggcaatg ccaagtgcaa cggctactgc aacgaatgct ttcagttcaa gcagatgtat 14640
ggcggaagcg gagctactaa cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac 14700
cctggaccta tgtctcgctc cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctggc 14760
ctcgaggctg ttatggctcc gcggacttta attttaggtt gcggcggttc cggtggtggc 14820
ggttctggtg gtggcggctc catccagcgt acgccaaaga ttcaggttta ctcacgtcat 14880
ccagcagaga atggaaagtc aaatttcctg aattgctatg tgtctgggtt tcatccatcc 14940
gacattgaag ttgacttact gaagaatgga gagagaattg aaaaagtgga gcattcagac 15000
ttgtctttca gcaaggactg gtctttctat ctcttgtact acactgaatt cacccccact 15060
gaaaaagatg agtatgcctg ccgtgtgaac catgtgactt tgtcacagcc caagatagtt 15120
aagtgggatc gcgacatggg tggtggcggt tctggtggtg gcggtagtgg cggcggagga 15180
agcggtggtg gcggttccgg atctcactcc ttgaagtatt tccacacttc cgtgtcccgg 15240
cccggccgcg gggagccccg cttcatctct gtgggctacg tggacgacac ccagttcgtg 15300
cgcttcgaca acgacgccgc gagtccgagg atggtgccgc gggcgccgtg gatggagcag 15360
gaggggtcag agtattggga ccgggagaca cggagcgcca gggacaccgc acagattttc 15420
cgagtgaacc tgcggacgct gcgcggctgc tacaatcaga gcgaggccgg gtctcacacc 15480
ctgcagtgga tgcatggctg cgagctgggg cccgacaggc gcttcctccg cgggtatgaa 15540
cagttcgcct acgacggcaa ggattatctc accctgaatg aggacctgcg ctcctggacc 15600
gcggtggaca cggcggctca gatctccgag caaaagtcaa atgatgcctc tgaggcggag 15660
caccagagag cctacctgga agacacatgc gtggagtggc tccacaaata cctggagaag 15720
gggaaggaga cgctgcttca cctggagccc ccaaagacac acgtgactca ccaccccatc 15780
tctgaccatg aggccaccct gaggtgctgg gctctgggct tctaccctgc ggagatcaca 15840
ctgacctggc agcaggatgg ggagggccat acccaggaca cggagctcgt ggagaccagg 15900
cctgcagggg atggaacctt ccagaagtgg gcagctgtgg tggtgccttc tggagaggag 15960
cagagataca cgtgccatgt gcagcatgag gggctacccg agcccgtcac cctgagatgg 16020
aagccggctt cccagcccac catccccatc gtgggcatca ttgctggcct ggttctcctt 16080
ggatctgtgg tctctggagc tgtggttgct gctgtgatat ggaggaagaa gagctcaggt 16140
ggaaaaggag ggagctacta taaggctgag tggagcgaca gtgcccaggg gtctgagtct 16200
cacagcttgg gaagcggagc tactaacttc agcctgctga agcaggctgg agacgtggag 16260
gagaaccctg gacctatgtg gcccctggta gcggcgctgt tgctgggctc ggcgtgctgc 16320
ggatcagctc agctactatt taataaaaca aaatctgtag aattcacgtt ttgtaatgac 16380
actgtcgtca ttccatgctt tgttactaat atggaggcac aaaacactac tgaagtatac 16440
gtaaagtgga aatttaaagg aagagatatt tacacctttg atggagctct aaacaagtcc 16500
actgtcccca ctgactttag tagtgcaaaa attgaagtct cacaattact aaaaggagat 16560
gcctctttga agatggataa gagtgatgct gtctcacaca caggaaacta cacttgtgaa 16620
gtaacagaat taaccagaga aggtgaaacg atcatcgagc taaaatatcg tgttgtttca 16680
tggttttctc caaatgaaaa tattcttatt gttattttcc caatttttgc tatactcctg 16740
ttctggggac agtttggtat taaaacactt aaatatagat ccggtggtat ggatgagaaa 16800
acaattgctt tacttgttgc tggactagtg atcactgtca ttgtcattgt tggagccatt 16860
cttttcgtcc caggtgaata ttcattaaag aatgctactg gccttggttt aattgtgact 16920
tctacaggga tattaatatt acttcactac tatgtgttta gtacagcgat tggattaacc 16980
tccttcgtca ttgccatatt ggttattcag gtgatagcct atatcctcgc tgtggttgga 17040
ctgagtctct gtattgcggc gtgtatacca atgcatggcc ctcttctgat ttcaggtttg 17100
agtatcttag ctctagcaca attacttgga ctagtttata tgaaatttgt ggcttccaat 17160
cagaagacta tacaacctcc taggaaagct gtagaggaac cccttaatgc attcaaagaa 17220
tcaaaaggaa tgatgaatga tgaataatgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 17280
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 17340
aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 17400
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 17460
gggctctatg ggtacccagg tgctgaagaa ttgacccggt tcctcctggg ccagaaagaa 17520
gcaggcacat ccccttctct gtgacacacc ctgtccacgc ccctggttct tagttccagc 17580
cccactcata ggacactcat agctcaggag ggctccgcct tcaatcccac ccgctaaagt 17640
acttggagcg gtctctccct ccctcatcag cccaccaaac caaacctagc ctccaagagt 17700
gggaagaaat taaagcaaga taggctatta agtgcagagg gagagaaaat gcctccaaca 17760
tgtgaggaag taatgagaga aatcatagaa ttcgttttgt gcagaaattt taaggtgact 17820
acacgcttag cccaactacc cttgggaaat gtgtgtgtgt tagtcactca atcgtgtcca 17880
gctctttgtg accccatgga ctgtagcctg ccaggctcct ctgtccatgg gattctccag 17940
gcaagaatac tggagtgggt tgccattccc caggggattt tcccaaccca aggatcaaac 18000
ccgagtttcc tgcattgcag gcagattctt tactctctga gccatcaggg aagccctgtg 18060
ggaaatggga accatgcaaa aacggctttg ggaccaataa gaccagaata tttgggatct 18120
gaactggcgc aagaaatgtg gaagagagat tctaaatgca tgtgtacata ctaagttgct 18180
tcagtcatgt ccgactattt gcaaccccat ggaccacagc ctgccaggct cctctgtcca 18240
tgggattctc cagtcaagaa tactggagtg agtttccatt tcctcttcca ggggatcttc 18300
cagacccagg gatcaaacca gtgtctctta tgtctcctgt gttgacaggc aggttcttta 18360
ccactagtgc cacctgagac ccaattctaa acgaggggtt gcaaattcag tgccaacagg 18420
tgccaggtat aagtggcaag ggctgca 18447
<210> 215
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 215
caccataatc acccccaacg tcctgcgtct ggagagtgag gagatggtgg tgttggaggc 60
ccacgaaggg caaggggata ttcggg 86
<210> 216
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 216
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 217
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 217
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 218
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 218
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 219
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 219
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 220
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 220
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 221
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 221
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 222
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 222
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 223
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 223
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 224
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 224
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 225
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 225
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 226
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 226
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 227
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 227
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 228
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 228
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 229
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 229
caccataatc tcccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 230
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 230
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 231
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 231
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 232
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 232
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 233
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 233
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 234
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 234
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 235
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 235
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 236
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 236
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 237
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 237
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 238
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 238
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 239
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 239
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 240
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 240
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 241
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 241
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 242
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 242
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 243
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 243
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 244
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 244
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 245
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 245
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 246
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 246
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 247
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 247
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 248
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 248
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggg 35
<210> 249
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 249
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 250
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 250
caccataatc acccccaagc aaggggatat tcggt 35
<210> 251
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 251
caccataatc acccccaaca aggggatatt cggg 34
<210> 252
<211> 161
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 252
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctatggctta aatgtctacc agtcttacgg tcccagcggc tattataccc 120
atgaatttga tggcgacgag gaattctatg tggacctgga g 161
<210> 253
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 253
atgcggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 254
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 254
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gccccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 255
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 255
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 256
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 256
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 257
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 257
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 258
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 258
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg gtggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 259
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 259
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 260
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 260
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 261
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 261
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 262
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 262
atgaggttct tttctctacc tttgttgtcc accctcatgc tgactacgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ttaatggctg aaatgtctac cagtcttacg gtcccagtgg ctattatacc 120
catgaatttg atgtcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 263
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 263
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 264
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 264
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 265
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 265
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctagtatacc 120
catgaatttg acggcgacga ggaattctat gtagacctgg ag 162
<210> 266
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 266
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtagacctgg ag 162
<210> 267
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 267
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac tagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 268
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 268
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac tagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 269
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 269
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 270
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 270
atgaggttct tttctctccc tttgttgtca accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattacacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 271
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 271
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 272
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 272
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 273
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 273
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 274
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 274
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 275
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 275
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 276
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 276
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 277
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 277
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgactccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 278
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 278
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
acgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 279
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 279
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgactacgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaattgg atggcgacga ggaattctat gtggaactgg ag 162
<210> 280
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 280
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatgtctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga gggattctat gtggacctgg ag 162
<210> 281
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 281
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatgtctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga gggattctat gtggacctgg ag 162
<210> 282
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 282
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 283
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 283
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 284
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 284
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 285
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 285
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 286
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 286
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 287
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 287
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 288
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 288
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 289
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 289
atgaggttct tttctctccc tttgttgtcc accttcatgc tgaccccgac ctagccgacc 60
atgttgcctc ctaatggctt aaatgtctac cagtcttacg gtcccagcgg ctattatacc 120
catgaatttg atggcgacga ggaattctat gtggacctgg ag 162
<210> 290
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 290
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata cttggggtcc 60
cagtcctagg atttgtcatc accatcttga accttcagaa atcatgggct atcgtaggta 120
agttctgaga 130
<210> 291
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 291
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 292
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 292
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 293
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 293
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 294
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 294
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa agtgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 295
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 295
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 296
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 296
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 297
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 297
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 298
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 298
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 299
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 299
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 300
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 300
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 301
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 301
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 302
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 302
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagga aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 303
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 303
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 304
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 304
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttgggatc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 305
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 305
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat cgccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 306
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 306
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 307
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 307
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 308
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 308
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 309
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 309
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 310
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 310
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 311
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 311
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 312
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 312
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 313
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 313
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gattcgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 314
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 314
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 315
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 315
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagccctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 316
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 316
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 317
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 317
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 318
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 318
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa gatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttccgag a 131
<210> 319
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 319
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 320
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 320
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tattgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 321
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 321
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata cctgggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tattgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 322
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 322
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 323
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 323
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 324
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 324
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 325
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 325
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 326
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 326
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 327
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 327
ccatagctct accgaccctc atcgaggcat ctaaggagaa aatgaccata ccttggggtc 60
ccagtcctag gatttgtcat caccatcttg aaccttcaga aatcatgggc tatcgtaggt 120
aagttctgag a 131
<210> 328
<211> 480
<212> PRT
<213> 智人
<400> 328
Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr
1 5 10 15
Cys Gln His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly
20 25 30
Cys His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
35 40 45
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg
50 55 60
Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu
65 70 75 80
His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala
85 90 95
Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val
100 105 110
Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His
115 120 125
Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly
130 135 140
Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val
145 150 155 160
Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val
165 170 175
Ala Val Val Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys
180 185 190
Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys
195 200 205
Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr
210 215 220
Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile
225 230 235 240
Ala Leu Leu Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn
245 250 255
Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile
260 265 270
Pro Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
275 280 285
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp
290 295 300
Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu
305 310 315 320
Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met Ala Gln Val
325 330 335
Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg
340 345 350
Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys
355 360 365
Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val
370 375 380
Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu
385 390 395 400
Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln
405 410 415
Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly
420 425 430
Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His
435 440 445
Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val
450 455 460
Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro
465 470 475 480
<210> 329
<211> 475
<212> PRT
<213> 野猪
<400> 329
Gln Cys Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Pro Val Thr
1 5 10 15
Cys Gln His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Ser Cys Val Glu Gly
20 25 30
Cys His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
35 40 45
Thr Cys Val Ser Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Ala Ala Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Ala Pro Gly Lys Lys Ile Ile Leu Asn Pro Arg Asp Pro Ala
65 70 75 80
His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Gly Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala
85 90 95
Cys Ala Glu Pro Val Pro Pro Thr Glu Gly Pro Val Ser Pro Thr Thr
100 105 110
Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Pro Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Phe Cys
115 120 125
Ser Lys Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Asp Lys Leu
130 135 140
Ser Glu Ala Asp Phe Glu Ala Leu Lys Val Phe Val Val Gly Met Met
145 150 155 160
Glu His Leu His Ile Ser Gln Lys His Ile Arg Val Ala Val Val Glu
165 170 175
Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Ser Leu Gln Asp Arg Lys Arg
180 185 190
Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser
195 200 205
Glu Val Ala Ser Ile Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
210 215 220
Phe Gly Arg Val Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu Leu
225 230 235 240
Met Ala Ser Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ala Gln Asn Leu Ala Arg Tyr
245 250 255
Leu Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Thr Val Ile Pro Val Gly Ile
260 265 270
Gly Pro His Val Ser Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala
275 280 285
Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Val Ser Gly Val Asp Glu Leu Glu Gln
290 295 300
Arg Lys Asn Glu Ile Ile Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Val
305 310 315 320
Pro Ala Pro Thr Arg Arg Pro Leu Val Ala Gln Val Thr Val Ala Pro
325 330 335
Glu Leu Pro Gly Val Ser Thr Leu Glu Pro Lys Lys Arg Met Val Leu
340 345 350
Asp Val Val Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Val Gly Glu Ala Asn
355 360 365
Phe Asn Arg Ser Thr Glu Phe Val Glu Glu Val Ile Arg Arg Met Asp
370 375 380
Val Gly Arg Asp Ser Val His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Val
385 390 395 400
Val Ala Val Glu His Ser Phe Arg Glu Ala Gln Ser Lys Gly Glu Val
405 410 415
Leu Gln Arg Val Arg Glu Ile Arg Phe Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn
420 425 430
Thr Gly Leu Ala Leu Gln Tyr Leu Ser Glu His Ser Phe Ser Ala Ser
435 440 445
Gln Gly Asp Arg Glu Glu Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly
450 455 460
Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Met Pro
465 470 475
<210> 330
<211> 579
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 双等位基因HDR克隆
<400> 330
tgggaggtcg ggttcagtgg gctgggaagg gcccagaggc tctccctgca ccgttctggt 60
ctttcctctc ctgcagtcac tgtgatggtg tcaatctcac ctgtgaagca tgccaagagc 120
cgggaggcct ggtggtgcct cccacagatg ccccggtgag ccccaccact ctgtatgtgg 180
aggacatctc ggaaccgccg ttgcacgatt tctactgcag caggctactg gacctggtct 240
tcctgctgga tggctcctcc aggctgtccg aggctgagtt tgaagtgctg aaggcctttg 300
tggtggacat gatggagcgg ctgcgcatct cccagaagtg ggtccgcgtg gccgtggtgg 360
agtaccacga cggctcccac gcctacatcg ggctcaagga ccggaagcga ccgtcagagc 420
tgcggcgcat tgccagccag gtgaagtatg cgggcagcca ggtggcctcc accagcgagg 480
tcttgaaata cacactgttc caaatcttca gcaagatcga ccgccctgaa gcctcccgca 540
tcaccctgct cctgatggcc agccaggagc cccaacgga 579
<210> 331
<211> 193
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 双等位基因HDR克隆
<400> 331
Trp Glu Val Gly Phe Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Leu Ser Leu
1 5 10 15
His Arg Ser Gly Leu Ser Ser Ser Cys Ser His Cys Asp Gly Val Asn
20 25 30
Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro
35 40 45
Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
50 55 60
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val
65 70 75 80
Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val
85 90 95
Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg Ile Ser Gln
100 105 110
Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala
115 120 125
Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile
130 135 140
Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala Ser Thr Ser Glu
145 150 155 160
Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro
165 170 175
Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln
180 185 190
Arg
<210> 332
<211> 463
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 双等位基因HDR克隆
<400> 332
ggcctccacc agcgaggtct tgaaatacac actgttccaa atcttcagca agatcgaccg 60
ccctgaagcc tcccgcatca ccctgctcct gatggccagc caggagcccc aacggatgtc 120
ccggaacttt gtccgctacg tccagggcct gaagaagaag aaggtcattg tgatcccggt 180
gggcattggg ccccatgcca acctcaagca gatccgcctc atcgagaagc aggcccctga 240
gaacaaggcc ttcgtgctga gcagtgtgga tgagctggag cagcaaaggg acgagatcgt 300
tagctacctc tgtgaccttg cccctgaagc ccctcctcct actctgcctc cggacatggc 360
ccaagtcact gtggcgcctg agctccccgg ggttcgacgc tcgaacccaa gaagaaaatg 420
gtcttggatg tggtgtttgt gctggaaggg tccgacaagg tcg 463
<210> 333
<211> 154
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 双等位基因HDR克隆
<400> 333
Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser
1 5 10 15
Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala
20 25 30
Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln
35 40 45
Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro
50 55 60
His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu
65 70 75 80
Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg
85 90 95
Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro
100 105 110
Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Ala Pro Glu Leu
115 120 125
Pro Gly Val Ser Thr Leu Glu Pro Lys Lys Lys Met Val Leu Asp Val
130 135 140
Val Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Val
145 150
<210> 334
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 334
gcaacacaaa catatctttg 20
<210> 335
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 335
ctattatttc tagtatggaa aatatccact gaagtatcaa cacaaacata tctccggggt 60
tgccatgagc tatggtgtgt cacagatgca gctcaggtcc catg 104
<210> 336
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 336
ctattatttc tagtatggaa aatatccact gacgtatcaa cacaaacata tctccggggt 60
tgccatgagc tatggtgtgt cacagatgca gctcaggtcc catg 104
<210> 337
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 337
ctattatttc tagtatggaa aatatccact gaagtatcaa cacaaacata tctccggggt 60
tgccatgagc tatggtgtgt cacagatgca gctcaggtcc catg 104
<210> 338
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 338
ctattatttc tagtatggaa aatatccact gaagtatcaa cacaaacata tctccggggt 60
tgccatgagc tatggtgtgt cacagatgca gctcaggtcc catg 104
<210> 339
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 339
ctattatttc tagtatggaa aatatccact gaagtatcaa cacaaacata tctccggggt 60
tgccatgagc tatggtgtgt cacagatgca gctcaggtcc catg 104
<210> 340
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 340
ctattatttc tagtatggaa aatatccact gaagtatcaa cacaaacata tctccggggt 60
tgccatgagc tatggtgtgt cacagatgca gctcaggtcc catg 104
<210> 341
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 341
ctattacttc tagtatggaa aatatccact gaagtatcaa cacaaacata tctatccggg 60
gttgccatga gctatggtgt gtcacagatg cagctcaggt cccatg 106
<210> 342
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 342
ctattatttc tagtatggaa aatatccact gaagtatcaa cacaaacata tctccggggt 60
tgccatgagc tatggtgtgt cacagatgca gctcaggtcc catg 104
<210> 343
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 343
ctattatttc tagtatggaa aatatccact gaagtatcaa cacaaacata tctctcagtg 60
ggttaactat ccggggttgc catgagctat ggtgtgtcac agatgcagct caggtcccat 120
g 121
<210> 344
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 344
tctagctgca tcaggatcat atcgtcgggt cttttttccg gctcagt 47
<210> 345
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 345
ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggct 47
<210> 346
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 346
cttttctttt cccaggagaa aataatgaat gtcaaaggaa gagtggttct gtca 54
<210> 347
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 347
cttttctttt cccaggagaa aataatggaa gagtggttct gtca 44
<210> 348
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 348
cttttctttt cccaggagaa aataatgaat gtcaaaggaa gagtggttct gtca 54
<210> 349
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (15)..(365)
<223> n是a、c、g或 t
<400> 349
aggaagctgt gtcannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 360
nnnnntctgc taaaacattt gccttttcat agcatcgaac aaacgacgca gatcctgttg 420
tgcctctca 429
<210> 350
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 350
aggaagctgt gtcaacgcag atcctgttgt gcctctca 38
<210> 351
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (15)..(365)
<223> n是a、c、g或t
<400> 351
aggaagctgt gtcannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 360
nnnnntctgc taaaacattt gccttttcat agcatcgaac aaacgacgca gatcctgttg 420
tgcctctca 429
<210> 352
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 352
cagcctgtct cctcaggttc actgcgggga ggtcacgcgg gtcgtaggca tcct 54
<210> 353
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 353
cagcctgtct cctcaggttc actgcgggtc gtaggcatcc t 41
<210> 354
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 354
cagcctgtct cctcaggttc actgcggtcg taggcatcct 40
<210> 355
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 355
cagcctgtct cctcaggttc actgcgggtc gtaggcatcc t 41
<210> 356
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 356
cagcctgtct cctcaggttc actgcggtcg taggcatcct 40

Claims (138)

1.一种经分离的细胞、组织、器官或动物，其包含选自炎症反应转基因、免疫应答转基因、免疫调节转基因及其组合的至少两种类型的多个转基因。
2.一种包含多个转基因的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述多个转基因包括至少一个炎症反应转基因、至少一个免疫应答转基因和至少一个免疫调节转基因。
3.根据权利要求1或2所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述炎症反应转基因选自TNFα诱导的蛋白质3(A20)、血红素加氧酶(HO-1)、分化簇47(CD47)及其组合。
4.根据权利要求1或2所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述免疫应答转基因选自人白细胞抗原-E(HLA-E)、β-2微球蛋白(B2M)及其组合。
5.根据权利要求1或2中任一项所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述免疫调节转基因选自程序性死亡配体1(PD-L1)、Fas配体(FasL)及其组合。
6.根据权利要求1或2所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述多个转基因进一步包括至少一个凝血反应转基因。
7.根据权利要求6所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述凝血反应转基因选自分化簇39(CD39)、血栓调节蛋白(THBD)、组织因子途径抑制剂(TFPI)及其组合。
8.根据权利要求1或2所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述多个转基因进一步包括至少一个补体应答转基因。
9.根据权利要求8所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述补体应答转基因选自人膜辅因子蛋白(hCD46)、人补体衰变加速因子(hCD55)、人MAC抑制剂因子(hCD59)及其组合。
10.一种包含六个或更多个转基因的经分离的细胞、组织、器官或动物，所述转基因各自独立地选自补体应答转基因、凝血反应转基因、炎症反应转基因、免疫应答转基因和免疫调节转基因。
11.根据权利要求10所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述经分离的细胞、组织、器官或动物包含9、10、11或12个转基因。
12.根据权利要求10所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述补体应答转基因选自人膜辅因子蛋白(hCD46)、人补体衰变加速因子(hCD55)、人MAC抑制剂因子(hCD59)及其组合。
13.根据权利要求10所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述凝血反应转基因选自分化簇39(CD39)、血栓调节蛋白(THBD)、组织因子途径抑制剂(TFPI)及其组合。
14.根据权利要求10所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述炎症反应转基因选自TNFα诱导的蛋白质3(A20)、血红素加氧酶(HO-1)、分化簇47(CD47)及其组合。
15.根据权利要求10所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述免疫应答转基因选自人白细胞抗原-E(HLA-E)、β-2微球蛋白(B2M)及其组合。
16.根据权利要求10中任一项所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述免疫调节转基因选自程序性死亡配体1(PD-L1)、Fas配体(FasL)及其组合。
17.根据权利要求10-16中任一项所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述六个或更多个转基因选自hCD46、hCD55、hCD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1。
18.根据权利要求17所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述细胞、组织、器官或动物包含hCD46、hCD55、hCD59、CD39、THBD、TFPI、A20、HO-1、CD47、HLA-E、B2M和PD-L1转基因或THBD、TFPI、CD39、CD46、CD55、CD59、CD46、HO-1、A20、B2M、HLA-E SCT和CD47转基因。
19.根据权利要求18所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其包含图17-图20、图31或图47-图49之一中的载体。
20.根据权利要求10-19中任一项所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述至少六个转基因是从单个基因座表达的。
21.根据权利要求10-20中任一项所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述至少六个转基因以临床有效水平表达。
22.根据权利要求10-21中任一项所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其进一步包含经基因修饰的血管性血友病因子(vWF)基因。
23.根据权利要求22所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述经修饰的vWF基因被人源化。
24.根据权利要求10-23中任一项所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其进一步包含脱唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)的缺失、破坏或失活。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其进一步包含一个或多个碳水化合物抗原基因的缺失、破坏或失活。
26.根据权利要求25所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述一个或多个碳水化合物抗原基因选自糖蛋白α-半乳糖基转移酶1(GGTA)、β1,4N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(B4GalNT2)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述经分离的细胞、组织、器官或受试者是猪细胞、猪组织、猪器官、猪或其后代。
28.根据权利要求27所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述经分离的细胞、组织、器官或动物是不含PERV的猪细胞、不含PERV的猪组织或不含PERV的猪。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述器官是肾脏或肝脏。
30.一种载体，其包含选自炎症反应转基因、免疫应答转基因、免疫调节转基因及其组合的至少两种类型的多个转基因。
31.一种包含多个转基因的载体，其中所述多个转基因包括至少一个炎症反应转基因、至少一个免疫应答转基因和至少一个免疫调节转基因。
32.根据权利要求30或31所述的载体，其中所述炎症反应转基因选自TNFα诱导的蛋白质3(A20)、血红素加氧酶(HO-1)、分化簇47(CD47)及其组合。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的载体，其中所述炎症反应转基因的至少部分的表达由组织特异性启动子、泛在启动子或其任何组合驱动。
34.根据权利要求33所述的载体，其中所述组织特异性启动子是内皮特异性启动子。
35.根据权利要求30或31所述的载体，其中所述免疫应答转基因选自人白细胞抗原-E(HLA-E)、β-2微球蛋白(B2M)及其组合。
36.根据权利要求30、31或35中任一项所述的载体，其中所述免疫应答转基因的至少部分的表达由泛在启动子驱动。
37.根据权利要求30或31所述的载体，其中所述免疫调节转基因选自程序性死亡配体1(PD-L1)、Fas配体(FasL)及其组合。
38.根据权利要求30或31所述的载体，其中所述多个转基因进一步包括至少一个凝血反应转基因。
39.根据权利要求38所述的载体，其中所述凝血反应转基因选自分化簇39(CD39)、血栓调节蛋白(THBD)、组织因子途径抑制剂(TFPI)及其组合。
40.根据权利要求38或39所述的载体，其中所述凝血反应转基因的至少部分的表达由组织特异性启动子驱动。
41.根据权利要求40所述的载体，其中所述组织特异性启动子是内皮特异性启动子。
42.根据权利要求41所述的载体，其中所述内皮特异性启动子是低表达内皮特异性启动子。
43.根据权利要求30或31所述的载体，其中所述多个转基因进一步包括至少一个补体应答转基因。
44.根据权利要求43所述的载体，其中所述补体应答转基因选自人膜辅因子蛋白(hCD46)、人补体衰变加速因子(hCD55)、人MAC抑制剂因子(hCD59)及其组合。
45.根据权利要求43或44所述的载体，其中所述补体应答转基因的至少部分的表达由泛在启动子驱动。
46.一种包含六个或更多个转基因的载体，所述转基因各自独立地选自补体应答转基因、凝血反应转基因、炎症反应转基因、免疫应答转基因和免疫调节转基因。
47.根据权利要求46所述的载体，其中所述载体包含9、10、11或12个转基因。
48.根据权利要求46所述的载体，其中所述补体应答转基因选自人膜辅因子蛋白(hCD46)、人补体衰变加速因子(hCD55)、人MAC抑制剂因子(hCD59)及其组合。
49.根据权利要求46-48中任一项所述的载体，其中所述补体应答转基因的至少部分的表达由泛在启动子驱动。
50.根据权利要求46所述的载体，其中所述凝血反应转基因选自分化簇39(CD39)、血栓调节蛋白(THBD)、组织因子途径抑制剂(TFPI)及其组合。
51.根据权利要求43-50中任一项所述的载体，其中所述凝血反应转基因的至少部分的表达由组织特异性启动子驱动。
52.根据权利要求51所述的载体，其中所述组织特异性启动子是内皮特异性启动子。
53.根据权利要求52所述的载体，其中所述内皮特异性启动子是低表达内皮特异性启动子。
54.根据权利要求46所述的载体，其中所述炎症反应转基因选自TNFα诱导的蛋白质3(A20)、血红素加氧酶(HO-1)、分化簇47(CD47)及其组合。
55.根据权利要求46-54中任一项所述的载体，其中所述炎症反应转基因的至少部分的表达由组织特异性启动子、泛在启动子或其任何组合驱动。
56.根据权利要求55所述的载体，其中所述组织特异性启动子是内皮特异性启动子。
57.根据权利要求46所述的载体，其中所述免疫应答转基因选自人白细胞抗原-E(HLA-E)、β-2微球蛋白(B2M)及其组合。
58.根据权利要求46-57中任一项所述的载体，其中所述免疫应答转基因的至少部分的表达由泛在启动子驱动。
59.根据权利要求46所述的载体，其中所述免疫调节转基因选自程序性死亡配体1(PD-L1)、Fas配体(FasL)及其组合。
60.根据权利要求46-59中任一项所述的载体，其中所述六个或更多个转基因选自hCD46、hCD55、hCD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1。
61.根据权利要求60所述的载体，其中所述载体包含hCD46、hCD55、hCD59、CD39、THBD、TFPI、A20、HO-1、CD47、HLA-E、B2M和PD-L1转基因或THBD、TFPI、CD39、CD46、CD55、CD59、CD46、HO-1、A20、B2M、HLA-E SCT和CD47转基因。
62.根据权利要求61所述的载体，其包含图17-图20、图31或图47-图49之一中的载体。
63.根据权利要求46-62中任一项所述的载体，其中所述至少六个转基因是从单个基因座表达的。
64.一种产生根据权利要求1至29中任一项所述的经分离的细胞、组织或动物的方法。
65.根据权利要求64所述的方法，其包括通过转座进行的单拷贝多顺反子转基因整合、通过重组酶介导的盒交换(RMCE)进行的单/双等位基因位点特异性整合、基因组替代、内源基因人源化或其任何组合。
66.一种转基因猪肝脏，所述转基因猪肝脏在暴露于非猪血时具有降低的肝脏损害和/或稳定的凝血，
其中所述降低的肝脏损害通过确定胆汁产生、一种或多种代谢酶和一种或多种血清电解质中的一种或多种的水平来评估，并且
其中，所述稳定的凝血通过确定凝血酶原时间(PT)和国际标准化比率(PT-NIR)、纤维蛋白原水平(FIB)和较低的激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)中的一种或多种的水平来评估。
67.根据权利要求66所述的转基因猪肝脏，其中所述代谢酶选自丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和白蛋白(ALB)。
68.根据权利要求66或67所述的转基因猪肝脏，其中所述血清电解质是钾(K)和/或钠(Na)。
69.一种经分离的猪细胞、组织、器官或动物，所述经分离的猪细胞、组织、器官或动物：
(a)包含选自炎症反应转基因、免疫应答转基因、免疫调节转基因及其任何组合的至少两种类型的多个转基因，并且
(b)基本上没有异嗜性猪内源性逆转录病毒(PERV)病毒粒子的产生。
70.一种经分离的猪细胞、组织、器官或动物，所述经分离的猪细胞、组织、器官或动物：
(a)包含多个转基因，其中所述多个转基因包括至少一个炎症反应转基因、至少一个免疫应答转基因和至少一个免疫调节转基因，并且
(b)基本上没有异嗜性猪内源性逆转录病毒(PERV)病毒粒子的产生。
71.根据权利要求69或70所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述猪经分离的细胞、组织、器官或动物基本上没有PERV聚合酶(pol)的酶活性。
72.根据权利要求69或70所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述猪经分离的细胞、组织、器官或动物基本上没有功能性全长PERVpol蛋白的表达。
73.根据权利要求69或70所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中至少约97％的基因组PERV pol拷贝的编码序列被破坏。
74.根据权利要求69或70所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中基本上所有基因组PERV pol拷贝的编码序列均被破坏。
75.根据权利要求69或70所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中至少约97％的从基因组PERV pol拷贝转录的PERV pol mRNA的编码序列被破坏。
76.根据权利要求73-75中任一项所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中破坏包括所述PERV pol编码序列的至少一个核苷酸位置处的至少一个移码插入/缺失(插入缺失)。
77.根据权利要求69-76中任一项所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述猪经分离的细胞、组织、器官或动物表达功能性PERV gag和/或env蛋白。
78.根据权利要求69-77中任一项所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述猪经分离的细胞、组织、器官或动物包含PERV gag和/或env基因的基本上所有基因组拷贝的完整编码序列。
79.根据权利要求69-78中任一项所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述猪经分离的细胞、组织、器官或动物表现出对人细胞的PERV感染性降低。
80.根据权利要求79所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中与野生型猪细胞相比，所述猪经分离的细胞、组织、器官或动物表现出对人细胞的PERV感染性低至少200倍。
81.根据权利要求79或80所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中与缺乏靶向PERV pol基因或mRNA的基因组修饰的猪经分离的猪细胞、组织、器官或动物相比，所述猪经分离的细胞、组织、器官或动物表现出对人细胞的PERV感染性降低。
82.根据权利要求79-81中任一项所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中通过将所述猪经分离的细胞、组织、器官或动物或其外科外植体与人细胞共培养确定PERV感染性。
83.根据权利要求79-81中任一项所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其为猪动物，其中通过将源自所述猪动物的细胞外液与人细胞共培养确定PERV感染性。
84.根据权利要求82或83所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中通过针对共培养后PERV基因组序列或抗原的存在用测序、PCR或免疫测定法分析所述人细胞，至少部分确定PERV感染性。
85.根据权利要求69-84中任一项所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述PERV是PERV-A、PERV-B、PERV-A/C或其重组变体。
86.根据权利要求69-85中任一项所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述炎症反应转基因选自TNFα诱导的蛋白质3(A20)、血红素加氧酶(HO-1)、分化簇47(CD47)及其任何组合。
87.根据权利要求69-86中任一项所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述免疫应答转基因选自人白细胞抗原-E(HLA-E)、β-2微球蛋白(B2M)及其任何组合。
88.根据权利要求69-87中任一项所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述免疫调节转基因选自程序性死亡配体1(PD-L1)、Fas配体(FasL)及其任何组合。
89.根据权利要求69-88中任一项所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述多个转基因进一步包括至少一个凝血反应转基因。
90.根据权利要求89所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述凝血反应转基因选自分化簇39(CD39)、血栓调节蛋白(THBD)、组织因子途径抑制剂(TFPI)及其任何组合。
91.根据权利要求69-90中任一项所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述多个转基因进一步包括至少一个补体应答转基因。
92.根据权利要求91所述的猪经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述补体应答转基因选自人膜辅因子蛋白(hCD46)、人补体衰变加速因子(hCD55)、人MAC抑制剂因子(hCD59)及其任何组合。
93.根据权利要求69-92中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述经分离的猪细胞、组织、器官或动物包含所述转基因的基因组整合。
94.根据权利要求93中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述经分离的猪细胞、组织、器官或动物包含所述转基因的种系可传递的基因组整合。
95.根据权利要求69-94中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述猪细胞、组织、器官或动物表达可检测水平的从所述转基因转录的mRNA。
96.根据权利要求69-95中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述猪细胞、组织、器官或动物表达可检测水平的从所述转基因翻译的蛋白质。
97.根据权利要求69-95中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述猪细胞、组织、器官或动物表达治疗有效水平的从转录自所述转基因的mRNA翻译的蛋白质。
98.一种经分离的猪细胞、组织、器官或动物，所述经分离的猪细胞、组织、器官或动物：
(a)包含六个或更多个转基因，所述转基因各自独立地选自补体应答转基因、凝血反应转基因、炎症反应转基因、免疫应答转基因和免疫调节转基因，并且
(b)基本上没有异嗜性猪内源性逆转录病毒(PERV)病毒粒子的产生。
99.根据权利要求98所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述经分离的猪细胞、组织、器官或动物包含所述转基因中的9、10、11或12个。
100.根据权利要求98或99所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述补体应答转基因选自人膜辅因子蛋白(hCD46)、人补体衰变加速因子(hCD55)、人MAC抑制剂因子(hCD59)及其组合。
101.根据权利要求100所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述补体应答转基因的至少部分的转录在泛在启动子的转录控制下。
102.根据权利要求98-101中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述凝血反应转基因选自分化簇39(CD39)、血栓调节蛋白(THBD)、组织因子途径抑制剂(TFPI)及其组合。
103.根据权利要求98-102中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述凝血反应转基因的至少部分的转录在组织特异性启动子的转录控制下。
104.根据权利要求103所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述组织特异性启动子是内皮特异性启动子。
105.根据权利要求104所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述内皮特异性启动子是低表达内皮特异性启动子。
106.根据权利要求98-105中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述炎症反应转基因选自TNFα诱导的蛋白质3(A20)、血红素加氧酶(HO-1)、分化簇47(CD47)及其组合。
107.根据权利要求98-106中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述炎症反应转基因的至少部分的转录由组织特异性启动子、泛在启动子或其任何组合驱动。
108.根据权利要求107所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述组织特异性启动子是内皮特异性启动子。
109.根据权利要求98-108中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述免疫应答转基因选自人白细胞抗原-E(HLA-E)、β-2微球蛋白(B2M)及其组合。
110.根据权利要求98-109中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述免疫应答转基因的至少部分的表达由泛在启动子驱动。
111.根据权利要求98-110中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述免疫调节转基因选自程序性死亡配体1(PD-L1)、Fas配体(FasL)及其组合。
112.根据权利要求98-111中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述六个或更多个转基因选自hCD46、hCD55、hCD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1。
113.根据权利要求98-112中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述细胞、组织、器官或动物包含hCD46、hCD55、hCD59、CD39、THBD、TFPI、A20、HO-1、CD47、HLA-E、B2M和PD-L1转基因或THBD、TFPI、CD39、CD46、CD55、CD59、CD46、HO-1、A20、B2M、HLA-E SCT和CD47转基因。
114.根据权利要求98-113中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述转基因是从单个基因座表达的。
115.根据权利要求98-114中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述转基因被转录成不多于3个顺反子。
116.根据权利要求115所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中顺反子包含至少3个不同转基因的编码序列，其中所述至少3个不同转基因被猪捷申病毒2A(P2A)肽的编码序列分开。
117.根据权利要求69-116中任一项所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其进一步包含一个或多个异种碳水化合物抗原产生基因的缺失、破坏或失活。
118.根据权利要求117所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其中所述一个或多个异种碳水化合物抗原产生基因选自糖蛋白α-半乳糖基转移酶1(GGTA)、β1,4N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(B4GalNT2)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)。
119.根据权利要求118所述的经分离的细胞、组织、器官或动物，其包含GGTA的2个拷贝、B4GALNT2的4个拷贝或CMAH的2个拷贝或其任何组合的缺失、破坏或失活。
120.一种经分离的猪细胞、组织、器官或动物，所述经分离的猪细胞、组织、器官或动物：
(a)包含六个或更多个转基因，所述转基因各自独立地选自补体应答转基因、凝血反应转基因、炎症反应转基因、免疫应答转基因和免疫调节转基因，
(b)基本上没有异嗜性猪内源性逆转录病毒(PERV)病毒粒子的产生，并且
(c)包含GGTA的2个拷贝、B4GALNT2的4个拷贝或CMAH的2个拷贝或其任何组合的缺失、破坏或失活。
121.根据权利要求69-120中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述细胞、组织、器官或动物在暴露于人血或其级分时，表现出与人抗体的结合降低。
122.根据权利要求121所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述细胞、组织、器官或动物在暴露于人血或其级分时，表现出与人抗体的结合降低至少约5倍。
123.根据权利要求121所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述细胞、组织、器官或动物在暴露于人血或其级分时，表现出与人抗体的结合降低至少约10倍。
124.根据权利要求121-123中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述抗体是IgM抗体。
125.根据权利要求121-123中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述抗体是IgG抗体。
126.根据权利要求69-125中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述细胞、组织、器官或动物在暴露于人血时，表现出降低的自然杀伤(NK)细胞毒性。
127.根据权利要求126所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述细胞、组织、器官或动物在暴露于人血时，表现出降低至少约20％的自然杀伤(NK)细胞毒性。
128.根据权利要求69-127中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述细胞、组织、器官或动物在暴露于来自人血的补体时，表现出降低的补体毒性。
129.根据权利要求128所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述细胞、组织、器官或动物在暴露于来自人血的人补体时，表现出至少约5倍降低的补体毒性。
130.根据权利要求69-129中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述细胞、组织、器官或动物在暴露于人血时，表现出降低的TAT复合物形成。
131.根据权利要求130所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述细胞、组织、器官或动物在暴露于人血时，表现出至少约3倍降低的TAT复合物形成。
132.根据权利要求130所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其中所述细胞、组织、器官或动物在暴露于人血时，表现出至少约10倍降低的TAT复合物形成。
133.根据权利要求69-132中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其是表现白细胞、血小板、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其任何组合的正常血细胞计数的动物。
134.根据权利要求69-133中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其是表现出正常肝脏功能的动物，如通过血清碱性磷酸酶水平、阿斯巴甜氨基酰基转移酶水平、丙氨酸氨基转移酶水平、ALT/AST水平、胆固醇、总胆红素、甘油三酸酯或白蛋白/球蛋白水平或其任何组合所评估。
135.根据权利要求69-134中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其是表现出正常心脏功能的动物，如通过血清肌酸激酶水平、肌酸激酶-MB水平、乳酸脱氢酶水平或其任何组合所评估。
136.根据权利要求69-135中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其是表现出正常肾脏功能的动物，如通过血清肌酐水平、尿素水平或其组合所评估。
137.根据权利要求69-136中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其是表现出正常凝血功能的动物，如通过凝血酶时间、凝血酶原水平或其组合所评估。
138.根据权利要求69-137中任一项所述的经分离的猪细胞、组织、器官或动物，其是能够将以下传递至后代动物的动物：
(a)一个或多个异种碳水化合物抗原产生基因的缺失、破坏或失活，所述基因包括α-半乳糖基转移酶1(GGTA)、β1,4N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(B4GalNT2)或胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)或其组合；
(b)所述转基因；
(c)不存在异嗜性猪内源性逆转录病毒(PERV)病毒粒子的产生；或者
(d)其任何组合；
其中(a)-(d)通过正常孟德尔遗传来传递。
CN202080050306.1A 2019-05-16 2020-05-15 具有一个或多个用于增强异种移植物存活和/或耐受性的经修饰基因的细胞、组织、器官和/或动物 Pending CN115176020A (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2019/087314 2019-05-16
PCT/CN2019/087314 WO2020228043A1 (en) 2019-05-16 2019-05-16 Cells, tissues, organs, and/or animals having one or more modified genes for enhanced xenograft survival and/or tolerance
CNPCT/CN2019/087310 2019-05-16
PCT/CN2019/087310 WO2020228039A1 (en) 2019-05-16 2019-05-16 Cells, tissues, organs, and/or animals having one or more modified genes for enhanced xenograft survival and/or tolerance
CNPCT/CN2019/112038 2019-10-18
PCT/CN2019/112038 WO2021072777A1 (en) 2019-10-18 2019-10-18 Cells, tissues, organs, and/or animals having one or more modified genes for enhanced xenograft survival and/or tolerance
PCT/CN2019/112039 WO2021072778A1 (en) 2019-10-18 2019-10-18 Cells, tissues, organs, and/or animals having one or more modified genes for enhanced xenograft survival and/or tolerance
CNPCT/CN2019/112039 2019-10-18
PCT/CN2020/090440 WO2020228810A1 (en) 2019-05-16 2020-05-15 Cells, tissues, organs, and/or animals having one or more modified genes for enhanced xenograft survival and/or tolerance

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115176020A true CN115176020A (zh) 2022-10-11

Family

ID=73289317

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080050306.1A Pending CN115176020A (zh) 2019-05-16 2020-05-15 具有一个或多个用于增强异种移植物存活和/或耐受性的经修饰基因的细胞、组织、器官和/或动物

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20220267805A1 (zh)
EP (1) EP3969596A4 (zh)
JP (1) JP2022532783A (zh)
KR (1) KR20220033468A (zh)
CN (1) CN115176020A (zh)
AU (1) AU2020274150A1 (zh)
BR (1) BR112021023029A2 (zh)
CA (1) CA3139928A1 (zh)
IL (1) IL288049A (zh)
MX (1) MX2021013914A (zh)
SG (1) SG11202112675SA (zh)
WO (1) WO2020228810A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4009780A4 (en) * 2019-08-06 2023-08-30 Nzeno Limited DONOR PIGS FOR XENOTRANSPLANTATION
AU2021283380A1 (en) * 2020-06-03 2023-01-05 Alexis Bio, Inc. Selection and monitoring methods for xenotransplantation

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102548394A (zh) * 2009-08-14 2012-07-04 雷维维科公司 用于糖尿病治疗的多转基因猪
US20180184630A1 (en) * 2015-06-26 2018-07-05 Indiana University Research & Technology Corporation Transgenic pigs with genetic modifications of sla
CN108473963A (zh) * 2015-09-09 2018-08-31 雷维维科公司 用于异种移植的多重转基因猪
CN108486152A (zh) * 2018-02-13 2018-09-04 铸造生物科技（深圳）有限公司 转基因猪的培育方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102656470B1 (ko) * 2014-12-10 2024-04-09 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기
US20190076479A1 (en) * 2017-09-14 2019-03-14 Cell4Vet Corporation Adipose tissue-derived stem cells from transgenic porcine animals for human use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102548394A (zh) * 2009-08-14 2012-07-04 雷维维科公司 用于糖尿病治疗的多转基因猪
US20180184630A1 (en) * 2015-06-26 2018-07-05 Indiana University Research & Technology Corporation Transgenic pigs with genetic modifications of sla
CN108473963A (zh) * 2015-09-09 2018-08-31 雷维维科公司 用于异种移植的多重转基因猪
CN108486152A (zh) * 2018-02-13 2018-09-04 铸造生物科技（深圳）有限公司 转基因猪的培育方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID K.C. COOPER ET AL.: "The potential of genetically-engineered pigs in providing an alternative source of organs and cells for transplantation", THE JOURNAL OF BIOMEDICAL RESEARCH, vol. 27, no. 4, pages 249 - 253 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220267805A1 (en) 2022-08-25
KR20220033468A (ko) 2022-03-16
WO2020228810A1 (en) 2020-11-19
IL288049A (en) 2022-01-01
EP3969596A4 (en) 2023-10-18
AU2020274150A1 (en) 2021-12-02
EP3969596A1 (en) 2022-03-23
CA3139928A1 (en) 2020-11-19
SG11202112675SA (en) 2021-12-30
JP2022532783A (ja) 2022-07-19
BR112021023029A2 (pt) 2022-04-12
MX2021013914A (es) 2022-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3732407B2 (ja) 染色体の改変方法
JP4082740B2 (ja) 内因性遺伝子が破壊されている分化多能性保持細胞
JP4087338B2 (ja) キメラ非ヒト動物
WO2020228039A1 (en) Cells, tissues, organs, and/or animals having one or more modified genes for enhanced xenograft survival and/or tolerance
US20240075164A1 (en) In utero crispr-mediated therapeutic editing of genes
US20070022485A1 (en) Method of preparing transgenic organism with use of methylation and system therefor
AU2024200154A1 (en) An engineered multi-component system for identification and characterisation of T-cell receptors, T-cell antigens and their functional interaction
CN115176020A (zh) 具有一个或多个用于增强异种移植物存活和/或耐受性的经修饰基因的细胞、组织、器官和/或动物
JP2023025182A (ja) Ｔ細胞レセプター及びｔ細胞抗原の同定及び特徴決定のための遺伝子操作された多成分システム
JP2019507610A (ja) ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集に基づく、Ｆｅｌ ｄ１ノックアウト並びに関連組成物及び方法
US20080104723A1 (en) Development of Mammalian Genome Modification Technique Using Retrotransposon
WO2021072777A1 (en) Cells, tissues, organs, and/or animals having one or more modified genes for enhanced xenograft survival and/or tolerance
Michalski et al. Generation of a new frizzled 2 flox mouse model to clarify its role in development
KR20230136188A (ko) 유전적으로 변형된 간세포 집단
JP7055469B2 (ja) ホモ接合型細胞の作製方法
WO2021072778A1 (en) Cells, tissues, organs, and/or animals having one or more modified genes for enhanced xenograft survival and/or tolerance
US10717991B2 (en) Transgenic pig which simultaneously expresses HO-1 gene and TNFR1-Fc gene, and comprises knocked-out GGTA1 gene, and use thereof
TW202128989A (zh) 具有一個或多個用於增強異種移植物存活和／或耐受性的經修飾基因的細胞、組織、器官和／或動物
WO2020228043A1 (en) Cells, tissues, organs, and/or animals having one or more modified genes for enhanced xenograft survival and/or tolerance
US20240066067A1 (en) In utero transplantation of factor viii-expressing cells for treatment of hemophilia
US20240084322A1 (en) Cells, tissues, organs, and animals having one or more modified genes for enhanced xenograft survival and tolerance
Suzuki et al. Seamless Gene Correction in the Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Locus by Vector Replacement and Vector Insertion Events
CN117157406A (zh) 具有一种或多种用于增强异种移植物存活和耐受性的经修饰基因的细胞、组织、器官和动物
AU766519B2 (en) alpha(1,3)-galactosyltransferase negative swine
CA3200855A1 (en) Influenza a-resistant animals having edited anp32 genes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40082059

Country of ref document: HK