TW202128989A - 具有一個或多個用於增強異種移植物存活和／或耐受性的經修飾基因的細胞、組織、器官和／或動物 - Google Patents
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Abstract
本公開文本涉及具有一個或多個用於增強異種移植物存活和/或耐受性的經修飾基因的細胞、組織、器官和/或動物。此外，本公開文本涉及製備和使用具有一個或多個所述經修飾基因的所述細胞、組織、器官和/或動物的方法。
Description
在過去的幾十年中，用於移植的人體器官和組織的短缺日益嚴重，並且是最重要的未滿足的醫療需求之一。異種移植有潛力幾乎無限制地供應用於慢性器官衰竭患者的移植器官。器官大小和生理上的相似性，再加上基因工程消除分子不相容性，使豬成為了腎異種移植的首選供體。臨床前研究表明，豬腎異種移植可以延長非人靈長類動物接受者數周至數月的生命（Higginbotham 2015, Iwase 2015b）。然而，由於豬與人之間的進化距離，豬器官以多種形式觸發了人免疫系統的排斥反應，包括 (i) 超急性排斥反應；(ii) 急性體液排斥反應，由血栓調節失調和II型內皮細胞（EC）啟動伴白細胞募集組成；(iii) 血栓性微血管病，由血管內血栓形成伴血小板消耗以及EC啟動、纖維蛋白沉積和由於缺乏血栓調節而引起的血栓形成組成，以及 (iv) 慢性血管病。這些不良事件至少部分是由於供體與接受者之間的分子不相容性，特別是關於參與補體、凝血、炎症和免疫反應系統的基因。異種器官（例如，豬）的臨床使用被這些免疫學不相容性阻礙，所述不相容性迄今已阻止了豬細胞、組織和血管化豬器官在臨床異種移植中的使用。
在過去的二十年中，已鑒定了減少豬與人之間的種間不相容性的幾種基因修飾。然而，這些先前鑒定的基因修飾尚未實現長期異種移植物存活。此外，大規模基因組工程的技術局限性阻礙了這些修飾在單個動物中的整合。
需要開發具有新穎的基因修飾組合的豬細胞、組織、器官和/或豬動物，用於異種移植和開發相關方法。
因此，本公開文本提供了包含導致增強的免疫學相容性的基因修飾的細胞、組織、器官和動物，以及用於產生這些細胞、組織、器官和動物的載體和方法，以及這些細胞、組織、器官和動物在異體移植中的用途。在某些實施例中，引起增強的免疫學相容性的基因修飾包括一個或多個補體反應基因（在本文中可互換地稱為補體毒性基因）、凝血反應基因（在本文中可互換地稱為凝血基因）、炎症反應基因（在本文中可互換地稱為凋亡/炎症基因）、免疫反應基因（在本文中可互換地稱為細胞毒性基因）和/或免疫調節基因。
在一些方面，本公開文本提供了經分離的細胞、組織、器官和動物，其包含選自炎症反應基因轉殖、免疫反應基因轉殖、免疫調節基因轉殖或其組合的至少兩種類型的多個基因轉殖。在一些方面，本公開文本提供了包含多個基因轉殖的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述多個基因轉殖包括至少一個炎症反應基因轉殖、至少一個免疫反應基因轉殖和至少一個免疫調節基因轉殖。在一些實施例中，所述多個基因轉殖包括選自炎症反應基因轉殖、免疫反應基因轉殖、免疫調節基因轉殖或其組合的至少三個基因轉殖。在一些實施例中，炎症反應基因轉殖選自腫瘤壞死因子α誘導的蛋白質3（A20）、血紅素加氧酶（HO-1或HMOX1）、分化簇47（CD47）及其組合。在一些實施例中，免疫反應基因轉殖選自人白細胞抗原-E（HLA-E）、β-2微球蛋白（B2M）及其組合。在一些實施例中，免疫調節基因轉殖選自程式性死亡配體1（PD-L1）、Fas配體（FasL）及其組合。在一些實施例中，所述多個基因轉殖進一步包括至少一個凝血反應基因轉殖。在一些實施例中，凝血反應基因轉殖選自分化簇39（CD39）、血栓調節蛋白（THBD、TBM或TM）、組織因子途徑抑制劑（TFPI）及其組合。在一些實施例中，所述多個基因轉殖進一步包括至少一個補體反應基因轉殖。在一些實施例中，補體反應基因轉殖選自人膜輔因子蛋白（hCD46或簡稱CD46）；人補體衰變加速因子（hCD55或簡稱CD55）、人MAC抑制劑因子（hCD59或簡稱CD59）及其組合。
在一個方面，本公開文本提供了包含一個或多個基因轉殖的經分離的細胞、組織、器官和動物，所述基因轉殖各自獨立地選自補體反應基因轉殖（例如，CD46、CD55、CD59）；凝血反應基因轉殖（例如，CD39、THBD或TBM、TFPI）；炎症反應基因轉殖（例如，A20、HO-1、CD47）；免疫反應基因轉殖（例如，HLA-E、B2M）；和/或免疫調節基因轉殖（例如，PD-L1、FasL）。在某些實施例中，所述細胞、組織、器官或動物可以進一步包含來自其他基因類別的一個或多個另外的基因轉殖。
在某些實施例中，本文提供的經分離的細胞、組織、器官和動物包含一個或多個選自hCD46、hCD55和hCD59的補體反應基因轉殖。在這些實施例的一些中，一種或多種所述補體反應基因轉殖的表現由泛在啟動子驅動。
在某些實施例中，本文提供的經分離的細胞、組織、器官和動物包含一個或多個選自CD39、THBD和TFPI的凝血反應基因轉殖。在這些實施例的一些中，一種或多種所述凝血反應基因轉殖的表現由組織特異性啟動子驅動。在這些實施例的某些中，所述組織特異性啟動子是內皮特異性啟動子，並且在這些實施例的某些中，所述內皮特異性啟動子是低表現內皮特異性啟動子。
在某些實施例中，本文提供的經分離的細胞、組織、器官和動物包含一個或多個選自A20、HO-1和CD47的炎症反應基因轉殖。在這些實施例的一些中，一種或多種所述炎症反應基因轉殖的表現由泛在啟動子、組織特異性啟動子（如內皮特異性啟動子）或其任何組合驅動。
在某些實施例中，本文提供的經分離的細胞、組織、器官和動物包含一個或多個選自HLA-E和B2M的免疫反應基因轉殖。在這些實施例的一些中，一種或多種所述免疫反應基因轉殖的表現由泛在啟動子驅動。
在某些實施例中，本文提供的經分離的細胞、組織、器官和動物包含一個或多個免疫調節基因轉殖，包括但不限於PD-L1、FasL或兩者。
在所述細胞、組織、器官或動物中以臨床有效水準表現這些基因轉殖中的至少六個導致增強的免疫學相容性。因此，在某些實施例中，本文提供的經分離的細胞、組織、器官和動物包含六個或更多個基因轉殖，例如6、7、8、9、10、11或12個基因轉殖，其選自補體反應、凝血反應、炎症反應、免疫基因和免疫調節基因轉殖。在這些實施例的某些中，所述細胞、組織、器官或動物可以包含來自每個類別的至少一個基因轉殖。在其他實施例中，可以排除某些類別的基因轉殖。在某些實施例中，補體反應、凝血反應、炎症反應、免疫反應和/或免疫調節基因轉殖均可以同時以可檢測和/或臨床有效水準表現。在其他實施例中，僅基因轉殖的特定子集可以在某些時間點或回應於某些信號以臨床有效水準表現。在這些實施例中，一種或多種所述基因轉殖的表現可以在某些時間點下降到可檢測和/或臨床有效水準以下。
在某些實施例中，本文提供的經分離的細胞、組織、器官和動物包含基因轉殖CD46、CD55、HLA-E、CD47、CD39、THBD和TFPI。
在某些實施例中，本文提供的經分離的細胞、組織、器官和動物包含基因轉殖CD46、CD55、CD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD和TFPI。
在某些實施例中，本文提供的經分離的細胞、組織、器官和動物包含基因轉殖CD46、CD55、CD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1。
本文所指的蛋白質或基因可以是根據下表的那些。序列通過引用併入。
| 蛋白質/基因 | 名稱 | 也稱為 | 示例人或豬UniProtKB參考 |
| GGTA | N-乙醯乳糖胺α-1,3-半乳糖基轉移酶 | GGTA1 | P50127（GGTA1_PIG） |
| β4GALNT2 | β1,4 N-乙醯半乳糖胺基轉移酶 | B4GALNT2、B4GAL | |
| CMAH | 胞苷單磷酸-N-乙醯神經胺酸羥化酶 | O19074（CMAH_PIG） | |
| CD46 | CD46補體調節蛋白 | P15529（MCP_HUMAN） | |
| CD55 | CD55分子（Cromer血型） | 衰變加速因子，DAF | P08174（DAF_HUMAN） |
| CD59 | CD59分子 （CD59血型） | P13987（CD59_HUMAN） | |
| THBD | 血栓調節蛋白 | CD141抗原 | P07204（TRBM_HUMAN） |
| TFPI | 組織因子途徑抑制劑 | 脂蛋白相關的凝血抑制劑 | P10646（TFPI1_HUMAN） |
| CD39 | CD39抗原 | 外核苷三磷酸二磷酸水解酶1，ENTPD1 | P55772（ENTP1_MOUSE） |
| HLA-E | 主要組織相容性複合物I類，E | MHC I類抗原E，MHC Ib類抗原 | P13747（HLAE_HUMAN） |
| B2M | β-2微球蛋白 | MHC I類分子的β鏈 | P61769（B2MG_HUMAN） |
| CD47 | 分化簇47，CD47抗原 | 整合素相關蛋白 | Q08722（CD47_HUMAN） |
| A20 | A20 | TNF α誘導蛋白3，TNFAIP3 | P21580（TNAP3_HUMAN） |
| PD-L1 | 程式性細胞死亡1配體1 | CD274，B7同系物1，B7H1 | Q9NZQ7（PD1L1_HUMAN） |
| FasL | Fas配體 | FASL，CD95，腫瘤壞死因子（配體）超家族，成員6，TNFL6 | P48023（TNFL6_HUMAN） |
在某些實施例中，本文公開的經分離的細胞、組織、器官和動物進一步包含對補體反應基因、凝血反應基因、炎症反應基因、免疫反應基因和/或免疫調節基因的一個或多個修飾。例如，在其中所述細胞、組織、器官或動物是豬的某些實施例中，所述細胞、組織、器官或動物可以包含血管性血友病因子（vWF）基因的改變，在一些情況下包括導致所述基因人源化的改變。
在某些實施例中，本文公開的細胞、組織、器官和動物進一步包含對其他類別基因的一個或多個修飾。這些修飾可以包括，例如，所述基因全部或部分的缺失或切除（即敲除），或任何其他失活、破壞或改變。例如，在某些實施例中，所述細胞、組織、器官和動物可以包含脫唾液酸糖蛋白受體1（ASGR1）的敲除、失活或破壞。在某些實施例中，可以對所述細胞、組織、器官和動物進行基因修飾以表現出降低的碳水化合物抗原反應。例如，所述細胞、組織、器官或動物可以包含一個或多個碳水化合物抗原產生基因（例如，糖蛋白α-半乳糖基轉移酶1（GGTA）、β1,4 N-乙醯半乳糖胺基轉移酶2（B4GalNT2）、胞苷單磷酸-N-乙醯神經胺酸羥化酶（CMAH））的敲除、失活或破壞。
在某些實施例中，本文提供的經分離的細胞、組織、器官和動物包含基因轉殖CD46、CD55、HLA-E、CD47、CD39、THBD和TFPI，並且進一步包含GGTA、B4GalNT2和CMAH的敲除、失活或破壞。在某些實施例中，所述經分離的細胞、組織、器官和動物進一步包含基因轉殖CD59和B2M，並且在那些實施例的某些中，所述經分離的細胞、組織、器官和動物進一步包含基因轉殖A20、PD-L1和HO-1。在某些實施例中，這些細胞、組織、器官和動物表現出增強的免疫相容性，包括減少的碳水化合物抗原反應和增強的凝血、補體、炎症和/或免疫反應。
在一些實施例中，本文提供的經分離的細胞、組織、器官和動物是豬，即豬細胞、豬組織、豬器官或豬或其後代。在這些實施例的某些中，所述細胞、組織、器官或動物不含豬內源性逆轉錄病毒（“不含PERV”）。在這些實施例的某些中，“不含PERV”的細胞、組織、器官或動物不產生異嗜性PERV病毒粒子。在這些實施例的某些中，“不含PERV”的細胞、組織、器官或動物不產生PERV病毒粒子。在這些實施例的某些中，“不含PERV”的細胞、組織、器官或動物不產生感染性PERV病毒粒子。在這些實施例的某些中，不含PERV的細胞、組織、器官和動物包含基因轉殖CD46、CD55、HLA-E、CD47、CD39、THBD和TFPI，並且任選地進一步包含GGTA、B4GalNT2和/或CMAH的敲除、失活或破壞。在其他實施例中，不含PERV的細胞、組織、器官和動物包含基因轉殖CD46、CD55、CD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD和TFPI，並且任選地進一步包含GGTA、B4GalNT2和/或CMAH的敲除、失活或破壞。在仍其他實施例中，不含PERV的細胞、組織、器官和動物包含基因轉殖CD46、CD55、CD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1，並且任選地進一步包含GGTA、B4GalNT2或CMAH的敲除、失活或破壞。
在本文提供的經分離的細胞和組織的某些實施例中，所述細胞或組織是腎臟或肝臟細胞或組織。在本文提供的經分離的器官的某些實施例中，所述器官是腎臟或肝臟。
在另一方面，本公開文本提供了載體，其包含選自炎症反應基因轉殖、免疫反應基因轉殖、免疫調節基因轉殖或其組合的至少兩種類型的多個基因轉殖。在一些實施例中，所述多個基因轉殖包括選自炎症反應基因轉殖、免疫反應基因轉殖、免疫調節基因轉殖或其組合的三種類型。在一些方面，本公開文本提供了包含多個基因轉殖的載體，其中所述多個基因轉殖包括至少一個炎症反應基因轉殖、至少一個免疫反應基因轉殖和至少一個免疫調節基因轉殖。在一些實施例中，所述炎症反應基因轉殖選自A20、HO-1、CD47及其組合。在一些實施例中，所述免疫反應基因轉殖選自HLA-E、B2M及其組合。在一些實施例中，所述免疫調節基因轉殖選自PD-L1、FasL及其組合。在一些實施例中，所述多個基因轉殖進一步包括至少一個凝血反應基因轉殖。在一些實施例中，所述凝血反應基因轉殖選自CD39、THBD、TFPI及其組合。在一些實施例中，所述多個基因轉殖進一步包括至少一個補體反應基因轉殖。在一些實施例中，所述補體反應基因轉殖選自CD46、CD55、CD59及其組合。
在其他方面，本公開文本提供了用於基因修飾細胞、組織、器官或動物以產生本文提供的細胞、組織、器官或動物的載體，包括例如用於插入（即敲入）一個或多個補體反應、凝血反應、炎症反應、免疫反應和/或免疫調節基因轉殖的載體。在這些實施例的某些中，所述載體包含所述基因轉殖中的至少6、7、8、9、10、11或12個。在這些實施例的一些中，所述基因轉殖中的至少六個是從單個基因座表現的。本文還提供了用於基因修飾細胞、組織、器官或動物以產生本文提供的細胞、組織、器官或動物的其他組分，包括例如基於CRISPR的編輯組分，如指導RNA（gRNA）或核酸內切酶。
在某些實施例中，本文提供的載體包含基因轉殖CD46、CD55、HLA-E、CD47、CD39、THBD和TFPI。在這些實施例的某些中，所述載體進一步包含基因轉殖CD59和B2M。在這些實施例中的某些中，所述載體進一步包含基因轉殖A20、PD-L1和HO-1，並且在這些實施例的某些中，所述載體包含如圖17-圖20、圖31或圖48-圖50所示的組分。在某些實施例中，所述載體包含如SEQ ID NO:212-214中任一個所示的序列。
在某些實施例中，本文還提供了產生本文提供的經分離的細胞、組織、器官和動物的方法。在這些實施例的某些中，所述方法包括引入一種或多種本文提供的載體。因此，在某些實施例中，本文提供的細胞、組織、器官和動物包含一種或多種本文公開的載體。
在一些實施例中，本文公開和描述的方法包括通過轉座進行的單拷貝多順反子基因轉殖整合、通過重組酶介導的盒交換（RMCE）進行的單/雙等位基因位點特異性整合、基因組替代、內源基因人源化或其任何組合。
在本文提供的方法的某些實施例中，其中所產生的細胞、組織、器官和動物是豬，所述方法進一步包括敲除或以其他方式破壞或滅活一個或多個PERV基因，例如PERV pol，並且在這些實施例的某些中，所得的豬細胞、組織、器官或動物不含PERV。
在另一方面，本公開文本提供了當暴露於非豬血液時具有減少的肝臟損害和/或穩定的凝血的基因轉殖豬肝臟，其中通過確定膽汁產生、一種或多種代謝酶和/或一種或多種血清電解質的水準來評估減少的肝臟損害，並且其中通過確定凝血酶原時間（PT）和國際標準化比率（PT-NIR）、纖維蛋白原水準（FIB）和/或較低的啟動部分促凝血酶原激酶時間（APTT）的水準來評估穩定的凝血。在一些實施例中，所述代謝酶選自丙胺酸胺基轉移酶（ALT）、天門冬胺酸胺基轉移酶（AST）和白蛋白（ALB）。在一些實施例中，所述血清電解質是鉀（K）和/或鈉（Na）。
在一些實施例中，本文公開和描述的基因轉殖豬肝臟包含選自丙胺酸胺基轉移酶（ALT）、天門冬胺酸胺基轉移酶（AST）和白蛋白（ALB）的天然代謝酶。
相關申請案的交叉引用
出於所有目的，本申請案併入2019年5月16日提交的PCT/CN19/87310、2019年5月16日提交的PCT/CN19/87314、2019年10月18日提交的PCT/CN19/112038和2019年10月18日提交的PCT/CN19/112039的全部公開內容。
序列表的交叉引用
將與此一起以電子方式提交的文字檔的內容通過引用以其整體併入本文：序列表的電腦可讀格式拷貝（檔案名：EGEN_037_00WO_SeqList_ST25.txt，記錄日期：2020年5月14日，文件大小：189千位元組）。
I. 定義
術語“豬（pig）”、“豬（swine）”和“豬（porcine）”在本文中可互換使用，是指與家豬物種野豬（Sus scrofa
）的各種品種有關的任何動物。
當用於指代蛋白質或多肽的片段或衍生物時，術語“生物活性”意指所述片段或衍生物保留了參考全長蛋白質或多肽的至少一種可測量和/或可檢測的生物活性。例如，CRISPR/Cas9蛋白的生物活性片段或衍生物可能能夠結合gRNA，有時在本文中也稱為單指導RNA（sgRNA），當與指導RNA複合時結合靶DNA序列，和/或切割一條或多條DNA鏈。
當在疾病、損傷或障礙的情況下使用時，術語“治療（treatment）”、“治療（treating）”、“減輕”等在本文中通常意指獲得希望的藥理學和/或生理學作用，並且還可以用於指代改善、減輕和/或降低所治療病症的一種或多種症狀的嚴重性。就完全或部分延遲疾病、病症或其症狀的發作或復發而言，所述作用可以是預防性的，和/或就部分或完全治癒疾病或病症和/或可歸因於所述疾病或病症的不利作用而言，所述作用可以是治療性的。如本文所使用，“治療”涵蓋對哺乳動物，特別是人的疾病或病症的任何治療，並且包括：(a) 在可能易患疾病或病症但尚未被診斷為患有所述疾病或病症的受試者中預防所述疾病或病症發生；(b) 抑制疾病或病症（例如，阻止其發展）；或 (c) 緩解疾病或病症（例如，使疾病或病症消退，從而改善一種或多種症狀）。
本文中使用的術語“同時”是指與另一事件同時發生的事件，如與另一事件的發生相比，在數秒、數毫秒、數微秒或更短的時間內發生。
本文中使用的術語“敲除（knockout）”（“KO”）或“敲除（knocking out）”是指豬或其他動物或者豬或其他動物中的任何細胞中的基因或缺陷基因的缺失、失活或消融。如本文所用，KO還可以指代執行或已執行了基因或其部分的缺失、失活或消融的方法。
本文中使用的術語“敲入（knockin）”（“KI”）或“敲入（knocking in）”是指豬或其他動物或者豬或其他動物中的任何細胞中的基因的一個或多個核苷酸的添加、替代或突變。如本文所用，KI還可以指代執行或已執行了基因或其部分的一個或多個核苷酸的添加、替代或突變的方法。
II. 細胞、組織、器官和動物
豬異種移植物與人器官大小和生理學廣泛相容，並且在倫理上被美國普通人群所接受。然而，異種移植的豬組織引發一系列複雜的事件，導致移植物排斥反應，包括：由於存在針對豬抗原的預先形成的抗體而導致的超急性排斥反應，補體啟動和高凝狀態，以及由於分子不相容性而導致的先天性和適應性免疫反應增強。本公開文本使用基因工程方法來解決當前異種移植的缺點。
具體地，存在許多免疫和功能挑戰，涉及先天性和適應性免疫功能。補體和凝血介導的功能障礙是由於供體豬組織與人體生理之間的分子不相容性而引起的，並導致了急性異種移植失敗。預先形成的針對α-1,3-半乳糖基-半乳糖（αGal）表位的抗體通過啟動補體來啟動超急性移植排斥反應。糖蛋白α-半乳糖基轉移酶1基因（GGTA1）的遺傳失活可以減少這種快速的移植物破壞。通過人補體調節蛋白（hCRP）CD46（膜輔因子蛋白）、CD55（補體衰變加速因子）和CD59（MAC抑制蛋白）基因的過表現，保護作用得到進一步改善。
大多數非Gal異種抗體均識別唾液酸N-羥乙醯神經胺酸（Neu5Gc），其是由胞苷單磷酸-N-乙醯神經胺酸水解酶（CMAH）基因合成的。此基因在人體中是無活性的，因此，豬Neu5Gc在人體中具有免疫原性。因此，豬CMAH可能必須被滅活以在異種移植中取得臨床成功。儘管補體調節子的表現和GGTA1的敲除（GTKO）減少了超急性排斥反應，但這些基因修飾並不影響急性血管排斥反應（AVR）。
凝血功能障礙，包括血栓性微血管病和全身性消耗性凝血病，甚至在GTKO和hCRP過表現的情況下也持續存在，這主要是由於豬與非人靈長類動物（NHP）之間的凝血系統的分子不相容性所致。
儘管其他人試圖產生用於安全異種移植的基因轉殖豬，但由於構建能力的限制和基因轉殖之間的轉錄干擾，這些基因轉殖豬僅攜帶有限數量的基因轉殖。這些方法被證明不足以克服異種移植物不相容性。例如，美國專利公開號2018/0249688利用了具有不同基因轉殖組合的多順反子表現載體。重要的是，這些多順反子載體僅包含4個基因轉殖，並被用於產生具有6個基因修飾（包括αGal的KO（GTKO））的豬。在本公開文本中，利用了KO、KI和基因組替代策略的組合。首次產生了從單個基因座表現多於6個基因轉殖的不含PERV的豬。
本文描述和公開的例子表明，豬補體因子可以被KO，並且可以生產具有以下的活豬：一個或多個經修飾的MHC I類基因、MHC II類基因的失活、PD-L1的KI以降低基於適應性免疫的排斥反應、經修飾的豬vWF以調節血小板聚集，以及豬MHC I類基因的缺失。這些例子提供了一個平臺，用於在同一頭豬內實現更大數量的基因修飾。通過這項工作，將豬細胞用多於六個基因轉殖進行基因修飾，以產生免疫相容的細胞、組織、器官、豬和後代。使用CRISPR-Cas9，功能上敲除了多個基因，包括GGTA1、CMAH和B4GALNT2，以消除由預先形成的人抗豬抗體識別的聚糖。此外，將九個或十二個人基因轉殖整合到豬基因組中的單個多基因轉殖盒中。具體地，通過以下方式來產生豬：利用CRISPR介導的非同源末端連接（NHEJ）來破壞3個主要的異種碳水化合物抗原產生基因（“3KO”；GGTA1、B4GALNT2和CMAH），並與PiggyBAC介導的將9個基因轉殖CD46、CD55、CD59、CD39、CD47、HLA-E、B2M、THBD和TFPI或12個基因轉殖（CD46、CD55、CD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1）隨機整合到豬基因組中結合。進一步的進步是使用在不含PERV背景下具有3KO和9T或12TG修飾的源供體豬。從那裡，還將對源供體豬進行基因工程化以使其攜帶另外的基因修飾，尤其包括vWF基因的人源化以及脫唾液酸糖蛋白受體1（ASGR1）和內源性B2M基因的缺失或破壞。
本公開文本提供了具有多個經修飾基因的細胞、組織、器官和動物，以及產生它們的方法。在一些實施例中，所述細胞、組織、器官獲自動物或者是動物。在一些實施例中，所述動物是哺乳動物。在一些實施例中，所述哺乳動物是非人哺乳動物，例如馬、靈長類動物、豬、牛、綿羊、山羊、犬或貓。在一些實施例中，所述哺乳動物是豬。
根據本公開文本的基因的修飾用於改善供體與接受者之間的分子相容性並減少不良事件，包括超急性排斥反應、急性體液排斥反應、血栓性微血管病和慢性血管病。例如，超急性排斥反應發生在非常短的時間跨度內，通常在移植後的幾分鐘到幾小時內發生，並且是由啟動補體和移植內皮細胞的預先形成的抗體引起的，進而導致促凝變化，其導致止血並最終破壞移植器官。在某些實施例中，所述細胞、組織、器官和動物產生減少的超急性排斥反應。
在一些實施例中，本公開文本提供了具有多個經修飾基因的一種或多種細胞、組織、器官或動物。在一些實施例中，所述細胞、組織、器官或動物已被基因修飾，使得多個基因已被添加、缺失、滅活、破壞，其部分已被切除，或者基因序列已被改變。在一些實施例中，所述細胞、組織、器官或動物具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個已被修飾的基因。在一些實施例中，已被修飾的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個基因是從單個基因座表現的。在一些實施例中，已被修飾的5、10或12個基因是從單個基因座表現的。在一些實施例中，已被修飾的12個基因是從單個基因座表現的。在一些實施例中，所述細胞、組織、器官或動物具有多於20、多於15、多於10、多於5、多於3、或2個已被修飾的基因。在一些實施例中，所述細胞、組織、器官或動物具有多於10、多於5、多於3、多於2或多於1個已被修飾的基因。在一些實施例中，所述細胞、組織、器官或動物具有所述經修飾基因的一個拷貝，並且在其他實施例中，所述細胞、組織、器官或動物具有所述一個或多個經修飾基因的多於一個拷貝，如所述經修飾基因的多於2、多於3、多於4、多於5、多於6、多於7、多於8、多於9、多於10、多於15、多於20、多於25、多於30、多於35、多於40、多於50、多於60、多於70、多於80、多於90或多於100個拷貝。在一些實施例中，所述細胞具有一個或多個經修飾基因的100個拷貝至約1個拷貝、90個拷貝至約1個拷貝、80個拷貝至約1個拷貝、約70個拷貝至約1個拷貝、60個拷貝至約1個拷貝、約50個拷貝至約1個拷貝、約40個拷貝至約1個拷貝、約30個拷貝至約1個拷貝、約20個拷貝至約5個拷貝、約15個拷貝至約10個拷貝或約5個拷貝至約1個拷貝。
在一些實施例中，本公開文本提供了具有一個或多個經修飾基因的多個拷貝的一種或多種細胞、組織、器官或動物。例如，所述細胞、組織、器官或動物可以具有一個或多個經修飾基因的2、3、4、5、6、7、8、9、約10、約15、約20、約25、約30或更多個拷貝。
在一些實施例中，所述一種或多種細胞是原代細胞。在一些實施例中，所述一種或多種細胞是體細胞。在一些實施例中，所述一種或多種細胞是出生後細胞。在一些實施例中，所述一種或多種細胞是成年細胞（例如，成年耳成纖維細胞）。在一些實施例中，所述一種或多種細胞是胎兒/胚胎細胞（例如，胚胎卵裂球）。在一些實施例中，所述一種或多種細胞是種系細胞。在一些實施例中，所述一種或多種細胞是卵母細胞。在一些實施例中，所述一種或多種細胞是幹細胞。在一些實施例中，所述一種或多種細胞是來自原代細胞株的細胞。在一些實施例中，所述一種或多種細胞選自：上皮細胞、肝臟細胞、顆粒細胞、脂肪細胞。在特定實施例中，所述一種或多種細胞是成纖維細胞。在一些實施例中，所述成纖維細胞是雌性胎兒成纖維細胞。在一些實施例中，所述一種或多種細胞是在體外的。在一些實施例中，所述一種或多種細胞是在體內的。在一些實施例中，所述一種或多種細胞是單細胞。在一些實施例中，所述一種或多種細胞是細胞集落的成員。
在一些實施例中，所述一種或多種細胞是豬細胞。豬細胞起源或衍生的品種的非限制性例子包括任何以下豬品種：美國長白豬（American Landrace）、美國約克夏豬（American Yorkshire）、Aksai Black Pied豬、昂格爾恩鞍背豬（Angeln saddleback）、阿巴拉契亞英國豬（Appalachian English）、阿拉帕瓦島豬（Arapawa Island）、奧克蘭群島豬（Auckland Island）、澳大利亞約克夏豬（Australian Yorkshire）、Babi Kampung豬、巴川豬（Ba Xuyen）、班圖豬（Bantu）、巴斯克豬（Basque）、巴茲納豬（Bazna）、北京黑豬（Beijing Black）、白俄羅斯黑雜色豬（Belarus Black Pied）、比利時長白豬（Belgian Landrace）、孟加拉棕Shannaj豬（Bengali Brown Shannaj）、本特海姆黑斑豬（Bentheim Black Pied）、巴克夏豬（巴克夏豬）、比薩羅豬（Bisaro）、班古爾豬（Bangur）、黑斯拉夫尼亞豬（Black Slavonian）、黑色加那利豬（Black Canarian）、Breitovo豬、英國長白豬（British Landrace）、英國羅布泊豬（British Lop）、英國白肩豬（British Saddleback）、保加利亞白豬（Bulgarian White）、Cambrough豬、廣東豬（Cantonese）、凱爾特豬（Celtic）、查托穆爾西亞豬（Chato Murciano）、賈斯特白豬（Chester White）、清邁黑豬（Chiangmai Blackpig）、喬克托豬（Choctaw Hog）、克裡奧爾豬（Creole）、捷克改良白豬（Czech Improved White）、丹麥長白豬（Danish Landrace）、丹麥Protest豬（Danish Protest）、雜色豬（Dermantsi Pied）、Li Yan豬、杜洛克豬（Duroc）、荷蘭長白豬（Dutch Landrace）、東長白豬（East Landrace）、東巴爾幹豬（East Balkan）、埃塞克斯豬（Essex）、愛沙尼亞培根豬（Estonian Bacon）、楓涇豬（Fengjing）、芬蘭長白豬（Finnish Landrace）、林山豬（Forest Mountain）、法國長白豬（French Landrace）、加斯科涅豬（Gascon）、德國長白豬（German Landrace）、格洛斯特郡花豬（Gloucestershire Old Spots）、哥廷根小型豬（Gottingen minipig）、格萊斯豬（Grice）、幾內亞豬（Guinea Hog）、漢普郡豬（Hampshire）、漢特豬（Hante）、赫裡福德豬（Hereford）、Hezuo豬、霍根豬（Hogan Hog）、亨廷頓黑豬（Huntington Black Hog）、伊比利亞豬（Iberian）、義大利長白豬（Italian Landrace）、日本長白豬（Japanese Landrace）、濟州黑豬（Jeju Black）、金華豬（Jinhua）、卡克黑提安豬（Kakhetian）、可樂豬（Kele）、克麥羅沃豬（Kemerovo）、韓國本土豬（Korean Native）、克斯烤普捷豬（Krskopolje）、庫內昆豬（Kunekune）、拉孔布豬（Lamcombe）、大黑豬（Large Black）、大黑白豬（Large Black-White）、大白豬（Large White）、拉脫維亞白豬（Latvian White）、Leicoma豬、立陶宛本土豬（Lithuanian Native）、立陶宛白豬（Lithuanian White）、林肯郡卷毛豬（Lincolnshire Curly-Coated）、利夫內豬（Livny）、Malhado de Alcobaca豬、曼加利察豬（Mangalitsa）、梅山豬（Meishan）、中白豬（Middle White）、民豬（Minzhu）、Minokawa Buta豬、蒙開豬（Mong Cai）、Mora Romagnola豬、莫拉豬（Moura）、Mukota豬、繆爾福特豬（Mulefoot）、穆羅姆豬（Murom）、米爾霍羅德豬（Myrhorod）、Nero dei Nebrodi豬、內江豬（Neijiang）、紐西蘭豬（New Zealand）、寧鄉豬（Ningxiang）、北高加索豬（North Caucasian）、北西伯利亞豬（North Siberian）、挪威長白豬（Norwegian Landrace）、挪威約克夏豬（Norwegian Yorkshire）、Ossabaw島豬（Ossabaw Island）、牛津桑迪黑豬（Oxford Sandy and Black）、Pakchong 5豬、菲律賓本土豬（Philippine Native）、皮特蘭豬（Pietrain）、波中豬（Poland China）、紅垂豬（Red Wattle）、Saddleback豬、Semirechensk豬、西伯利亞黑斑豬（Siberian Black Pied）、小黑豬（Small Black）、小白豬（Small White）、斑點豬（Spots）、Surabaya Babi豬、施韋比施哈爾豬（Swabian-Hall）、瑞典長白豬（Swedish Landrace）、燕腹燕子曼加利察豬（Swallow Belied Mangalitza）、太湖豬（Taihu pig）、塔姆沃思豬（Tamworth）、Thuoc Nhieu豬、藏豬（Tibetan）、東京-X豬（Tokyo-X）、齊維利斯克豬（Tsivilsk）、Turopolje豬、烏斑草原豬（Ukrainian Spotted Steppe）、烏白草原豬（Ukrainian White Steppe）、烏爾茹姆豬（Urzhum）、越南大肚豬（Vietnamese Potbelly）、威爾士豬（Welsh）、威賽克斯白肩豬（Wessex Saddleback）、西法白豬（West French White）、Windsnyer豬、五指山豬（Wuzhishanm）、雅南豬（Yanan）、約克夏豬和約克夏藍白豬（Yorkshire Blue and White）。在一些實施例中，所述豬細胞是約克夏和尤卡坦豬細胞。
在一些實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已被基因修飾，使得一個或多個基因已通過添加、缺失、失活、破壞、切除其部分而被修飾，或者所述基因序列的部分已被改變。
在一些實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物包含使一個或多個基因失活的一個或多個突變。在一些實施例中，所述細胞、組織、器官或動物包含一個或多個突變或表觀遺傳變化，其導致具有所述一個或多個突變的一個或多個基因的表現減少或消除。在一些實施例中，通過對存在於所述細胞、組織、器官或動物中的核酸進行基因修飾來使所述一個或多個基因失活。在一些實施例中，一個或多個基因的失活通過測定來證實。在一些實施例中，所述測定是感染性測定、逆轉錄酶PCR測定、RNA-seq、即時PCR或連接PCR定位測定。
特定基因型
為了保證細胞、組織、器官和動物對人臨床使用是安全且有效的，對本公開文本的細胞、組織、器官和動物（例如，供體豬）進行了基因工程化，以使其具有增強的補體（即補體毒性）、凝血、炎症（即細胞凋亡/炎症）、免疫（即細胞毒性）和/或免疫調節系統，使它們在人體中相容。敲除（KO）、敲入（KI）（在本文中也稱為基因轉殖（TG））和/或基因組替代策略的新穎組合提供了增強的補體、凝血、炎症、免疫和/或免疫調節系統。
例如因基因KO而缺乏主要異種碳水化合物抗原表現的細胞、組織、器官和動物在異種移植過程中減少或消除體液排斥反應。三種主要的異種碳水化合物抗原包括通過糖基轉移酶/糖基水解酶GGTA1、CMAH和B4GALNT2產生的那些抗原。這些基因的功能喪失的目的是減少和/或消除預先形成的抗豬抗體與豬移植物內皮的結合。
將關鍵補體、凝血、炎症、免疫和/或免疫調節因子插入一個或多個基因組基因座，例如安全港基因組基因座（如AAVS1）中，將有助於調節人補體系統以及自然殺傷（NK）、巨噬細胞和T細胞功能。非限制性例子包括通過KI使hCD46、hCD55和hCD59過表現以抑制人補體級聯；將vWF人源化以防止未調節的血小板封存和血栓性微血管病，例如通過人源化豬vWF序列的A1結構域和/或側翼區域；B2M-HLA-E SCT的KI，以提供針對人NK細胞細胞毒性的保護和豬細胞的人源化；以及CD47、CD39、THBD、TFPI、A20的KI，以起到免疫抑制劑、免疫調節劑和/或抗凝劑的作用。
在一些實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已被基因修飾，使得一個或多個基因已通過添加、缺失、失活、破壞、切除其部分而被修飾，或者所述基因序列的部分已被改變。在一些實施例中，本公開文本提供了具有多個經修飾基因的經分離的細胞、組織、器官或動物。在一些實施例中，所述經修飾基因包括以下中的一個或多個：α1,3,半乳糖基轉移酶（GGTA）、β-1,4-N-乙醯基-半乳糖胺基轉移酶2（B4GalNT2）、胞苷單磷酸-N-乙醯神經胺酸羥化酶（CMAH）、THBD、TFPI、CD39、HO-1、CD46、CD55、CD59、主要組織相容性複合物I類E單鏈三聚體（HLA-E SCT）、A20、PD-L1、CD47、豬白細胞抗原1（SLA-1）、SLA-2、SLA-3、vWF、B2M、DQA、DRA和CD47。
在一些實施例中，所述經修飾基因是GGTA、B4GalNT2、CMAH或其任何組合。在一些實施例中，所述GGTA、B4GalNT2和/或CMAH是遺傳上KO的。在一些實施例中，所述經修飾基因是THBD、TFPI、CD39，HO-1或其任何組合。在一些實施例中，所述THBD、TFPI、CD39和/或HO-1是遺傳上KI的。在一些實施例中，所述經修飾基因是CD46、CD55、CD59、B2M-HLA-E SCT、A20、PD-L1、CD47或其任何組合。在一些實施例中，所述CD46、CD55、CD59、B2M-HLA-E SCT、A20、PD-L1和/或CD47是遺傳上KI的。在一些實施例中，所述經修飾基因是SLA-1、SLA-2、SLA-3、B2M或其任何組合。在一些實施例中，所述經修飾基因是DQA和/或DRA。在一些實施例中，所述經修飾基因是PD-L1、外源vWF、HLA-E、HLA-G、B2M、CIITA-DN和/或其任何組合。在一些實施例中，所述經修飾基因是TBM、PD-L1、HLA-E、CD47或其任何組合。在一些實施例中，所述TBM、PD-L1、HLA-E和/或CD47是遺傳上KI的。在一些實施例中，所述經修飾基因是MHC-I基因SLA-1、SLA-2和SLA-3，MHC-II基因DQA和DRA，內源性vWF，CD9，脫唾液酸糖蛋白受體，至少一種補體抑制劑基因（例如，C3、CD46、CD55和CD59）及其任何組合。在一些實施例中，所述CD46、CD55和/或CD59是遺傳上KI的。
在一個實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已用基因轉殖表現載體進行了基因修飾，所述基因轉殖表現載體包含B2M、HLA-E SCT、CD47、THBD、TFPI、CD39、A20、PD-L1、FasL、CD46、CD55、CD59或其任何組合。在一個實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已用基因轉殖表現載體進行了基因修飾，所述基因轉殖表現載體包含B2M、HLA-E SCT、CD47、THBD、TFPI、CD39、A20、PD-L1、FasL、CD46、CD55和CD59中的每一個。基因轉殖表現載體的一個實施例在圖17中描繪。在一個實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已被進一步基因修飾以具有GGTA、B4GalNT2、CMAH或其任何組合的降低的表現或無表現，例如通過基因KO來修飾。
在一個實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已用基因轉殖表現載體進行了基因修飾，所述基因轉殖表現載體包含B2M、HLA-E SCT、CD47、THBD、TFPI、CD39、A20、PD-L1、HO-1、CD46、CD55、CD59或其任何組合。在一個實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已用基因轉殖表現載體進行了基因修飾，所述基因轉殖表現載體包含B2M、HLA-E SCT、CD47、THBD、TFPI、CD39、A20、PD-L1、HO-1、CD46、CD55和CD59中的每一個。基因轉殖表現載體的一個實施例在圖18中描繪。在一個實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已被進一步基因修飾以具有GGTA、B4GalNT2、CMAH或其任何組合的降低的表現或無表現，例如通過基因KO來修飾。
在一個實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已用基因轉殖表現載體進行了基因修飾，所述基因轉殖表現載體包含B2M、HLA-E SCT、CD47、PD-L1、HO-1、THBD、TFPI、CD39、A20、CD46、CD55、CD59或其任何組合。在一個實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已用基因轉殖表現載體進行了基因修飾，所述基因轉殖表現載體包含B2M、HLA-E SCT、CD47、PD-L1、HO-1、THBD、TFPI、CD39、A20、CD46、CD55和CD59中的每一個。基因轉殖表現載體的一個實施例在圖19中描繪。在一個實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已被進一步基因修飾以具有GGTA、B4GalNT2、CMAH或其任何組合的降低的表現或無表現，例如通過基因KO來修飾。
在一個實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已用基因轉殖表現載體進行了基因修飾，所述基因轉殖表現載體包含CD46、CD55、CD59、A20、THBD、TFPI、CD39、HO-1、2xFKBP（FK506結合蛋白的融合物）、h半胱天冬酶8、PD-L1、B2M、HLA-E SCT、CD47或其任何組合。在一個實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已用基因轉殖表現載體進行了基因修飾，所述基因轉殖表現載體包含CD46、CD55、CD59、A20、THBD、TFPI、CD39、HO-1、2xFKBP、h半胱天冬酶8、PD-L1、B2M、HLA-E SCT和CD47中的每一個。基因轉殖表現載體的一個實施例在圖20中描繪。在一個實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已被進一步基因修飾以具有GGTA、B4GalNT2、CMAH或其任何組合的降低的表現或無表現，例如通過基因KO來修飾。
本公開文本的細胞、組織、器官或動物可以通過任何方法進行基因修飾。用於本文公開和描述的敲除（KO）、敲入（KI）和/或基因組替代策略的合適方法的非限制性例子包括使用Cas9、Cas12a（Cpf1）或其他CRISPR核酸內切酶、Argonaute核酸內切酶、轉錄啟動因子樣（TAL）效應子和核酸酶（TALEN）、鋅指核酸酶（ZFN）、表現載體、轉座子系統（例如PiggyBac轉座酶）或其任何組合的CRISPR介導的基因修飾。
本公開文本的細胞、組織、器官或動物可以進一步被修飾成不含PERV。本公開文本的細胞、組織、器官或動物可以被進一步修飾以使PERV拷貝從其基因組中功能性缺失。本公開文本的細胞、組織、器官或動物可以被進一步修飾以使PERV拷貝在其基因組中功能性失活。如果將豬細胞、組織或器官移植到人接受者中，則PERV表示危險因素。PERV從正常豬細胞中釋放出來並具有感染性。PERV-A和PERV-B是感染幾個物種細胞的多嗜性病毒，所述物種中包括人（例如，它們是異嗜性的）；而PERV-C是僅感染豬細胞的嗜親性病毒。功能性缺失PERV拷貝的非限制性方法披露且描述於Niu 2017和WIPO公開號WO2018/195402中，兩者均通過引用以其整體併入本文。在一些實施例中，將豬基因工程化為不含PERV-A、PERV-B或PERV-C（或其任何組合）。
在一些實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物的另外的基因已通過添加、缺失、失活、破壞、切除其部分而被修飾，或者所述基因序列的部分已被改變。在一些實施例中，所述經修飾基因包括缺失以下基因中的一個或多個：MHC-I基因SLA-1、SLA-2和SLA-3，MHC-II基因DQA和DRA，內源性vWF，CD9，脫唾液酸糖蛋白受體，和C3，以及表現以下基因轉殖中的一個或多個：PD-L1、外源性vWF、HLA-E、HLA-G、B2M和CIITA-DN。在一些實施例中，所述經修飾基因包括缺失以下基因中的一個或多個：α半乳糖基轉移酶1、β1,4 N-乙醯半乳糖胺基轉移酶和胞苷單磷酸-N-乙醯神經胺酸羥化酶，以及表現以下基因轉殖中的一個或多個：CD46、CD55、CD59、CD47、HO-1、A20、TNFR1-Ig、CD39、THBD、TFPI、EPCR、PD-1、CTLA-Ig、CD73、SOD3、CXCL12、FasL、CXCR3、CD39L1、GLP-1R、M3R、IL35、IL12A和EB13。在一些實施例中，所述經修飾基因是CD46、CD55、CD59、CD47、HO-1、A20、TNFR1-Ig、CD39、THBD、TFPI、EPCR、PD-1、CTLA-Ig、CD73、SOD3、CXCL12、FasL、CXCR3、CD39L1、GLP-1R、M3R、IL35、IL12A和EB13。
在一些實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已被基因修飾，使得一個或多個基因已通過添加、缺失、失活、破壞、切除其部分而被修飾，基因序列的部分已被改變，或者引入基因轉殖或其部分。在一些實施例中，本公開文本提供了具有一個或多個經修飾基因的經分離的細胞、組織、器官或動物。在一些實施例中，所述經修飾基因是MHC I類基因。在一些實施例中，所述經修飾的MHC I類基因包括以下SLA-1、SLA-2、SLA-3和B2M中的一個或多個。在一些實施例中，所述經修飾基因是SLA-1、SLA-2和/或SLA-3。在一些實施例中，所述經修飾基因是B2M。在一些實施例中，所述經修飾的MHC I類基因包括以下SLA-1、SLA-2、SLA-3和B2M中的一個或多個。在一些實施例中，將所述經修飾的B2M、SLA-1、SLA-2和/或SLA-3基因和/或其部分用人HLA-E基因、人HLA-G基因、人B2M基因和/或人（顯性陰性突變II類反式啟動因子）CIITA-DN基因和/或其部分替代。在一些實施例中，所述經修飾基因是條件性和/或誘導性修飾的。在一些實施例中，將條件性啟動子和/或誘導型啟動子用於條件性和/或誘導性修飾所述一個或多個經修飾基因。在一些實施例中，所述經分離的細胞、組織、器官或動物包括條件性改變B2M、SLA-1、SLA-2或SLA-3基因或其任何組合，以及用人HLA-E基因、人HLA-G基因、人B2M基因和/或人CIITA-DN基因的至少部分替代所述條件性改變的基因。
在一些實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已被基因修飾，使得一個或多個基因已通過添加、缺失、失活、破壞、切除其部分而被修飾，基因序列的部分已被改變，或者引入基因轉殖或其部分。在一些實施例中，本公開文本提供了具有一個或多個經修飾基因的經分離的細胞、組織、器官或動物。在一些實施例中，所述經修飾基因是MHC II類基因。在一些實施例中，所述經修飾的MHC II類基因是DRQ、DRA或其任何組合。在一些實施例中，DRQ和/或DRA通過添加、缺失、失活、破壞、切除其部分而被修飾，所述基因序列的部分已被改變。在一些實施例中，所述經修飾基因是條件性和/或誘導性修飾的。在一些實施例中，將條件性啟動子和/或誘導型啟動子用於條件性和/或誘導性修飾所述一個或多個經修飾基因。在一些實施例中，所述經分離的細胞、組織、器官或動物包括條件性改變DRQ和/或DRA基因或其任何組合。
在一些實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已被基因修飾，使得一個或多個基因已通過添加、缺失、失活、破壞、切除其部分而被修飾，基因序列的部分已被改變，或者引入基因轉殖或其部分。在一些實施例中，本公開文本提供了具有經修飾的vWF基因的經分離的細胞、組織、器官或動物。在一些實施例中，所述經修飾基因是vWF基因和vWF相關基因。在一些實施例中，將所述經修飾的vWF基因和/或其部分用人vWF基因和/或其部分替代。在一些實施例中，將所述經修飾的vWF基因、經修飾的vWF相關基因和/或其一個或多個部分用人vWF基因、一個或多個人vWF相關基因和/或其部分替代。在一些實施例中，所述經修飾的vWF基因和/或vWF相關基因是條件性和/或誘導性修飾的。在一些實施例中，將條件性啟動子和/或誘導型啟動子用於條件性和/或誘導性修飾所述一個或多個經修飾基因。在一些實施例中，所述經分離的細胞、組織、器官或動物包括條件性改變vWF、vWF相關基因、其一個或多個部分或其任何組合，以及用人vWF基因、人vWF基因的至少部分、一個或多個其他人vWF相關基因、一個或多個人vWF相關基因的至少部分或其任何組合替代所述條件性改變的基因。在一些實施例中，所述vWF基因使用gRNA進行修飾，所述gRNA設計用於在內源性豬基因組中啟動HDR替代，並在將被人序列替代的區域附近切割。合適的gRNA的非限制性例子是SEQ ID NO: 5-157中的任何一個或多個。
在一些實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已被基因修飾，使得一個或多個基因已通過添加、缺失、失活、破壞、切除其部分而被修飾，基因序列的部分已被改變，或者引入基因轉殖或其部分。在一些實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已通過將一個或多個外源性基因或其部分（如基因轉殖）引入所述細胞、組織、器官或動物中而被基因修飾。在一些實施例中，本公開文本提供了具有一個或多個經修飾基因的經分離的細胞、組織、器官或動物。在一些實施例中，所述經修飾基因是程式性死亡基因。在一些實施例中，所述經修飾基因是PD-L1。在一些實施例中，所述細胞、組織、器官或動物被修飾以表現外源性PD-L1基因或其部分，如基因轉殖。在一些實施例中，所述經修飾基因是條件性和/或誘導性修飾的。在一些實施例中，將條件性啟動子和/或誘導型啟動子用於條件性和/或誘導性修飾所述一個或多個經修飾基因。在一些實施例中，所述經分離的細胞、組織、器官或動物包括條件性改變PD-L1。在一些實施例中，所述PD-L1包含SEQ ID NO: 211中描述的序列或其任何變異體或部分。
在一些實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已被基因修飾，使得一個或多個基因已通過添加、缺失、失活、破壞、切除其部分而被修飾，基因序列的部分已被改變，或者引入基因轉殖或其部分。在一些實施例中，本公開文本提供了具有一個或多個經修飾基因的經分離的細胞、組織、器官或動物。在一些實施例中，所述經修飾基因是補體基因。在一些實施例中，所述經修飾基因是C3。在一些實施例中，C3通過添加、缺失、失活、破壞、切除其部分而被修飾，所述基因序列的部分已被改變。在一些實施例中，所述經修飾的C3基因和/或補體相關基因是條件性和/或誘導性修飾的。在一些實施例中，將條件性啟動子和/或誘導型啟動子用於條件性和/或誘導性修飾所述一個或多個經修飾基因。在一些實施例中，所述經分離的細胞、組織、器官或動物包括條件性改變C3、補體相關基因、其一個或多個部分或其任何組合。在一些實施例中，所述C3基因使用gRNA進行修飾。合適的gRNA的非限制性例子包括SEQ ID NO: 158-210中的任何一個或多個。
在一些實施例中，所述經修飾基因是C3的敲除。在一些實施例中，所述經修飾基因是PD-L1的敲入。在一些實施例中，所述經修飾基因是豬vWF的人源化vWF。在一些實施例中，所述經修飾基因是MHC-I基因SLA-1、SLA-2和SLA-3的條件性敲入。
在一些實施例中，宿主對經基因修飾的細胞、組織或器官沒有或基本上沒有引發免疫反應。
在一些實施例中，本公開文本提供了從本文所公開細胞中的任一種獲得的核酸。在一些實施例中，對所述細胞中的一種或多種核酸進行基因修飾，使得改變所述細胞中的一個或多個基因，或者另外修飾所述細胞的基因組。在一些實施例中，使用本領域已知和/或本文公開的任何基因修飾系統對所述基因或其部分進行基因修飾。在一些實施例中，所述基因修飾系統是TALEN、鋅指核酸酶和/或基於CRISPR的系統。在一些實施例中，所述基因修飾系統是CRISPR-Cas9系統。在一些實施例中，所述基因修飾系統是II類II型CRISPR系統。在一些實施例中，所述基因修飾系統是II類V型CRISPR系統。在一些實施例中，對所述細胞進行基因修飾，使得所述細胞中的一個或多個基因或其部分失活，並且進一步對所述細胞進行基因修飾，使得所述細胞的一個或多個基因或其部分（如果將所述細胞（或從所述細胞克隆/衍生的組織或器官）移植到人體，所述基因或其部分會誘導免疫反應）的表現降低。在一些實施例中，對所述細胞進行基因修飾以增加一個或多個人基因或其部分的表現。在一些實施例中，對所述細胞進行基因修飾以增加一個或多個人源化基因或其部分的表現。在一些實施例中，對所述細胞進行基因修飾，使得所述細胞中的一個或多個基因或其部分失活，並且進一步對所述細胞進行基因修飾，使得所述細胞的一個或多個基因（如果將所述細胞（或從所述細胞克隆/衍生的組織或器官）移植到人體，所述基因會抑制免疫反應）的表現增加。在一些實施例中，對所述細胞進行基因修飾，使得所述細胞中的一個或多個基因或其部分失活，並且進一步對所述細胞進行基因修飾，使得所述細胞的一個或多個基因（如果將所述細胞（或從所述細胞克隆/衍生的組織或器官）移植到人體，所述基因會誘導免疫反應）的表現降低，並且進一步對所述細胞進行基因修飾，使得所述細胞的一個或多個基因（如果將所述細胞（或從所述細胞克隆/衍生的組織或器官）移植到人體，所述基因會抑制免疫反應）的表現增加。
在一些實施例中，本公開文本提供了從經基因修飾的細胞克隆的胚胎。在一些實施例中，從經基因修飾的細胞中提取一種或多種經基因修飾的核酸並將其克隆到不同的細胞中。例如，在體細胞核移植中，將來自經基因修飾細胞的經基因修飾的核酸引入去核卵母細胞中。在一些實施例中，卵母細胞可以通過以下方式去核：在極體附近進行部分透明帶解剖，然後在解剖區處壓出細胞質。在一些實施例中，使用具有鋒利斜尖的注射移液管將經基因修飾的細胞注射至停滯在減數分裂2期的去核卵母細胞中。停滯在減數分裂2期的卵母細胞通常被稱為“卵”。在一些實施例中，通過融合和啟動卵母細胞產生胚胎。這樣的胚胎在本文中可以被稱為“經基因修飾的胚胎”。在一些實施例中，將所述經基因修飾的胚胎轉移到接受者雌性豬的輸卵管。在一些實施例中，在啟動後20至24小時，將所述經基因修飾的胚胎轉移到接受者雌性豬的輸卵管。參見例如，Cibelli 1998和美國專利號6,548,741。在一些實施例中，在轉移經基因修飾的胚胎後大約20-21天，檢查接受者雌性的妊娠。
在一些實施例中，使經基因修飾的胚胎生長成出生後基因修飾的動物。在一些實施例中，所述出生後基因修飾的動物是新生基因修飾的動物。在一些實施例中，所述經基因修飾的豬是幼年基因修飾的動物。在一些實施例中，所述經基因修飾的動物是成年基因修飾的動物（例如，大於5-6個月）。在一些實施例中，所述經基因修飾的動物是雌性基因修飾的動物。在一些實施例中，所述動物是雄性基因修飾的動物。在一些實施例中，將所述經基因修飾的動物用非基因修飾的動物繁殖。在一些實施例中，將所述經基因修飾的動物用另一種經基因修飾的動物繁殖。在一些實施例中，將所述經基因修飾的豬用具有減少的活性病毒或沒有活性病毒的另一種經基因修飾的動物繁殖。在一些實施例中，將所述經基因修飾的動物用第二種經基因修飾的動物繁殖，所述第二種經基因修飾的動物已進行基因修飾，使得來自所述第二種經基因修飾的動物的細胞、組織或器官如果移植到人體不太可能誘導免疫反應。
在一些實施例中，所述經基因修飾的動物是具有一個或多個經修飾基因的動物，並在妊娠後至少一個月、至少6個月、至少1年、至少5年、至少10年維持相同或相似的一種或多種經修飾基因的表現或失活水平。在一些實施例中，即使在從非病毒失活的代孕者分娩之後或在與其他非病毒失活的動物一起處於設施/空間中之後，所述經基因修飾的動物仍保持基因修飾，作為經基因修飾的豬具有一個或多個經修飾基因。
在一些實施例中，本公開文本提供了從本文所述的任何出生後基因修飾的豬獲得的細胞、組織或器官。在一些實施例中，所述細胞、組織或器官選自肝臟、腎臟、肺、心臟、胰腺、肌肉、血液和骨骼。在特定實施例中，所述器官是肝臟、腎臟、肺或心臟。在一些實施例中，來自所述出生後基因修飾的豬的細胞選自：胰島、肺上皮細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、肝臟細胞、非實質肝臟細胞、膽囊上皮細胞、膽囊內皮細胞、膽管上皮細胞、膽管內皮細胞、肝臟血管上皮細胞、肝血管內皮細胞、竇細胞、脈絡叢細胞、成纖維細胞、支援細胞、神經元細胞、幹細胞和腎上腺嗜鉻細胞。在一些實施例中，已將經基因修飾的器官、組織或細胞與它們的自然環境分離（即，與它們正在其中生長的豬分離）。在一些實施例中，與自然環境的分離意指與自然環境的總體物理分離，例如，從經基因修飾的供體動物中移出，以及改變經基因修飾的器官、組織或細胞與它們直接接觸的鄰近細胞的關係（例如，通過解離）。
III. 產生細胞、組織、器官或動物的方法
本公開文本提供了產生具有本文公開的一個或多個經修飾基因的任何細胞、組織、器官或動物的方法。在一些實施例中，本公開文本提供了在本文公開的任何細胞中滅活、缺失或以其他方式破壞一個或多個基因或其部分的方法，所述方法包括向所述細胞投予對基因具有特異性的基因編輯劑，其中所述試劑破壞所述基因的轉錄和/或翻譯。在一些實施例中，所述試劑靶向所述基因的起始密碼子並抑制所述基因的轉錄。在一些實施例中，所述試劑靶向所述基因中的外顯子，並且所述試劑誘導所述基因中的移碼突變。在一些實施例中，所述試劑將失活突變引入所述基因中。在一些實施例中，所述試劑抑制所述基因的轉錄。
在一些實施例中，本公開文本提供了在體內改變一個或多個基因或其部分的方法，所述方法包括向所述細胞投予對基因具有特異性的基因編輯劑，其中所述試劑改變所述基因的序列，如通過使所述基因人源化或以其他方式改變所述基因的天然（例如野生型）序列。
在一些實施例中，本公開文本提供了表現一個或多個基因或其部分，如基因轉殖（例如，非天然基因）的方法，所述方法包括向所述細胞投予對所述基因轉殖基因具有特異性的基因編輯劑，其中所述試劑引入所述基因轉殖的序列。在一些實施例中，所述試劑是核酸序列，如質體、載體等。在一些實施例中，所述核酸序列包括一個或多個核酸序列，如啟動子、基因轉殖和/或另外的基因。在一些實施例中，所述核酸序列或其部分衍生自一個或多個物種和/或一個或多個來源。在一些實施例中，所述物種是將接收經基因修飾的細胞、組織或器官的物種。在一些實施例中，所述物種是人。在其他實施例中，所述物種是非人的，如哺乳動物、動物、細菌和/或病毒。
在一些實施例中，本文公開的任何試劑是多核苷酸。在一些實施例中，所述多核苷酸編碼本文所述的核酸酶和/或切口酶和/或RNA或DNA分子中的一種或多種。在一些實施例中，將所述多核苷酸試劑引入一個或多個細胞中。在一些實施例中，以使得一個或多個細胞暫態表現所述多核苷酸的方式將所述多核苷酸引入所述一個或多個細胞中。在一些實施例中，以使得一個或多個細胞穩定表現所述多核苷酸的方式將所述多核苷酸引入所述一個或多個細胞中。在一些實施例中，以使得所述多核苷酸穩定地併入細胞基因組中的方式引入所述多核苷酸。在一些實施例中，將所述多核苷酸與一個或多個可轉座元件一起引入。在一些實施例中，所述可轉座元件是編碼轉座酶的多核苷酸序列。在一些實施例中，所述可轉座元件是編碼PiggyBac轉座酶的多核苷酸序列。在一些實施例中，所述可轉座元件是可誘導的。在一些實施例中，所述可轉座元件是多西環素誘導的。在一些實施例中，所述多核苷酸進一步包含可選標記。在一些實施例中，所述可選標記是嘌呤黴素抗性標記。在一些實施例中，所述可選標記是螢光蛋白（例如，GFP）。
在一些實施例中，所述試劑是用於靶向細胞中的DNA的核酸酶或切口酶。在一些實施例中，所述試劑特異性地靶向基因並抑制其表現。在一些實施例中，所述試劑包含轉錄阻遏物結構域。在一些實施例中，所述轉錄阻遏物結構域是Krüppel相關盒（KRAB）。
在一些實施例中，所述試劑是任何可程式設計核酸酶。在一些實施例中，所述試劑是天然歸巢大範圍核酸酶。在一些實施例中，所述試劑是基於TALEN的試劑、基於ZFN的試劑或基於CRISPR的試劑，或其任何生物活性片段、融合物、衍生物或組合。基於CRISPR的試劑包括例如，II類II型和V型系統，包括例如Cas9和Cpf1的各種物種變異體。在一些實施例中，所述試劑是脫胺酶或編碼脫胺酶的核酸。在一些實施例中，將細胞基因工程化以穩定和/或暫態表現基於TALEN的試劑、基於ZFN的試劑和/或基於CRISPR的試劑。
IV. 治療方法
在一些實施例中，本文公開的任何經基因修飾的細胞、組織或器官可以用於治療與經基因修飾的細胞不同物種的受試者。在一些實施例中，本公開文本提供了將本文所述的任何經基因修飾的細胞、組織或器官移植到有需要的受試者中的方法。在一些實施例中，所述受試者是人。在一些實施例中，所述受試者是非人靈長類動物。
在一些實施例中，用於本文公開的任何方法的經基因修飾的器官可以選自經基因修飾的豬的心臟、肺、肝臟、眼睛、垂體、甲狀腺、甲狀旁腺、食道、胸腺、腎上腺、闌尾、膀胱、膽囊、小腸、大腸、小腸、腎臟、胰腺、脾、胃、皮膚和/或前列腺。在一些實施例中，用於本文公開的任何方法的經基因修飾的組織可以選自經基因修飾的豬的軟骨（例如，食道軟骨、膝蓋軟骨、耳軟骨、鼻子軟骨）、肌肉（如但不限於平滑肌和心臟（例如心臟瓣膜））、腱、韌帶、骨（例如，骨髓）、角膜、中耳和靜脈。在一些實施例中，用於本文公開的任何方法的經基因修飾的細胞包括血細胞、皮膚毛囊、毛囊和/或幹細胞。還可以向器官或組織的任何部分（例如，眼睛的部分，如角膜）投予本公開文本的組合物。
在一些實施例中，從豬分離心臟、肺、肝臟、腎臟、胰腺或脾，所述豬已被基因修飾以包含 (a) GGTA1、CMAH和B4GALNT2的缺失或破壞；(b) 從豬基因組中單個多基因轉殖盒表現的CD46、CD55、CD59、CD39、CD47、A20、PD-L1、HLA-E、B2M、THBD、TFPI和HO基因轉殖（例如其人或人源化拷貝）的添加；和 (c) 所有PERV拷貝的功能性缺失。在一些實施例中，從豬分離心臟、肺、肝臟、腎臟、胰腺或脾，所述豬已被基因修飾以包含 (a) GGTA1、CMAH和B4GALNT2的功能性破壞；(b) 從豬基因組中單個多基因轉殖盒表現的CD46、CD55、CD59、CD39、CD47、A20、PD-L1、HLA-E、B2M、THBD、TFPI和HO基因轉殖（例如其人源化拷貝）的添加；和 (c) 所有PERV拷貝的功能性失活。在某些實施例中，所述豬已被進一步基因修飾以具有人源化vWF、ASGR1的缺失和/或B2M基因的缺失。
在一些實施例中，一旦異種移植到人或非人靈長類動物中，異種移植的器官（例如，心臟、肺、肝臟、腎臟、胰腺、脾）表現出持續的功能，持續超過約300天、超過約1年、超過約1.5年、超過約2年、超過約2.5年、超過約3年、超過約3.5年、超過約4年、超過約4.5年、超過約5年、超過約5.5年、超過約6年、超過約6.5年、超過約7年、超過約7.5年、超過約8年、超過約8.5年、超過約9年、超過約9.5年或超過約10年。
在一些實施例中，本公開文本提供了對患有導致器官、組織或細胞功能受損、不足或缺乏的疾病、障礙或損傷的受試者的治療。在一些實施例中，所述受試者遭受了導致損害受試者的一個或多個細胞、組織或器官的損傷或創傷（例如，車禍）。在一些實施例中，所述受試者遭受了火或酸灼傷。在一些實施例中，所述受試者患有導致器官、組織或細胞功能受損、不足或缺乏的疾病或障礙。在一些實施例中，所述受試者患有自體免疫性疾病。在一些實施例中，所述疾病選自：心臟病（例如，動脈粥樣硬化）、擴張型心肌病、嚴重的冠狀動脈疾病、瘢痕心臟組織、心臟的先天缺陷、I型或II型糖尿病、肝炎、囊性纖維化、肝硬化、腎臟衰竭、狼瘡、硬皮病、IgA腎臟病、多囊性腎臟病、心肌梗塞、肺氣腫、慢性支氣管炎、閉塞性細支氣管炎、肺動脈高壓、先天性膈疝、先天性表面活性蛋白B缺乏症和先天性囊性肺氣腫性肺病、原發性膽汁性膽管炎、硬化性膽管炎、膽道閉鎖、酒精中毒、威爾遜病、血色沉著病和/或α-1抗胰蛋白酶缺乏症。
在一些實施例中，將本公開文本的任何經基因修飾的細胞、組織和/或器官與經基因修飾的供體分離並投予非供體受試者宿主。在本文中使用的“投予（Administering）”或“投予（administration）”包括但不限於引入、施加、注射、植入、移植（grafting）、縫合和移植（transplanting）。根據本公開文本，可以通過導致本公開文本的器官、組織、細胞或組合物定位在所希望位點處的方法或途徑來投予所述經基因修飾的細胞、組織和/或器官。可以通過任何合適的途徑將本公開文本的器官、組織、細胞或組合物投予受試者，所述合適的途徑導致將細胞遞送至受試者中的所希望位置，其中所述細胞的至少一部分保持活力。在一些實施例中，所述細胞的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%（無論是單獨還是作為組織或器官的部分投予）在投予受試者後保持活力。投予本公開文本的器官、組織、細胞或組合物的方法是本領域熟知的。在一些實施例中，將所述細胞、組織和/或器官移植到宿主中。在一些實施例中，將所述細胞、組織和/或器官注射至宿主中。在一些實施例中，將所述細胞、組織和/或器官移植到宿主表面（例如，骨骼或皮膚）上。
在一些實施例中，將已被基因修飾以含有以下的心臟、肺、肝臟、腎臟、胰腺或脾移植到宿主中：GGTA1、CMAH和B4GALNT2的缺失或破壞；來自豬基因組中單個多基因轉殖盒的CD46、CD55、CD39、CD47、HLA-E、THBD和TFPI以及任選CD59、B2M、A20、PD-L1和HO-1中的一個或多個的表現；以及所有PERV拷貝的缺失。在一些實施例中，將已被基因修飾以含有以下的心臟、肺、肝臟、腎臟、胰腺或脾移植到宿主中：GGTA1、CMAH和B4GALNT2的缺失；來自豬基因組中單個多基因轉殖盒的CD46、CD55、CD39、CD47、HLA-E、THBD和TFPI以及任選CD59、B2M、A20、PD-L1和HO-1中的一個或多個的表現；以及所有PERV拷貝的功能性失活。在一些實施例中，移植的心臟、肺、肝臟、腎臟、胰腺、脾或其部分存活並起作用持續約1天、約1周、約2周、約3周、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約9個月、約1年、約2年、約3年、約4年、約5年、約6年、約7年、約8年、約9年、約10年或更久的時間段。
在一些實施例中，將有必要保護經基因修飾的一種或多種細胞、一種或多種組織或一種或多種器官免受被投予所述經基因修飾的一種或多種細胞、一種或多種組織或一種或多種器官的宿主的免疫系統的影響。例如，在一些實施例中，將經基因修飾的一種或多種細胞、一種或多種組織或一種或多種器官與基質或包衣（例如，明膠）一起投予，以保護所述經基因修飾的一種或多種細胞、一種或多種組織或一種或多種器官免受來自宿主的免疫反應的影響。在一些實施例中，所述基質或包衣是可生物降解的基質或包衣。在一些實施例中，所述基質或包衣是天然的。在其他實施例中，所述基質或包衣是合成的。
在一些實施例中，將所述經基因修飾的一種或多種細胞、一種或多種組織或一種或多種器官與免疫抑制化合物一起投予。在一些實施例中，所述免疫抑制化合物是小分子、肽、抗體和/或核酸（例如，反義或siRNA分子）。在一些實施例中，所述免疫抑制化合物是小分子。在一些實施例中，所述小分子是類固醇、mTOR抑制劑、鈣神經素抑制劑、抗增殖劑或IMDH抑制劑。在一些實施例中，所述小分子選自皮質類固醇（例如，強的松、布地奈德、潑尼松龍）、鈣神經素抑制劑（例如，環孢黴素、他克莫司）、mTOR抑制劑（例如，西羅莫司、依維莫司）、IMDH抑制劑（硫唑嘌呤、來氟米特、黴酚酸酯）、抗生素（例如，放線菌素D、蒽環類、絲裂黴素C、博萊黴素、光神黴素）和甲胺蝶呤，或其鹽或衍生物。在一些實施例中，所述免疫抑制化合物是選自以下的多肽：CTLA4、抗b7抗體、阿巴西普、阿達木單抗、阿那白滯素、賽妥珠單抗、依那西普、戈利木單抗、英夫利昔單抗、艾塞吉珠單抗、那他珠單抗、利妥昔單抗、蘇金單抗、托珠單抗、優特克單抗、維多利珠單抗、巴厘昔單抗、達克珠單抗和莫羅單抗。
在一些實施例中，待投予受試者的所述經基因修飾的一種或多種細胞、一種或多種組織或一種或多種器官已被進一步基因修飾，使得它們不太可能在受試者中誘導免疫反應。在一些實施例中，所述經基因修飾的一種或多種細胞、一種或多種組織或一種或多種器官已被進一步基因修飾，使得它們不表現功能性免疫刺激分子。
提供以下實例以舉例說明本公開文本，並且僅出於說明目的，並且不應將其解釋為限制本公開文本的範圍。
實例
現已總體上描述本公開文本，其參考以下實例將更容易地被理解，所述實例僅出於說明本公開文本的某些方面和實施例的目的被包括，並且不意圖限制本公開文本。例如，本文公開的特定構建體和實驗設計表示用於驗證適當功能的示例性工具和方法。因此，將容易清楚的是，可以在本公開文本的範圍內取代任何所公開的特定構建體和實驗計畫。
實例1：敲除豬補體組分3（C3）以抑制補體系統
選擇C3的高度保守的區域，並設計了兩個靶向C3結構域的sgRNA。這兩個gRNA序列的序列是TCTCCAGACGCAGGACGTTG（SEQ ID NO: 158）和GGAGGCCCACGAAGGGCAAG（SEQ ID NO: 159）。使用氖轉染機和試劑，將C3 sgRNA與GGTA sgRNA（GAGAAAATAATGAATGTCAA（SEQ ID NO: 210））質體和cas9質體一起暫態轉染到豬胎兒成纖維細胞中。使用GGTA抗體反選擇方法選擇缺乏C3的細胞（“C3-KO”）以共富集C3-KO細胞，然後對其進行單細胞分選和基因分型以確定使用深度測序敲低C3靶標的效率。
在篩選的156個克隆中，108個克隆是雙等位基因C3-KO。雙等位基因C3-KO細胞的敲低效率為69%。所得的C3-KO細胞株已被用於利用體細胞核移植方法產生豬。C3-KO豬存活63天，並且死於肝臟和肺感染。如圖1A-圖1C所示，C3-KO豬是100% NHEJ敲除的。圖1A示出了引入C3中的缺失的大小，圖1B示出了插入缺失的位置，並且圖1C示出了在C3-KO豬中產生的插入缺失的序列。
預計上述C3-KO豬將不產生任何功能性C3蛋白。由於缺少功能性C3蛋白，因此將無法啟動C3-KO豬的補體系統，從而降低C3-KO豬的先天免疫系統。此外，與野生型豬相比，預計C3-KO豬可能更容易受到細菌和/或病毒感染。此外，預計將C3-KO豬的細胞、組織和/或器官異種移植到人體內不會啟動人補體系統。因此，這應使人對C3-KO豬異種移植物的天然免疫反應最小化。
實例2：具有一個或多個經修飾的MHC I類基因的豬
將豬的MHC主要I類等位基因條件性地替代為人MHC次要I類等位基因（“MHC-I豬”）。為此，豬的基因組中含有SLA-1、SLA-2和SLA-3基因的區域被替代為人次要等位基因HLA-E的經修飾形式。
圖2描繪了MHC I類替代策略的方案：使含有SLA-1、SLA-2和SLA-3基因的基因座側接有loxP位點。在用Cre處理後，將SLA-1、SLA-2和SLA-3切除，並替代為人HLA-E，如HLA-E、HLA-G、B2M和CIITA-DN基因的各種組合。MHC-I豬是活的，並且免疫功能嚴重受損。因此，在收穫細胞、組織和/或器官之前，使用了條件性敲除，並且用人HLA-E和其他人基因替代了SLA-1、SLA-2和SLA-3基因，而不是以通用方式用人基因替代SLA-1、SLA-2和SLA-3基因。
使用長讀段技術對豬的MHC I區域進行測序。設計了捕獲SLA-1、SLA-2和SLA-3基因的探針，並將其用於捕獲MHC-I基因區域。將PacBio測序和10X測序用於準確地確定MHC-I基因區域。SLA-1、SLA-2和SLA-3的構造在圖9中示出。設計了兩個具有側接MHC-I區的loxP位點的盒。盒1含有啟動子、loxP位點和選擇劑（即，嘌呤黴素）。盒2含有第二標記（GFP）、loxP位點和無啟動子的基因（包括HLA-E、B2M和CIITA-DN）盒。
使用Golden Gate組裝策略（New England BioLabs）從單個組分合成盒1和盒2，並用對應於插入位點的800bp同源序列側接。使用連續兩輪的CRISPR-cas9來插入兩個位點17
。使用嘌呤黴素選擇和GFP FACS分選來分離克隆，並使用連接PCR來驗證插入。
用Cre重組酶轉染細胞，並誘導Cre重組酶的表現。進行單細胞分選，並使用連接PCR篩選經分選的細胞，以分離具有用人MHC-1雙等位基因替代SLA-1、SLA-2和SLA-3的細胞。
對於體內Cre切除，已設計了可替代的盒1，其包括在組織特異性啟動子或誘導型啟動子控制下的Cre重組酶。通過使用組織特異性啟動子或誘導型啟動子，將在目的細胞、組織和/或器官中切除SLA-1、SLA-2和SLA-3基因，或者可以在收穫細胞、組織和/或器官之前在動物中誘導切除。可以通過體細胞核移植（SCNT）產生SLA-1、SLA-2和SLA-3被人MHC-I替代的豬，並且可以產生編碼條件性和/或組織特異性條件性替代的基因的仔豬。
實例3：MHC II類失活
通過以下方式產生缺乏MHC-IIα鏈表現的豬（“MHC-II KO豬”）：在豬細胞中使用已建立的gRNA技術切除DQA基因並使DRA基因失活，然後將所述豬細胞經由SCNT轉移到宿主豬中。簡而言之，在gRNA轉移到豬細胞中之後，對基因組進行了測序，並鑒定MHC-II基因座處的變異。將Cas9遞送至這些細胞，然後對所述細胞進行分選以分離單細胞。對這些單細胞進行測序以對靶向的DQA和DRA基因進行基因分型。在具有DQA和DRA失活的單細胞中，在SCNT之後產生胚胎，隨後將其植入豬中以產生MHC-II KO豬。在出生後四周，MHC-II KO豬保持健康。
圖3A和圖3B基於DQA基因示出了MHC-II KO的基因型。通過DQA基因的基於外顯子靶向的擴增和測序以及DRA基因測序對MHC-II KO豬進行基因分型。如左圖所示，插入缺失的大小和位置位於DRA基因中。如右圖所示，DRA基因的失活是由於在DRA擴增子的位置126和127各自的兩個單核苷酸插入造成的。
圖4A和圖4B示出了MHC-II KO豬的另一種基因型。使用DRA基因的基於外顯子靶向的擴增和測序確定DRA基因型。來自DRA的外顯子靶向區已被擴增和測序。如左圖所示，插入缺失的大小和位置位於DRA基因中。如右圖所示，DRA基因的失活是由於在DRA擴增子的位置106和107各自的兩個單核苷酸插入造成的。
與缺乏MHC-II表現的人相似，MHC-II KO豬的CD4+
T細胞群體減少，然而，CD8+
T細胞群體保持完整（圖5）。此外，除其他問題外，MHC-II KO豬受到免疫抑制，具有增強的自體免疫力和淋巴樣缺陷。已知這些表型與MHC-II KO表型相關，並且已在缺乏MHC-II表現的小鼠中觀察到。這些相似性證實了MHC-II KO豬是有效的MHC-II KO，而不是活性基因修飾（圖6）。
實例4：減少基於適應性免疫的排斥反應的PD-L1敲入
將人PD-L1基因（例如，PD-L1基因轉殖）遞送至豬基因組。參見圖7中的結構示意圖。使用兩個不同的PD-L1擴增子通過qPCR確認了人PD-L1基因轉殖的表現（圖8）。
在異種移植後，表現PD-L1的豬組織可能具有減少的宿主（如人）的排斥反應。
實例5：豬血管性血友病因子的基因修飾以調節血小板聚集
設計並構建了含有來自pvWF的同源臂、A1結構域和來自hvWF的側翼區域中的某些殘基的HDR載體。（圖10）。還設計以下兩種sgRNA，以啟動內源性豬基因組中的HDR替代，並在待被人序列替代的區域附近切割：TCTCACCTGTGAAGCCTGCG（SEQ ID NO: 5）和CACAGTGACTTGGGCCACTA（SEQ ID NO: 6）。
HDR載體由來自豬vWF的約1kb同源臂和人A1和側翼結構域以及sgRNA切割位點中的失活突變構成，以防止sgRNA切割供體和經修飾的豬基因組。HDR載體還在sgRNA切割位點附近含有SphI和BspEI位點，所述SphI和BspEI位點可以將HDR載體與內源性豬基因組區分開。
使用Neon轉染系統（Invitrogen）用8µg Cas9、1µg sgRNA1和1µg sgRNA2以及10µg HDR載體轉染豬原代成纖維細胞。在轉染後兩天，使用FACS對細胞進行單細胞亞克隆。將單細胞再培養12天，直到游離形式的HDR載體在細胞分裂過程中消失。使用側翼引子擴增hvWF的A1和側翼區域。對PCR產物進行SphI和BspEI順序消化，以篩選具有HDR替代的克隆，所述HDR替代將在順序消化後向具有700bp、323bp和258bp大小的片段的PCR產物添加新穎的SphI和BspEI位點（圖11）。完整的雙等位基因HDR消除了1281bp的野生型產物以及大於700bp的任何部分消化產物。
從約150個單細胞集落分離出具有雙等位基因HDR的細胞（圖11）。如通過測序證實的，豬A1結構域和側翼區域的等位基因均被人對應物替代（圖12A和圖12B）。A1結構域突出顯示，而側翼區域中的潛在糖基化位點則用劃線標記。在pvWF中缺失的人特有殘基用條形標記，並且人源化A1結構域和側翼區域用半括弧標記。這種經分離的細胞已擴增成細胞株，並且可以用於通過SCNT產生經基因修飾的豬。
表現A1人源化pvWF的細胞在血小板啟動測定期間具有顯著降低的針對人血小板的聚集反應（圖13）。簡而言之，將細胞與人血小板一起孵育，並通過剪切應力誘導聚集。表現A1人源化pvWF的細胞顯示出較溫和且可誘導的聚集曲線，而表現野生型pvWF的細胞對人血小板的聚集反應更強。因此，與表現pvWF的豬器官相比，具有A1 hvWF的豬器官可能在人血中誘導更溫和的凝血反應，並且可能改善在豬到人異種移植中觀察到的血管不相容性。
這些資料一起表明，用來自人對應物（hvWF）的對應殘基替代內源性豬pvWF的A1結構域和一個或多個側翼結構域中的某些殘基，可以調節異種移植過程中發生的血小板聚集反應（圖9）。
實例6：豬經典MHCI抗原的基因組缺失以防止CD8+ T細胞啟動
MHC I類分子通過其到CD8+ T細胞的肽呈遞，在同種異體移植的排斥反應中起著至關重要的作用。在這裡，測試了在豬原代成纖維細胞中整個約200kb經典MHC I類基因座的缺失是否阻止異種移植中CD8+ T細胞介導的毒性。
經典MHC I類基因編碼在細胞表面廣泛表現的高多態性蛋白質。它們將外源肽呈遞至CD8+ T淋巴細胞，從而導致靶細胞裂解。另外，錯配的MHCI分子在移植中也充當抗原。已探索了在用於異種移植的供體豬器官中去除經典MHCI分子的不同策略。在一次嘗試中，Tector組使用Cas9和3個sgRNA敲除了SLA-1、SLA-2和SLA-3分子的保守外顯子4（Reyes 2014）。然而，此外顯子也被其他經典和非經典MHCI分子共用，並且其可能產生無法預測的脫靶效應。另外，其餘外顯子1-3仍可以作為細胞表面抗原存在。在另一次嘗試中，使用TALEN敲除了異二聚體伴侶B2M（Wang 2016）。此方法也可能影響非經典MHCI分子，並且其餘MHCI仍可能在細胞表面上呈現解構的蛋白質。在異種移植的情況下，通常在MHCI缺陷細胞中補充人HLA-E/B2M分子，以防止NK細胞介導的毒性。人B2M可能與豬SLA二聚化並恢復其在B2M敲除豬中的抗原性。
對於此實例，為了特異性和完全去除經典MHCI抗原，首先鑒定豬基因組中具有獨特側翼序列的MHC經典I類簇（圖14）。這種約200kb的簇含有所有8個經典MHCI基因，而沒有任何其他蛋白質編碼基因。然後，鑒定出獨特的側翼區域中的sgRNA（SEQ ID NO 1-4）以誘導這種整個基因簇的片段缺失。由於約200kb片段缺失的頻率相對較低，因此還設計了富集策略來分離雙等位基因缺失克隆。
使用Neon轉染系統（Invitrogen）用1.25 μg TrueCut Cas9蛋白和7.5nmol crRNA/tracrRNA雙鏈體（Invitrogen）轉染豬原代成纖維細胞。在轉染後三天，從經轉染的細胞收穫基因組DNA，並使用圖15A所示的指定引子對進行PCR。使用側接預計缺失連接的引子檢測片段缺失。使用基於拓撲異構酶的克隆（“TOPO克隆”）亞克隆此PCR產物，並對單獨TOPO克隆進行Sanger測序，以確認缺失連接的序列。將所述序列與圖15B中所示的預計連接進行比對。同時，用豬特異性SLA-1抗體將細胞的等分試樣染色。MHCI陰性細胞的部分在圖16中示出。
在單細胞亞克隆後，含有雙等位基因缺失的細胞可以用於經由體細胞核移植產生經典MHCI敲除豬。預期所述豬完全缺乏所有經典MHCI分子，並且富含可能涉及能育性和其他生理功能的非經典MHCI分子。其餘B2M分子不可能具有抗原性，因為它們是非多態的，並且對人對應物來說是高度保守的。另外，人HLA-E/B2M的外源性表現不能挽救經典MHCI分子的缺乏。與先前的報告相比，所得的豬應具有最乾淨的經典MHCI敲除背景。
實例7：免疫學上相容的豬細胞、組織、器官、豬和後代的產生
儘管其他人進行了許多嘗試來產生用於安全異種移植的基因轉殖豬，但由於構建體的相容性和基因轉殖之間的轉錄干擾，迄今為止，用於異種移植的最先進的基因轉殖豬攜帶的基因轉殖數量也是有限的。在這裡，將KO、KI和基因組替代的組合用於產生供體豬的幾次疊代運算。圖21概述了供體豬世代通過順序基因編輯的進程。如下所述，在豬2.0（3KO+12TG）的情況下，這些基因編輯包括三個敲除和12個基因轉殖敲入，它們被設計用於解決免疫、凝血和物種不相容性。
將CRISPR-Cas9介導的NHEJ用於功能性敲除三個主要的產生碳水化合物的糖基轉移酶/糖基水解酶基因GGTA1、CMAH和B4GALNT2。結合野生型豬組織的預先形成的抗體是異種移植的主要初始免疫學障礙，並且這三個基因已被鑒定為主要負責產生由這些抗體靶向的異種抗原（Byrne 2014, Lai 2002, Lutz 2013, Martens 2017, Tseng 2006）。因此，預測這些基因的功能喪失將在很大程度上消除預先形成的抗豬抗體與豬移植物內皮的結合。這通過流式細胞術結果得到確認，所述結果表明宿主抗體與靶豬2.0（3KO+12TG）成纖維細胞的結合降低（圖22）。為了表明抗體結合減少，將基因工程豬成纖維細胞與合併的人血清孵育，並用綴合的第二抗人抗體檢測結合的人IgM和IgG，並通過流式細胞術進行分析。與野生型豬成纖維細胞（紅色等高線圖）形成對比，這三個基因的消除導致抗體結合顯著減少（綠色和棕色等高線圖，降低約98%）。
經由PiggyBAC轉座子介導的隨機整合將十二個人基因轉殖（CD46、CD55、CD59、CD39、CD47、A20、PD-L1、HLA-E、B2M、THBD、TFPI、HO-1）整合到豬基因組中的單個多基因轉殖盒中，以產生豬2.0（3KO+12TG）的第一次疊代運算（參見圖17-圖20、圖31、圖47-圖49；SEQ ID NO: 212-214）。將基因轉殖佈置到具有所希望的泛在或組織特異性啟動子的4個不同的順反子中。將每個順反子內的基因轉殖用核糖體跳躍2A肽分開，以確保以相似的莫耳比表現。此外，引入了順式元件（如泛染色質開放元件（UCOE））的組合，以防止基因轉殖沉默；並引入具有強聚腺苷酸化位點和終止子的隔離子，以最小化基因轉殖之間以及基因轉殖與側翼染色體之間的相互作用。
使用qPCR確定基因轉殖表現水準和組織特異性啟動子驅動表現（圖23），並使用基於反向PCR的連接捕獲確定整合位點和拷貝數。作為原理驗證，相鄰順反子中的所有基因轉殖在成纖維細胞和內皮細胞株中均展示出所希望的組織特異性，而沒有可檢測的轉錄干擾。此外，所有基因轉殖在具有不同基因組整合位置的克隆之間均顯示出高度一致的表現水準，這表明基因轉殖表現與染色體背景無關。如所預計的，在泛在啟動子控制下插入的六個基因（包括補體調節基因（CD46、CD55和CD59；EF1α啟動子）以及B2M、HLA-E和CD47（CAG啟動子））在成纖維細胞和內皮細胞兩者中表現。相比之下，在組織特異性啟動子（NeuroD或ICAM2）調節下表現的六個基因（A20、PD-L1、HO1、THBD、TFPI和CD39）展示出相對于在內皮細胞中的表現較低的在成纖維細胞中的表現水準。與qPCR資料一致，觀察到蛋白質的細胞表面表現由豬脾細胞以及豬成纖維細胞中插入的人基因轉殖表現（圖24）。簡而言之，分離出豬2.0（3KO+12TG）脾細胞或成纖維細胞，並與識別所示特定人蛋白的抗體一起孵育，並使用流式細胞術分析經染色的細胞。在圖24的每個圖中，左側的峰表示用同種型對照染色的細胞，並且右側的峰表示用特異性抗體染色的細胞。
對於臨床前實驗，使用PiggyBac轉座酶將基因轉殖敲入隨機整合到基因組中，並將具有單拷貝整合到基因間區域且無可預測後果的克隆用於豬生產。對於臨床開發，在擴大育種和生產源供體豬之前，將通過雙等位基因位點特異性基因轉殖整合到安全港（例如，AAVS1基因組基因座）中產生純合的雌性/雄性豬。
先天性和適應性免疫細胞功能以及補體和凝血級聯的另外的體外評估將包括抗體反應性譜分析、混合淋巴細胞反應、補體依賴性細胞毒性、NK細胞毒性、巨噬細胞吞噬作用以及對凝血因子和血小板聚集的影響。
為了維持豬移植物功能並保護供體器官免受補體介導的毒性影響，人補體調節蛋白被過表現。簡而言之，將基因工程豬成纖維細胞和豬脾細胞與25%人補體孵育一小時。用碘化丙啶染色細胞，並通過流式細胞術分析以定量細胞死亡。在用人補體培養後，野生型成纖維細胞和脾細胞展示出最高的細胞死亡百分比。4-7P和4-7H細胞源自豬2.0（3KO+12TG）仔豬；4-7F細胞（3KO +12 TG）源自豬2.0（3KO+12TG）胎兒。3-9是三重碳水化合物抗原產生酶KO、HLA-DQA KO、HLA-DRA KO和人補體調節因子C3 KO。如圖25所示，與對照人成纖維細胞相比，經基因工程化以表現人CD46、CD55和CD59的豬成纖維細胞和脾細胞表現出明顯更低水準的補體介導的細胞死亡。
靶細胞上的MHC I與天然殺傷（NK）細胞上的殺傷抑制受體（KIR）連接抑制NK細胞介導的靶細胞殺傷。豬MHC I無法通過人NK KIR傳遞信號，並且因此，豬細胞對NK細胞的靶向細胞殺傷敏感。為了克服NK介導的細胞死亡，使連接人NK KIR受體的人HLA-E在豬細胞中過表現。百分之七十的WT豬成纖維細胞和K562細胞（人MHC缺陷型細胞株）被NK細胞的殺傷所靶向。如圖26所示，人HLA-E+工程豬成纖維細胞展示出明顯降低的NK介導的細胞殺傷。相比之下，HLA-E+豬成纖維細胞展示出明顯降低的NK細胞殺傷，這表明HLA-E的表現保護了這些細胞免於裂解。
人CD55在豬細胞中的過表現降低了補體介導的毒性，這可能會減少凝血並提高異種移植物存活。凝血的啟動最終導致凝血酶的形成，其通過在穩定的凝血酶-抗凝血酶（TAT）複合物中結合抗凝血酶而失活。簡而言之，用人血培養野生型、CD55 KI + GGTA1缺陷型細胞和人內皮細胞。如圖27所示，單獨的人血或與人內皮細胞一起孵育60 min的人血產生了大約10 ng/mL TAT蛋白。此外，人血與野生型豬內皮細胞的共培養啟動了凝血，並使TAT複合物形成增加至58 ng/mL。相比之下，與CD55 KI + GGTA缺陷型豬內皮細胞共培養導致TAT複合物形成的顯著減少。這些資料表明人CD55表現能夠調節凝血啟動。
對從用有效載荷9或有效載荷10進行基因修飾的豬分離的樣品進行RNAseq。結果顯示幾種有效載荷免疫修飾基因轉殖，即補體基因轉殖，以及細胞毒性基因（B2M、HLA-E、CD47）的表現增加（圖36）。
實例8：異種移植中的抗體和酶切割防止功能性結合的潛力
抗體介導的排斥反應在歷史上一直是開發異種移植作為終末期器官衰竭的可行治療的主要阻礙。然而，近來的遺傳學進步已允許開發多基因敲除豬，這些豬缺乏已建立的異種抗原靶標。敲除aGal、Neu5Gc和SDa與提高移植物存活有關。然而，需要進一步的工作來充分瞭解殘留抗體與其他異種抗原靶標結合的影響，以及這些抗原的去除是否能保護組織免受高度敏化的人血清的侵害。在這裡，研究了異種抗原敲除是否降低了高PRA血清結合以及酶促降解是否降低了功能性抗體結合。
使用Ficoll分離從外周血收集人和豬PBMC。從WT豬和實例7的經基因修飾的豬2.0（3KO+12TG）加工豬主動脈內皮細胞（pAEC）。匿名的高和低PRA血清樣品由麻塞諸塞州總醫院HLA實驗室慷慨提供。從心臟、肝臟和腎臟異種移植接受者收集血清。通過IdeS（Genovis Inc.）酶促切割血清抗體。
低PRA人血清顯示出與人PBMC靶細胞的結合最少，而高PRA人血清以高水準與相同人PBMC結合（圖43A）。相比之下，高和低PRA血清均強烈結合豬PBMC（圖43B）。高PRA血清還顯示出與豬主動脈內皮細胞（pAEC）的顯著結合。基因修飾顯著（＞ 95%）降低了所有人血清的結合（圖44）。重要的是，使用來自豬2.0（3KO+12TG）的心臟、肝臟和腎臟異種移植物的體內異種移植實驗顯示，通過減少來自移植後取樣的接受者血清的抗體結合來封存豬特異性抗體（圖45）。這些資料表明存在低水準的殘留異種抗體。圖46A-圖46C顯示，IgG特異性蛋白酶IdeS將來自人和食蟹猴血清的功能性IgG的結合有效地降低至背景水準。
去除已知異種抗原靶標的基因修飾降低了人和靈長類動物血清與豬細胞的結合，但保留了低水準的異種抗體結合。高和低PRA血清相似，表明結合可能與HLA-SLA交叉反應性無關。對來自高度敏化患者的血清的IdeS處理展示了與豬2.0（3KO+12TG）細胞的負交叉匹配。保護異種移植物靶標免受具有未知靶標的抗體影響的其他方法是使用另外的基因修飾來防止下游後遺症，如補體啟動和血栓形成。此資料首次表明，酶促抗體切割可以成功地減少殘留IgG的功能結合，這表明此處理還可能是減少預先形成的異種抗體結合的影響的方法。
實例9：不含PERV且免疫學上相容的豬細胞、組織、器官、豬和後代的產生
豬器官被認為是異種移植的有利資源，因為它們的大小和功能與人體器官相似，並且可以大量繁殖豬。然而，豬內源性逆轉錄病毒（PERV）傳遞的潛在風險以及免疫學上的不相容性阻礙了豬器官的臨床使用。PERV是在所有豬品系的基因組中發現的γ逆轉錄病毒。豬基因組含有PERV元件的幾個至幾十個拷貝（Lee 2011）。與其他動物傳染病病原體不同，PERV是豬基因組的整體部分。因此，不能通過生物安全育種消除它們（Schuurman 2009）。儘管迄今為止尚無研究顯示PERV在臨床環境中傳遞給人，但已表明PERV可以在人細胞中通過“複製粘貼”機制感染和繁殖。在細胞培養中，已顯示病毒顆粒可以被釋放並可以感染人細胞並且隨機整合到人基因組中，優先地整合在基因內區域和活躍的染色質重塑區中（Armstrong 1971, Moalic 2006, Niu 2017, Patience 1997）。還已表明PERV-A和PERV-B兩者均可以感染人細胞。儘管PERV-C是嗜親性的，但重組病毒類型（A/C）展示出最大的感染性。此外，一旦PERV通過延長LTR序列適應新的宿主基因組環境，感染性潛力可能會增加。PERV還可以從經感染的人細胞水準傳遞到與豬細胞沒有接觸的其他人細胞。在體內，在免疫受損的小鼠中，已表明PERV可以從豬細胞傳遞到小鼠細胞（Clémenceau 2002）。如對其他逆轉錄病毒所報導的，PERV整合可能潛在地導致免疫缺陷和腫瘤發生。基因工程的最新突破已表明了永生化豬細胞株中PERV的全基因組失活（Yang 2015；PCT公開號WO 17/062723）和不含PERV的豬的產生（Niu 2017；PCT公開號WO 18/195402）。
利用CRISPR-Cas9技術，實現了PERV元件的所有62個拷貝從PK15豬腎臟上皮細胞基因組的完全消除（Yang 2015），和所有25個拷貝從豬胎兒成纖維細胞的完全消除，以及隨後產生了所有PERV元件均失活的活豬（Niu 2017）。這一成功表明，現在有可能衍生出不含PERV的豬，這可以為異種移植提供安全的供體庫。
為了確定PERV是否在人細胞中保持活性並繁殖，在PERV感染的HEK293T-GFP細胞（iHEK293T-GFP）的群體和克隆中監測PERV拷貝數大於4個月。如通過ddPCR所確定的，觀察到PERV拷貝數隨時間增加（Pinheiro 2012）。
已進行了研究以確定破壞豬基因組中PERV pol的所有拷貝是否可以消除PERV從豬到人細胞的體外傳遞（Niu 2017）。在高度工程化的PERV胎兒成纖維細胞克隆的細胞培養上清液中未檢測到逆轉錄酶活性，表明經修飾的細胞產生極少（如果有的話）PERV顆粒。具有＞ 97% PERV pol靶向的PK15克隆表現出PERV感染減少多達1000倍，與背景水準相似。這些結果由具有與PK15克隆的接觸史的人胚腎293（HEK293）細胞的連續稀釋物的PCR擴增證實。從豬的各種組織分離的總RNA已證實，在mRNA水準上，約100%的PERV失活。
迄今為止，已從約克夏品種生產了具有100% PERV KO的多個克隆，並且正在進行豬克隆。PERV失活的豬生產穩健，並且已生產了63頭PERV失活的仔豬，其中47頭為雌性且16頭為雄性。迄今為止，最老的健康動物已存活了兩年。目前43頭PERV KO豬正在成熟以進行育種。與用於克隆豬的細胞的正常核型一致，在PERV失活的豬中未檢測到異常的染色體結構變化。
正在進行長期研究，以監測PERV失活和基因編輯對大型動物的影響。這項技術正在應用於另外的豬品系，包括美國的約克夏豬和尤卡坦豬兩者。源供體豬將在所有PERV元件失效的背景線下進行基因工程化。
不含 PERV 和免疫學相容的豬的形式疊代運算。
已進行了研究，以工程化在基因組中不具有任何活性PERV的供體豬，以及具有增強的與人組織相容的免疫、炎症和凝血系統的豬。關於前者，在豬中，豬基因組中所有PERV的功能已通過以下方式來根除：使用CRISPR-Cas9工程來破壞PERV元件中逆轉錄酶基因（pol
）的催化結構域（使用如Niu 2017和WIPO公開號WO 2018/195402中描述的方法），並使用敲除（KO）、敲入（KI）和基因組替代的組合來提供人組織相容性器官。關於後者，如本文所述產生如下豬：其中觸發體液排斥反應的三個主要異種碳水化合物抗原產生基因/酶（即，GGTA1、CMAH和β1,4 N-乙醯半乳糖胺基轉移酶2（B4GALNT2））已被基因滅活。預期這些基因的功能喪失將在很大程度上消除預先形成的抗豬抗體與豬移植物內皮的結合。此外，將關鍵的免疫調節因子插入到不含PERV的豬基因組內的單個基因座處，以調節例如人補體系統（hCD46、hCD55和hCD59）、凝血系統（例如hCD39、hTHBD和hTFPI）、炎症反應（例如hA-20、hCD47和hHO-1）和NK（例如PD-L1）和T細胞反應（例如hHLA-E、hB2M）。將通過轉座進行的單拷貝多順反子基因轉殖整合用於敲入這些人源化基因。
預期可以產生既不含PERV又帶有免疫相容性有效載荷的豬，所述豬將具有多種希望的特性。為了實現這一目標，通過基因修飾的多次疊代運算產生了供體豬。圖21概述了供體豬世代通過順序基因編輯的進程。在第一次疊代運算中，使用CRISPR-Cas9介導的非同源性末端連接（NHEJ）對豬1.0的豬成纖維細胞進行了基因工程化，以使所有PERV拷貝從基因組功能性缺失或在其內失活。通過CRISPR介導的NHEJ產生了豬2.0，以缺失3個主要的異種碳水化合物抗原產生基因（3KO；GGTA1、B4GALNT2和CMAH），並與PiggyBAC介導的選自CD46、CD55、CD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1的多達12個所選擇基因轉殖或敲入的隨機整合結合，所述基因轉殖或敲入將異種免疫反應的各種成分修飾至豬基因組中。對於豬3.0疊代運算，然後在不含PERV的背景下產生源供體豬以攜帶3KO和多達12個指定的基因轉殖。預期下一代源供體豬（豬3.1、3.2等）將被基因工程化以攜帶另外的修飾，如vWF基因的人源化以及脫唾液酸糖蛋白受體1（ASGR1）和內源性B2M基因的缺失。
一旦不含PERV的3KO+TG豬（豬3.0，圖21）被基因工程化，則這些豬將進行雜交育種以產生後代和/或豬的漂移、驅趕、產仔和/或發聲。
細胞工程和
SCNT
以產生豬。
3.0
併入免疫相容性有效載荷、異種抗原破壞和
PERV
破壞
為了生產不含PERV的豬3.0，首先產生了具有異種相容性修飾的豬2.0（3KO+9TG）。豬2.0（3KO+9TG）包括基因轉殖hCD46、hCD55、hCD59、hB2M、hHLA-E、hCD47、hTHBD、hTFPI和hCD39。為了產生用於體細胞核移植（SCNT）的供體細胞以產生豬2.0，首先用以下兩種試劑對野生型豬耳成纖維細胞進行電穿孔：a) 靶向GGTA、CMAH和B4GALNT2基因的CRISPR-Cas9試劑；以及 b) 有效載荷質體，其帶有 (i) PiggyBac轉座酶盒 (ii) 由組織成3個可表現順反子的九種人基因轉殖（hCD46、hCD55、hCD59、hB2M、hHLA-E、hCD47、hTHBD、hTFPI和hCD39）組成的基因轉殖構建體（參見圖51）。產生成纖維細胞的單細胞克隆並通過以下方式進行篩選：a) 片段分析/全基因組測序以鑒定具有所希望基因組修飾的克隆（參見圖51C）和b) 常規PCR（參見圖51D）。然後將帶有所希望修飾的克隆用作供體，以通過SCNT產生豬2.0。
使用從豬2.0（3KO+9TG）的蹄子分離的細胞，將使用CRISPR-Cas9系統的PERV工程化用於產生具有異種相容性修飾且也不含PERV的細胞。將豬2.0成纖維細胞用CRISPR-Cas9試劑電穿孔，所述試劑靶向PERV元件的所有基因組拷貝共有的逆轉錄酶（Pol
）基因。產生了經電穿孔細胞的單細胞克隆，並且通過深度測序篩選這些克隆以鑒定其中Pol
基因的催化核心被破壞的克隆（參見圖51C）。然後對具有所希望的Pol
破壞的克隆進行核型分析（參見圖51E）；然後將具有正常核型的那些克隆用於SCNT中，以產生豬3.0（3KO+9TG）胚胎和豬。
豬
3.0
基因組、生化和表型特徵的表徵
A)
基因轉殖和敲除完整性的評估
在產生了豬3.0（3KO+9TG）後，我們接下來試圖仔細檢查其中的基因修飾的中靶和脫靶效應。為此，我們對WT成纖維細胞以及以上產生的豬2.0和豬3.0成纖維細胞進行了10倍全基因組測序（WGS）。與為了篩選進行的深度測序一致，WGS證實引入PERVpol
和GGTA/B4GALNT2/
CMAH基因的基因組拷貝中的突變均為移碼插入或缺失，預計它們將轉化為經修飾基因拷貝的功能性敲除（參見圖51A和圖51C）。此外，我們證實了所有九個基因轉殖在豬基因組中的存在，並且令人驚訝地，發現所述基因轉殖構建體已在CRISPR-Cas9靶向位點處整合到GGTA1等位基因之一中。
關於CRISPR編輯的潛在混淆脫靶效應，我們沒有發現預計將干擾我們希望的編輯的功能或具有對豬健康的預計有害影響的偽像。我們在WT與豬2.0（3KO+9TG）之間或在豬2.0（3KO+9TG）與豬3.0（3KO+9TG）之間未觀察到結構變異體的任何差異，表明這些豬的總體基因組穩定性。關於較小的基因組變化，如小插入缺失，我們檢查了所使用指導RNA的所有1,211個預測脫靶位點，並且發現與WT相比，豬2.0中B4GALNT2 gRNA脫靶位點中有兩個小插入；然而，所述插入均不影響蛋白質編碼序列。此外，當我們將豬3.0細胞與豬2.0細胞進行比較時，我們沒有觀察到預計重要的另外的基因組改變；我們僅發現了兩個PERV gRNA脫靶位點內的兩個缺失和一個插入，這兩者均發生在蛋白質編碼區域之外，並且可能實際上表示體細胞突變（參見Kim 2014）。考慮到缺乏功能性意義以及我們的豬的大量正常病理生理學資料，我們得出結論，所選擇的豬3.0保持了基因組穩定性。
在DNA水準上確認了基因組修飾後，我們進一步使用RNA表現和免疫測定方法檢查了豬3.0（3KO+9TG）是否具有適當的三重敲除和9TG表現。我們首先進行了RNA-seq，並且發現豬2.0和豬3.0兩者均以與人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）相當的水準表現了所有基因轉殖（圖52A）。此外，我們在豬的臍靜脈內皮細胞（PUVEC）和成纖維細胞兩者中觀察到了相當的基因轉殖表現譜和水準，表明基因轉殖在這些細胞類型中普遍表現。接下來，我們表徵了工程豬中的蛋白表現。我們在細胞表面上觀察到了α-Gal、Neu5GC和SDa的聚糖標記的減少，這表明在豬2.0（3KO+9TG）細胞和豬3.0細胞二者中功能性消除了負責合成這些聚糖表位的3個基因（分別為GGTA、CMAH和B4GALNT2）（圖52B）。通過PUVEC的FACS分析，我們觀察到豬2.0和豬3.0兩者均在蛋白質水準上表現所有基因轉殖。實際上，九個基因轉殖中的八個以與HUVEC相當的水準穩健表現。有趣的是，THBD表現是可檢測的，但水準低得多。與FACS分析一致，IHC研究顯示豬3.0腎臟缺乏三種聚糖抗原（圖52C）。同樣與FACS染色一致，我們檢測到豬3.0腎臟中8個基因轉殖的表現，除了THBD之外（圖52C）。綜上所述，我們從RNA表現和免疫測定資料得出結論，我們的三重敲除和9TG基因修飾在工程豬中在細胞和組織水準上成功轉化為RNA和蛋白質表現。
B)
豬
3.0
細胞的異種相容性特徵的評價
接下來，我們檢查了經基因組修飾的豬是否獲取了異種相容性功能。我們首先測試了基因修飾是否允許經修飾的豬細胞逃避預先形成的人抗體結合。與WT PUVEC相比，豬2.0和豬3.0 PUVEC表現出與人IgG和IgM的抗體結合降低了超過90%，這證實了可以通過3KO大大減輕針對異種移植的抗體障礙（圖53A）。此外，當與來自合併的人血清的人補體一起孵育時，表現人補體調節劑CD46、CD55和CD59的具有三重敲除的豬3.0 PUVEC展示出最小的體外人補體毒性，類似於它們的人HUVEC對應物（圖53B）。綜上所述，這些結果表明，當移植時，由於顯著降低的抗體結合和補體啟動，預計豬3.0衍生的異種移植物對體液損傷和超急性排斥反應較不敏感。
此外，我們檢查了豬3.0是否對由人先天細胞免疫介導的損傷抗性更強。當進行離體測定時，與WT PUVEC相比，表現HLA-E/B2M的豬3.0展示出對NK介導的細胞殺傷的明顯更強的抗性（圖53C）。綜上所述，這些結果表明，當移植時，預計豬3.0細胞對人先天免疫的攻擊抗性更強。
最後，我們檢查了豬3.0（3KO+9TG）是否可以減弱異種移植中經常觀察到的失調的血小板啟動和凝血級聯。當將血管化的WT豬器官移植到人體內時，預先形成的抗體、補體和先天免疫細胞可以誘導內皮細胞啟動並觸發凝血和炎症。來自豬內皮細胞的凝血調節因子與人血之間的不相容性導致異常的血小板啟動和凝血酶形成，從而加劇損害。此外，豬與人之間的凝血調節劑（例如，組織因子途徑抑制劑，TFPI）的分子不相容性使得外部凝血調節無效。
為了解決這些異種凝血問題，我們在豬3.0中使以下兩者作為我們用於豬3.0的多基因轉殖構建體的一部分過表現：a) 人CD39（抵消ADP在凝血級聯中的血栓形成效應的ADP水解酶）和b) 人TFPI（在內皮細胞啟動後易位到細胞表面的因子）。然後，我們進行了各種體外和離體測定，以驗證這些基因轉殖在移植到豬細胞時正確發揮功能並調節凝血途徑的能力。體外ADP酶生化測定顯示當與WT PUVEC和HUVEC相比時，豬3.0 PUVEC中CD39活性明顯更高，與其更高的來自基因轉殖的mRNA和蛋白表現一致（圖53F）。類似地，啟動的豬3.0 PUVEC顯示出有效結合並中和人Xa的能力，其可以減輕凝血並減少凝血酶-抗凝血酶（TAT）複合物的形成（圖53G）。最後，在使用與豬3.0 PUVEC共培養的人全血的離體凝血測定中，形成了最小的TAT（凝血酶抗凝血酶），並且TAT的形成水準與HUVEC相似（圖53E），表明豬3.0獲得了增強的與人因子的凝血相容性。
總的來說，這些異種相容性實驗的結果表明，豬3.0（3KO+9TG）獲得了增強的與人免疫系統的相容性，如通過減弱的人抗體結合、補體毒性、NK細胞毒性、吞噬作用和恢復的凝血調節所證明。
C)
豬
3.0
祖先
/
原理驗證豬的生理表型
為了評估工程豬的總體健康狀況，我們檢查了工程豬的生理學、能育性以及基因修飾對後代的傳遞。我們觀察到儘管在PERV元件、免疫學和凝血途徑上進行了廣泛工程化，但豬1.0和2.0（3KO+9TG）兩者均顯示正常的血細胞計數，包括總白細胞和血小板、單核細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞計數（圖54A）。我們還觀察到工程豬的正常生命器官功能（肝臟、腎臟和心臟）（圖54B、圖54C和圖54D）。此外，與WT豬相比，工程豬具有相似的凝血酶原和凝血酶時間（圖54E）。
此外，我們發現豬1.0和2.0可育，並且產生的正常平均產仔數為七。用WT豬育種豬1.0的後代在其肝臟、腎臟和心臟組織中攜帶約50%的PERV失活等位基因，表明PERV-KO等位基因是遵循孟德爾遺傳學穩定地遺傳的（圖55）。類似地，豬2.0和WT豬的所有後代對於3KO均是雜合的（圖56A），並且大約一半攜帶9TG，其表現在mRNA（圖56B）和蛋白質水準（圖56C）兩者上得到驗證。這表明基因修飾沒有被正常育種掃除。因此，我們得出結論，工程豬表現出正常的生理、能育性和經編輯等位基因的種系傳遞。
D)
結論
基因工程豬在解決未滿足的器官短缺的醫療需求方面具有廣闊的前景。在本報告中，我們工程化了豬3.0（3KO+9TG），其42個基因組基因座被修飾以根除PERV活性並增強人免疫相容性。豬3.0的廣泛分析顯示，工程豬細胞表現出降低的人抗體結合、補體毒性、NK細胞毒性和凝血失調。我們還檢查並驗證了我們的工程豬的正常病理生理、能育性和基因遺傳性。豬3.0的成功產生增強了為臨床移植提供安全且有效的器官的能力。
豬3.0（3KO+9TG）的成功產生表明了合成生物學在大型動物中廣泛工程化基因組並賦予新穎功能的能力。在豬3.0中，我們缺失了PERV元件的25個拷貝、異種基因的8個等位基因，並同時將9個人基因轉殖表現至生理相關水準。從而將在大型動物模型中進行基因組修飾的記錄擴展到42個。憑藉以這種規模執行複雜基因工程的能力，我們能夠工程化另外的編輯，並最終選擇具有最適合異種移植的組合的豬。此外，借助這些工具，我們設想可以對豬3.0進行進一步工程化，以實現另外的新穎功能，如免疫耐受、器官壽命和病毒免疫。
E)
方法
CRISPR-Cas9 gRNA設計
我們使用R庫DECIPHER設計特定的gRNA（PERV-3N：5'-TCTGGCGGGAGCCACCAAAC-3'，PERV-5N：5'-GGCTTCGTCAAAGATGGTCG-3'，PERV-9N：5'-TTCTAAGCAGTCCTGTTTGG-3'）以特異性靶向豬2.0基因組中的所有pol催化序列。此外，我們使用了特定的gRNA（GGTA1：5'-GCTGCTTGTCTCAACTGTAA-3'，CMAH：5'-GAAGCTGCCAATCTCAAGGA-3'，B4GALTN2：5'- GATGCCCGAAGGCGTCACAT-3'）分別靶向GGTA1、CMAH和B4GALNT2。
細胞培養
將豬胎兒成纖維細胞和成纖維細胞FFF3維持在達爾伯克氏改良伊格爾培養基（DMEM，Invitrogen）高葡萄糖和丙酮酸鈉中，其補充有15%胎牛血清（Invitrogen）、1%青黴素/鏈黴素（Pen/Strep，Invitrogen）和1% HEPES（Thermo Fisher Scientific）。將所有細胞保持在38ºC和5% CO2、90% N2和5% O2的加濕三氣培養箱中。
從臍靜脈新鮮分離豬臍靜脈內皮細胞（PUVEC），並在補充有10%胎牛血清（Gibco）、1%青黴素/鏈黴素（Pen/Strep，Invitrogen）和1% HEPES（Thermo Fisher Scientific）的PriGrow II培養基（abm）中培養。將人臍靜脈內皮細胞（HUVEC，ATCC，PCS-100-010）在補充有內皮細胞生長套組-BBE（ECG套組，ATCC）的血管細胞基礎培養基（ATCC）中培養。將人NK-92細胞株在補充有12.5%胎牛血清（Gibco）、12.5%胎馬血清（FES，Solarbio）和1%青黴素/鏈黴素（Pen/Strep，Invitrogen）的最低必需培養基α（α-MEM，Gibco）中培養。將人巨噬細胞株THP-1在補充有10%胎牛血清（Gibco）和1%青黴素/鏈黴素（Pen/Strep，Invitrogen）的RPMI 1640（BI）中培養。在62.5 nM佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA，Sigma）中經3天實現THP-1細胞的分化，並通過將這些細胞附著到組織培養塑膠進行確認。
PiggyBac-Cas9/2gRNA構建和細胞株建立
與先前描述的程式（Yang 2015）類似，我們合成了編碼U6-gRNA1-U6-gRNA2的DNA片段（Genewiz），並將其併入先前構建的PiggyBac-cas9質體中。為了建立具有PiggyBac-Cas9/2gRNA整合的FFF3細胞株，我們使用Neon轉染系統，根據由供應商（Thermo Fisher Scientific）提供的說明，用14.3 μg PiggyBac-Cas9/2gRNA質體和5.7 μg Super PiggyBac轉座酶質體（System Biosciences）轉染了5×105個FFF3細胞。為了選擇攜帶整合的構建體的細胞，將2 μg/mL嘌呤黴素施加至經轉染的細胞。基於將嘌呤黴素施加至野生型FFF3細胞的陰性對照，我們確定嘌呤黴素選擇在4天內完成。此後，用2 μg/mL嘌呤黴素維持FFF3-PiggyBac細胞株，並施加2 μg/ml多西環素以誘導多西環素可誘導FFF3-PiggyBac細胞株的Cas9表現持續一周。
為了避免在FFF3細胞株中的組成型Cas9表現，我們通過使用Lipofectamine 2000試劑用3 µg PiggyBac僅切除轉座酶載體轉染5×105個細胞，從FFF3基因組中進行PiggyBac-Cas9/2gRNA切除。然後，將經PiggyBac-Cas9/2gRNA切除的FFF3細胞單細胞分選到96孔板中，進行克隆生長和基因分型。
單細胞和單細胞克隆的基因分型
首先，對FFF3-PiggyBac-Cas9/2gRNA細胞株進行嘌呤黴素選擇，隨後進行PiggyBac切除。然後將細胞分選成單細胞，進入96孔PCR板進行直接基因分型，並進入96孔細胞培養板進行菌落生長。為了在不進行克隆擴增的情況下對單個FF細胞進行基因分型，我們從經分選的單細胞直接擴增PERV基因座。我們還對從經分選的單細胞生長的克隆進行了基因分型。基因分型的程式根據Yang等人, (6)的方法。簡而言之，我們將單細胞分選到96孔PCR板中，其中每個孔攜帶5 µl裂解混合物，所述混合物含有0.5 µl 10×KAPA表現提取緩衝液（KAPA Biosystems）、0.1 µl 1U/µl KAPA表現提取酶和4.4 µl水。我們將裂解反應在75ºC下孵育15 min，並在95ºC下使所述反應失活5 min。然後將所有反應添加到含有1x KAPA 2G fast（KAPA Biosystems）、0.2 µM PERV Illumina引子的20 µl PCR反應中（方法表2）。將反應在95ºC下孵育3 min，隨後進行30次（對於單細胞）或25次（對於單細胞克隆）以下迴圈：95ºC，20 s；59ºC，20 s和72ºC，10 s。為了添加Illumina序列銜接子，然後將3 µl反應產物添加到20 µl PCR混合物中，所述混合物含有1×KAPA 2G fast（KAPA Biosystems）和0.3 µM攜帶Illumina序列銜接子的引子。將反應在95ºC下孵育3 min，隨後進行20次（對於單細胞）或10次（對於單細胞克隆）以下迴圈：95ºC，20 s；59ºC，20 s和72ºC，10 s。在EX 2%凝膠（Invitrogen）上檢查PCR產物，隨後從凝膠中回收約360 bp靶產物。然後將這些產物以大致相同的量混合，純化（QIAquick凝膠提取套組），並用MiSeq個人測序儀（Illumina）進行測序。然後，我們分析了深度測序數據，並使用CRISPR-GA確定PERV編輯效率 (5)。
PERV pol基因分型中使用的引子
Illumina_PERV_pol正向：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGACTGCCCCAAGGGTTCAA-3'
Illumina_PERV_pol反向：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTCTCCTGCAAATCTGGGCC-3'
體細胞顯微注射以產生SCNT胚胎並進行胚胎移植用於豬克隆
體細胞顯微注射程式是根據Wei等人。所有動物實驗均在中國雲南農業大學動物保護委員會的批准下進行。除非另外說明，否則所有化學品均購自Sigma Chemical Co.（美國密蘇里州聖路易斯）。從Hongteng屠宰場（中國雲南省昆明Chenggong Ruide Food Co., Ltd）採集豬卵巢。將卵巢在補充有75 mg/mL青黴素G鉀和50 mg/mL硫酸鏈黴素的0.9%（w/v）NaCl溶液中於25ºC至30ºC下運送到實驗室。從直徑3-6 mm的卵泡分離卵丘細胞-卵母細胞複合物（COC），並且然後在具有5% CO2的加濕氣氛（APC-30D，ASTEC，日本）中，在200 µL補充有0.1 mg/mL丙酮酸、0.1 mg/mL L-半胱胺酸鹽酸鹽一水合物、10 ng/mL表皮生長因子、10%（v/v）豬卵泡液、75 mg/mL青黴素G鉀、50 mg/mL硫酸鏈黴素和10 IU/mL eCG和hCG（Teikoku Zouki Co.，日本東京）的TCM-199培養基中於38.5ºC下培養。在體外成熟38至42小時後，通過重複吸取0.1%（w/v）透明質酸酶中的COC，去除COC中膨脹的卵丘細胞。
如先前所述地進行SCNT。簡而言之，將擠出具有完整膜的第一極體的卵母細胞在補充有0.1 mg/mL秋水仙胺、0.05 M蔗糖和4 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）的NCSU23培養基中培養0.5至1小時，用於核突出。然後，在0.1 mg/mL秋水仙胺和5 mg/mL細胞鬆弛素B的存在下，在補充有10 µM羥乙基哌噥乙磺酸（HEPES）、0.3%（w/v）聚乙烯吡咯啶酮和10% FBS的Tyrode乳酸鹽培養基中，通過使用斜口移液管（直徑為大約20 µm）將突出的核連同極體一起去除。將WT或不含PERV的成纖維細胞用作核供體。將單個供體細胞注射到無核卵母細胞的卵周隙中。
在含有0.25 M D-山梨醇、0.05 mM Mg(C2H3O2)2、20 mg/mL BSA和0.5 mM HEPES（游離酸）的融合培養基中，通過使用胚胎細胞融合系統（ET3，日本東京的Fujihira Industry Co. Ltd.）以200 V/mm持續20 µs的單直流脈衝將供體細胞與接受者細胞質融合。將重建的胚胎在PZM-3溶液（van't Veer 1997）中培養2小時，以允許核重編程設計，然後在含有0.25 M D-山梨醇、0.01 mM Ca(C2H3O2)2、0.05 mM Mg(C2H3O2)2和0.1 mg/mL BSA的啟動介質中以150 V/mm持續100 µs的單脈衝啟動。然後，將經啟動的胚胎在具有5% CO2、5% O2和90% N2的加濕氣氛（APM-30D用於進一步啟動，ASTEC，日本）中，在補充有5 mg/mL細胞鬆弛素B的PZM-3中於38.5ºC下培養2小時。然後將重建的胚胎轉移到新的PZM-3培養基中，並於38.5ºC下在含有5% CO2、5% O2和90% N2的加濕空氣中分別培養2天和7天，以檢測卵裂和胚泡發育率。
將具有一次分娩史的雜交育種（大白/長白杜洛克）母豬用作所構建胚胎的代孕母親。每天上午9:00和下午6:00對它們進行發情檢查。將啟動後培養6小時的SCNT胚胎通過手術轉移到代孕者的輸卵管。在胚胎移植後23天，使用超聲波掃描器（HS-101 V，Honda Electronics Co. Ltd.，日本Yamazuka）檢查妊娠。
通過免疫螢光表徵蛋白質表現
對WT、豬2.0和豬3.0的新生兒（3-6日齡）豬腎臟冷凍切片進行免疫螢光，以在組織水準上表徵基因修飾（3KO和9TG）。將冷凍切片用冰冷的丙酮固定，封閉，然後使用一步式直接免疫螢光技術或兩步式間接免疫螢光技術染色。所使用的一抗和二抗在補充表2中匯總。使用ProLong Gold DAPI（Thermo Fisher，P36931）進行核染色。使用Leica螢光顯微鏡對切片成像，並使用ImageJ軟體進行分析。所有照片均在相同條件下拍攝，以允許正確比較WT、豬2.0和豬3.0冷凍切片之間的螢光強度。
人抗體與豬內皮細胞的結合
如先前所述（Xenotransplantation, Methods and Protocols, 編輯：Costa, Cristina, Máñez, Rafael, ISBN 978-1-61779-845-0），通過流式細胞術評估人IgG和IgM抗體與豬和人內皮細胞的抗體結合。簡而言之，收集豬2.0、豬3.0、WT PUVEC和HUVEC，洗滌兩次並重懸於染色緩衝液（含有1% BSA的PBS）中。將正常人男性AB血清（Innovative Research，IPLA-SERAB-H26227）於56ºC下熱滅活30 min，並在染色緩衝液中以1:4稀釋。將豬2.0、豬3.0、WT PUVEC和HUVEC（每個測試1 × 105個細胞）分別與經稀釋的人血清於37ºC下孵育30 min。然後用冷的染色緩衝液洗滌細胞，並與山羊抗人IgG Alexa Fluor 488（Invitrogen，A11013，1:200稀釋）和山羊抗人IgM Alexa Fluor 647（Invitrogen，A21249，1:200稀釋）於4ºC下孵育30 min。在用冷的染色緩衝液洗滌後，將細胞重懸於含有7-AAD（BD，559925，1:100稀釋）的染色緩衝液中，以便包括死/活門控。在CytoFLEX S流式細胞儀上獲取螢光，並使用FlowJo分析軟體分析資料。對於每個樣品，在活細胞門中收集5,000個事件，並繪製為通過“測試MFI（IgG或IgM）-對照（僅二抗）MFI”產生的特定中值螢光強度（MFI）。
人補體細胞毒性測定
收穫豬2.0、豬3.0、WT PUVEC和HUVEC，用PBS洗滌兩次，並重懸於無血清培養基中。將細胞（每個測試1x105
個細胞）與不同濃度（0%、25%、50%和75%）的人血清補體（Quidel，A113）的統一池在37ºC和5% CO2下孵育45 min。之後，將細胞用碘化丙錠（Invitrogen，P3566，1:500稀釋）染色5 min，並使用CytoFLEX S流式細胞儀進行分析。對於每個樣品收集了5,000個事件，並且將PI陽性細胞的百分比用作由人補體介導的細胞死亡的百分比。
NK細胞毒性測定
將PUVEC和HUVEC用作靶細胞並分別用抗豬CD31-FITC抗體（Bio-Rad）和抗人CD31-FITC抗體（BD）標記。同時，將人NK 92細胞用作效應細胞並用抗人CD56-APC抗體（eBioscience）標記。將效應子（E）和靶細胞（T）在37ºC和5% CO2
下以3的E/T比共培養4小時。將細胞用碘化丙啶染色5 min，然後進行FACS分析。將CD31+門中PI陽性細胞的百分比用於計算殺傷的靶細胞的百分比。
吞噬作用測定
通過62.5 μM佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）經3天實現人巨噬細胞株THP-1的分化，並通過將這些細胞附著到組織培養塑膠進行確認。根據製造商的規程，用螢光染料5/6-CFSE（Molecular Probes）對豬脾細胞（靶細胞）進行染色。將CFSE標記的靶細胞與人分化的THP-1細胞（效應細胞）分別以1 : 1和1 : 5的E/T比於37ºC下孵育4小時。用抗人CD11b抗體複染巨噬細胞，並通過FACS測量CFSE標記的靶標的吞噬作用。如先前所述（Ide 2007）地計算吞噬活性。
CD39生化ADP酶測定
在測定前1天，將豬2.0、豬3.0以及WT PUVEC和HUVEC以每孔2×104接種在96孔板中。將細胞與500 μM ADP（Chrono-Log Corp，＃384）在37ºC和5% CO2下孵育30 min。加入孔雀石綠（Sigma，MAK307）以終止反應，並在630 nm處測量吸光度，以相對於KH2PO4的標準曲線確定磷酸鹽產生的水準。
TFPI活性和人因子Xa結合測定
在測定之前，將細胞用1 μM PMA處理6小時以誘導豬2.0和豬3.0 PUVEC的細胞表面上的hTFPI表現。然後如先前所述地進行TFPI活性和人因子Xa結合測定（Xenotransplantation, Methods and Protocols, 編輯：Costa, Cristina, Máñez, Rafael, ISBN 978-1-61779-845-0）。一式四份地進行所有測定。
TAT形成測定
將豬2.0、豬3.0以及WT PUVEC和HUVEC以每孔3×105接種在6孔板中。在1天后，在平緩振盪下，將細胞與1 mL新鮮的全人血（含有0.5 U/mL肝素）於37ºC下孵育。在不同的指示時間點，抽血，從中分離血漿。通過使用凝血酶-抗凝血酶複合物人ELISA套組（Abcam，ab108907）測量血漿中的TAT含量。
來自全基因組測序數據的變異體調用
通過BWA（v0.7.17-r1188）將配對的讀段映射到野豬11.1基因組（ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-91/fasta/sus_scrofa/dna/）。使用標準篩檢程式加上要求最小深度為10，遵循GATK最佳實踐建議，使用GATK（v4.0.7.0）來調用變異體（SNP和INDEL）。
中靶/脫靶位點的電腦預測
使用允許最多6個錯配的R（v3.5.0）中的CRISPRSeek（v1.22.1）預測全基因組中靶和脫靶位點。輸入基因組是野豬11.1（ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-91/fasta/sus_scrofa/dna/）。
全基因組測序數據的脫靶調用
將落入通過CRISPRSeek（v1.22.1）預測的脫靶PAM位點側翼20 bp內的GATK的經過濾變異體稱為潛在的脫靶修飾。當親本系WGS資料可用時，使用內部開發的統計檢驗過濾出等位基因頻率明顯偏離親本系大於或小於0.5的變異體。該檢驗假設兩個等位基因同時被修飾的機會極小，因為脫靶突變是罕見的事件。
突變的功能影響分析
無論變異體是脫靶突變還是種系突變，都應注釋在轉錄水準上的序列變化和在蛋白質水準上的胺基酸變化，以使用VEP（變異體效應預測器，v93.3）評估其潛在的功能影響。如果高影響突變會導致移碼、起始增益/丟失、終止增益/丟失、剪接供體/受體移位或剪接區域變化，則應特別地選擇高影響突變。只要有可能，突變將被注釋，以表明它是否影響使用APPRIS資料庫的原理或可替代轉錄物。
來自RNA-Seq的轉錄分析
在剪接感知模式下，使用STAR（v2.6.1a）將RNA-Seq讀段與野豬11.1基因組進行比對。將豬轉錄組和基因轉殖兩者作為輸入轉錄物，使用Salmon（v0.11.3）將表現水準量化為TPM（每百萬轉錄物）。
通過Amplicon-Seq進行PERV敲除效率分析
在修剪低於Q20的3'末端低品質鹼基後，如果配對讀段的重疊超過100個鹼基，則將其合併成片段。針對低於Q20的硬遮蔽低品質鹼基進一步掃描合併的片段，並在剪接感知模式下使用STAR（v2.6.1a）與PERV擴增子靶序列進行比對。然後，通過內部R腳本（v3.5.0）對輸出BAM檔進行分析，以消化比對模式，評估INDEL在PERV擴增子靶序列中的分佈（相對於催化中心）並得出敲除效率。
通過Capture-Seq進行PERV敲除效率分析
首先在剪接感知模式下使用STAR（v2.6.1a）將配對的讀段與PERV靶序列進行比對，隨後通過Picard（v2.18.14）進行比對位置依賴性去重。然後，通過內部腳本將去重的配對讀段合併成片段。然後在剪接感知模式下，使用STAR（v2.6.1a）將合併的片段與PERV捕獲靶序列重新比對。然後，通過內部R腳本（v3.5.0）對輸出BAM檔進行分析，以消化比對模式，評估INDEL在捕獲靶序列中的分佈並得出敲除效率。
通過Capture-Seq進行PERV單倍型分析
首先在剪接感知模式下使用STAR（v2.6.1a）將配對的讀段與PERV靶序列進行比對。使用Mutect2（v4.1.2.0）調用體細胞變異體，並過濾出等位基因頻率超過給定閾值較少（MAF ＞ 0.01）的變異體。合併來自多個樣品的經過濾變異體，以得出用於單倍型分型的變異體位點的集合。接下來，通過內部腳本將正確比對的配對讀段合併成片段。然後在剪接感知模式下，使用STAR（v2.6.1a）將合併的片段與PERV靶序列重新比對。對於覆蓋目的區域的每個片段，我們提取等位基因用於收集變異體位點，以定義片段的單倍型。最後，通過計數覆蓋目的區域的所有片段，得出單倍型的分佈。
使用全基因組測序數據鑒定有效載荷整合位點
在剪接感知模式下，使用STAR（v2.6.1a）將配對的讀段與由野豬11.1基因組、PERV單倍型和有效載荷質體序列構成的參考庫進行比對。使用Lumpy（v0.2.13）從BAM檔調用結構變異體（SV），以檢測DNA融合點。接下來，我們篩選在整合位點處將豬基因組和有效載荷序列與錯配讀段橋接的SV。
統計分析
所有統計分析均通過R（v3.5.0）和Excel（v2016）執行。除非另外指明，否則p值＜ 0.05是顯著的。當同時涉及多個檢驗時，遵循Benjamini-Hochberg程式執行p值校正，以控制總體錯誤發現率（FDR）。除非另外指明，否則通常使用FDR ＜ 0.05。
實例10：用人血灌注免疫相容性豬肝臟
用從豬2.0（4-7；3KO+12TG）分離的免疫學相容性豬肝臟進行肝臟灌注實驗，作為異種移植的替代實驗，用於分析器官功能。從12個月齡的豬分離野生型肝臟和4-7肝臟（大約80 kg）。用人全血和人新鮮冰凍血漿（FFP）灌注肝臟。表1概述了簡要的肝臟灌注方案。
表
1
| 方案 A | 方案 B | |
| 人全血 | 3個單位 | 800 ml |
| 人FFP | 5個單位 | 5個單位 |
| Clinimix（4.25/5） | 最初為50 mL，然後為10 mL/hr | 最初為50 mL，然後為10 mL/hr |
| 肝素 | 10,000個單位推注 | 10,000個單位推注 |
| 胰島素 | 100個單位 | 100個單位 |
| 按需添加劑： | ||
| 8.4% NaHCO3 | 目標pH ＜ 7.2 | 目標pH ＜ 7.2 |
| 10% CaCl2 | 目標iCa ＜ 1.05 | 目標iCa ＜ 1.05 |
| 肝素 | 目標ACT ＞ 400 | 目標ACT ＞ 400 |
| 胰島素 | 目標葡萄糖＜ 300 | 目標葡萄糖＜ 300 |
| 溫度： | 38C | 38C |
| HA壓力： | 75 mmHg | 75 mmHg |
| PV壓力： | 7 mmHg | 7 mmHg |
在不同時間點從肝臟收集膽汁並進行分析。如圖28所示，與WT肝臟相比，4-7肝臟中總膽汁產量增加了大約2倍。此外，4-7肝臟顯示出穩定的代謝酶血清水準，所述代謝酶是肝臟損害的標記，包括丙胺酸胺基轉移酶（ALT）、天門冬胺酸胺基轉移酶（AST）和白蛋白（ALB）（圖29A-圖29C）。此外，4-7肝臟顯示出穩定的血清電解質水準，包括鉀（K）和鈉（Na）（圖29D-圖29E）。還測試了4-7和WT肝臟的補體（C3）表現，與WT肝臟相比，4-7肝臟中的補體（C3）表現以更高、更穩定的水準持續（圖29F）。當分析凝血時，4-7肝臟顯示出穩定的凝血酶原時間（PT）和國際標準化比率（PT-NIR）、纖維蛋白原水準（FIB）和較低的啟動部分促凝血酶原激酶時間（APTT）（圖30A-圖30D）。綜上所述，這些資料表明4-7肝臟具有改善的肝臟功能。
實例11：豬到非人靈長類動物（NHP）腎移植
在2014年之前，最長的豬到非人靈長類動物（NHP）腎異種移植物為90天，移植物存活＞ 30天是非常不尋常的。誘導和維持免疫抑制治療方案的最新進展與具有靶向宿主先天性和適應性免疫反應的基因改變的供體豬的可用性增加相結合，已導致移植物存活延長至＞ 125天（Higginbotham 2015, Iwase 2015b）。補償免疫、凝血、補體和炎症反應途徑中的分子不相容性的進一步基因工程正在開始推進異種移植領域。儘管通過基因修飾以產生GTKO並使一種hCRP過表現，但凝血功能障礙（包括血栓性微血管病和全身性消耗性凝血病）仍持續存在，這主要是由於豬與NHP之間的分子不相容性所致。
臨床前腎移植研究。
對於臨床前腎移植研究，將在NHP中進行安全性和功效研究。對於安全性和功效檢查，將來自8至10周齡豬2.0供體的腎臟移植到NHP（食蟹猴）接受者，所述接受者將在移植時經歷雙側腎臟切除術。異種移植物功能將通過血清肌酐值、全血細胞計數和尿液蛋白質分析以及一系列活檢以及體重和總體健康狀況的檢查來監測。免疫抑制將由臨床相關試劑組成，其組合和強度是在同種異體移植中可接受的。這些將包括使用類固醇、抗NHP胸腺細胞球蛋白、抗CD20誘導治療，以及使用類固醇、抗CD40、MMF和雷帕黴素維持免疫抑制。將投予預防性抗病毒、抗細菌和抗凝血療法，並且將基於血細胞比容水準按需投予補充的Epogen。
預期六個月功能良好的異種移植物存活將提供足夠功效證據，所述異種移植物存活是通過正常肌酐和不存在蛋白尿或低水準蛋白尿以及不含抗體或細胞介導的急性損傷的活檢來指示。
通過與同種異體移植類比，預計預先形成的抗體介導的損傷的最大風險期將在移植後的最初幾周內，並且急性細胞介導的排斥反應最有可能在移植後的前三個月內發生，此後風險逐漸降低（Cowan 2014）。
同種異體移植物排斥反應。
根據2016年12月修訂的指南草案“Source Animal, Product, Preclinical, and Clinical Issues Concerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans”（FDA 2016），存在異種移植產物的排斥反應可能使接受者易於排斥隨後的異種移植產物或同種異體移植物的可能性（第IX.C.1.g節）。
將在臨床前模型中使用體外抗體反應性和混合淋巴細胞反應（MLR）測定來表明異種移植後反應性的缺乏。為了測試對異種移植物的反應與對隨後的同種異體移植物的反應之間可能的交叉反應性，將使用雄性NHP的血清進行流式細胞術交叉匹配，所述雄性NHP接受來自正常豬和如上所述的豬2.0供體的腎臟移植物。將測試血清對來自一組NHP供體的淋巴細胞以及對來自豬供體的淋巴細胞的反應性。對豬細胞的反應將證實已通過抗豬抗體水準的升高發生了異種敏化事件。將來自移植前NHP（首次實驗的）的樣品與排斥反應後樣品進行比較，以評估抗體與NHP淋巴細胞組結合的變化。同時，將評價移植前和移植後（排斥反應後）NHP接受者T細胞對一組同種異體刺激物的直接和間接T細胞反應，以確定細胞介導的同種異體反應是否在異種移植排斥反應後被增強（Baertschiger 2004, Cooper 2004, Ye 1995）。
預期將在異種與同種異體反應之間觀察到至少低水準的交叉反應性。然而，在提出的試驗中應考慮這些結果。對於腎臟試驗，計畫對高度敏化患者進行移植，所述患者由於不能鑒定合適的匹配而無法接受移植。適度的額外敏化不太可能改變接受後續同種異體移植的機會的可能。此外，T細胞敏化尚未被鑒定為再移植的重要障礙，並且因此可能無法在臨床上進行監測（Baertschiger 2004, Cooper 2015）。因此，異種細胞介導的敏化似乎不可能阻礙同種異體移植物存活。
生物分佈。
供體細胞在接受者中遷移到遠端組織/器官仍然是異種移植的可能結果。嵌合體研究表明，這可能實際上增加移植的成功率，降低排斥反應的可能性（Starzl 1993, Vagefi 2015）。然而，豬供體細胞遷移可能會產生未知的後果，並且因此開發出策略來確定是否發生細胞遷移。根據FDA指導性檔（包括Source Animal, Product, Preclinical, and Clinical Issues Concerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans，2016年12月（第IX.C.5節；FDA 2016年12月）、Gene Therapy Clinical Trials - Observing Subjects for Delayed Adverse Events，2016年11月（第IV.B.2節；FDA 2016年11月），和Preclinical Assessment of Investigational Cellular and Gene Therapy Products，2013年11月（第V.C.5.節；FDA 2013））中概述的原則，將生物分佈作為豬-NHP異種移植研究的一部分進行研究。
致瘤性。
SCNT和輔助生殖設施中包括的所有動物將被常規監測，用於尋找腫瘤發生的證據。被發現垂死或死亡的所有動物將由獸醫病理學家進行完整的屍檢以及肉眼和微觀病理學檢查。所有基因工程動物健康和病理的記錄都將得到維護和彙編，以確定由於特定或非預期的基因修飾而引起致瘤性潛力的風險。
實例12：豬到人腎的移植
腎異種移植已被研究了幾十年，並且已在早期臨床試驗中評估了豬異種移植物（Starzl 1964）。挑戰是使異種移植程式能夠提供等同於同種異體移植物存活的臨床益處。
臨床研究設計。
所提出的臨床研究群體將包括年齡為18-65歲的患有終末期腎疾病的移植患者，他們由於存在高水準的群體反應性抗HLA抗體（PRA）而不可能及時找到合適的腎臟供體。高PRA在匹配合適的已故或活體供體方面帶來了巨大挑戰，導致移植的等待時間延長，以及血液透析額外年限導致的發病率增加。儘管在等待名單上分配了優先順序，但與不那麼敏感的患者相比，＞ 90%的PRA患者仍經歷明顯延長的等待時間。將以具有＞ 90%針對HLA抗原的PRA敏化且表現與豬供體淋巴細胞（或內皮細胞）的負流交叉匹配的受試者為目標。
患者將接受120 ± 10克的豬供體腎臟，其提供40-50 mL/min/1.73m2
的預計腎小球濾過率（GFR）。來自9至12個月齡供體的單個豬腎臟將以與用於同種異體腎移植相同的方式移植到右側或左側髂窩。主要終點將是移植後擺脫血液透析持續一年。將通過針對肌酐水準、尿蛋白的連續血液測試以及使用MDRD方程計算GFR來評估患者：GFR (mL/min/1.73 m2
) = 175 × (Scr)-1.154
× (年齡)-0.203
× (如果是女性，0.742) × (如果是非裔美國人，1.212)。將每三個月進行方案指定的移植物活檢，並且原因是基於肌酐從基線上升＞ 20%，定義為移植後第一個月中最佳的連續三次肌酐測量的平均值，或者尿蛋白大於300 mg/天。安全性測量將包括監測凝血參數、臨床化學、血液學和外來感染。
用於豬 - 人腎移植的器官。
資料表明，豬腎臟通過腎臟重量表現出與人腎臟相似的功能效力，因此允許依據與臨床上用於同種異體移植物相當的移植物和接受者重量進行腎臟移植。在人體中，同種異體腎移植物的移植是在腎臟重量與接受者重量的寬範圍內進行的。平均而言，成年男性腎臟重量為125-170克，並且成年女性腎臟重量為115-155克（Boron 2003）。在針對腎臟重量與接受者重量的比率考慮給藥上限時，沒有證據表明腎功能過剩以任何方式有害。相反，可移植腎品質的上限受技術問題的限制。例如，可以成功移植到10kg嬰兒中的單個成人腎臟相當於12-17克腎臟/kg，這是平均成人的腎品質比（3-4克腎臟/kg；Donati-Bourne 2014）的大約3-4倍。這種移植物重量與接受者重量比率的上限與以下詳述的所提出的臨床前研究有關。在實驗性臨床前研究中，來自8至10周齡豬供體的50-75克腎臟將被移植到5-12 kg NHP接受者中（約10克腎臟/kg）。
腎小球濾過率（GFR；mL/min/1.73m2）是腎功能或腎臟效力的標準量度，用於對符合透析和/或移植條件的慢性腎臟疾病（CKD）和腎衰竭的進展進行分期。在針對腎臟重量與接受者重量確定給藥下限時，目標是實現45-60 mL/min/1.73m2
的GFR（CKD 3A期；Levey 2011）。GFR的該目標範圍是基於資料的，所述資料表明，CKD 3A中的腎功能與在人體中通過單腎臟同種異體移植所實現的腎功能相當並且是穩定的，而CKD 3B期中的較低GFR（GFR 30-45 mL/min/1.73m2
）與終末期腎疾病以及全因和心血管疾病死亡率增加相關（Sharma 2010）。45-60 mL/min/1.73m2
的目標GFR範圍與在人體中通過單腎臟同種異體移植所實現的GFR範圍（50-65 mL/min/1.73m2
；Gourishankar 2003，Marcén 2010）相當。
考慮到人和豬腎臟在每腎品質的GFR方面的可比性，這將要求異種移植的腎臟品質與同種異體移植中常規使用的腎臟品質（115-170克）相當。應考慮到，由於用呈鈣神經素抑制劑形式的腎毒性免疫抑制治療接受者，部分腎功能可能在捐獻過程中和移植後喪失。
藥理學和毒理學信息。
將以齧齒動物和NHP模型兩者使用藥理學研究來評價功效和安全性。將使用多種綜合安全性終點，以及在基因工程供體豬組織中對臨床病理學和病理生理學的評估。將採取分層方法，其涉及體外細胞和組織功能，以及在供體豬和NHP異種移植物中對臨床病理學和組織病理學的評估。終點將包括移植物功能和排斥反應，以及與先天性和適應性免疫、炎症以及補體和凝血級聯有關的接受者安全性。
基因工程供體豬的體細胞核移植和輔助生殖。
出於安全性考慮，將通過全臨床病理學（包括臨床化學和血液學以及肉眼和微觀組織病理學）定期監測基因工程供體豬。將監測並記錄育種集落內所有供體豬的生殖能力、胚胎-胎兒發育、器官和組織發育以及潛在的腫瘤發生。
通過用永久性墨水印刷的獨特耳標（在原產地放置）來標識動物。豬的流動包括隔離區，所述隔離區是具有刨花墊層的露天群居式畜欄。飼料槽是木制的，並且保持乾淨，沒有碎片和廢物。隨時可經由乳頭式飲水器獲得自由選擇的淡水。畜欄依靠室外風運動來迴圈空氣，並且溫度保持在高於10ºC。生物安全性要求至少24小時沒有其他豬接觸、特定的畜欄服裝，以及在接觸畜欄之前和之後在消毒劑中浸泡靴子。隔離期包括35-40天的隔離，用Parvo Shield L5E、FluSure XP/ER Bac Plus、Ingelvac FLEX組合（圓環病毒和真菌病毒）和Dectomax進行疫苗接種，並且包括2次抽血，表明疾病抗體（PRRSV、PRRSX3）沒有增加。在從隔離區清除後，將豬轉移到所述設施的緩衝區。這個區是一個封閉式畜欄的群居式具有鋸屑墊層的畜舍，每組最多12頭。每週更換墊層。溫度由恒溫器控制的風扇和丙烷加熱器控制在15-24ºC的範圍內。豬是以不銹鋼槽餵養的，並且可隨時經由乳頭式飲水器獲得自由選擇的淡水。每天至少一次以及根據健康狀況指示對豬進行觀察。
將觀察到健康問題的豬圈養在單個畜舍中進行個性化護理和關注，並按照主治獸醫和胚胎學主任的引導進行處理。生物安全性要求至少24小時不與其他豬群接觸。在接觸畜欄之前和之後，用Virkon-S或Synergize對僅限在畜欄區中使用的連身工作服和靴子進行消毒。用於臨床研究的源供體豬的產生將遵循所有相關的指導和規定。
基因工程的驗證
。將在基因組、mRNA和蛋白質水準上驗證內源性基因KO和人基因轉殖表現。對於基因KO，將進行Sanger測序或深度測序以確認預期靶位點處的基因突變。其次，將進行RNA-seq和/或RT-PCR以確保mRNA含有預期的突變，並經受無義介導的衰變。將進行RT測定以表明在PERV KO細胞中消除了RT活性。此外，將進行免疫組織化學（IHC）染色和/或流式細胞術以確保細胞中或細胞表面處不存在基因產物。
儘管在精確基因編輯領域中取得了進展，但脫靶突變仍可能存在，並且必須理解所述脫靶突變以便產生用於臨床異種移植的安全有效的供體器官。為了查明CRISPR-Cas9基因編輯的潛在脫靶效應，已採用以下多分層評估方法：
1. 經修飾的細胞克隆的核型，用於確定染色體結構完整性；
2. CIRCLE-Seq：一種靈敏的體外篩選策略，其全面地檢測任何給定gRNA的全基因組CRISPR-Cas9脫靶突變。潛在的脫靶位點將使用隨後的靶向擴增子測序在來自特定gRNA的任何衍生細胞株中進行審查；
3. 全基因組測序（WGS）：用於檢查基因工程細胞株或豬的單點突變以及小結構變異。表2列出了所採用檢測方法的解析度和靈敏度。
表
2
| 解析度 | 靈敏度 | 平臺 | 注意 | |
| 全基因組測序 | 1 bp | 95%（SNV） 80%（插入缺失） | Broad Institute Clinical Services | CRO和內部分析 |
| 全基因組測序 | 100 bp-100 kbp | 取決於區域 外顯子組密度 | CN.MOPS 方法 | CRO和內部分析 |
| Circle-Seq | 1-20 bp | 具有＞ 1%脫靶活性的所有 位點 | Beacon Bio | CRO/內部發展 |
| 核型 | 5 Mbp | 10%鑲嵌性 | Cell Line Genetics, Inc. | CRO |
對於基因轉殖表現，將使用測序、RT-PCR/RNA-seq和IHC/流式細胞術技術在基因組、mRNA和蛋白質水準上驗證人基因轉殖的完整性和表現。此外，將通過基於反向PCR的連接捕獲確定隨機基因轉殖整合的位置，並將通過連接PCR驗證結果。
將選擇如下克隆：其中單拷貝基因轉殖整合到距任何已知基因和ncRNA至少10,000bp，並且距任何癌基因和腫瘤抑制因子至少50,000bp的基因間區域中。對於位點特異性整合和內源性基因人源化，將通過連接PCR和液滴數位式PCR（ddPCR）驗證雙等位基因位點特異性整合/替代。
實例13：非人靈長類動物（NHP）腎移植
臨床前移植研究。對於臨床前移植研究，在NHP中進行了安全性和功效研究。將來自8-10周齡豬2.0供體的心臟、腎臟和肝臟用於移植的實體器官研究，並將肝臟和肺用於灌注器官研究。在5個月的跨度中，進行了15次器官移植和11次器官灌注。具體地，進行了7次腎臟移植、4次心臟移植、4次肝臟移植，同時進行了4次肝臟灌注和7次肺灌注，如表3中所匯總。
表
3
| 有效載荷 | 供體 ID | 移植的實體器官 | 灌注的器官 | |||
| 2.9 | 1839 | X | X | X | X | |
| 1841 | X | X | X | |||
| 1844 | X | X | X | X | ||
| 1848 | X | X | X | |||
| 1850 | X | X | X | X | ||
| 2.10 | 1856 | X | X | |||
| A10169 | X | X | X | |||
| A9956 | X | X | ||||
| A9954 | X |
腎臟移植的免疫抑制方案由臨床相關試劑組成，其組合和強度是在同種異體移植中可接受的。臨床監測包括：在第2、5、7、9、12和14天進行腹部超聲檢查，並在第2、5、7、9、12和14天以及每週進行臨床實驗室檢查（CBC、Chem 17、凝血篩查、血清）。
分析了來自豬2.0供體和對照豬（GTKO.hCD55）的經移植腎臟的存活。表4提供了結果的總結。
表
4
| 豬 ID | 供體品系 | 腎臟移植物存活（天） |
| 33-7 | GTKO.hCD55 | 15 (aCD40) |
| 32-2 | GTKO.hCD55 | 11 (aCD40) |
| 53-5 | GTKO.hCD55 | 76 (aCD40L) |
| 53-1 | GTKO.hCD55 | 93 (aCD40L) |
| 1839 | 9 | 存活＞ 190（aCD40L） |
| 1841 | 9 | 20 (aCD40L) |
| 1844 | 9 | 72 (aCD40L) |
| 1848 | 9 | 15 (aCD40L) |
| 1850 | 9 | 6 (aCD40L) |
| A10169 | 10M | 2 (aCD40L) |
| 9956 | 10M | 存活＞ 30（aCD40L） |
GTKO.hCD55豬腎臟的兩個最長存活接受者存活直到第76天和第93天，此時它們分別由於腎衰竭和體重減輕而被安樂死。在這兩者中，一者被發現患有血栓性微血管病（TMA）、慢性抗體介導的排斥反應（AMR）和臨界性T細胞介導的排斥反應（TCMR）；而另一者具有C4d沉積，但原本沒有明顯排斥反應的組織學證據。其餘七名接受者接受了來自豬2.0的腎臟。在這些豬中，調節免疫反應或補體啟動的經轉導人蛋白以高水準表現。這些經基因修飾的豬腎臟的NHP接受者在進行用於腎臟移植的免疫抑制方案的情況下存活＞ 190、72、20、15和6天。
一名接受者目前在進行用於腎臟移植的免疫抑制方案的第190天表現良好，腎臟功能正常（肌酐0.6 mg/dl）。多次活檢未顯示排斥反應或TMA的證據。
這些資料一起表明，在最小維持免疫抑制下實現具有三重異種抗原KO的腎臟異種移植物的長期存活，所述異種移植物具有編碼先天性反應和補體途徑中調節蛋白的人基因的多重轉導，且無排斥反應或TMA。
猴子的健康受損導致了數隻異種移植猴子的提前終止。併發症包括輸血、注射部位膿腫和感染、創傷癒合。一些病例出現膀胱和/或輸尿管出血，可能是由於過度抗凝所致。表5提供了豬2.0移植物的總結。
表
5
| 豬 ID | 供體品系 | 當前狀態 |
| 1839 | 9 | 存活 ：持續進行，BUN/Cr穩定；1/周的抗CD154，每天DHPG和MMF |
| 1841 | 9 | 已終止：可能出現了排斥反應，但未確認 |
| 1844 | 9 | 已終止：腎功能波動 |
| 1848 | 9 | 已終止：可能出現了輸尿管排斥反應和缺血性損傷，但未確認 |
| 1850 | 9 | 已終止：在膀胱中凝塊，並且後來在輸尿管中凝塊。肌酐升高。 |
| A10169 | 10M | 已終止：極少灌注到腎臟，肌酐升高 |
| 9956 | 10M | 存活 ：持續進行，BUN/Cr穩定；1/周的抗CD154，每天DHPG和MMF |
對移植有從有效載荷9（A）和有效載荷10（B）供體豬分離的腎臟的宿主猴子的分析表明，宿主表現出穩定的血清肌酐水準（圖32A和圖32B）。幾隻宿主猴子還表現出穩定的或恢復的血細胞比容水準（圖33A和圖33B）。血小板計數在一些宿主猴子中是低的，但在其他宿主猴子中已恢復（圖34A和圖34B）。WBC的波動反映了免疫抑制方案和感染事件（圖35A和圖35B）。
肝臟異種移植。
直到最近，豬到狒狒原位肝臟異種移植（OLTx）存活仍限於9天。投予人凝血因子使兩名GTKO肝臟接受者的存活延長至25天和29天，但持續的存活仍難以確定。
在這裡，進行了四個豬到狒狒OLTx。肝臟來自基因轉殖豬的兩個基因構建體，所述基因構建體缺乏異種抗體的靶標，並且含有人基因轉殖以解決補體啟動和先天性免疫細胞功能（第1組：B1、B2；第2組：B3、B4）。免疫抑制由ATG、利妥昔單抗、皮質類固醇、MMF和aCD154組成。所有接受者均接受了KCentra輸注。與先前的研究不同，未進行脾切除術，並省略了眼鏡蛇毒因子和他克莫司。B2和B4接受了GpIIb/IIIa抑制劑的連續輸注。用每日化學、乳酸鹽，CBC、INR和每週凝血概況評估移植物功能。
狒狒B1、B2和B4成功經歷了具有維持生命移植功能的OLTx。LFT在所有狒狒中在POD1均達到峰值，並在POD4-7之間歸一化（圖38A-圖38B）。每只狒狒表現出血小板減少症，且在B2中於POD8以及在B4中於POD4開始自發恢復（圖38C）。輸血要求（圖38D）少於歷史經驗。凝血因子在OLTx之後立即發生消耗，隨後以正常豬水準產生（圖38E-圖38I）。B1在POD8由於體液瀦留和腹腔室隔綜合征導致的呼吸衰竭而被安樂死。肝臟活檢顯示局灶性缺血、無排斥反應和陰性C4d（圖38A-圖38B）。B2順利地恢復，並且在POD8的活檢是正常的。咯血的發展和輸血需求的增加，使得需要在POD14進行安樂死。屍檢鑒定為肺出血。肝臟的H+E染色表現出彌漫性竇狀嗜中性粒細胞浸潤，表明感染併發症與排斥反應，B2為C4陰性，並且LFT自始至終保持正常（圖38C-圖38D）。B3在再灌注後出現術中低血壓和低血氧，需要安樂死。屍檢顯示彌漫性肺出血，同時肝臟正常且脈管通暢。B4順利地恢復。僅需要一次術後輸血。在POD7，Tbili和LFT的上升促使了探索，其中鑒定出膽汁洩漏和肝動脈血栓形成（HAT），需要安樂死。活檢顯示局灶性包膜下壞死和陰性C4d,且無排斥反應的證據，與HAT一致（圖38E-圖38F）。
使用新型經基因修飾的豬器官的OLTx的這些資料一起表明：減少的再灌注損傷，減少的RBC消耗，以及首次在不進行脾切除術或不使用CVF的情況下無抗體介導的排斥反應的存活。不存在明顯的排斥反應表明，這種豬品系適合於進一步的OLTx研究。
肝臟異種灌注。
成功進行異種豬肝臟移植的障礙包括預先形成的異種抗體的超急性排斥反應、導致補體失調的分子不相容性、凝血以及先天性和適應性免疫。經基因修飾的豬可以避開這些障礙，並且將需要快速有效的模型來評價不同基因構建體的有效性。在這裡，使用以人血液和血漿（hWB+P）灌注的野生型（WT）和經基因修飾的豬肝臟的離體肝臟異種灌注（EVLXP）報告初步結果。
簡而言之，研究了來自豬2.0（EG組，n = 3）、WT（n = 2）和GTKO.hCD55（n = 4）肝臟的肝臟。在37ºC下用新鮮的肝素化hWB+P進行EVXLP。EVXLP期間的失敗被定義為由於血管阻力升高、嚴重代謝紊亂或嚴重壞死引起的血流減少。進行了CBC、血清臨床化學和血氣分析。將組織活檢用H+E並針對IgG、IgM和補體的沉積（C4d）染色。
所有組均表現出進行性血流減少，同時血管阻力相應上升。與EG肝臟相比，WT和GTKO.CD55中的血流動力學惡化更早發生並且進展更快（圖39A-圖39B），並且與更長的EG肝臟存活相關。WT的平均肝臟存活為5小時（範圍為5-7小時），GTKO.CD55為4.5小時（範圍為4-6小時）並且在EG肝臟中為13小時（範圍為11-14小時）。在所有組中，血小板和嗜中性粒細胞快速減少，其中對WT觀察到最大的損失，但差異未達到統計學顯著性（圖39C-圖39D）。RBC計數對於EG在整個灌注過程中被保持，並顯著高於WT肝臟，並且傾向于高於GTKO.CD55（圖39E）。
EG肝臟組織活檢基於H+E表現出保留的肝構造，伴有輕度彌漫性門脈和竇狀炎症（圖41A）。WT肝臟基於H+E表現出局灶性缺血性壞死和淤血（圖41E），伴有針對IgM和IgG的強染色（圖41F-圖41G）和C4d陽性（圖41H）。相比之下，EG肝臟顯示出彌漫性輕度竇狀IgG和IgM沉積（圖41B-圖41C），伴有陰性C4d（圖41D），這可能表明預先形成的抗原的減少和通過增加人補體調節蛋白表現來改善補體調節導致了較少的損傷。
與WT或GTKO.CD55異種移植物相比，缺乏異種特異性抗原並含有與補體啟動和免疫細胞功能相關的人源化基因轉殖的來自基因轉殖豬的異種肝臟實現了顯著延長的存活，以及不太嚴重的血小板封存、保持的RBC品質以及減少的抗體和補體沉積。此模型是類比豬到人異種移植並評價特定基因修飾的功效的有效資訊工具。
肺異種灌注。
用人血進行離體肺灌注是評價基因轉殖組合的影響的標準化方法。在這裡報告了在參考群組的情況下評價的與新穎基因轉殖豬系相關的結果。
簡而言之，用新鮮收集的肝素化人血離體灌注來自豬的八對肺，所述豬具有組合的Gal1,3αGal、β4Gal和Neu5Gc敲除（TKO），並且含有解決補體啟動中的分子不相容性以及先天性和適應性免疫細胞功能的人基因轉殖。GalTKO.hCD55肺作為參考組。在來自每頭豬的成對肺中，使血液保持“未被處理”（對於豬2.0，n = 5，且對於參考，n = 3），或者血液被1-BIA（一種血栓素合酶抑制劑和組胺受體阻滯劑）“處理”（對於豬2.0，n = 7；對於參考，n = 4）。在預定時間點收集組織和血液樣品，並且如果肺沒有提前衰竭，則在灌注8小時後選擇性地終止實驗。
豬2.0肺的中位存活時間在未處理組中為450 min（範圍為300-480 min）與參考肺的30 min（範圍為20-300 min）（P = 0.04），並且在經處理群組中為480 min（範圍為360-480 min）與300 min（範圍為145-360 min）（P = 0.009）。相對於GalTKO.hCD55肺，‘未處理’豬2.0肺中的肺血管阻力（PVR）上升明顯減弱和延遲（圖42）。在豬2.0和參考組兩者中，使用1-BIA和H-阻滯劑的另外的血液處理減弱了PVR上升。嗜中性粒細胞和血小板封存通常發生在灌注的5-15 min內，並且與豬2.0多基因轉殖肺相關未減弱。
這些資料表明，新穎豬2.0供體遺傳學保護肺免受PVR上升和肺損傷的影響，並且在此嚴格模型中與顯著改善的肺存活相關。如先前關於其他肺遺傳學所描述，白細胞（Leukocyte）和白細胞（white cell）封存並沒有被阻止。由豬2.0肺表現的基因轉殖組合可能有助於成功完成肺和其他器官的異種移植。
基因轉殖表現。
RNAseq表現資料顯示補體和細胞毒性基因在從有效載荷9和有效載荷10豬2.0豬收集的樣品中表現（圖36）。FACS資料顯示補體和細胞毒性蛋白在從有效載荷5、有效載荷9和有效載荷10豬收集的樣品中表現（圖37）。所有三個有效載荷均表現補體（CD46、CD55和CD59）和細胞毒性相關蛋白（例如，B2M、HLA-E、CD47）。此外，有效載荷5表現CD39，而有效載荷10表現PDL1。儘管在NHP中的表現差異很大，但在五頭攜帶有效載荷5的豬之間基因表現譜是相似的。
除非另外明確指出，否則在本申請案中指定的數值的使用表述為在規定範圍內指定的最小值和最大值的近似值，並且放在單詞“約”之後。範圍的公開文本旨在作為連續的範圍，包括所列舉的最小值與最大值之間的每個值以及可以通過此類值形成的任何範圍。本申請案中提出的數值表示本公開文本的各種實施例。
本公開文本並不旨在窮舉或將本技術限制為本文公開的精確形式。儘管出於說明性目的本文公開了特定實施例，但如相關領域的普通技術人員將認識到的，在不脫離本技術的情況下，各種等效修改是可能的。在一些情況下，未詳細示出和/或描述熟知的結構和功能，以避免不必要地使本技術的實施例的描述模糊。儘管方法的步驟可以以特定順序在本文中呈現，但在替代實施例中，所述步驟可以具有另一種合適的順序。類似地，在特定實施例的情況下公開的本技術的某些實施例可以在其他實施例中被組合或消除。此外，雖然與某些實施例相關的優點可能已在那些實施例的情況下公開了，但其他實施例也可以表現出此類優點，並且並非所有實施例都需要表現出此類優點或本文公開的其他優點，以落入本技術的範圍內。因此，本公開文本和相關技術可以涵蓋本文未明確示出和/或描述的其他實施例。
根據上述內容應瞭解，本公開文本的特定實施例已出於說明目的在本文中描述，但可以在不背離本公開文本的範圍的情況下進行各種修改。因此，除了所附申請專利範圍外，本公開內容不受限制。
雖然已討論了主題公開文本的多個具體實施例，但是以上說明書是說明性的並且不是限制性的。通過回顧本說明書和以下申請專利範圍，本公開文本的多種變型對於本領域的技術人員而言將變得明顯。應通過參考申請專利範圍、連同它們的等效物的全部範圍、以及說明書、連同此類變化，確定本公開文本的全部範圍。
縮寫
急性血管排斥反應（AVR）；啟動部分促凝血酶原激酶時間（APTT）；腺相關病毒整合位點1（AAVS1）；丙胺酸轉胺酶（ALT）；白蛋白（ALB）；α1,3-半乳糖基-半乳糖（Gal或αGal）；抗體介導的排斥反應（AMR）；抗胸腺細胞球蛋白（ATG）；脫唾液酸糖蛋白受體1（ASGR1）；天門冬胺酸轉胺酶（AST）；β1,4 N-乙醯半乳糖胺基轉移酶2（B4GalNT2）；β-2微球蛋白（B2M）；分化簇39（CD39）；分化簇47（CD47）；成簇規律間隔短回文重複序列（CRISPR）；II類反式啟動顯性負性（CIITA-DN）；CMV早期增強子/雞β肌動蛋白（CAG）；補體因子3（C3）；補體因子3敲除（C3-KO）；全血細胞計數（CBC）；C-X-C基序趨化因子受體3（CXCR3）；C-X-C基序趨化因子受體12（CXCR12）；胞苷單磷酸-N-乙醯神經胺酸羥化酶（CMAH）；細胞毒性T淋巴細胞相關免疫球蛋白（CTLA-Ig）；去氧核糖核酸（DNA）；DQα（DQA）；DRα（DRA）；液滴數字式pCR（ddPCR）；外-5'核苷酸酶（CD73）；延伸因子1α（EF1α）；內皮細胞（EC）；內皮蛋白C受體（EPCR）；離體肝臟異種灌注（EVLXP）；Fas配體（FasL）；纖維蛋白原水準（FIB）；螢光啟動細胞分選（FACS）；新鮮冷凍血漿（FFP）；綠色螢光蛋白（GFP）；腎小球濾過率（GFR）；胰高血糖素樣肽1受體（GLP-1R）；糖蛋白IIb/IIIa（GpIIb/IIIa）；糖蛋白α-半乳糖基轉移酶1（GGTA）；GGTA敲除（GTKO）；指導核糖核酸（gRNA）；蘇木精和曙紅（H+E）；肝動脈血栓形成（HAT）；人胚胎腎臟293（HEK293）；血紅素加氧酶（HO-1）；同源定向修復（HDR）；人血液和血漿（hWB+P）；人膜輔因子蛋白（hCD46）；人補體衰變加速因子（hCD55）；人補體調節蛋白（hCRP）；人白細胞抗原（HLA）；人白細胞抗原-E（HLA-E）；人MAC抑制因子（hCD59）；免疫球蛋白G（IgG）；釀膿鏈球菌的免疫球蛋白G降解酶（IdeS）；免疫球蛋白M（IgM）；免疫組織化學（IHC）；肌苷單磷酸脫氫酶（IMDH）；白介素12（IL12）；白介素35（IL35）；國際標準化比率（INR）；細胞內粘附分子-2（ICAM2）；殺傷抑制受體（KIR）；敲入（KI）；敲除（KO）；Krüppel相關盒（KRAB）；肝臟功能測試（LFT）；長末端重複序列（LTR）；主要組織相容性複合物I類（MHC I類）；主要組織相容性複合物II類（MHC II類）；主要組織相容性複合物I類E單鏈三聚體（HLA-ESCT）；雷帕黴素（mTOR）的機制性靶標；信使核糖核酸（mRNA）；腎病飲食改進（MDRD）；混合淋巴細胞反應（MLR）；黴酚酸酯（MMF）；自然殺傷（NK）；N-羥乙醯神經胺酸（Neu5Gc）；神經源性分化1（NeuroD）；非人靈長類動物（NHP）；非同源末端連接（NHEJ）；原位肝臟異種移植（OLTx）；群體反應性抗體（PRA）；外周血單核細胞（PBMC）；豬腎臟-15細胞（PK15）；豬內源性逆轉錄病毒（PERV）；豬內源性逆轉錄病毒敲除（PERV KO）；程式性死亡配體1（PD-L1）；聚合酶鏈反應（PCR）；豬主動脈內皮細胞株（PEC-A或pAEC）；鉀（K）；凝血酶原時間（PT）和國際標準化比率（PT-NIR）；定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）；重組酶介導的盒交換（RMCE）；紅細胞（RBC）；核糖核酸測序（RNAseq）；逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCT）；sgRNA（單指導RNA）；小干擾核糖核酸（siRNA）；鈉（Na）；體細胞核移植（SCNT）；超氧化物歧化酶3（SOD3）；豬白細胞抗原（SLA）；T細胞介導的排斥反應（TCMR）；凝血酶-抗凝血酶III（TAT）；血栓調節蛋白（THBD、TBM或TM）；血栓性微血管病（TMA）；組織因子途徑抑制劑（TFPI）；拓撲異構酶（TOPO）；總膽紅素（Tbili）；轉錄啟動因子樣（TAL）效應子和核酸酶（TALEN）；腫瘤壞死因子α誘導的蛋白3（A20）；腫瘤壞死因子受體1免疫球蛋白（TNFR1-Ig）；泛在染色質開放元件（UCOE）；血管性血友病因子（vWF）；全基因組測序（WGS）；野生型（WT）；鋅指核酸酶（ZFN）。
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序列
| SEQ ID NO | 序列 |
| 1 | tcaacacaaacatatctttg |
| 2 | tgtttgtgttgatacgtcag |
| 3 | gaaactgactaggatccatg |
| 4 | ctcagtgggttaactatccg |
| 5 | tctcacctgtgaagcctgcg |
| 6 | cacagtgacttgggccacta |
| 7 | tctcacctgtgaagcctgcgcgg |
| 8 | cacagtgacttgggccactaggg |
| 9 | tcctcctgcagtcactgtgatgg |
| 10 | ggtgccccccacagaaggcccgg |
| 11 | cagccccaccacaccctacgagg |
| 12 | cttcttctgcagcaaacttctgg |
| 13 | cggctctgacaagctgtccgagg |
| 14 | cgaggccctgaaggtcttcgtgg |
| 15 | ctcccagaagcacatccgcgtgg |
| 16 | ccacgcctacatctcgctccagg |
| 17 | gaaagcggccctcggagctgcgg |
| 18 | cgccagccaggtgaagtacgcgg |
| 19 | cgaggtggcttccatcagcgagg |
| 20 | tacacgctcttccaaatctttgg |
| 21 | ccgtatagccctgctgctcatgg |
| 22 | cagccaggagccacgccggctgg |
| 23 | gaacttggcccgctacctccagg |
| 24 | gaagaaggtcaccgtgattccgg |
| 25 | gatccgcctcatcgagaagcagg |
| 26 | cccggagaacaaagcctttgtgg |
| 27 | ctacctctgcgacctcgccccgg |
| 28 | ccctacgcggcgccccctagtgg |
| 29 | actgtggcgcctgagctccccgg |
| 30 | gctcgaacccaagaagagaatgg |
| 31 | atcacagtgactgcaggaggagg |
| 32 | cggttccgcgcaggcttcacagg |
| 33 | ctgaccgggccttctgtgggggg |
| 34 | cctcctcgtagggtgtggtgggg |
| 35 | aagtcgtgcagcggcggctctgg |
| 36 | agccgtccagcaggaagaccagg |
| 37 | cagggcctcgaagtcggcctcgg |
| 38 | tgtgcttctgggagatgtgcagg |
| 39 | ggtactccaccaccgccacgcgg |
| 40 | ctggagcgagatgtaggcgtggg |
| 41 | gcagctccgagggccgctttcgg |
| 42 | gcccgcgtacttcacctggctgg |
| 43 | gtacttcaaaacctcgctgatgg |
| 44 | ggtcgaccctgccaaagatttgg |
| 45 | agggctatacgggaggcttcggg |
| 46 | cagccggcgtggctcctggctgg |
| 47 | gaggtagcgggccaagttctggg |
| 48 | cggtgaccttcttcttcttcagg |
| 49 | acgtggggtccgatgcccaccgg |
| 50 | cgatgaggcggatctgcttgagg |
| 51 | cacaaaggctttgttctccgggg |
| 52 | cttccggggcgaggtcgcagagg |
| 53 | agggggcgccgcgtaggggcggg |
| 54 | ctcaggcgccacagtgacttggg |
| 55 | gttcgagcgttgaaaccccgggg |
| 56 | atccaagaccattctcttcttgg |
| 57 | accatcacagtgactgcaggagg |
| 58 | gacaccatcacagtgactgcagg |
| 59 | ctgtgaagcctgcgcggaaccgg |
| 60 | ggggggcaccggttccgcgcagg |
| 61 | agggtgtggtggggctgaccggg |
| 62 | gaaccggtgccccccacagaagg |
| 63 | gggccttctgtggggggcaccgg |
| 64 | gctgaccgggccttctgtggggg |
| 65 | tcctcctcgtagggtgtggtggg |
| 66 | ggctgaccgggccttctgtgggg |
| 67 | gtcctcctcgtagggtgtggtgg |
| 68 | gggctgaccgggccttctgtggg |
| 69 | cgtgtcctcctcgtagggtgtgg |
| 70 | ggggctgaccgggccttctgtgg |
| 71 | tagggtgtggtggggctgaccgg |
| 72 | tctggcgtgtcctcctcgtaggg |
| 73 | cagaagaagtcgtgcagcggcgg |
| 74 | ctctggcgtgtcctcctcgtagg |
| 75 | ctgcagaagaagtcgtgcagcgg |
| 76 | ctgcagcaaacttctggacctgg |
| 77 | tctggacctggtcttcctgctgg |
| 78 | gacctggtcttcctgctggacgg |
| 79 | gctgtccgaggccgacttcgagg |
| 80 | ggtcttcgtggtgggcatgatgg |
| 81 | gcttgtcagagccgtccagcagg |
| 82 | ggccgacttcgaggccctgaagg |
| 83 | gaccttcagggcctcgaagtcgg |
| 84 | gcccaccacgaagaccttcaggg |
| 85 | ggccctgaaggtcttcgtggtgg |
| 86 | gccctgaaggtcttcgtggtggg |
| 87 | tgcccaccacgaagaccttcagg |
| 88 | cgccacgcggatgtgcttctggg |
| 89 | tgtaggcgtgggagccgtcgtgg |
| 90 | ccgagggccgctttcggtcctgg |
| 91 | ccagaagcacatccgcgtggcgg |
| 92 | gaagcacatccgcgtggcggtgg |
| 93 | gcacatccgcgtggcggtggtgg |
| 94 | gcggtggtggagtaccacgacgg |
| 95 | tctcgctccaggaccgaaagcgg |
| 96 | gctgcggcgcatcgccagccagg |
| 97 | gaagtacgcgggcagcgaggtgg |
| 98 | tcggtcctggagcgagatgtagg |
| 99 | gcgatgcgccgcagctccgaggg |
| 100 | cgctgcccgcgtacttcacctgg |
| 101 | ggcgatgcgccgcagctccgagg |
| 102 | gccagccaggtgaagtacgcggg |
| 103 | ggtgaagtacgcgggcagcgagg |
| 104 | cgctcttccaaatctttggcagg |
| 105 | gctcttccaaatctttggcaggg |
| 106 | aaatctttggcagggtcgaccgg |
| 107 | ctatacgggaggcttcgggccgg |
| 108 | ctggctggccatgagcagcaggg |
| 109 | aagttctgggccagccggcgtgg |
| 110 | cttcaggccctggaggtagcggg |
| 111 | tccgatgcccaccggaatcacgg |
| 112 | atctgcttgaggctgacgtgggg |
| 113 | gggcctgcttctcgatgaggcgg |
| 114 | gtccacaccgctgaccacaaagg |
| 115 | cagggctatacgggaggcttcgg |
| 116 | gagcagcagggctatacgggagg |
| 117 | catgagcagcagggctatacggg |
| 118 | cctgctgctcatggccagccagg |
| 119 | acgccggctggcccagaacttgg |
| 120 | ccagggcctgaagaagaagaagg |
| 121 | accgtgattccggtgggcatcgg |
| 122 | tggccagccaggagccacgccgg |
| 123 | gggccagccggcgtggctcctgg |
| 124 | gggccaagttctgggccagccgg |
| 125 | tcttcttcttcaggccctggagg |
| 126 | ggaggtagcgggccaagttctgg |
| 127 | aacttggcccgctacctccaggg |
| 128 | tcttcaggccctggaggtagcgg |
| 129 | gaaggtcaccgtgattccggtgg |
| 130 | aaggtcaccgtgattccggtggg |
| 131 | gatctgcttgaggctgacgtggg |
| 132 | ccggggcctgcttctcgatgagg |
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| 134 | aacaaagcctttgtggtcagcgg |
| 135 | accacaaaggctttgttctccgg |
| 136 | agcctttgtggtcagcggtgtgg |
| 137 | ggtcagcggtgtggacgagctgg |
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| 141 | cagtgacttgggccactaggggg |
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| 144 | cgtaggggcgggcacttccgggg |
| 145 | gcgtaggggcgggcacttccggg |
| 146 | cgcgtaggggcgggcacttccgg |
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| 150 | gctcaggcgccacagtgacttgg |
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| 152 | ctgtggcgcctgagctccccggg |
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| 159 | ggaggcccacgaagggcaagggg |
| 160 | tgcctagcatctcgtgcccctgg |
| 161 | cacccccaacgtcctgcgtctgg |
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| 163 | acgaagggcaaggggatattcgg |
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| 165 | cctgagcaccgtcaacatcaagg |
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無
圖1A-圖1C是顯示補體因子3敲除（“C3-KO”）豬的基因分型結果的圖表。圖1A示出了引入的缺失的大小。圖1B示出了插入缺失的位置。圖1C列出了產生的插入缺失的序列（SEQ ID NO: 253-289）。
圖2是描述主要組織相容性複合物I類（“MHC I類”）替代策略的方案的框圖，其中含有SLA-1、SLA-2和SLA-3基因的基因座側接有loxP位點。
圖3A和圖3B是顯示主要組織相容性複合物（MHC）II類敲除（“MHCII-KO”）豬基因型，特別是MHCII基因DQA的基因分型結果的圖表。圖3A示出了在擴增子的位置126和位置127中具有兩個1bp插入的插入缺失的位置和大小。圖3B示出了插入之一的位置。
圖4A和圖4B是顯示另一種MHC II類-KO豬基因型，特別是MHCII基因DRA的基因分型結果的圖表。圖4A示出了在擴增子的位置106和位置107中具有1兩個bp插入的插入缺失的位置和大小。圖4B示出了插入（SEQ ID NO: 290-327）之一的位置。
圖5包括六個圖表，示出了MHCII-KO豬（“H3-9P01”）和野生型（“WT”）豬的螢光輔助細胞分選（FACS）分析結果。
圖6是描繪與MHCII-KO表型相關的一個或多個表型的一系列圖像。
圖7是示出用於改變PD-L1基因的方案的一系列框圖。
圖8是示出如使用兩個擴增子通過qPCR所測量的PD-L1表現的圖表。
圖9是示出豬（SEQ ID NO: 329）和人（SEQ ID NO: 328）vWF蛋白的比對的序列表。A1結構域在方框中突出顯示，而側翼區域中的潛在糖基化位點則用劃線標記。pvWF中缺失的人特有殘基用水平線標記。被人源化的A1和側翼區域用半括弧標記。
圖10描繪了靶向pvWF和兩個sgRNA（SEQ ID NO: 5和6）的同源性定向修復（“HDR”）載體的設計。
圖11示出了經由SphI和BspEI消化對HDR的篩選結果。
圖12A和圖12B示出了從圖11獲得的雙等位基因HDR克隆（其中vWF被靶向）的測序結果（SEQ ID NO: 330-333）。兩個測序結果的色譜圖用一行重疊序列說明。人源化A1和側翼區域用半括弧標記。
圖13是描繪通過剪切應力誘導並通過光透射監測從WT（豬A1結構域）或HDR靶向（人A1結構域）豬分離的血小板的物種特異性血小板聚集反應的圖。
圖14是豬MHC I類基因座的示意圖。所有經典的MHCI基因均用顏色編碼。緊鄰MHCI基因的UTR的獨特側翼區域被標記為綠色括弧。還示出了選自這些區域的四個高活性sgRNA（SEQ ID NO: 1-4）。
圖15描繪了使用圖14中的sgRNA誘導的MHCI經典簇的片段缺失。圖15A示出了sgRNA轉染的細胞群體中MHCI 5'、3'和5'-3'缺失連接的獨特區域的PCR擴增子。圖15B示出，對5'-3'連接PCR進行TOPO克隆，並且將測序結果與由MHC5'_sg1和MHC3'_sg2產生的預計MHCI 5'-3'連接比對（SEQ ID NO: 335-343）。
圖16示出了使用豬特異性SLA-1抗體富集MHCI陰性細胞。
圖17示出了根據本文公開和描述的實施例，用於表現多個基因轉殖（例如人源化基因轉殖）的基因轉殖表現載體。有效載荷5（豬2.1）：12個基因轉殖，泛在表現。
圖18示出了根據本文公開和描述的實施例，用於表現多個基因轉殖（例如人源化基因轉殖）的基因轉殖表現載體。有效載荷9（豬2.2）：12個基因轉殖，內皮特異性。
圖19示出了根據本文公開和描述的實施例，用於表現多個基因轉殖（例如人源化基因轉殖）的基因轉殖表現載體。有效載荷10（豬2.3）：12個基因轉殖，內皮/胰島特異性。
圖20示出了根據本文公開和描述的實施例，用於表現多個基因轉殖（例如人源化基因轉殖）的基因轉殖表現載體。有效載荷10-Exo（豬2.4）：12個基因轉殖，內皮/胰島特異性，進行胰腺外分泌消融。
圖21是示出本文所述的基因工程來源供體豬的系譜的示意圖。
圖22表明，與人組織的相容性增強的基因工程豬成纖維細胞顯示出對人抗體的結合親和力顯著降低。
圖23展示了來自本文所述的基因工程豬原代成纖維細胞或內皮細胞的組織特異性mRNA表現。圖23A是使用分子克隆技術組裝的基因轉殖構建體的示意圖。將CD46、CD55和CD59盒置於泛在EF1α啟動子的控制下，將HLA-E、B2M和CD47盒置於泛在CAG啟動子的控制下，將A20、PD-L1、HO-1盒置於胰島特異性NeuroD啟動子的控制下，並將THBD、TFPI和CD39盒置於內皮特異性ICAM2啟動子的控制下。將基因轉殖構建體電穿孔至豬原代成纖維細胞（圖23B）或永生化的豬主動脈內皮細胞株（PEC-A）（圖23C）中，並通過qRT-PCR確定mRNA表現。
圖24描繪了豬2.0（“3KO+12TG”）脾和成纖維細胞中的基因轉殖蛋白表現。
圖25表明，與人細胞相容性增強的基因工程豬成纖維細胞表現出明顯較低水準的補體介導的細胞死亡。
圖26表明，經基因工程化以表現人HLA-E的豬成纖維細胞表現出對NK介導的裂解的敏感性降低。
圖27表明，源自GGTAKO + CD55KI豬的內皮細胞表現出凝血酶-抗凝血酶III（TAT）複合物的形成減少。
圖28表明，與野生型（WT）肝臟相比，從4-7頭豬分離並灌注人血的肝臟具有增加的膽汁產生。
圖29表明，與WT肝臟相比，如通過肝臟損害和血清電解質水準的標記所評估，從4-7頭豬分離並灌注人血的肝臟具有改善的肝臟功能。
圖30表明，與WT肝臟相比，從4-7頭豬分離並灌注人血的肝臟具有改善的凝血。
圖31示出了根據本文公開和描述的實施例的基因轉殖表現載體。有效載荷13（豬2.5）：10個基因轉殖，雙順反子。
圖32A-圖32B表明，移植有從有效載荷9（圖32A）和有效載荷10（圖32B）供體豬分離的腎臟的宿主猴子表現出穩定的血清肌酐水準。
圖33A-圖33B示出了移植有從有效載荷9（圖33A）和有效載荷10（圖33B）供體豬分離的腎臟的宿主猴子中的血細胞比容水準。
圖34A-圖34B示出了移植有從有效載荷9（圖34A）和有效載荷10（圖34B）供體豬分離的腎臟的宿主猴子中的血小板計數。
圖35A-圖35B示出了移植有從有效載荷9（圖35A）和有效載荷10（圖35B）供體豬分離的腎臟的宿主猴子中白細胞（WBC）計數的波動。
圖36示出了RNAseq表現資料，其顯示補體和細胞毒性基因在從有效載荷9和有效載荷10豬收集的樣品中表現。
圖37示出了FACS資料，其顯示在從有效載荷5、有效載荷9和有效載荷10豬收集的樣品中表現的補體和細胞毒性蛋白。
圖38A-圖38I示出了豬到狒狒原位肝臟異種移植（OLTx）後的臨床實驗室。
圖39A-圖39F是來自OLTx的H+E染色肝臟樣品的代表性圖像。
圖40A-圖40E展示了用人全血對經基因修飾的豬肝臟進行離體異種灌注後的臨床實驗室。
圖41A-圖41H是異種灌注豬肝臟的H+E染色的代表性圖像。
圖42表明，相對於GalTKO.hCD55肺，在灌注了人血的‘未處理’豬2.0（“3KO+12TG”）肺中，肺血管阻力（PVR）的上升顯著減弱和延遲。
圖43A-圖43D展示了一組人血清與人T細胞（圖43A）和B細胞（圖43C）的結合，表明高PRA血清比低PRA更可能染色人細胞，以及一組人血清與豬T細胞（圖43B）和B細胞（圖43D）的結合。來自低PRA患者和高PRA患者兩者的血清均顯示出與豬靶標的高水準結合。
圖44示出了一組高PRA人血清，與野生型細胞（WT pAEC）相比，其顯示出與經基因修飾的豬主動脈內皮細胞（豬2.0（“3KO+12TG”）pAEC）的結合水準顯著降低。所述豬2.0細胞缺少aGal、Neu5Gc和Sda。
圖45A-圖45C展示了用在不同時間點取自異種移植接受者動物的腎臟（圖45A）、心臟（圖45B）和肝臟（圖45C）的血清對豬2.0（“3KO+12TG”）pAEC的染色。移植後採集的血清樣品顯示出降低的結合水準，尤其是肝臟異種移植後。
圖46A-圖46C展示了人血清與野生型（WT）和豬2.0（“3KO+12TG”）pAEC的結合（圖46A），人血清（圖46B）或食蟹猴血清（圖46C）在IdeS處理前後與pAEC的結合。IdeS有效減少人和食蟹猴IgG結合，而對完整IgM的結合沒有影響。
圖47示出了根據本文公開和描述的實施例的基因轉殖表現載體（SEQ ID NO: 344和345）。有效載荷12F：12個基因轉殖。
圖48示出了根據本文公開和描述的實施例的基因轉殖表現載體。有效載荷12G：12個基因轉殖。
圖49示出了根據本文公開和描述的實施例的基因轉殖表現載體。有效載荷13A：10個基因轉殖。
圖50示出了RNAseq結果，表明補體和細胞毒性基因的表現。
圖51A示出了CRISPR基因敲除和PiggyBac整合的方案。將靶向2個拷貝的GGTA1基因、2個拷貝的CMAH基因和4個拷貝的B4GALNT2基因的CRISPR/Cas9用於產生3KO，並且將靶向豬2.0（“3KO+9TG”）中PERV拷貝的CRISPR/Cas9用於產生PERV-KO細胞。將PiggyBac介導的隨機整合用於將9個基因轉殖插入豬基因組中。所述基因轉殖在3個盒中表現，其中每個盒表現通過豬2A（P2A）肽連接的3個基因。
圖51B示出了GGTA1（SEQ ID NO: 346-348）、CMAH（SEQ ID NO: 349-351）和B4GALNT2（SEQ ID NO: 352-356）敲除的測序結果。全基因組測序分析揭示，在豬2.0（3KO+9TG）和豬3.0（3KO+9TG）中，i) GGTA1基因在一個等位基因中具有-10 bp缺失，並且在另一個基因中具有基因轉殖載體插入，ii) CMAH基因在一個等位基因中具有-391 bp缺失，並且在另一個等位基因中具有2bp（AA）插入，以及iii) B4GALNT2在B4GALNT2基因的4個等位基因的每一個中具有-13、-14、-13、-14。所有修飾均發生在gRNA靶位點處，表明所述修飾是由所使用的CRISPR/Cas9的靶活性介導的。
圖51C示出了PERV敲除的測序分析結果。豬2.0（3KO+9TG）（約2,000X）和3.0（約20,000X）的原始讀段在示意性PERV基因結構下方示出。讀段按其序列組成分組，並按其覆蓋度成比例地示出。覆蓋度軌跡中紅色、藍色、綠色和橙色的垂直線分別表示從參考等位基因到T、C、A、G的單個核苷酸變化。
圖51D示出了9TG整合的PCR分析。豬2.0（3KO+9TG）和豬3.0（3KO+9TG）的基因轉殖整合已通過PCR在基因組DNA（gDNA）水準上得到驗證。PCR凝膠圖像顯示，來自豬2.0和豬3.0胎兒成纖維細胞的gDNA中存在9個人基因轉殖，而WT豬胎兒成纖維細胞和NTC（不添加gDNA）組用作陰性對照。
圖51E示出了豬2.0（3KO+9TG）和3.0（3KO+9TG）細胞的正常核型。使用基於Giemsa染色的G帶技術對豬2.0（A）和豬3.0（B）成纖維細胞進行核型分析。使用SmartType軟體分析中期擴散。豬2.0和豬3.0兩者均顯示正常的[36 + XY]核型。
圖52A示出了9個基因轉殖的表現的熱圖。通過RNA-Seq在HUVEC內皮、PUVEC內皮、豬2.0（3KO+9TG）PUVEC內皮、豬2.0耳成纖維細胞和豬3.0胎兒成纖維細胞中測量基因轉殖表現。每行表示一個基因轉殖，並且每列表示一個樣品。表現水準用藍色-黃色-紅色進行著色編碼，以表示低-中-高。每個樣品的組織類型和有效載荷資訊在熱圖的頂部標記為顏色條。
圖52B示出了通過FACS對3KO和9TG表現的分析。豬2.0（3KO+9TG）和豬3.0（3KO+9TG）的基因修飾（KO和TG）已通過FACS在蛋白質水準上得到驗證。除了hCD39（高於人內源性）和hTHBD（低於人內源性）之外，豬2.0和豬3.0 PUVEC總體上顯示與人內源性（HUVEC）相當的TG表現水準。
圖52C示出了3KO和9TG表現的免疫螢光分析。豬2.0（3KO+9TG）和豬3.0（3KO+9TG）的基因修飾（KO和TG）已通過免疫螢光（IF）在腎臟冷凍切片中在蛋白質水準上得到驗證。
圖53A示出了人抗體與豬2.0（3KO+9TG）和3.0（3KO+9TG）細胞的結合。與它們的WT對應物相比，豬2.0和豬3.0 PUVEC實質上減弱了抗體與人IgG和IgM的結合。通過FACS分別測量合併的人血清與PUVEC和HUVEC（陽性對照）的抗體結合。誤差條表示平均值± s.d。（n = 3）。
圖53B示出了對WT豬、豬2.0（3KO+9TG）、豬3.0（3KO+9TG）和HUVEC細胞的補體毒性。與HUVEC相比，豬2.0和豬3.0 PUVEC顯示出相當的抗體依賴性補體毒性，其與WT PUVEC相比明顯更低。誤差條表示平均值±s.d。（n = 4）。
圖53C示出了對WT豬、豬2.0（3KO+9TG）、豬3.0（3KO+9TG）和HUVEC細胞的NK介導的細胞毒性。與它們的WT對應物相比，豬2.0和豬3.0 PUVEC顯示出顯著降低的NK介導的細胞毒性。誤差條表示平均值±s.d。（n = 3）。
圖53D示出了人巨噬細胞對豬2.0（3KO+9TG）和3.0（3KO+9TG）脾細胞的吞噬作用。豬2.0和豬3.0脾細胞顯示出人巨噬細胞株的吞噬作用降低。將CFSE標記的豬2.0和豬3.0脾細胞（靶細胞，T）分別與CD11b標記的人巨噬細胞株（效應細胞，E）在37ºC下孵育4小時。以2種不同的E : T比進行，即1 : 1和1 : 5。CFSE標記的靶標的吞噬作用通過FACS進行測量，其中非吞噬巨噬細胞的區域在左上象限（Q1）中示出，而吞噬巨噬細胞的區域在右上象限（Q2）中示出。吞噬活性計算為Q2/(Q1+Q2) x 100%。
圖53E示出了WT豬、豬2.0（3KO+9TG）、豬3.0（3KO+9TG）和HUVEC細胞的凝血酶-抗凝血酶（TAT）形成的水準。在與全人血孵育指定的時間後，豬2.0和豬3.0 PUVEC介導非常低水準的凝血酶-抗凝血酶（TAT）形成，其與HUVEC相當，但顯著低於WT PUVEC。誤差條表示平均值± s.d。（n = 4）。
圖53F示出了CD39基因轉殖的ADP酶活性。與WT PUVEC和HUVEC相比，豬2.0（3KO+9TG）和豬3.0（3KO+9TG）PUVEC顯示出明顯更高的CD39 ADP酶生化活性。(A) 在豬2.0和豬3.0中，人基因轉殖CD39 mRNA的表現高於內源性CD39。(B) FACS揭示，豬2.0和豬3.0具有高於WT PUVEC和HUVEC的人CD39蛋白表現。(C) 當與ADP孵育時，豬2.0和豬3.0 PUVEC具有明顯較高的CD39的ADP酶生化活性，如通過磷酸鹽濃度所測量。較高的CD39 ADP酶生化活性與其在豬2.0和豬3.0中較高的CD39蛋白表現水準一致。誤差條表示標準差（n = 6）。
圖53G示出了3.0細胞中的TFPI功能。在體外，啟動的豬2.0（3KO+9TG）和豬3.0（3KO+9TG）PUVEC在細胞表面上表現人TFPI，並且與WT PUVEC和HUVEC相比，顯示出顯著更高的與人Xa的結合能力。(A) RNA-Seq揭示，豬2.0 PUVEC表現的人TFPI多於TFPI在HUVEC中的內源性水準以及WT PUVEC中的豬TFPI水準（n = 2）。(B) 在體外，與WT PUVEC和HUVEC相比，啟動的豬2.0 PUVEC顯示出顯著更高的Xa結合能力。左圖：標準曲線測量人重組TFPI（rTFPI）蛋白濃度與未結合的Xa水準之間的線性回歸。右圖：使用左側的標準曲線從未結合的Xa水準投影的tTFPI水準測量了在進行和未進行PMA啟動的情況下，豬2.0 EC、WT PUVEC和HUVEC中的TFPI Xa結合能力。PMA（1 μM）：PUVEC和HUVEC被PMA啟動6小時，這導致hTFPI從胞質溶膠易位到細胞膜。誤差條表示標準差（n = 4）。
圖54A、圖54B、圖54C、圖54D和圖54E示出了豬1.0和2.0豬（3KO+9TG）的正常表型。在全血細胞計數（A）、肝臟（B）、心臟（C）和腎臟功能（D）以及凝血功能（E）方面，與WT豬相比，豬1.0和豬2.0顯示出相似的病理生理。豬1.0、豬2.0和WT豬的樣品數分別為18、16和21。“無顯著性（no sig）”表示通過student's t檢驗，豬1.0、豬2.0和WT組之間無統計學顯著性。
圖55示出了PERV-KO的孟德爾遺傳。PERV-KO的基因修飾可以在自然交配生產過程中遵循孟德爾遺傳學進行遺傳。x軸表示按插入的總和減去缺失的總和計算出的移位鹼基的總數。y軸表示讀段的百分比。紅色和綠色分別指示移碼或不移碼。將一頭豬1.0豬與野生型巴馬豬交配，並產生11頭仔豬。通過高通量DNA測序與親本成纖維細胞一起分析了一頭後代仔豬的肝臟、腎臟和心臟組織，以評估PERV-KO修飾的遺傳。豬1.0的PERV拷貝100%待敲除，而WT豬中約80%的PERV拷貝的大小與WT長度相同（插入-缺失= 0）。值得注意的是，WT樣品中的一些PERV拷貝可能不起作用或帶有KO。相比之下，後代豬的肝臟、腎臟和心臟僅具有約50%的PERV拷貝來攜帶敲除。組織之間的模式相似，表明PERV-KO修飾在不同組織之間遵循孟德爾遺傳學穩定地遺傳。
圖56A、圖56B和圖56C示出了9TG構建體和3KO在整個育種期間的孟德爾遺傳。如在基因組DNA（A）、mRNA（B）和蛋白質水準（C）上得到驗證，豬2.0的此疊代運算的基因修飾（3KO和9TG）可以通過自然交配生產遵循孟德爾遺傳學傳遞給下一代。我們分別將9頭WT豬與豬2.0交配，並且將11頭3KO豬與豬2.0交配，並檢測到F1後代中存在3KO和9TG。(A) 對於9TG，豬2.0 x WT豬和豬2.0 x 3KO豬的後代中的大約一半在基因組中攜帶所述基因轉殖。對於GGTA1、CMAH和B4GALNT2，豬2.0 X WT豬的後代全部為雜合敲除，並且豬2.0 X 3KO豬的後代全部為純合敲除。值得注意的是，由於包含了其高度同源的假基因，B4GALNT2被分析為具有四個等位基因。(B) 豬2.0 X 3KO豬的後代中的大約一半（5/11）在其mRNA轉錄物中攜帶對應於9TG的mRNA。(C) FACS分析驗證了豬2.0 X 3KO和豬2.0 X WT豬的3KO和9TG的遺傳為細胞表面聚糖的減少或不存在或者人蛋白的存在。
Claims (138)
- 一種經分離的細胞、組織、器官或動物，其包含選自炎症反應基因轉殖、免疫反應基因轉殖、免疫調節基因轉殖及其組合的至少兩種類型的多個基因轉殖。
- 一種包含多個基因轉殖的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述多個基因轉殖包括至少一個炎症反應基因轉殖、至少一個免疫反應基因轉殖和至少一個免疫調節基因轉殖。
- 如請求項1或2所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述炎症反應基因轉殖選自TNF α誘導的蛋白質3（A20）、血紅素加氧酶（HO-1）、分化簇47（CD47）及其組合。
- 如請求項1或2所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述免疫反應基因轉殖選自人白細胞抗原-E（HLA-E）、β-2微球蛋白（B2M）及其組合。
- 如請求項1或2中任一項所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述免疫調節基因轉殖選自程式性死亡配體1（PD-L1）、Fas配體（FasL）及其組合。
- 如請求項1或2所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述多個基因轉殖進一步包括至少一個凝血反應基因轉殖。
- 如請求項6所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述凝血反應基因轉殖選自分化簇39（CD39）、血栓調節蛋白（THBD）、組織因子途徑抑制劑（TFPI）及其組合。
- 如請求項1或2所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述多個基因轉殖進一步包括至少一個補體反應基因轉殖。
- 如請求項8所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述補體反應基因轉殖選自人膜輔因子蛋白（hCD46）、人補體衰變加速因子（hCD55）、人MAC抑制劑因子（hCD59）及其組合。
- 一種包含六個或更多個基因轉殖的經分離的細胞、組織、器官或動物，所述基因轉殖各自獨立地選自補體反應基因轉殖、凝血反應基因轉殖、炎症反應基因轉殖、免疫反應基因轉殖和免疫調節基因轉殖。
- 如請求項10所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述經分離的細胞、組織、器官或動物包含9、10、11或12個基因轉殖。
- 如請求項10所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述補體反應基因轉殖選自人膜輔因子蛋白（hCD46）、人補體衰變加速因子（hCD55）、人MAC抑制劑因子（hCD59）及其組合。
- 如請求項10所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述凝血反應基因轉殖選自分化簇39（CD39）、血栓調節蛋白（THBD）、組織因子途徑抑制劑（TFPI）及其組合。
- 如請求項10所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述炎症反應基因轉殖選自TNF α誘導的蛋白質3（A20）、血紅素加氧酶（HO-1）、分化簇47（CD47）及其組合。
- 如請求項10所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述免疫反應基因轉殖選自人白細胞抗原-E（HLA-E）、β-2微球蛋白（B2M）及其組合。
- 如請求項10中任一項所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述免疫調節基因轉殖選自程式性死亡配體1（PD-L1）、Fas配體（FasL）及其組合。
- 如請求項10-16中任一項所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述六個或更多個基因轉殖選自hCD46、hCD55、hCD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1。
- 如請求項17所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述細胞、組織、器官或動物包含hCD46、hCD55、hCD59、CD39、THBD、TFPI、A20、HO-1、CD47、HLA-E、B2M和PD-L1基因轉殖或THBD、TFPI、CD39、CD46、CD55、CD59、CD46、HO-1、A20、B2M、HLA-E SCT和CD47基因轉殖。
- 如請求項18所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其包含圖17-圖20、圖31或圖47-圖49之一中的載體。
- 如請求項10-19中任一項所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述至少六個基因轉殖是從單個基因座表現的。
- 如請求項10-20中任一項所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述至少六個基因轉殖以臨床有效水準表現。
- 如請求項10-21中任一項所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其進一步包含經基因修飾的血管性血友病因子（vWF）基因。
- 如請求項22所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述經修飾的vWF基因被人源化。
- 如請求項10-23中任一項所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其進一步包含脫唾液酸糖蛋白受體1（ASGR1）的缺失、破壞或失活。
- 如請求項1-24中任一項所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其進一步包含一個或多個碳水化合物抗原基因的缺失、破壞或失活。
- 如請求項25所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述一個或多個碳水化合物抗原基因選自糖蛋白α-半乳糖基轉移酶1（GGTA）、β1,4 N-乙醯半乳糖胺基轉移酶2（B4GalNT2）、胞苷單磷酸-N-乙醯神經胺酸羥化酶（CMAH）。
- 如請求項1-26中任一項所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述經分離的細胞、組織、器官或受試者是豬細胞、豬組織、豬器官、豬或其後代。
- 如請求項27所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述經分離的細胞、組織、器官或動物是不含PERV的豬細胞、不含PERV的豬組織或不含PERV的豬。
- 如請求項1-28中任一項所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述器官是腎臟或肝臟。
- 一種載體，其包含選自炎症反應基因轉殖、免疫反應基因轉殖、免疫調節基因轉殖及其組合的至少兩種類型的多個基因轉殖。
- 一種包含多個基因轉殖的載體，其中所述多個基因轉殖包括至少一個炎症反應基因轉殖、至少一個免疫反應基因轉殖和至少一個免疫調節基因轉殖。
- 如請求項30或31所述的載體，其中所述炎症反應基因轉殖選自TNF α誘導的蛋白質3（A20）、血紅素加氧酶（HO-1）、分化簇47（CD47）及其組合。
- 如請求項30-32中任一項所述的載體，其中所述炎症反應基因轉殖的至少部分的表現由組織特異性啟動子、泛在啟動子或其任何組合驅動。
- 如請求項33所述的載體，其中所述組織特異性啟動子是內皮特異性啟動子。
- 如請求項30或31所述的載體，其中所述免疫反應基因轉殖選自人白細胞抗原-E（HLA-E）、β-2微球蛋白（B2M）及其組合。
- 如請求項30、31或35中任一項所述的載體，其中所述免疫反應基因轉殖的至少部分的表現由泛在啟動子驅動。
- 如請求項30或31所述的載體，其中所述免疫調節基因轉殖選自程式性死亡配體1（PD-L1）、Fas配體（FasL）及其組合。
- 如請求項30或31所述的載體，其中所述多個基因轉殖進一步包括至少一個凝血反應基因轉殖。
- 如請求項38所述的載體，其中所述凝血反應基因轉殖選自分化簇39（CD39）、血栓調節蛋白（THBD）、組織因子途徑抑制劑（TFPI）及其組合。
- 如請求項38或39所述的載體，其中所述凝血反應基因轉殖的至少部分的表現由組織特異性啟動子驅動。
- 如請求項40所述的載體，其中所述組織特異性啟動子是內皮特異性啟動子。
- 如請求項41所述的載體，其中所述內皮特異性啟動子是低表現內皮特異性啟動子。
- 如請求項30或31所述的載體，其中所述多個基因轉殖進一步包括至少一個補體反應基因轉殖。
- 如請求項43所述的載體，其中所述補體反應基因轉殖選自人膜輔因子蛋白（hCD46）、人補體衰變加速因子（hCD55）、人MAC抑制劑因子（hCD59）及其組合。
- 如請求項43或44所述的載體，其中所述補體反應基因轉殖的至少部分的表現由泛在啟動子驅動。
- 一種包含六個或更多個基因轉殖的載體，所述基因轉殖各自獨立地選自補體反應基因轉殖、凝血反應基因轉殖、炎症反應基因轉殖、免疫反應基因轉殖和免疫調節基因轉殖。
- 如請求項46所述的載體，其中所述載體包含9、10、11或12個基因轉殖。
- 如請求項46所述的載體，其中所述補體反應基因轉殖選自人膜輔因子蛋白（hCD46）、人補體衰變加速因子（hCD55）、人MAC抑制劑因子（hCD59）及其組合。
- 如請求項46-48中任一項所述的載體，其中所述補體反應基因轉殖的至少部分的表現由泛在啟動子驅動。
- 如請求項46所述的載體，其中所述凝血反應基因轉殖選自分化簇39（CD39）、血栓調節蛋白（THBD）、組織因子途徑抑制劑（TFPI）及其組合。
- 如請求項43-50中任一項所述的載體，其中所述凝血反應基因轉殖的至少部分的表現由組織特異性啟動子驅動。
- 如請求項51所述的載體，其中所述組織特異性啟動子是內皮特異性啟動子。
- 如請求項52所述的載體，其中所述內皮特異性啟動子是低表現內皮特異性啟動子。
- 如請求項46所述的載體，其中所述炎症反應基因轉殖選自TNF α誘導的蛋白質3（A20）、血紅素加氧酶（HO-1）、分化簇47（CD47）及其組合。
- 如請求項46-54中任一項所述的載體，其中所述炎症反應基因轉殖的至少部分的表現由組織特異性啟動子、泛在啟動子或其任何組合驅動。
- 如請求項55所述的載體，其中所述組織特異性啟動子是內皮特異性啟動子。
- 如請求項46所述的載體，其中所述免疫反應基因轉殖選自人白細胞抗原-E（HLA-E）、β-2微球蛋白（B2M）及其組合。
- 如請求項46-57中任一項所述的載體，其中所述免疫反應基因轉殖的至少部分的表現由泛在啟動子驅動。
- 如請求項46所述的載體，其中所述免疫調節基因轉殖選自程式性死亡配體1（PD-L1）、Fas配體（FasL）及其組合。
- 如請求項46-59中任一項所述的載體，其中所述六個或更多個基因轉殖選自hCD46、hCD55、hCD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1。
- 如請求項60所述的載體，其中所述載體包含hCD46、hCD55、hCD59、CD39、THBD、TFPI、A20、HO-1、CD47、HLA-E、B2M和PD-L1基因轉殖或THBD、TFPI、CD39、CD46、CD55、CD59、CD46、HO-1、A20、B2M、HLA-E SCT和CD47基因轉殖。
- 如請求項61所述的載體，其包含圖17-圖20、圖31或圖47-圖49之一中的載體。
- 如請求項46-62中任一項所述的載體，其中所述至少六個基因轉殖是從單個基因座表現的。
- 一種產生如請求項1至29中任一項所述的經分離的細胞、組織或動物的方法。
- 如請求項64所述的方法，其包括通過轉座進行的單拷貝多順反子基因轉殖整合、通過重組酶介導的盒交換（RMCE）進行的單/雙等位基因位點特異性整合、基因組替代、內源基因人源化或其任何組合。
- 一種基因轉殖豬肝臟，所述基因轉殖豬肝臟在暴露於非豬血時具有降低的肝臟損害和/或穩定的凝血， 其中所述降低的肝臟損害通過確定膽汁產生、一種或多種代謝酶和一種或多種血清電解質中的一種或多種的水準來評估，並且 其中，所述穩定的凝血通過確定凝血酶原時間（PT）和國際標準化比率（PT-NIR）、纖維蛋白原水準（FIB）和較低的啟動部分促凝血酶原激酶時間（APTT）中的一種或多種的水準來評估。
- 如請求項66所述的基因轉殖豬肝臟，其中所述代謝酶選自丙胺酸胺基轉移酶（ALT）、天門冬胺酸胺基轉移酶（AST）和白蛋白（ALB）。
- 如請求項66或67所述的基因轉殖豬肝臟，其中所述血清電解質是鉀（K）和/或鈉（Na）。
- 一種經分離的豬細胞、組織、器官或動物，所述經分離的豬細胞、組織、器官或動物： (a) 包含選自炎症反應基因轉殖、免疫反應基因轉殖、免疫調節基因轉殖及其任何組合的至少兩種類型的多個基因轉殖，並且 (b) 基本上沒有異嗜性豬內源性逆轉錄病毒（PERV）病毒粒子的產生。
- 一種經分離的豬細胞、組織、器官或動物，所述經分離的豬細胞、組織、器官或動物： (a) 包含多個基因轉殖，其中所述多個基因轉殖包括至少一個炎症反應基因轉殖、至少一個免疫反應基因轉殖和至少一個免疫調節基因轉殖，並且 (b) 基本上沒有異嗜性豬內源性逆轉錄病毒（PERV）病毒粒子的產生。
- 如請求項69或70所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述豬經分離的細胞、組織、器官或動物基本上沒有PERV聚合酶（pol ）的酶活性。
- 如請求項69或70所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述豬經分離的細胞、組織、器官或動物基本上沒有功能性全長PERVpol 蛋白的表現。
- 如請求項69或70所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中至少約97%的基因組PERVpol 拷貝的編碼序列被破壞。
- 如請求項69或70所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中基本上所有基因組PERVpol 拷貝的編碼序列均被破壞。
- 如請求項69或70所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中至少約97%的從基因組PERVpol 拷貝轉錄的PERVpol mRNA的編碼序列被破壞。
- 如請求項73-75中任一項所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中破壞包括所述PERVpol 編碼序列的至少一個核苷酸位置處的至少一個移碼插入/缺失（插入缺失）。
- 如請求項69-76中任一項所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述豬經分離的細胞、組織、器官或動物表現功能性PERVgag 和/或env 蛋白。
- 如請求項69-77中任一項所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述豬經分離的細胞、組織、器官或動物包含PERVgag 和/或env 基因的基本上所有基因組拷貝的完整編碼序列。
- 如請求項69-78中任一項所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述豬經分離的細胞、組織、器官或動物表現出對人細胞的PERV感染性降低。
- 如請求項79所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中與野生型豬細胞相比，所述豬經分離的細胞、組織、器官或動物表現出對人細胞的PERV感染性低至少200倍。
- 如請求項79或80所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中與缺乏靶向PERVpol 基因或mRNA的基因組修飾的豬經分離的豬細胞、組織、器官或動物相比，所述豬經分離的細胞、組織、器官或動物表現出對人細胞的PERV感染性降低。
- 如請求項79-81中任一項所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中通過將所述豬經分離的細胞、組織、器官或動物或其外科外植體與人細胞共培養確定PERV感染性。
- 如請求項79-81中任一項所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其為豬動物，其中通過將源自所述豬動物的細胞外液與人細胞共培養確定PERV感染性。
- 如請求項82或83所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中通過針對共培養後PERV基因組序列或抗原的存在用測序、PCR或免疫測定法分析所述人細胞，至少部分確定PERV感染性。
- 如請求項69-84中任一項所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述PERV是PERV-A、PERV-B、PERV-A/C或其重組變異體。
- 如請求項69-85中任一項所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述炎症反應基因轉殖選自TNF α誘導的蛋白質3（A20）、血紅素加氧酶（HO-1）、分化簇47（CD47）及其任何組合。
- 如請求項69-86中任一項所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述免疫反應基因轉殖選自人白細胞抗原-E（HLA-E）、β-2微球蛋白（B2M）及其任何組合。
- 如請求項69-87中任一項所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述免疫調節基因轉殖選自程式性死亡配體1（PD-L1）、Fas配體（FasL）及其任何組合。
- 如請求項69-88中任一項所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述多個基因轉殖進一步包括至少一個凝血反應基因轉殖。
- 如請求項89所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述凝血反應基因轉殖選自分化簇39（CD39）、血栓調節蛋白（THBD）、組織因子途徑抑制劑（TFPI）及其任何組合。
- 如請求項69-90中任一項所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述多個基因轉殖進一步包括至少一個補體反應基因轉殖。
- 如請求項91所述的豬經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述補體反應基因轉殖選自人膜輔因子蛋白（hCD46）、人補體衰變加速因子（hCD55）、人MAC抑制劑因子（hCD59）及其任何組合。
- 如請求項69-92中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述經分離的豬細胞、組織、器官或動物包含所述基因轉殖的基因組整合。
- 如請求項93中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述經分離的豬細胞、組織、器官或動物包含所述基因轉殖的種系可傳遞的基因組整合。
- 如請求項69-94中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述豬細胞、組織、器官或動物表現可檢測水準的從所述基因轉殖轉錄的mRNA。
- 如請求項69-95中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述豬細胞、組織、器官或動物表現可檢測水準的從所述基因轉殖翻譯的蛋白質。
- 如請求項69-95中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述豬細胞、組織、器官或動物表現治療有效水準的從轉錄自所述基因轉殖的mRNA翻譯的蛋白質。
- 一種經分離的豬細胞、組織、器官或動物，所述經分離的豬細胞、組織、器官或動物： (a) 包含六個或更多個基因轉殖，所述基因轉殖各自獨立地選自補體反應基因轉殖、凝血反應基因轉殖、炎症反應基因轉殖、免疫反應基因轉殖和免疫調節基因轉殖，並且 (b) 基本上沒有異嗜性豬內源性逆轉錄病毒（PERV）病毒粒子的產生。
- 如請求項98所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述經分離的豬細胞、組織、器官或動物包含所述基因轉殖中的9、10、11或12個。
- 如請求項98或99所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述補體反應基因轉殖選自人膜輔因子蛋白（hCD46）、人補體衰變加速因子（hCD55）、人MAC抑制劑因子（hCD59）及其組合。
- 如請求項100所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述補體反應基因轉殖的至少部分的轉錄在泛在啟動子的轉錄控制下。
- 如請求項98-101中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述凝血反應基因轉殖選自分化簇39（CD39）、血栓調節蛋白（THBD）、組織因子途徑抑制劑（TFPI）及其組合。
- 如請求項98-102中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述凝血反應基因轉殖的至少部分的轉錄在組織特異性啟動子的轉錄控制下。
- 如請求項103所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述組織特異性啟動子是內皮特異性啟動子。
- 如請求項104所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述內皮特異性啟動子是低表現內皮特異性啟動子。
- 如請求項98-105中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述炎症反應基因轉殖選自TNF α誘導的蛋白質3（A20）、血紅素加氧酶（HO-1）、分化簇47（CD47）及其組合。
- 如請求項98-106中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述炎症反應基因轉殖的至少部分的轉錄由組織特異性啟動子、泛在啟動子或其任何組合驅動。
- 如請求項107所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述組織特異性啟動子是內皮特異性啟動子。
- 如請求項98-108中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述免疫反應基因轉殖選自人白細胞抗原-E（HLA-E）、β-2微球蛋白（B2M）及其組合。
- 如請求項98-109中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述免疫反應基因轉殖的至少部分的表現由泛在啟動子驅動。
- 如請求項98-110中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述免疫調節基因轉殖選自程式性死亡配體1（PD-L1）、Fas配體（FasL）及其組合。
- 如請求項98-111中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述六個或更多個基因轉殖選自hCD46、hCD55、hCD59、HLA-E、B2M、CD47、CD39、THBD、TFPI、A20、PD-L1和HO-1。
- 如請求項98-112中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述細胞、組織、器官或動物包含hCD46、hCD55、hCD59、CD39、THBD、TFPI、A20、HO-1、CD47、HLA-E、B2M和PD-L1基因轉殖或THBD、TFPI、CD39、CD46、CD55、CD59、CD46、HO-1、A20、B2M、HLA-E SCT和CD47基因轉殖。
- 如請求項98-113中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述基因轉殖是從單個基因座表現的。
- 如請求項98-114中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述基因轉殖被轉錄成不多於3個順反子。
- 如請求項115所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中順反子包含至少3個不同基因轉殖的編碼序列，其中所述至少3個不同基因轉殖被豬捷申病毒2A（P2A）肽的編碼序列分開。
- 如請求項69-116中任一項所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其進一步包含一個或多個異種碳水化合物抗原產生基因的缺失、破壞或失活。
- 如請求項117所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其中所述一個或多個異種碳水化合物抗原產生基因選自糖蛋白α-半乳糖基轉移酶1（GGTA）、β1,4 N-乙醯半乳糖胺基轉移酶2（B4GalNT2）、胞苷單磷酸-N-乙醯神經胺酸羥化酶（CMAH）。
- 如請求項118所述的經分離的細胞、組織、器官或動物，其包含GGTA的2個拷貝、B4GALNT2的4個拷貝或CMAH的2個拷貝或其任何組合的缺失、破壞或失活。
- 一種經分離的豬細胞、組織、器官或動物，所述經分離的豬細胞、組織、器官或動物： (a) 包含六個或更多個基因轉殖，所述基因轉殖各自獨立地選自補體反應基因轉殖、凝血反應基因轉殖、炎症反應基因轉殖、免疫反應基因轉殖和免疫調節基因轉殖， (b) 基本上沒有異嗜性豬內源性逆轉錄病毒（PERV）病毒粒子的產生，並且 (c) 包含GGTA的2個拷貝、B4GALNT2的4個拷貝或CMAH的2個拷貝或其任何組合的缺失、破壞或失活。
- 如請求項69-120中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述細胞、組織、器官或動物在暴露於人血或其級分時，表現出與人抗體的結合降低。
- 如請求項121所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述細胞、組織、器官或動物在暴露於人血或其級分時，表現出與人抗體的結合降低至少約5倍。
- 如請求項121所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述細胞、組織、器官或動物在暴露於人血或其級分時，表現出與人抗體的結合降低至少約10倍。
- 如請求項121-123中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述抗體是IgM抗體。
- 如請求項121-123中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述抗體是IgG抗體。
- 如請求項69-125中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述細胞、組織、器官或動物在暴露于人血時，表現出降低的自然殺傷（NK）細胞毒性。
- 如請求項126所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述細胞、組織、器官或動物在暴露于人血時，表現出降低至少約20%的自然殺傷（NK）細胞毒性。
- 如請求項69-127中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述細胞、組織、器官或動物在暴露於來自人血的補體時，表現出降低的補體毒性。
- 如請求項128所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述細胞、組織、器官或動物在暴露於來自人血的人補體時，表現出至少約5倍降低的補體毒性。
- 如請求項69-129中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述細胞、組織、器官或動物在暴露于人血時，表現出降低的TAT複合物形成。
- 如請求項130所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述細胞、組織、器官或動物在暴露于人血時，表現出至少約3倍降低的TAT複合物形成。
- 如請求項130所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其中所述細胞、組織、器官或動物在暴露于人血時，表現出至少約10倍降低的TAT複合物形成。
- 如請求項69-132中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其是表現白細胞、血小板、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞或其任何組合的正常血細胞計數的動物。
- 如請求項69-133中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其是表現出正常肝臟功能的動物，如通過血清鹼性磷酸酶水準、阿斯巴甜胺基醯基轉移酶水準、丙胺酸胺基轉移酶水準、ALT/AST水準、膽固醇、總膽紅素、甘油三酸酯或白蛋白/球蛋白水準或其任何組合所評估。
- 如請求項69-134中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其是表現出正常心臟功能的動物，如通過血清肌酸激酶水準、肌酸激酶-MB水準、乳酸脫氫酶水準或其任何組合所評估。
- 如請求項69-135中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其是表現出正常腎臟功能的動物，如通過血清肌酐水準、尿素水準或其組合所評估。
- 如請求項69-136中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其是表現出正常凝血功能的動物，如通過凝血酶時間、凝血酶原水準或其組合所評估。
- 如請求項69-137中任一項所述的經分離的豬細胞、組織、器官或動物，其是能夠將以下傳遞至後代動物的動物： (a) 一個或多個異種碳水化合物抗原產生基因的缺失、破壞或失活，所述基因包括α-半乳糖基轉移酶1（GGTA）、β1,4 N-乙醯半乳糖胺基轉移酶2（B4GalNT2）或胞苷單磷酸-N-乙醯神經胺酸羥化酶（CMAH）或其組合； (b) 所述基因轉殖； (c) 不存在異嗜性豬內源性逆轉錄病毒（PERV）病毒粒子的產生；或者 (d) 其任何組合； 其中 (a)-(d) 通過正常孟德爾遺傳來傳遞。
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| TW109123749A TW202128989A (zh) | 2019-10-18 | 2020-07-14 | 具有一個或多個用於增強異種移植物存活和／或耐受性的經修飾基因的細胞、組織、器官和／或動物 |
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2020
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