JP2021101741A - 異種移植のための多トランスジェニックブタ - Google Patents
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Abstract
Description
特に、改善された機能性を有する肺異種移植片を提供することができるドナー動物の必要性がまだある。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
少なくとも4つの導入遺伝子を含むトランスジェニックブタであって、前記少なくとも4つの導入遺伝子は、少なくとも2つのプロモーターの制御下で単一の遺伝子座において組み込まれ、発現されており、前記ブタは、アルファ1,3ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を欠く、トランスジェニックブタ。
(項目2)
前記単一の遺伝子座が天然の遺伝子座である、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目3)
前記単一の遺伝子座が改変された天然の遺伝子座である、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目4)
前記改変された天然の遺伝子座が遺伝子編集媒介挿入、欠失または置換を含む、項目3に記載のトランスジェニックブタ。
(項目5)
前記改変された天然の遺伝子座がトランスジェニックDNAを含む、項目3に記載のトランスジェニックブタ。
(項目6)
前記トランスジェニックDNAが選択可能マーカー遺伝子を含む、項目5に記載のトランスジェニックブタ。
(項目7)
前記トランスジェニックDNAがランディングパッドを含む、項目5に記載のトランスジェニックブタ。
(項目8)
前記単一の遺伝子座が、AAVS1、ROSA26、CMAH、β4GalNT2およびGGTA1からなる群から選択される、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目9)
前記単一の遺伝子座が天然のGGTA1遺伝子座である、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目10)
前記単一の遺伝子座が改変されたGGTA1遺伝子座である、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目11)
前記単一の遺伝子座がトランスジェニックGGTA1遺伝子座である、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目12)
前記プロモーターの少なくとも1つが構成的プロモーターである、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目13)
前記プロモーターの少なくとも1つが調節可能なプロモーターである、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目14)
前記調節可能なプロモーターが組織特異的プロモーターまたは誘導可能なプロモーターである、項目13に記載のトランスジェニックブタ。
(項目15)
前記プロモーターの少なくとも1つが外因性プロモーターである、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目16)
前記少なくとも4つの導入遺伝子が第1のポリシストロンおよび第2のポリシストロンとして発現され、前記少なくとも2つのプロモーターが前記第1のポリシストロンの発現を制御する第1のプロモーターおよび前記第2のポリシストロンの発現を制御する第2のプロモーターを含む、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目17)
少なくとも4つのプロモーターを含み、前記少なくとも4つの導入遺伝子の各々が専用のプロモーターによって制御される、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目18)
前記第1のプロモーターが構成的プロモーターであり、前記第2のプロモーターが組織特異的プロモーターである、項目16に記載のトランスジェニックブタ。
(項目19)
前記組織特異的プロモーターが内皮細胞特異的プロモーターである、項目18に記載のトランスジェニックブタ。
(項目20)
前記第1のプロモーターおよび前記第2のプロモーターが構成的プロモーターである、項目16に記載のトランスジェニックブタ。
(項目21)
前記少なくとも2つのプロモーターがCAGおよびICAM−2を含む、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目22)
前記少なくとも4つの導入遺伝子が抗凝固因子、補体阻害因子、免疫調節因子、細胞保護導入遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目23)
前記抗凝固因子がTBM、TFPI、EPCR、CD39およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目22に記載のトランスジェニックブタ。
(項目24)
前記補体阻害因子がCD46、CD55、CD59およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目22に記載のトランスジェニックブタ。
(項目25)
前記免疫調節因子が免疫抑制因子である、項目22に記載のトランスジェニックブタ。
(項目26)
前記免疫抑制因子がブタのCLTA4−IG、CIITA−DNおよびそれらの組合せからなる群から選択される、項目25に記載のトランスジェニックブタ。
(項目27)
前記免疫調節因子がCD47である、項目22に記載のトランスジェニックブタ。
(項目28)
前記細胞保護導入遺伝子がHO−1、A20およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目22に記載のトランスジェニックブタ。
(項目29)
前記導入遺伝子の少なくとも2つが抗凝固因子である、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目30)
前記導入遺伝子の少なくとも1つが細胞保護導入遺伝子である、項目29に記載のトランスジェニックブタ。
(項目31)
前記導入遺伝子の少なくとも1つが免疫調節因子である、項目30に記載のトランスジェニックブタ。
(項目32)
前記導入遺伝子の少なくとも1つが補体阻害因子である、項目31に記載のトランスジェニックブタ。
(項目33)
少なくとも1つのさらなる遺伝子改変をさらに含む、項目1に記載のトランスジェニックブタ。
(項目34)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、遺伝子ノックアウト;遺伝子ノックイン;遺伝子交換;点突然変異;遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換;大きなゲノム挿入;またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目35)
前記単一の遺伝子座がGGTA1でなく、前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変がアルファ1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウトを含む、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目36)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変がヒトCD46の組み込みおよび発現を含む、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目37)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、ヒト血小板の自発的な凝集を低減または排除するためのブタvWF遺伝子座の改変を含む、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目38)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変がキメラのブタ−ヒトvWFの組み込みおよび発現を含む、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目39)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、ブタvWF遺伝子のターゲティング化された不活性化ならびにヒトvWF遺伝子の断片の組み込みおよび発現を含む、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目40)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変がヒトHLA−Eの組み込みおよび発現を含む、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目41)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変がβ4GalNT2遺伝子のノックアウトを含む、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目42)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変がCMAH遺伝子のノックアウトを含む、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目43)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が少なくとも2つのさらなる導入遺伝子の組み込みおよび発現を含む、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目44)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、第2の単一の遺伝子座における少なくとも2つのさらなる導入遺伝子の組み込みおよび発現を含む、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目45)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、第2の単一の遺伝子座における少なくとも4つのさらなる導入遺伝子の組み込みおよび発現を含む、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目46)
前記単一の遺伝子座がGGTA1であり、前記第2の単一の遺伝子座がβ4GalNT2である、項目44に記載のトランスジェニックブタ。
(項目47)
前記単一の遺伝子座がGGTA1であり、前記第2の単一の遺伝子座がCMAHである、項目44に記載のトランスジェニックブタ。
(項目48)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が少なくとも1つの天然遺伝子の発現の排除または低減をもたらす、項目33に記載のトランスジェニックブタ。
(項目49)
前記少なくとも1つの天然遺伝子が、CMP−NeuAcヒドロキシラーゼ、イソグロボシド3シンターゼ、β4GalNT2、vWF、フォルスマンシンターゼまたはそれらの組合せからなる群から選択される、項目48に記載のトランスジェニックブタ。
(項目50)
項目1〜49に記載のトランスジェニックブタに由来する器官。
(項目51)
項目1〜49に記載のトランスジェニックブタに由来する肺または肺断片。
(項目52)
項目1〜49に記載のトランスジェニックブタに由来する組織。
(項目53)
項目1〜49に記載のトランスジェニックブタに由来する細胞。
(項目54)
少なくとも4つのトランスジェニック遺伝子を発現するが、アルファ1,3ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を欠くトランスジェニックブタを作製する方法であって、(i)ポリジーンブタゲノムを提供するためにブタゲノム中の単一の遺伝子座に少なくとも2つのプロモーターの制御下の少なくとも4つの導入遺伝子を組み込むこと;(ii)前記ポリジーンブタゲノムを含む細胞がトランスジェニックブタに成熟することを可能にすることを含む方法。
(項目55)
前記ブタゲノムが体細胞ブタゲノムであり、前記細胞はブタ接合体であり、前記ブタ接合体は体細胞核移植(SCNT)によって、かつマイクロインジェクションにより前記ポリジーンブタゲノムを再構築されたSCNT接合体に移すことによって提供される、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記体細胞ブタゲノムが少なくとも1つのさらなる遺伝子改変を含む、項目53に記載の方法。
(項目57)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、遺伝子ノックアウト;遺伝子ノックイン;遺伝子交換;点突然変異;遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換;大きなゲノム挿入;またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目56に記載の方法。
(項目58)
少なくとも1つのさらなる遺伝子改変を前記ポリジーンブタゲノムに導入することをさらに含む、項目55に記載の方法。
(項目59)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、遺伝子ノックアウト;遺伝子ノックイン;遺伝子交換;点突然変異;遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換;大きなゲノム挿入;またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目56または58に記載の方法。
(項目60)
前記ブタゲノムが、生殖体ブタゲノム、接合体ブタゲノム、胚ブタゲノムまたは胚盤胞ブタゲノムからなる群から選択される、項目54に記載の方法。
(項目61)
前記ブタゲノムが少なくとも1つのさらなる遺伝子改変を含む、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、遺伝子ノックアウト;遺伝子ノックイン;遺伝子交換;点突然変異;遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換;大きなゲノム挿入;またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目61に記載の方法。
(項目63)
少なくとも1つのさらなる遺伝子改変を前記ポリジーンブタゲノムに導入することをさらに含む、項目60に記載の方法。
(項目64)
前記少なくとも1つの遺伝子改変が、遺伝子ノックアウト;遺伝子ノックイン;遺伝子交換;点突然変異;遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換;大きなゲノム挿入またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目61または63に記載の方法。
(項目65)
前記組み込むことが、生物学的トランスフェクション、化学的トランスフェクション、物理的トランスフェクション、ウイルス媒介形質導入もしくは形質転換またはそれらの組合せからなる群から選択される方法を含む、項目54に記載の方法。
(項目66)
組み込むことが、細胞質マイクロインジェクションおよび前核マイクロインジェクションを含む、項目54に記載の方法。
(項目67)
前記単一の遺伝子座が天然の遺伝子座である、項目54に記載の方法。
(項目68)
前記単一の遺伝子座が改変された天然の遺伝子座である、項目54に記載の方法。
(項目69)
前記改変された天然の遺伝子座が遺伝子編集媒介挿入または欠失または置換を含む、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記改変された天然の遺伝子座がトランスジェニックDNAを含む、項目68に記載の方法。
(項目71)
前記トランスジェニックDNAが選択可能マーカー遺伝子を含む、項目70に記載の方法。
(項目72)
前記トランスジェニックDNAがランディングパッドを含む、項目70に記載の方法。
(項目73)
前記トランスジェニックDNAがポリヌクレオチド改変酵素のための1つまたは複数の認識配列を含む、項目72に記載の方法。
(項目74)
前記ポリヌクレオチド改変酵素が、工学操作エンドヌクレアーゼ、部位特異的リコンビナーゼ、インテグラーゼまたはそれらの組合せからなる群から選択される、項目73に記載の方法。
(項目75)
前記工学操作エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼおよびクラスター化規則的間隔短鎖回文反復配列/Cas9ヌクレアーゼからなる群から選択される、項目74に記載の方法。
(項目76)
前記部位特異的リコンビナーゼが、ラムダインテグラーゼ、Creリコンビナーゼ、FLPリコンビナーゼ、ガンマ−デルタレゾルバーゼ、Tn3レゾルバーゼ、ΦC31インテグラーゼ、Bxb1−インテグラーゼ、R4インテグラーゼまたはそれらの組合せからなる群から選択される、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記単一の遺伝子座が天然のGGTA1遺伝子座である、項目54に記載の方法。
(項目78)
前記単一の遺伝子座が改変されたGGTA1遺伝子座である、項目54に記載の方法。
(項目79)
前記改変されたGGTA1遺伝子座がトランスジェニックGGTA1遺伝子座である、項目78に記載の方法。
(項目80)
前記トランスジェニックGGTA1遺伝子座が選択可能マーカー遺伝子を含む、項目79に記載の方法。
(項目81)
前記トランスジェニックGGTA1遺伝子座が工学操作ランディングパッドを含む、項目79に記載の方法。
(項目82)
前記単一の遺伝子座が、CMAH、β4GalNT2、AAVS1遺伝子座およびRosa26からなる群から選択される天然の遺伝子座である、項目54に記載の方法。
(項目83)
前記単一の遺伝子座が、CMAH、β4GalNT2、AAVS1遺伝子座およびRosa26からなる群から選択される改変された遺伝子座である、項目54に記載の方法。
(項目84)
前記単一の遺伝子座がGGTA1遺伝子座でなく、前記さらなる遺伝子改変がアルファ1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子をノックアウトすることを含む、項目56または61に記載の方法。
(項目85)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変がCD46の組み込みおよび発現を含む、項目56、58、61または63に記載の方法。
(項目86)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変がヒトHLA−Eの組み込みおよび発現を含む、項目56、58、61または63に記載の方法。
(項目87)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、ヒト血小板の自発的な凝集を低減または排除するための前記ブタvWF遺伝子座の改変を含む、項目56、58、61または63に記載の方法。
(項目88)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変がキメラのブタ−ヒトvWFの組み込みおよび発現を含む、項目56、58、61または63に記載の方法。
(項目89)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、前記ブタvWF遺伝子のターゲティング化された不活性化ならびに前記ヒトvWF遺伝子の断片の挿入および発現を含む、項目56、58、61または63に記載の方法。
(項目90)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、天然のvWF遺伝子内のヌクレオチド置換によって、または前記天然のvWF遺伝子のノックアウトおよび完全ヒトvWF遺伝子との交換によって生産されるブタvWFの改変を含む、項目56、58、61または63に記載の方法。
(項目91)
前記少なくとも1つの遺伝子改変が、β4GalNT2遺伝子、CMAH遺伝子、β4GalNT2遺伝子およびGGTA1遺伝子からなる群から選択される遺伝子のノックアウトを含む、項目56、58、61または63に記載の方法。
(項目92)
項目54または61に記載の方法によって生産される、トランスジェニック動物または生産群。
(項目93)
前記トランスジェニックブタを第2のトランスジェニックブタに交配することをさらに含み、前記第2のトランスジェニックブタは少なくとも1つの遺伝子改変を含む、項目54または60に記載の方法。
(項目94)
前記少なくとも1つの遺伝子改変が少なくとも1つの導入遺伝子の組み込みおよび発現を含む、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記少なくとも1つの導入遺伝子が抗凝固因子、補体阻害因子、免疫調節因子、細胞保護導入遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目94に記載の方法。
(項目96)
前記少なくとも1つの遺伝子改変が少なくとも1つのブタ遺伝子のノックアウトを含む、項目93に記載の方法。
(項目97)
前記少なくとも1つの遺伝子改変がキメラのブタ−ヒトvWFの組み込みおよび発現を含む、項目93に記載の方法。
(項目98)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、ヒト血小板の自発的な凝集を低減または排除するためのブタvWF遺伝子座の改変を含む、項目94に記載の方法。
(項目99)
改変された前記ブタvWFが、天然のvWF遺伝子内のヌクレオチド置換によって、または前記天然のvWF遺伝子のノックアウトおよび完全ヒトvWF遺伝子との交換によって生産される、項目98に記載の方法。
(項目100)
項目94に記載の方法によって生産される、トランスジェニック動物または生産群。
(項目101)
それを必要とする対象を処置するための方法であって、前記対象に項目1〜53に記載のトランスジェニックブタに由来する少なくとも1つの器官、器官断片、組織または細胞を移植することを含む方法。
(項目102)
前記少なくとも1つの器官が、肺、心臓、腎臓、肝臓、膵臓またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目101に記載の方法。
(項目103)
前記少なくとも1つの器官が肺である、項目102に記載の方法。
(項目104)
前記少なくとも1つの器官断片が、肺断片、心臓断片、腎臓断片、膵臓断片またはそれらの組合せから選択される、項目101に記載の方法。
(項目105)
前記対象が進行性の肺疾患を有し、肺または肺断片が移植される、項目101に記載の方法。
(項目106)
前記進行性の肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、特発性肺線維症(IPD)、嚢胞性線維症(CF)、アルファ1−アンチトリプシン疾患または原発性肺高血圧と関連する、項目105に記載の方法。
(項目107)
前記対象に1つまたは複数の治療剤を投与することをさらに含む、項目101に記載の方法。
(項目108)
前記治療剤が、抗拒絶剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗菌剤および抗ウイルス剤、ならびにそれらの組合せから選択される、項目107に記載の方法。
(項目109)
ブタvWF遺伝子座の遺伝子改変を含み、アルファ1,3ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を欠くトランスジェニックブタ。
(項目110)
少なくとも1つのさらなる遺伝子改変をさらに含む、項目109に記載のトランスジェニックブタ。
(項目111)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が、遺伝子ノックアウト;遺伝子ノックイン;遺伝子交換;点突然変異;遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換;大きなゲノム挿入およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目110に記載のトランスジェニックブタ。
(項目112)
前記少なくとも1つのさらなる遺伝子改変が少なくとも4つの導入遺伝子の組み込みおよび発現を含む、項目110に記載のトランスジェニックブタ。
本明細書で使用する場合、用語「有害事象」は、医療品に関係すると考えられるか否かを問わず、医用品(例えば、異種移植片)の使用と一時的に関連する任意の好ましからぬ、または意図しない徴候(例えば、異常な検査所見を含む)、症状または疾患を指す。
本発明は、異種移植において使用するための器官、器官断片、組織または細胞の供与源としての役割を果たすトランスジェニック動物(例えば、トランスジェニックブタ動物)を提供する。本発明は、トランスジェニック動物に由来する器官、組織および細胞、ならびにそのような動物の群、例えば生産群に拡張する。
導入遺伝子の発現は任意のレベルであってよいが、具体的な実施形態では、発現は高レベルである。
1.アルファ1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ(アルファ.Gal)
一実施形態では、本発明は、異種移植のための器官、組織および細胞の供与源として使用するのに適するトランスジェニック動物を提供し、ここで、ドナー動物はアルファGalの発現を欠くか、または発現が低減されている。アルファGalの発現を欠く(すなわち、アルファGalヌルである)トランスジェニック動物は、1つまたは複数のさらなる遺伝子改変、ある特定の実施形態では少なくとも4つのさらなる遺伝子改変、少なくとも5つのさらなる遺伝子改変または少なくとも6つのさらなる遺伝子改変を有する。これらの遺伝子改変は、例えば、導入遺伝子の組み込みまたは発現であってよい。特定の実施形態では、トランスジェニック動物は、(i)アルファGalの発現の欠如;ならびに(ii)単一の遺伝子座における少なくとも2つの導入遺伝子の組み込みおよび発現をもたらす少なくとも3つの遺伝子改変を有する。ある特定の実施形態では、単一の遺伝子座は、改変されたアルファGalである。
一実施形態では、本発明は、異種移植のための器官、組織および細胞の供与源として使用するのに適するトランスジェニック動物を提供し、ここで、ドナー動物はβ1,4N−アセチル−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ2(β4GALNT2)の発現を欠くか、または発現が低減している。β4GALNT2の発現を欠く(すなわち、β4GALNT2ヌル)トランスジェニック動物は、1つまたは複数のさらなる遺伝子改変を有する。これらの遺伝子改変は、例えば、導入遺伝子の組み込みまたは発現であってよい。特定の実施形態では、β1,4N−アセチル−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ2(β4GALNT2)の発現を欠くかまたは発現が低減しているトランスジェニック動物は、(i)アルファGalの発現の欠如;ならびに(ii)少なくとも2つのプロモーターの制御下での単一の遺伝子座における少なくとも4つの導入遺伝子の組み込みおよび発現によっても特徴付けられる。
一実施形態では、本発明は、異種移植のための器官、組織および細胞の供与源として使用するのに適するトランスジェニック動物を提供し、ここで、ドナー動物はシチジン一リン酸−N−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ(CMAH)の発現を欠くかまたは発現が低減している。CMAHの発現を欠く(CMAHヌル)トランスジェニック動物は、1つまたは複数のさらなる遺伝子改変を有する。これらの遺伝子改変は、例えば、導入遺伝子の組み込みまたは発現であってよい。特定の実施形態では、トランスジェニック動物は、(i)アルファGalの発現の欠如;ならびに(ii)単一の遺伝子座における少なくとも4つの導入遺伝子の組み込みおよび発現をもたらす少なくとも4つのさらなる遺伝子改変を有する。
フォンビルブラント因子(vWF)遺伝子は、複数のドメインを有し、多量体の糖タンパク質をコードする、大きな複合遺伝子である。(Ulrichts,H、Udvardy M、Lenting PJ、Pareyn Iら、Shielding of the A1 domain by the D'D3 domains of von Willebrand Factor Modulates Its interaction with Platelet Glycoprotein 1b-IX-V.(2006年)JBC、281巻、4699〜4707頁;Zhou Y-F、Eng ET、Zhu J、Lu Cら、Sequence and structure relationships within von Willebrand factor.(2012年)Blood、120巻、449〜458頁)。多量体の糖タンパク質フォンビルブラント因子(vWF)の主要な機能は、結合組織および内皮下層への血小板粘着ならびに血小板糖タンパク質Ib(GPIb)に結合するvWFに対応した血小板凝集である。しかし、レシピエントの血小板凝集が提供された器官の生存に有害な作用を有するとき、この現象は異種移植の間より不利である。例として、ヒトまたは非ヒト霊長類へのブタの肺(および他の器官)の移植は、ヒト血小板の自発的な凝集および隔離をもたらす。これは、ヒト血小板へのブタvWFのこの自発的な結合を排除する努力における、ブタVWF遺伝子の「ヒト化」によって回避することができる。
本発明のトランスジェニック動物のゲノムに導入される導入遺伝子は、任意の適する導入遺伝子であってよい。
一実施形態では、導入遺伝子は免疫調節因子である。例示的な実施形態では、ドナー動物が遺伝子改変されて、その結果(i)アルファGalの発現を欠いているかまたは低減し、および(ii)単一の遺伝子座において少なくとも4つの導入遺伝子が組み込まれて発現され、少なくとも2つの導入遺伝子のうちの少なくとも1つが免疫調節因子である。
一実施形態では、本発明は、異種移植のための器官、組織および細胞の供与源として使用するのに適するトランスジェニック動物(例えば、ブタ動物)を提供し、ドナー動物は、少なくとも1つの補体調節因子、例えば補体阻害因子を組み込み、発現するように遺伝子改変されている。例示的な実施形態では、ドナー動物が遺伝子改変されて、その結果(i)アルファGalの発現を欠いているかまたは低減し、および(ii)単一の遺伝子座において少なくとも4つの導入遺伝子が組み込まれて発現され、導入遺伝子のうちの少なくとも1つは、補体調節因子、またはより具体的には補体阻害因子である。
一実施形態では、本発明は、異種移植のための器官、組織および細胞の供与源として使用するのに適するトランスジェニック動物を提供し、ドナー動物は、少なくとも1つの免疫抑制因子を組み込み、発現するように遺伝子改変されている。トランスジェニック動物は、一般的に1つまたは複数のさらなる遺伝子改変、より詳細には5つまたはそれより多くのさらなる遺伝子改変、さらにより詳細には6つまたはそれより多くのさらなる遺伝子改変を有する。
PDL1、PDL2:T細胞活性化のための一般的な共刺激分子は、CD80/86またはCD40である。過去数年わたるこれらの正の共刺激経路に加えて、負のシグナルを媒介し、T細胞活性化の調節にとって重要である新しい共刺激経路が見出された。これらのより新しい経路の1つは、プログラム死1(PD−1)受容体ならびにそのリガンドPD−L1およびPD−L2からなる経路である。PD−1受容体は静止細胞で発現されないが、TおよびB細胞活性化の後に上方制御される。PD−1は細胞質免疫受容体のチロシンをベースとしたスイッチモチーフを含有し、PD−L1またはPD−L2のPD−1への結合は、T細胞における阻害性シグナルにつながる。PD1/PDリガンド経路が、調節活性を示しているT細胞サブセットの制御において役割を果たすことができることを、最近のデータは示唆する。マウスにおいて、PD−1シグナルは調節T細胞(Treg)の抑制活性および適応性Tregの生成のために必要とされることが示された。これらの観察は、PD−1/PDLigおよび相互作用が、T細胞応答を阻害するだけでなく、免疫調節を引き起こすこともできることを示唆する。いくつかの系列の証拠は、PD−1/PDリガンド経路が同種異系移植片の生着および拒絶反応を制御することができることを実証し、これらの分子が、器官移植の後の免疫調節のための興味深いターゲットであることを暗示する。実際に、ラット移植モデルにおけるドナー心臓へのPDL1 Ig遺伝子移入によって、同種異系移植片生存の延長を得ることができた。さらに、PD−L1 Igの注射によってPD−1シグナル伝達を強化することは、マウスにおける拒絶反応から移植片を保護することも報告されている。最近のデータは、マウスにおける島移植片でのPD−L1 IGの過剰発現が、島移植片生存を部分的に延長することができることも示す。ブタ細胞および組織におけるヒトPD−L1またはPD−L2のトランスジェニック発現は、直接の感作経路を通して開始される初期のヒト抗ブタT細胞応答を低減するはずである(Plegeら、Transplantation、2009年4月15日;87巻(7号):975〜82頁)。Tregの誘導によって、長期持続寛容性を達成するために必要とされる間接経路を通して、異種移植片に感作されるT細胞を制御することも可能かもしれない。
一実施形態では、本発明は、異種移植のための器官、組織および細胞の供与源として使用するのに適するトランスジェニックドナー動物を提供し、ドナー動物は、少なくとも1つの抗凝固因子を組み込み、発現するように遺伝子改変されている。動物は、一般的にさらなる遺伝子改変、より詳細には少なくとも5つのさらなる遺伝子改変、およびさらにより詳細には少なくとも6つのさらなる遺伝子改変を有する。例示的な実施形態では、本発明は、(i)アルファGalの発現の欠如;ならびに(ii)少なくとも2つのプロモーターの制御下の単一の遺伝子座における少なくとも4つの導入遺伝子の組み込みおよび発現をもたらす遺伝子改変を含み、ここで、少なくとも1つの導入遺伝子は抗凝固因子であるトランスジェニック動物である。
一実施形態では、本発明は、異種移植のための器官、組織および細胞の供与源として使用するのに適するトランスジェニックドナー動物を提供し、ここで、ドナー動物は、少なくとも1つの凍結保護因子導入遺伝子(「細胞保護因子」)を組み込み、発現するように遺伝子改変されている。例示的な実施形態では、本発明は、(i)アルファGalの発現の欠如;ならびに(ii)少なくとも2つのプロモーターの制御下の単一の遺伝子座における少なくとも4つの導入遺伝子の組み込みおよび発現をもたらす遺伝子改変を含み、ここで、少なくとも4つの導入遺伝子のうちの少なくとも1つは細胞保護的導入遺伝子であるトランスジェニック動物(例えば、ブタ)を提供する。
(a)A20:A20は、抗炎症および抗アポトーシス活性を提供する。血管化移植器官は、抗炎症性分子、抗凝固性分子および/または抗アポトーシス分子によって内皮細胞活性化および細胞損傷から保護することができる。急性血管拒絶反応(AVR)のモジュレーションのために大きな可能性を有する遺伝子の中には、ヒト臍静脈内皮細胞において腫瘍壊死因子(TNF)−α誘導可能因子として最初に同定されたヒトA20遺伝子(hA20)がある。ヒトA20は、それぞれいくつかのカスパーゼおよび転写因子核因子−κBの遮断を通して、内皮細胞をTNF媒介アポトーシスおよび炎症から保護することによる、二重細胞保護機能を有する。生存能力のあるA20トランスジェニック子ブタが生産され、これらの動物では、hA20の発現は骨格筋、心臓およびPAECに限定され、それらはhA20発現によってTNF媒介アポトーシスから保護され、およびCD95(Fas)L媒介細胞死から少なくとも部分的に保護された。さらに、hA20−トランスジェニッククローンブタからの心筋細胞は、心臓傷害から部分的に保護された(Oropezaら、Xenotransplantation、2009年11月;16巻(6号):522〜34頁)。
(b)HO−1:HOは、抗炎症、抗アポトーシスおよび抗酸化活性を提供する。HSP32とも命名されたヘム異化作用における律速酵素ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、熱ショックタンパク質のメンバーに属し、ここで、ヘム環は第一鉄、一酸化炭素(CO)およびビリベルジンに切断され、それは次いで、ビリベルジンレダクターゼによってビリルビンに変換される。HO−1、HO−2およびHO−3を含むHOの3つのアイソフォームをクローニングした。HO−1の発現は高度に誘導可能であるが、HO−2およびHO−3は構成的に発現される(Maines M Dら、Annual Review of Pharmacology & Toxicology、1997年;37巻:517〜554頁およびChoi A Mら、American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology1996年;15巻:9〜19頁)。HO−1−/−マウスの分析は、HO−1をコードする遺伝子が鉄ホメオスタシスを調節して、強力な抗酸化、抗炎症および抗アポトーシス効果を有する細胞保護的遺伝子として働くことを示唆する(Poss K Dら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、1997年;94巻:10925〜10930頁、Poss K Dら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、1997年;94巻:10919〜10924頁およびSoares M Pら、Nature Medicine、1998年;4巻:1073〜1077頁)。ヒトにおけるHO−1欠乏症の症例報告において、類似の所見が最近記載された(Yachie Aら、Journal of Clinical Investigation、1999年;103巻:129〜135頁)。抗炎症、抗酸化および抗アポトーシスを含むHO−1の細胞保護効果の役割を担う分子機構は、その反応生成物によって媒介される。HO−1発現は、異なる金属とのプロトポルフィリンによってin vitroおよびin vivoでモジュレートすることができる。コバルトプロトポルフィリン(CoPP)および鉄プロトポルフィリン(FePP)は、HO−1の発現を上方制御することができる。対照的に、スズプロトポルフィリン(SnPP)および亜鉛プロトポルフィリン(ZnPP)は、タンパク質レベルでHO−1の活性を阻害する。最近、HO−1の発現がマウスからラットへの心臓移植の拒絶反応を抑制すること(Sato Kら、J. Immunol.2001年;166巻:4185〜4194頁)、アポトーシスから島細胞を保護すること、および移植後の島細胞のin vivo機能を改善すること(Pileggi Aら、Diabetes、2001年;50巻:1983〜1991頁)が証明された。遺伝子移入によるHO−1の投与が高酸素症誘導肺傷害からの保護を提供すること(Otterbein L Eら、J Clin Invest、1999年;103巻:1047〜1054頁)、HO−1の上方制御は、遺伝的に脂肪性のツッカーラット肝臓を虚血/再灌流傷害から保護すること(Amersi Fら、J Clin Invest、1999年;104巻:1631〜1639頁)、および、HO−1遺伝子の除去または発現は、シスプラチン誘導腎尿細管アポトーシスをモジュレートすること(Shiraishi Fら、Am J Physiol Renal Physiol2000年;278巻:F726〜F736頁)も証明された。トランスジェニック動物モデルでは、HO−1の過剰発現が低酸素に対する肺炎症性および血管応答を予防すること(Minamino Tら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2001年;98巻:8798〜8803頁)、ならびに、心臓を虚血および再灌流傷害から保護すること(Yet S Fら、Cir Res2001年;89巻:168〜173頁)が示された。HO−1導入遺伝子を有するブタが生産されたが、異種移植におけるそれらの使用に関係した臨床効果は報告されなかった(米国特許第7,378,569号)。
(c)FAT−1:FAT−1は、抗炎症活性を提供する。多価不飽和脂肪酸(PUFA)は、(n−3クラス)炎症を阻害する役割をする。哺乳動物の細胞は、n−6をn−3 PUFAに変換するデサチュラーゼを欠く。その結果として、必須のn−3脂肪酸は食事で供給しなければならない。しかし哺乳動物と異なって、自由生活線虫Caenorhabditis elegansは、n−6脂肪酸に対して炭化水素鎖のn−3位置に二重結合を導入してn−3PUFAを形成するn−3脂肪酸デサチュラーゼを発現する。C.elegansのfat−1遺伝子を発現し、その結果として、6系の食事性PUFAを3系のPUFA、例えばEPA(20:5のn−3)およびDHA(22−6のn−3)に効率的に変換することができるトランスジェニックマウスが生産された。(Kangら、Nature、2004年2月5日;427巻(6974号):504頁)。別のグループは、fat−1のcDNAのコドンが哺乳動物の系における効率的な翻訳のためにさらに最適化されたトランスジェニックマウスモデルを生成した;C.elegansのn−3脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子mfat−1の過剰発現を通して、n−3 PUFAの内因性生成が達成された。このグループは、mfat−1のトランスジェニック発現を通したn−3 PUFAの細胞性増加およびn−6 PUFAの低減が、マウスの単離された膵臓島において、グルコース、アミノ酸およびGLP−1によって刺激されるインスリン分泌を増強し、島をサイトカイン誘導細胞死に対して強く抵抗性にすることを示した(Weiら、Diabetes、2010年2月;59巻(2号):471〜8頁)。
(d)可溶性TNF−アルファ受容体(sTNFR1):腫瘍壊死因子(TNF、カケキシンまたはカケクチン、および腫瘍壊死因子アルファとして正式に知られる)は、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性相の反応を刺激する一群のサイトカインのメンバーである。TNFの主な役割は、免疫細胞の調節にある。TNFは、炎症を誘導するために、アポトーシス細胞死を誘導することができる。可溶性TNF−アルファ受容体1(sTNFR1)は、TNFR1の細胞外ドメインであり、TNF−アルファに対するアンタゴニストである(Suら、1998年、Arthritis Rheum.41巻、139〜149頁)。異種移植片におけるsTNFR1のトランスジェニック発現は、有益な抗炎症効果を有することができる。
トランスジェニック動物は、選択的交配、核移植、卵母細胞、精子、接合体もしくは卵割球中へのDNAの導入、または胚性幹細胞の使用を介するものが含まれるがこれらに限定されない、当業者に公知の任意の方法によって生産され得る。本明細書にさらに記載されるように、遺伝子編集ツールもまた利用され得る。
特定の実施形態では、これらの細胞は、線維芽細胞から識別不能な形態もしくは表現型、または少なくとも10もしくは少なくとも12もしくは少なくとも14もしくは少なくとも18もしくは少なくとも20日間の老化前寿命、または相同組換えおよび非老化核の核移植を可能にするのに十分な寿命を有する、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞であり得る;具体的な一実施形態では、これらの細胞は、胎仔線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、発生中の胎仔および成体動物から大量に取得できるので、適切な体細胞型である。これらの細胞は、迅速な倍加時間でin vitroで容易に拡大増殖され得、遺伝子ターゲティング手順における使用のためにクローン的に拡大増殖され得る。使用される細胞は、胎仔動物由来であり得るか、または元来、新生仔であり得るか、もしくは成体動物由来であり得る。これらの細胞は、成熟または未成熟であり得、分化したまたは未分化のいずれかであり得る。
相同組換えは、内因性遺伝子における部位特異的改変を可能にし、したがって、新規変更がゲノム中に工学操作され得る。相同組換えにおける主なステップは、DNA鎖交換であり、これには、ヘテロ二重鎖DNAを含む中間組換え構造を形成する、相補的配列を含む少なくとも1つのDNA鎖との、DNA二重鎖の対合が関与する(例えば、Radding, C. M.(1982年)Ann. Rev. Genet. 16巻:405頁;米国特許第4,888,274号を参照のこと)。このヘテロ二重鎖DNAは、単一の相補鎖がDNA二重鎖に侵入する三重鎖形態を含む3DNA鎖を含むいくつかの形態を取り得(Hsiehら(1990年)Genes and Development 4巻:1951頁;Raoら、(1991年)PNAS 88巻:2984頁))、2つの相補的DNA鎖がDNA二重鎖と対合する場合、古典的なHolliday組換え連結部もしくはカイ構造(Holliday, R.(1964年)Genet. Res. 5巻:282頁)、または二重−Dループ(「Diagnostic Applications of Double-D Loop Formation」、1991年9月4日出願の米国特許出願第07/755,462号)が形成され得る。一旦形成されると、ヘテロ二重鎖構造は、鎖の切断および交換によって解消され得、その結果、侵入DNA鎖の全てまたは一部分がレシピエントDNA二重鎖中にスプライスされて、レシピエントDNA二重鎖のセグメントを付加または交換する。あるいは、ヘテロ二重鎖構造は、遺伝子変換を生じ得、ここで、侵入鎖の配列は、鋳型として侵入鎖を使用するミスマッチした塩基の修復によって、レシピエントDNA二重鎖に移行される(Genes、第3版(1987年)Lewin, B.、John Wiley、New York、N.Y.;Lopezら(1987年)Nucleic Acids Res. 15巻:5643頁)。切断および再連結の機構によるのであれ、遺伝子変換の機構(複数可)によるのであれ、相同に対合した連結部におけるヘテロ二重鎖DNAの形成は、1つのDNA分子から別のDNA分子へと遺伝子配列情報を移行させるように機能できる。
一実施形態では、導入遺伝子配列をコードするDNAは、細胞の染色体中にランダムに挿入され得る。このランダム組み入れは、当業者に公知の、DNAを細胞中に導入する任意の方法から生じ得る。これには、エレクトロポレーション、ソノポレーション(sonoporation)、遺伝子銃の使用、リポトランスフェクション(lipotransfection)、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマーの使用、マイクロインジェクション、アデノウイルス、AAVおよびレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターの使用、ならびにII群リボザイムが含まれ得るがこれらに限定されない。一実施形態では、をコードするDNAは、導入遺伝子またはその発現産物の存在がレポーター遺伝子の活性化を介して検出できるように、レポーター遺伝子を含むように設計され得る。上に開示したものなどの、当該分野で公知の任意のレポーター遺伝子が使用され得る。このレポーター遺伝子はまた、細胞に添加されている導入遺伝子のうち1つであり得、その結果、その導入遺伝子(例えば、DAFまたはCD46またはEPCRまたはCD47)の細胞表面発現は、導入遺伝子(および共挿入された導入遺伝子組合せ)の遺伝子導入および部分配列発現について富化するための手段として、フローサイトメトリー(および前記導入遺伝子に特異的な蛍光抗体)と併せて使用され得る。レポーター遺伝子が活性化された細胞を細胞培養物中で選択することによって、導入遺伝子を含む細胞が選択され得る。他の実施形態では、導入遺伝子をコードするDNAは、エレクトロポレーションを介して細胞中に導入され得る。他の実施形態では、DNAは、リポフェクション、感染または形質転換を介して細胞中に導入され得る。一実施形態では、エレクトロポレーションおよび/またはリポフェクションが、線維芽細胞をトランスフェクトするために使用され得る。特定の実施形態では、トランスフェクトされた線維芽細胞は、当該分野で公知であり以下に記載されるように、トランスジェニック動物を生成するための核移植の核ドナーとして使用され得る。
例示的実施形態では、導入遺伝子は、ゲノム編集ツールを利用して動物中に組み込まれる。これらのツールには、ヌクレアーゼおよび部位特異的リコンビナーゼが含まれるがこれらに限定されない。例示的実施形態では、挿入の方法は、インテグラーゼ(リコンビナーゼ)、CRISPR/CAS9ヌクレアーゼ、TALANヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどであるがこれらに限定されない遺伝子編集ツールを利用するゲノム編集法によって促進される。
一実施形態では、導入遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を利用して組み込まれる。
別の実施形態では、導入遺伝子は、CRISPR/CAS9ヌクレアーゼを利用して組み込まれる。
例示的実施形態では、導入遺伝子は、部位特異的リコンビナーゼを利用して組み込まれる。特異的リコンビナーゼテクノロジーは、細胞のDNA中の特異的部位において欠失、挿入、転座および逆位を実施するために広く使用される。これは、DNA改変が特定の細胞型にターゲティングされること、またはDNA改変が特定の外部刺激によって誘発されることを可能にする。これは、真核生物系および原核生物系の両方において実行される。遺伝子工学操作戦略のために効率的に働くいくつかの組換え系が存在する。Flp−FRTおよびCre−loxPリコンビナーゼ系は、可逆的であり、したがって、部位特異的な組み入れおよび切除の両方を促進する。DNAの正確な組み入れ、切除および/または逆位を生じる高度に部位特異的な組換え反応を触媒するインテグラーゼは、ゲノム組み入れプロセスを媒介する。セリン(ФC31、Bxb1、R4)およびチロシンインテグラーゼ(λ、P22、HP1)は、ゲノム工学操作に現在適用されているインテグラーゼの2つの主要なファミリーである。広い意味では、部位特異的組換えのプロセスには、タンパク質−タンパク質相互作用を介してそれらをごく接近させるための、リコンビナーゼ基質(複数可)へのリコンビナーゼの結合が関与する。このプロセスの間、基質は切断され、DNA末端は鎖交換反応において再組織化され、その結果、DNA骨格の再連結が組換え産物を生じさせる。ほとんどの場合、セリンインテグラーゼは、単純なatt部位を使用する高度に効率的な不可逆的組換えを触媒している。
核酸ターゲティングベクター構築物は、細胞において相同組換えを達成するために設計され得る。一実施形態では、ターゲティングベクターは、プロモータートラップを使用して設計され、ここで、ターゲティングされた遺伝子座における組み入れは、導入遺伝子の挿入されたオープンリーディングフレームが、挿入された遺伝子(または挿入された選択可能マーカー;例えば、NeoもしくはPuro)の発現を駆動するために内因性または天然のプロモーターを利用することを可能にする。特定の実施形態では、ターゲティングベクターは、「ポリ(A)トラップ」を使用して設計される。プロモータートラップとは異なり、ポリ(A)トラップベクターは、ターゲット細胞(即ち、線維芽細胞またはES細胞)においては発現されないものを含む、より広いスペクトルの遺伝子を捕捉する。ポリAトラップベクターは、ポリAシグナルを欠く選択可能マーカー遺伝子の発現を駆動する構成的プロモーターを含む。ポリAシグナルを交換するのは、下流エクソン中にスプライスするように設計されたスプライスドナー部位である。この戦略では、選択可能マーカー遺伝子のmRNAは、ターゲット細胞におけるその発現状態に関わらず、内因性遺伝子のポリAシグナルのトラップの際に安定化され得る。一実施形態では、ポリアデニル化のためのシグナルを欠損した選択可能マーカーを含むターゲティングベクターが構築される。
本発明の動物を生産するために使用されるベクター構築物は、配列に作動可能に連結したプロモーター−エンハンサー配列が含まれるがこれらに限定されない調節配列、「2A」ペプチドテクノロジーおよびドッキングベクターを含み得る。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。
特定の実施形態では、二シストロンベクターは、2つの導入遺伝子と、器官、組織および細胞における発現を制御する1つの組織特異的プロモーターとを含む。
一部の場合には、トランスジェニック細胞は、細胞ゲノム中へのターゲティングされた導入遺伝子の挿入または組み入れ(即ち、相同組換えを介した)の結果である遺伝子改変を有する。一部の場合には、トランスジェニック細胞は、細胞ゲノム中への非ターゲティング化(ランダム)組み入れの結果である遺伝子改変を有する。これらの細胞は、適切な組み入れを提供する細胞を同定するために、適切に選択された培地において増殖され得る。次いで、所望の表現型を示す細胞は、制限分析、電気泳動、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応、または当該分野で公知の別の技術によってさらに分析され得る。ターゲット遺伝子部位において適切な挿入を示す(または非ターゲティング化適用では、ランダム組み入れ技術が所望の結果を生じた)断片を同定することによって、ターゲット遺伝子を不活性化または他の方法で改変するような相同組換え(または所望の非ターゲティング化組み入れ事象)が生じた細胞が同定され得る。
本明細書に記載される遺伝子改変されたまたはトランスジェニックの動物、例えば、有蹄動物またはブタは、当該分野で公知の任意の適切な技術を使用して生産され得る。これらの技術には、(例えば、前核および/または細胞質の)マイクロインジェクション、卵子もしくは接合体のエレクトロポレーション、および/または体細胞核移植(SCNT)が含まれるがこれらに限定されない。
他の実施形態では、導入遺伝子を含むブタ細胞などの有蹄動物細胞は、クローン化されたトランスジェニック動物を生産するために、除核された卵母細胞中への核移植のための核を提供するためのドナー細胞として使用され得る。一実施形態では、有蹄動物細胞は、核移植のためのドナー細胞として有用であるために、導入遺伝子タンパク質を発現する必要がない。一実施形態では、ブタ細胞は、プロモーターを含む核酸構築物またはベクターから導入遺伝子を発現するように工学操作され得る。あるいは、ブタ細胞は、相同組換えを介して、内因性プロモーターの制御下で導入遺伝子を発現するように工学操作され得る。一実施形態では、導入遺伝子核酸配列は、組織特異的プロモーター、組織特異的エンハンサーまたはその両方の制御下でゲノム中に挿入され得る。別の実施形態では、導入遺伝子核酸配列は、構成的プロモーターの制御下でゲノム中に挿入され得る。ある特定の実施形態では、体細胞におけるターゲティング相同組換えを可能にするように設計されたターゲティングベクターが提供される。これらのターゲティングベクターは、相同組換えを介して目的の内因性遺伝子をターゲティングするために、哺乳動物細胞中に形質転換され得る。一実施形態では、ターゲティング構築物は、上流配列とインリーディングフレームになるように、導入遺伝子ヌクレオチド配列および選択可能マーカー遺伝子の両方を内因性遺伝子中に挿入し、活性融合タンパク質を生産する。細胞は、本発明の方法を使用して構築物で形質転換され得、選択可能マーカーによって選択され、次いで、組換えの存在についてスクリーニングされる。
本発明の動物(または胎仔)は、以下から選択される群が含まれるがこれらに限定されない以下の手段に従って繁殖され得る:SCNT、天然交配、核ドナーとして既存の細胞系、胎仔もしくは動物由来の細胞を使用する−NT前にこれらの細胞にさらなる導入遺伝子を任意選択で添加する−SCNTを介した再誘導、連続的核移植、人工生殖テクノロジー(ART)、またはこれらの方法もしくは当該分野で公知の他の方法の任意の組合せ。一般に、「交配する」または「交配した」とは、天然手段および人工手段の両方を含む、任意の繁殖手段を指す。さらに、本発明は、本明細書に開示される方法によって生産された動物の全ての子孫を提供する。ある特定の実施形態では、かかる子孫は、本明細書に記載される遺伝子についてホモ接合性になり得ることが理解される。
一実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるトランスジェニック動物(例えば、ブタ動物)に由来する器官、器官組織または細胞である。
移植された肺の長期生存は、心臓、腎臓および肝臓を含む他の器官よりも劣っている。肺移植後のこの劣った転帰は、虚血再灌流(IRI)傷害、心停止後の脳死状態にあるドナーから主に生じる虚血によって開始される炎症性侵襲といった多くの因子と関連し得るが、調達の間の器官回収の持続時間、器官低温保存などの因子を含む。引き続いて、IRIが、血流が回復されるときに肺組織の再酸素供給の際に増悪する。傷害へのさらなる侵襲は、他の移植された器官と比較したものであり、新たに移植された肺は、手術後に環境抗原に曝露され続け、部分的に、生存率における減少の原因とされ得る。移植された肺の環境抗原へのほぼ継続的な曝露は、免疫認識経路が活性化されて拒絶をもたらし、おそらくは炎症、組織損傷およびIRIの結果に対する増加した感受性が生存率を増加させるために対処されるべきである、独自の状況を創出することが提唱されている。例示的実施形態では、肺移植耐容性誘導のための戦略が考慮され、ex vivo肺灌流、より具体的には、移植された肺の長期生存を増強するための遺伝子療法としてのAdhIL−10を補充したSTEEN溶液による肺の灌流を介して肺を再コンディショニングすることが非限定的な一例である。さらなる一実施形態では、耐容性は、CD47ありまたはなしの、胸骨、胸腺から収集された「混合キメラ」骨髄を介して誘導され得る。
ex vivo肺灌流(EVLP)は、ドナーからの取り出し後に肺を評価および再コンディショニングするために使用され得、その結果、周辺/傷害肺の機能は改善され得、顕著な持続性の機能不全が、レシピエントの移植前に同定され得る。
さらに、抗炎症性サイトカインは、傷害修復、および炎症性サイトカイン生産を減少させるために利用されるインターロイキン(IL)−10のベクター媒介導入を促進し、細胞間肺胞上皮タイトジャンクションの回復を促進し、酸素供給を改善し、血管抵抗を減少させるために、肺中に注入され得る。
異種肺および耐容性:混合キメラの誘導は、移植前に5〜7日間の間、集中非骨髄破壊的コンディショニングレジメンを使用する;死亡ドナーの状況における要求に応えるためにこれを短縮させようとする試みは、過度に毒性であり、耐容性が低かった。臨床的にはいまだ実証されていないが、CD8+メモリーT細胞を枯渇させ、次いで、炎症性サイトカインを最小化するために骨髄移植のタイミングを合わせることによって「遅延された」耐容性誘導が、非ヒト霊長類腎臓移植実験において使用されてきた。
本明細書に記載される発明は、本明細書に記載される器官、器官断片、組織または細胞の異種移植の方法を包含する。例示的実施形態では、これらの方法には、本明細書に記載されるドナー動物由来の器官、器官断片、組織または細胞を対象に投与することが含まれるがこれに限定されない。このドナー動物はブタであり得る。対象または宿主は、霊長類、例えば、ヒヒが含まれるがこれに限定されない非ヒト霊長類(NHP)であり得る。宿主は、ヒト、特に、移植によって治療的に影響され得る疾患または障害に罹患しているヒトであり得る。
レシピエントが単一の肺移植片を有している場合、そのレシピエントは、どちらの肺が交換されているかに依存して、自身の右側または左側のいずれかに開胸切開を有する。ドナー肺が手術室に到着した後で、外科医は、罹患した肺を除去する。レシピエントは、他方の肺を使用して換気される。残りの肺が十分な酸素を交換できない場合、外科医は、レシピエントを心肺バイパスに置く場合がある。彼らの血液は、血液に酸素を供給し二酸化炭素を除去する、身体の外側の機械を通じて濾過される。
両方の肺が移植される場合(両側移植)、外科医は、各乳房の下に前方開胸と呼ばれる切開、または乳房の基部に右側から左側に行く切開を作成する。これは、横行胸骨切開術切開と呼ばれる。両側肺移植では、各肺は別々に交換される。外科医は、最も低い機能を有する肺を除去することによって始める。レシピエントは、部分的心肺バイパスが必要とされない限り、残りの肺を使用して換気される。最初の肺が除去されると、ドナー肺が、3つの接合を使用して取り付けられる。ドナー気管支がレシピエントの主気管支に取り付けられ、次いで、血管が取り付けられる−最初に肺動脈、次いで肺静脈。レシピエントの第2の罹患肺が除去され、他方の新たな肺が同じ方法で取り付けられる。第2の肺が完全に接合されると、血流が回復される。
生着を可能にするのに十分な時間(例えば、1週間、3週間など)が提供され、首尾よい生着が、当業者に公知の任意の技術を使用して決定される。これらの技術には、ドナーC−ペプチドレベルの評価、組織学的研究、静脈内グルコース負荷試験、外因性インスリン必要量試験、アルギニン刺激試験、グルカゴン刺激試験、IEQ/kg(膵島当量(pancreatic islet equivalent)/kg)必要量の試験、レシピエントにおける正常血糖の持続についての試験、免疫抑制必要量の試験、および移植された島の機能性についての試験が含まれ得るがこれらに限定されない(Roodら、Cell Transplantation、15巻:89〜104頁、2006年;Roodら、Transplantation、83巻:202〜210頁、2007年;DufraneおよびGianello、Transplantation、86巻:753〜760頁、2008年;van der Windtら、2009年、Am. J. Transplantation、9巻(12号):2716〜2726頁、2009年を参照のこと)。
ベクター構築および二シストロンベクターを使用するブタの生成
ベクター構築
単一のプロモーターを共有する、2Aペプチド配列によって連結された2つの導入遺伝子からなる複数の二シストロン単位を合成した。2つの形態の2A配列、P2A(66bp)およびT2A(55bp)を利用し、多数の2導入遺伝子単位を連結して、1つのプロモーターからの両遺伝子の同時発現を可能にした。プロモーターは、構成的CAGプロモーター(CMVエンハンサー、ニワトリアクチンプロモーター、ウサギb−グロビンイントロン1)、内皮特異的ブタICAM−2プロモーター、またはTie2内皮特異的エンハンサーとCAGプロモーターとの組合せのいずれかであった。トロンボモジュリン(TBM)、CD39、EPCR、DAF、A20、CD47、CIITA、HO1、TFPIを含む、およびある特定の二シストロンベクターではブタCTLA4−Igもまた含むヒト導入遺伝子のペア(2A配列によって連結される)を構築した。
遺伝子型:GTKO.CD46.cagEPCR.DAF.cagTFPI.CD47。
遺伝子改変されたブタの生産のための多シストロンベクターの構築。
18の多シストロンベクターを生成し、これらの生物活性導入遺伝子の異なる組合せを有するブタを生産するために使用した(図4を参照のこと)。ほとんどの場合において、1対の遺伝子を、内皮特異的pICAM−2プロモーターの制御下で発現させ、同じベクターにおいて、2つの他の遺伝子(第2の二シストロン中)を、構成的CAGプロモーターを介して発現させた。しかし、MCVベクターpREV999では、利用した両方のプロモーターがCAGであった。これらの二シストロンを分離し、インシュレータ配列(図4中の二重矢印によって示される)を隣接させて、ゲノム組み入れ部位に関するいずれの影響も最小化し、各二シストロン中に存在する調節配列間のクロストークもまた制限した。
6遺伝子改変(6GE)を有するブタ動物の生産
直鎖MCV4遺伝子断片(例えば、図4を参照のこと)を、GTKO(アルファ−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウト)またはGTKO.CD46(アルファ−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウト、およびCD46の遍在発現)プラットフォーム遺伝学を有するブタ胎仔線維芽細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、蛍光活性化細胞分取(FACS)によってCAGプロモーターの後で発現される両方の遺伝子について選択し、これらの分取された細胞を、体細胞核移植(SCNTまたはクローニング)のための核ドナーとして使用した。融合した胚を、複数のレシピエント未経産ブタ(8〜10匹の未経産ブタ/MCV)に移植し、妊娠を出産までモニタリングした。
これらのMCVエレメントを発現するブタを、遺伝子組合せのうちいくつかから生産した。生存可能なブタにおいてロバストな発現を提供した4−遺伝子MCV組合せのうち4つは以下を含んだ:
pREV941:EPCR−CD55−TBM−CD39
pREV971:EPCR−HO−1−TBM−CD47
pREV967:EPCR−HO−1−TBM−TFPI
pREV958:EPCR−CD55−TFPI−CD47
これら6GEブタの遺伝学は以下であった:
pREV941:GTKO.CD46.EPCR.CD55.TBM.CD39
pREV971:GTKO.CD46.EPCR.HO−1.TBM.CD47
pREV967:GTKO.CD46.EPCR.HO−1.TBM.TFPI
pREV958:GTKO.CD46.EPCR.CD55.TFPI.CD47
6GEブタ由来の器官の生存および機能
pREV941:GTKO.CD46.EPCR.CD55.TBM.CD39。この6−遺伝子遺伝子型の数匹のファウンダーブタを生産し、肺、心臓および腎臓の移植に使用した。1匹のファウンダーは、ブタから非ヒト霊長類(NHP)in vivo肺モデルにおいて12時間の生命維持を提供した。第2のファウンダーは、in vivo肺Txモデルにおいて7時間の生命維持を提供した。第3のファウンダーは、非ヒト霊長類において5カ月より長く持続する心臓を提供した。6つ全ての遺伝子(図4を参照のこと)の優れた発現を有するファウンダーのうち1匹を、再クローン化し、子孫のいくつかを、10カ月持続した異所性心臓移植片を含むヒヒモデルにおいてin vivoでの移植(Tx)のための器官ドナーとして使用した。この系統を、7時間の生命維持機能で、in vivo肺移植のために使用した。
Gal遺伝子座中へのオリゴヌクレオチド「ランディングパッド」のターゲティング化挿入
アルファGal遺伝子座中へのCRISPR増強されたターゲティング化組み入れのために意図される合成されたDNA断片を、この系統のGTKO.CD46トランスジェニックブタ内の改変された天然のアルファGal遺伝子座において埋め込まれたNeor選択可能マーカー遺伝子のターゲティングのために工学操作した(Daiら 2002年、Nature Biotechnologyを参照のこと)。この「ランディングパッド」断片は100bpであり、リコンビナーゼ/インテグラーゼ媒介部位特異的組換えのための2つの部位、即ち、phi−C31およびBxbI attP部位を含み、これには、改変されたアルファGalにおけるターゲティング化組み入れに特異的な50bpの相同性アームが隣接した。特定のMCV(かかるatt部位が隣接する)内に存在し、引き続いて、アルファGal遺伝子座中に組み入れられる複数の導入遺伝子は、MCV内の他の導入遺伝子とだけでなく、アルファGalノックアウト遺伝子型とも、交配の間に同時分離する。
Gal相同性アームを有するGTKO.CD46hom+TBM.CD39.EPCR.DAF(941HDR)
改変されたアルファGal遺伝子座内に位置するneo遺伝子を、ランディングパッドとして使用した。このアルファGal遺伝子座は、ブタ内のほとんどの細胞系譜ならびに全ての器官および組織において強い発現を有することが公知である。4導入遺伝子の安定かつ一貫した発現を目的として、4−遺伝子MCVベクターは、CRISPR補助された相同組換えを使用してGal遺伝子座中に首尾よくターゲティングされた。かかる組換えは、相同性誘導組換え(HDR)としても公知である。この断片は、約500bpのNeor遺伝子相同性アーム(改変されたGal遺伝子座内に位置する)が隣接するpREV941 MCVからなり、ここで、ΦC31およびBxb1 attP部位もまた、将来の改変のために、MCVのリコンビナーゼ媒介スワップアウト(swap-out)を可能にするために、このベクター中に含めた(図7を参照のこと)。この941hdrベクターを、Neo−Gal CRISPRガイドDNAベクターと共に、GTKO.CD46胎仔線維芽細胞中にトランスフェクトした。2つの細胞クローンを、5’および3’ジャンクションPCR、ならびにMCV941断片の確認された正確な組み入れを有するジャンクションのDNA配列決定によって同定した。1つの遺伝子編集された細胞系は、アルファGal遺伝子座中への14kbpREV941 MCVの一対立遺伝子ターゲティング化挿入を有し、第2の細胞クローンは、アルファGal遺伝子座中への14kbpREV941 MCVの二対立遺伝子ターゲティング化挿入を有した。両方の細胞クローンを混合してSCNTに使用し、9つの胚移植を実施した。アルファGal遺伝子座におけるpREV941 MCVのDNA配列確認された二対立遺伝子組み入れを有する9匹の生存ブタが、3つの妊娠から生産された。一対立遺伝子組み入れに由来するターゲティングされたブタは生産されなかった。
Gal相同性アームを有するGTKO.CD46hom+EPCR.HO−1.TBM.CD47(pREV971HDR)
pREV958、pREV941、pREV971およびpREV954を含む複数のMCVベクターを改変して、遺伝子編集ツールとの利用を可能にするために、隣接する相同性アームを有させた。LR−PCR、ジャンクションPCR(アルファGal遺伝子座中への)およびDNA配列決定によって示されるように、pREV971のターゲティング化挿入を有する2つの細胞クローンを同定した。ターゲティングされた971 HDRコロニー(Icam−TBM.2A.CD47−CAG.EPCR.2A.HO1)のプールをSCNTに使用し、再構築された胚を12匹のレシピエント中に導入した。6つの妊娠がこの試みから生産され、そのうち1つを胎仔の単離に使用した。1つの妊娠由来の8匹全ての胎仔をロングレンジPCRによって分析したところ、pREV971 MCVベクターについて一対立遺伝子ターゲティング化ノックインであることが決定された。
vWF改変
ブタvWFの改変を実施して、ブタvWFによる自発的ヒト血小板活性化に関与する特異的領域に「ヒト化」を提供した。D3(部分的)、A1、A2、A3(部分的)ドメイン内の領域を、hvWF中のGP1b結合部位のフォールディングおよび隔離と関連するブタvWF領域(D3ドメイン)、ならびにGP1b受容体とのコラーゲン結合(2つの領域のうち1つ)と関連する領域(A1ドメイン)、およびADAMTS13切断部位(A2ドメイン)を改変するために選択した。エクソン22〜28は、これらの領域を包含し、したがって、これら7つのヒトエクソンを、遺伝子ターゲティングによって等価なブタゲノム領域を同時に除去するために、cDNA断片(ヒトイントロンなし)として提供した。得られた遺伝子交換戦略は、ブタvWF遺伝子の遺伝子座をその他の点で改変することなく、vWFのキメラヒト−ブタエクソン22〜28領域を創出した(図17を参照のこと)。
β4galNT2 KO(GTKO.CD46.HLA−E背景上)
3遺伝子ブタ(3GE)を、GTKO.CD46、および異種移植に対するナチュラルキラー(NK)細胞応答を防止するために、トリマーとしての(ヒトベータ−2−ミクログロブリンと組み合わせた)ヒトHLA−Eの発現のためのゲノム導入遺伝子を用いて生成した。HLA−E 3−遺伝子ブタは、NK細胞の活性化の防止を伴って、ex vivo肺移植モデルにおいて有効性を示した。ブタβ4galNT2遺伝子のさらなるノックアウトを有するHLAEブタは、異種肺移植の間に宿主NHPにおいて生じる異種抗体(xeno-antibody)応答からのさらなる保護を提供するために試験され得る。CRISPR/Cas9ベクターを生成して、GTKO.CD46.HLAEトランスジェニック線維芽細胞においてβ4galNT2遺伝子をノックアウトした。HLAE背景上に二対立遺伝子β4galNT2 KO(B4KO)を有すると思われる細胞クローンのプールを、核移植に使用した。8匹の胎仔は、得られた7つの妊娠のうち1つに由来し、これらのうち4匹は、DBAレクチン(FL−1031、Vector Labs)染色の完全な欠如によって確認されるように、β4galNT2遺伝子座において二対立遺伝子挿入または欠失(INDEL)を有しただけでなく、β4galNT2の機能的ノックアウト(B4KO)を有した。B4KOを有する3−遺伝子HLAE系統は、ex vivoおよびin vivoのTxモデルにおいて試験され得る。
pREV999:GTKO.CD46.cagEPCR.DAFcagTFPI.CD47
不死ブタ内皮細胞において全ての遺伝子を発現することが示された別のMCV構築物は、in vivo肺Txモデルにおいて優れた生命維持を提供したが、導入遺伝子がゲノム中の独立した位置において2つの二シストロンとしてランダムに組み入れられた遺伝子のセットの遍在性のおよびロバストな発現を提供する。アルファGalまたはブタβ4galNT2のいずれかの相同性アームと共に、pREV999 MCVを有するベクターが生成されている(図2を参照のこと)。GTKOおよびCD46の背景上のB4GALNT2 KOの付加を伴うこのMCVは、肺Txにおける増強された生命維持を提供するために生成され得る。Gal遺伝子座ターゲティング化アームを有するpREV999ベクターを、GTKO線維芽細胞中にトランスフェクトし、ターゲティングされたコロニーを、組み入れ部位ジャンクションのLRPCRおよび配列決定によって同定した。ターゲティングされた細胞を、6匹のレシピエント中へのSCNTのために使用し、妊娠を得た。
アルファGal相同性アームを有するpREV954 MCV(EPCR.DAF.TBM.A20)のターゲティング化ノックインは、GTKO線維芽細胞において達成されており、Gal遺伝子座において954 MCVの一対立遺伝子ノックインを有する細胞系が、SCNTに使用されている。
アルファGal遺伝子座における2つの補体阻害因子遺伝子(CD46+DAF/CD55)のターゲティング化挿入によるGTKOブタの生成。
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