CN107106607A - 适用于异种移植的三重转基因猪 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了改善排斥相关症状、减轻过早分离的方法，并且提供了产生具有改变的表位谱的目的化合物的方法。提供了具有破坏的基因的敲除猪以及从其来源的猪器官、组织和细胞。

Description

适用于异种移植的三重转基因猪
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年10月22日提交的美国临时申请No：62/067,129的优先权，其内容通过引用并入本文。
序列表的并入
与本文一同提交的文本格式的序列表出于所有目的通过引用整体并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
不适用。
技术领域
本发明一般地涉及用于开发适于移植到人中的转基因猪、转基因猪器官、组织或细胞(特别是具有降低的引起血小板减少症倾向、超急性排斥(hyperacute rejection，HAR)反应或血小板摄取的转基因猪)的异种移植和遗传修饰的领域。
背景技术
众所周知，从一个动物到同一物种的另一个动物(例如人到人)的移植是许多严重病症(包括肾、心、肺、肝和其他器官疾病和皮肤损伤(例如严重烧伤疾病))的常规治疗选择。然而，众所周知，没有足够的合适器官可用于移植以满足当前或预期的器官移植的临床需求。肾移植名单上约有100,000名患者，他们接受移植或死亡之前在等待名单上平均保留将近5年。在肾衰竭的患者中，透析提高了患者可等待移植的时间长度。在UNOS肝移植的全国等待名单上有超过18,000名患者，然而在美国每年进行不超过7000次移植。对于患有肝病或肝衰竭的患者，没有相当于透析的系统。
异种移植(将器官、组织或细胞从一种动物移植到不同物种的另一种动物中(例如将猪器官移植到人接受者中))具有减轻可用于移植之器官短缺的潜力，这潜在地帮助全球数千人。然而，使用标准的未修饰的猪组织到人或其他灵长类动物中的异种移植伴随着严重的移植组织排斥。排斥可以是超急性排斥、急性排斥、慢性排斥，可涉及存活限制性的血小板减少性凝血病(survival limiting thrombocytopenia coagulopathy)或者可以是急性体液异种移植反应(acute humoral xenograft reaction，AHXR)。对移植组织上存在的猪抗体的人超急性排斥反应如此强烈，使得移植组织通常在移植到人体中的数分钟或数小时内被人免疫系统损伤。此外，不同的排斥机制可以以器官偏好的方式占主导地位。参见Demetris等，1998“Antibody-mediated Rejection of Human Orthotopic LiverAllografts.A study of liver transplantation across ABO blood group barriers”，Am J.Pathol 132：489-502；Nakamura等，1993“Liver allograft rejection insensitized recipients.Observations in a Clinically Relevant Small AnimalModel”Am J.Pathol.142：1383-91；Furuya等1992.“Preformed LymphocytotoxicAntibodies：the Effets of Class，Titer and Specificity on Liver v HeartAllografts”Hepatology 16：1415-22；Tector等2001.“Rejection of Pig HiverXenografts in Patients with Liver Failure：Implications forXenotransplantation”，Liver Transpl第82-9页；其通过引用整体并入本文。例如，血小板减少性凝血病的早期发生是猪肝异种移植后非人灵长类动物接受者死亡的主要因素。然而，如果抗体介导的异种移植排斥(antibody mediated xenograft rejection，AMXR，AMR)被阻止，则猪肾的非人灵长类动物(non-human primate，NHP)接受者就不会发生显著的血小板减少症，也不会表现出凝血病的临床表现。参见例如Ekser等，2012“GeneticallyEngineered Pig to Baboon Liver Xenotransplantation：Histopathology ofXenografts and Native Organs”PLoS ONE第e29720页；Knosalla等2009，“Renal andCardia Endothelial Heterogeneity Impact Acute Vascular Rejection in Pig toBaboon Xenotransplantation”，Am J Transplant 1006-16；Shimizu等2012.“PathologicCharacteristics of Transplanted Kidney Xenografts”，J.Am.Soc.Nephrology 225-35；其通过引用整体并入本文。
除了需要用于移植的器官、组织和细胞之外，用于输血的安全血液也短缺。每年在美国进行使用包装的人红细胞(RBC)的1100万次输血(National Blood Data Source，1998)。美国的血液供应长期不足。在2001年，预计美国血库将获得比最佳期望少约250,000个单位。官员们例行地预测在当常规献血者休假以及大学生也离开主要城市中心的夏季月份期间会有严重的国家短缺。由于国家拥有稳健且有竞争力的血液收集和分配系统，因此周期性短缺通常不会导致死亡，但是选择性手术(elective surgery)可能需要推迟，并且非重要需求不能得到满足。由于正常捐献的血液只能储存约42天并且少于5％的合格捐献者献血，恶劣的天气条件(例如暴风雪或飓风)常常导致危险的低血液储备。
人血液不仅是稀缺资源，而且其对于接受者也有潜在的风险。尽管有病毒筛选过程，但是捐献的人血液不是100％安全的(FDA，血液采集和输血后向FDA报告的死亡的年度总结(Annual Summary of Fatalities Reported to the FDA Following BloodCollection and Transfusion)，FY2013)。普通人群中丙型肝炎和HIV的发病率使得献血制品昂贵且难以检测。由于确保人血液中没有任何感染性微生物困难且费用高，因此非常希望开发数量不限且不含感染原的红细胞和其他输血产品的来源。
猪细胞表达未见于人细胞中的α(1，3)半乳糖基转移酶(α(1，3)galactosyltransferase，αGal)和胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidinemonophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH)。猪细胞还表达猪β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(β1，4N-acetylgalactosaminyltransferase，β4GalNT2)；认为许多人表达β4GalNT2的形式(Morton等(1970)Vox Sang 19：472-482)。αGal酶催化糖蛋白上半乳糖-α1，3-半乳糖(αGal)残基的形成。CMAH将唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)转化为N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。猪β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(β4GalNT2)催化将N-乙酰半乳糖胺末端添加至唾液酸修饰的乳糖胺以产生Sda样抗原，包括但不限于Sda和GalNAc β1，4[Neu5Acα2，3]Gal β1-4GlcNAc β1-3Gal，也称为CAD或CT血型抗原(Blanchard等(1983)JBC258：7691-7695)。猪β4GalNT2也可催化形成另外的聚糖。在组织移植之前，Neu5Gc、αGal和Sda表位的抗体存在于人血液中，并且参与所植入组织的强烈且即时的抗体介导的排斥。针对另一些β4GalNT2(Sda样)表位的抗体也可存在于患者的血液中，并且可有助于抗体介导的所植入组织的排斥。
已经采用许多策略来解决排斥反应，包括除去编码α(1，3)半乳糖基转移酶和CMAH的基因以阻止酶的表达，修饰编码α(1，3)半乳糖基转移酶和CMAH的基因以降低或限制酶的表达，或者以其他方式限制排斥反应。Phelps等的美国专利7,795,493描述了用于产生缺乏功能性αGal表达的猪的方法。例如，Day等的美国专利7,547,816描述了与野生型猪相比具有降低的α(1，3)半乳糖基转移酶表达的敲除猪。尽管Day猪可能具有降低的α(1，3)半乳糖基转移酶表达，但是Neu5Gc抗原表位仍然存在，而且来自Day猪的糖脂具有αGal抗原表位。遗憾的是，尽管GTKO猪可具有降低的作为异种移植之障碍的抗α-Gal抗体，但是在狒狒中使用GTKO心和肾异种移植物的研究表明，GTKO器官仍然引发免疫原性应答，导致所移植器官的排斥或损伤。用GTKO肾移植并用两种不同免疫抑制方案治疗的狒狒在手术的16天内死亡。Chen等得出结论：“Gal抗原的遗传缺失不提供异种移植物存活的主要益处”(Chen等，(2005)Nature Med 11(12)：1295-1298)，Koike等的美国专利7,560,538和Zhu等的美国专利7,166,378和8,034,330分别描述了用于制备不太可能遭受延迟异种移植排斥和超急性排斥之用于移植的猪器官的方法。Zhu的专利讨论了猪细胞上CMAH活性或表位的降低。然而，Basnet等检测了人血清对CMAH-/-小鼠细胞的细胞毒性反应。Basnet等得出结论：“抗Neu5Gc Ab介导的免疫应答可显著参与异种细胞移植中的移植物失功(graft loss)，但在器官移植中则不参与”(Basnet Diamond等，2010Xenotransplantation 17(6)：440-448)。Diamond等的美国专利6,166,288描述了制备以降低的异种移植材料的排斥将用于异种移植到人中的器官、组织或细胞的方法。美国专利6,166,288描述了表达岩藻糖基转移酶基因的转基因猪，所述岩藻糖基转移酶基因编码据称从猪器官、组织和细胞中除去某些异源反应性抗原的酶。美国专利6,166,288没有提供具有三个猪基因改变的转基因猪。
Schwarz等的美国专利6,572,867提供了用于降低灵长类动物中抗(αGal(1，3)Gal)抗体之血浆水平的免疫抑制组合物。免疫抑制治疗在移植领域中是已知的。因为免疫抑制药物方案抑制了患者的免疫应答，其提高了感染风险，需要昂贵的维护药物，可包括与其他药物相互作用的药物，并可引起额外的副作用，例如体重增长。
该领域的进展在很大程度上取决于具有降低排斥反应之修饰的遗传修饰猪的开发。遗憾的是，开发纯合转基因猪是缓慢的过程，需要长达三年时间，在胎儿成纤维细胞中使用传统的同源重组方法，随后进行体细胞核转移(somatic cell nuclear transfer，SCNT)，然后使杂合的转基因动物繁殖以产生纯合的转基因猪。用于异种移植的新的转基因猪的开发受到缺乏多能干细胞的阻碍，作为替代依赖胎儿成纤维细胞作为进行遗传工程的细胞。
因此，本领域中需要改进的、简单的、可重复的、高效的和标准化的方法，所述方法产生具有降低的αGal、Sda样和Neu5Gc表位的三重敲除(αGal、β4GalNT2、CMAH)猪作为用于人移植接受者的器官、组织、血液和细胞的移植材料来源。
发明概述
本公开内容一般地涉及制备用于移植到人中的具有降低的α(1，3)半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2表达的猪器官、组织或细胞的方法。
提供了转基因猪，其在所述猪的至少一个细胞的核基因组中包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因。与野生型猪中的表达相比，转基因猪中的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶的表达降低。提供了从三重转基因猪获得的猪器官、组织、输血产品或细胞。猪器官、组织、输血产品或细胞可选自皮肤、心、肝、肾、肺、胰、甲状腺、小肠及其组分。在一方面，与将来自野生型猪的组织移植给人相比，将来自三重转基因猪的组织移植给人时，排斥相关症状改善。在一方面，排斥相关症状选自包含以下的组：细胞排斥反应相关症状、体液排斥反应相关症状、超急性排斥相关症状、急性体液异种移植反应排斥相关症状和急性血管性排斥反应相关症状。在一方面，与将来自野生型猪的器官、组织、输血产品或细胞移植给人相比，将来自三重转基因猪的器官、组织、输血产品或细胞移植给人时，血小板减少症降低。在一方面，与将来自野生型猪的肝暴露于人血小板时相比，将来自三重转基因猪的肝暴露于人血小板时，肝显示出降低的人血小板吸收。在一方面，与将来自野生型猪的肾移植给人相比，将来自三重转基因猪的肾移植给人时，排斥相关症状降低。
在一个实施方案中，提供了从三重转基因猪获得的皮肤相关产品，所述转基因猪在所述猪的至少一个细胞的核基因组中包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，并且其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶的表达降低。在本申请的一个方面，皮肤相关产品表现出减轻的与伤口(特别是与人皮肤伤口)过早分离(premature separation)。
提供了制备用于异种移植到人中的移植材料的方法。所述方法包括提供本申请的三重转基因猪作为移植材料的来源，并且其中所述移植材料选自器官、组织、输血产品和细胞，并且其中所述移植材料具有降低的αGal、Sda样抗原和Neu5Gc抗原水平。
提供了三重转基因猪，其在所述猪的至少一个细胞的核基因组中包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β1，4GalNT2基因。在一个实施方案中，α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含但不限于以下破坏的组：与G至A替换相邻的三碱基对缺失、单碱基对缺失、单碱基对插入、二碱基对插入、六碱基对缺失、十碱基对缺失、七碱基对缺失、五碱基对缺失的八碱基对插入、五碱基对插入、十一碱基对缺失和十八碱基对缺失；CMAH基因的破坏选自包含但不限于以下破坏的组：四碱基对插入、一碱基对缺失、二碱基对缺失、三碱基对缺失、四碱基对插入、五碱基对缺失、八碱基对缺失、十一碱基对缺失、十二碱基对缺失、单碱基对插入、单碱基对缺失的二碱基对插入、六十六碱基对缺失的十二碱基对插入、三碱基对缺失的四碱基对插入；以及五碱基对缺失/一碱基对替换，并且β4GalNT2基因的破坏选自包含但不限于以下破坏的组：一碱基对插入、十二碱基对缺失/一碱基对替换、十二碱基对缺失、十四碱基对缺失、五碱基对缺失和271碱基对缺失/1碱基对插入。在一个实施方案中，α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下破坏的组：五碱基对缺失和七碱基对缺失，CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：十二碱基对缺失和三碱基对缺失/四碱基对插入，β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：一碱基对插入、十二碱基对缺失和五碱基对缺失。在一个实施方案中，α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下破坏的组：十一碱基对缺失和十八碱基对缺失，CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：六十六碱基对缺失/十二碱基对插入和五碱基对缺失/一碱基对替换，并且β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十四碱基对缺失、十二碱基对缺失/一碱基对替换和271碱基对缺失/1碱基对插入。与野生型猪相比，三重转基因猪中功能性α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低。与将来自野生型猪的组织移植给人相比，将来自三重转基因猪的组织移植给人时，超急性排斥相关综合征改善。
提供了使将人对象鉴定为需要人器官移植的对象与进行人器官移植之间的持续时间延长的方法。所述方法包括提供来自三重转基因猪的器官，所述三重转基因猪包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶的表达降低；以及以治疗有效的方式将来自三重转基因猪的器官与人对象通过手术连接。在一方面，将所述器官与人对象内部通过手术连接。在一方面，将所述器官与人对象外部通过手术连接。所述器官可与对象直接或间接连接。
提供了使将对象鉴定为需要人肝移植的对象与进行人肝移植之间的持续时间延长的方法。所述方法包括提供来自三重转基因猪的器官，所述三重转基因猪包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶的表达降低；以及以治疗有效的方式将来自三重转基因猪的肝与人对象通过手术连接。在一方面，将肝与人对象内部通过手术连接。在一方面，将肝与人对象外部通过手术连接。肝可与对象直接或间接连接。
提供了使将人对象鉴定为需要人肾移植的对象与进行人肾移植之间的持续时间延长的方法。所述方法包括提供来自三重转基因猪的肾，所述三重转基因猪包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶的表达降低；以及以治疗有效的方式将来自三重转基因猪的肾与人对象通过手术连接。在一个方面，将肾与人对象内部通过手术连接。在一方面，将肾与人对象外部通过手术连接。肾可与对象直接或间接连接。
提供了减轻皮肤相关产品与人对象过早分离的方法。所述方法包括提供包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因的三重转基因猪以及从三重转基因猪制备皮肤相关产品的步骤。与野生型猪相比，三重转基因猪中α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低。
提供了在患者中改善超急性排斥相关症状的方法。所述方法包括将具有降低的αGal抗原、Sda样抗原和Neu5Gc抗原水平的猪移植材料移植到对象中。与将来自野生型猪的猪移植材料移植到人中相比，超急性排斥相关症状改善。
提供了表现出改变的表位谱(epitope profile)的细胞培养试剂。从包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因的三重转基因猪分离细胞培养试剂。与野生型猪相比，三重转基因猪中α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低。细胞培养试剂选自包含以下的组：细胞培养基、细胞培养血清、细胞培养添加剂和能够增殖的分离的细胞。在一方面，细胞培养试剂分离自三重转基因猪，其中α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下破坏的组：五碱基对缺失、七碱基对缺失或在指定位置的单碱基对插入，CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：十二碱基对缺失、三碱基对缺失/四碱基对插入、七碱基对缺失和十一碱基对缺失，并且β4GalNT2基因的破坏选自在指定位置的单碱基对插入、十二碱基对缺失和五碱基对缺失。在一方面，细胞培养试剂分离自三重转基因猪，其中α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下破坏的组：十一碱基对缺失和十八碱基对缺失，CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：六十六碱基对缺失/十二碱基对插入和五碱基对缺失/一碱基对替换，并且β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十四碱基对缺失、十二碱基对缺失/1碱基对替换和271碱基对缺失/1碱基对插入。
提供了产生具有改变的表位谱的目的化合物的方法。所述方法包括以下步骤：提供显示改变的表位谱的细胞培养试剂，以及用表现出改变的表位谱的细胞培养试剂孵育能够表达目的化合物的分离的细胞。从包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因的三重转基因猪分离具有改变的表位谱的细胞培养试剂。与野生型猪相比，三重转基因猪中α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低。目的化合物上Neu5Gc、αGal和Sda样表位的水平低于当所述目的化合物是由用来自野生型猪的细胞培养试剂孵育的分离的细胞产生的时所述目的化合物上Neu5Gc、αGal和Sda样表位的水平。在一个实施方案中，目的化合物选自包含糖脂和糖蛋白的组。在多个方面，目的化合物是糖蛋白，其选自包含以下糖蛋白的组：抗体、生长因子、细胞因子、激素和凝血因子(clotting factor)。在一个实施方案中，α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自以下破坏：五碱基对缺失、七碱基对缺失或指定位置的单碱基对插入，CMAH基因的破坏选自以下破坏：十二碱基对缺失、三碱基对缺失/四碱基对插入、七碱基对缺失和十一碱基对缺失，并且β4GalNT2基因的破坏选自：指定位置的单碱基对插入、十二碱基对缺失和五碱基对缺失。在一个实施方案中，α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下破坏的组：十一碱基对缺失和十八碱基对缺失，CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：六十六碱基对缺失/十二碱基对插入和五碱基对缺失/一碱基对替换，并且β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十四碱基对缺失、十二碱基对缺失/一碱基对替换和271碱基对缺失/1碱基对插入。
提供了用于移植到人中的猪移植材料。猪移植材料的脂质和蛋白质具有降低的αGal表位水平，并且移植材料具有降低的Neu5Gc和Sda样表位水平。
提供了转基因猪，其在所述猪的至少一种细胞的核基因组中包含破坏的α1，3-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中与野生型猪相比，α1，3-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低，并且其中VVL结合降低。
附图简述
图1描述了示例性敲除猪(猪分离群(isolate)标识符(identifier)47-1)中的序列改变的示意图。图A示出了野生型(wild-type，wt)和破坏的α1，3半乳糖基转移酶基因(GGTA-1)核苷酸序列的一部分。野生型GGTA-1核苷酸序列(WT)的一部分示于顶行。来自三重转基因猪的改变的GGTA-1核苷酸序列的同一区域示于两个底行中，每个底行提供一个GGTA-1等位基因的改变的序列。来自示例性三重转基因猪的破坏的GGTA-1核苷酸序列是五个碱基对和七碱基对缺失。短划线(dash)表示其中在野生型序列中将出现缺失的核苷酸的核苷酸序列部分。
图B示出了示例性三重转基因猪的野生型和破坏的CMAH基因的一部分。野生型(wt)CMAH基因的一部分示于顶行。来自同一三重转基因猪的相当区域的两个等位基因的核苷酸序列示于野生型序列下方。三重转基因猪的破坏的CMAH序列包含十二碱基对缺失和三碱基对缺失/四碱基对插入。短划线表示其中缺失发生的核苷酸序列的区域。
图C示出了示例性三重转基因猪的野生型和破坏的β4GalNT2基因的一部分。野生型(wt)β4GalNT2基因的一部分示于顶行。来自相同的示例性三重转基因猪的相当区域的核苷酸序列示于野生型序列的下方。如所示，三重转基因猪的破坏的β4GalNT2序列包含单碱基对插入、十二碱基对缺失和五碱基对缺失。与GGTA1和CMAH序列不同，检测到三个不同的等位基因。β4GalNT2序列有可发生在猪基因组中多于一个不同的基因座。短划线表示发生β4GalNT2缺失的核苷酸序列的区域。
图2描绘了从来自CMAH/αGal双重转基因猪(CMAH，上图)或CMAH/αGal/β4GalNT2三重转基因猪(B4，下图)的外周血单核细胞(PBMC)获得的流式细胞术数据的图。细胞未经染色(仅细胞，白色曲线)或用与FITC缀合的双花扁豆(Dolichus biflorus)凝集素染色(DBA-FITC，实心黑色曲线)。DBA结合带有由β4GalNT2产生的聚糖或Sda样聚糖的α-N-乙酰半乳糖胺。在上图中，来自在用DBA孵育后具有野生型β4GalNT2序列(CMAH)的双重敲除(CMAH/αGal)猪之PBMC的谱(黑色曲线)明显相对于由来自双重转基因CMAH/αGal猪的未染色细胞的谱(白色曲线)偏移。在下图中，来自用DBA孵育后具有破坏的β4GalNT2序列(B4)的三重转基因猪之PMBC的谱显著地覆盖来自三重转基因CMAH/αGal/β4GalNT2猪的未染色细胞的谱(叠加的白色和黑色曲线的区域表示为灰色)。DBA-FITC处理的细胞的谱中的有限变化表明缺乏与来自三重转基因猪的PBMC结合的DBA，并且来自三重转基因猪的细胞上Sda样抗原的出现降低。
图3示出了来自多种猪的PBMC的表位分析结果。图A示出了用来自野生型(WT)和三重转基因(GGTA1-/-、CMAH-/-、B4GalNT2-/-)猪的PBMC进行的实验之流式细胞术结果。在y轴上示出细胞计数；在x轴上示出荧光。
最左侧的图描绘了来自阴性对照(白色)和用IB4凝集素孵育的细胞(深色)的数据。IB4与由GGTA1的基因产物产生的α半乳糖连接的碳水化合物相互作用。对照(阴性)和实验(阳性)结果之间重叠的曲线用灰色示出。用IB4孵育的野生型细胞示出与未染色的野生型细胞不同的单独峰。用IB4孵育的三重转基因猪的细胞没有示出显著的第二个峰，表明αGal连接的碳水化合物显著降低。
中间图描绘了来自阴性对照(白色)和用HD抗体孵育的细胞(深色)的数据。阴性对照是不相关的同种型对照抗体。HD抗体与由CMAH基因的产物产生的Neu5Gc碳水化合物相互作用。对照(阴性)和实验(阳性)结果之间重叠的曲线用灰色示出。用HD抗体孵育的野生型细胞示出与用不相关抗体处理的野生型细胞不同的单独峰。用HD抗体孵育的三重转基因猪的细胞没有示出显著的第二个峰，表明Neu5Gc表位水平显著降低。
最左侧的图描绘了来自阴性对照(白色)和用DBA凝集素孵育的细胞(深色)的数据。DBA凝集素与β4GalNT2的基因产物产生的碳水化合物结构相互作用。对照(阴性)和实验(阳性)结果之间重叠的曲线用灰色示出。用DBA孵育的野生型细胞示出与未染色的野生型细胞不同的单独峰。用DBA孵育的三重转基因猪的细胞没有示出显著的第二个峰，表明由β4GalNT2的基因产物产生的碳水化合物显著降低。
图B示出了从流式细胞术实验获得的用于评价来自44种独特人的血清中的人IgG(X轴)和IgM(Y轴)与来自多种猪类型的PBMC的相对结合之结果的散点图。来自野生型(WT)猪的PBMC的结果用空心正方形示出，来自单个转基因αGal破坏的(GGTA1-/-)猪的结果用三角形示出，来自双重转基因CMAH/αGal破坏的(GGTA1-/-和CMAH-/-)猪的结果用空心圆示出，来自三重转基因CMAH/αGal/B4GalNT2破坏的(GGTA1-/-和CMAH-/-和β4GalNT2-/-)猪的结果用实心圆示出。来自三重转基因CMAH/αGal/B4GalNT2破坏的(GGTA1-/-和CMAH-/-和β4GalNT2-/-)猪的结果以低水平的IgM和IgG结合聚集；几个数据点表明与三重转基因细胞的中等IgG结合。
图4示出了从流式细胞术实验获得的用于评价来自恒河猴(Rhesus Macaque)、狒狒和人的血清中恒河猴IgG(X-轴)和IgM(Y-轴)与来自多种猪类型的PBMC的相对结合之结果的散点图。来自单个转基因αGal破坏的(GGTA1-/-)猪的PBMC的结果示于x轴上，来自双重转基因CMAH/GGTA1-/-破坏的(GGTA1-/-和CMAH-/-)猪的结果用空心圆示出，三重转基因CMAH/GGTA1-/-/B4GalNT2破坏的(GGTA1-/-和CMAH-/-和β4GalNT2-/-)猪的结果用实心圆示出。CMAH/GGTA1-/-和CMAH/GGTA1-/-/β4GalNT2在y轴上。在线下方的结合表示与x轴上猪细胞的结合比与y轴上的猪细胞更具抗原性。用猪细胞测试人(上)、狒狒(中)和恒河猴(底部)血清。IgM结果示于左侧；IgG结果示于右侧。
图5提供了一系列流式细胞术结果，表明与红细胞(RBC)结合的IgG抗体水平。针对三种人血清评价了多种类型的RBC。来自人A血清的结果在左栏，人O血清1在中间栏，并且人O血清2在右栏中。B4Gal/CMAH/Gal三重敲除(B4G三重KO)RBC结果在顶行中。人O 1RBC结果在第二行中。人O 2RBC结果在第三行中。人A RBC结果在第四行中。猪野生型RBC在底行中。当用人A和人O血清1评价野生型猪RBC时，存在多个显著峰(significant peak)；当用人O血清2评价野生型猪RBC时，存在多个小峰(minor peak)。在追踪人A RBC和两种人O血清中，存在显著峰。然而，人A RBC和人A血清仅显示一个重叠的峰。正如所预期的，两种人O RBC在针对所有三种血清进行测试时仅显示单个重叠峰。当针对所有三种血清测试时，B4Gal/CMAH/Gal三重敲除RBC仅显示单个重叠峰，这与人O RBC类似。
图6提供从与多种猪和人RBC结合的人抗体之流式细胞术比较获得的数据的总结。将来自74个人的血清用猪和人RBC孵育。示出了来自野生型猪RBC(W)、缺乏GGTA1和CMAH(CMAH RBC)或GGTA1/CMAH/β4GalNT2(B4G RBC)的动物和人同种异体RBC(h)的数据。图A示出了与多种RBC结合IgG的总结。数据表示IgG的归一化中位荧光强度(medianfluorescence intensity，MFI)和标准差。使用人A、B、O和AB血清。使用重复测量单因素方差分析(ANOVA)和Tukey的多重比较检验进行抗体结合的组间比较。与多种RBC结合的人抗体在野生型细胞上最高，并且随着每个聚糖产生基因被失活而降低。三重敲除RBC(B4G)最接近人allo-RBC(h)上观察到的抗体结合水平。图B示出了与多种RBC结合的IgM的总结。数据表示IgM的归一化中位荧光强度(MFI)和标准差。对于IgG和IgM二者都观察到野生型>双重敲除＞三重敲除≈人的趋势。在图C中，流式细胞术用于揭示GGTA1、CMAH和β4GalNT2基因失活对α-Gal、Neu5Gc和DBA反应性聚糖的表达的作用。在图中示出了来自猪野生型(W)红细胞、CMAH/αGal双重敲除(D)红细胞、CMAH/αGal/βGalNT2三重转基因红细胞(T)和人血型O红细胞的结果。流式细胞术结果表明具有每种基因破坏的抗原性结构的丧失。在图D中，对数据作图以显示当在x轴上检查与人O RBC结合的抗体时，每个人血清样品的单个MFI以及当在y轴上检查与三重敲除猪RBC(B4G)结合的抗体时每个人血清样品的单个MFI。图上对角线下方的数据点表示对猪三重敲除细胞的结合低于人血型O细胞。O型血的人被认为是万能供血者；输血人群O RBC经受有限的体液破坏。
图7提供了使用定量质谱法来测量单个抗体同种型丰度的免疫球蛋白分析的结果。图7A是描述用于评价IgG和IgM与RBC的结合的生物化学方法的图式。评价了来自野生型猪(W)、GGTA1/CMAH缺陷猪(D)、GGTA/CMAH/β4GalNT2猪(T)和自体人RBC(H)的RBC。该过程的细节在本文中其他地方描述。图B中示出了从RBC洗脱的物质的代表性凝胶。将分子量标志物(Mw)、粗制起始血清(S)和纯化的人IgG上样以用于比较。其他对照包括未处理的RBC(泳道1所有样品)和经酸洗涤但未用血清孵育的RBC(泳道2所有样品)。通过低pH孵育2或3分钟从经血清处理的RBC中去除材料(分别为泳道3和4，所有样品)。单箭头标记与白蛋白大小类似的蛋白质的迁移。尽管自体人RBC比猪细胞释放出更少的该蛋白质，但是在另一些实验中没有重现这一结果。双箭头突出显示与IgG大小类似的蛋白质的迁移(泳道3和4)。IgG重链大小的带的强度在不同的RBC之间不同。在低pH下孵育细胞2或3分钟释放相似的蛋白质水平。为了定量从细胞释放的抗体的量，收集在两分钟洗脱样品中包含免疫球蛋白重链大致大小的凝胶切片，用胰蛋白酶孵育并通过质谱法(参见下文)进行评估。三个箭头指明与血红蛋白大小相同的一起迁移的蛋白质。无血清样品的上清液中血红蛋白的存在表明在操作期间发生RBC裂解。所有RBC类型的泳道1与2之间的变化表明酸洗涤加速裂解并从细胞释放提高量的血红蛋白。作为略高于免疫球蛋白轻链的双重迁移的未知多肽(由＊标记)甚至在不存在血清的情况下也从RBC释放。
图C示出了用与通过质谱法确定的相同血清的单独等分试样孵育后，从每种类型的RBC洗脱的IgM和IgG的相对水平。针对每种血清，来自质谱分析的AUC均相对于从与自体人红细胞结合的总IgG或IgM获得的值进行归一化。通过对每个同种型的AUC求和来计算IgG的总抗体。示出了野生型猪红细胞(W)、三重敲除猪红细胞(B)和自体人红细胞(A)的结果。自体人红血细胞来自与获得所测试血清相同的对象。
图8提供免疫球蛋白衍生肽的代表性质谱色谱图。在y轴上示出相对丰度。在x轴上示出以分钟(min)计的时间。使用这样的色谱图来计算AUC。
图9示出了流式细胞术分析设门(gating)和命运(fate)。将三种人血清用来自野生型猪(W)的RBC、自体人RBC(A)和来自GGTA1/CMAH/β4GalNT2缺陷猪(T)的RBC孵育。在用荧光二抗孵育以报告结合的人免疫球蛋白后，通过流式细胞术分析细胞。使用前向散射(FSC，x轴)和侧向散射(SSC，Y轴)来识别RBC。黑色椭圆形表示用于选择RBC进行分析的门。每个门旁边示出的百分比表示驻留在门内的总事件的分数。人血清的破坏的野生型猪RBC如通过落入在设门区域内的碎片增多和RBC降低所见。野生型RBC高抗原性和随后的细胞破坏可有助于在一些实验中野生型(W)样品的直方图质量。
图10描绘了通过质谱法确定的针对每个IgG同种型获得的曲线下面积(AUC)值。在y轴上示出AUC；在x轴上示出IgG同种型和RBC类型。示出了来自三重敲除猪红细胞(TKO)、人自体红细胞(Human Auto)和野生型猪红细胞(WT)的结果。
图11描述了从野生型(WT)或Gal/CMAH/β4GalNT2三重敲除猪(B4G)获得的外周血单核细胞(PBMC)获得的流式细胞术结果。示出了来自两个猪分离群(58-1和59-2)的PBMC。IB4被αGal结合；在存在降低的αGal表达情况下，IB4结合降低。Neu5Gc是由CMAH基因产物产生的表位。DBA是由β4GalNT2产物结合的凝集素。灰色直方图示出了阴性对照结果。对于各自具有IB4、DBA和Neu5Gc的野生型细胞，显然存在两个峰。对于三重敲除猪分离群，第二峰消除或偏移到与阴性对照重叠，表明结合降低。
图12提供了在凝集素染色后从主动脉内皮细胞(aortic endothelial cell，AEC)或永生化肾内皮细胞(immortalized renal endothelial cell，iREC)获得的流式细胞术结果。将指定的细胞类型用IB4、Neu5Gc、DBA、PNA、木菠萝凝集素(Jacalin)或VVL孵育。左栏示出了从野生型AEC(WT/AEC)获得的结果，第二栏示出了从αGal破坏的猪(GAL/AEC)获得的结果，中间栏示出了从双重敲除CMAH/αGal猪(CMAH/AEC)获得的结果，第四栏示出了从三重敲除CMAH/αGal/β4GalNT2猪(B4G/AEC)获得的结果，第五栏示出了从野生型永生化肾内皮细胞获得的结果，第六栏示出了从GGTA1/CMAH/β4GalNT2和SLA抗原破坏的永生化肾内皮细胞获得的结果。灰色直方图不合凝集素阴性对照。黑色实线代表凝集素结合。注意，在Gal破坏的细胞中不存在第二IB4峰，在CMAH破坏的细胞中没有第二Neu5Gc峰，并且在β4GalNT2破坏的细胞中不存在第二DBA峰。第二PNA和木菠萝凝集素峰出现在来自单个、双重和三重敲除猪的细胞中。在三重敲除AEC和β4GalNT2/SLA三重敲除中，Sla抗原破坏iRMEC，第二个VVL峰显著偏移。虽然不受机制束缚，三重敲除细胞上抗原的VVL凝集素识别降低可有助于从三重敲除CMAH/αGal/β4GalNT2细胞和猪获得的出人意料的结果。
图13示出了示例性三重转基因猪中野生型和破坏的β4GalNT2、GGTA1和CMAH基因的一部分。每个野生型序列的下划线部分表示Crispr靶区域。该图示出了来自多个三重转基因猪(猪分离群标识符54-2、58-1和59-2)的序列破坏。示出了三种β4GalNT2变异：14核苷酸缺失、12核苷酸缺失/1核苷酸替换和271核苷酸缺失/1核苷酸插入。描述的第三β4GalNT2突变是271核苷酸缺失/1核苷酸插入，其中双斜线(//)划分缺失。示出了两种αGal(GGTA1)变异：11核苷酸(nt)缺失和18核苷酸(nt)缺失。示出了两种CMAH变异：66核苷酸缺失/12核苷酸插入和5核苷酸缺失/1核苷酸替换。
图14示出了在人临床交叉配型(crossmatch)试验中用多种人血清评价的三重转基因猪(αGal/B4GalNT2/CMAH缺陷)猪的三重转基因细胞获得的数据。上图示出了来自31个PRA＝0的人血清的结果；下图示出了来自19个PRA＞80的人血清的结果。用实心条表示不存在DTT的情况下的IgM和IgG结果；用空白条表示用DTT处理后的IgG结果。在y轴上示出细胞毒性评分。细胞毒性评分为1是同种异体移植非常好的候选者。
发明详述
本申请提供了不表达所指定的猪基因组编码的产物的用于移植到人中的转基因猪和猪器官、组织和细胞，及其制备和使用方法。在一个实施方案中，本申请提供了包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、β4GalNT2和胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶基因的三重转基因猪，其中与野生型猪相比，在敲除猪中，功能性α(1，3)-半乳糖基转移酶、β4GalNT2和胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶的表达降低。
I.概述
在说明书和权利要求中，术语“包括”和“包含”是开放式术语，并且应被解释为意指“包括但不限于...”。这些术语包括限制性更强的术语“基本上由......组成”和“由......组成”。
除非上下文中另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。同样，术语“一”(或“一个”)、“一个或更多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。还应注意，术语“包含”、“包括”和“具有”可互换使用。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文中明确提及的所有出版物和专利出于所有目的(包括描述和公开可能与本发明联合使用的出版物中报道的化学品、仪器、统计分析和方法)通过引用整体并入本文。本说明书中引用的所有参考文献都将被视为指示本领域的技术水平。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明没有由于先前的发明而先于这样的公开内容的资格。
II.组合物和方法
提供了适用于异种移植的转基因动物和产生适用于异种移植的哺乳动物的方法。具体地，本申请描述了α1，3半乳糖基转移酶(αGal)、β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(β4GalNT2)和胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)表达降低的三重转基因猪的产生。
在本发明的一些实施方案中，提供了猪和从其来源的猪器官、组织和细胞，其中αGal、β4GalNT2和CMAH基因活性较低，使得所得的αGal、β4GalNT2和CMAH产物不再在细胞表面、糖蛋白或糖脂上产生野生型水平的α1，3-半乳糖基表位、Sda样表位或Neu5Gc。在一个替代实施方案中，αGal、β4GalNT2和CMAH基因以不发生基因转录的方式失活。在多个实施方案中，制备三重αGal/B4GalNT2/CMAH敲除猪。制备转基因猪的方法及对其的挑战将在Galli等2010Xenotransplantation 17(6)p.397-410中讨论。本发明的方法和细胞培养物在下文中进一步详细描述。
术语“转基因哺乳动物”是指其中给定基因已被改变、去除或破坏的转基因哺乳动物。要强调的是，该术语旨在包括所有后代。因此，包括建立者动物(founder animal)及其所有F1、F2、F3等后代，不论后代是否由建立者动物或后代动物通过体细胞核转移(SCNT)产生或通过传统繁殖方法产生。“单转基因”意指其中一种基因已被改变、去除或破坏的转基因哺乳动物。“双重转基因”意指其中两种基因已被改变、去除或破坏的转基因哺乳动物。“三重转基因”意指其中三种基因已被改变、去除或破坏的转基因哺乳动物。“四重转基因”意指其中四种基因已被改变、去除或被破坏的转基因哺乳动物。
原则上，转基因动物可具有所破坏的目的基因序列的一个或两个拷贝。在目的核酸序列的仅一个拷贝或等位基因被破坏的情况下，敲除动物被称为“杂合转基因动物”。术语“无效(null)”突变包括其中目的核苷酸序列的两个拷贝被不同地破坏，但是破坏重叠使得一些遗传物质已经从两个等位基因中去除，以及其中目的核苷酸序列的两个等位基因共享相同破坏的情况二者。在多个实施方案中，三种目的基因的破坏可发生在转基因动物的至少一个细胞、至少多个动物细胞、至少一半的动物细胞、至少大部分的动物细胞、至少绝大多数的动物细胞中，至少70％、75”、80％、85％、90％、95％、98％或99％的动物细胞中。
术语“嵌合体”、“镶嵌”或“嵌合哺乳动物”是指在其一些含有基因组的细胞中具有敲除的转基因哺乳动物。嵌合体具有未改变的基因序列的至少一个细胞、具有未改变的基因序列的至少几个细胞或具有未改变序列的多个细胞。
术语“杂合子”或“杂合哺乳动物”是指在所有其含有基因组的细胞中的一个染色体对上具有破坏的转基因哺乳动物。
术语“纯合子”或“纯合哺乳动物”是指在所有其含有基因组的细胞中一个染色体对上的两个成员都具有破坏的转基因哺乳动物。“纯合改变”是指染色体对的两个成员的改变。
本申请的“非人哺乳动物”包括哺乳动物，例如啮齿动物、绵羊、狗、绵羊类(例如绵羊)、牛类(例如肉牛和奶牛)、以及猪类(例如家猪和肉猪)。尽管本申请提供了典型的非人动物(猪)，但是其他动物也可类似地进行遗传修饰。
“突变”是动物中传递给动物后代的遗传物质的可检测变化。突变通常是一个或更多个脱氧核糖核苷酸的变化，例如添加、插入、缺失、颠倒或替换核苷酸。
“猪”是指本领域中已知的任何猪，包括但不限于：野生猪、家养猪、迷你猪、野猪(Sus scrofa pig)、家猪(Sus scrofa domesticus pig)以及近亲交配猪。不受限制，所述猪可选自包含以下的组：兰德瑞斯猪(Landrace)、约克郡猪(Yorkshire)、汉普郡猪(Hampshire)、杜洛克猪(Duroc)、中国眉山猪(Chinese Meishan)、切斯特白猪(ChesterWhite)、伯克希尔戈廷根猪(Berkshire Goettingen)、兰德瑞斯/约克郡/切斯特白猪、尤卡坦猪(Yucatan)、巴马香猪(Bama Xiang Zhu)、五指山猪(Wuzhishan)、西双版纳猪(XiShuang Banna)和皮特兰猪(Pietrain)。猪器官、组织、细胞或输血产品是来自猪的器官、组织、失活的动物组织、细胞或输血产品。
α1，3半乳糖基转移酶(αGal、GGTA、GGT1、GT、αGT、GGTA1、GGTA-1)基因编码酶(GT、αGal、α1，3半乳糖基转移酶)。Ensemble转录物ENSSSCG00000005518包括猪GGTA1核苷酸序列。功能性α1，3半乳糖基转移酶催化在糖蛋白上形成半乳糖α1，3-半乳糖(αGal、Gal、Gal、gal1，3gal、gal1-3gal)残基。半乳糖α1，3-半乳糖(αGal)残基是人免疫系统识别的抗原表位或抗原。从转基因器官材料中去除αGal无法消除对外源材料移植的人免疫应答，表明另一些抗体参与对异种移植物的迅速免疫应答。(Mohiudden等(2014)，AmJ.Transplantation 14：488-489和Mohiudden等2014Xenotransplantation 21：35-45)。导致功能性αGal表达降低的αGal基因的破坏可包含但不限于：与G至A替换相邻的3碱基对缺失、单碱基对缺失、单碱基对插入、二碱基对插入、六碱基对缺失、十碱基对缺失、七碱基对缺失、五碱基对缺失的八碱基对插入、五碱基对插入、十一碱基对缺失和十八碱基对缺失(参见表1)。Crispr靶序列位于基因的外显子3中，接近起始密码子。
胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMP-Neu5Ac羟化酶基因，CMAH)基因编码酶(CMAH)。功能性CMAH催化唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)转化为N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。Neu5Gc残基是被人免疫系统识别的抗原表位或抗原。Ensembl数据库id基因：ENSSSCG00000001099包括猪CMAH核苷酸序列，并且Crispr靶区域在外显子6附近。导致功能性CMAH表达降低的CMAH基因的破坏可包含但不限于：四碱基对插入、一碱基对缺失、二碱基对缺失、三碱基对缺失、二十碱基对缺失、五碱基对缺失、八碱基对缺失、十一碱基对缺失、十二碱基对缺失、单碱基对插入、单碱基对缺失的二碱基对插入、四碱基对插入的三碱基对缺失、六十六碱基对缺失/十二碱基对插入和五碱基对缺失/1碱基对替换(参见表1)。
β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(B4GalNT2、β4GalNT2、B1，4GalNT2、β1，4GalNT2)基因编码β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶2糖基转移酶(B4GalNT2)。功能性B4GalNT2产生Sda样聚糖(Dall′Olio等(2014)Biochemica Biophysica Acta 1840：443-453和Blanchard等(1983)JBC 258：7691-7685)。认为B4GalNT2在大多数人中表达；先前的工作表明，仅5％的人缺乏功能性B4GalNT2的表达。猪细胞中β4GalNT2的破坏显著降低了在超过5％的所测试人样品中的交叉配型；该结果是意料之外的。Sda样聚糖可包括与血型或血型测定和胃肠癌抑制相关的Sda和类似聚糖。Ensembl数据库ENSSSCG00000030269条目包括β4GalNT2 cDNA和氨基酸序列。基因组猪β4GalNT2跨越跨过约40,000个碱基对的多个外显子，并且可能在多个基因座发生。在这些实验中使用的CrispR靶区域见于外显子2中，并且是CTGTATCGAGGAACACGCTT。导致功能性β4GalNT2表达降低的β4GalNT2基因的破坏可包括但不限于：一碱基对插入、十二碱基对缺失、五碱基对缺失、十四碱基对缺失、十二碱基对缺失/一碱基对替换、271碱基对缺失/一碱基对插入。
表1.功能性基因产物降低的活猪中目的基因破坏的实例
术语“破坏的基因”旨在包括目的核苷酸序列的插入、中断或缺失，其中所述破坏的基因编码具有不同于内源性序列的氨基酸序列之改变的氨基酸序列的多肽，编码具有比内源性氨基酸序列少的氨基酸残基的多肽或者不编码多肽，但是目的野生型核苷酸序列编码多肽。
本说明书提供了具有降低的功能性αGal、β4GalNT2和CMAH基因表达的转基因动物。所述动物可以是适用于异种移植的任何哺乳动物。在一个具体实施方案中，所述动物是猪。“CMAH/αGAL双敲除”、“CMAH/αGAL DKO”、“CMAH/αGal”、“CMAH/αGal DKO”、“CMAH-/-/GAL-/-”、“αGal/CMAH DKOs”、“αGal/CMAH双重敲除”、“GGTA1/CMAH DKO”、“GT1/CMAH DKO”、“GGTA1-/-/CMAH-/-”、“GGT1-/-/CMAH-/-”、“CMAH/GGTA DKO”、“GT/CMAH-KO”、“GGTA1/CMAHKO”、“DKO(αGal/CMAH)”、“DKO(αGAL&CMAH)”、“CMAH-/αGal-”、“αGal-/CMAH-”、“CMAH-/αGAL-”及其变体是指缺乏功能性α1，3半乳糖基转移酶和胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶表达的转基因动物、细胞或组织。可在野生型背景或CMAH/αGal双敲除背景中产生三重敲除产物或猪。“CMAH/αGAL/B4GalNT2三重敲除”、“CMAH/αGAL/β4GalNT2三重敲除”、“CMAH/αGAL/B4GalNT2 TKO”、“CMAH/αGal/β4GalNT2”、“CMAH/αGal/B4GalNT2 TKO”、“CMAH-/-/GAL-/-/B4GalNT2-/-”、“αGal/CMAH/β4GalNT2 TKOs”，“αGAL/CMAH/β4Gal三重敲除”、“GGTA1/CMAH/B4GalNT2 TKO”、“GT1/CMAH/β4GalNT2 TKO”、“GGTA1-/-/CMAH-/-/β4GalNT2-/-”、“GGT1-/-/CMAH-/-/β4GalNT2-/-”、“CMAH/GGTA/β4GalNT2 TKO”、“GT/CMAH/β4GalNT2-KO”、“GGTA1/CMAH/β4GalNT2 KO”、“TKO(αGal/CMAH/β4GalNT2)”、“TKO(αGAL、CMAH、β4GalNT2)”、“CMAH-/αGal-/β4GalNT2-”、“αGal-/CMAH-/β4GalNT2-”、“CMAH-/αGAL-β4GalNT2-”及其变体是指缺乏功能性α1，3半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶和β4GalNT2表达的转基因动物、细胞或组织。
转基因移植材料。移植材料包括来自用作异种移植物的动物的器官、组织、输血产品和/或细胞。用作异种移植物的移植材料可以从具有降低的αGal、β4GalNT2和CMAH表达的转基因动物中分离出来。来自转基因或敲除猪的转基因植物材料可以从产前、新生、未成熟或完全成熟的转基因动物中分离出来。移植材料可用作需要器官移植的人对象的临时或永久性器官替代物。可使用任何猪器官，包括但不限于：脑、心、肺、眼、胃、胰、肾、肝、肠、子宫、膀胱、皮肤、毛发、指甲、耳、腺体、鼻、口、唇、脾、牙龈、牙齿、舌、唾液腺、扁桃体、咽、食管、大肠、小肠、小肠、直肠、肛门、甲状腺、胸腺、骨、软骨、腱、韧带、肾上腺囊(suprarenalcapsule)、骨骼肌、平滑肌、血管、血液、脊髓、气管、输尿管、尿道、下丘脑、垂体、幽门、肾上腺、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、精囊、阴茎、淋巴、淋巴结和淋巴管。
在另一个实施方案中，本申请提供可用于异种移植的非人组织。在多个实施方案中，非人组织是来自三重αGal/CMAH/β4GalNT2转基因猪的猪组织。可使用任何猪组织，包括但不限于：上皮、结缔组织、血液、骨、软骨、肌肉、神经、腺样体(adenoid)、脂肪、乳晕组织、棕色脂肪、松质骨肌(cancellous muscle)、软骨组织、海绵状组织、软骨样组织、嗜铬组织、肉膜状组织(dartoic)、弹性组织、上皮组织、脂肪组织、透明纤维(fibrohyaline)、纤维组织、Gamgee、凝胶状组织、肉芽组织、肠相关淋巴样组织、骨骼肌、Haller血管组织、中性组织、间质组织、包埋组织(investing)、胰岛、淋巴组织、淋巴样组织、间质组织、中肾组织、多泡脂肪(multilocular adipose)、胸腺组织、黏液结缔组织、骨髓组织、鼻额点组织、肾原性组织、结组织、骨样组织、骨状组织、成骨组织、骨髓、网状组织、根尖周组织、网状组织、平滑肌、硬造血组织和皮下组织、失活的动物组织(包括心脏瓣膜、皮肤和腱，以及活体猪皮肤)。
另一个实施方案提供了来自具有减低或减小的αGal、B4GalNT2和CMAH表达的猪三重转基因动物的细胞和细胞系。在一个实施方案中，这些细胞或细胞系可用于异种移植。可使用来自任何猪组织或器官的细胞，包括但不限于：上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、单核细胞、单个核细胞、心肌细胞、其他肌细胞、颗粒细胞、卵丘细胞、表皮细胞、内皮细胞、朗格尔汉斯细胞岛(Islet of Langerhans cell)、胰腺胰岛素分泌细胞、骨细胞、骨前体细胞、神经元干细胞、原始干细胞、肝细胞、主动脉内皮细胞、微血管内皮细胞、成纤维细胞、肝星形细胞、主动脉平滑肌细胞、心肌细胞、神经元、库普弗细胞(Kupferr cell)、平滑肌细胞、施万细胞、红细胞、血小板、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脂肪细胞、软骨细胞、胰岛细胞、甲状腺细胞、胸腺细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、胶质细胞、星形胶质细胞、红细胞、白细胞、巨噬细胞、体细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、毛细胞、膀胱细胞、肾细胞、视网膜细胞、视杆细胞、视锥细胞、心脏细胞、起搏细胞、脾细胞、抗原呈递细胞、记忆细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、肌细胞、卵巢细胞、子宫细胞、前列腺细胞、阴道上皮细胞、精细胞、睾丸细胞、生殖细胞、卵细胞、睾丸间质细胞(leydig cell)、管周细胞、睾丸支持细胞(sertoli cell)、黄体细胞、子宫颈细胞、子宫内膜细胞、乳腺细胞、卵泡细胞、黏液细胞、纤毛细胞、非角质化上皮细胞、角质化上皮细胞、肺细胞、杯状细胞、柱状上皮细胞、多巴胺能细胞、鳞状上皮细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨髓、胚胎干细胞、成纤维细胞和胎儿成纤维细胞。
非活体衍生物(nonviable derivative)包括通过酶促或化学处理这些组织衍生物从活细胞中剥离的组织，这些组织衍生物可在用于移植之前通过交联或其他化学处理进一步加工。在一个优选的实施方案中，衍生物包括来自于多种组织的细胞外基质，包括皮肤、骨、尿、膀胱或器官黏膜下组织。此外，提供活组织剥离的腱、关节和骨，包括但不限于：心脏瓣膜和其他非活体组织作为医疗装置。在一个实施方案中，提供了适用于细胞培养以及分离自本发明的转基因猪的血清或培养基。还提供了猪转基因器官、组织或细胞的组分。组分也可通过本领域中已知的任何方式进行修饰，包括但不限于交联和醛交联。组分可根据来自获得所述组分的较大器官或组织而变化。皮肤组分可包括但不限于剥离的皮肤、胶原、上皮细胞、成纤维细胞和真皮。骨组分可包括但不限于胶原和细胞外基质。心脏组分可包括但不限于瓣膜和瓣膜组织。
“异种移植”包括涉及将细胞、组织或器官移植、植入或输注到来自不同物种的接受者对象的任何过程。特别地考虑其中接受者是人的异种移植。因此，异种移植包括但不限于血管化异种移植、部分血管化异种移植、非血管化异种移植、异种敷料、异种绷带、异种结构和异种输注。
在一些实施方案中，提供分离自包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、β4GalNT2和CMAH基因的转基因猪的细胞培养试剂。细胞培养试剂是用于组织培养、体外组织培养、微流体组织培养、细胞培养或使分离的细胞或细胞系生长的其他手段的试剂。细胞培养试剂可包括但不限于：细胞培养基、细胞培养血清、细胞培养添加剂、饲养细胞和能够增殖的分离细胞。“能够增殖的分离细胞”是指从其他细胞类型或其他细胞分离或部分分离的细胞，其中细胞能够增殖、分裂或增殖成至少一种另外的克隆细胞。
在培养物中培养的细胞可合成抗原表位或将其代谢地并入由所培养的细胞产生的目的化合物中。抗原表位可导致通过人抗体的结合提高和目的化合物的效力降低。参见Ghaderi等，2010，Nature Biotechnology 28(8)：863-867，其通过引用整体并入本文。在具有改变的表位谱(例如降低的αGal、B4GalNT2或Neu5Gc水平)的细胞培养试剂中培养产生细胞可降低目的化合物上的αGal抗原、Neu5Gc抗原和/或Sda样抗原的水平。目的化合物可包括但不限于糖蛋白和糖脂。目的糖蛋白可包括但不限于抗体、生长因子、细胞因子、激素或凝血因子。目的糖脂可包括但不限于治疗剂、抗原和生物表面活性剂。
词语“提供”旨在包括准备、获取、预备、制备、供应或供给。认识到提供细胞的方法可与提供对象的方法不同，提供器官的方法可与提供猪的方法不同，提供肾的方法可与提供肝的方法不同，并且提供肝的方法器官可与提供适合于输血之材料的方法不同。
当移植的组织、器官、细胞或材料不被接受者的身体接受时，则发生移植排斥。在移植排斥中，接受者的免疫系统攻击移植的材料。存在多种类型的移植排斥并且其可以单独或一起发生。排斥过程包括但不限于超急性排斥(HAR)、急性体液异种移植排斥反应(AHXR)、血小板减少症、急性体液排斥、超急性血管排斥、抗体介导的排斥反应和移植物抗宿主病。“超急性排斥反应”我们意指移植材料或组织在移植后前24小时内发生或开始的排斥，涉及一种或更多种排斥机制。排斥包括但不限于“超急性排斥”、“体液排斥”、“急性体液排斥”、“细胞排斥”和“抗体介导的排斥”。急性体液异种移植反应(AHXR)的特征在于一系列病理特征，包括但不限于在移植的几天内发生的急性抗体介导的排斥、血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy，TMA)的发生、微血管病、预形成的非Gal IgM和IgG结合、补体激活、微血管血栓形成和移植后前几周内的消耗性血小板减少症。血小板减少是低于正常范围140,000至440,000/μl的血小板量。血小板减少症相关症状包括但不限于：内出血、颅内出血、血尿、呕血、牙龈出血、腹胀、黑粪(melena)、经期延长、鼻出血、瘀斑、瘀点或紫癜。通过猪肝摄取人血小板导致异种移植接受者血小板减少症的发生。血小板减少症可在异种移植器官的再灌注后或紧随其后的再灌注期间发生。
在另一个实施方案中，本发明提供了改善患者中排斥相关症状的方法，所述方法包括将在猪器官、组织或细胞上具有降低的αGal、β4GalNT2和Neu5Gc表达的猪器官、组织或细胞移植到人中，其中与将来自野生型猪的组织移植给人相比，一种或更多种排斥相关症状改善。“改善”、“变好”、“改良”、“增强”和“帮助”旨在在所期望的方向推进或取得进展。还考虑改善排斥相关症状可包括不期望症状的降低、减轻或减小。进一步认识到，排斥相关症状可在另一种排斥相关症状改变的同时改善。改变的第二排斥相关症状可能改善或增强。第二改变的排斥相关症状可以以较不期望的方式改变。排斥相关症状包括但不限于超急性排斥相关症状和急性体液异种移植反应相关症状。排斥相关症状可包括但不限于：血栓性微血管病(TMA)、微血管病、预先形成的非Gal IgM和IgG结合、补体活化、凝集、纤维化、微血管血栓形成、消耗性血小板减少症、消耗性凝血病、深度血小板减少症、难治性凝血病、移植物间质性出血、斑驳(mottling)、发绀、水肿、血栓形成、坏死、纤维蛋白血栓形成(fibrinthrombi formation)、全身弥漫性血管内凝血、肾小球毛细血管中IgM沉积、肾小球毛细血管中IgG沉积、肌酸酐水平升高、BUN水平升高、T细胞浸润、浸润性嗜酸性粒细胞、浸润性浆细胞、浸润性嗜中性粒细胞、动脉炎、与内皮结合的抗体，ICOS、CTLA-4、BTLA、PD-1、LAG-3或TIM-3的表达改变以及全身性炎症。
“超急性排斥相关症状”旨在包括与超急性排斥相关或由超急性排斥引起的本领域中已知的任何症状。认识到超急性排斥相关症状可以根据所移植的器官、组织或细胞的类型而变化。超急性排斥相关症状可包括但不限于血栓性闭塞、移植物脉管系统出血、嗜中性粒细胞流入(neutrophil influx)、缺血、斑驳、发绀、水肿、器官衰竭、器官功能下降、坏死、肾小球毛细血管血栓形成、缺乏功能、溶血、发热、凝血、胆汁产生降低、虚弱、低血压、少尿、凝血病、血清转氨酶水平升高、碱性磷酸酶水平升高、黄疸、嗜睡、酸中毒和高胆红素血症和血小板减少症。
血小板减少是低于正常范围140,000至440,000/μl的血小板量。血小板减少症相关症状包括但不限于：内出血、颅内出血、血尿、呕血、牙龈出血、腹胀、黑粪、经期延长、鼻出血、瘀斑、瘀点或紫癜。通过猪肝摄取人血小板导致异种移植接受者血小板减少症的发生。
血小板(也称为凝血细胞)是参与血液凝固、止血和血栓形成的巨核细胞的去核碎片。人血小板通过多种方法常规分离，包括但不限于血小板采集术(platelet apheresis)、单采血小板术(plateletpheresis)和超速离心。
短语“血小板摄取”旨在包括将血小板并入肝或肝细胞中。虽然不受机制限制，但是这种摄取可通过吞噬过程发生。可通过本领域中已知的任何血小板摄取监测测定法来监测血小板摄取。血小板摄取监测测定法包括但不限于免疫学方法、蛋白质印迹法、免疫印迹法、显微术、共聚焦显微术、透射电子显微术和吞噬体分离。认识到适当的血小板摄取监测测定法可取决于所用标记的类型。血小板摄取可以测量为所吸收的总血小板百分比、未吸收的总血小板百分比、吸收的与未吸收血小板的比例、吸收至少一个血小板的细胞百分比、不吸收血小板的细胞百分比或每个细胞吸收的血小板数。认识到通过多于一种细胞类型的血小板摄取可有助于肝的总血小板摄取。动物肝摄取的总血小板可包括肝窦内皮细胞摄取的血小板、库普弗细胞(Kupffer)摄取的血小板、LSEC和库普弗细胞摄取的血小板以及其他细胞类型摄取的血小板。认识到通过不同细胞类型摄取的血小板可能有助于相似或不同分数的肝摄取的总血小板。因此，肝摄取的血小板的改变、抑制、降低、减小或下降包含一种或更多种肝细胞类型的血小板摄取的改变、抑制、降低、减小或下降。
虽然不受机制的限制，血小板摄取可通过LSEC和库普弗细胞的吞噬发生。吞噬的特征在于形成内含体，其通过含有降解酶的溶酶体的融合变成吞噬体(phagosome)。
评价、评估、分析、测量、量化或确定本领域中已知的排斥相关症状的任何方法可与要求保护的组合物和方法一起使用。分析排斥相关症状的方法可包括但不限于：包括具有血小板计数的CBC的实验室评估、凝血研究、肝功能测试、流式细胞术、免疫组织化学、标准诊断标准、免疫学方法、蛋白质印迹法、免疫印迹法、显微术、共聚焦显微术、透射电子显微术、IgG结合测定、IgM结合测定、表达测定、肌酐测定和吞噬体分离。
当基因产物的总表达降低时，产生改变大小的基因产物或者当基因产物表现出改变的功能时，基因产物的表达降低。因此，如果基因表达野生型量的产物，但产物具有改变的酶活性、改变的大小、改变的细胞定位模式、改变的受体-配体结合或其他改变的活性，则认为该基因产物的表达降低。可通过本领域中已知的任何手段分析表达，包括但不限于：RT-PCR、蛋白质印迹法、RNA印迹法、微阵列分析、免疫沉淀、放射性测定、多肽纯化、分光光度分析、丙烯酰胺凝胶的考马斯染色、ELISA、2-D凝胶电泳、原位杂交、化学发光、银染、酶测定、丽春红S染色、多重RT-PCR、免疫组织化学测定、放射免疫测定、比色测定、免疫放射测定、正电子发射断层成像、荧光测定、透化细胞的荧光激活细胞分选染色、放射免疫吸附测定、实时PCR、杂交测定、夹心免疫测定、流式细胞术、SAGE、差异扩增或电子分析。表达可以直接或间接分析。间接表达分析可包括但不限于分析由酶催化的产物的水平以评价酶的表达。参见例如，Ausubel等，编辑(2013)Current Protocols in Molecular Biology，Wiley-Interscience，New York，N.Y和Coligan等(2013)Current Protocols in ProteinScience，Wiley-Interscience New York，NY。猪ASGR1的基因表达测定是可商购的(Applied Biosystems TM，Carlsbad CA)。
“与......相比”旨在包括将某些事物与相似但不同的事物进行比较，例如将从转基因猪实验获得的数据点与从野生型猪的相似实验获得的数据点相比较。词语“比较”旨在包括检查特征、质量、值、数量或比例，以便发现正被比较的事物之间相似性或差异。比较可揭示了正在被比较的事物之间的显著性差异。“显著性差异”是指针对多组获得的结果(例如来自转基因猪的材料和来自野生型猪的材料的结果)的统计学显著性差异。通常来说，通过统计学显著性检验来评价统计学显著性，例如但不限于t检验、卡方检验、单尾t检验、双尾t检验、方差分析(ANOVA)、Dunnett事后检验、Fisher检验和z检验。两个结果之间的显著性差异可以是具有p＜0.1、p＜0.05、p＜0.04、p＜0.03、p＜0.02、p＜0.01或更大的结果。
词语“分离的”旨在包括与另一实体或组物理分离的实体。分离的细胞与另一组细胞物理分离。一组细胞的实例包括但不限于：发育的细胞团、细胞培养物、细胞系、组织和动物。词语“分离”旨在包括将实体与另一个实体或组物理分离。实例包括将细胞与其他细胞物理分离，将细胞组分与细胞的其余部分物理分离以及将动物的组织或器官物理分离。分离的细胞或细胞组分与来自其他天然存在的细胞或细胞成分以10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、高至100％分离。从另一组细胞中分离一种或更多种细胞的方法是本领域中已知的。参见例如，Freshney(ED)Culture ofAnimal Cells：a manual of basic techniques(第3版)1994，Wiley-Liss；Spector等(编辑)(1998)Cells：a Laboratory Manual(第1卷)Cold Spring Harbor Laboratory Press以及Darling等(1994)Animal Cells：cultureand media John Wiley&Sons。从动物中分离组织或器官的方法是本领域中已知的，并且根据待分离的组织或器官以及所期望的移植组织或器官的方法而变化。从动物或样品分离输血产品的方法是本领域中已知的，并且根据期望的输血产品而变化。这些方法包括但不限于离心、透析、洗脱、单采血液成分术(apheresis)和低温沉淀。
“皮肤相关产品”包括从皮肤分离的产品和旨在与皮肤一起使用的产品。与皮肤或其他组织分离的皮肤相关产品可在与皮肤一起使用前进行修饰。皮肤相关产品包括但不限于：替代敷料、烧伤覆盖物、真皮产品、替代真皮、真皮成纤维细胞、胶原蛋白、软骨素、结缔组织、角质形成细胞、脱细胞异种真皮(cell-free xenodermis)、脱细胞猪真皮、复合皮肤替代物和表皮及临时伤口覆盖物。参见例如Matou-Kovd等(1994)Ann Med Burn Club 7：143，其通过引用整体并入本文。
皮肤相关产品的连接时间段是向人对象施用皮肤相关产品与皮肤相关产品从人对象自然分离之间的时间。当人对象的皮肤伤口被密封时，皮肤相关产品可通过自然分离或机械分离来去除。然而，皮肤相关产品与人对象的自然分离可过早地发生。过早的自然分离在医师期望的分离之前发生。例如而非限制，过早的自然分离可在伤口已经被密封之前发生。过早的自然分离也可称为“蜕皮(sloughing)”、“脱落”或“剥落”。过早的自然分离的临床管理可包括皮肤相关产品的再应用、敷料应用、绷带应用、施用抗生素和施用流体。可通过本领域中已知的任何手段密封皮肤伤口，包括但不限于对象皮肤的生长和皮肤移植。减轻的过早分离包括在医师期望的分离之前降低、下降、较低频率、减小、较少的量的皮肤相关产品的天然分离。减轻的过早分离可涉及较少数量的完全、较少数量的部分过早分离事件，并且与从野生型猪获得的皮肤相关产品相比，在部分过早分离事件中涉及较少部分的皮肤相关产品。本申请的皮肤相关产品也可表现出提高的、加长的、改进的、延长的或扩展的连接时间。使用本申请的皮肤相关产品可延长连接持续时间。
皮肤伤口包括对体被(integument)的任何损伤，包括但不限于：开放性伤口、烧伤、撕裂、溃疡、腿部溃疡、足部溃疡、黑素瘤摘除、癌症摘除、整形手术和咬伤。
“手术连接”是指通过本领域中已知的任何手术方法来接合、组合、联合、附接、紧固、连接、接合或缔合。
在一个实施方案中，本申请提供了来自具有降低的αGal、CMAH和β4GalNT2基因表达的多个敲除猪动物之适用于输血的非人材料。适用于输血的这些材料可包括但不限于：血液、全血、血浆、血清、红细胞、血小板和白细胞。这样的材料可被分离、富集或纯化。分离、富集或纯化适合于输血的材料的方法是本领域中已知的。血清学猪血红细胞(RBC)与人RBC共享许多共同特征(Pond WG，Houpt KA，The Biology of the Pig Ithaca：ComstockPub.Associates，1978和Jandl，JH Blood：Textbook of Hematology，Boston：Little，Brown，1996)。与在其他哺乳动物中一样，猪中红细胞生成的主要部位是骨髓。pRBC是直径为约4-8微米的双凹盘(biconcave disk)。猪血液的血细胞比容为35-47％，血红蛋白浓度为6-17g/100ml。pRBC的半衰期约为40天，而人RBC的半衰期为60天。
到目前为止，已经鉴定了15种猪血型系统。最重要且充分研究的是与人ABO系统密切相关的A-O(H)。pRBC上的A和O抗原以与人Lewis抗原类似的机制(Marcus，D.M.&Cass，L.E(1969)Science 164：553-555))从循环的血浆鞘糖脂被动地被吸附。pRBC表型不完全可靠。猪的表型分型(phenotyping)可通过用抗A单克隆抗体(mAb)(如血库中使用的)和抗H凝集素抗体(Ulex europaeus)对颊上皮细胞免疫组织化学染色(Villarroya H等1990，Autoimmunity 6：47-60)实现。携带血型A的糖脂已经从猪胃黏膜、上皮细胞和红细胞中分离出来。在一些来自pRBC的良好表征的蛋白质中，猪血红蛋白与其人对应物共享85％的序列同一性，并以分辨率显示相似的三维结构。与大多数组织细胞不同，猪RBC不含核，并因此不太可能含有逆转录病毒，例如但不限于猪内源性逆转录病毒(porcineendogenous retrovirus，PERV)。pRBC还缺乏细胞内细胞器并且在体内具有相对较短的半衰期。
以下实施例仅用于举例说明目的，并不意在以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文中所示和描述的那些之外，根据前述说明和以下实施例，多种修改对于本领域技术人员来说将变得明显并落入所附权利要求书的范围内。
实施例
实施例1.靶定的CMAH、GGTA1和β4GalNT2区域的DNA测序分析
使用GenElute哺乳动物基因组DNA微量制备试剂盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)提取来自克隆猪的基因组DNA。进行CMAH、GGTA1和β4GalNT2 Crispr/Cas9靶区域的PCR扩增。使用引物对靶定的CMAH、GGTA1和β4GalNT2区域进行测序。
使用Pwo Master(Roche，Indianapolis IN)，使用Pwo SuperYield DNA聚合酶、dNTPack(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)。GGTA1的PCR条件如下：94℃，2分钟；94℃，15秒，54℃，30秒，和72℃，45秒，持续15个循环；94℃，15秒，54℃，30秒，72℃，45秒，每个循环外加5秒，持续25个循环；且最后延伸步骤为72℃，持续5分钟。对于CMAH，94℃，2分钟；94℃，15秒，56℃，30秒和72℃，45秒，持续15个循环；94℃，15秒，56℃，30秒，72℃，45秒，每个循环外加5秒，持续25个循环；且最后延伸步骤为72℃，持续5分钟。对于β4GALNT2，94℃，2分钟；94℃，15秒，62℃，30秒，72℃，40秒，持续15个循环，94℃，15秒，62℃，30秒，72℃，40秒，每个循环外加5秒，持续25个循环；且最后延伸步骤为72℃，持续5分钟。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分离，并通过GenElute凝胶提取试剂盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)纯化。PCR产物通过Sanger方法(DNA测序核心设施，印第安纳大学医学院(Indiana UniversitySchool of Medicine))进行测序，用以下特异性测序引物，对于GGTA1为5’CCTTAGTATCCTTCCCAACCCAGAC 3’(SEQ ID NO：5)；对于CMAH为5’CATTTTCTTCGGAGTTGAGGGC3’(SEQ ID NO：6)；对于β4GALNT2为5’AAAGCCACAGGAGGAGCCAG 3’(SEQ ID NO：7)。一旦检测到突变，将PCR产物插入pCR4blunt-TOPO载体中并转化到大肠杆菌(E.coli.)中。再次对单个克隆进行测序以进一步研究单个基因的每个等位基因中的突变。
来自示例性DNA序列分析的结果总结在图1的图A-C中。DNA序列分析证实至少一只猪中两个等位基因中GGTA1和CMAH基因的改变。序列分析示出GGTA1靶区域中重叠的5和7碱基对缺失(图A)。在同一的猪中，序列分析证实在一个等位基因上由12碱基对缺失组成的CMAH基因的破坏，以及另一个等位基因上重叠的3碱基对缺失的5碱基对替换(图B)。DNA序列分析证实了同一猪中β4GalNT2基因序列的改变。β4GalNT2基因序列数据示出三种变异；三个突变的存在可表明β4GalNT2基因在至少两个基因座出现。在β4GalNT2基因的重叠区域，一个等位基因示出单碱基对插入，一个等位基因示出五碱基对缺失并且一个等位基因示出十二碱基对缺失/一碱基对替换。没有发现野生型β4GalNT2序列的证据(图C)。图13总结了另外的三重敲除猪分离群的DNA序列分析。
实施例2.敲除猪(三重转基因猪)的产生
使用Addgene质粒42230[http：//www.addgene.org/42230和20]进行寡核苷酸退火并克隆到PX330质粒中以驱动gRNA表达。靶定基因的寡核苷酸对是GGTA1(NCB1登录号：XM_005660398.1)，5’CACCGAGAGAAAATAATGAATGTCAA-3’正向)(SEQ ID NO：8)，5’AAATTGACATTCATTATTTTCTC-3’(反向)(SEQ ID NO：9)；CMAH(NCBI登录号：NM_001113015.1)5’-CACCGAG下AAGGTACGTGATCTGT-3’(正向)(SEQ ID NO：10)，5’-AAACACAGATCACGTACCTTACTC-3’(反向)(SEQ ID NO：11；β4GalNT2(NCBI登录号NM_001244330.1)5’-CACCGTGTATCGAGGAACACGCTT-3’(正向)(SEQ ID NO：12)，5’-AAACAAGCGTGTTCCTCGATACAC-3’(反向)(SEQ ID NO：13)。
用所有三种gRNA/Cas9质粒共转染肝源细胞。48小时后，将经处理的细胞通过IB4凝集素柱以分离α-Gal无效细胞。在含有0.5％BSA的500μlHBSS中，用2μg/ml荧光素标记的双花扁豆(Dolichos biflorus)凝集素(DBA)-FITC(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)进一步对两百万个α-Gal阴性细胞进行染色，并使用BD FACSARIA分选机(BDBioscience，San Jose，CA，USA)对DBA阴性细胞进行流式分选。在体细胞核转移之前没有分析Neu5Gc(CMAH基因功能的指示物)的存在。
使用体外成熟卵母细胞进行体细胞核转移(SCNT)(DeSoto Biosciences Inc.，St.Seymour TN和Minitube of Amcrica(Mount Horeb WI))。通过在0.1％透明质酸酶中用移液管进行吸取从卵母细胞中去除卵丘细胞。选择具有正常形态和可见极体的卵母细胞，在操作介质(具有含5μg/ml双苯甲酰亚胺和7.5μg/ml细胞松弛素B之5％胎牛血清(FBS)的无钙NCSU-23)中孵育15分钟。在该孵育期后，通过除去第一极体和中期II板来从卵母细胞去除细胞核。对于三重转基因猪，将位点靶向的、IB4反向选择(counter-selected)的、DBA阴性肝源细胞(liver derived cell，LDC)的单细胞注射到每个去核的卵母细胞中。一些三重转基因猪是从胎儿成纤维细胞的SCNT发育来的，所述胎儿成纤维细胞从由位点靶向的、IB4反向选择的、DBA阴性肝源细胞产生的流产的三重敲除猪胎儿获得。用BTX电穿孔仪(Harvard Apparatus，Holliston MA)诱导电融合。在多种情况下，将注射有细胞(偶联)的去核卵母细胞在280mM甘露醇、0.001mM CaCl2和0.05mM MgCl2中暴露于140V的50μs，或者在280mM甘露醇、0.1mM CaCl2和0.05mM MgCl2中暴露于180V的50μs的两个DC脉冲。激活后，将卵母细胞置于具有0.4％牛血清白蛋白(BSA)的NCSU-23培养基中，并在潮湿气氛中于38.5℃、5％CO2下孵育少于1小时。在激活后一小时内，将卵母细胞转移到接受者猪中。接受者猪在动情期的第一天与西方猪(occidental pig)同步饲养(synchronize)。胚胎移植后第25天或第26天通过超声验证妊娠。
本研究中使用的所有动物均经机构生物安全委员会(Institutional BiosafetyCommittee，IBC)和机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee，IACUC)批准。
实施例3.三重敲除的IB4反选择
用三组靶向构建体(αGal、β4GalNT2和CMAH)转染肝源细胞(LDC)。用IB4(一种结合αGal的物质)选择细胞。获得IB4反选择中存活的大量细胞群体中的细胞DNA，并评价靶基因序列。在IB4反选择中存活的大量群体细胞直接用于SCNT以制备妊娠猪。
实施例4.靶向载体的设计
靶向载体(例如CrispR构建体、Zn指构建体和TALEN构建体)被设计成在合适位点靶向猪CMAH序列(Ensemble转录物ENSSSCT00000001195)。靶向载体构建体被设计成在合适位点靶向GGTA1(Ensemble转录物ENSSSCT00000006069)。靶向载体构建体被设计成在NCBIGeneID：100621328和Ensemble：ENSSSCG00000030269中的合适位点靶向β4GalNT2。
创建具有作为Ensemble转录物中列出的序列的一部分的反向互补物之引物序列的CMAH Crispr构建体，并将其用于产生三重敲除猪。创建具有与适当Ensemble转录物中的一部分相同的引物序列的Gal Crispr构建体并将其用于产生三重转基因猪。创建具有与上述NCBI序列NCBI GeneID：100621328的一部分相同的引物序列的β4GalNT2 Crispr构建体并将其用于产生三重转基因猪。
实施例5.具有转基因PBMC的人血清的交叉配型
从静脉穿刺在ACD中收集来自转基因(例如三重GGTA-1/β4GalNT2/CMAH)猪和野生型猪的猪全血。将全血与PBS以1∶1混合并用Ficoll分离。使用Ficoll-Paque Plus(GEHealthcare)从全血制备猪外周血单核细胞(PBMC)。从Ficoll层中取出PBMC，并用PBS洗涤数次，然后根据需要用裂解液洗涤以除去红细胞。将PBMC以400万个细胞/mi悬浮于EX-CELL培养基中(用于杂交瘤细胞14610C的EX-Cell 610 HSF-无血清培养基)。
从44名健康人志愿者获得血清。制备了25％的热灭活血清。将25μl热灭活的血清、25μl EX-CELL培养基和50μl悬浮细胞添加到96孔V底板上的每个孔中。将细胞在4℃下孵育30分钟，然后用EX-CELL培养基洗涤3次。将细胞用如下二抗进行染色：在EX-CELL培养基中以1∶250浓度的Alexa Flour 488山羊抗人IgG 109-546-170，在EX-CELL培养基中1∶250浓度的Alexa Flour 488山羊抗人IgM 709-546-073，添加100μl的二抗。用移液管悬浮细胞。将细胞在4℃下孵育30分钟。细胞用EX-CELL培养基洗涤一次，并用移液管悬浮于EX-Cell培养基或1∶1的EX-CELL培养基和流式固定液(1％缓冲的多聚甲醛)中。对于Alexa flour488，流式细胞术分析用通道FL-1设门完成。来自一个这样的实验的结果示于图3的图B中。
实施例6.DBA凝集素流式细胞术染色
将来自三重转基因猪和其他目的猪的全血收集在抗凝血柠檬酸盐葡萄糖(anticoagulant citrate dextrose，ACD)中。将全血与PBS1∶1混合，并用ficoll(Ficoll-Paque PLUS，GE Healthcare 17-1440-03)分离。获得含有钙的流式洗涤和染色缓冲液。流式洗涤缓冲液是具有0.5％BSA无IgG的0.1％叠氮化钠的HBSS(pH 7.4)，进行0.45μM过滤以除去微粒。将PBMC以2×106个细胞/ml重新悬浮于流式洗涤缓冲液中并均匀悬浮。细胞在冰上封闭15分钟。细胞再次重新悬浮。将100μl(2×105个细胞)添加到5ml流式管中。获得DBA-荧光素(2mg/ml储液)。在流式缓冲液中将DBA-荧光素凝集素储液以1∶10稀释至终浓度为0.2μg/ml。将DBA-荧光素凝集素以1μg DBA：1×106个细胞(0.2μg/2×105个细胞或1μl)的比例添加到细胞中。DBA凝集素和细胞在室温下孵育30分钟。用4ml流式洗涤HBSS彻底洗涤细胞。将细胞以400×g离心5分钟，并除去洗涤的上清液。将细胞重新悬浮于200μl流式洗涤HBSS中。如果进行额外的洗涤，则使用相同的参数。如果希望的话，最后一次洗涤后将细胞以约200μl流式固定剂/2×105个细胞固定，并在4℃下储存直到分析。通过对前向散射和侧向散射设门进行流式细胞术分析。在FL-1中收集细胞荧光事件；在散射门中收集了10,000个事件。对于每个细胞系，收集仅细胞和DBA-荧光素数据。IB4凝集素与由αGal基因产物产生的αGal连接的碳水化合物相互作用。HD抗体与由CMAH基因产物产生的Neu5Gc碳水化合物相互作用。DBA凝集素与β4GalNT2基因产物产生的碳水化合物结构相互作用。图3的图A中示出了一个这样的实验的结果。
实施例7.与RBC结合的IgG抗体
获得人A和两个人O血清和RBC。获得猪野生型和j/CMAH/GAL三重敲除RBC。使用Ficoll-Paque Plus(GE Health，Uppsala Sweden)从酸-柠檬酸盐-葡萄糖管(BectonDickinson&Co.，Franklin Lakes NJ)中收集的全血中分离红细胞。通过在没有抗凝血剂的情况下通过收集全血分离新鲜血清并离心以去除凝结的物质。密度分离后，用PBS洗涤RBC三次，室温下在PBS中以1∶10稀释。为了确定与RBC结合的抗体(2×105细胞/孔)，将其与稀释的、热灭活的人血清在4℃下孵育30分钟，最终血清浓度为25％。将细胞在含有叠氮化物的PBS中洗涤三次，并用山羊抗人IgG Alexa Fluor 488或驴抗人IgM Alexa Fluor 488(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA，USA)染色。使用AccuriC6流式细胞仪和CFlow软件(Accuri，Ann Arbor，MI USA)进行流式细胞术分析。RBC设门是基于前向散射和侧向散射。与RBC结合的示例性IgG抗体流式细胞术描记图(Trace)示于图5中。
对于αGal，使用抗体/凝集素同工凝集素斑豆(Griffonia simplicifolia)GS-IB4Alexa Fluor 647(Invitrogen，Grand Island NY，USA)；对于Neu5Gc，使用鸡抗Neu5Gc抗体试剂盒(BioLegend，San Diego CA)；并且对于β4GalNT2来源的碳水化合物，使用荧光双花扁豆凝集素(Fluorescein Dolichos Biflorus Agglutinin)(DBA)(VectorLaboratories，Inc.Barlingame，CA USA)进行猪RBC细胞表面聚糖的细胞表面分析。来自一个这样一系列实验的描记图示于图6中。[Matt.-请确认实验细节。]
实施例8.RBC剥离和相关流式细胞术
在密度分离后，将RBC在PBS中洗涤3次并悬浮于50％阿氏液(Alsever’ssolution)中。将RBC以21,300×g沉淀2分钟。以1∶1的细胞沉淀物体积与血清体积将血清添加到沉淀细胞中。将血清RBC混合物混合并在4℃下孵育20分钟。将细胞以21,300×g沉淀2分钟，并用阿氏液洗涤一次。将细胞与酸剥离缓冲液(pH 2.75柠檬酸/磷酸盐，300mOs/kg)混合以除去结合的抗体，并用1M Tris-碱(pH 9.0)(Calbiochem，LaJolla CA)中和。在低pH处理期间洗脱的物质通过SDS-PAGE和质谱进行分析(见下文)。使用2×106个RBC完成抗体洗脱样品的匹配流式细胞术分析。将细胞悬浮于含有0.1％叠氮化钠的EX-CELL 610-HSF无血清培养基(Sigma，St.Louis，MO USA)中，在4℃下用25％热灭活血清的混合物孵育30分钟。将RBC洗涤三次并用山羊抗人IgG Alexa Fluor 488或驴抗人IgM Alexa Fluor 488(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，West Grove PA，USA)抗体染色。二抗与RBC在4℃下孵育30分钟并洗涤。在BD Accuri C6流式细胞仪(Accuri，Ann Arbor，MI，USA)上完成流式细胞术分析并使用FlowJo7.6.5(FlowJo LLC，Ashland OR，USA)生成直方图。代表性描记图示于图8中。RBC设门基于前向散射和侧向散射。代表性设门示于图10中。
实施例9.从RBC洗脱的蛋白质的SDS-PAGE凝胶分析
将单个人血清用多种RBC(野生型猪(W)、CMAH/GAL DKO(D)、CMAH/GAL/β4GalNT2(T)和自体人(A))孵育。在上述剥离之后，通过将100μl洗脱液稀释至900μl丙酮中沉淀中和的洗脱液，然后在-20℃下孵育30分钟。沉淀物在4℃下以20,000×g离心15分钟。弃去上清液，并用水中的70％v/v乙醇洗涤沉淀。沉淀物在4℃下以20,000×g再次离心15分钟。再次弃去上清液，并将沉淀在Vacufuge Plus(Eppendorf，Hauppauge，NY，USA)中在37℃下干燥30分钟。然后根据制造商的说明书，并将样品溶于100微升含有2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的2×Laemmeli缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)中。然后将样品在95℃下加热5分钟，并随后使其冷却至室温。然后将15微升的各样品上样到26孔，4-20％无染色剂TGX凝胶(Bio-Rad)上，并使用Bio-Rad标准系统在变性和还原条件下在200V下电泳42分钟。电泳后，取出凝胶，并用100毫升G-250 Bio-Safe考马斯染色剂(Bio-Rad)染色30分钟。然后将凝胶在水中脱色并使用700nm激光在Li-Cor经典成像仪(LiCorBiosciences，Lincoln，NE USA)上成像。然后将各样品在干冰上装运用于质谱制备和分析。图7的图A中示出了工艺示意图；从RBC洗脱的材料的代表性凝胶示于图7的图B中。
实施例10.从RBC洗脱的免疫球蛋白的质谱定量
由MSBioworks，LLC进行质谱分析。根据制造商的说明书，用PNGase F(NewEngland Biolabs)处理50μl等分试样的每个样品。每个样品用丙酮沉淀30分钟，然后每个客户方案(client protocol)在4℃下用70％乙醇洗涤。将所得沉淀物干燥并重悬浮于40μl具有DTT的1.4×LDS上样缓冲液中。在MOPS缓冲液系统中，20μl在4-12％的双Tris SDSPAGE凝胶上运行。
切下含有重链(50kDa)的区域，并按照以下方案使用机器人(ProGest，DigiLab)进行胰蛋白酶消化：1)用25mM碳酸氢铵然后用乙腈洗涤。2)用10mM二硫苏糖醇在60℃下还原，然后在室温(RT)下用50mM碘乙酰胺烷基化。3)用胰蛋白酶(Promega)在37℃下消化4小时。4)用甲酸淬灭，并直接分析上清液，无需进一步处理。
使用与ThermoFisher Q Exactive接口的Waters NanoAcquity HPLC系统，通过纳米LC/MS/MS分析凝胶消化物。将肽上样到捕集柱(trapping column)上并以350nL/分钟在75μm分析柱上洗脱；两个柱都装有Jupiter Proteo树脂(Jupiter Proteo resin)(Phenomenex)。质谱仪以数据依赖模式运行，MS和MS/MS分别在70,000FWHM分辨率和17,500FWHM分辨率下在Orbitrap中进行。选择十五个最丰富的离子用于MS/MS。对于每种同种型特异性肽，确定并计算曲线下面积(AUC)。比较AUC使得可以对样品中每种抗体的水平进行定量评价。代表性描记图示于图9中。用于通过质谱鉴定和定量每种抗体的肽的序列示于表2中。
●IgM肽中的小写字母n表示作为PNGase F处理结果推定出现的脱酰胺化天冬酰胺残基。
实施例11.数据处理
使用具有以下参数的Mascot的本地拷贝搜索数据：酶：胰蛋白酶，数据库：Swissprot Human(正向和反向附加有常见杂质)，固定修饰：脲甲基(Carbidomethyl)(C)，可变修饰：氧化(M)、乙酰(蛋白质N端)、脱酰胺(NQ)，Pyro-Glu(N端Q)。质量值：单一同位素肽质量公差：10ppm，片段质量公差：0.02Da Max，错过酶切位点：2。Mascot DAT文件被解析到脚手架软件(Scaffold software)中进行验证、过滤，并为每个样品创建一个非冗余列表。以1％蛋白质和肽水平假发现率(false discover rate，FDR)过滤数据，并且每个蛋白质需要至少两种独特的肽。检查原始LC/MS数据，在QualBrowser(Thermo)中提取所选离子色谱图的靶标肽的准确m/z值；计算每种情况下的峰面积。
实施例12.用于定量与RBC结合的抗体之质谱和流式细胞术技术的比较
荧光二抗(可能人工掩蔽且不能容易地报告不同的IgG同种型)的使用可影响流式细胞术结果。定量质谱法可允许直接的肽分析，无需第二试剂，并可提供有关个体同种型水平的信息。质谱和流式细胞术提供可反映方法中不同固有偏倚的抗体结合的测量结果。个体同种型水平可对多种免疫效应子功能有不同的贡献。从三个人收集血清和RBC。每份血清与其自体RBC(A)和猪RBC(野生型(W)或三重敲除(T))孵育。使用流式细胞术和质谱法评价免疫球蛋白结合。图8的图A和图B提供了来自一个这样的实验的流式细胞术描记图。质谱定量表明，对于三份血清中的两份，与自体人RBC(A)相比，三重敲除猪细胞(T)结合较少的IgG，对于所有三种血清，结合较少的IgM。流式细胞术和定量质谱均表明，与来自三敲除猪的RBC结合的人免疫球蛋白水平较低。与人血型O RBC进行比较，因为人血型O RBC的抗原性足够低以避免即使在不存在免疫抑制情况下的体液损伤。
实施例13.与RBC结合的抗体的同种型分析
使用质谱AUC来定量每种同种型与不同RBC的结合。使用GGTA1/CMAH敲除RBC(D)、GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除RBC(T)和自体人RBC(A)进行评价。血清1中的零值表示没有特定同种型与靶细胞结合。与血清2、3和4中的自体人细胞结合的IgG4以10倍至16倍提高。与多重血清中的猪(T)RBC相比，IgG2是唯一的显示与人细胞(A)的提高结合的其他同种型，但是提高小于对于IgG4所见的(范围3至6倍，参见血清2、3和4)。图10显示了一系列实验的结果。
样品14.不同猪的凝集素染色
将来自GGTA1/CMAH DKO猪的猪肾用来自溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)(Sigma，St.Louis，MO，USA)的0.025％的IV型胶原酶冲洗。分离初级RMEC，并用补充有10％的DKO猪血清、100μg/ml内皮细胞特异性生长因子、青霉素、链霉素和两性霉素B的RPMI培养基培养。培养3天后，用含有慢病毒载体(其中c-DNA表达SV40的大T抗原和小T抗原)(Applied Biological Materials Inc，Richmond，BC，Canada)的慢病毒上清液感染猪RMEC 24小时。分离单细胞克隆并扩增至10代。将iRMEC用补充有10％的DKO猪血清、100μg/ml内皮细胞特异性生长因子、青霉素、链霉素的RPMI培养基培养，并用于在第15-40代之间表征。获得αGal/CMAH/β4GalNT2/SLA抗原破坏的iREC。
用来自溶组织梭菌(Sigma，St.Louis，MO，USA)2的0.025％的IV型胶原酶分离来自GGTA1/CMAH/B4GALNT2 KO猪的主动脉胸部和腹部分支的原代主动脉内皮细胞。将AEC用补充有GGTA1/CMAH/B4GALNT2 KO猪血清、100μg/ml内皮细胞特异性生长因子、青霉素、链霉素和两性霉素B的RPMI 1640培养基培养，以及对于WT/GGTA1 KO AEC，用10％FBS或对于GGTA1/CMAH DKO和GGTA1/CMAH/B4GALNT2 AEC，用5％的GGTA1/CMAH DKO猪血清。这些细胞在5代以内使用。使CMAH缺陷猪细胞在GGTA1/CMAH DKO猪血清中生长以防止摄取来自牛血清的Neu5Gc。
使用荧光素标记的双花扁豆凝集素凝集素(在HBSS中以1∶1000稀释)(DBA，VectorLaboratories，Burlingame，CA，USA)、荧光素标记的木菠萝(Artocarpus integrifolia)凝集素(在HBSS中以1∶1000稀释)(AIL，Vector Laboratories)、荧光素标记的长柔毛野豌豆(Vicia villosa)凝集素(在HBSS中以1∶1000稀释)(VVL，Vector Laboratories)、荧光素标记的花生(Arachis hypogaea)凝集素(在HBSS中以1∶1000稀释)(PNA，VectorLaboratories)和来自斑豆(Griffonia simplicifolia)(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)的Alexa Fluor 488标记的同工凝集素IB4(在HBSS中以1∶1000稀释)染色原代AEC细胞(2×105个细胞)。对于Neu5GC，用具有Alexa Fluor标记的抗Neu5GC或正常鸡IgY(BioLegend)的0.5mg/mL储液以1∶5000的最终稀释比对细胞进行染色。细胞在4℃下染色30分钟。然后洗涤细胞并使用C6流式细胞仪(BD Biosciences)进行分析。然后在Neu5GC的情况下，在凝集素或同种型对照的情况下与未染色的细胞相比计算荧光强度。代表性描记图示于图12中。
实施例15.PBMC的表型分析
通过Ficoll-Paque(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)分离外周血单个核细胞(PBMC)并计数。然后按照制造商的说明书，将在Hank′s平衡盐溶液(HBSS)中稀释的Neu5GC封闭缓冲液(Biolegend，San Diego，CA，USA)中以2×106个细胞/毫升的密度重悬浮细胞。将细胞在冰上孵育15分钟，然后染色。将100微升(2×105个细胞)添加到12×75mm聚苯乙烯流式染色管(BD BiosCiences，Bedford，MA，USA)中。将细胞以每1×106个细胞1微克的以下物质进行染色：荧光素标记的双花扁豆凝集素凝集素(DBA，Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)、荧光素标记的木菠萝凝集素(AIL，Vector Laboratories)、荧光素标记的长柔毛野豌豆凝集素(VVL，Vector Laboratories)、荧光素标记的花生凝集素(PNA，Vector Laboratories)和来自斑豆的Alexa Fluor 488标记的同工凝集素IB4(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)。对于Neu5GC，用来自具有Alexa Fluor标记的抗Neu5GC或正常鸡IgY(BioLegend)的0.5mg/mL储液以1∶5000的最终稀释比例染色细胞。细胞在冰上孵育的同时染色30分钟。然后用4毫升的Neu5GC封闭缓冲液洗涤细胞，并以400×g沉淀5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于200微升的封闭缓冲液中并立即分析。使用C6流式细胞仪(BD Biosciences)通过使用正向散射和侧向散射设门方法收集10,000个事件来分析细胞。然后在Neu5GC的情况下，在凝集素或同种型对照的情况下与未染色的细胞相比计算荧光强度。
实施例16.临床交叉配型测试
将来自三重转基因猪的PBMC进行用于同种异体移植的人临床交叉配型测试。从具有反应性抗体图(PRA)为0(顶图)的31名人对象和具有PRA图评分超过80(下图)的19名人对象获得血清。临床医生通常移植细胞毒性评分为1的人器官。将经Ficoll处理的来自三重转基因猪的PBMC调节至2×106个细胞/ml的细胞浓度。一些血清等分试样用DTT处理。准备两套交叉配型托盘。将血清和对照装载到交叉配型托盘中。将细胞制备物充分混合并在Hamilton重复分配器中缓慢地抽取。在照明视窗框内，将一微升的细胞添加到含有血清的每个孔中。最后将受试细胞添加到阳性对照孔。将相等数量的托盘放入Sorvall离心机的相对的桶中。启动离心机并使其达到1000rpm，然后关闭离心机。在照明视窗框内检查托盘以确保细胞微滴与血清混合。将托盘在室温下孵育30分钟。使用Jet移液管将所有托盘用15μlPBS洗涤四次至各孔中。使用温和洗涤技术使细胞沉降2-3分钟。除去PBS、油和血清。
制备AHG/C’1类混合物的工作稀释液。一组托盘用5μl的AHG/C’处理；另一组托盘用5μl的未稀释的兔补体(无AHG托盘)处理。托盘任选地以60rpm在转子上放置4分钟。将托盘在室温下孵育60分钟。细胞用5μl的Fluoroquench染色，并使其静置5分钟。将托盘放置在反相荧光显微镜上；使用160X的总放大率评价每个孔。
评估各个孔中死亡细胞的百分比。AO穿过活细胞的完整细胞膜，插入DNA并且当在490nm激发时发出绿色荧光(535nm)。当490nm激发时，死细胞用溴化乙锭染色时发出红色荧光(605nm)。使用以下所述的系统对每个孔进行评分：
一个这样的系列的实验结果示于图14中。注意细胞毒性评分为1的多种血清。
实施例17.通过转基因肝的人血小板离体灌注
将三重转基因GGTA1/CMAH/β4GalNT2猪麻醉并插管。进行中线腹部切口(abdominal incision)。取出肝并在正常温度条件下置于灌注装置中。在灌注装置中保持湿度、温度和空气流。灌注装置通过改变流量来保持恒定的压力。使用通过门静脉的离心式流和通过肝动脉的脉冲式流。这两种流量均在猪生理压力下设定。基础灌注溶液是具有生理营养和胰岛素的含氧的林格液。
人血小板从健康志愿对象获得，或者在从分离少于6天时间内商购并储存在20-24℃。在含有抗凝血剂柠檬酸盐葡萄糖的无菌磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤大约1×1011个人血小板。血小板可根据制造商的方案用CFSE标记。
在添加血小板前两小时灌注猪肝。在添加到灌注系统之前和在预定时间点在添加血小板后，获得血小板样品。评价灌注前和灌注后血小板水平。进行猪肝的灌注前和灌注后评价。获得野生型猪肝，并在类似条件下灌注肝。
实施例18.对转基因异种移植物之反应的评价
从三重敲除猪(αGal、CMAH、β4GalNT2)获得猪肝。使用背负法(piggyback method)将肝通过手术移植到最近死亡的人尸体中。手术后，从人尸体获得生物样本。监测排斥相关反应的临床指标。
实施例19.对转基因异种移植之反应的评价
从三重转基因猪(αGal、CMAH、β4GalNT2)获得猪肾。向高度敏感的人对象施用化合物以管理预先存在的和从头合成的供体特异性抗体。将猪肾通过手术移植到对象中。手术后，从人尸体获得生物样本。监测移植排斥的临床指标。
实施例20.共聚焦显微术分析
将仔猪(三重GGTA1、CMAH、βGalNT2敲除，野生型或其他目的仔猪)安乐死。从猪获得肝、心和肾组织。制备每种组织的冷冻切片。将固定的组织在HBSS中的Odyssey封闭缓冲液(Li-Cor Biosciences，Lincoln NE)中封闭1小时。将载玻片固定在4％多聚甲醛中10分钟。将组织用IB4凝集素Alexa Fluor 647(Invitrogen，Grand Island NY)染色以可视化Gal表位的存在。为了可视化Neu5Gc表位，将组织用鸡抗Neu5Gc抗体或对照抗体(Sialix，Vista CA)染色1小时。将组织用DBA染色以可视化Sda样表位的存在。将组织用HBSS洗涤三次。将驴抗鸡Dylight 649(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc，West Grove PA)二抗与组织孵育约1小时。将组织用0.1％HBSS吐温洗涤三次。为了对细胞核进行染色，将DAPI染色剂(Invitrogen，Grand Island NY)添加至所有载玻片中保持1分钟，然后进行两次0.1％HBSS吐温洗涤。将组织固定在ProLong Gold(Invitrogen，Grand Island NY)中。使用Olympus FV1000进行共聚焦显微术。
实施例21.抗体介导的补体依赖性细胞毒性
抗体介导的补体依赖性细胞毒性测定法是本领域中已知的。进行Diaz等的方法(Diaz等，2004 Transplant Immunology 13(4)：313-317)。从健康志愿者获得人血清。制备25％热灭活血清。将热灭活的人血清连续稀释，并将100μl的各浓度置于96孔V底测定板中。将血清与从目的猪(GGTA1/CMAH/β4GalNT2三重转基因等)获得的100μl等分试样的PBMC混合。PBMC终浓度为5×106/ml或者1×106/ml。血清浓度为50％、17％、2％、0.6％、0.2％和0.07％。混合物在4℃下孵育30分钟。30分钟后，将板以400×g离心4分钟。将板倾析并用HBSS洗涤。向每个孔中添加兔补体(150μl 1∶15稀释)，并在37℃下孵育30分钟。将PBMC用在HBSS(1μg/ml)中从1mg/ml丙酮储液中每天新鲜制备的荧光素二乙酸酯(fluoresceindiacetate，FDA)储液标记，以及用在磷酸缓冲盐水(PBS)中以50μg/ml制备的碘化丙啶(PI)标记。在补体中孵育后，通过移液管将样品转移到含有250μl的HBSS和10μl的FDA/PI的管中以便使用Accuri C6流式细胞仪进行分析。
确定死细胞(PI+/FDA-)、受损细胞(PI+/FDA+)和活细胞的百分比。从计算中排除双阴性事件(PI-/FDA-)。认为未暴露于血清的细胞中的细胞毒性百分比是自发性杀伤。对于自发性杀伤校正细胞毒性值。
实施例22.猪肝获取
将猪术前用药、插管且用丙泊酚进行麻醉并置于仰卧位。进行腹部的中线切口。肝的韧带附着物(ligamentous attachment)被取下。对门静脉和肝动脉插管并用2升冷的组氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液(Essential Pharmaceuticals，LLC)冲洗。将肝从猪中取出，并在4℃下在冰上储存在组氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液中，直到其被放到肝灌注回路中。冷缺血时间在45分钟至3小时之间。在某些实验中，猪肝可从屠宰场获得。来自屠宰场的猪肝在放血两分钟内用含有肝素(2000U/L)的组氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液冲洗。
实施例23.血小板摄取分析I
用羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorecein diacetatesuccinimidyl ester，CFSE)(一种荧光绿细胞质标志物)标记血小板。使用常温猪肝灌注系统。在添加血小板之前，将来自目的敲除猪或野生型猪的猪肝灌注2小时。向灌注系统中添加约3000亿血小板(未标记的为70％，标记的为30％)。在多个预定时间点从猪肝中取出活检物。通过共聚焦显微镜术检验活检物。用对怀布尔-帕拉德体(Wieble-Palade body)特异的染色剂处理活检物。怀布尔-帕拉德体在血小板和内皮细胞中出现。进行基于荧光ELISA的测定。血小板来自人或狒狒。或者，在共聚焦显微术之前，用内皮标志物和溶酶体标志物标记活检物。
实施例24.血小板摄取分析II
用羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(CFSE)、荧光绿细胞质标志物标记血小板。使用常温猪肝灌注系统。在添加血小板之前，将来自目的敲除猪或野生型猪的猪肝灌注2小时。通过透射电子显微术(TEM)分析活检物。
实施例25.体外血小板摄取
从猪肝或目的肝的血窦分离原代肝血窦内皮细胞(liver sinusoidalendothelial cell，LSEC)。原代野生型猪LSEC在培养5天后失去吞噬能力；这些实验用第3天和第4天原代LSEC进行。人或狒狒血小板用CFSE标记，如本文中别处所述。分离的LSEC与标记的血小板一起孵育。通过共聚焦显微术分析样品。
实施例26.NHP中的肾异种移植
用一个剂量的抗CD4/抗CD8(50mg/kg)、抗CD154/抗-CD28dAb、MMF和类固醇处理接受者非人灵长类动物(non-human primate，NHP)。在某些研究中使用他克莫司(靶水平8-12)。使用恒河猴(Macaca mulatta)作为NHP。在一些实验中，恒河猴可以是3-5岁且小于6kg。将敲除猪的肾(或野生型对照肾)移植到NHP接受者中。在规定的时间点收集样品(血液、尿和肾活检样品)进行分析。随后分析了肾功能、血清肌酐、异种抗体的存在和量(流式细胞术和多参数流式细胞术)、细胞因子分泌、来自外周血的转录谱、尿和移植物活检、异种移植组织学和抗猪抗体的产生(基于流式的异种交叉匹配测定)。CMAH缺失对NHP中的研究没有帮助。对于NHP研究，使用具有野生型CMAH基因的猪(Gal-/β4GalNT2)。在移植后2周、5周和10周进行超声引导针穿刺活检。
实施例27.NHP的兽医护理
将NHP圈养在单独的笼中并提供有干净、适当大小的生活区；每天喂两次；并由动物护理技术人员每天至少检查两次，且临床兽医人员每天检查一次。每次麻醉的动物进行血液采集或其他手术时都进行身体检查。
实施例28.NHP静脉切开术和组织取样
在氯胺酮(10mg/kg)或舒泰(Telazol)(4mg/kg)麻醉下对禁食动物进行静脉放血术(phlebotomy)和组织取样(例如：血液收集、淋巴结活检和骨髓吸出)。施用丁丙诺啡(buprenephrine)(每6小时0.01mg/kg)作为进行肾移植的动物的术后镇痛，并且根据需要由主治兽医确定。监测动物“不可逆转的危重病”，例如但不限于：体重由基线降低25％；完全厌食4天；主要器官衰竭或对治疗无响应的医学状况(例如呼吸窘迫、黄疸、尿毒症、难治性腹泻、自残或持续性呕吐等)，以及对立即干预无响应的手术并发症：出血、血管移植/循环衰竭、感染和伤口开裂。
实施例29.猪胚胎移植手术、静脉放血术和收集程序
胚胎移植手术：在手术之前，用TKX(舒泰(500mg)+氯胺酮(250mg)和甲苯噻嗪(250mg)；每50磅1cc，IM)将母猪麻醉以进行插管外加使用精密蒸发器的ET管吸入异氟醚和废气清除。在恢复期期间，每15分钟至少监测动物一次，并评价和记录生命体征(温度、心率、呼吸速率和毛细血管再充盈时间)。受过培训的动物护理技术人员或兽医监测动物，直到它们可自主地保持自己的胸骨无妨碍(sternal recumbrance)。经主管兽医批准后，将动物返回常规圈养区。术后镇痛剂包括每8-12小时一次丁丙诺啡0.01-0.05mg/kg IM或每天一次卡洛芬2-4mg/kg SC。在胚胎移植后约26天，当母猪被食物转移注意力时，进行超声检查以确认发生妊娠。约10天后进行第二次超声。出生是通过自然分娩，除非临床上出现困难。由兽医工作人员推荐进行剖宫产术。将标准的剖宫产术方案与胚胎移植手术中使用的全身麻醉方案一起使用。将实验仔猪清洁，将脐带消毒。每只仔猪在出生后的第一个小时接受初乳。以24/7观察仔猪，直到至其少7天大。使用产仔栏(farrowing crate)保护仔猪与母亲，同时保持能够护理仔猪。
在氯胺酮(10mg/k)或舒泰(4mg/kg)麻醉下对禁食动物进行全部的静脉放血术。器官收集(终末手术步骤)使用麻醉方案(舒泰(500mg)+氯胺酮(250mg)+甲苯噻嗪(250mg))；每50磅1cc；IM)+/-戊巴比妥(10-20mg/kg)IV，如果需要进行插管和通过使用精密蒸发器的ET管吸入异氟醚以实现废气清除。猪用盐水灌注，然后除去心脏和其他组织/器官。或者，用吸入的麻醉剂麻醉猪，并用巴比妥酸衍生物(100-150mg/kg)处理并进行两侧气胸(bilateral pneumothorax)。
实施例30.免疫抑制剂对T细胞增殖应答的CFSE MLR评估
来自恒河猴的PBMC与来自GGTA-/β4GalNT2-双重敲除或对照猪的猪PBMC一起孵育。使用CFSE的稀释液来评价T细胞亚群中的T细胞增殖。
实施例31.肾异种移植中免疫抑制剂的评估
接受者恒河猴是免疫成熟的(CMV+、LCV+、SV40+、＞4kg)、MHC和家谱限定的。将免疫抑制候选物(抗CD154 dAb、克隆5C8抗CD154)施用于恒河猴。在移植前，用T细胞消耗(抗CD4/抗CD8，单剂量)、MMF、类固醇和免疫抑制候选物处理接受者恒河猴。使用血清肌酐评估肾功能。认为肌酐和/或BUN分别提高＞5.0mg/dl或100mg/dl为阴性结果。在移植后第2、5和10周进行超声引导针穿刺活检。使用多参数流式细胞术(T、B和其他细胞子集)收集移植前和每周移植后外周血样品进行免疫分型。功能测定(包括细胞因子分泌以及转录物谱的离体评价)为在确定的时间点的外周血、尿和移植物活检。可以评价外周血样品中共刺激和共抑制受体(例如但不限于ICOS、CTLA-4、BTLA、PD-1、LAG-3、TIM-3)的表达。
本发明不限于本文中列出的用于举例说明的实施方案，而是包括在权利要求的范围内的一切。已经参照一些示例性实施方案描述了本发明，应理解，本文中列出的描述一些示例性实施方案的任何限制或要素并不旨在被并入专利权利要求的含义中，除非这些限制或要素是在权利要求中明确列出。同样地，应理解，由于本发明是由权利要求限定，并且由于即使在本文中未被明确讨论，本发明的固有和/或不可预见的优点也可存在，所以不必为了落入任何权利要求的范围内而满足本文中所公开的本发明的任何或全部的指定优点或目的。
此外，本文中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文并且用于所有目的，如同在本文中完全列出一样。
序列表
<110> 印第安纳大学研究与技术公司
约瑟夫·A·泰克托尔
<120> 适用于异种移植的三重转基因猪
<130> IURTC2015-074
<150> 62/067,129
<151> 2014-10-22
<160> 13
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 野猪
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(41)
<223> GGTA1区
<400> 1
gtcatctttt acatcatggt ggatgatatc tccaggatgc c 41
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 野猪
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(35)
<223> CMAH区
<400> 2
aaactcctga actacaaggc tcggctggtg aagga 35
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 野猪
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(31)
<223> B4GalNT2区
<400> 3
ctgtatcgag gaacacgctt cggaacataa a 31
<210> 4
<211> 363
<212> DNA
<213> 野猪
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(363)
<223> B4GalNT2区
<400> 4
gatgggtgag ttgaagagac tgaagtctgt atcgaggaac acgcttcgga acataaagag 60
tccaacgctc aggaccaaaa gcaccatcga tatcttgagg atcgacagac atctagggct 120
gttgggacac aagagagcaa acgctgttaa aatcttttct gagtatgtta aaaaagattt 180
cattgtgcga catagatggg aatagcaact tgagcaaaaa tgcaagtcaa acctgttttg 240
tacactacgt atcaaaattg atttcttccc aaagcaaaag agaaagaaaa gcaaaaataa 300
acctaagcaa actgagcaag cttttgcaca gcaaaggaaa ccataaaata acccaaaaag 360
atc 363
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸- GGTA1测序引物
<400> 5
ccttagtatc cttcccaacc cagac 25
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸- CMAH测序引物
<400> 6
cattttcttc ggagttgagg gc 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸- B4GalNT2测序引物
<400> 7
aaagccacag gaggagccag 20
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸- GGTA1正向
<400> 8
caccgagaga aaataatgaa tgtcaa 26
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸- GGTA1反向
<400> 9
aaattgacat tcattatttt ctc 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸- CMAH正向
<400> 10
caccgagtaa ggtacgtgat ctgt 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(24)
<223> CMAH反向
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 11
aaacacagat cacgtacctt actc 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(24)
<223> B4 Gal NT2正向
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 12
caccgtgtat cgaggaacac gctt 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(24)
<223> B4GalNT2反向
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 13
aaacaagcgt gttcctcgat acac 24

Claims (32)

1.转基因猪，其在所述猪的至少一个细胞的核基因组中包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低。
2.分离自权利要求1的所述转基因猪的猪器官、组织、输血产品或细胞。
3.权利要求2所述的猪器官、组织或细胞，其中所述猪器官、组织、输血产品或细胞选自：皮肤、心、肝、肾、肺、胰、甲状腺、小肠、血液及其组分。
4.权利要求1所述的转基因猪，其中与将来自野生型猪的器官、组织、输血产品或细胞移植给人相比，将来自所述猪的器官、组织、输血产品或细胞移植给人时，排斥相关症状改善。
5.权利要求4所述的转基因猪，其中将来自所述猪的器官、组织、输血产品或细胞移植给人时，所述排斥相关症状选自包含以下的组：细胞排斥反应相关症状、体液排斥反应相关症状、超急性排斥相关症状、急性体液异种移植反应排斥相关症状和急性血管排斥反应相关症状。
6.权利要求4所述的转基因猪，其中与将来自野生型猪的器官、组织、输血产品或细胞移植给人相比，将来自所述猪的器官、组织、输血产品或细胞移植给人时，血小板减少症降低。
7.权利要求1所述的转基因猪，其中与将来自野生型猪的肝暴露于人血小板时相比，将来自所述转基因猪的肝暴露于人血小板时，所述肝显示出降低的血小板摄取。
8.从权利要求1所述的转基因猪获得的皮肤相关产品，其中所述皮肤相关产品显示出减轻的与伤口过早分离。
9.权利要求8所述的皮肤相关产品，其中所述伤口是人皮肤伤口。
10.权利要求4所述的转基因猪，其中与将来自野生型猪的肾移植给人相比，将来自所述转基因猪的肾移植给人时，排斥相关症状降低。
11.制备用于异种移植到人中的移植材料的方法，所述方法包括提供权利要求1所述的转基因猪作为所述移植材料的来源，并且其中所述移植材料选自器官、组织、输血产品和细胞，并且其中所述移植材料具有降低的αGal抗原水平、降低的Neu5GC抗原水平和降低的Sda样抗原水平。
12.转基因猪，其在所述猪的至少一个细胞的核基因组中包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中所述α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下破坏的组：与G至A替换相邻的3碱基对缺失，单碱基对缺失、单碱基对插入、二碱基对插入、六碱基对缺失、十碱基对缺失、七碱基对缺失，五碱基对缺失的八碱基对插入，五碱基对插入、十一碱基对缺失和十八碱基对缺失；其中所述CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：四碱基对插入、一碱基对缺失、二碱基对缺失、三碱基对缺失、五碱基对缺失、八碱基对缺失、二十碱基对缺失、十一碱基对缺失、十二碱基对缺失、单碱基对插入，单碱基对缺失的二碱基对插入，四碱基对插入的三碱基对缺失，六十六碱基对缺失和十二碱基对插入、以及伴有一碱基对替换的五碱基对缺失；其中所述β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十二碱基对缺失、五碱基对缺失、十四碱基对缺失、十二碱基对缺失和一碱基对替换、伴有一碱基对插入的271碱基对缺失、以及单碱基对插入，并且其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低，并且与将来自野生型猪的组织移植给人相比，将来自所述转基因猪的组织移植给人时，超急性排斥相关症状改善。
13.权利要求12所述的转基因猪，其中所述α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下的组：五碱基对缺失、七碱基对缺失、以及五碱基对缺失和七碱基对缺失二者，其中所述CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：十二碱基对缺失、以及三碱基对缺失的四碱基对替换，其中所述β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十二碱基对缺失、五碱基对缺失和单碱基对插入，并且其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低，并且与将来自野生型猪的组织移植给人相比，将来自所述转基因猪移植给人时，超急性排斥相关症状改善。
14.权利要求12所述的转基因猪，其中所述α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下破坏的组：十一碱基对缺失和十八碱基对缺失，其中所述CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：六十六碱基对缺失/十二碱基对插入和五碱基对缺失/一碱基对替换，其中所述β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十四碱基对缺失、十二碱基对缺失和271碱基对缺失/1碱基对插入，并且其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低，并且与将来自野生型猪的组织移植给人相比，将来自所述转基因猪的组织移植给人时，超急性排斥相关症状改善。
15.使将人对象鉴定为需要人器官移植的对象与进行人器官移植之间的持续时间延长的方法，所述方法包括提供来自转基因猪的器官，所述转基因猪在所述猪的至少一个细胞的核基因组中包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中在所述猪中α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达与野生型猪相比降低；以及以治疗有效的方式将来自所述转基因猪的所述器官与所述人对象通过手术连接。
16.权利要求15所述的方法，其中来自所述转基因猪的所述器官与所述人对象内部通过手术连接。
17.权利要求15所述的方法，其中来自所述转基因猪的所述器官与所述人对象外部通过手术连接。
18.权利要求15所述的方法，其中所述器官与所述对象直接或间接连接。
19.使将人对象鉴定为需要人肝移植的对象与进行所述人肝移植之间的持续时间延长的方法，所述方法包括提供来自转基因猪的肝，所述转基因猪在所述猪的至少一个细胞的核基因组中包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中在所述猪中α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达与野生型猪相比降低；以及以治疗有效的方式将来自所述转基因猪的所述肝与所述人对象通过手术连接。
20.减轻皮肤相关产品与人过早分离的方法，其包括以下步骤：提供包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因的转基因猪，其中在所述猪中α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达与野生型猪相比降低；以及从所述转基因猪制备皮肤相关产品。
21.改善人对象中超急性排斥相关症状的方法，其包括将具有降低的αGal、Sda样和Neu5GC抗原水平的猪移植材料移植到需要移植的对象中，其中与将来自野生型猪的猪移植材料移植到人对象中时相比，超急性排斥相关症状改善。
22.表现出改变的表位谱的细胞培养试剂，其中所述细胞培养试剂分离自包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因的转基因猪，并且其中在所述转基因猪中α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达与野生型猪相比降低。
23.权利要求22所述的细胞培养试剂，其中所述细胞培养试剂选自包含以下的组：细胞培养基、细胞培养血清、细胞培养添加剂和能够增殖的分离的细胞。
24.权利要求22所述的细胞培养试剂，其中所述细胞培养试剂分离自转基因猪，其中所述α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下的组：五碱基对缺失、七碱基对缺失、以及五碱基对缺失和七碱基对缺失二者，其中所述CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：十二碱基对缺失、以及三碱基对缺失的五碱基替换，其中所述β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十二碱基对缺失、五碱基对缺失和单碱基对插入。
25.权利要求22所述的细胞培养试剂，其中所述细胞培养试剂分离自转基因猪，其中所述α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下的组：所述α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下破坏的组：十一碱基对缺失和十八碱基对缺失，其中所述CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：六十六碱基对缺失/十二碱基对插入和五碱基对缺失/一碱基对替换，其中所述β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十四碱基对缺失、十二碱基对缺失/一碱基对替换和271碱基对缺失/1碱基对插入。
26.产生具有改变的表位谱的目的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：提供显示出改变的表位谱的细胞培养试剂，其中所述细胞培养试剂分离自转基因猪，所述转基因猪包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，并且其中在所述转基因猪中α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达与野生型猪相比降低；以及用所述细胞培养试剂孵育能够表达所述目的化合物的分离的细胞；并且其中所述目的化合物上Neu5Gc、Sda样或αGal表位的水平低于当所述目的化合物由用来自野生型猪的细胞培养试剂孵育的分离的细胞产生时所述目的化合物上所述表位的水平。
27.权利要求26所述的方法，其中所述目的化合物选自包含糖脂和糖蛋白的组。
28.权利要求27所述的方法，其中所述目的化合物是糖蛋白，其选自包含以下糖蛋白的组：抗体、生长因子、细胞因子、激素和凝血因子。
29.权利要求26所述的方法，其中所述细胞培养试剂分离自转基因猪，其中所述α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下的组：五碱基对缺失、七碱基对缺失、以及五碱基对缺失和七碱基对缺失二者，其中所述CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：十二碱基对缺失、以及三碱基对缺失的五碱基对替换，其中所述β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十二碱基对缺失、五碱基对缺失和单碱基对插入。
30.权利要求26所述的方法，其中所述细胞培养试剂分离自转基因猪，其中所述α(1，3)-半乳糖基转移酶基因的破坏选自包含以下破坏的组：十一碱基对缺失和十八碱基对缺失，其中所述CMAH基因的破坏选自包含以下破坏的组：六十六碱基对缺失/十二碱基对插入和五碱基对缺失/一碱基对替换，其中所述β4GalNT2基因的破坏选自包含以下破坏的组：十四碱基对缺失、十二碱基对缺失/一碱基对替换和271碱基对缺失/1碱基对插入，并且其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低。
31.用于移植到人中的猪移植材料，其中所述移植材料具有降低的αGal抗原水平、降低的Sda样抗原水平，并且其中所述移植材料具有降低的Neu5Gc抗原水平。
32.转基因猪，其在所述猪的至少一个细胞的核基因组中包含破坏的α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2基因，其中与野生型猪相比，α(1，3)-半乳糖基转移酶、CMAH和β4GalNT2的表达降低，并且其中VVL结合降低。
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