KR20170074941A - 이종이식에 적합한 삼중 트랜스제닉 돼지 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 거부 관련 증상을 개선시키고 조기 분리를 방지하는 방법을 제공하고, 변경된 에피토프 프로파일을 갖는 관심 화합물을 생산하는 방법이 제공된다. 파괴된 유전자 또는 유전자들을 지닌 녹아웃 돼지, 및 그로부터의 돼지 기관, 조직, 및 세포가 제공된다.

Description

이종이식에 적합한 삼중 트랜스제닉 돼지{TRIPLE TRANSGENIC PIGS SUITABLE FOR XENOGRAFT}
관련 출원의 전후-참조
본 출원은 2014년 10월 22일 출원된 미국 가특허 출원 62/067,129호의 우선권을 주장하며, 이의 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
서열 목록의 포함
본원에 제출된 텍스트 포맷의 서열 목록은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
해당없음.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 인간에 이식하기 적합한 트랜스제닉 돼지, 트랜스제닉 돼지 기관, 조직 또는 세포, 특히 저혈소판증, 초급성 거부(HAR) 반응 또는 혈소판 흡수를 유발할 경향이 감소된 트랜스제닉 돼지를 개발하기 위한 이종기관이식 및 유전자 변형의 분야에 관한 것이다.
배경
한 동물에서 동일한 종의 다른 동물로의 이식, 예컨대 인간에서 인간으로의 이식은 신장, 심장, 폐, 간 및 기타 기관 질환 및 심한 화상 질환과 같은 피부 손상을 포함한 많은 심각한 질병에 대한 일상적인 치료 옵션임이 널리 알려져 있다. 그러나, 기관 이식에 대한 현재 또는 예상되는 임상적 요구를 충족시키기 위해 이식에 이용가능한 적합한 기관이 충분하지 않음이 널리 공지되어 있다. 약 100,000명의 환자가 신장 이식 목록에 있고, 이들은 이식을 받거나 사망하지 전까지 평균 5년 정도를 대기자 명단에 남아 있다. 신부전 환자에서, 투석은 환자가 이식을 기다릴 수 있는 시간의 길이를 증가시킨다. 18,000명이 넘는 환자가 UNOS 간 이식 국립 대기자 명단에 올라 있지만, 연간 7,000건 미만의 이식이 미국에서 수행된다. 간 질환 또는 간부전 환자에 이용가능한 투석과 비슷한 시스템은 존재하지 않는다.
이종기관이식, 즉 한 동물로부터 상이한 종의 다른 동물로의 기관, 조직 또는 세포의 이식, 예컨대 돼지 기관의 인간 수용체로의 이식은 이식에 이용가능한 기관의 부족을 줄일 가능성이 있고, 잠재적으로 전세계적으로 수 천명의 사람을 돕는다. 그러나, 표준의 변형되지 않은 돼지 조직을 인간 또는 다른 영장류에 이용하는 이종기관이식은 이식된 조직의 심각한 거부를 동반한다. 거부는 초급성 거부, 급성 거부, 만성 거부일 수 있거나, 생존 제한적인 저혈소판증 응고병증을 수반할 수 있거나, 급성 체액 이종이식 반응(AHXR)일 수 있다. 이식된 조직에 존재하는 돼지 항체에 대한 인간 초급성 거부 반응은 이식 조직이 전형적으로 인간에 이식한 지 수 분 또는 수 시간 내에 인간 면역계에 의해 손상될 정도로 강하다. 더욱이, 상이한 거부 메커니즘이 기관-우선 방식으로 지배적일 수 있다. 문헌[Demetris et al. 1998 "Antibody-mediated Rejection of Human Orthotopic Liver Allograft. A study of liver transplantation across ABO blood group barriers", Am J. Pathol 132:489-502; Nakamura et al 1993 "Liver allograft rejection in sensitized recipients. Observations in a Clinically Relevant Small Animal Model" Am J. Pathol. 142:1383-91; Furuya et al 1992. "Preformed Lymphocytotoxic Antibodies: the Effects of Class, Titer and Specificity on Liver v Heart Allografts" Hepatology16:1415-22; Tector et al 2001. "Rejection of Pig Liver Xenografts in Patients with Liver Failure: Implications for Xenotransplantation", Liver Transpl pp.82-9; 이들의 전문이 본원에 참조로서 포함됨]을 참조하라. 예를 들어, 혈소판감소 응고병증의 조기 발생은 돼지 간의 이종-이식 후 비-인간 영장류 수용체 사망의 주요 요인이다. 그렇지만, 항체 매개된 이종이식 거부(AMXR, AMR)가 방지된다면, 돼지 신장의 비-인간 영장류(NHP) 수용체는 현저한 저혈소판증을 보이지 않고 응고병증의 임상 소견도 나타내지 않는다. 예를 들어 문헌[Ekser et al. 2012 "Genetically Engineered Pig to Baboon Liver Xenotransplantation: Histopathology of Xenografts and Native Organs" PLoS ONE pp e29720; Knosalla et al 2009, "Renal and Cardia Endothelial Heterogeneity Impact Acute Vascular Rejection in Pig to Baboon Xenotransplantation", Am J Transplant 1006-16; Shimizu et al 2012. "Pathologic Characteristics of Transplanted Kidney Xenografts", J. Am. Soc. Nephrology 225-35; 전문이 본원에 참조로서 포함됨]을 참조하라.
이식을 위한 기관, 조직 및 세포의 요구 외에도, 수혈을 위한 안전한 혈액이 부족하다. 매년 천백만 건의 패킹된 인간 적혈구(RBC)를 이용한 혈액 수혈이 미국에서 시행된다(National Blood Data Source, 1998). 미국의 혈액 공급은 만성적으로 부족하다. 2001년에 미국 혈액 뱅크는 최적으로 요구되는 것보다 약 250,000 유닛 적게 얻어질 것을 예상하였다. 관련청은 정기적인 혈액 기증자가 휴가를 가고 대학생들이 또한 주요 도심을 떠나는 여름철 동안 치명적인 국가적 부족을 일상적으로 예견한다. 국가는 견고하고 경쟁력 있는 혈액 수집 및 분배 시스템을 갖고 있기 때문에, 일반적으로 주기적 부족으로 사망에 이르지는 않으나, 대기 수술이 연기될 필요가 있고 치명적이지 않은 요구는 충족되지 않는다. 일반적으로 기증된 혈액은 약 42일 동안만 보관할 수 있고 5% 미만의 적격 기증자가 혈액을 공급할 수 있으므로, 눈보라 또는 허리케인과 같은 심각한 기상 조건은 종종 위험할 정도로 낮은 혈액 보유량을 초래한다.
인간 혈액은 희소한 자원일 뿐 아니라, 수용체에 잠재적인 위험을 안겨준다. 바이러스 스크리닝 과정에도 불구하고, 기증된 인간 혈액은 100% 안전하지 않다(FDA, Annual Summary of Fatalities Reported to the FDA Following Blood Collection and Transfusion, FY2013). 일반 집단에서 C형 간염 및 HIV의 발생율은 기증된 혈액 생성물의 값비싸고 어려운 검사를 필요하게 만든다. 인간 혈액에 어떤 감염성 미생물도 없다는 것을 보장하는 어려움과 비용 때문에, 그 양이 무제한이며 감염성 작용제가 없는 적혈구 및 기타 수혈 생성물의 공급원을 개발하는 것은 매우 바람직할 것이다.
돼지 세포는 인간 세포에서는 발견되지 않는 α(1,3) 갈락토실트랜스퍼라제(αGal), 및 시티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제(CMAH)를 발현시킨다. 돼지 세포는 또한 돼지 β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(β4GalNT2)를 발현시킨다; 많은 인간은 β4GalNT2의 형태를 발현시키는 것으로 여겨진다(Morton et al (1970) Vox Sang 19:472-482). αGal 효소는 당단백질 상에서 갈락토스-α1,3-갈락토스(αGal) 잔기의 형성을 촉매화한다. CMAH는 시알산 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac)을 N-글리코실뉴라민산(Neu5Gc)으로 전환시킨다. 돼지 β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(β4GalNT2)는 시알산 변형된 락토스 아민으로의 N-아세틸갈락토사민의의 말단 첨가를 촉매화하여, 비제한적으로, CAD 또는 CT 혈액 그룹 항원으로도 공지된 Sda, 및 GalNAc β1,4[Neu5Ac α2,3] Gal β1-4GlcNAc β1-3 Gal을 포함하는 Sda-유사 항원을 생성한다(Blanchard et al (1983) JBC 258:7691-7695). 돼지 β4GalNT2는 추가적인 글리칸의 형성도 촉매화할 수 있다. Neu5Gc, αGal 및 Sda 에피토프에 대한 항체는 조직의 이식 전에 인간 혈액에 존재하며, 이식된 조직의 강렬하고 즉각적인 항체 매개된 거부에 관여한다. 추가적인 β4GalNT2(Sda-유사) 에피토프에 대한 항체도 환자의 혈액에 존재할 수 있고 이식된 조직의 항체 매개된 거부에 기여할 수 있다.
효소의 발현을 막기 위해 α(1,3) 갈락토실트랜스퍼라제 및 CMAH를 인코딩하는 유전자를 제거하거나, α(1,3) 갈락토실트랜스퍼라제 및 CMAH를 인코딩하는 유전자를 변형시켜 효소의 발현을 감소시키거나 제한하거나, 또는 달리 거부 반응을 제한하는 것을 포함하는 많은 전략이 거부 반응을 다루기 위해 이용되어 왔다. Phelps 등에 의한 미국 특허 7,795,493호는 기능성 αGal의 어떤 발현도 결여된 돼지의 생산 방법을 기재한다. 예를 들어, Day 등에 의한 미국 특허 7,547,816호는 야생형 돼지에 비해 α(1,3) 갈락토실트랜스퍼라제의 발현이 감소된 녹아웃 돼지를 기재한다. 비록 Day 돼지에서 α(1,3) 갈락토실트랜스퍼라제의 발현이 감소될 수 있었다고 해도, Neu5Gc 항원성 에피토프가 여전히 남아 있고 Day 돼지로부터의 당지질은 αGal 항원성 에피토프를 지닌다. 불행히도, GTKO 돼지가 이종기관이식에 대한 장벽으로서 항-α-Gal 항체를 감소시킬 수 있었으나, 개코원숭이에서 GTKO 심장 및 신장 이종이식을 이용한 연구는 GTKO 기관이 여전히 면역원성 반응을 촉발시켜, 이식된 기관에 대한 거부 또는 손상을 발생시킴을 보여준다. GTKO 신장을 이식하고 두 상이한 면역억제 요법으로 처리된 개코원숭이는 수술 후 16일 이내에 사망하였다. Chen 등은 "Gal 항원의 유전적 고갈은 이종이식 생존에 큰 혜택을 제공하지 못한다"라고 결론내렸다"(Chen et al., (2005) Nature Med 11(12):1295-1298. Koike 등에 의한 미국 특허 7,560,538호 및 Zhu 등에 의한 미국 특허 7,166,378호 및 8,034,330호는 각각 지연된 이종이식 거부 및 초급성 거부의 대상이 될 가능성이 적은 이식용 돼지 기관을 제조하는 방법을 기재한다. Zhu 특허는 CMAH 활성 또는 돼지 세포 상의 에피토프의 감소를 논의한다. 그러나, Basnet 등은 CMAH-/- 마우스 세포에 대한 인간 혈청의 세포독성 반응을 조사하였다. Basnet 등은 "항-Neu5Gc Ab-매개된 면역 반응은 이종발생 세포 이식에서 이식편 손실에 현저하게 관여할 수 있으나, 기관 이식에서는 그렇지 않다"라고 결론내렸다(Basnet et al., 2010 Xenotransplantation 17(6):440-448). Diamond 등에 의한 미국 특허 6,166,288호는 인간으로의 이종기관이식 재료의 거부가 감소된 이종기관이식용 기관, 조직 또는 세포를 제조하는 방법을 기재한다. 미국 특허 6,166,288호는 알려진 대로 돼지 기관, 조직 및 세포로부터 특정 이종반응성 항원을 제거하는 효소를 인코딩하는 푸코실트랜스퍼라제 유전자를 발현시키는 트랜스제닉 돼지를 기재한다. 미국 특허 6,166,288호는 3개의 돼지 유전자에 변동을 지닌 트랜스제닉 돼지를 제공하지 않는다.
Schwarz 등에 의한 미국 특허 6,572,867호는 영장류에서 항-(αGal(1,3)Gal) 항체의 혈장 수준을 감소시키기 위한 면역억제 조성물을 제공한다. 면역억제 요법은 이식 분야에 공지되어 있다. 면역억제 약물 요법은 이들이 환자의 면역 반응을 약화시키므로 감염의 위험을 증가시키고, 값비싼 유지 의약품을 필요로 하며, 다른 약물치료와 상호작용하는 약물을 포함할 수 있고, 체중 증가와 같은 추가적인 부작용을 유발할 수 있는 위험을 증가시킨다.
이 분야에서의 진전은 거부 반응을 감소시키는 변형을 갖는 유전적으로 변형된 돼지의 발생에 결정적으로 의존한다. 불행히도, 동형접합 트랜스제닉 돼지를 발생시키는 것은 느린 과정이며, 태아 섬유모세포에서의 동종 재조합에 이어 체세포 핵 이식(SCNT)의 전통적인 방법을 이용한 다음, 이형접합 트랜스제닉 동물의 번식으로 동형접합 트랜스제닉 돼지를 생산하는 3년만큼이나 긴 시간을 필요로 한다. 이종기관이식을 위한 새로운 트랜스제닉 돼지의 개발은 다능성 줄기 세포의 부족에 의해 방해 받았고, 대신 유전 공학이 수행된 세포로서의 태아 섬유모세포에 의존적이다.
따라서, 인간 이식 수용체를 위한 기관, 조직, 혈액 및 세포에 대한 이식 재료의 공급원으로서 감소된 αGal, Sda-유사 및 Neu5Gc 에피토프를 갖는 삼중 녹아웃(αGal, β4GalNT2, CMAH) 돼지를 생산하는 개선되고, 간단하고, 재현가능하며, 효율적이고, 표준화된 방법이 당 분야에 필요하다.
간단 개요
본 발명은 일반적으로 인간에 이식하기 위해 감소된 α(1,3)갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 발현을 지닌 돼지 기관, 조직 또는 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
돼지의 적어도 한 세포의 핵 유전체에 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 트랜스제닉 돼지가 제공된다. 트랜스제닉 돼지에서 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β 1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제의 발현은 야생형 돼지에서의 발현에 비해 감소한다. 삼중 트랜스제닉 돼지로부터 수득된 돼지 기관, 조직, 수혈 생성물, 또는 세포가 제공된다. 돼지 기관, 조직, 수혈 생성물 또는 세포는 피부, 심장, 간, 신장, 폐, 췌장, 갑상샘, 소장 및 이의 성분으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 한 양태에서, 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 조직이 인간에 이식될 때, 거부 관련 증상은 야생형 돼지로부터의 조직이 인간에 이식될 때보다 개선된다. 한 양태에서, 거부 관련 증상은 세포 거부 반응 관련 증상, 체액 거부 반응 관련 증상, 초급성 거부 관련 증상, 급성 체액 이종이식 반응 거부 관련 증상, 및 급성 혈관 거부 반응 관련 증상을 포함하는 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 기관, 조직, 수혈 생성물 또는 세포가 인간에 이식될 때, 저혈소판증은 야생형 돼지로부터의 기관, 조직, 수혈 생성물 또는 세포가 인간에 이식될 때보다 감소한다. 한 양태에서, 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 간이 인간 혈소판에 노출될 때, 간은 야생형 돼지로부터의 간이 인간 혈소판에 노출될 때보가 감소된 인간 혈소판 흡수를 나타낸다. 한 양태에서, 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 신장이 인간에 이식될 때, 거부 관련 증상은 야생형 돼지로부터의 신장이 인간에 이식될 때보가 감소한다.
한 구체예에서, 돼지의 적어도 한 세포의 핵 유전체에 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 삼중 트랜스제닉 돼지로부터 수득되고 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소된 피부 관련 생성물이 제공된다. 본 출원의 한 양태에서 피부 관련 생성물은 상처, 특히 인간 피부 상처로부터 조기 분리 감소를 나타낸다.
인간으로의 이종기관이식을 위한 이식 재료를 제조하는 방법이 제공된다. 이 방법은 본 출원의 삼중 트랜스제닉 돼지를 이식 재료의 공급원으로서 제공하는 것을 포함하고, 이식 재료는 기관, 조직, 수혈 생성물 및 세포로 구성된 군으로부터 선택되고, 이식 재료는 감소된 수준의 αGal, Sda-유사 항원 및 Neu5Gc 항원을 갖는다.
돼지의 적어도 한 세포의 핵 유전체에 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β1,4GalNT2 유전자를 포함하는 삼중 트랜스제닉 돼지가 제공된다. 한 구체예에서 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴는 G에서 A로의 치환에 인접한 3개의 염기쌍 결실, 단일 염기쌍 결실, 단일 염기쌍 삽입, 2개의 염기쌍 삽입, 6개의 염기쌍 결실, 10개의 염기쌍 결실, 7개의 염기쌍 결실, 5개의 염기쌍 결실에 대한 8개의 염기쌍 삽입, 5개의 염기쌍 삽입, 11개의 염기쌍 결실 및 18개의 염기쌍 결실을 비제한적으로 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고; CMAH 유전자의 파괴는 4개의 염기쌍 삽입, 1개의 염기쌍 결실, 2개의 염기쌍 결실, 3개의 염기쌍 결실, 4개의 염기쌍 삽입, 5개의 염기쌍 결실, 8개의 염기쌍 결실, 11개의 염기쌍 결실, 12개의 염기쌍 결실, 단일 염기쌍 삽입, 단일 염기쌍 결실에 대한 2개의 염기쌍 삽입, 66개의 염기쌍 결실에 대한 12개의 염기쌍 삽입, 3개의 염기쌍 결실에 대한 4개의 염기쌍 삽입; 및 5개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환을 비제한적으로 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, β4GalNT2 유전자의 파괴는 1개의 염기쌍 삽입, 12개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환, 12개의 염기쌍 결실, 14개의 염기쌍 결실, 5개의 염기쌍 결실 및 271개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 삽입을 비제한적으로 포함하는 파괴의 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴는 5개의 염기쌍 결실 및 7개의 염기쌍 결실을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, CMAH 유전자의 파괴는 12개의 염기쌍 결실 및 3개의 염기쌍 결실/4개의 염기쌍 삽입을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, β4GalNT2 유전자의 파괴는 1개의 염기쌍 삽입, 12개의 염기쌍 결실 및 5개의 염기쌍 결실을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴는 11개의 염기쌍 결실 및 18개의 염기쌍 결실을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, CMAH 유전자의 파괴는 66개의 염기쌍 결실/12개의 염기쌍 삽입 및 5개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, β4GalNT2 유전자의 파괴는 14개의 염기쌍 결실, 12개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환, 및 271개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 삽입을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택된다. 삼중 트랜스제닉 돼지에서 기능성 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현은 야생형 돼지에 비해 감소한다. 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 조직이 인간에 이식될 때, 초급성 거부 관련 증상은 야생형 돼지로부터의 조직이 인간에 이식될 때보다 개선된다.
인간 대상체가 인간 기관 이식을 필요로 하는 대상체로서 식별될 때와 인간 기관 이식이 발생할 때 사이의 지속 기간을 증가시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 기관을 제공하는 단계로서, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소된 단계, 및 치료적으로 효과적인 방식으로 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 기관을 인간 대상체에 수술적으로 부착시키는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 기관은 인간 대상체의 내부에 수술적으로 부착된다. 한 양태에서, 기관은 인간 대상체의 외부에 수술적으로 부착된다. 기관은 대상체에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다.
인간 대상체가 인간 간 이식을 필요로 하는 대상체로서 식별될 때와 인간 간 이식이 발생할 때 사이의 지속 기간을 증가시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 기관을 제공하는 단계로서, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소된 단계, 및 치료적으로 효과적인 방식으로 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 간을 인간 대상체에 수술적으로 부착시키는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 간은 인간 대상체의 내부에 수술적으로 부착된다. 한 양태에서, 간은 인간 대상체의 외부에 수술적으로 부착된다. 간은 대상체에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다.
인간 대상체가 인간 신장 이식을 필요로 하는 대상체로서 식별될 때와 인간 신장 이식이 발생할 때 사이의 지속 기간을 증가시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 신장을 제공하는 단계로서, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소된 단계, 및 치료적으로 효과적인 방식으로 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 신장을 인간 대상체에 수술적으로 부착시키는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 신장은 인간 대상체의 내부에 수술적으로 부착된다. 한 양태에서, 신장은 인간 대상체의 외부에 수술적으로 부착된다. 신장은 대상체에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다.
인간 대상체로부터 피부 관련 생성물의 조기 분리를 감소시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 삼중 트랜스제닉 돼지를 제공하는 단계, 및 삼중 트랜스제닉 돼지로부터 피부 관련 생성물을 제조하는 단계를 포함한다. 삼중 트랜스제닉 돼지에서 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현은 야생형 돼지에 비해 감소한다.
환자에서 초급성 거부 관련 증상을 개선시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 감소된 수준의 αGal 항원, Sda-유사 및 Neu5GC 항원을 갖는 돼지 이식 재료를 대상체에 이식하는 것을 포함한다. 초급성 거부 관련 증상은 야생형 돼지로부터의 돼지 이식 재료가 인간에 이식될 때보다 개선된다.
변경된 에피토프 프로파일을 나타내는 세포 배양 시약이 제공된다. 세포 배양 시약은 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 삼중 트랜스제닉 돼지로부터 분리된다. 삼중 트랜스제닉 돼지에서 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현은 야생형 돼지에 비해 감소한다. 세포 배양 시약은 세포 배양 배지, 세포 배양 혈청, 세포 배양 첨가제 및 증식할 수 있는 분리된 세포를 포함하는 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 세포 배양 시약은, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴가 5개의 염기쌍 결실, 7개의 염기쌍 결실, 또는 지시된 위치에서 단일 염기쌍 삽입으로 구성된 파괴의 군으로부터 선택되고, CMAH 유전자의 파괴가 12개의 염기쌍 결실, 3개의 염기쌍 결실/4개의 염기쌍 삽입, 7개의 염기쌍 결실 및 11개의 염기쌍 결실로 구성된 파괴의 군으로부터 선택되고, β4GalNT2 유전자의 파괴가 지시된 위치에서 단일 염기쌍 삽입, 12개의 염기쌍 결실 및 5개의 염기쌍 결실로부터 선택되는 삼중 트랜스제닉 돼지로부터 선택된다. 한 양태에서, 세포 배양 시약은, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴가 11개의 염기쌍 결실 및 18개의 염기쌍 결실을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, CMAH 유전자의 파괴가 66개의 염기쌍 결실/12개의 염기쌍 삽입 및 5개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, β4GalNT2 유전자의 파괴가 14개의 염기쌍 결실, 12개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환, 및 271개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 삽입을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되는 삼중 트랜스제닉 돼지로부터 분리된다.
변경된 에피토프 프로파일을 지닌 관심 화합물을 생산하는 방법이 제공된다. 이 방법은 변경된 에피토프 프로파일을 나타내는 세포 배양 시약을 제공하는 단계 및 관심 화합물을 발현시킬 수 있는 분리된 세포를 변경된 에피토프 프로파일을 나타내는 세포 배양 시약과 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 변경된 에피토프 프로파일을 지닌 세포 배양 시약은 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 삼중 트랜스제닉 돼지로부터 분리된다. 삼중 트랜스제닉 돼지에서 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현은 야생형 돼지에 비해 감소한다. 관심 화합물에 대한 Neu5Gc, alphaGal 및 Sda-유사 에피토프의 수준은 관심 화합물이 야생형 돼지로부터 분리된 세포 배양 시약과 인큐베이션된 분리된 세포로부터 생산될 때의 관심 화합물에 대한 Neu5Gc, alphaGal 및 Sda-유사 에피토프의 수준보다 낮다. 한 구체예에서 관심 화합물은 당지질 및 당단백질을 포함하는 군으로부터 선택된다. 다양한 양태에서, 관심 화합물은 항체, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 및 응고 인자를 포함하는 당단백질의 군으로부터 선택된 당단백질이다. 한 구체예에서 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴는 5개의 염기쌍 결실, 7개의 염기쌍 결실 또는 지시된 위치에서 단일 염기쌍 삽입으로 구성된 파괴의 군으로부터 선택되고, CMAH 유전자의 파괴는 12개의 염기쌍 결실, 3개의 염기쌍 결실/4개의 염기쌍 삽입, 7개의 염기쌍 결실 및 11개의 염기쌍 결실로 구성된 파괴의 군으로부터 선택되고, β4GalNT2 유전자의 파괴는 지시된 부위에서 단일 염기쌍 삽입, 12개의 염기쌍 결실 및 5개의 염기쌍 결실로부터 선택된다. 한 구체예에서 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴는 11개의 염기쌍 결실 및 18개의 염기쌍 결실을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, CMAH 유전자의 파괴는 66개의 염기쌍 결실/12개의 염기쌍 삽입 및 5개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, β4GalNT2 유전자의 파괴는 14개의 염기쌍 결실, 12개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환, 및 271개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 삽입을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택된다.
인간으로의 이식을 위한 돼지 이식 재료가 제공된다. 돼지 이식 재료의 지질 및 단백질은 감소된 수준의 αGal 에피토프를 갖고, 이식 재료는 감소된 수준의 Neu5Gc 및 Sda-유사 에피토프를 갖는다.
돼지의 적어도 한 세포의 핵 유전체에 파괴된 α1,3-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 트랜스제닉 돼지로서, α1,3-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소되고 VVL 결합이 감소된 트랜스제닉 돼지가 제공된다.
도 1은 예시적인 녹아웃 돼지(돼지 단리물 식별자 47-1)에서 서열 변동의 도식을 묘사한다. 패널 A는 야생형(wt) 및 파괴된 α1,3 갈락토실트랜스퍼라제 유전자(GGTA-1) 뉴클레오티드 서열의 부분을 제공한다. 야생형 GGTA-1 뉴클레오티드 서열(WT)의 부분이 맨 윗줄에 도시된다. 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 변경된 GGTA-1 뉴클레오티드 서열의 동일한 영역이 아래 두 줄에 도시되고 각각은 한 GGTA-1 대립유전자의 변경된 서열을 제공한다. 예시적인 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 파괴된 GGTA-1 뉴클레오티드 서열은 5개의 염기쌍 및 7개의 염기쌍 결실이다. 점선은 결실된 뉴클레오티드가 야생형 서열에서 발생할 뉴클레오티드 서열의 부분을 나타낸다.
패널 B는 예시적인 삼중 트랜스제닉 돼지에 대한 야생형 및 파괴된 CMAH 유전자의 부분을 제공한다. 야생형(wt) CMAH 유전자의 부분이 맨 윗줄에 도시된다. 동일한 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 유사한 영역의 두 대립유전자 모두의 뉴클레오티드 서열이 야생형 서열 아래에 도시된다. 삼중 트랜스제닉 돼지의 파괴된 CMAH 서열은 12개의 염기쌍 결실 및 3개의 염기쌍 결실/4개의 염기쌍 삽입을 포함한다. 점선은 결실이 발생한 뉴클레오티드 서열의 영역을 나타낸다.
패널 C는 예시적인 삼중 트랜스제닉 돼지에 대한 야생형 및 파괴된 β4GalNT2 유전자의 부분을 나타낸다. 야생형(wt) β4GalNT2 유전자의 부분이 맨 윗줄에 도시된다. 동일한 예시적인 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 유사한 영역의 뉴클레오티드 서열이 야생형 서열 아래에 도시된다. 도시된 대로, 삼중 트랜스제닉 돼지의 파괴된 β4GalNT2 서열은 단일 염기쌍 삽입, 12개의 염기쌍 결실 및 5개의 염기쌍 결실을 포함한다. GGTA1 및 CMAH 서열과 달리, 3개의 상이한 대립유전자가 검출되었다. β4GalNT2 서열은 돼지 유전체에서 하나를 초과하는 별개의 유전자좌에서 발생할 수 있다. 점선은 β4GalNT2 결실이 발생한 뉴클레오티드 서열의 영역을 나타낸다.
도 2는 CMAH/αGal 이중 트랜스제닉 돼지(CMAH, 상부 패널) 또는 CMAH/αGal/β4GalNT2 삼중 트랜스제닉 돼지(B4, 하부 패널)로부터의 말초혈 단핵구 세포(PBMC)로부터 수득된 흐름세포측정법 데이터의 그래프를 도시한다. 세포를 탈염색하거나(세포만, 흰색 곡선) 돌리쿠스 바이플로루스 응집소 컨쥬게이션된 FITC(DBA-FITC, 실선 검정색 곡선)로 염색하였다. DBA는 β4GalNT2에 의해 생산된 글리칸 또는 Sda-유사 글리칸을 지닌 α-N-아세틸갈락토사민에 결합한다. 상부 패널에서 DBA와 인큐베이션 후 야생형 β4GalNT2 서열(CMAH)을 지닌 이중 녹아웃(CMAH/αGal) 돼지로부터의 PBMC의 프로파일(검정색 곡선)은 이중 트랜스제닉 CMAH/αGal 돼지로부터의 탈염색된 세포의 프로파일(흰색 곡선)로부터 뚜렷하게 이동한다. 하부 패널에서 DBA와 인큐베이션 후 파괴된 β4GalNT2 서열(B4)을 지닌 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 PBMC의 프로파일은 대부분 삼중 트랜스제닉 CMAH/αGal/β4GalNT2 돼지로부터의 탈염색된 세포로부터의 프로파일 위에 놓인다(오버레이가 회색으로 표시된 흰색 및 검정색 곡선의 영역). DBA-FITC 처리된 세포의 프로파일에서의 제한적인 변화는 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 PBMC에 대한 DBA 결합의 부족 및 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 세포 상에서 Sda-유사 항원의 발생 감소를 나타낸다.
도 3은 다양한 돼지로부터의 PBMC의 에피토프 분석 결과를 제공한다. 패널 A는 야생형(WT) 및 삼중 트랜스제닉(GGTA1-/-, CMAH-/-, B4GalNT2-/-) 돼지로부터의 PBMC로 수행된 실험의 흐름세포측정법 결과를 제공한다. 세포 수는 y-축 상에 도시된다; 형광성은 x-축 상에 도시된다.
맨 왼쪽 그래프는 음성 대조군(흰색)과 IB4 렉틴과 인큐베이션된 세포(짙은색)로부터의 데이터를 도시한다. IB4는 GGTA1의 유전자 생성물에 의해 생성된 알파 갈락토스 연결된 탄수화물과 상호작용한다. 대조군(음성) 및 실험(양성) 결과 간의 중첩된 곡선은 회색으로 도시된다. IB4와 인큐베이션된 야생형 세포는 탈염색된 야생형 세포와 별개의 분리된 피크를 나타낸다. IB4와 인큐베이션된 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 세포는 현저한 두 번째 피크를 나타내지 않는데, 이는 αGal 연결된 탄수화물이 현저하게 감소되었음을 나타낸다.
중간 그래프는 음성 대조군(흰색) 및 HD 항체와 인큐베이션된 세포(짙은색)로부터의 데이터를 도시한다. 음성 대조군은 무관한 아이소형 대조군 항체였다. HD 항체는 CMAH 유전자의 생성물에 의해 생산된 Neu5Gc 탄수화물과 상호작용한다. 대조군(음성) 및 실험(양성) 결과 간의 중첩된 곡선은 회색으로 도시된다. HD 항체와 인큐베이션된 야생형 세포는 비관련 항체로 처리된 야생형 세포와 별개의 분리된 피크를 나타낸다. HD 항체와 인큐베이션된 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 세포는 현저한 두 번째 피크를 나타내지 않는데, 이는 Neu5Gc 에피토프 수준이 현저하게 감소되었음을 나타낸다.
맨 왼쪽 그래프는 음성 대조군(흰색) 및 DBA 렉틴과 인큐베이션된 세포(짙은색)로부터의 데이터를 도시한다. DBA 렉틴은 β4GalNT2의 유전자 생성물에 의해 생성된 탄수화물 구조물과 상호작용한다. 대조군(음성) 및 실험(양성) 결과 간의 중첩된 곡선은 회색으로 도시된다. DBA와 인큐베이션된 야생형 세포는 탈염색된 야생형 세포와 별개의 분리된 피크를 나타낸다. DBA와 인큐베이션된 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 세포는 현저한 두 번째 피크를 나타내지 않는데, 이는 β4GalNT2의 유전자 생성물에 의해 생산된 탄수화물이 현저하게 감소되었음을 나타낸다.
패널 B는 다양한 돼지 유형으로부터의 PBMC에 대한 44명의 고유 인간으로부터의 혈청 중 인간 IgG(X-축) 및 IgM (Y-축)의 상대적 결합을 평가하기 위한 흐름세포측정법 실험으로부터 수득된 결과의 분포 그래프를 제공한다. 야생형(WT) 돼지로부터의 PBMC에 의한 결과는 열린 사각형으로 표시되고, 단일 트랜스제닉 αGal 파괴된(GGTA1-/-) 돼지로부터의 결과는 삼각형으로 표시되며, 이중 트랜스제닉 CMAH/αGal 파괴된(GGTA1-/- 및 CMAH-/-) 돼지로부터의 결과는 빈 원으로 표시되고, 삼중 트랜스제닉 CMAH/αGal/B4GalNT2 파괴된(GGTA1-/- 및 CMAH-/- 및 β4GalNT2-/-) 돼지로부터의 결과는 채워진 원으로 표시된다. 삼중 트랜스제닉 CMAH/αGal/B4GalNT2 파괴된(GGTA1-/- 및 CMAH-/- 및 β4GalNT2-/-) 돼지로부터의 결과는 낮은 수준의 IgM 및 IgG 결합에 밀집되어 있다; 약간의 데이터 포인트는 삼중 트랜스제닉 세포에 대한 적당한 IgG 결합을 나타낸다.
도 4는 다양한 돼지 유형으로부터의 PBMC에 대한 붉은털 원숭이(Rhesus Macaque), 개코원숭이 및 인간로부터의 혈청 중 붉은털 원숭이 IgG(X-축) 및 IgM (Y-축)의 상대적 결합을 평가하기 위한 흐름세포측정법 실험으로부터 수득된 결과의 분포 그래프를 제공한다. 단일 트랜스제닉 αGal 파괴된(GGTA1-/-) 돼지로부터의 PBMC에 의한 결과는 x-축에 표시되고, 이중 트랜스제닉 CMAH/ GGTA1-/- 파괴된(GGTA1-/- 및 CMAH-/-) 돼지로부터의 결과는 빈 원으로 표시되며, 삼중 트랜스제닉 CMAH/ GGTA1-/- /B4GalNT2 파괴된 (GGTA1-/- 및 CMAH-/- 및 β4GalNT2-/-) 돼지로부터의 결과는 채워진 원으로 표시된다. CMAH/ GGTA1-/- 및 CMAH/ GGTA1-/-/β4GalNT2는 y-축에 있다. 선 아래의 결합은 x 축 상의 돼지 세포에 대한 결합이 y 축 상의 돼지 세포보다 더욱 항원성임을 나타낸다. 인간(위), 개코원숭이(중간) 및 붉은털 원숭이(아래) 혈청을 돼지 세포로 시험하였다. IgM 결과는 왼쪽에 도시된다; IgG 결과는 오른쪽에 도시된다.
도 5는 적혈구(RBC)에 대한 IgG 항체 결합의 수준을 나타내는 일련의 흐름세포측정법 결과를 제공한다. 여러 타입의 RBC를 3개의 인간 혈청에 대해 평가하였다. 인간 A 혈청으로부터의 결과는 왼쪽 컬럼에 있고, 인간 O 혈청 1은 중간 컬럼 및 인간 O 혈청 2는 오른쪽 컬럼에 있다. B4Gal/CMAH/Gal 삼중 녹아웃(B4G 삼중 KO) RBC 결과는 맨 윗줄에 있다. 인간 O 1 RBC 결과는 두 번째 줄에 있다. 인간 O 2 RBC 결과는 세 번째 줄에 있다. 인간 A RBC 결과는 네 번째 줄에 있다. 돼지 야생형 RBC는 맨 아래줄에 있다. 야생형 돼지 RBC가 인간 A 및 인간 O 혈청 1로 평가될 때 다수의 현저한 피크가 존재한다; 야생형 돼지 RBC가 인간 O 혈청 2로 평가될 때 여러 작은 피크가 존재한다. 인간 A RBC 및 2개의 인간 O 혈청의 트레이스에서, 현저한 피크가 존재한다. 그러나, 인간 A RBC 및 인간 A 혈청은 한 중첩 피크만을 나타낸다. 예상된 대로 둘 모두의 인간 O RBC는 3개 모두의 혈청에 대해 시험될 때 단일한 중첩 피크만을 나타낸다. B4Gal/CMAH/Gal 삼중 녹아웃 RBC는 인간 O RBC와 유사하게, 3개 모두의 혈청에 대해 시험될 때 단일한 중첩 피크만을 나타내다.
도 6은 다양한 돼지 및 인간 RBC에 대한 인간 항체 결합의 흐름세포측정법 비교로부터 수득된 데이터의 개요를 제공한다. 74명 인간으로부터의 혈청을 돼지 및 인간 RBC와 인큐베이션시켰다. 야생형 돼지 RBC(W), GGTA1 및 CMAH가 결여된 동물(CMAH RBC), 또는 GGTA1/CMAH/β4GalNT2(B4G RBC) 및 인간 동종이계 RBC(h)로부터의 결과가 도시된다. 패널 A는 다양한 RBC에 대한 IgG 결합의 개요를 도시한다. 데이터는 IgG에 대한 표준화된 중간 형광 강도(MFI) 및 표준 편차를 나타낸다. 인간 A, B, O 및 AB 혈청을 이용하였다. 일원 ANOVA 및 Tukey's 다중 비교 테스트의 반복 측정을 이용하여 항체 결합의 그룹간 비교를 수행하였다. 다양한 RBC에 대한 인간 항체 결합은 야생형 세포에서 최대였고 각 글리칸 생산 유전자가 불활성화됨에 따라 감소하였다. 삼중 녹아웃-RBC(B4G)는 인간 알로-RBC(h)에서 보여진 항체 결합 수준과 가장 비슷하였다. 패널 B는 다양한 RBC에 대한 IgM 결합의 개요를 도시한다. 데이터는 IgM에 대한 표준화된 중간 형광 강도(MFI) 및 표준 편차를 나타낸다. 둘 모두의 IgG 및 IgM에 대하여 야생형>이중 녹아웃>삼중 녹아웃
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인간의 경향이 관찰되었다. 패널 C에서, 흐름세포측정법을 이용하여 α-Gal, Neu5Gc 및 DBA-반응성 글리칸의 발현에 대한 GGTA1, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 불활성화시킨 효과를 나타내었다. 돼지 야생형(W) 적혈구, CMAH/αGal 이중 녹아웃(D) 적혈구, CMAH/αGal/βGalNT2 삼중 트랜스제닉 적혈구(T) 및 인간 혈액 그룹 O 적혈구로부터의 결과가 도면에 도시된다. 흐름세포측정법 결과는 각각의 유전자 파괴에 의한 항원성 구조물의 손실을 나타낸다. 패널 D에서, 인간 O RBC에 대한 항체 결합을 조사할 때 각 인간 혈청 샘플의 개개 MFI를 x-축 위에 그리고 삼중 녹아웃 돼지 RBC(B4G)에 대한 항체 결합을 조사할 때 각 인간 혈청 샘플의 개개 MFI를 y-축에 나타내도록 데이터를 플롯팅하였다. 그래프에서 대각선 아래에 있는 데이터 포인트는 인간 혈액 그룹 O 세포보다 돼지 삼중 녹아웃 세포에 덜 결합함을 나타낸다. 인간 그룹 O 혈액은 보편적인 기증자로 간주된다; 수혈된 인간 그룹 O RBC는 제한된 체액 파괴를 겪는다.
도 7은 개별 항체 아이소형의 과다(abundance)를 측정하기 위해 정량적 질량 분석법을 이용한 면역글로불린 분석 결과를 제공한다. 패널 7A는 RBC에 대한 IgG 및 IgM의 결합을 평가하는데 이용된 생화학적 접근법을 설명한 도식이다. 야생형 돼지(W), GGTA1/CMAH 결핍 돼지(D), GGTA/CMAH/β4GalNT2 돼지(T)로부터의 RBC 및 자가 인간 RBC(H)를 평가하였다. 공정의 세부사항은 본원에 달리 기재되어 있다. RBC로부터 용리된 물질을 보여주는 대표적인 겔이 패널 B에 도시된다. 분자량 마커(Mw), 미정제 출발 혈청(S) 및 정제된 인간 IgG를 비교를 위해 부하시켰다. 다른 대조군은 미처리된 RBC(레인 1 모든 샘플), 및 산 세척되고 혈청과 인큐베이션되지 않은 RBC(레인 2 모든 샘플)를 포함하였다. 2 또는 3분 동안 낮은 pH 인큐베이션에 의해 혈청-처리된 RBC로부터 물질을 제거하였다(각각 레인 3 및 4, 모든 샘플). 단일 화살촉은 알부민과 유사한 크기로 이동하는 단백질을 표시한다. 비록 자가 인간 RBC가 이 단백질을 돼지 세포보다 덜 방출하였으나, 이 결과는 다른 실험에서 재현되지 않았다. 이중 화살촉은 IgG와 유사한 크기로 이동하는 단백질을 강조한다(레인 3 및 4). IgG 중쇄 크기조정된 밴드의 강도는 상이한 RBC 사이에서 다양하였다. 세포를 낮은 pH에서 2 또는 3분 동안 인큐베이션하는 것은 유사한 단백질 수준을 방출시켰다. 세포로부터 방출되는 항체의 양을 정량하기 위해, 2분 용리 샘플 중 면역글로불린 중쇄의 대략적인 크기를 포함하는 겔 조각을 수집하고, 트립신과 인큐베이션하고, 질량 분석법에 의해 평가하였다(본원의 하기를 참조하라). 3개의 화살촉은 헤모글로빈과 동일한 크기로 이동하는 단백질을 보여준다. 혈청-비함유 샘플의 상청액 중 헤모글로빈의 존재는 RBC 용해가 조작 중 발생하였음을 나타내었다. 모든 RBC 유형에 대해 레인 1 및 2 사이의 변동은 산 세척이 용해를 촉진하고 세포로부터 증가량의 헤모글로빈을 방출시켰음을 시사한다. 면역글로불린 경쇄의 두 배 약간 위로 이동하는, *으로 표시된 비공지된 폴리펩티드는 혈청의 부재 하에서도 RBC로부터 방출되었다.
패널 C는 질량 분광학에 의해 결정된 바와 같이 동일한 혈청의 분리된 분취량과의 인큐베이션 후 각 유형의 RBC로부터 용리된 IgM 및 IgG의 상대적인 수준을 나타낸다. 질량 분석법으로부터의 AUC를 모두 각 혈청에 대한 자가 인간 적혈구에 대한 총 IgG 또는 IgM 결합에 대해 수득된 값으로 표준화시켰다. 총 항체는 각 아이소형에 대한 AUC를 합산함에 의해 IgG에 대해 계산되었다. 야생형 돼지 적혈구(W), 삼중 녹아웃 돼지 적혈구(B), 및 자가 인간 적혈구(A)로부터의 결과가 도시된다. 자가 인간 적혈구는 시험 혈청이 수득된 동일한 대상체로부터 얻었다.
도 8은 면역글로불린-유래된 펩티드의 대표적인 질량 분광학 크로마토그램을 제공한다. 상대적 과다는 y-축 상에 도시된다. 분 단위의 시간(min)은 x-축 상에 도시된다. 이와 같은 크로마토그램을 이용하여 AUC를 계산하였다.
도 9는 흐름세포측정 분석 게이팅 및 운명을 제공한다. 3개의 인간 혈청을 야생형 돼지로부터의 RBC(W), 자가 인간 RBC(A) 및 GGTA1/CMAH/β4GalNT2 결핍 돼지로부터의 RBC(T)와 인큐베이션시켰다. 결합된 인간 면역글로불린을 보고하기 위해 형광성 이차 항체와 인큐베이션 후에, 세포를 흐름세포측정법에 의해 분석하였다. 전방 산란기(FSC, x-축) 및 측방 산란기(SSC, y-축)를 이용하여 RBC를 확인하였다. 검정색 타원은 분석을 위한 RBC를 선택하는데 사용되는 게이트를 나타낸다. 각 게이트 옆에 표시된 백분율은 게이트 내에 있는 총 사건의 분획을 나타낸다. 인간 혈청은 파편의 증가 및 게이팅된 영역에 있는 RBC의 감소에 의해 보여진 대로 야생형 돼지 RBC를 파괴시켰다. 야생형 RBC 고 항원성 및 결과적인 세포 파괴는 일부 실험에서 야생형(W) 샘플의 히스토그램 품질에 기여했을 수 있다.
도 10은 질량 분석법에 의해 결정된 바와 같은 각 IgG 아이소형에 대해 수득된 곡선하면적(AUC)을 도시한다. AUC는 y-축 상에 도시된다; IgG 아이소형 및 RBC 타입은 x-축 상에 도시된다. 삼중 녹아웃 돼지 적혈구(TKO), 인간 자가 적혈구(인간 자가) 및 야생형 돼지 적혈구(WT)로부터의 결과가 도시된다.
도 11은 야생형(WT) 또는 Gal/CMAH/β4GalNT2 삼중 녹아웃 돼지(B4G)로부터 수득된 말초혈 단핵구(PBMC)로부터 수득된 흐름세포측정법 결과를 도시한다. 2개의 돼지 단리물(58-1 및 59-2)로부터의 PBMC가 도시된다. IB4는 αGal에 의해 결합된다; 감소된 αGal 발현의 존재 하에, IB4 결합은 감소된다. Neu5Gc는 CMAH 유전자 생성물에 의해 생산된 에피토프이다. DBA는 β4GalNT2 생성물에 의해 결합된 렉틴이다. 회색 히스토그램은 음성 대조군 결과를 나타낸다. 2개의 피크는 각각의 IB4, DBA 및 Neu5Gc를 지닌 야생형 세포에 대해 명확하게 존재한다. 둘 모두의 삼중 녹아웃 돼지 단리물에서, 두 번째 피크는 제거되거나 음성 대조군과 중첩되게 이동하였는데, 이는 감소된 결합을 나타낸다.
도 12는 렉틴 염색 후 대동맥 내피 세포(AEC) 또는 무한증식 신장 내피 세포(iREC)로부터 수득된 흐름세포측정법 결과를 제공한다. 지시된 세포 유형을 IB4, Neu5Gc, DBA, PNA, Jacalin 또는 VVL과 인큐베이션시켰다. 왼쪽 컬럼은 야생형 AEC(WT/AEC)로부터 수득된 결과를 나타내고, 두 번째 컬럼은 αGal 파괴된 돼지(GAL/AEC)로부터 수득된 결과를 나타내고, 중간 컬럼은 이중 녹아웃 CMAH/αGal 돼지(CMAH/AEC)로부터 수득된 결과를 나타내고, 네 번째 컬럼은 삼중 녹아웃 CMAH/αGal/β4GalNT2 돼지(B4G/AEC)로부터 수득된 결과를 나타내고, 다섯 번째 컬럼은 야생형 무한증식 신장 내피 세포로부터 수득된 결과를 나타내고, 여섯 번째 컬럼은 GGTA1/CMAH/β4GalNT2 및 SLA 항원 파괴된 무한증식 신장 내피 세포로부터 수득된 결과를 나타낸다. 회색 히스토그램은 렉틴이 없는 음성 대조군이다. 검정색 실선은 렉틴 결합을 나타낸다. Gal 파괴된 세포에서 두 번째 IB4의 부재, CMAH 파괴된 세포에서 두 번째 Neu5Gc 피크의 부재 및 β4GalNT2 파괴된 세포에서 두 번째 DBA 피크의 부재에 주목하라. 두 번째 PNA 및 Jacalin 피크는 단일, 이중 및 삼중 녹아웃 돼지로부터의 세포에서 발생한다. 삼중 녹아웃 AEC 및 β4GalNT2/SLA 삼중 녹아웃, Sla 항원 파괴된 iRMEC에서, 두 번째 VVL 피크는 실질적으로 이동한다. 메커니즘에 의해 제한되지는 않지만, 삼중 녹아웃 세포 상에서 항원의 감소된 VVL 렉틴 인지는 삼중 녹아웃 CMAH/αGal/β4GalNT2 세포 및 돼지로부터 수득된 놀라운 결과에 기여할 수 있다.
도 13은 예시적인 삼중 트랜스제닉 돼지에서 야생형 및 파괴된 β4GalNT2, GGTA1 및 CMAH 유전자의 부분을 제공한다. 각 야생형 서열의 밑줄친 부분은 Crispr 표적 영역을 나타낸다. 도면은 여러 삼중 트랜스제닉 돼지(돼지 단리물 식별자 54-2, 58-1 및 59-2)로부터의 서열 파괴를 보여준다. 3개의 β4GalNT2 변동, 즉, 14개의 뉴클레오티드 결실, 12개의 뉴클레오티드 결실/1개의 뉴클레오티드 치환 및 271개의 뉴클레오티드 결실/1개의 뉴클레오티드 삽입이 도시된다. 묘사된 세 번째 β4GalNT2 돌연변이는 271개의 뉴클레오티드 결실/1개의 뉴클레오티드 삽입이며, 이 때 이중 슬래쉬(//)는 결실의 경계를 확정한다. 2개의 αGal (GGTA1) 변동, 즉, 11개의 뉴클레오티드(nt) 결실 및 18개의 뉴클레오티드(nt) 결실이 도시된다. 2개의 CMAH 변동, 즉, 66개의 뉴클레오티드 결실/12개의 뉴클레오티드 삽입 및 5개의 뉴클레오티드 결실/1개의 뉴클레오티드 치환이 도시된다.
도 14는 인간 임상적 교차적합 시험에서 다수의 인간 혈청에서 평가된 삼중 트랜스제닉 돼지(αGal/B4GalNT2/CMAH 결핍)로부터의 삼중 트랜스제닉 세포로부터 수득된 데이터를 제공한다. 상부 그래프는 PRA=0인 31개 인간 혈청으로부터의 결과를 나타내고; 하부 그래프는 PRA>80인 19개 인간 혈청으로부터의 결과를 도시한다. DTT의 부재 하에 IgM 및 IgG 결과는 채워진 막대로 표시된다; DTT에 의한 처리 후 IgG 결과는 빈 막대로 표시된다. 세포 독성 결과는 y-축 상에 도시된다. 1의 세포독성 점수는 동종이식을 위한 매우 우수한 후보이다.
발명의 상세한 설명
본 출원은 지시된 돼지 유전체 인코딩된 생성물을 발현시키지 않는 인간으로의 이식을 위한 트랜스제닉 돼지 및 돼지 기관, 조직 및 세포 및 이를 제조하고 이용하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서 본 출원은 파괴된 α (1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, β4GalNT2 및 시티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 유전자를 포함하는 삼중 트랜스제닉 돼지를 제공하고, 녹아웃 돼지에서 기능성 α (1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, β4GalNT2 및 시티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제의 발현은 야생형 돼지에 비해 감소한다.
I. 총괄
명세서 및 청구범위에서, 용어 "포함하는(including)" 및 "포함하는(comprising)"은 개방된 용어이며 "포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다"를 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 이러한 용어는 보다 제한적인 용어 "본질적으로 구성된" 및 "구성된"을 포함한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 대상물을 포함한다. 또한, 용어 "한"(또는 "1"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 이용될 수 있다. 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)" 및 "갖는"은 상호교환적으로 이용될 수 있음이 또한 주목되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 구체적으로 언급된 모든 간행물 및 특허는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 간행물에 보고된 화학물질, 도구, 통계 분석 및 방법론을 기술하고 공개하는 것을 포함하여 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로서 포함된다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 당해 기술 수준을 나타내는 것으로 간주되어야 한다. 본원의 무엇도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시보다 선행될 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
II. 조성물 및 방법
이종기관이식에 사용하기 적합한 트랜스제닉 동물 및 이종기관이식에 사용하기 적합한 포유동물을 생산하는 방법이 제공된다. 구체적으로, 본 출원은 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(αGal), β 1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(β4GalNT2) 및 시티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제(CMAH)의 발현이 감소된 삼중 트랜스제닉 돼지의 생산을 기재한다.
본 발명의 구체예에서, 생성된 αGal, β4GalNT2 및 CMAH 생성물이 세포 표면, 당단백질 또는 당지질에 대해 더 이상 야생형 수준의 α1,3-갈락토실 에피토프, Sda-유사 에피토프, 또는 Neu5Gc를 생성하지 않도록, αGal, β4GalNT2 및 CMAH 유전자가 덜 활성인 돼지 및 그로부터의 돼지 기관, 조직 및 세포가 제공된다. 대안적인 구체예에서 αGal, β4GalNT2 및 CMAH 유전자는 유전자의 전사가 일어나지 않는 방식으로 불활성화된다. 다양한 구체예에서, 삼중 αGal/B4GalNT2/CMAH 녹아웃 돼지가 만들어졌고, 트랜스제닉 돼지를 제조하는 방법, 및 이에 대한 챌린지가 문헌[Galli et al 2010 Xenotransplantation 17(6) p.397-410]에 논의되어 있다. 본 발명의 방법 및 세포 배양은 이하 본원에서 더 상세히 설명된다.
용어 "트랜스제닉 포유동물"은 주어진 유전자가 변경되거나, 제거되거나 파괴된 트랜스제닉 포유동물을 의미한다. 이 용어는 모든 자손 세대를 포함하려는 것임이 강조되어야 한다. 따라서, 자손이 시조 동물 또는 자손 동물로부터의 체세포 핵 이식(SCNT)에 의해 생성되었는지 또는 전통적인 생식 방법에 의해 생성되었는지에 관계없이, 시조 동물 및 이의 모든 F1, F2, F3 등의 자손이 포함된다. "단일 트랜스제닉"은 한 유전자가 변경되거나, 제거되거나 파괴된 트랜스제닉 포유동물을 의미한다. "이중 트랜스제닉"은 2개의 유전자가 변경되거나, 제거되거나 파괴된 트랜스제닉 포유동물을 의미한다. "삼중 트랜스제닉"은 3개의 유전자가 변경되거나, 제거되거나 파괴된 트랜스제닉 포유동물을 의미한다. "사중 트랜스제닉"은 4개의 유전자 변경되거나, 제거되거나 파괴된 트랜스제닉 포유동물을 의미한다.
원칙적으로, 트랜스제닉 동물은 파괴된 관심 유전자 서열의 1개 또는 둘 모두의 복사체를 지닐 수 있다. 관심 핵산 서열의 단 1개의 복사체 또는 대립유전자가 파괴된 경우, 녹아웃 동물은 "이형접합 트랜스제닉 동물"이라 불린다. 용어 "영(null)" 돌연변이는 관심 뉴클레오티드 서열의 2개의 복사체가 다르게 파괴되지만 일부 유전 물질이 둘 모두의 대립유전자로부터 제거되도록 파괴가 중첩된 예, 및 관심 뉴클레오티드 서열의 둘 모두의 대립유전자가 동일한 파괴를 공유한 예를 모두 포함한다. 다양한 구체예에서 3개의 관심 유전자의 파괴는 트랜스제닉 동물의 적어도 한 세포, 적어도 복수의 동물 세포, 동물 세포의 적어도 절반, 동물 세포의 적어도 대부분, 적어도 동물 세포의 압도적 다수, 동물 세포의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%에서 발생할 수 있다.
용어 "키메라", "모자이크" 또는 "키메라 포유동물"은 이의 유전체-함유 세포의 일부에 녹아웃을 지닌 트랜스제닉 포유동물을 의미한다. 키메라는 변경되지 않은 유전자 서열을 지닌 적어도 한 세포, 변경되지 않은 유전자 서열을 지닌 적어도 여러 세포 또는 변경되지 않은 서열을 지닌 복수의 세포를 갖는다.
용어 "이형접합체" 또는 "이형접합 포유동물"은 이의 모든 유전체 함유 세포의 염색체 쌍 중 하나에 파괴를 지닌 트랜스제닉 포유동물을 의미한다.
용어 "동형접합체" 또는 "동형접합 포유동물"은 이의 모든 유전체 함유 세포의 염색체 쌍 중 둘 모두의 구성원에 파괴를 지닌 트랜스제닉 포유동물을 의미한다. "동형접합 변경"은 염색체 쌍의 둘 모두의 구성원에 대한 변경을 의미한다.
본 출원의 "비-인간 포유동물"은 설치류, 양(sheep), 개, 양(ovine), 예컨대 양(sheep), 소, 예컨대 육우 및 젖소, 및 돼지(swine), 예컨대 돼지(pig) 및 비육돈을 포함한다. 본 출원이 전형적인 비-인간 동물(돼지)을 제공하나, 다른 동물이 유사하게 유전적으로 변형될 수 있다.
"돌연변이"는 동물의 자손에 전달되는 동물에서의 유전 물질의 검출가능한 변화이다. 돌연변이는 일반적으로, 예를 들어 뉴클레오티드를 첨가, 삽입, 결실, 반전 또는 치환시키는 것과 같은 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드의 변화이다.
"돼지"는 비제한적으로 야생 돼지, 식용 돼지, 미니 돼지, 멧돼지, 가축화 멧돼지, 뿐만 아니라 사육 돼지를 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 돼지이다. 비제한적으로 돼지는 랜드레이스, 요크셔, 햄프셔, 듀록, 차이니스 메이산, 체스터 화이트, 버크셔 괴팅겐, 랜드레이스/요크/체스터 화이트, 유카탄, 바마 시앙 쥬(Bama Xiang Zhu), 우즈산, 시 슈앙 반나 및 피에트레인 돼지를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 돼지 기관, 조직, 세포 또는 수혈 생성물은 돼지로부터의 기관, 조직, 실활된 동물 조직, 세포 또는 수혈 생성물이다.
알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(αGal, GGTA, GGT1, GT, αGT, GGTA1, GGTA-1) 유전자는 효소(GT, αGal, α1,3 갈락토실트랜스퍼라제)를 인코딩한다. 앙상블 전사체 ENSSSCG00000005518은 돼지 GGTA1 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 기능성 α1,3 갈락토실트랜스퍼라제는 당단백질 상에서 갈락토스-α1,3-갈락토스(αGal,Gal,Gal, gal1,3gal, gal1-3gal) 잔기의 형성을 촉매화한다. 갈락토스-α1,3-갈락토스(αGal) 잔기는 인간 면역계에 의해 인지되는 항원성 에피토프 또는 항원이다. 트랜스제닉 기관 물질로부터 αGal의 제거는 외래 물질의 이식에 대한 인간 면역 반응을 제거하지 못하는데, 이는 이종기관이식에 대한 신속한 면역 반응에 추가적인 항체가 관여함을 시사한다(Mohiudden et al (2014), Am J. Transplantation 14:488-489 and Mohiudden et al 2014 Xenotransplantation 21:35-45). 기능성 αGal의 발현 감소를 초래하는 αGal 유전자의 파괴는 G에서 A로의 치환에 인접한 3개의 염기쌍 결실, 단일 염기쌍 결실, 단일 염기쌍 삽입, 2개의 염기쌍 삽입, 6개의 염기쌍 결실, 10개의 염기쌍 결실, 7개의 염기쌍 결실, 5개의 염기쌍 결실에 대한 8개의 염기쌍 삽입, 5개의 염기쌍 삽입, 11개의 염기쌍 결실, 및 18개의 염기쌍 결실(표 1을 참조하라)을 포함할 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다. Crispr 표적 서열은 개시 코돈 근처에 있는 유전자의 엑손 3에 있다.
시티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제(CMP-Neu5Ac 하이드록실라제 유전자, CMAH) 유전자는 효소(CMAH)를 인코딩한다. 기능성 CMAH는 시알산 N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac)의 N-글리콜릴뉴라민산 (Neu5Gc)으로의 전환을 촉매화한다. Neu5Gc 잔기는 인간 면역계에 의해 인지되는 항원성 에피토프 또는 항원이다. 앙상블 데이터베이스 id 유전자: ENSSSCG00000001099는 돼지 CMAH 뉴클레오티드 서열을 포함하고, Crispr 표적 영역은 엑손 6 근처에 있다. 기능성 CMAH의 발현 감소를 초래하는 CMAH 유전자의 파괴는 4개의 염기쌍 삽입, 1개의 염기쌍 결실, 2개의 염기쌍 결실, 3개의 염기쌍 결실, 20개의 염기쌍 결실, 5개의 염기쌍 결실, 8개의 염기쌍 결실, 11개의 염기쌍 결실, 12개의 염기쌍 결실, 단일 염기쌍 삽입, 단일 염기쌍 결실에 대한 2개의 염기쌍 삽입, 4개의 염기쌍 삽입에 대한 3개의 염기쌍 결실, 66개의 염기쌍 결실/12개의 염기쌍 삽입, 및 5개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환(표 1을 참조하라)을 포함할 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다.
β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(B4GalNT2, β4GalNT2, B1,4GalNT2, β1,4GalNT2) 유전자는 β1,4 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제 2 글리코실트랜스퍼라제(B4GalNT2)를 인코딩한다. 기능성 B4GalNT2는 Sda-유사 글리칸을 생산한다(Dall'Olio et al (2014) Biochemica Biophysica Acta 1840:443-453 and Blanchard et al (1983) JBC 258:7691-7685). B4GalNT2는 대부분의 인간에서 발현되는 것으로 여겨진다; 종래 연구는 인간의 5%만이 기능성 B4GalNT2의 발현이 부족하다고 제안하였다. 돼지 세포에서 β4GalNT2의 파괴는 시험된 인간 샘플 중 5% 초과의 샘플에서 교차적합을 현저하게 감소시킨다; 이 결과는 예상치 못한 것이었다. Sda-유사 글리칸은 혈액 유형 또는 혈액 그룹 결정 및 위장 암 억제와 관련된 Sda 및 유사한 글리칸을 포함할 수 있다. 앙상블 데이터베이스 ENSSSCG00000030269 엔트리는 β4GalNT2 cDNA 및 아미노산 서열을 포함한다. 유전체 돼지 β4GalNT2는 약 40,000개 염기쌍에 걸쳐 여러 엑손에 걸쳐 있고 여러 유전자좌에서 발생할 수 있다. 이러한 실험에 사용된 CrispR 표적 영역은 엑손 2에서 발견되며 CTGTATCGAGGAACACGCTT이다. 기능성 β4GalNT2의 발현 감소를 초래하는 β4GalNT2 유전자의 파괴는 1개의 염기쌍 삽입, 12개의 염기쌍 결실, 5개의 염기쌍 결실, 14개의 염기쌍 결실, 12개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환, 271개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 삽입을 포함할 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다.
표 1. 감소된 기능성 유전자 생성물을 지닌 생육성 돼지에서 관심 유전자의 파괴의 예
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
어구 "파괴된 유전자"는 관심 뉴클레오티드 서열의 삽입, 개입, 또는 결실을 포함하려는 것이고 이 때 파괴된 유전자는 내인성 서열의 아미노산 서열과 상이한 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하거나, 내인성 아미노산 서열보다 더 적은 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드 인코딩하거나, 비록 관심 야생형 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드를 인코딩할지라도, 폴리펩티드를 인코딩하지 않는다.
본 명세서는 기능성 αGal, β4GalNT2 및 CMAH 유전자의 발현이 감소된 트랜스제닉 동물을 제공한다. 동물은 이종기관이식에 적합한 임의의 포유동물일 수 있다. 특수한 구체예에서, 동물은 돼지이다. "CMAH/αGAL 이중 녹아웃", "CMAH/αGAL DKO", "CMAH/αGal", "CMAH/αGal DKO", "CMAH-/-/GAL-/-", "αGal/CMAH DKO", "αGAL/CMAH 이중 녹아웃", "GGTA1/CMAH DKO", "GT1/CMAH DKO", "GGTA1-/-/CMAH-/-", "GGT1-/-/CMAH-/-", "CMAH/GGTA DKO", "GT/CMAH-KO", "GGTA1/CMAH KO", "DKO(αGal/CMAH)", "DKO(αGAL & CMAH)", "CMAH-/αGal-", "αGal-/CMAH-", "CMAH-/αGAL-" 및 이의 변이체는 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제 및 시티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제의 발현이 결여된 트랜스제닉 동물, 세포, 또는 조직을 의미한다. 삼중 녹아웃 생성물 또는 돼지는 야생형 배경 또는 CMAH/αGal 이중 녹아웃 배경에서 생성될 수 있다. "CMAH/αGAL/B4GalNT2 삼중 녹아웃", "CMAH/αGAL/β4GalNT2 삼중 녹아웃", "CMAH/αGAL/B4GalNT2 TKO", "CMAH/αGal/β4GalNT2", "CMAH/αGal/B4GalNT2 TKO", "CMAH-/-/GAL-/-/B4GalNT2-/-", "αGal/CMAH/β4GalNT2 TKO", "αGAL/CMAH/β4Gal 삼중 녹아웃", "GGTA1/CMAH/B4GalNT2 TKO", "GT1/CMAH/β4GalNT2 TKO", "GGTA1-/-/CMAH-/-/β4GalNT2-/-", "GGT1-/-/CMAH-/-/β4GalNT2-/-", "CMAH/GGTA/β4GalNT2 TKO", "GT/CMAH/β4GalNT2-KO", "GGTA1/CMAH/β4GalNT2 KO", "TKO(αGal/CMAH/β4GalNT2)", "TKO (αGAL, CMAH, β4GalNT2)", "CMAH-/αGal-/β4GalNT2-", "αGal-/CMAH-/β4GalNT2-", "CMAH-/αGAL-β4GalNT2-" 및 이의 변이체는 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제, 시티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 및 β4GalNT2의 발현이 결여된 트랜스제닉 동물, 세포, 또는 조직을 의미한다.
트랜스제닉 이식 재료. 이식 재료는 이종이식에 사용하기 위한 동물로부터의 기관, 조직, 수혈 생성물 및/또는 세포를 포함한다. 이종이식에 사용하기 위한 이식 재료는 αGal, β4GalNT2 및 CMAH의 발현이 감소된 트랜스제닉 동물로부터 분리될 수 있다. 트랜스제닉 또는 녹아웃 돼지로부터의 트랜스제닉 이식 재료는 출생전, 신생, 미성숙 또는 완전히 성숙한 트랜스제닉 동물로부터 분리될 수 있다. 이식 재료는 기관 이식을 필요로 하는 인간 대상체를 위한 일시적 또는 영구적 기관 대체물로서 이용될 수 있다. 뇌, 심장, 폐, 눈, 위, 췌장, 신장, 간, 창자, 자궁, 방광, 피부, 모발, 손톱, 귀, 분비선, 코, 입, 입술, 비장, 잇몸, 치아, 혀, 타액선, 편도선, 인두, 식도, 대장, 작은 창자, 소장, 직장, 항문, 갑상샘, 흉선, 뼈, 연골, 힘줄, 인대, 부신 낭, 골격근, 평활근, 혈관, 혈액, 척수, 기관, 요관, 요도, 시상하부, 뇌하수체, 유문, 부신샘, 난소, 난관, 자궁, 질, 유선, 고환, 정낭, 음경, 림프, 림프절 및 림프관을 비제한적으로 포함하는 임의의 돼지 기관이 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 출원은 이종기관이식에 유용한 비-인간 조직을 제공한다. 다양한 구체예에서, 비-인간 조직은 삼중 αGal/CMAH/β4GalNT2 트랜스제닉 돼지로부터의 돼지 조직이다. 상피, 결합 조직, 혈액, 뼈, 연골, 근육, 신경, 아데노이드, 지방, 윤문상, 갈색 지방, 해면상 근육, 연골성, 해면성, 연골양, 크롬친화, 음낭성, 탄력, 상피성, 지방성, 섬유유리질, 섬유상, 감지(Gamgee), 젤라틴모양, 과립, 창자-관련 림프양, 골격근, 할러(Haller's) 혈관, 무작용(indifferent), 사이질, 피복, 섬, 림프, 림프양, 중간엽, 중신, 다방성 지방, 흉선 조직, 점액 결합체, 골수모양, 비근점 연조직, 콩팥기원, 결절, 풋뼈, 골, 골형성, 골수, 망상, 치아끝주위, 그물, 평활근, 경 조혈 및 피하 조직, 심장 판막, 피부, 및 힘줄을 포함하는 실활된 동물 조직, 및 살아 있는 돼지 피부를 비제한적으로 포함하는 임의의 돼지 조직이 이용될 수 있다.
또 다른 구체예는 αGal, B4GalNT2 및 CMAH의 발현이 감소되거나 저하된 돼지 삼중 트랜스제닉 동물로부터의 세포 및 세포주를 제공한다. 한 구체예에서 이러한 세포 또는 세포주는 이종기관이식에 이용될 수 있다. 상피 세포, 섬유모세포 세포, 신경 세포, 각질세포, 조혈 세포, 멜라닌세포, 연골세포, 림프구(B 및 T), 대식세포, 단핵구, 단핵 세포, 심근 세포, 다른 근육 세포, 과립층 세포, 난구 세포, 상피 세포, 내피 세포, 랑게르한스 섬 세포, 췌장 인슐린 분비 세포, 골 세포, 골 전구체 세포, 신경 줄기 세포, 원시 줄기 세포, 간세포, 대동맥 내피 세포, 미세혈관 내피 세포, 섬유모세포, 간 별 세포, 대동맥 평활근 세포, 심장 근육세포, 신경세포, Kupferr 세포, 평활근 세포, Schwann 세포, 적혈구, 혈소판, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기, 지방세포, 연골세포, 췌장 섬 세포, 갑상샘 세포, 흉선 세포, 부갑상샘 세포, 귀밑샘 세포, 신경아교 세포, 별아교세포, 적혈구, 백혈구, 대식세포, 체세포, 뇌하수체 세포, 아드레날 세포, 모세포, 방광 세포, 신장 세포, 망막 세포, 간상 세포, 원추 세포, 심장 세포, 박동조율 세포, 비장 세포, 항원 제시 세포, 기억 세포, T 세포, B 세포, 형질 세포, 근육 세포, 난소 세포, 자궁 세포, 전립선 세포, 질 상피 세포, 정자 세포, 고환 세포, 배 세포, 난 세포, 레이디히 세포, 관주위 세포, 세르톨리 세포, 루테인 세포, 자궁경부 세포, 자궁내막 세포, 유선 세포, 난포 세포, 점액 세포, 섬모 세포, 비각질 상피 세포, 각질화 상피 세포, 폐 세포, 술잔 세포, 원주 상피 세포, 도파민성 세포, 편평 상피 세포, 골세포, 골모세포, 파골세포, 골수, 배아 줄기 세포, 섬유모세포 및 태아 섬유모세포를 비제한적으로 포함하는 임의의 돼지 조직 또는 기관으로부터의 세포가 이용될 수 있다.
비생육성 유도체는 효소적 또는 화학적 처리에 의해 생육성 세포를 제거한 조직을 포함하고 이러한 조직 유도체는 이식에 사용하기 전에 가교 또는 다른 화학적 처리를 통해 추가로 처리될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 유도체는 피부, 골, 소변, 방광 또는 기관 점막밑 조직을 포함하는 다양한 조직으로부터 유래된 세포외 기질을 포함한다. 또한, 심장 판막을 비제한적으로 포함하는 생육성 조직 및 다른 비생육성 조직을 제거한 힘줄, 관절, 및 뼈는 의료 장비로서 제공된다. 한 구체예에서, 세포 배양에 적합하고 본 발명의 트랜스제닉 돼지로부터 분리된 혈청 또는 배지가 제공된다. 돼지 트랜스제닉 기관, 조직 또는 세포의 구성요소도 제공된다. 구성요소는 가교 및 알데하이드 가교를 비제한적으로 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 수단을 통해 또한 변형될 수 있다. 구성요소는 구성요소가 수득되는 더 큰 기관 또는 조직에 따라 다양할 수 있다. 피부 구성요소는 제거된 피부, 콜라겐, 상피 세포, 섬유모세포 및 진피를 비제한적으로 포함할 수 있다. 골 구성요소는 콜라겐 및 세포외 기질을 비제한적으로 포함할 수 있다. 심장 구성요소는 판막 및 판막 조직을 비제한적으로 포함할 수 있다.
"이종기관이식"은 상이한 종으로부터 수용 대상체로의 세포, 조직 또는 기관의 이식, 삽입 또는 주입을 포함하는 임의의 절차를 포함한다. 수용체가 인간인 이종기관이식이 특히 구상된다. 따라서, 이종기관이식은 비제한적으로 혈관화된 이종기관이식, 부분적으로 혈관화된 이종기관이식, 비혈관화된 이종기관이식, 이종드레싱, 이종붕대, 이종구조 및 이종수혈을 포함한다.
구체예에서, 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, β4GalNT2 및 CMAH 유전자를 포함하는 트랜스제닉 돼지로부터 분리된 세포 배양 시약이 제공된다. 세포 배양 시약은 조직 배양액, 시험관내 조직 배양액, 미세유체 조직 배양액, 세포 배양액 또는 분리된 세포 또는 세포주를 성장시키는 다른 수단에 이용되는 시약이다. 세포 배양 시약은 세포 배양 배지, 세포 배양 혈청, 세포 배양 첨가제, 공급자 세포, 및 증식할 수 있는 분리된 세포를 포함할 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다. "증식할 수 있는 분리된 세포"라 함은 다른 세포 유형 또는 다른 세포로부터 분리되거나 부분적으로 분리된 세포를 의미하며, 이 때 세포는 적어도 하나의 추가적인 클론 세포로 증식, 분열 또는 번식할 수 있다.
배양액에서 성장한 세포는 항원성 에피토프를 합성할 수 있거나 항원성 에피토프를 배양된 세포에 의해 생산된 관심 화합물로 대사적으로 혼입시킬 수 있다. 항원성 에피토프는 인간 항체에 의한 증가된 결합 및 관심 화합물의 감소된 효능을 발생시킬 수 있다. 전문이 본원에 참조로서 포함된 문헌[Ghaderi et al 2010 Nature Biotechnology 28(8):863-867]을 참조하라. 감소된 수준의 αGal, B4GalNT2 또는 Neu5Gc와 같이 변경된 에피토프 프로파일을 갖는 생산 세포를 세포 배양 시약에서 성장시키는 것은 관심 화합물에 대한 αGal 항원, Neu5Gc 항원, 및/또는 Sda-유사 항원의 수준을 감소시킬 수 있다. 관심 화합물은 비제한적으로 당단백질 및 당지질을 포함할 수 있다. 관심 당단백질은 비제한적으로 항체, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 또는 응고 인자를 포함할 수 있다. 관심 당지질은 비제한적으로 치료제, 항원, 및 바이오계면활성제를 포함할 수 있다.
"제공하는"이라는 단어는 제조, 조달, 준비 중, 준비, 공급 또는 제공을 포함한다. 세포를 제공하는 방법은 대상체를 제공하는 방법과 다를 수 있고, 기관을 제공하는 방법은 돼지를 제공하는 방법과 다를 수 있으며, 신장을 제공하는 방법은 간을 제공하는 방법과 다를 수 있고, 기관을 제공하는 방법은 수혈에 적합한 물질을 제공하는 방법과 다를 수 있음이 인지된다.
이식된 조직, 기관, 세포 또는 물질이 수용체의 신체에 허용되지 않을 때 이식 거부가 발생한다. 이식 거부에서, 수용체의 면역계는 이식된 물질을 공격한다. 여러 유형의 이식 거부가 존재하며, 별도로 또는 함께 발생할 수 있다. 거부 과정은 초급성 거부(AHXR), 급성 체액 이종이식 거부 반응(AHXR), 저혈판소판증, 급성 체액 거부, 초급성 혈관 거부, 항체 매개된 거부 및 이식편대 숙주 질환을 포함하였으나 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명자들은 "초급성 거부"에 의해 하나 이상의 거부 메커니즘을 수반하는 이식 후 첫 24시간 내에 발생하거나 시작되는 이식된 물질 또는 조직의 거부를 의미한다. 거부는 "초급성 거부", "체액 거부", "급성 체액 거부", "세포 거부" 및 "항체 매개된 거부"를 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다. 급성 체액 이종이식 반응(AHXR)은 이식한 지 수 일 내에 발생하는 급성 항체 매개된 거부, 혈전 미세혈관병증(TMA)의 발생, 미세혈관 혈관병증, 기형성된 비-Gal IgM 및 IgG 결합, 보체 활성화, 미세혈관 혈전증 및 이식 후 처음 몇 주 안에 발생하는 소모성 저혈소판증을 비제한적으로 포함하는 병리학의 스펙트럼을 특징으로 한다. 저혈소판증은 140,000 내지 440,000/μl의 정상 범위 미만의 혈소판의 양이다. 저혈소판증 관련 증상은 내출혈, 두개내 출혈, 혈뇨, 토혈, 잇몸 출혈, 복부 팽만, 혈변, 지속 월경, 코피, 반상출혈, 점상출혈 또는 자반병을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 돼지 간에 의한 인간 혈소판의 흡수는 이종이식 수용체에서의 저혈소판증의 발생에 기여한다. 저혈소판증은 이종기관이식된 기관의 재관류시 또는 재관류 기간 직후에 발생할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 돼지 기관, 조직 또는 세포에 대한 αGal, β4GalNT2 및 Neu5Gc의 발현이 감소한 돼지 기관, 조직 또는 세포를 인간에 이식하는 것을 포함하는, 환자에서 거부 관련 증상을 개선시키는 방법을 제공하고, 이 때 하나 이상의 거부 관련 증상은 야생형 돼지로부터의 조직이 인간에 이식될 때보다 개선된다. "개선", "호전", "완화", "향상", 및 "도움"은 바람직한 쪽으로 발전하거나 진전되는 것을 의미한다. 또한, 거부 관련 증상을 개선시키는 것은 요망되지 않는 증상의 감소, 약화, 또는 저하를 포함할 수 있다고 예상된다. 거부 관련 증상은 또 다른 거부 관련 증상이 변경되는 동안 개선될 수 있음이 추가로 인지된다. 변경된 두 번째 거부 관련 증상은 개선되거나 증가할 수 있다. 두 번째 변경된 거부 관련 증상은 덜 바람직한 방식으로 변경될 수 있다. 거부 관련 증상은 초급성 거부 관련 증상 및 급성 체액 이종이식 반응 관련 증상을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 거부 관련 증상은 비제한적으로 혈전 미세혈관병증(TMA), 미세혈관 혈관병증, 기형성된 비-Gal IgM 및 IgG 결합, 보체 활성화, 응집, 섬유증, 미세혈관 혈전증, 소모성 저혈소판증, 소모성 응고병증, 최중증 저혈소판증, 난치성 응고병증, 이식편 사이질 출혈, 반점형성, 청색증, 부종, 혈전증, 괴사, 섬유소 혈전 형성, 전신성 파종 혈관내 응고, 토리 모세혈관에 IgM 침착, 토리 모세혈관에 IgG 침착, 상승된 크레아티닌 수준, 상승된 BUN 수준, T 세포 침윤, 침윤성 호산구, 침윤성 형질 세포, 침윤성 호중구, 동맥염, 내피에 항체 결합, ICOS, CTLA-4, BTLA, PD-1, LAG-3, 또는 TIM-3의 변경된 발현, 및 전신 염증을 포함할 수 있다.
"초급성 거부 관련 증상"은 초급성 거부와 관련되거나 이에 의해 야기된 것으로 당 분야에 알려진 임의의 증상을 포함하고자 한다. 초급성 거부 관련 증상은 이식된 기관, 조직 또는 세포의 유형에 따라 달라질 수 있음이 인지된다. 초급성 거부 관련 증상은 비제한적으로 혈전 폐색, 이식편 혈관계의 출혈, 호중구 유입, 허혈, 반점형성, 청색증, 부종, 기관 기능상실, 감소된 기관 기능, 괴사, 토리 모세혈관 혈전증, 기능 부족, 용혈, 발열, 응고, 감소된 담즙 생산, 무력증, 저혈압, 감뇨증, 응고병증, 상승된 혈청 아미노트랜스퍼라제 수준, 상승된 알칼리 포스파타제 수준, 고빌리루빈혈증, 기면, 산증 및 저혈소판증을 포함할 수 있다.
저혈소판증은 140,000 내지 440,000/μl의 정상 범위 미만의 혈소판의 양이다. 저혈소판증 관련 증상은 내출혈, 두개내 출혈, 혈뇨, 토혈, 잇몸 출혈, 복부 팽만, 혈변, 지속 월경, 코피, 반상출혈, 점상출혈 또는 자반병을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 돼지 간에 의한 인간 혈소판의 흡수는 이종이식 수용체에서의 저혈소판증의 발생에 기여한다.
전구(thrombocyte)로도 공지된 혈소판은 혈액 응고, 지혈 및 혈액 혈전 형성에 관여하는 거핵세포의 제핵 단편이다. 인간 혈소판은 혈소판 분반술, 혈소판성분채집술 및 초원심분리를 비제한적으로 포함하는 다양한 방법을 통해 일상적으로 분리된다.
어구 "혈소판 흡수"는 간 또는 간 세포로의 혈소판의 혼입을 포함하고자 한다. 메커니즘에 의해 제한되지는 않지만, 그러한 흡수는 포식 과정을 통해 발생할 수 있다. 혈소판 흡수는 당 분야에 공지된 임의의 혈소판 흡수 모니터링 검정에 의해 모니터될 수 있다. 혈소판 흡수 모니터링 검정은 면역학적 방법, 웨스턴 블롯, 면역블롯팅, 현미경검사, 공초점 현미경검사, 투과 전자 현미경검사 및 포식소체 분리를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 적절한 혈소판 흡수 모니터링 검정은 이용된 표지의 유형에 의존적일 수 있음이 인지된다. 혈소판 흡수는 흡수된 총 혈소판의 백분율, 흡수되지 않은 총 혈소판의 백분율, 흡수된 대 흡수되지 않은 혈소판의 비, 적어도 하나의 혈소판을 흡수한 세포의 백분율, 혈소판을 흡수하지 않은 세포의 백분율, 또는 세포 당 흡수된 혈소판의 수로서 측정될 수 있다. 하나를 초과하는 세포 유형에 의한 혈소판 흡수는 간의 총 혈소판 흡수에 기여할 수 있는 것으로 인지된다. 동물 간에 의한 총 혈소판 흡수는 간 굴모양 내피 세포에 의한 혈소판 흡수, Kuppffer 세포에 의한 혈소판 흡수, LSEC 및 Kupffer 세포에 의한 혈소판 흡수 및 추가적인 세포 유형에 의한 혈소판 흡수를 포함할 수 있다. 상이한 세포 유형에 의한 혈소판 흡수는 간에 의한 총 혈소판 흡수의 유사하거나 다른 분획에 기여할 수 있음이 인지된다. 따라서, 간에 의한 혈소판 흡수의 변경, 억제, 감소, 하락, 또는 저하는 하나 이상의 간 세포 유형에 의한 혈소판 흡수의 변경, 억제, 감소, 하락, 또는 저하를 포함한다.
메커니즘에 의해 제한되지는 않지만, 혈소판 흡수는 LSEC 및 Kupffer 세포에 의한 포식작용을 통해 발생할 수 있다. 포식작용은 분해 효소를 함유하는 리소좀의 융합에 의해 포식소체가 된 엔도솜의 형성을 특징으로 한다.
당 분야에 공지된 거부 관련 증상을 평가, 가늠, 분석, 측정, 정량, 또는 결정하는 임의의 방법은 청구된 조성물 및 방법에 이용될 수 있다. 거부 관련 증상을 분석하는 방법은 혈소판 계수에 의한 CBC, 응고 연구, 간 기능 시험, 흐름세포측정법, 면역조직화학, 표준 진단 기준, 면역학적 방법, 웨스턴 블롯, 면역블롯팅, 현미경검사, 공초점 현미경검사, 투과 전자 현미경검사, IgG 결합 검정, IgM 결합 검정, 발현 검정, 크레아티닌 검정 및 포식소체 분리를 포함한 실험실 평가를 포함할 수 있지만 이로 한정되는 것은 아니다.
유전자 생성물의 발현은 유전자 생성물의 총 발현이 감소할 때, 변경된 크기의 유전자 생성물이 생산될 때 또는 유전자 생성물이 변경된 기능성을 나타낼 때 감소한다. 따라서, 유전자가 야생형 양의 생성물을 발현하지만 생성물이 변경된 효소적 활성, 변경된 크기, 변경된 세포 편재 패턴, 변경된 수용체-리간드 결합 또는 다른 변경된 활성을 지닐 때, 그 유전자 생성물의 발현은 감소한 것으로 간주된다. 발현은 비제한적으로 RT-PCR, 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 마이크로어레이 분석, 면역침전, 방사선 검정, 폴리펩티드 정제, 분광광도 분석, 아크릴아미드 겔의 Coomassie 염색, ELISA, 2-D 겔 전기영동, 동일반응계내 하이브리드화, 화학발광, 은 염색, 효소적 검정, ponceau S 염색, 멀티플렉스 RT-PCR, 면역조직화학 검정, 방사면역검정, 비색 검정, 면역방사 검정, 양전자 방출 단층촬영술, 형광 검정, 투과된 세포의 형광 활성화 세포 분류기, 방사면역흡수 검정, 실시간 PCR, 하이브리드화 검정, 샌드위치 면역검정, 흐름세포측정법, SAGE, 차별적 증폭 또는 전자 분석을 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 분석될 수 있다. 발현은 직접적으로 또는 간접적으로 분석될 수 있다. 간접적 발현 분석은 효소의 발현을 평가하기 위해 효소에 의해 촉매화된 생성물을 수준을 분석하는 것을 포함할 수 있지만 이로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al, eds (2013) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York, N.Y. and Coligan et al (2013) Current Protocols in Protein Science, Wiley-Interscience New York, NY]을 참조하라. 돼지 ASGR1에 대한 유전자 발현 검정은 시판된다(Applied Biosystems™, Carlsbad CA).
"에 비해"는 유사하지만 상이한 것에 대해 무언가를 비교하는 것을 의미하고, 예컨대 트랜스제닉 돼지를 이용한 실험으로부터 수득된 데이터 포인트를 야생형 돼지를 이용한 유사한 실험으로부터 수득된 데이터 포인트와 비교하는 것이다. 단어 "포함하는"은 비교되는 것 사이의 유사점 또는 차이점을 발견하기 위해 특성, 품질, 값, 양, 또는 비율을 조사하는 것을 포함하고자 한다. 비교는 비교되어지는 현저한 차이를 드러낼 수 있다. "현저한 차이"는 트랜스제닉 돼지로부터의 물질 및 야생형 돼지로부터의 물질에 대한 결과와 같은 여러 그룹에 대해 수득된 결과에서의 통계적으로 현저한 차이를 의미한다. 일반적으로 통계적 유의성은 비제한적으로 스튜던트(student's) t-테스트, 카이-제곱(Chi-square), 원-테일드(one-tailed) t-테스트, 투-테일드(two-tailed) t-테스트, ANOVA, Dunett's post hoc 테스트, 피셔(Fisher's) 테스트 및 z-테스트와 같은 통계적 유의성 테스트에 의해 평가된다. 두 결과 간의 현저한 차이는 p<0.1, p<0.05, p<0.04, p<0.03, p<0.02, p<0.01 또는 그 초과의 결과일 수 있다.
단어 "분리된"은 또 다른 실체 또는 그룹으로부터 물리적으로 분리된 실체를 포함하고자 한다. 분리된 세포는 또 다른 그룹의 세포로부터 물리적으로 분리된다. 세포의 그룹의 예는 발생 세포괴, 세포 배양액, 세포주, 조직, 및 동물을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 단어 "분리하는"은 또 다른 실체 또는 그룹으로부터 실체를 물리적으로 분리시키는 것을 포함하고자 한다. 예는 한 세포를 다른 세포로부터 물리적으로 분리시키는 것, 세포 구성요소를 세포의 나머지로부터 물리적으로 분리시키는 것 및 동물로부터 조직 또는 기관을 물리적으로 분리시키는 것을 포함한다. 분리된 세포 또는 세포 구성요소는 다른 자연 발생 세포 또는 세포 구성요소로부터 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 최대 100%만큼 분리된다. 하나 이상의 세포를 또 다른 세포 그룹으로부터 분리시키는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Freshney (ED) Culture of Animal cells: a manual of basic techniques (3rd Ed.) 1994, Wiley-Liss; Spector et al (Eds)(1998) Cells: a Laboratory Manual (vol.1) Cold Spring Harbor Laboratory Press and Darling et al (1994) Animal cells: culture and media John Wiley & Sons]을 참조하라. 동물로부터 조직 또는 기관을 분리시키는 방법은 당 분야에 공지되어 있고 분리될 조직 또는 기관 및 조직 또는 기관을 이식하는 요망되는 방법에 따라 다르다. 동물 또는 샘플로부터 수혈 생성물을 분리시키는 방법은 당 분야에 공지되어 있고 요망되는 수혈 생성물에 따라 다르다. 그러한 방법은 원심분리, 투석, 용리, 성분채집술 및 한랭침전을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
"피부 관련 생성물"은 피부로부터 분리된 생성물 및 피부에 사용하도록 의도된 생성물을 포함한다. 피부 또는 다른 조직으로부터 분리된 피부 관련 생성물은 피부에 사용하기 전에 변형될 수 있다. 피부 관련 생성물은 대체 드레싱, 화상 덮개, 진피 생성물, 대체 진피, 진피 섬유모세포, 콜라겐, 콘드로이틴, 결합 조직, 각질세포, 세포-비함유 이종진피, 세포-비함유 돼지 진피, 합성 피부 대용물 및 표피 및 일시적 상처 덮개를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로서 포함된 문헌[Matou-Kovd et al (1994) Ann Med Burn Club 7:143]을 참조하라.
피부 관련 생성물의 부착 기간은 피부 관련 생성물이 인간 대상체에 적용되고 피부 관련 생성물이 인간 대상체로부터 자연 분리되기까지의 시간이다. 인간 대상체의 피부 상처가 아물었을 때, 피부 관련 생성물은 자연 분리 또는 기계적 분리에 의해 제거될 수 있다. 그러나, 인간 대상체로부터 피부 관련 생성물의 자연 분리는 조기에 발생할 수 있다. 의료 종사자가 원하는 분리 전에 조기 자연 분리가 발생한다. 예로서 및 비제한적으로, 조기 자연 분리는 상처가 아물기 전에 발생할 수 있다. 조기 자연 분리는 또한 "탈리", "쉐딩", 또는 "박리"로도 명명될 수 있다. 조기 자연 분리의 임상적 관리는 피부 관련 생성물의 재적용, 드레싱 적용, 붕대 적용, 항생제 투여, 및 유체 투여를 포함할 수 있다. 피부 상처는 대상체의 피부의 성장 및 피부 이식을 비제한적으로 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 수잔에 의해 아물 수 있다. 조기 분리 감소는 의료 종사자가 원하는 분리 전에 피부 관련 생성물의 감소된, 더 낮은, 덜 빈번한, 줄어든, 더 적은 양의 자연 분리를 포함한다. 조기 분리 감소는 야생형 돼지로부터 수득된 피부 관련 생성물에 비해 더 적은 수의 완전한 조기 분리 사건, 더 적은 수의 부분적 조기 분리 사건, 및 부분적 조기 분리 사건에 있어서 더 적은 부분의 피부 관련 생성물의 수반과 관련이 있을 수 있다. 본 출원의 피부 관련 생성물은 또한 증가, 연장, 개선, 확장, 또는 확대된 부착 기간을 나타낼 수 있다. 본 출원의 피부 관련 생성물의 사용은 부착 기간의 지속기간을 증가시킬 수 있다.
피부 상처는 개방창, 화상, 열상, 궤양, 다리 궤양, 발 궤양, 흑색종 제거, 암 제거, 성형 수술, 및 교상을 비제한적으로 포함하는 외피에 대한 임의의 손상을 포함한다.
"수술적 부착"이라 함은 당 분야에 공지된 임의의 수술 방법을 통해 잇거나, 결합하거나, 통합하거나, 부착하거나, 잠그거나, 연결하거나, 합치거나, 회합시키는 것을 의미한다.
한 구체예에서 본 출원은 αGal, CMAH 및 β4GalNT2 유전자의 발현이 감소된 여러 녹아웃 돼지 동물로부터 수혈에 적합한 비-인간 물질을 제공한다. 수혈에 적합한 이러한 물질은 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 적혈구, 혈소판, 및 백혈구를 포함할 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다. 그러한 물질은 분리, 풍부화 또는 정제될 수 있다. 수혈에 적합한 물질을 분리, 풍부화 또는 정제시키는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 혈청학적으로 돼지 적혈구(RBC)는 인간 RBC와 다수의 공통 특성을 공유한다(Pond W.G, Houpt K.A, The Biology of the Pig Ithaca: Comstock Pub. Associates, 1978 and Jandl, J. H. Blood: Textbook of Hematology, Boston:Little, Brown, 1996). 다른 포유동물에서처럼, 돼지에서 적혈구생성을 위한 주요 부위는 골수이다. pRBC는 직경이 약 4-8 마이크론인 양오목 디스크이다. 돼지 혈액의 적혈구용적율은 35-47%이고, 헤모글로빈 농도는 6-17 g/100 ml이다. pRBC의 반감기는 약 40일이고, 이에 비해 인간 RBC는 60일이다.
15개의 돼지 혈액 그룹 시스템이 지금까지 확인되었다. 가장 중요하고 잘 연구된 것이 인간 ABO 시스템과 밀접하게 관련된 A-O(H)이다. pRBC 상의 A 및 O 항원은 인간 루이스 항원과 유사한 메커니즘으로 순환하는 혈장 글리코스핑고리피드로부터 수동적으로 흡착된다(Marcus, D.M. & Cass, L.E. (1969) Science 164:553-555). pRBC 표현형분석은 전적으로 신뢰할만하지 않다. 돼지의 표현형분석은 볼 상피 세포를 항-A 모노클로날 항체(mAb)(Blood Banks에서 이용됨) 및 항-H 렉틴 항체(Ulex europaeus)로 면역조직화학적 염색함에 의해 달성될 수 있다(Villarroya H et al 1990 Autoimmunity 6:47-60). 혈액 그룹 A를 지닌 당지질은 돼지 위 점막, 상피 세포 및 적혈구로부터 분리되었다. pRBC로부터 유래된 잘 특성화된 소수의 단백질 중에, 돼지 헤모글로빈은 이의 인간 대응부와 85% 서열 동일성을 공유하고 2.8A 해상도에서 유사한 3차원 구조를 나타낸다. 대부분의 조직 세포와 달리, 돼지 RBC는 핵을 함유하지 않으므로, 비제한적으로 돼지 내인성 레트로바이러스(PERV)와 같은 레트로바이러스를 지닐 가능성이 낮다. pRBC는 또한 세포내 소기관이 없고 생체내 반감기가 비교적 짧다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 실제로, 본원에 도시되고 설명된 것 이외에 다양한 변형이 전술한 설명 및 하기 실시예로부터 당업자에게 명백해질 것이며 이는 첨부된 청구범위의 범주 내에 속한다.
실시예
실시예 1. 표적화된 CMAH, GGTA1 및 β4GalNT2 영역의 DNA 시퀀싱 분석
클로닝된 돼지로부터의 유전체 DNA를 GgenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep 키트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 이용하여 추출하였다. CMAH, GGTA1 및 β4GalNT2 Crispr/Cas9 표적 영역의 PCR 증폭을 수행하였다. 프라이머를 이용하여 표적화된 CMAH, GGTA1 및 β4GalNT2 영역을 시퀀싱하였다.
Pwo Master(Roche, Indianapolis IN)를 이용하였고, Pwo SuperYield DNA 폴리머라제, dNTPack(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 이용하였다. GGTA1에 대한 PCR 조건은 다음과 같았다: 15회 사이클 동안 94℃, 2분; 94℃, 15초, 54℃, 30초, 및 72℃, 45초; 25회 사이클 동안 각 사이클마다 추가 5초와 함께 94℃, 15초, 54℃, 30초, 72℃, 45초; 및 5분 동안 72℃의 최종 신장 단계. CMAH의 경우, 15회 사이클 동안 94℃, 2분; 94℃, 15초, 56℃, 30초, 및 72℃, 45초; 25회 사이클 동안 각 사이클마다 추가 5초와 함께 94℃, 15초, 56℃, 30초, 72℃, 45초; 및 5분 동안 72℃의 최종 신장 단계. β4GALNT2의 경우, 15회 사이클 동안 94℃, 2분, 94℃ 15초, 62℃, 30초, 72℃ 40초; 25회 사이클 동안 각 사이클마다 추가 5초와 함께 94℃, 15초, 62℃, 30초, 72℃, 40초; 및 5분 동안 72℃의 최종 신장 단계. PCR 생성물은 1% 아가로스 겔 상에서 분리되었고 GgenElute Gel Extraction 키트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에 의해 정제되었다. PCR 생성물은 특수한 시퀀싱 프라이머, 즉, GGTA1의 경우 5' CCTTAGTATCCTTCCCAACCCAGAC 3' (SEQ ID NO:5); CMAH의 경우 5' CATTTTCTTCGGAGTTGAGGGC 3' (SEQ ID NO:6); β4GALNT2의 경우 5' AAAGCCACAGGAGGAGCCAG 3' (SEQ ID NO:7)으로 Sanger 방법(DNA Sequencing Core Facility, Indiana University School of Medicine)에 의해 시퀀싱되었다. 일단 돌연변이가 검출되면, PCR 생성물을 pCR4blunt-TOPO 벡터에 삽입하고 E. 콜리(E. coli)로 형질전환시켰다. 개개 클론을 다시 시퀀싱하여 개개 유전자의 각 대립유전자에서의 돌연변이를 추가로 조사하였다.
예시적인 DNA 서열 분석으로부터의 결과는 도 1, 패널 A-C에 요약되어 있다. DNA 서열 분석은 적어도 한 마리의 돼지에서 둘 모두의 대립유전자에서의 GGTA1 및 CMAH 유전자의 변동을 확인시켜 주었다. 서열 분석은 GGTA1 표적 영역에서 중첩된 5개 및 7개 염기쌍 결실을 나타내었다(패널 A). 동일한 돼지에서, 서열 분석은 한 대립유전자 상에서 12개의 염기쌍 결실 및 다른 대립유전자 상에서 3개의 염기쌍 결실에 대한 중첩된 5개 염기쌍 치환으로 구성된 CMAH 유전자의 파괴를 확인시켜 주었다(패널 B). DNA 서열 분석은 동일한 돼지에서 β4GalNT2 유전자 서열의 변동을 확인시켜 주었다. β4GalNT2 유전자 서열 데이터는 3개의 변동을 나타낸다; 3개의 돌연변이의 존재는 β4GalNT2 유전자가 적어도 2개의 유전자좌에서 발생함을 시사할 수 있다. β4GalNT2 유전자의 중첩 영역에서, 한 대립유전자는 단일 염기쌍 삽입을 나타내고, 한 대립유전자는 5개의 염기쌍 결실을 나타내며, 한 대립유전자는 12개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환을 나타낸다. 야생형 β4GalNT2 서열이 발견되었다는 증거는 없다(패널 C). 도 13은 추가적인 삼중 녹아웃 돼지 단리물의 DNA 서열 분석을 요약한다.
실시예 2. 녹아웃 돼지(삼중 트랜스제닉 돼지)의 생산
gRNA 발현 유도를 위한 올리고 어닐링 및 PX330 플라스미드로의 클로닝은 Addgene 플라스미드 42230을 이용하여 수행되었다[http://www.addgene.org/42230 and 20]. 표적화된 유전자에 대한 올리고 쌍은 GGTA1(NCB1 수탁:XM_005660398.1), 5'CACCGAGAGAAAATAATGAATGTCAA-3' 정방향)(SEQ ID NO:8), 5'AAATTGACATTCATTATTTTCTC-3' (역방향)(SEQ ID NO:9); CMAH(NCBI 수탁: NM_001113015.1) 5'-CACCGAGTAAGGTACGTGATCTGT-3' (정방향)(SEQ ID NO:10), 5'-AAACACAGATCACGTACCTTACTC-3' (역방향)(SEQ ID NO:11; β4GalNT2 (NCBI 수탁: NM_001244330.1) 5'-CACCGTGTATCGAGGAACACGCTT-3' (정방향)(SEQ ID NO:12), 5'-AAACAAGCGTGTTCCTCGATACAC-3' (역방향)(SEQ ID NO:13)이다.
간-유래된 세포를 3개 모두 gRNA/Cas9 플라스미드로 공트랜스펙션시켰다. 48 hr 후에, 처리된 세포를 IB4-렉틴 컬럼 위로 통과시켜 α-Gal 영 세포를 분리하였다. 200만개의 α-Gal 음성 세포를 0.5% BSA를 지닌 500 μl HBSS에서 2 μg/ml의 플루오레세인 표지된 돌리코스 바이플로루스(Dolichos biflorus) 응집소(DBA)-FITC(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 추가 염색하고 BD FACSARia 분류기(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 이용하여 DBA-음성 세포에 대해 유동-분류시켰다. CMAH 유전자 기능의 지표인 Neu5Gc의 존재는 체세포 핵 이식 전에 분석하지 않았다.
체세포 핵 이식 (SCNT)을 시험관내 성숙 난모세포(DeSoto Biosciences Inc., St. Seymour TN and Minitube of America (Mount Horeb WI)를 이용하여 수행하였다. 난구 세포는 0.1% 히알루로니다제에서 피펫팅함에 의해 난모세포로부터 제거되었다. 정상 형태를 갖는 난모세포 및 가시적인 극체를 선택하고 5 μg/ml 비즈벤즈이미드 및 7.5 μg/ml 사이토칼라신 B를 함유하는 조작 배지(5% 우태아 혈청(FBS)을 지닌 칼슘-비함유 NCSU-23)에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 이 인큐베이션 기간 후에, 제 1 극체 및 중기 II 플레이트를 제거함에 의해 난모세포를 제핵시켰다. 삼중 트랜스제닉 돼지의 경우, 부위-표적화, IB4 대항-선별, DBA 음성 간 유래된 세포(LDC)의 단일 세포를 각 제핵된 난모세포에 주입시켰다. 부위-표적화, IB4 대항-선별, DBA 음성 간 유래된 세포로부터 생성된 유산된 삼중 녹아웃 돼지로부터 수득된 태아 섬유모세포의 SCNT로부터 일부 삼중 트랜스제닉 돼지가 발생하였다. 전기 융합은 BTX 일렉트로포레이터(Harvard Apparatus, Holliston MA)로부터 유도되었다. 다양한 예에서 세포에 주입된 제핵된 난모세포(커플)를 280 mM 만니톨, 0.001 mM CaCl2 및 0.05 mM MgCl2에서 50 μs 동안 140 V 또는 280 mM 만니톨, 0.1 mM CaCl2, 및 0.05 mM MgCl2에서 50 μs 동안 180 V의 2개의 DC 펄스에 노출시켰다. 활성화 후에, 난모세포를 0.4% 소 혈청 알부민(BSA)을 지닌 NCSU-23 배지에 두고 1시간 미만 동안 가습 대기에서 38.5℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 활성화 후 1시간 이내에, 난모세포를 수용체 돼지에 전달하였다. 수용체 돼지를 발정 첫날에 서구 돼지와 합사시켰다. 임신은 배아 이식 후 25일 또는 26일에 초음파로 확인하였다.
이 연구에 사용된 모든 동물은 Institutional Biosafety Committee(IBC) 및 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 승인을 받았다.
실시예 3. 삼중 녹아웃의 IB4 대항선별
간-유래된 세포(LDC)를 3개 세트의 표적화 작제물(αGal, β4GalNT2 및 CMAH)로 트랜스펙션시켰다. 세포를 αGal에 결합하는 물질인 IB4로 선별하였다. IB4 대항선별에서 생존한 벌크 집단의 세포로부터 DNA를 수득하고, 표적 유전자 서열을 평가하였다. IB4 대항선별에서 생존한 벌크 집단 세포를 SCNT에 직접 이용하여 임신한 돼지를 만들었다.
실시예 4. 표적화 벡터의 설계
CrispR 작제물, Zn 손가락 작제물 및 TALEN 작제물과 같은 표적화 벡터는 적합한 부위에서 돼지 CMAH(앙상블 전사체 ENSSSCT00000001195)의 서열을 표적화하도록 설계된다. 표적화 벡터 작제물은 적합한 부위에서 GGTA1(앙상블 전사체 ENSSSCT00000006069)를 표적화하도록 설계된다. 표적화 벡터 작제물은 NCBI 유전자ID:100621328 및 앙상블: ENSSSCG00000030269의 적합한 부위에서 β4GalNT2를 표적화하도록 설계된다.
앙상블 전사체에 열거된 서열 일부의 역방향 보체인 프라이머 서열을 지닌 CMAH Crispr 작제물을 생성하고 삼중 녹아웃 돼지의 생성에 이용하였다. 적절한 앙상블 전사체의 서열 일부와 동일한 프라이머 서열을 지닌 Gal Crispr 작제물을 생성하고 삼중 트랜스제닉 돼지의 생성에 이용하였다. 상기 지시된 NCBI 서열 NCBI 유전자ID:100621328의 일부와 동일한 프라이머 서열을 지닌 β4GalNT2 Crispr 작제물을 생성하고 삼중 트랜스제닉 돼지의 생성에 이용하였다.
실시예 5. 인간 혈청과 트랜스제닉 PBMC의 교차적합
트랜스제닉(예를 들어 삼중 GGTA-1/β4GalNT2/CMAH) 및 야생형 돼지로부터의 돼지 전혈을 정맥 천자로 ACD에서 수집하였다. 전혈을 PBS와 1:1로 혼합하고 Ficoll로 분리시켰다. 돼지 말초혈 단핵구(PBMC)를 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)를 이용하여 전혈로부터 제조하였다. PBMC를 Ficoll 층으로부터 제거하고 PBS로 여러 번 세척한 다음 필요에 따라 용해 용액으로 적혈구를 제거하였다. PBMC를 4백만개 세포/ml로 EX-CELL 배지에 현탁시켰다(EX-Cell 610 HSF-Serum free Medium for Hybridoma Cells 14610C).
44명의 건강한 인간 지원자로부터 혈청을 수득하였다. 25 퍼센트의 열 불활성화된 혈청을 제조하였다. 25 μl의 열-불활성화된 혈청, 25 μl의 EX-CELL 배지 및 50 μl의 현탁된 세포를 96 웰 V-바닥 플레이트 상의 각 웰에 첨가하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 다음, EX-CELL 배지로 3회 세척하였다. 세포를 다음과 같은 이차 항체로 염색하였다: EX-CELL 배지 중 1:250 농도의 Alexa Flour 488 염소 항-인간 IgG 109-546-170, EX-CELL 배지 중 1:250 농도의 Alexa Flour 488 염소 항-인간 IgM 709-546-073, 100 μl의 이차물질을 첨가하였다. 세포를 피펫으로 현탁시켜다. 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 EX-CELL 배지로 1회 세척하고 피펫으로 EX-Cell 배지 또는 1:1 EX-CELL 배지 및 Flow Fixative 용액(1% 완충된 파라포름알데하이드)에 재현탁시켰다. 흐름세포측정 분석은 Alexa flour 488에 대한 채널 FL-1 게이팅으로 완료되었다. 한 그러한 실험으로부터 결과가 도 3, 패널 B에 도시되어 있다.
실시예 6. DBA 렉틴 흐름세포측정법 염색
삼중 트랜스제닉 돼지 및 다른 관심 돼지로부터의 전혈을 항응고제 시트레이트 덱스트로스(ACD)에 수집하였다. 전혈을 PBS와 1:1 혼합시키고 ficoll(Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare 17-1440-03)로 분리시켰다. 칼슘을 함유한 흐름 세척 및 염색 완충제를 수득하였다. 흐름 세척 완충제는 미립자를 제거하기 위해 0.45 μM의 여과된, 0.5% BSA IgG-비함유 0.1% 소듐 아지드를 지닌 HBSS pH 7.4)였다. PBMC를 흐름 세척 완충제에 2 x 106개 세포/ml로 재현탁시키고 균질하게 현탁시켰다. 세포를 얼음 위에서 15분 동안 차단시켰다. 세포를 다시 재현탁시켰다. 100 μl (2 X 105개 세포)를 5 ml 흐름 튜브에 첨가하였다. DBA-플루오레세인(2 mg/ml 원액)을 수득하였다. DBA-플루오레세인 렉틴 원액을 흐름 완충제에서 0.2 μg/ml의 최종 농도로 1:10 희석시켰다. DBA-플루오레세인 렉틴을 1 μg DBA: 1 x 106개 세포(0.2 μg/2 x 105개 세포 또는 1 μl)의 비율로 세포에 첨가하였다. DBA 렉틴 및 세포를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 4 ml의 흐름 세척 HBSS로 철저히 세척하였다. 세포를 400 x g 5분 동안 회전시키고 세척 상청액을 제거하였다. 세포를 200 μl의 흐름 세척 HBSS에 재현탁시켰다. 추가 세척이 수행되는 경우 동일한 파라미터를 활용하였다. 요망되는 경우, 마지막 세척 후 세포를 약 200 μl의 흐름 고정제/2 x 105개 세포로 고정하고 분석까지 4℃에 저장하였다. 흐름세포측정 분석을 전방 및 측광 산란기 상의 게이트에 의해 수행하였다. 세포 형광 사건을 FL-1에서 수집하고; 10,000 사건을 산란기 게이트에서 수집하였다. 각 세포주에 대해 2개 모두의 세포만 그리고 DBA-플루오레세인 데이터를 수집하였다. IB4 렉틴은 αGal 유전자 생성물에 의해 생산된 αGal 연결된 탄수화물과 상호작용한다. HD 항체는 CMAH 유전자 생성물에 의해 생산된 Neu5Gc 탄수화물과 상호작용한다. DBA 렉틴은 β4GalNT2 유전자 생성물에 의해 생산된 탄수화물 구조물과 상호작용한다. 한 그러한 실험으로부터 결과가 도 3, 패널 A에 도시되어 있다.
실시예 7. RBC에 결합하는 IgG 항체
인간 A 및 2개의 인간 O 혈청 및 RBC를 수득하였다. 돼지 야생형 및 j/CMAH/GAL 삼중 녹아웃 RBC를 수득하였다. 적혈구를 산-시트레이트-덱스트로스 튜브(Becton Dickinson & Co., Franklin Lakes NJ)에 수집된 전혈로부터 Ficoll-Paque Plus(GE Health, Uppsala Sweden)를 이용하여 분리하였다. 신선한 혈청을 항응고제의 부재 하에 전혈을 수집하고 원심분리시켜 응고된 물질을 제거함에 의해 분리시켰다. 밀도 분리 후에, RBC를 PBS로 3회 세척하고 실온에서 PBS에 1:10 희석시켰다. RBC(2 X 105개 세포/웰)에 대한 항체 결합을 결정하기 위해 최종 혈청 농도 25%인 희석된, 열-불활성화된 인간 혈청과 30분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS에서 아지드로 3회 세척하고 염소 항-인간 IgG Alexa Fluor 488 또는 당나귀 항-인간 IgM Alexa Fluor 488(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)로 염색하였다. 흐름세포측정 분석을 Accuri C6 흐름세포측정기 및 CFlow 소프트웨어(Accuri, Ann Arbor, MI USA)를 이용하여 수행하였다. RBC 게이팅은 전방 및 측광 산란기에 기반하였다. RBC에 결합하는 예시적인 IgG 항체 흐름세포측정법 트레이스가 도 5에 도시된다.
돼지 RBC 세포 표면 글리칸의 세포 표면 분석을 αGal의 경우 항체/렉틴 이소렉틴 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia simplicifolia) GS-IB4 Alexa Fluor 647(Invitrogen, Grand Island NY, USA), Neu5Gc의 경우 닭 항-Neu5Gc 항체 키트(BioLegend, San Diego CA), 및 β4GalNT2-유래된 탄수화물의 경우 플루오레세인 돌리코스 바이플로루스 응집소(DBA)(Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA USA)를 이용하여 수행하였다. 한 그러한 일련의 실험으로부터의 트레이스가 도 6에 제시된다. [Matt- 실험 세부사항을 확인하십시오.]
실시예 8. RBC 제거 및 관련 흐름세포측정법
밀도 분리 후에, RBC를 PBS로 3회 세척하고, 50% Alseve의 용액에 현탁시켰다. RBC를 21,300 x g에서 2분 동안 펠렛화하였다. 혈청을 1:1의 세포 펠렛 부피 대 혈청 부피로 펠렛화된 세포에 첨가하였다. 혈청 RBC 혼합물을 혼합하고 20분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 세포를 21,300 x g에서 2분 동안 펠렛화하고 Alsever의 용액으로 1회 세척하였다. 세포를 산 제거 완충제(pH 2.75 300 mOs/kg의 시트르산/포스페이트)와 혼합시켜 결합된 항체를 제거하고 1 M Tris-base, pH 9.0(Calbiochem, LaJolla CA)로 중화시켰다. 낮은 pH 처리 동안 용리된 물질을 SDS-PAGE 및 질량 분석법에 의해 분석하였다(하기 참조). 항체 용리 샘플에 대한 매칭 흐름세포측정 분석을 2 x 106개 RBC를 이용하여 완료하였다. 세포를 25% 열 불활성화된 혈청의 혼합물과 4℃에서 30분 동안 인큐베이션된 0.1% 소듐 아지드를 지닌 EX-CELL 610-HSF 혈청-비함유 배지(Sigma, St. Louis, MO USA)에 현탁시켰다. RBC를 3회 세척하고 염소 항-인간 IgG Alexa Fluor 488 또는 당나귀 항-인간 IgM Alexa Fluor 488(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove PA, USA) 항체로 염색하였다. 이차 항체를 4℃에서 30분 동안 RBC와 인큐베이션시키고 세척하였다. 흐름세포측정 분석을 BD Accuri C6 흐름세포측정기(Accuri, Ann Arbor, MI, USA) 상에서 완료하고 FlowJo 7.6.5(FlowJo LLC, Ashland OR, USA)를 이용하여 히스토그램을 생성하였다. 대표적인 트레이스가 도 8에 도시된다. RBC 게이팅은 전방 및 측광 산란기에 기반하였다. 대표적인 게이팅이 도 10에 도시되어 있다.
실시예 9. RBC로부터 용리된 단백질의 SDS-PAGE 겔 분석
단일 인간 혈청을 다양한 RBC(야생형 돼지(W), CMAH/GAL DKO(D), CMAH/GAL/β4GalNT2(T); 및 자가 인간 (A))와 인큐베이션시켰다. 상기 기재된 대로 제거 후에, 100 μl 용리액을 900 μl 아세톤으로 희석시킨 다음 영하 20℃에서 30분 동안 인큐베이션시킴에 의해 중화된 용리액을 침전시켰다. 침전물을 4℃에서 15분 동안 20,000 X g로 다시 회전시켰다. 상청액을 폐기하고 펠렛을 물 중 70% v/v 에탄올로 세척하였다. 침전물을 4℃에서 15분 동안 20,000 X g로 회전시켰다. 상청액을 다시 폐기하고 펠렛을 Vacufuge Plus(Eppendorf, Hauppauge, NY, USA)에서 37℃에서 30분 동안 건조시켰다. 그 후 샘플을 2-메르캅토에탄올(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 함유하는 100 마이크로리터의 2 X Laemmeli 완충제(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 공급업체의 지시에 따라 용해시켰다. 그 후 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열시킨 다음 실온으로 냉각되게 하였다. 이어서 15 마이크로리터의 각 샘플을 26-웰, 4-20% 스테인-비함유 TGX 젤(Bio-Rad)에 부하시키고 변성 및 환원 조건 하에 200 V에서 42분 동안 Bio-Rad 기준 시스템을 이용하여 전기영동시켰다. 전기영동 후에, 겔을 제거하고 100 밀리리터의 G-250 Bio-Safe Coomassie 스테인(Bio-Rad)으로 30분 동안 염색하였다. 그 후 물에서 겔을 탈염색하고 Li-Cor Classic Imager(LiCor Biosciences, Lincoln, NE USA) 상에서 700 nm 레이저를 이용하여 이미지를 만들었다. 그 다음 각각의 샘플을 질량 분석법 준비 및 분석을 위해 드라이 아이스 상에 선적하였다. 공정 도식은 도 7, 패널 A에 도시된다; RBC로부터 용리된 물질의 대표적인 겔은 도 7, 패널 B에 도시된다.
실시예 10. RBC로부터 용리된 면역글로불린의 질량 분석법 정량
질량 분석법 분석을 MSBioworks, LLC에 의해 수행하였다. 각 샘플의 50 μl 분취량을 제조업체의 지시에 따라 PNGase F(New England Biolabs)로 처리하였다. 각 샘플을 30분 동안 아세톤 침전시킨 다음 클라이언트 프로토콜에 따라 4℃에서 70% 에탄올로 세척하였다. 생성된 침전물을 건조시키고 DTT를 지닌 40 μl 1.4 X LDS 부하 완충제에 재현탁시켰다. 20 μl를 MOPS 완충제 시스템에서 4-12%bis tris SDS PAGE 겔 상에서 진행시켰다.
중쇄(50kDa)를 함유하는 영역을 절제하고 트립신 분해를 로봇(ProGest, DigiLab)을 이용하여 다음 프로토콜에 따라 수행하였다: 1) 25mM 암모늄 바이카르보네이트에 이어 아세토니트릴로 세척. 2) 60℃에서 10 mM 디티오트레이톨로 환원시킨 후 RT에서 50 mM 아이오도아세트아미드로 알킬화. 3) 37℃에서 4 h 동안 트립신(Promega)으로 분해. 4) 포름산으로 켄칭 및 추가 처리 없이 상청액 직접 분석.
겔 분해물을 ThermoFisher Q Exactive에 인터페이스된 Waters NanoAcquity HPLC 시스템에 의해 나노 LC/MS/MS로 분석하였다. 펩티드를 트랩핑 컬럼에 부하시키고 75 μm 분석 컬럼 상에서 350 nL/분으로 용리시켰다; 둘 모두의 컬럼을 Jupiter Proteo 수지(Phenomenex)로 패킹하였다. 질량 분광기는 데이터-의존 방식으로 작동되며, MS 및 MS/MS는 각각 70,000 FWHM 분해능 및 17,500 FWHM 분해능으로 Orbitrap에서 수행되었다. 15개의 가장 풍부한 이온이 MS/MS에 대해 선택되었다. 곡선하면적(AUC)을 확인하고 각 아이소형 특이적-펩티드에 대해 계산하였다. AUC를 비교하는 것은 샘플 중 각 항체 수준의 정량적 평가를 가능하게 한다. 대표적인 트레이스는 도 9에 도시되어 있다. 질량 분광학에 의해 각 항체를 확인하고 정량하기 위해 사용된 펩티드의 서열은 표 2에 제시된다.
Figure pct00006
· IgM 펩티드의 소문자 n은 아마도 PNGase F 처리의 결과로서 발생하는 탈아미드화된 아스파라긴 잔기를 나타낸다.
실시예 11. 데이터 처리
데이터는 다음 파라미터를 갖는 Mascot의 로컬 복사본을 이용하여 검색되었다: 효소: 트립신, 데이터베이스: Swissprot 인간(공통 오염물이 추가된 전방 및 역방향), 고정된 변형: 카르비도메틸(C), 가변적인 변형: 산화(M), 아세틸(단백질 N-term), 탈아미드화(NQ), Pyro-Glu(N-term Q). 질량 값: 단동위 펩티드 질량 허용오차(Monoisotopic Peptide Mass Tolerance): 10 ppm 단편 질량 허용오차: 0.02 Da 최대 손실된 절단: 2 Mascot DAT 파일은 검증을 위해 Scaffold 소프트웨어로 분석되고, 필터링되어 샘플 당 비중복(nonredundant) 목록을 생성한다. 데이터를 1% 단백질 및 펩티드 수준 오발견율(FDR)로 필터링하였고 이는 단백질 당 적어도 2개의 독특한 펩티드를 필요로 하였다. 미가공 LC/MS 데이터를 표적 펩티드의 정확한 m/z 값에 대해 검사하고 선택된 이온 크로마토그램을 QualBrowser(Thermo)에서 추출하였다; 각 경우의 피크 면적을 계산하였다.
실시예 12. RBC에 결합하는 항체를 정량하기 위한 질량 분석법 및 흐름세포측정 기술의 비교
형광 이차 항체의 이용, 인위적인 마스킹의 가능성 및 상이한 IgG 아이소형에 대한 보고가 쉽지 않음은 흐름세포측정법 결과에 영향을 줄 수 있다. 정량적인 질량 분석법은 이차 시약 없이 직접적인 펩티드 분석을 허용할 수 있고 개개의 아이소형 수준에 대한 정보를 제공할 수 있다. 질량 분석법 및 흐름세포측정법은 방법 내에서 상이한 고유 편향을 반영할 수 있는 항체 결합의 측정을 제공한다. 개개의 아이소형 수준은 다양한 면역 이펙터 기능에 다르게 기여할 수 있다. 혈청 및 RBC를 3명의 사람으로부터 수집하였다. 각 혈청을 이의 자가 RBC(A) 및 돼지 RBC(야생형 (W) 또는 삼중 녹아웃 (T))와 인큐베이션하였다. 흐름세포측정법 및 질량 분석법을 이용하여 면역글로불린 결합을 평가하였다. 도 8, 패널 A 및 B는 한 그러한 실험으로부터의 흐름세포측정법 트레이스를 제공한다. 질량 분석법 정량은 삼중 녹아웃 돼지 세포(T)가 3개의 혈청 중 2개에서 자가 인간 RBC(A)보다 IgG에 덜 결합하고 3개 모두의 혈청에서 IgM에 덜 결합하였음을 나타내었다. 흐름세포측정법 및 정량적 질량 분석법 둘 모두는 삼중 녹아웃 돼지로부터의 RBC에 대한 낮은 수준의 인간 면역글로불린 결합을 나타내었다. 인간 혈액 그룹 O RBC의 항원성이 심지어 면역 억제의 부재에도 체액 손상을 피하기에 충분히 낮으므로 인간 혈액 그룹 O RBC에 대한 비교가 이루어졌다.
실시예 13. RBC에 결합하는 항체의 아이소형 분석
질량 분석법 AUC를 이용하여 상이한 RBC에 대한 각 아이소형의 결합을 정량하였다. GGTA1/CMAH 녹아웃 RBC(D), GGTA1/CMAH/β4GalNT2 녹아웃 RBC(T) 및 자가 인간 RBC(A)를 이용하여 평가를 수행하였다. 혈청 1의 0 값은 표적 세포에 대한 특정 아이소형의 결합이 없음을 나타낸다. 혈청 2, 3 및 4에서 자가 인간 세포에 대한 IgG4 결합이 10배 내지 16배 범위로 증가하였다. IgG2는 다수의 혈청에서 돼지(T) RBC에 비해 인간 세포(A)에 증가된 결합을 나타내는 유일한 다른 아이소형이었으나, 그 증가는 IgG4에서 보여진 것보다 작았다(3 내지 6배 범위, 혈청 2, 3, 및 4를 참조하라). 한 그러한 일련의 실험으로부터의 결과가 도 10에 도시된다.
실시예 14. 상이한 돼지의 렉틴 염색
GGTA1/CMAH DKO 돼지로부터의 돼지 신장을 클로스트리듐 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터의 0.025% 콜라게나제 타입 IV로 플러싱하였다(Sigma, St. Louis, MO, USA). 일차 RMEC를 분리하고 이를 10%의 DKO 돼지 혈청, 100 μg/ml 내피 세포-특이적 성장 인자, 페니실린, 스트렙토마이신, 및 암포테리신 B가 보충된 RPMI 배지에서 배양시켰다. 3일 배양 후, 돼지 RMEC를, c-DNA가 SV40의 크고 작은 T 항원을 발현시키는 렌티바이러스 벡터를 함유하는 렌티바이러스 상청액으로 24 h 동안 감염시켰다(Applied Biological Materials Inc, Richmond, BC, Canada). 단일-세포 클론을 분리하고 최대 10회 계대 증폭시켰다. iRMEC를 10%의 DKO 돼지 혈청, 100 μg/ml 내피 세포-특이적 성장 인자, 페니실린, 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지를 이용하여 배양시키고, 15-40회 계대 내에서 특성화에 이용하였다. αGal/CMAH/β4GalNT2/SLA 항원 파괴된 iREC를 수득하였다.
GGTA1/CMAH/B4GALNT2 KO 돼지의 대동맥 흉부 및 복부 가지로부터의 일차 대동맥 내피 세포를 클로스트리듐 히스톨리티쿰으로부터의 0.025% 콜라게나제 타입 IV에 의해 분리하였다(Sigma, St.Louis, MO, USA) 2. AEC를 GGTA1/CMAH/B4GALNT2 KO 돼지 혈청, 100 ug/ml 내피 세포-특이적 성장 인자, 페니실린, 스트렙토마이신, 및 암포테리신 B, 뿐만 아니라 WT/GGTA1 KO AEC의 경우 10% FBS 또는 GGTA1/CMAH DKO 및 GGTA1/CMAH/B4GALNT2 AEC의 경우 5% GGTA1/CMAH DKO 돼지 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지를 이용하여 배양시켰다. 이러한 세포는 5회 계대 안으로 이용되었다. CMAH 결핍 돼지 세포를 GGTA1/CMAH DKO 돼지 혈청에서 성장시켜 소 혈청으로부터 Neu5Gc의 흡수를 방지하였다.
일차 AEC 세포 (2 x 105개 세포)를 플루오레세인 표지된 돌리코스 바이플로루스 응집소 렉틴(HBSS에서 1:1000으로 희석됨)(DBA, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), 플루오레세인 표지된 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴(HBSS에서 1:1000으로 희석됨)(AIL, Vector Laboratories), 플루오레세인 표지된 비키아 빌로사(Vicia villosa) 렉틴(HBSS에서 1:1000으로 희석됨)(VVL, Vector Laboratories), 플루오레세인 표지된 아라키스 하이포게아(Arachis hypogaea) 렉틴(HBSS에서 1:1000으로 희석됨)(PNA, Vector Laboratories), 및 그리포니아 심플리시폴리아로부터 Alexa Fluor 488 표지된 이소렉틴 IB4(HBSS에서 1:1000으로 희석됨)(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)로 염색하였다. Neu5GC의 경우, 세포를 Alexa Fluor 표지된 항-Neu5GC 또는 정상 닭 IgY(BioLegend)에 의해 0.5mg/mL 원액으로부터 1:5000 최종 희석 비율로 염색하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 그 후 세포를 세척하고 C6 흐름세포측정기(BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 이어서 형광 강도는 렉틴의 경우 염색되지 않은 세포와 비교하여 또는 Neu5GC의 경우 아이소형 대조군과 비교하여 계산되었다. 대표적인 트레이스는 도 12에 도시된다.
실시예 15. PBMC의 표현형 분석
말초혈 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Paque(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)에 의해 분리하고 계수하였다. 그 후 세포를 제조업체의 지시에 따라 행크의 평형 염 용액(HBSS)에 희석된 Neu5GC 차단 완충제(Biolegend, San Diego, CA, USA)에 2 x 106개 세포/밀리리터의 밀도로 재현탁시켰다. 세포를 염색 전에 얼음 위에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 백 마이크로리터(2 x 105개 세포)를 12x75mm 폴리스티렌 흐름 염색 튜브(BD Biosciences, Bedford, MA, USA)에 첨가하였다. 세포를 1 x 106개 세포 당 1 마이크로그램의 하기 시약의 비율로 염색하였다: 플루오레세인 표지된 돌리코스 바이플로루스 응집소 렉틴(DBA, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), 플루오레세인 표지된 아르토카르푸스 인테그리폴리아 렉틴(AIL, Vector Laboratories), 플루오레세인 표지된 비키아 빌로사 렉틴(VVL, Vector Laboratories), 플루오레세인 표지된 아라키스 하이포게아 렉틴(PNA, Vector Laboratories), 및 그리포니아 심플리시폴리아로부터 Alexa Fluor 488 표지된 이소렉틴 IB4(Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Neu5GC의 경우, 세포를 Alexa Fluor 표지된 항-Neu5GC 또는 정상 닭 IgY(BioLegend)에 의해 0.5mg/mL 원액으로부터 1:5000 최종 희석 비율로 염색하였다. 세포를 얼음 위에서 인큐베이션하면서 30분 동안 염색하였다. 그 후 세포를 4 밀리리터의 Neu5GC 차단 완충제로 세척하고 400 x g에서 5분 동안 펠렛화하였다. 상청액을 폐기하고 세포를 200 마이크로리터의 차단 완충제에 재현탁시키고 즉시 분석하였다. 세포를 전방 및 측광 산란기 게이팅 방법을 이용하여 10,000 사건을 수집함에 의해 C6 흐름세포측정기(BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 이어서 형광 강도는 렉틴의 경우 염색되지 않은 세포와 비교하여 또는 Neu5GC의 경우 아이소형 대조군과 비교하여 계산되었다.
실시예 16. 임상적 교차적합 시험
삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 PBMC는 동종이식에 활용된 인간 임상적 교차적합 시험을 받았다. 혈청을 0의 반응성 항체의 패널(PRA)을 지닌 31명의 인간 대상체(상부 그래프) 및 80을 초과하는 패널 PRA 점수를 갖는 19명의 인간 대상체(하부 그래프)로부터 수득하였다. 임상의는 일상적으로 세포독성 점수가 1인 인간 기관을 이식한다. 삼중 트랜스제닉 돼지로부터의 Ficoll 처리된 PBMC는 2 X 106개 세포/ml의 세포 농도로 조정되었다. 일부 혈청 분취량을 DTT로 처리하였다. 두 세트의 교차적합 트레이를 제조하였다. 혈청 및 대조군을 교차적합 트레이에 부하시켰다. 세포 제조물을 충분히 혼합시키고 Hamilton 반복 디스펜서에서 천천히 뽑아 내었다. 1 마이크로리터의 세포를 조명된 뷰 박스 상에서 혈청을 함유하는 각 웰에 첨가하였다. 시험 세포를 마지막으로 양성 대조군 웰에 첨가하였다. 동일한 수의 트레이를 Sorvall 원심분리기의 반대 버킷에 넣었다. 원심분리기를 켜고 1000 rpm에 도달하게 한 다음, 원심분리기를 껐다. 조명된 뷰 박스 상에서 트레이를 조사하여 세포 점적이 혈청과 혼합되었음을 확인하였다. 트레이를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 모든 트레이를 Jet Pipette을 이용하여 각 웰에 대해 15 μl PBS로 4회 세척하였다. 세포를 부드러운 세척 기술을 사용하여 2-3분 동안 침전되게 하였다. PBS, 오일 및 혈청을 제거하였다.
AHG/C' Class 1 혼합물의 작업 희석액을 제조하였다. 한 세트의 트레이를 5 μl AHG/C로 처리하였다; 다른 세트의 트레이를 5 μl의 희석되지 않은 토끼 보체로 처리하였다(AHG 트레이 없음). 트레이를 임의로 60 rpm의 로테이터 상에 4분 동안 두었다. 트레이를 실온에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 5 μl Fluoroquench로 염색하고 5' 동안 정치시켰다. 트레이를 도립상 형광 현미경에 두었다; 160X의 총 배율을 이용하여 각 웰을 평가하였다.
각 웰에서 사멸 세포의 백분율이 추정된다. AO는 살아 있는 세포의 무손상 세포막을 횡단하고, DNA에 삽입되며, 490 nm에서 여기될 때 녹색 형광을 낸다(535 nm). 에티듐 브로마이드로 염색된 사멸 세포는 490 nm에서 여기될 때 적색 형광을 낸다(605 nm). 하기 기재된 시스템을 이용하여 각 웰의 점수를 매긴다:
Figure pct00007
한 그러한 일련의 실험으로부터의 결과는 도 14에 도시된다. 세포독성 점수가 1인 다수의 혈청에 주목하라.
실시예 17. 트랜스제닉 간을 통한 인간 혈소판의 생체외 관류
삼중 트랜스제닉 GGTA1/CMAH/β4GalNT2 돼지를 마취시키고 삽관하였다. 정중선 복부 절개를 하였다. 간을 제거하고 정상온도 조건 하에 관류 장치에 두었다. 습도, 온도 및 공기 흐름을 관류 장치에서 유지하였다. 관류 장치는 유량을 변화시켜 일정한 압력을 유지하였다. 문맥을 통한 원심 흐름 및 간 동맥을 통한 박동 흐름이 이용되었다. 둘 모두의 유량은 돼지의 생리적 압력으로 설정되었다. 기본 관류 용액은 생리학적 영양 및 인슐린이 포함된 산소화 링거 용액이었다.
인간 혈소판을 분리로부터 6일 이내에 건강한 지원 대상체로부터 수득하거나 상업적으로 구매하였고 20-24℃에 저장하였다. 약 1 x 1011개 인간 혈소판을 항-혈액응고제 시트레이트 덱스트로스를 함유하는 멸균 포스페이트 완충 염수(PBS)로 세척하였다. 혈소판을 제조업체의 프로토콜에 따라 CFSE로 표지할 수 있다.
돼지 간을 혈소판을 첨가하기 2시간 전에 관류시켰다. 혈소판 샘플을 관류 시스템에 첨가하기 전 및 혈소판의 첨가 후 소정의 시점에 수득하였다. 관류 전 및 관류 후 샘플의 혈소판 수준을 평가하였다. 돼지 간의 관류 전 및 관류 후 평가를 수행하였다. 야생형 돼지 간을 수득하고, 간을 유사한 조건 하에 관류시켰다.
실시예 18. 트랜스제닉 이종이식에 대한 반응의 평가
돼지 간을 삼중 녹아웃 돼지(αGal, CMAH, β4GalNT2)로부터 수득하였다. 간을 피기백(piggyback) 방법을 이용하여 최근에 사망한 인간 카데버에 수술적으로 이식하였다. 수술 후에, 생물학적 샘플을 인간 카데버로부터 수득하였다. 거부 관련 반응의 임상 표지를 모니터하였다.
실시예 19. 트랜스제닉 이종이식에 대한 반응의 평가
돼지 신장을 삼중 트랜스제닉 돼지(αGal, CMAH, β4GalNT2)로부터 수득하였다. 고도로 민감화된 인간 대상체에 기존 및 신규 기증자-특이적 항체를 관리하기 위한 화합물을 투여하였다. 돼지 신장을 대상체에 수술적으로 이식하였다. 수술 후에, 생물학적 샘플을 인간 카데버로부터 수득하였다. 이식편 거부의 임상 표지를 모니터하였다.
실시예 20. 공초점 현미경검사 분석
새끼돼지(삼중 GGTA1, CMAH, βGalNT2 녹아웃, 야생형 또는 다른 관심 새끼돼지)를 안락사시켰다. 간, 심장 및 신장 조직을 돼지로부터 수득하였다. 각 조직의 동결 섹션을 제조하였다. 마운팅된 조직을 HBSS에서 1시간 동안 Odyssey 차단 완충제(Li-Cor Biosciences, Lincoln NE)에서 차단시켰다. 슬라이드를 4% 파라포름알데하이드에 10분 동안 고정시켰다. 조직을 IB4 렉틴 Alexa Fluor 647(Invitrogen, Grand Island NY)로 염색하여 Gal 에피토프의 존재를 가시화하였다. Neu5Gc 에피토프를 가시화하기 위해, 조직을 닭 항-Neu5Gc 항체 또는 대조군 항체(Sialix, Vista CA)로 1시간 동안 염색하였다. 조직을 DBA로 염색하여 Sda-유사 에피토프 조직의 존재를 가시화하고 이를 HBSS로 3회 세척하였다. 당나귀 항-닭 Dylight 649(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove PA) 이차 항체를 조직과 약 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 조직을 0.1% HBSS Tween으로 3회 세척하였다. 핵을 염색하기 위해, DAPI 스테인(Invitrogen, Grand Island NY)을 1분 동안 모든 슬라이드에 첨가한 다음 0.1% HBSS Tween으로 2회 세척하였다. 조직을 ProLong Gold (Invitrogen, Grand Island NY)에 마운팅하였다. 공초점 현미경검사를 Olympus FV1000을 이용하여 수행하였다.
실시예 21. 항체-매개된 보체-의존적 세포독성
항체-매개된 보체 의존적 세포독성 검정은 당 분야에 공지되어 있다. Diaz 등의 방법(Diaz et al., 2004 Transplant Immunology 13(4):313-317)을 수행하였다. 인간 혈청을 건강한 지원자로부터 수득하였다. 25 퍼센트의 열 불활성화된 혈청을 제조하였다. 열-불활성화된 인간 혈청을 연속하여 희석시키고 각 농도의 100 μl를 96 웰 v-바닥 검정 플레이트에 두었다. 혈청을 관심 돼지(GGTA1/CMAH/β4GalNT2 삼중 트랜스제닉 또는 기타)로부터 수득된 PBMC의 100 μl의 분취량과 혼합시켰다. PBMC 최종 농도는 5 x 106/ml 또는 1 x 106/ml이었다. 혈청 농도는 50%, 17%, 2%, 0.6%, 0.2%, 및 0.07%로부터 다양하다. 혼합물을 30분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 30분 후, 플레이트를 4분 동안 400 x g에서 원심분리시켰다. 플레이트를 디캔팅하고 HBSS로 세척하였다. 토끼 보체(150 μl의 1:15 희석액)을 각 웰에 첨가하고, 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. PBMC를 아세톤 중 1 mg/ml 원액으로부터 HBSS(1 μg/ml)에서 매일 신선하게 제조된 플루오레세인 디아세테이트(FDA) 원액 및 포스페이트 완충 염수(PBS)에서 50 μg/ml으로 제조된 프로피듐 아이오다이드(PI)로 표지시켰다. 보체에서의 인큐베이션 후에, 샘플을 Accuri C6 흐름세포측정기를 이용한 분석을 위해 피펫에 의해 250 μl의 HBSS 및 10 μl의 FDA/PI를 함유하는 튜브로 옮겼다.
사멸된 세포(PI+/FDA-), 손상된 세포(PI+/FDA+) 및 살아 있는 세포의 백분율을 결정하였다. 이중 음성 사건(PI-/FDA-)은 계산에서 제외시켰다. 혈청에 노출되지 않은 세포에서의 세포독성 백분율은 자발적 사멸로 간주된다. 세포독성에 대한 값은 자발적 사멸에 대해 보정되었다.
실시예 22. 돼지 간 조달
돼지를 사전 약물처리하고, 삽관하고, 프로포폴로 마취시켜, 양와위 자세로 두었다. 복부를 정중선 절개하였다. 간에 대한 인대성 부착물을 제거하였다. 문맥 및 간 동맥에 캐뉼러를 삽입하고 2 리터의 냉 히스티딘-트립토판-케토글루타레이트 용액(Essential Pharmaceuticals, LLC)으로 플러싱하였다. 돼지로부터 간을 제거하고 간 관류 회로에 놓일 때까지 얼음 위에서 히스티딘-트립토판-케토글루타레이트 용액에 4℃로 보관하였다. 냉-허혈 시간은 45분에서 3시간까지 다양하다. 특정 구체예에서 돼지 간은 abbatoirs로부터 수득될 수 있다. abbatoirs로부터의 돼지 간을 실혈 2분 이내에 헤파린(2000 U/L)을 함유하는 히스티딘-트립토판-케토글루타레이트 용액으로 플러싱하였다.
실시예 23. 혈소판 흡수 분석 I
혈소판을 형광 그린 세포질 마커인 카르복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지시켰다. 정상온도 돼지 간 관류 시스템을 이용하였다. 관심 녹아웃 돼지 또는 야생형 돼지로부터의 돼지 간을 혈소판을 첨가하기 전 2시간 동안 관류시켰다. 약 3천억개의 혈소판(표지되지 않음 70%, 표지됨 30%)을 관류 시스템에 첨가하였다. 다양한 소정의 시점에 돼지로부터 생검을 취하였다. 생검을 공초점 현미경검사에 의해 조사하였다. 생검은 Wieble-Palade 소체에 특이적인 스테인으로 처리되었다. Wieble-Palade 소체는 혈소판 및 내피 세포에서 발생한다. 형광 ELISA 기반 검정을 수행하였다. 혈소판은 인간 또는 개코원숭이이다. 대안적으로 생검을 공초점 현미경검사 전에 내피 마커 및 리소좀 마커로 표지하였다.
실시예 24. 혈소판 흡수 분석 II
혈소판을 형광 그린 세포질 마커인 카르복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지시켰다. 정상온도 돼지 간 관류 시스템을 이용하였다. 관심 녹아웃 돼지 또는 야생형 돼지로부터의 돼지 간을 혈소판을 첨가하기 전 2시간 동안 관류시켰다. 생검을 투과 전자 현미경검사(TEM)에 의해 분석하였다.
실시예 25. 시험관내 혈소판 흡수
일차 간 굴 내피 세포(LSEC)를 관심 돼지 간 또는 간들의 굴맥관으로부터 분리하였다. 일차 야생형 돼지 LSEC는 배양 5일 후 포식 능력을 잃는다; 이러한 실험은 3일 및 4일의 일차 LSEC로 수행되었다. 인간 또는 개코원숭이 혈소판을 본원에 달리 기재된 대로 CFSE로 표지시켰다. 분리된 LSEC 및 표지된 혈소판을 함께 인큐베이션시켰다. 샘플을 공초점 현미경검사에 의해 분석하였다.
실시예 26. NHP에서 신장 이종이식
수용체 비-인간 영장류(NHP)를 일 용량의 항-CD4/항-CD8(50 mg/kg), 항-CD154/항-CD28 dAb, MMF 및 스테로이드로 처리하였다. 특정 연구에서 타크롤리무스를 이용하였다(표적 수준 8-12). 붉은털 원숭이(Rhesus macaques)(Macaca mulatta)를 NHP로서 이용하였다. 일부 실험에서, 원숭이는 3-5년령이고 6 kg 미만일 수 있다. 녹아웃 돼지 신장(또는 야생형 대조군 신장)을 NHP 수용체에 이식하였다. 샘플(혈액, 소변 및 신장 생검 샘플)을 분석을 위해 규정된 시점에 수집하였다. 신장 기능, 혈청 크레아티닌, 이종항체의 존재 및 양(흐름세포측정법 및 다중-파라미터 흐름세포측정법), 사이토카인 분비, 말초혈, 소변 및 이식편 생검로부터 전사체 프로파일, 이종이식 조직학 및 항-돼지 항체의 발생(흐름-기반 이종교차적합 검정)이 뒤따랐다. CMAH 결실은 NHP에서 연구에 도움이 되지 않았다. NHP 연구를 위해, 야생형 CMAH 유전자를 지닌 돼지를 이용하였다(Gal-/β4GalNT2). 초음파 유도된 바늘 생검은 이식 후 2, 5 및 10주에 수행되었다.
실시예 27. NHP의 수의과적 관리
NHP를 개별 우리에 수용하고 깨끗하고 적절한 크기의 거처를 제공하고; 1일 2회 먹이를 주고; 동물 관리 기술자가 매일 적어도 2회 그리고 임상 수의사가 매일 1회 점검하였다. 신체 검사는 동물이 혈액 수집 또는 다른 절차를 위해 마취될 때마다 수행되었다.
실시예 28. NHP 사혈 및 조직 샘플링
NHP의 사혈 및 조직 샘플링(예를 들어: 채혈, 림프절 생검 및 골수 흡입)을 공복 동물에 대한 케타민(10 mg/kg) 또는 텔라졸(4 mg/kg) 마취 하에 수행하였다. 부프레네프린(6시간마다 0.01 mg/kg)을 신장 이식을 받은 동물에 수술 후 진통제로서 투여하였고 이는 필요에 따라 수의사가 결정하였다. 동물을, 비제한적으로, 기준선으로부터 25%의 체중 손실; 4일 동안 식욕 부진; 주요 기관 기능상실 또는 치료에 반응이 없는 의학적 상태, 예컨대 호흡 곤란, 황달, 요독증, 난치성 설사, 자해 또는 지속적 구토, 및 즉각-중재에 반응하지 않는 수슬 합병증: 출혈, 혈관 이식편/순환 기능상실, 감염 및 창상 열개와 같은 "돌이킬 수 없는 치명적 질병"에 대해 모니터하였다.
실시예 29. 돼지 배아 이식 수술, 사혈 및 수확 절차
배아 이식 수술: 수술 전에, 암퇘지를 삽관 동안 TKX(텔라졸 (500 mg) + 케타민(250 mg) 및 자일라진(250 mg); 50 lbs 당 1 cc, IM)과, 정밀 증발기 및 폐가스 소기를 이용하여 ET 튜브를 통한 흡입에 의해 이소플루란으로 마취시켰다. 회복 기간 동안, 동물을 15분마다 적어도 1회 모니터하고 생체 신호(온도, 심박수, 호흡수 및 모세혈관 재충전 시간)을 평가하고 기록하였다. 숙련된 동물 관리 기술자 또는 수의사는 동물 자신이 자발적인 흉골 리컴브런스(recumbrance)를 유지할 수 있을 때까지 동물을 모니터하였다. 동물을 수의사의 승인 하에 정규 수용 구역으로 돌려보냈다. 수술 후 진통제는 매일 8-12시간마다 부프레노르핀 0.01-0.05 mg/kg IM 또는 카르프로펜 2-4 mg/kg SC을 포함한다. 배아 이식 후 약 26일에, 암퇘지가 사료에 집중하는 동안 임신했음을 확인하기 위해 초음파를 수행하였다. 약 10일 후 2차 초음파를 수행하였다. 출산은 임상적 어려움이 발생하지 않는 한 자연 분만을 통해 진행된다. 제왕절개 수술은 수의사 스태프의 권고에 따라 수행되었다. 표준 제왕절개 수술 프로토콜은 배아 이식 수술에 이용된 일반적인 마취 프로토콜과 함께 이용되었다. 실험용 새끼돼지를 씻기고 탯줄을 소독하였다. 모든 새끼돼지는 출생 후 처음 몇 시간 동안 젖을 먹었다. 새끼돼지는 이들이 적어도 7일령이 될 때까지 24/7 관찰되었다. 새끼돼지를 돌볼 수 있게 하면서 새끼돼지를 어미로부터 보호하기 위해 분만틀을 이용하였다.
케타민(10 mg/k) 또는 텔라졸(4 mg/kg) 마취 하에 공복 동물에 대한 모든 사혈을 수행하였다. 마지막 수술 절차인 기관 수확은 삽관 동안 필요에 따라 마취 프로토콜(텔라졸(500 mg) + 케타민(250 mg) + 자일라진(250 mg); 50 lbs 당 1 cc; IM) +/- 펜토탈(10-20 mg/kg) IV과, 폐가스 소기를 수행하기 위해 정밀 증발기를 이용한 ET 튜브를 통한 흡입에 의한 이소플루란을 이용하였다. 돼지를 염수로 관류시킨 다음 심장 및 다른 조직/기관을 제거하였다. 대안적으로, 돼지는 흡입 마취제로 마취되고 바르비투르산 유도체(100-150 mg/kg)로 처리되며 양측 기흉이 수행되었다.
실시예 30. T 세포 증식 반응에 대한 면역억제제의 CFSE MLR 평가
붉은털 원숭이로부터의 PBMC를 GGTA-/β4GalNT2- 이중 녹아웃 또는 대조군 돼지로부터의 돼지 PBMC와 인큐베이션시켰다. CFSE의 희석액을 사용하여 T 세포 서브세트에서 T 세포 증식을 평가하였다.
실시예 31. 신장 이종이식에서 면역억제제의 평가
수용체 원숭이는 면역학적으로 성숙하고(CMV+, LCV+, SV40+, >4 kg), MHC- 및 혈통으로 정의된다. 면역억제제 후보(항-CD154 dAb, 클론 5C8 항-CD154)를 붉은털 원숭이에 투여하였다. 수용체 원숭이를 이식 전에 T-세포 고갈(항-CD4/항-CD8, 단일 용량), MMF, 스테로이드 및 면역억제제 후보로 처리하였다. 혈청 크레아티닌을 이용하여 신장 기능을 평가하였다. 크레아티닌 및/또는 BUN에서 각각 > 5.0 mg/dl 또는 100 mg/dl 증가는 음성 결과로 간주된다. 초음파 유도된 바늘 생검을 이식 후 2, 5 및 10주에 수행하였다. 이식 전 및 매주 이식 후 말초혈 샘플을 다중-파라미터 흐름세포측정법을 이용한 면역표현형분석(T, B 및 다른 세포 서브세트)을 위해 수집하였다. 사이토카인 분비의 생체외 평가 뿐만 아니라 전사체 프로파일을 포함하는 기능성 검정은 정해진 시점에 말초혈, 소변 및 이식편 생검이다. 말초혈 샘플에서 공자극 및 공-억제 수용체(예컨대, 비제한적으로, ICOS, CTLA-4, BTLA, PD-1, LAG-3, TIM-3)의 발현을 평가할 수 있다.
본 발명은 설명을 위해 본원에 개시된 구체예에 제한되지 않으며 청구범위의 범주 내에 있는 모든 것을 포함한다. 예시적인 구체예를 참조하여 본 발명을 설명 하였지만, 본원에 개시된 예시적인 구체예를 설명하는 임의의 제한 또는 요소는 그러한 제한 또는 요소가 청구범위에 명백하게 열거되지 않는 한 특허 청구범위의 의미에 포함되지 않음이 이해되어야 한다. 유사하게, 본 발명이 청구범위에 의해 정의되고, 본 발명의 핵심적인 및/또는 예기치 않은 이점이 본원에 명백하게 논의되지 않았더라도 존재할 수 있으므로, 임의의 청구범위의 범주 내에 속하기 위해 본원에 기재된 본 발명의 확인된 이점 또는 목적의 일부 또는 전부가 반드시 충족될 필요는 없음이 이해되어야 한다.
또한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 본원에 충분히 개시된 바와 같이 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Indiana University Research & Techology Co. Tector, Joseph A <120> Triple Transgenic Pigs Suitable for Xenograft <130> IURTC2015-074 <150> 62/067,129 <151> 2014-10-22 <160> 13 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)...(41) <223> GGTA1 regions <400> 1 gtcatctttt acatcatggt ggatgatatc tccaggatgc c 41 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)...(35) <223> CMAH region <400> 2 aaactcctga actacaaggc tcggctggtg aagga 35 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)...(31) <223> B4GalNT2 region <400> 3 ctgtatcgag gaacacgctt cggaacataa a 31 <210> 4 <211> 363 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)...(363) <223> B4GalNT2 region <400> 4 gatgggtgag ttgaagagac tgaagtctgt atcgaggaac acgcttcgga acataaagag 60 tccaacgctc aggaccaaaa gcaccatcga tatcttgagg atcgacagac atctagggct 120 gttgggacac aagagagcaa acgctgttaa aatcttttct gagtatgtta aaaaagattt 180 cattgtgcga catagatggg aatagcaact tgagcaaaaa tgcaagtcaa acctgttttg 240 tacactacgt atcaaaattg atttcttccc aaagcaaaag agaaagaaaa gcaaaaataa 300 acctaagcaa actgagcaag cttttgcaca gcaaaggaaa ccataaaata acccaaaaag 360 atc 363 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo- GGTA1 sequencing primer <400> 5 ccttagtatc cttcccaacc cagac 25 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo- CMAH sequencing primer <400> 6 cattttcttc ggagttgagg gc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo- B4GalNT2 sequencing primer <400> 7 aaagccacag gaggagccag 20 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo- GGTA1 forward <400> 8 caccgagaga aaataatgaa tgtcaa 26 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo- GGTA1 reverse <400> 9 aaattgacat tcattatttt ctc 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo- CMAH forward <400> 10 caccgagtaa ggtacgtgat ctgt 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(24) <223> CMAH reverse <220> <223> Oligo <400> 11 aaacacagat cacgtacctt actc 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(24) <223> B4 Gal NT2 forward <220> <223> Oligo <400> 12 caccgtgtat cgaggaacac gctt 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(24) <223> B4GalNT2 reverse <220> <223> Oligo <400> 13 aaacaagcgt gttcctcgat acac 24

Claims (32)

  1. 돼지의 적어도 한 세포의 핵 유전체에 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 트랜스제닉 돼지로서, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소된, 트랜스제닉 돼지.
  2. 제 1항의 상기 트랜스제닉 돼지로부터 분리된 돼지 기관, 조직, 수혈 생성물 또는 세포.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 돼지 기관, 조직, 수혈 생성물 또는 세포가 피부, 심장, 간, 신장, 폐, 췌장, 갑상샘, 소장, 혈액 및 이의 성분으로 구성된 군으로부터 선택되는 돼지 기관, 조직 또는 세포.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 돼지로부터의 기관, 조직, 수혈 생성물 또는 세포가 인간에 이식될 때, 거부 관련 증상이 야생형 돼지로부터의 기관, 조직, 수혈 생성물 또는 세포가 인간에 이식될 때보다 개선되는 트랜스제닉 돼지.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 돼지로부터의 기관, 조직, 수혈 생성물 또는 세포가 인간에 이식될 때, 상기 거부 관련 증상이 세포 거부 반응 관련 증상, 체액 거부 반응 관련 증상, 초급성 거부 관련 증상, 급성 체액 이종이식 반응 거부 관련 증상 및 급성 혈관 거부 반응 관련 증상을 포함하는 군으로부터 선택되는 트랜스제닉 돼지.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 돼지로부터의 기관, 조직, 수혈 생성물 또는 세포가 인간에 이식될 때, 저혈소판증이 야생형 돼지로부터의 기관, 조직, 수혈 생성물 또는 세포가 인간에 이식될 때보다 감소하는 트랜스제닉 돼지.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 트랜스제닉 돼지로부터의 간이 인간 혈소판에 노출될 때, 상기 간이 야생형 돼지로부터의 간이 인간 혈소판에 노출될 때보가 감소된 혈소판 흡수를 나타내는 트랜스제닉 돼지.
  8. 제 1항의 트랜스제닉 돼지로부터 수득된 피부 관련 생성물로서, 상기 피부 관련 생성물이 상처로부터 조기 분리 감소를 나타내는, 피부 관련 생성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 상처가 인간 피부 상처인 피부 관련 생성물.
  10. 제 4항에 있어서, 상기 트랜스제닉 돼지로부터의 신장이 인간에 이식될 때, 거부 관련 증상이 야생형 돼지로부터의 신장이 인간에 이식될 때보가 감소하는 트랜스제닉 돼지.
  11. 인간으로의 이종기관이식을 위한 이식 재료를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 제 1항의 트랜스제닉 돼지를 상기 이식 재료의 공급원으로서 제공하는 것을 포함하고, 상기 이식 재료가 기관, 조직, 수혈 생성물 및 세포로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 이식 재료가 감소된 수준의 αGal 항원, 감소된 수준의 Neu5GC 항원 및 감소된 수준의 Sda-유사 항원을 갖는, 방법.
  12. 돼지의 적어도 한 세포의 핵 유전체에 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 트랜스제닉 돼지로서, 상기 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴가 G에서 A로의 치환에 인접한 3개의 염기쌍 결실, 단일 염기쌍 결실, 단일 염기쌍 삽입, 2개의 염기쌍 삽입, 6개의 염기쌍 결실, 10개의 염기쌍 결실, 7개의 염기쌍 결실, 5개의 염기쌍 결실에 대한 8개의 염기쌍 삽입, 5개의 염기쌍 삽입, 11개의 염기쌍 결실 및 18개의 염기쌍 결실을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고; 상기 CMAH 유전자의 파괴가 4개의 염기쌍 삽입, 1개의 염기쌍 결실, 2개의 염기쌍 결실, 3개의 염기쌍 결실, 5개의 염기쌍 결실, 8개의 염기쌍 결실, 20개의 염기쌍 결실, 11개의 염기쌍 결실, 12개의 염기쌍 결실, 단일 염기쌍 삽입, 단일 염기쌍 결실에 대한 2개의 염기쌍 삽입, 4개의 염기쌍 삽입에 대한 3개의 염기쌍 결실, 66개의 염기쌍 결실 및 12개의 염기쌍 삽입, 및 1개의 염기쌍 치환을 갖는 5개의 염기쌍 결실을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, 상기 β4GalNT2 유전자의 파괴가 12개의 염기쌍 결실, 5개의 염기쌍 결실, 14개의 염기쌍 결실, 12개의 염기쌍 결실 및 1개의 염기쌍 치환, 1개의 염기쌍 삽입을 갖는 271개의 염기쌍 결실, 및 단일 염기쌍 삽입을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소하며, 상기 트랜스제닉 돼지로부터의 조직이 인간에 이식될 때, 초급성 거부 관련 증상이 야생형 돼지로부터의 조직이 인간에 이식될 때보다 개선되는, 트랜스제닉 돼지.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴가 5개의 염기쌍 결실, 7개의 염기쌍 결실, 및 5개의 염기쌍 결실과 7개의 염기쌍 결실 둘 모두를 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 CMAH 유전자의 파괴가 12개의 염기쌍 결실 및 3개의 염기쌍 결실에 대한 4개의 염기쌍 치환을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, 상기 β4GalNT2 유전자의 파괴가 12개의 염기쌍 결실, 5개의 염기쌍 결실 및 단일 염기쌍 삽입을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소하며, 상기 트랜스제닉 돼지로부터의 조직이 인간에 이식될 때, 초급성 거부 관련 증상이 야생형 돼지로부터의 조직이 인간에 이식될 때보다 개선되는 트랜스제닉 돼지.
  14. 제 12항에 있어서, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴가 11개의 염기쌍 결실 및 18개의 염기쌍 결실을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, CMAH 유전자의 파괴가 66개의 염기쌍 결실/12개의 염기쌍 삽입 및 5개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, β4GalNT2 유전자의 파괴가 14개의 염기쌍 결실, 12개의 염기쌍 결실, 및 271개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 삽입을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소하며, 상기 트랜스제닉 돼지로부터의 조직이 인간에 이식될 때, 초급성 거부 관련 증상이 야생형 돼지로부터의 조직이 인간에 이식될 때보다 개선되는 트랜스제닉 돼지.
  15. 인간 대상체가 인간 기관 이식을 필요로 하는 대상체로서 식별될 때와 인간 기관 이식이 발생할 때 사이의 지속 기간을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법이 돼지의 적어도 한 세포의 핵 유전체에 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 트랜스제닉 돼지로부터의 기관을 제공하는 단계로서, 상기 돼지에서 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소된 단계, 및 치료적으로 효과적인 방식으로 상기 트랜스제닉 돼지로부터의 상기 기관을 상기 인간 대상체에 수술적으로 부착시키는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 트랜스제닉 돼지로부터의 상기 기관이 상기 인간 대상체의 내부에 수술적으로 부착되는 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 트랜스제닉 돼지로부터의 상기 기관이 상기 인간 대상체의 외부에 수술적으로 부착되는 방법.
  18. 제 15항에 있어서, 상기 기관이 상기 대상체에 직접 또는 간적접으로 부착되는 방법.
  19. 인간 대상체가 인간 간 이식을 필요로 하는 대상체로서 식별될 때와 상기 인간 간 이식이 발생할 때 사이의 지속 기간을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법이 돼지의 적어도 한 세포의 핵 유전체에 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 트랜스제닉 돼지로부터의 간을 제공하는 단계로서, 상기 돼지에서 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소된 단계, 및 치료적으로 효과적인 방식으로 상기 트랜스제닉 돼지로부터의 상기 간을 상기 인간 대상체에 수술적으로 부착시키는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 인간으로부터 피부 관련 생성물의 조기 분리를 감소시키는 방법으로서, 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 트랜스제닉 돼지를 제공하는 단계로서, 상기 돼지에서 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소된 단계, 및 상기 트랜스제닉 돼지로부터 피부 관련 생성물을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 감소된 수준의 αGal, Sda-유사 및 Neu5GC 항원을 갖는 돼지 이식 재료를 이식을 필요로 하는 대상체에 이식하는 것을 포함하는 인간 대상체에서 초급성 거부 관련 증상을 개선시키는 방법으로서, 초급성 거부 관련 증상이 야생형 돼지로부터의 돼지 이식 재료가 인간 대상체에 이식될 때보다 개선되는, 방법.
  22. 변경된 에피토프 프로파일을 나타내는 세포 배양 시약으로서, 상기 세포 배양 시약이 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH, 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 트랜스제닉 돼지로부터 분리되고, 상기 트랜스제닉 돼지에서 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소된, 세포 배양 시약.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 세포 배양 시약이 세포 배양 배지, 세포 배양 혈청, 세포 배양 첨가제 및 증식할 수 있는 분리된 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는 세포 배양 시약.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 세포 배양 시약이, 상기 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴가 5개의 염기쌍 결실, 7개의 염기쌍 결실, 및 5개의 염기쌍 결실 및 7개의 염기쌍 결실 둘 모두를 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 CMAH 유전자의 파괴가 12개의 염기쌍 결실 및 3개의 염기쌍 결실에 대한 5개의 염기쌍 치환을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, 상기 β4GalNT2 유전자의 파괴가 12개의 염기쌍 결실, 5개의 염기쌍 결실 및 단일 염기쌍 삽입을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되는 트랜스제닉 돼지로부터 분리되는 세포 배양 시약.
  25. 제 22항에 있어서, 상기 세포 배양 시약이, 상기 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴가 11개의 염기쌍 결실 및 18개의 염기쌍 결실을 포함하는 군으로부터 선택되고, CMAH 유전자의 파괴가 66개의 염기쌍 결실/12개의 염기쌍 삽입 및 5개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, β4GalNT2 유전자의 파괴가 14개의 염기쌍 결실, 12개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환, 및 271개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 삽입을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되는 트랜스제닉 돼지로부터 분리되는 세포 배양 시약.
  26. 변경된 에피토프 프로파일을 지닌 관심 화합물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법이 변경된 에피토프 프로파일을 나타내는 세포 배양 시약을 제공하는 단계로서, 상기 세포 배양 시약이 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH, 및 β4GalNT2유전자를 포함하는 트랜스제닉 돼지로부터 분리되고, 상기 트랜스제닉 돼지에서 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소된 단계, 및 상기 관심 화합물을 발현시킬 수 있는 분리된 세포를 상기 세포 배양 시약과 인큐베이션시키는 단계를 포함하고, 상기 관심 화합물에 대한 Neu5Gc, Sda-유사 또는 alphaGal 에피토프의 수준이 상기 관심 화합물이 야생형 돼지로부터 분리된 세포 배양 시약과 인큐베이션된 분리된 세포로부터 생산될 때의 상기 관심 화합물에 대한 상기 에피토프의 수준보다 낮은, 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 관심 화합물이 당지질 및 당단백질을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 관심 화합물이 항체, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 및 응고 인자를 포함하는 당단백질의 군으로부터 선택된 당단백질인 방법.
  29. 제 26항에 있어서, 상기 세포 배양 시약이, 상기 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴가 5개의 염기쌍 결실, 7개의 염기쌍 결실, 및 5개의 염기쌍 결실 및 7개의 염기쌍 결실 둘 모두를 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 CMAH 유전자의 파괴가 12개의 염기쌍 결실 및 3개의 염기쌍 결실에 대한 5개의 염기쌍 치환을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, 상기 β4GalNT2 유전자의 파괴가 12개의 염기쌍 결실, 5개의 염기쌍 결실 및 단일 염기쌍 삽입을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되는 트랜스제닉 돼지로부터 분리되는 방법.
  30. 제 26항에 있어서, 상기 세포 배양 시약이, 상기 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 파괴가 11개의 염기쌍 결실 및 18개의 염기쌍 결실을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, 상기 CMAH 유전자의 파괴가 66개의 염기쌍 결실/12개의 염기쌍 삽입 및 5개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, 상기 β4GalNT2 유전자의 파괴가 14개의 염기쌍 결실, 12개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 치환, 및 271개의 염기쌍 결실/1개의 염기쌍 삽입을 포함하는 파괴의 군으로부터 선택되고, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소된 트랜스제닉 돼지로부터 분리되는 방법.
  31. 인간으로의 이식을 위한 돼지 이식 재료로서, 상기 이식 재료가 감소된 수준의 αGal 항원, 감소된 수준의 Sda-유사 항원을 갖고, 상기 이식 재료가 감소된 수준의 Neu5Gc 항원을 갖는 돼지 이식 재료.
  32. 돼지의 적어도 한 세포의 핵 유전체에 파괴된 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2 유전자를 포함하는 트랜스제닉 돼지로서, α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, CMAH 및 β4GalNT2의 발현이 야생형 돼지에 비해 감소되고 VVL 결합이 감소된, 트랜스제닉 돼지.
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