JP2023109993A - 異種移植に好適なトランスジェニックブタ - Google Patents
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Abstract
【課題】本出願は、拒絶反応関連症状を改善し、早期分離を低減する方法を提供し、また、改変されたエピトーププロファイルを有する目的化合物を生産する方法を提供する。【解決手段】破壊された遺伝子を有するノックアウトブタ、並びに、それに由来するブタの臓器、組織、および細胞が提供される。ある実施形態において、少なくとも1つの細胞の核ゲノムにおいて、破壊されたα(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現が野生型のブタと比べて減少している、トランスジェニックブタが提供される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2014年10月22日に出願された米国仮出願第62/067,129号
に対して優先権を主張するものであり、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる
。
本出願は、2014年10月22日に出願された米国仮出願第62/067,129号
に対して優先権を主張するものであり、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる
。
配列表の組み込み
本明細書と共に提出されたテキスト形式の配列表は、全ての目的のために、参照により
その全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書と共に提出されたテキスト形式の配列表は、全ての目的のために、参照により
その全体が本明細書に組み込まれる。
連邦により支援された研究または開発についての記述
該当なし。
該当なし。
技術分野
本発明は、異種移植、およびトランスジェニックブタ、ヒトへの移植に好適なトランス
ジェニックブタの臓器、組織、または細胞、特に、血小板減少症、超急性拒絶反応(HA
R)、または血小板取り込みを引き起こす傾向が減少したトランスジェニックブタを開発
するための遺伝子組換えの分野に広く関するものである。
本発明は、異種移植、およびトランスジェニックブタ、ヒトへの移植に好適なトランス
ジェニックブタの臓器、組織、または細胞、特に、血小板減少症、超急性拒絶反応(HA
R)、または血小板取り込みを引き起こす傾向が減少したトランスジェニックブタを開発
するための遺伝子組換えの分野に広く関するものである。
ある動物から同種の別の動物への、例えばヒトからヒトへの移植は、腎臓、心臓、肺、
肝臓および他の臓器の疾患、並びに重度の熱傷疾患などの皮膚損傷を含む多くの重篤な症
状にとって、通例の治療の選択肢であることはよく知られている。しかしながら、臓器移
植に関して、現在の、または期待される臨床上の需要を満たすための、移植に利用可能な
好適な臓器は十分存在しないことがよく知られている。およそ10万人の患者が腎臓移植
リストに載っており、移植あるいは死に至るまでに平均で5年近く待機リストに載ってい
る状態である。腎不全患者において、透析は、患者が移植を待つことができる時間の長さ
を増大させる。18,000人を超える患者が、UNOS肝臓移植国際待機リストに載っ
ているが、今のところ7,000未満の移植が米国において毎年実施されている。肝疾患
または肝不全患者にとって利用できる、透析に匹敵するシステムは存在しない。
肝臓および他の臓器の疾患、並びに重度の熱傷疾患などの皮膚損傷を含む多くの重篤な症
状にとって、通例の治療の選択肢であることはよく知られている。しかしながら、臓器移
植に関して、現在の、または期待される臨床上の需要を満たすための、移植に利用可能な
好適な臓器は十分存在しないことがよく知られている。およそ10万人の患者が腎臓移植
リストに載っており、移植あるいは死に至るまでに平均で5年近く待機リストに載ってい
る状態である。腎不全患者において、透析は、患者が移植を待つことができる時間の長さ
を増大させる。18,000人を超える患者が、UNOS肝臓移植国際待機リストに載っ
ているが、今のところ7,000未満の移植が米国において毎年実施されている。肝疾患
または肝不全患者にとって利用できる、透析に匹敵するシステムは存在しない。
異種移植、すなわち、ある動物由来の臓器、組織、または細胞の、異なる種の別の動物
への移植、例えばブタの臓器のヒトレシピエントの移植は、移植に利用可能な臓器の不足
を減少させ、世界中で数千人を救う可能性を有している。しかしながら、標準的な、非修
飾のブタ組織を用いた、ヒトまたは他の霊長類への異種移植は、移植された組織の重度の
拒絶反応を伴う。該拒絶反応は、超急性拒絶反応、急性拒絶反応、慢性拒絶反応であって
よく、生着を制限する血小板減少症凝固障害を含んでよく、あるいは急性体液性異種移植
反応(AHXR)であってよい。移植された組織に存在するブタ抗体に対するヒト超急性
拒絶反応は、非常に強いため、該移植組織はヒトに移植された数分または数時間以内に、
ヒトの免疫系により一般的に損傷を受ける。さらに、臓器に応じて異なる拒絶反応メカニ
ズムが優勢となり得る。Demetris et al. 1998 “Antibody-mediated Rejection of Huma
n Orthotopic Liver Allografts. A study of liver transplantaion across ABO blood
group barriers”, Am J. Pathol 132:489-502; Nakamura et al 1993 “Liver allogra
ft rejection in sensitized recipients. Observations in a Clinically Relevant Sm
all Animal Model” Am J. Pathol. 142:1383-91; Furuya et al 1992. “Preformed Lym
phocytotoxic Antibodies: the Effects of Class, Titer and Specificity on Liver v
Heart Allografts” Hepatology16:1415-22; Tector et al 2001. “Rejection of Pig L
iver Xenografts in Patients with Liver Failure: Implications for Xenotransplanta
tion”, Liver Transpl pp.82-9(これらの全体は参照により本明細書に組み込まれる)
を参照されたい。例えば、血小板減少性の凝固障害の初期の進行は、ブタ肝臓の異種移植
後の非ヒト霊長類レシピエントの死における主な要因である。しかし、抗体仲介異種移植
拒絶反応(AMXR、AMR)が妨げられた場合、ブタ腎臓の非ヒト霊長類(NHP)レ
シピエントは、重大な血小板減少症を発症せず、凝固障害の臨床病態も示さない。例えば
、Ekser et al. 2012 “Genetically Engineered Pig to Baboon Liver Xenotransplanta
tion: Histopathology of Xenografts and Native Organs” PLoS ONE pp e29720; Knos
alla et al 2009, “Renal and Cardia Endothelial Heterogeneity Impact Acute Vascu
lar Rejection in Pig to Baboon Xenotransplantaion”, Am J Transplant 1006-16; Sh
imizu et al 2012. “Pathologic Characteristics of Transplanted Kidney Xenografts
”, J. Am. Soc. Nephrology 225-35(これらの全体は参照により本明細書に組み込まれ
る)を参照されたい。
への移植、例えばブタの臓器のヒトレシピエントの移植は、移植に利用可能な臓器の不足
を減少させ、世界中で数千人を救う可能性を有している。しかしながら、標準的な、非修
飾のブタ組織を用いた、ヒトまたは他の霊長類への異種移植は、移植された組織の重度の
拒絶反応を伴う。該拒絶反応は、超急性拒絶反応、急性拒絶反応、慢性拒絶反応であって
よく、生着を制限する血小板減少症凝固障害を含んでよく、あるいは急性体液性異種移植
反応(AHXR)であってよい。移植された組織に存在するブタ抗体に対するヒト超急性
拒絶反応は、非常に強いため、該移植組織はヒトに移植された数分または数時間以内に、
ヒトの免疫系により一般的に損傷を受ける。さらに、臓器に応じて異なる拒絶反応メカニ
ズムが優勢となり得る。Demetris et al. 1998 “Antibody-mediated Rejection of Huma
n Orthotopic Liver Allografts. A study of liver transplantaion across ABO blood
group barriers”, Am J. Pathol 132:489-502; Nakamura et al 1993 “Liver allogra
ft rejection in sensitized recipients. Observations in a Clinically Relevant Sm
all Animal Model” Am J. Pathol. 142:1383-91; Furuya et al 1992. “Preformed Lym
phocytotoxic Antibodies: the Effects of Class, Titer and Specificity on Liver v
Heart Allografts” Hepatology16:1415-22; Tector et al 2001. “Rejection of Pig L
iver Xenografts in Patients with Liver Failure: Implications for Xenotransplanta
tion”, Liver Transpl pp.82-9(これらの全体は参照により本明細書に組み込まれる)
を参照されたい。例えば、血小板減少性の凝固障害の初期の進行は、ブタ肝臓の異種移植
後の非ヒト霊長類レシピエントの死における主な要因である。しかし、抗体仲介異種移植
拒絶反応(AMXR、AMR)が妨げられた場合、ブタ腎臓の非ヒト霊長類(NHP)レ
シピエントは、重大な血小板減少症を発症せず、凝固障害の臨床病態も示さない。例えば
、Ekser et al. 2012 “Genetically Engineered Pig to Baboon Liver Xenotransplanta
tion: Histopathology of Xenografts and Native Organs” PLoS ONE pp e29720; Knos
alla et al 2009, “Renal and Cardia Endothelial Heterogeneity Impact Acute Vascu
lar Rejection in Pig to Baboon Xenotransplantaion”, Am J Transplant 1006-16; Sh
imizu et al 2012. “Pathologic Characteristics of Transplanted Kidney Xenografts
”, J. Am. Soc. Nephrology 225-35(これらの全体は参照により本明細書に組み込まれ
る)を参照されたい。
移植のための臓器、組織、および細胞の必要性に加えて、輸血のための安全な血液が不
足している。濃縮赤血球(RBC)を利用した1,100万回の血液の輸血が、米国で毎
年投与されている(National Blood Data Source, 1998)。米国の血液供給は、慢性的に不
十分である。2001年、米国の血液バンクが得る量は最も望ましい量よりも約250,
000ユニット少ないと見込まれていた。当局は、通常、定期的な供血者が休暇に出かけ
、大学生も主な都心を離れる夏季に、危機的な全国的不足が起こると予測する。国は頑強
で競争力のある血液集配システム(blood collection and distribution system)を有し
ているため、定期的な不足は、たいていは死に至らないが、待機手術を延期する必要があ
り得、危機的でない必要性は満たされない。通常の提供された血液は約42日間しか保管
できず、また血液を提供するのは適格ドナーのうちの5%未満であるため、吹雪またはハ
リケーンなどの厳しい気象条件はしばしば、血液の貯えが危険なほど少ない状況をもたら
す。
足している。濃縮赤血球(RBC)を利用した1,100万回の血液の輸血が、米国で毎
年投与されている(National Blood Data Source, 1998)。米国の血液供給は、慢性的に不
十分である。2001年、米国の血液バンクが得る量は最も望ましい量よりも約250,
000ユニット少ないと見込まれていた。当局は、通常、定期的な供血者が休暇に出かけ
、大学生も主な都心を離れる夏季に、危機的な全国的不足が起こると予測する。国は頑強
で競争力のある血液集配システム(blood collection and distribution system)を有し
ているため、定期的な不足は、たいていは死に至らないが、待機手術を延期する必要があ
り得、危機的でない必要性は満たされない。通常の提供された血液は約42日間しか保管
できず、また血液を提供するのは適格ドナーのうちの5%未満であるため、吹雪またはハ
リケーンなどの厳しい気象条件はしばしば、血液の貯えが危険なほど少ない状況をもたら
す。
ヒトの血液は希少資源であるのみならず、レシピエントへの潜在的な危険もまた伴う。
ウイルスのスクリーニングプロセスがあるにもかかわらず、提供されたヒトの血液は10
0%安全ではない(FDA, Annual Summary of Fatalities Reported to the FDA Following
Blood Collection and Transfusion, FY2013)。母集団におけるC型肝炎およびHIVの
発症は、費用がかかり難しい、提供された血液製剤の検査を強いる。ヒトの血液がいずれ
の感染性微生物も含まないことを確認することは困難かつ費用がかかるために、量の制限
がなく、感染性の病原体を含まないであろう赤血球および他の輸血製剤の供給源を開発す
ることが、非常に望ましいであろう。
ウイルスのスクリーニングプロセスがあるにもかかわらず、提供されたヒトの血液は10
0%安全ではない(FDA, Annual Summary of Fatalities Reported to the FDA Following
Blood Collection and Transfusion, FY2013)。母集団におけるC型肝炎およびHIVの
発症は、費用がかかり難しい、提供された血液製剤の検査を強いる。ヒトの血液がいずれ
の感染性微生物も含まないことを確認することは困難かつ費用がかかるために、量の制限
がなく、感染性の病原体を含まないであろう赤血球および他の輸血製剤の供給源を開発す
ることが、非常に望ましいであろう。
ブタ細胞は、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ(αGal)、およびシチ
ジン一リン酸N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ(CMAH)を発現し、これら
はヒト細胞では見られない。ブタ細胞はまた、β1,4N-アセチルガラクトサミントラ
ンスフェラーゼ(β4GalNT2)を発現し;多くのヒトは、β4GalNT2の一形
態を発現していると考えられている(Morton et al (1970) Vox Sang 19:472-482)。αG
al酵素は、糖タンパク質上のガラクトース-α1,3-ガラクトース(αGal)残基
の形成を触媒する。CMAHは、シアル酸N-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)を
、N-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)に変換する。ブタのβ1,4N-アセチ
ルガラクトサミントランスフェラーゼ(β4GalNT2)は、シアル酸修飾ラクトース
アミンへのN-アセチルガラクトサミンの末端付加を触媒し、CADまたはCT血液型抗
原としてもまた知られる、Sda、およびGalNAcβ1,4[Neu5Acα2,3
]Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galを含むがこれらに限定されないSda様抗
原を産生する(Blanchard et al (1983) JBC 258:7691-7695)。ブタのβ4GalNT2は
、同様にさらなるグリカンの形成を触媒し得る。Neu5Gcエピトープ、αGalエピ
トープおよびSdaエピトープに対する抗体が、組織の埋め込み(implantation)よりも
前からヒトの血液に存在し、埋め込まれた組織の強烈な即時の抗体媒介性拒絶反応に関係
する。さらなるβ4GalNT2(Sda様)エピトープに対する抗体がまた、患者の血
液中に存在し得、埋め込まれた組織の抗体媒介性拒絶反応の一因となり得る。
ジン一リン酸N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ(CMAH)を発現し、これら
はヒト細胞では見られない。ブタ細胞はまた、β1,4N-アセチルガラクトサミントラ
ンスフェラーゼ(β4GalNT2)を発現し;多くのヒトは、β4GalNT2の一形
態を発現していると考えられている(Morton et al (1970) Vox Sang 19:472-482)。αG
al酵素は、糖タンパク質上のガラクトース-α1,3-ガラクトース(αGal)残基
の形成を触媒する。CMAHは、シアル酸N-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)を
、N-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)に変換する。ブタのβ1,4N-アセチ
ルガラクトサミントランスフェラーゼ(β4GalNT2)は、シアル酸修飾ラクトース
アミンへのN-アセチルガラクトサミンの末端付加を触媒し、CADまたはCT血液型抗
原としてもまた知られる、Sda、およびGalNAcβ1,4[Neu5Acα2,3
]Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galを含むがこれらに限定されないSda様抗
原を産生する(Blanchard et al (1983) JBC 258:7691-7695)。ブタのβ4GalNT2は
、同様にさらなるグリカンの形成を触媒し得る。Neu5Gcエピトープ、αGalエピ
トープおよびSdaエピトープに対する抗体が、組織の埋め込み(implantation)よりも
前からヒトの血液に存在し、埋め込まれた組織の強烈な即時の抗体媒介性拒絶反応に関係
する。さらなるβ4GalNT2(Sda様)エピトープに対する抗体がまた、患者の血
液中に存在し得、埋め込まれた組織の抗体媒介性拒絶反応の一因となり得る。
α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼおよびCMAHをコードする遺伝子を除
去して酵素の発現を妨げること、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼおよびC
MAHをコードする遺伝子を修飾して酵素の発現を低減または制限すること、あるいは他
の方法で拒絶反応を制限することを含む多くの戦略が、拒絶反応に対処するために採用さ
れてきた。Phelps et alの米国特許第7,795,493号は、機能性のαGalの発現
を欠いているブタの生産の方法を記述している。例えば、Day et alの米国特許第7,5
47,816号は、野生型のブタと比較してα(1,3)ガラクトシルトランスフェラー
ゼの発現が減少しているノックアウトブタを記述している。Dayのブタは、α(1,3)
ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が減少し得るが、Neu5Gc抗原性エピトープ
は存在したままであり、Dayブタ由来の糖脂質はαGal抗原性エピトープを有する。残
念なことに、GTKOブタは異種移植に対するバリアーとしての抗α-Gal抗体を低減
させ得るが、ヒヒにおけるGTKOの心臓および腎臓の異種移植を用いた研究は、GTK
O臓器がなお免疫原性反応を引き起こし、移植された臓器に対する拒絶反応または損傷を
もたらすことを示している。GTKOの腎臓が移植され、2つの異なる免疫抑制治療レジ
メンで治療されたヒヒは、手術後16日以内に死亡した。Chen et alは、「Gal抗原の
遺伝学的欠失は、異種移植の生着に大きな利益を与えない」と結論づけた(Chen et al.,
(2005) Nature Med 11(12):1295-1298)。Koike et alの米国特許第7,560,538
号、およびZhu et alの米国特許第7,166,378号および8,034,330号は
、遅延型の異種移植拒絶反応および超急性拒絶反応をそれぞれ受ける可能性が低い、移植
のためのブタの臓器を作製する方法を記述している。Zhuの特許は、ブタ細胞上のCMA
H活性またはエピトープの低減について論じている。しかしながら、Basnet et alは、ヒ
ト血清の、CMAH-/-マウス細胞に対する細胞傷害性反応を調べた。Basnet et alは
、「抗Neu5GcAb媒介性免疫応答は、異種間の細胞移植において、移植片機能損失
に顕著に関係し得るが、臓器移植においては関係しない」と結論付けた(Basnet et al.,
2010 Xenotransplantation 17(6):440-448)。Diamond et alの米国特許第6,166,2
88号は、異種移植物質の拒絶反応が減少したヒトへの異種移植のための、臓器、組織、
または細胞を製造する方法を記述している。米国特許第6,166,288号は、ブタの
臓器、組織、および細胞由来の特定の異種反応性抗原を意図的に除去する酵素をコードす
るフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックブタについて記述し
ている。米国特許第6,166,288号は、3つのブタ遺伝子における改変を有するト
ランスジェニックブタは提供していない。
去して酵素の発現を妨げること、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼおよびC
MAHをコードする遺伝子を修飾して酵素の発現を低減または制限すること、あるいは他
の方法で拒絶反応を制限することを含む多くの戦略が、拒絶反応に対処するために採用さ
れてきた。Phelps et alの米国特許第7,795,493号は、機能性のαGalの発現
を欠いているブタの生産の方法を記述している。例えば、Day et alの米国特許第7,5
47,816号は、野生型のブタと比較してα(1,3)ガラクトシルトランスフェラー
ゼの発現が減少しているノックアウトブタを記述している。Dayのブタは、α(1,3)
ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が減少し得るが、Neu5Gc抗原性エピトープ
は存在したままであり、Dayブタ由来の糖脂質はαGal抗原性エピトープを有する。残
念なことに、GTKOブタは異種移植に対するバリアーとしての抗α-Gal抗体を低減
させ得るが、ヒヒにおけるGTKOの心臓および腎臓の異種移植を用いた研究は、GTK
O臓器がなお免疫原性反応を引き起こし、移植された臓器に対する拒絶反応または損傷を
もたらすことを示している。GTKOの腎臓が移植され、2つの異なる免疫抑制治療レジ
メンで治療されたヒヒは、手術後16日以内に死亡した。Chen et alは、「Gal抗原の
遺伝学的欠失は、異種移植の生着に大きな利益を与えない」と結論づけた(Chen et al.,
(2005) Nature Med 11(12):1295-1298)。Koike et alの米国特許第7,560,538
号、およびZhu et alの米国特許第7,166,378号および8,034,330号は
、遅延型の異種移植拒絶反応および超急性拒絶反応をそれぞれ受ける可能性が低い、移植
のためのブタの臓器を作製する方法を記述している。Zhuの特許は、ブタ細胞上のCMA
H活性またはエピトープの低減について論じている。しかしながら、Basnet et alは、ヒ
ト血清の、CMAH-/-マウス細胞に対する細胞傷害性反応を調べた。Basnet et alは
、「抗Neu5GcAb媒介性免疫応答は、異種間の細胞移植において、移植片機能損失
に顕著に関係し得るが、臓器移植においては関係しない」と結論付けた(Basnet et al.,
2010 Xenotransplantation 17(6):440-448)。Diamond et alの米国特許第6,166,2
88号は、異種移植物質の拒絶反応が減少したヒトへの異種移植のための、臓器、組織、
または細胞を製造する方法を記述している。米国特許第6,166,288号は、ブタの
臓器、組織、および細胞由来の特定の異種反応性抗原を意図的に除去する酵素をコードす
るフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックブタについて記述し
ている。米国特許第6,166,288号は、3つのブタ遺伝子における改変を有するト
ランスジェニックブタは提供していない。
Schwarz et alの米国特許第6,572,867号は、霊長類において抗(αGal(
1,3)Gal)抗体の血漿レベルを低減するための免疫抑制組成物を提供する。免疫抑
制療法は移植分野において知られている。免疫抑制薬レジメンは、患者の免疫応答を弱め
るために感染リスクを上昇させ、費用のかかる維持を目的とした医薬を必要とし、他の薬
物と相互作用する薬を含み得、体重増加などのさらなる副作用を引き起こし得る。
1,3)Gal)抗体の血漿レベルを低減するための免疫抑制組成物を提供する。免疫抑
制療法は移植分野において知られている。免疫抑制薬レジメンは、患者の免疫応答を弱め
るために感染リスクを上昇させ、費用のかかる維持を目的とした医薬を必要とし、他の薬
物と相互作用する薬を含み得、体重増加などのさらなる副作用を引き起こし得る。
本分野の進歩は、拒絶反応を低減させる修飾を有する遺伝子組換えブタの開発に、大い
に左右される。残念ながら、ホモ接合性トランスジェニックブタの開発は、ゆっくりとし
たプロセスであり、胎仔線維芽細胞の相同組み換えの後に体細胞核移植(SCNT)が続
き、その後ヘテロ接合性トランスジェニック動物を繁殖させてホモ接合性トランスジェニ
ックブタを産生する伝統的方法を用いる、3年もの長い期間を必要とする。異種移植のた
めの新規のトランスジェニックブタの開発は、多能性幹細胞の欠如により妨げられており
、遺伝子操作が行われた細胞として、代わりに胎仔線維芽細胞に頼っている。
に左右される。残念ながら、ホモ接合性トランスジェニックブタの開発は、ゆっくりとし
たプロセスであり、胎仔線維芽細胞の相同組み換えの後に体細胞核移植(SCNT)が続
き、その後ヘテロ接合性トランスジェニック動物を繁殖させてホモ接合性トランスジェニ
ックブタを産生する伝統的方法を用いる、3年もの長い期間を必要とする。異種移植のた
めの新規のトランスジェニックブタの開発は、多能性幹細胞の欠如により妨げられており
、遺伝子操作が行われた細胞として、代わりに胎仔線維芽細胞に頼っている。
従って、ヒト移植レシピエントに対する臓器、組織、血液および細胞の移植材料の供給
源として、αGalエピトープ、Sda様エピトープおよびNeu5Gcエピトープが低
減されたトリプルノックアウト(αGal、β4GalNT2、CMAH)ブタを生産す
る、改善された、単純で、再現可能な、効率の良い、標準化された方法が、当業界におい
て必要とされている。
源として、αGalエピトープ、Sda様エピトープおよびNeu5Gcエピトープが低
減されたトリプルノックアウト(αGal、β4GalNT2、CMAH)ブタを生産す
る、改善された、単純で、再現可能な、効率の良い、標準化された方法が、当業界におい
て必要とされている。
本開示は、ヒトに移植するために、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ、C
MAHおよびβ4GalNT2の発現を減少させたブタの臓器、組織、または細胞を作製
する方法に広く関する。
MAHおよびβ4GalNT2の発現を減少させたブタの臓器、組織、または細胞を作製
する方法に広く関する。
少なくとも1つの細胞の核ゲノムにおいて、破壊されたα(1,3)-ガラクトシルト
ランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含むトランスジェニックブ
タが提供される。トランスジェニックブタにおけるα(1,3)-ガラクトシルトランス
フェラーゼ、CMAHおよびβ1,4N-アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの
発現は、野生型のブタにおける発現と比較して減少している。トリプルトランスジェニッ
クブタから得られる臓器、組織、輸血製剤、または細胞が提供される。ブタの臓器、組織
、輸血製剤または細胞は、皮膚、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、甲状腺、小腸およびそれ
らの構成成分からなる群から選択されてよい。ある局面において、トリプルトランスジェ
ニックブタ由来の組織がヒトに移植される場合、野生型のブタ由来の組織がヒトに移植さ
れる場合と比較して、拒絶反応関連症状が改善される。ある局面において、拒絶反応関連
症状は、細胞性拒絶反応関連症状、体液性拒絶反応関連症状、超急性拒絶反応関連症状、
性体液性異種移植反応拒絶反応関連症状、および急性血管性拒絶反応関連症状を含む群か
ら選択される。ある局面において、トリプルトランスジェニックブタ由来の臓器、組織、
輸血製剤または細胞がヒトに移植される場合、野生型のブタ由来の臓器、組織、輸血製剤
または細胞がヒトに移植される場合と比較して、血小板減少症が減少する。ある局面にお
いて、トランスジェニックブタ由来の肝臓がヒト血小板に暴露される場合、野生型のブタ
由来の肝臓がヒト血小板に暴露される場合と比較して、ヒト血小板の取り込みの減少を示
す。ある局面において、トリプルトランスジェニックブタ由来の腎臓がヒトに移植される
場合、野生型のブタ由来の腎臓がヒトに移植される場合と比較して拒絶反応関連症状が減
少する。
ランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含むトランスジェニックブ
タが提供される。トランスジェニックブタにおけるα(1,3)-ガラクトシルトランス
フェラーゼ、CMAHおよびβ1,4N-アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの
発現は、野生型のブタにおける発現と比較して減少している。トリプルトランスジェニッ
クブタから得られる臓器、組織、輸血製剤、または細胞が提供される。ブタの臓器、組織
、輸血製剤または細胞は、皮膚、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、甲状腺、小腸およびそれ
らの構成成分からなる群から選択されてよい。ある局面において、トリプルトランスジェ
ニックブタ由来の組織がヒトに移植される場合、野生型のブタ由来の組織がヒトに移植さ
れる場合と比較して、拒絶反応関連症状が改善される。ある局面において、拒絶反応関連
症状は、細胞性拒絶反応関連症状、体液性拒絶反応関連症状、超急性拒絶反応関連症状、
性体液性異種移植反応拒絶反応関連症状、および急性血管性拒絶反応関連症状を含む群か
ら選択される。ある局面において、トリプルトランスジェニックブタ由来の臓器、組織、
輸血製剤または細胞がヒトに移植される場合、野生型のブタ由来の臓器、組織、輸血製剤
または細胞がヒトに移植される場合と比較して、血小板減少症が減少する。ある局面にお
いて、トランスジェニックブタ由来の肝臓がヒト血小板に暴露される場合、野生型のブタ
由来の肝臓がヒト血小板に暴露される場合と比較して、ヒト血小板の取り込みの減少を示
す。ある局面において、トリプルトランスジェニックブタ由来の腎臓がヒトに移植される
場合、野生型のブタ由来の腎臓がヒトに移植される場合と比較して拒絶反応関連症状が減
少する。
ある実施形態において、少なくとも1つの核ゲノムにおいて破壊されたα(1,3)-
ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α(
1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ1,4N-アセチルガラ
クトサミントランスフェラーゼの発現が野生型のブタと比較して減少しているトリプルト
ランスジェニックブタから得られる皮膚関連物が提供される。本出願のある局面において
、該皮膚関連物は、創傷からの、特にヒトの皮膚創傷からの早期分離の低減を示す。
ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α(
1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ1,4N-アセチルガラ
クトサミントランスフェラーゼの発現が野生型のブタと比較して減少しているトリプルト
ランスジェニックブタから得られる皮膚関連物が提供される。本出願のある局面において
、該皮膚関連物は、創傷からの、特にヒトの皮膚創傷からの早期分離の低減を示す。
ヒトに異種移植するための移植材料の製造方法が提供される。本方法は、移植材料の供
給源として本出願のトリプルトランスジェニックブタを提供することを含み、ここでは、
移植材料は、臓器、組織、輸血製剤および細胞からなる群から選択され、また、移植材料
は低減されたレベルのαGal抗原、Sda様抗原およびNeu5Gc抗原を有する。
給源として本出願のトリプルトランスジェニックブタを提供することを含み、ここでは、
移植材料は、臓器、組織、輸血製剤および細胞からなる群から選択され、また、移植材料
は低減されたレベルのαGal抗原、Sda様抗原およびNeu5Gc抗原を有する。
少なくとも1つの核ゲノムにおいて、破壊されたα(1,3)-ガラクトシルトランス
フェラーゼ、CMAHおよびβ1,4GalNT2遺伝子を含む、トリプルトランスジェ
ニックブタが提供される。ある実施形態において、α(1,3)-ガラクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子の破壊は、GからAへの置換に隣接した3塩基対の欠失、1塩基対の欠
失、1塩基対の挿入、2塩基対の挿入、6塩基対の欠失、10塩基対の欠失、7塩基対の
欠失、5塩基対の欠失に代わる8塩基対の挿入、5塩基対の挿入、11塩基対の欠失、お
よび18塩基対の欠失が含まれるが、これらに限定されない破壊の群から選択される;C
MAH遺伝子の破壊は、4塩基対の挿入、1塩基対の欠失、2塩基対の欠失、3塩基対の
欠失、4塩基対の挿入、5塩基対の欠失、8塩基対の欠失、11塩基対の欠失、12塩基
対の欠失、1塩基対の挿入、1塩基対の欠失に代わる2塩基対の挿入、66塩基対の欠失
に代わる12塩基対の挿入、3塩基対の欠失に代わる4塩基対の挿入;および5塩基対の
欠失/1塩基対の置換が含まれるが、これらに限定されない破壊の群から選択され、β4
GalNT2遺伝子の破壊は、1塩基対の挿入、12塩基対の欠失/1塩基対の置換、1
2塩基対の欠失、14塩基対の欠失、5塩基対の欠失および271塩基対の欠失/1塩基
対の挿入が含まれるが、これらに限定されない破壊の群から選択される。ある実施形態に
おいて、α(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊は、5塩基対の欠
失および7塩基対の欠失が含まれる破壊の群から選択され、CMAH遺伝子の破壊は、1
2塩基対の欠失および3塩基対の欠失/4塩基対の挿入が含まれる破壊の群から選択され
、β4GalNT2遺伝子の破壊は、1塩基対の挿入、12塩基対の欠失および5塩基対
の欠失が含まれる破壊の群から選択される。ある実施形態において、α(1,3)-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊は、11塩基対の欠失および18塩基対の欠失
が含まれる破壊の群から選択され、CMAH遺伝子の破壊は、66塩基対の欠失/12塩
基対の挿入および5塩基対の欠失/1塩基対の置換が含まれる破壊の群から選択され、β
4GalNT2遺伝子の破壊は、14塩基対の欠失、12塩基対の欠失/1塩基対の置換
、および271塩基対の欠失/1塩基対の挿入が含まれる破壊の群から選択される。機能
性α(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の
、トリプルトランスジェニックブタにおける発現は、野生型のブタと比較して減少してい
る。トリプルトランスジェニックブタ由来の組織がヒトに移植される場合、野生型のブタ
由来の組織がヒトに移植される場合と比較して、超急性拒絶反応関連症候群が改善される
。
フェラーゼ、CMAHおよびβ1,4GalNT2遺伝子を含む、トリプルトランスジェ
ニックブタが提供される。ある実施形態において、α(1,3)-ガラクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子の破壊は、GからAへの置換に隣接した3塩基対の欠失、1塩基対の欠
失、1塩基対の挿入、2塩基対の挿入、6塩基対の欠失、10塩基対の欠失、7塩基対の
欠失、5塩基対の欠失に代わる8塩基対の挿入、5塩基対の挿入、11塩基対の欠失、お
よび18塩基対の欠失が含まれるが、これらに限定されない破壊の群から選択される;C
MAH遺伝子の破壊は、4塩基対の挿入、1塩基対の欠失、2塩基対の欠失、3塩基対の
欠失、4塩基対の挿入、5塩基対の欠失、8塩基対の欠失、11塩基対の欠失、12塩基
対の欠失、1塩基対の挿入、1塩基対の欠失に代わる2塩基対の挿入、66塩基対の欠失
に代わる12塩基対の挿入、3塩基対の欠失に代わる4塩基対の挿入;および5塩基対の
欠失/1塩基対の置換が含まれるが、これらに限定されない破壊の群から選択され、β4
GalNT2遺伝子の破壊は、1塩基対の挿入、12塩基対の欠失/1塩基対の置換、1
2塩基対の欠失、14塩基対の欠失、5塩基対の欠失および271塩基対の欠失/1塩基
対の挿入が含まれるが、これらに限定されない破壊の群から選択される。ある実施形態に
おいて、α(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊は、5塩基対の欠
失および7塩基対の欠失が含まれる破壊の群から選択され、CMAH遺伝子の破壊は、1
2塩基対の欠失および3塩基対の欠失/4塩基対の挿入が含まれる破壊の群から選択され
、β4GalNT2遺伝子の破壊は、1塩基対の挿入、12塩基対の欠失および5塩基対
の欠失が含まれる破壊の群から選択される。ある実施形態において、α(1,3)-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊は、11塩基対の欠失および18塩基対の欠失
が含まれる破壊の群から選択され、CMAH遺伝子の破壊は、66塩基対の欠失/12塩
基対の挿入および5塩基対の欠失/1塩基対の置換が含まれる破壊の群から選択され、β
4GalNT2遺伝子の破壊は、14塩基対の欠失、12塩基対の欠失/1塩基対の置換
、および271塩基対の欠失/1塩基対の挿入が含まれる破壊の群から選択される。機能
性α(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の
、トリプルトランスジェニックブタにおける発現は、野生型のブタと比較して減少してい
る。トリプルトランスジェニックブタ由来の組織がヒトに移植される場合、野生型のブタ
由来の組織がヒトに移植される場合と比較して、超急性拒絶反応関連症候群が改善される
。
ヒト対象がヒト臓器移植を必要とする対象として同定されてから、ヒト臓器移植が行わ
れるまでの期間を拡大させる方法が提供される。本方法は、破壊されたα(1,3)-ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α(1
,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ1,4N-アセチルガラク
トサミントランスフェラーゼの発現が野生型のブタと比較して減少しているトリプルトラ
ンスジェニックブタ由来の臓器を提供すること、および、治療的に有効な方法でトリプル
トランスジェニックブタ由来の臓器をヒト対象に外科的に取り付けることを包含する。あ
る局面において、臓器はヒト対象に、体内に外科的に取り付けられる。ある局面において
、臓器はヒト対象に、外部に外科的に取り付けられる。臓器は、対象に直接的または間接
的に、取り付けられてよい。
れるまでの期間を拡大させる方法が提供される。本方法は、破壊されたα(1,3)-ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α(1
,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ1,4N-アセチルガラク
トサミントランスフェラーゼの発現が野生型のブタと比較して減少しているトリプルトラ
ンスジェニックブタ由来の臓器を提供すること、および、治療的に有効な方法でトリプル
トランスジェニックブタ由来の臓器をヒト対象に外科的に取り付けることを包含する。あ
る局面において、臓器はヒト対象に、体内に外科的に取り付けられる。ある局面において
、臓器はヒト対象に、外部に外科的に取り付けられる。臓器は、対象に直接的または間接
的に、取り付けられてよい。
ヒト対象がヒト肝臓移植を必要とする対象として同定されてから、ヒト肝臓移植が行わ
れるまでの期間を拡大させる方法が提供される。本方法は、破壊されたα(1,3)-ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α(1
,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ1,4N-アセチルガラク
トサミントランスフェラーゼの発現が野生型のブタと比較して減少しているトリプルトラ
ンスジェニックブタ由来の臓器を提供すること、および、治療的に有効な方法でトリプル
トランスジェニックブタ由来の肝臓をヒト対象に外科的に取り付けることを包含する。あ
る局面において、肝臓はヒト対象に、体内に外科的に取り付けられる。ある局面において
、肝臓はヒト対象に、外部に外科的に取り付けられる。肝臓は、対象に直接的または間接
的に、取り付けられてよい。
れるまでの期間を拡大させる方法が提供される。本方法は、破壊されたα(1,3)-ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α(1
,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ1,4N-アセチルガラク
トサミントランスフェラーゼの発現が野生型のブタと比較して減少しているトリプルトラ
ンスジェニックブタ由来の臓器を提供すること、および、治療的に有効な方法でトリプル
トランスジェニックブタ由来の肝臓をヒト対象に外科的に取り付けることを包含する。あ
る局面において、肝臓はヒト対象に、体内に外科的に取り付けられる。ある局面において
、肝臓はヒト対象に、外部に外科的に取り付けられる。肝臓は、対象に直接的または間接
的に、取り付けられてよい。
ヒト対象がヒト腎臓移植を必要とする対象として同定されてから、ヒト腎臓移植が行わ
れるまでの期間を拡大させる方法が提供される。本方法は、破壊されたα(1,3)-ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α(1
,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ1,4N-アセチルガラク
トサミントランスフェラーゼの発現が野生型のブタと比較して減少している、トリプルト
ランスジェニックブタ由来の腎臓を提供すること、および、治療的に有効な方法でトリプ
ルトランスジェニックブタ由来の腎臓をヒト対象に外科的に取り付けることを包含する。
ある局面において、腎臓はヒト対象に、体内に外科的に取り付けられる。ある局面におい
て、腎臓はヒト対象に、外部に外科的に取り付けられる。腎臓は、対象に直接的または間
接的に、取り付けられてよい。
れるまでの期間を拡大させる方法が提供される。本方法は、破壊されたα(1,3)-ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α(1
,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ1,4N-アセチルガラク
トサミントランスフェラーゼの発現が野生型のブタと比較して減少している、トリプルト
ランスジェニックブタ由来の腎臓を提供すること、および、治療的に有効な方法でトリプ
ルトランスジェニックブタ由来の腎臓をヒト対象に外科的に取り付けることを包含する。
ある局面において、腎臓はヒト対象に、体内に外科的に取り付けられる。ある局面におい
て、腎臓はヒト対象に、外部に外科的に取り付けられる。腎臓は、対象に直接的または間
接的に、取り付けられてよい。
ヒト対象からの皮膚関連物の早期分離の低減方法が提供される。本方法は、破壊された
α(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝
子を提供するステップ、およびトリプルトランスジェニックブタ由来の皮膚関連物を製造
するステップを包含する。トリプルトランスジェニックブタにおけるα(1,3)-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現は、野生型のブタ
と比較して減少している。
α(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝
子を提供するステップ、およびトリプルトランスジェニックブタ由来の皮膚関連物を製造
するステップを包含する。トリプルトランスジェニックブタにおけるα(1,3)-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現は、野生型のブタ
と比較して減少している。
患者における超急性拒絶反応関連症状を改善する方法が提供される。本方法は、低減さ
れたレベルのαGal抗原、Sda様抗原、およびNeu5Gc抗原を有するブタの移植
材料を、対象に移植することを包含する。超急性拒絶反応関連症状は、野生型のブタ由来
のブタの移植材料がヒトに移植される場合と比較して、改善される。
れたレベルのαGal抗原、Sda様抗原、およびNeu5Gc抗原を有するブタの移植
材料を、対象に移植することを包含する。超急性拒絶反応関連症状は、野生型のブタ由来
のブタの移植材料がヒトに移植される場合と比較して、改善される。
改変されたエピトーププロファイルを示す細胞培養試薬が提供される。細胞培養試薬は
、破壊されたα(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4Ga
lNT2遺伝子を含むトリプルトランスジェニックブタから単離される。トリプルトラン
スジェニックブタにおけるα(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHお
よびβ4GalNT2の発現は、野生型のブタと比較して減少している。細胞培養試薬は
、細胞培養培地、細胞培養血清、細胞培養添加物および増殖可能な単離細胞を含む群から
選択される。ある局面において、細胞培養試薬は、α(1,3)-ガラクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子の破壊が、所定の位置における5塩基対の欠失,7塩基対の欠失または
1塩基対の挿入からなる破壊の群から選択され、CMAH遺伝子の破壊が12塩基対の欠
失、3塩基対の欠失/4塩基対の挿入、7塩基対の欠失および11塩基対の欠失からなる
破壊の群から選択され、β4GalNT2遺伝子の破壊が、所定の位置における1塩基対
の挿入、12塩基対の欠失および5塩基対の欠失から選択される、トリプルトランスジェ
ニックブタから単離される。ある局面において、細胞培養試薬は、α(1,3)-ガラク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が、11塩基対の欠失および18塩基対の欠失を
含む破壊の群から選択され、CMAH遺伝子の破壊が66塩基対の欠失/12塩基対の挿
入および5塩基対の欠失/1塩基対の置換を含む破壊の群から選択され、β4GalNT
2遺伝子の破壊が14塩基対の欠失、12塩基対の欠失/1塩基対の置換、および271
塩基対の欠失/1塩基対の挿入を含む破壊の群から選択される、トリプルトランスジェニ
ックブタから単離される。
、破壊されたα(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4Ga
lNT2遺伝子を含むトリプルトランスジェニックブタから単離される。トリプルトラン
スジェニックブタにおけるα(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHお
よびβ4GalNT2の発現は、野生型のブタと比較して減少している。細胞培養試薬は
、細胞培養培地、細胞培養血清、細胞培養添加物および増殖可能な単離細胞を含む群から
選択される。ある局面において、細胞培養試薬は、α(1,3)-ガラクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子の破壊が、所定の位置における5塩基対の欠失,7塩基対の欠失または
1塩基対の挿入からなる破壊の群から選択され、CMAH遺伝子の破壊が12塩基対の欠
失、3塩基対の欠失/4塩基対の挿入、7塩基対の欠失および11塩基対の欠失からなる
破壊の群から選択され、β4GalNT2遺伝子の破壊が、所定の位置における1塩基対
の挿入、12塩基対の欠失および5塩基対の欠失から選択される、トリプルトランスジェ
ニックブタから単離される。ある局面において、細胞培養試薬は、α(1,3)-ガラク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が、11塩基対の欠失および18塩基対の欠失を
含む破壊の群から選択され、CMAH遺伝子の破壊が66塩基対の欠失/12塩基対の挿
入および5塩基対の欠失/1塩基対の置換を含む破壊の群から選択され、β4GalNT
2遺伝子の破壊が14塩基対の欠失、12塩基対の欠失/1塩基対の置換、および271
塩基対の欠失/1塩基対の挿入を含む破壊の群から選択される、トリプルトランスジェニ
ックブタから単離される。
改変されたエピトーププロファイルを有する目的化合物を生産する方法が提供される。
本方法は、改変されたエピトーププロファイルを示す細胞培養試薬を提供するステップ、
および、目的化合物を発現可能な単離細胞を、改変されたエピトーププロファイルを示す
細胞培養試薬と培養するステップを包含する。改変されたエピトーププロファイルを有す
る細胞培養試薬は、破壊されたα(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMA
Hおよびβ4GalNT2遺伝子を含むトリプルトランスジェニックブタから単離される
。トリプルトランスジェニックブタにおけるα(1,3)-ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現は、野生型のブタと比較して減少している
。目的化合物上のNeu5Gcエピトープ、alphaGalエピトープおよびSda様
エピトープのレベルは、目的化合物が野生型のブタから単離された細胞培養試薬と培養さ
れた単離細胞から生産される場合の、目的化合物上のNeu5Gcエピトープ、alph
aGalエピトープおよびSda様エピトープのレベルよりも低い。ある実施形態におい
て、目的化合物は糖脂質および糖タンパク質を含む群から選択される。いくつかの局面に
おいて、目的化合物は、抗体、増殖因子、サイトカイン、ホルモンおよび凝固因子を含む
糖タンパク質の群から選択される糖タンパク質である。ある実施形態において、α(1,
3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が、所定の位置における5塩基対の
欠失,7塩基対の欠失または1塩基対の挿入からなる破壊の群から選択され、CMAH遺
伝子の破壊が12塩基対の欠失、3塩基対の欠失/4塩基対の挿入、7塩基対の欠失およ
び11塩基対の欠失からなる破壊の群から選択され、およびβ4GalNT2遺伝子の破
壊が、所定の位置における1塩基対の挿入、12塩基対の欠失および5塩基対の欠失から
選択される。ある実施形態において、α(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺
伝子の破壊が、11塩基対の欠失および18塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され、
CMAH遺伝子の破壊が66塩基対の欠失/12塩基対の挿入および5塩基対の欠失/1
塩基対の置換を含む破壊の群から選択され、β4GalNT2遺伝子の破壊が、14塩基
対の欠失、12塩基対の欠失/1塩基対の置換、および271塩基対の欠失/1塩基対の
挿入を含む破壊の群から選択される。
本方法は、改変されたエピトーププロファイルを示す細胞培養試薬を提供するステップ、
および、目的化合物を発現可能な単離細胞を、改変されたエピトーププロファイルを示す
細胞培養試薬と培養するステップを包含する。改変されたエピトーププロファイルを有す
る細胞培養試薬は、破壊されたα(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMA
Hおよびβ4GalNT2遺伝子を含むトリプルトランスジェニックブタから単離される
。トリプルトランスジェニックブタにおけるα(1,3)-ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現は、野生型のブタと比較して減少している
。目的化合物上のNeu5Gcエピトープ、alphaGalエピトープおよびSda様
エピトープのレベルは、目的化合物が野生型のブタから単離された細胞培養試薬と培養さ
れた単離細胞から生産される場合の、目的化合物上のNeu5Gcエピトープ、alph
aGalエピトープおよびSda様エピトープのレベルよりも低い。ある実施形態におい
て、目的化合物は糖脂質および糖タンパク質を含む群から選択される。いくつかの局面に
おいて、目的化合物は、抗体、増殖因子、サイトカイン、ホルモンおよび凝固因子を含む
糖タンパク質の群から選択される糖タンパク質である。ある実施形態において、α(1,
3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が、所定の位置における5塩基対の
欠失,7塩基対の欠失または1塩基対の挿入からなる破壊の群から選択され、CMAH遺
伝子の破壊が12塩基対の欠失、3塩基対の欠失/4塩基対の挿入、7塩基対の欠失およ
び11塩基対の欠失からなる破壊の群から選択され、およびβ4GalNT2遺伝子の破
壊が、所定の位置における1塩基対の挿入、12塩基対の欠失および5塩基対の欠失から
選択される。ある実施形態において、α(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺
伝子の破壊が、11塩基対の欠失および18塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され、
CMAH遺伝子の破壊が66塩基対の欠失/12塩基対の挿入および5塩基対の欠失/1
塩基対の置換を含む破壊の群から選択され、β4GalNT2遺伝子の破壊が、14塩基
対の欠失、12塩基対の欠失/1塩基対の置換、および271塩基対の欠失/1塩基対の
挿入を含む破壊の群から選択される。
ヒトに移植するためのブタの移植材料が提供される。ブタの移植材料の脂質およびタン
パク質は、低減されたレベルのαGalエピトープを有し、また、該移植材料は、低減さ
れたレベルのNeu5GcエピトープおよびSda様エピトープを有する。
パク質は、低減されたレベルのαGalエピトープを有し、また、該移植材料は、低減さ
れたレベルのNeu5GcエピトープおよびSda様エピトープを有する。
少なくとも1つの核ゲノムにおいて、破壊されたα1,3-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α1,3-ガラクトシルトラン
スフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現が野生型のブタと比較して減少し
ており、VVL結合が低減しているトランスジェニックブタが提供される。
ラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α1,3-ガラクトシルトラン
スフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現が野生型のブタと比較して減少し
ており、VVL結合が低減しているトランスジェニックブタが提供される。
一番左のグラフは、ネガティブコントロール(白色)と、IB4レクチンとインキュベ
ートした細胞(暗色)のデータを図示している。IB4は、GGTA1の遺伝子産物によ
り作製されるアルファガラクトース結合糖質と相互作用する。コントロールの結果(ネガ
ティブ)と、実験の結果(ポジティブ)の重なりを有する曲線は灰色で示している。IB
4とインキュベートした野生型細胞は、無染色の野生型細胞と、明確に離れたピークを示
している。IB4とインキュベートしたトリプルトランスジェニックブタの細胞は、顕著
な第二のピークを示さず、このことはαGal結合糖質の顕著な低減を示している。
ートした細胞(暗色)のデータを図示している。IB4は、GGTA1の遺伝子産物によ
り作製されるアルファガラクトース結合糖質と相互作用する。コントロールの結果(ネガ
ティブ)と、実験の結果(ポジティブ)の重なりを有する曲線は灰色で示している。IB
4とインキュベートした野生型細胞は、無染色の野生型細胞と、明確に離れたピークを示
している。IB4とインキュベートしたトリプルトランスジェニックブタの細胞は、顕著
な第二のピークを示さず、このことはαGal結合糖質の顕著な低減を示している。
中央のグラフは、ネガティブコントロール(白色)と、HD抗体とインキュベートした
細胞(暗色)のデータを図示している。ネガティブコントロールは、無関係なアイソタイ
プコントロール抗体とした。HD抗体は、CMAH遺伝子の産物により生産されるNeu
5Gc糖質と相互作用する。コントロールの結果(ネガティブ)と、実験の結果(ポジテ
ィブ)の重なりを有する曲線は灰色で示している。HD抗体とインキュベートした野生型
細胞は、無関係の抗体で処理した野生型の細胞と明確に離れたピークを示している。HD
抗体とインキュベートしたトリプルトランスジェニックブタ由来の細胞は、顕著な第二の
ピークを示さず、このことはNeu5Gcエピトープレベルの顕著な低減を示している。
細胞(暗色)のデータを図示している。ネガティブコントロールは、無関係なアイソタイ
プコントロール抗体とした。HD抗体は、CMAH遺伝子の産物により生産されるNeu
5Gc糖質と相互作用する。コントロールの結果(ネガティブ)と、実験の結果(ポジテ
ィブ)の重なりを有する曲線は灰色で示している。HD抗体とインキュベートした野生型
細胞は、無関係の抗体で処理した野生型の細胞と明確に離れたピークを示している。HD
抗体とインキュベートしたトリプルトランスジェニックブタ由来の細胞は、顕著な第二の
ピークを示さず、このことはNeu5Gcエピトープレベルの顕著な低減を示している。
一番右のグラフは、ネガティブコントロール(白色)と、DBAレクチンとインキュベ
ートした細胞(暗色)のデータを図示している。DBAレクチンは、β4GalNT2の
遺伝子産物により生産された糖質構造と相互作用する。コントロールの結果(ネガティブ
)と、実験の結果(ポジティブ)の重なりを有する曲線は灰色で示している。DBAと相
互作用した野生型細胞は、無染色の野生型細胞と明確に離れたピークを示す。DBAとイ
ンキュベートしたトリプルトランスジェニックブタの細胞は顕著な第二のピークを示さず
、このことはβ4GalNT2の遺伝子産物により産生される糖質の顕著な低減を示して
いる。
ートした細胞(暗色)のデータを図示している。DBAレクチンは、β4GalNT2の
遺伝子産物により生産された糖質構造と相互作用する。コントロールの結果(ネガティブ
)と、実験の結果(ポジティブ)の重なりを有する曲線は灰色で示している。DBAと相
互作用した野生型細胞は、無染色の野生型細胞と明確に離れたピークを示す。DBAとイ
ンキュベートしたトリプルトランスジェニックブタの細胞は顕著な第二のピークを示さず
、このことはβ4GalNT2の遺伝子産物により産生される糖質の顕著な低減を示して
いる。
パネルCは、同一の血清の別々の分注液とインキュベートした後の、各タイプのRBC
から溶出したIgMおよびIgGの、マススペクトロスコピーにより決定された相対的レ
ベルを示している。各血清について、マススペクトロメトリー解析から得られたAUCを
、自家性ヒト赤血球へのIgGまたはIgM全結合に対して得られた値に、全て正規化し
た。IgGについて、各アイソタイプのAUCを合計することにより抗体総量を計算した
。野生型ブタ赤血球(W)、トリプルノックアウトブタ赤血球(B)、および自家性ヒト
赤血球(A)からの結果を示している。自家性ヒト赤血球は、試験した血清を得た対象と
同じ対象由来である。
から溶出したIgMおよびIgGの、マススペクトロスコピーにより決定された相対的レ
ベルを示している。各血清について、マススペクトロメトリー解析から得られたAUCを
、自家性ヒト赤血球へのIgGまたはIgM全結合に対して得られた値に、全て正規化し
た。IgGについて、各アイソタイプのAUCを合計することにより抗体総量を計算した
。野生型ブタ赤血球(W)、トリプルノックアウトブタ赤血球(B)、および自家性ヒト
赤血球(A)からの結果を示している。自家性ヒト赤血球は、試験した血清を得た対象と
同じ対象由来である。
本発明の詳細な説明
本出願は、トランスジェニックブタと、ブタゲノムがコードする所定の産物を発現しな
い、ヒトに移植するための、ブタの臓器、組織および細胞と、これらを作製および使用す
る方法を提供する。ある実施形態において、本出願は、破壊されたα(1,3)-ガラク
トシルトランスフェラーゼ、β4GalNT2およびシチジン一リン酸N-アセチルノイ
ラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を含み、機能性のα(1,3)-ガラクトシルトランス
フェラーゼ、β4GalNT2およびシチジン一リン酸N-アセチルノイラミン酸ヒドロ
キシラーゼのノックアウトブタにおける発現が、野生型のブタと比較して減少している、
トリプルトランスジェニックブタを提供する。
本出願は、トランスジェニックブタと、ブタゲノムがコードする所定の産物を発現しな
い、ヒトに移植するための、ブタの臓器、組織および細胞と、これらを作製および使用す
る方法を提供する。ある実施形態において、本出願は、破壊されたα(1,3)-ガラク
トシルトランスフェラーゼ、β4GalNT2およびシチジン一リン酸N-アセチルノイ
ラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を含み、機能性のα(1,3)-ガラクトシルトランス
フェラーゼ、β4GalNT2およびシチジン一リン酸N-アセチルノイラミン酸ヒドロ
キシラーゼのノックアウトブタにおける発現が、野生型のブタと比較して減少している、
トリプルトランスジェニックブタを提供する。
I.一般的用語
本明細書および特許請求の範囲において、「含む(including)」および「含む(compr
ising)」という用語は制約のない(open-ended)用語であり、「含むが、それらに限定
されない」と解釈されるべきである。これらの用語は、より制限された用語である「本質
的に~からなる」および「~からなる」を包含する。
本明細書および特許請求の範囲において、「含む(including)」および「含む(compr
ising)」という用語は制約のない(open-ended)用語であり、「含むが、それらに限定
されない」と解釈されるべきである。これらの用語は、より制限された用語である「本質
的に~からなる」および「~からなる」を包含する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形の「a」、「an」、お
よび「the」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数形の参照を含む。尚、用語「a」(
または「an」)、「1つ以上」および「少なくとも1つ」は、本明細書において互換的に
用いられ得る。用語「含む(comprising)」、「含む(including)」、および「有する
(having)」が互換的に用いられ得ることもまた、注意すべきである。
よび「the」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数形の参照を含む。尚、用語「a」(
または「an」)、「1つ以上」および「少なくとも1つ」は、本明細書において互換的に
用いられ得る。用語「含む(comprising)」、「含む(including)」、および「有する
(having)」が互換的に用いられ得ることもまた、注意すべきである。
他に規定されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発
明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で特
に言及される全ての出版物および特許は、本発明と関連して用いられ得る出版物で報告さ
れる化学物質、装置、統計解析および方法論を記述することおよび開示することを含む全
ての目的で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される全て
の参照は、当業界の技術レベルを指し示すものとして理解されるべきである。本明細書中
のいかなるものも、本発明が先発明としてそれらの開示に先行する資格がないと認めるも
のと解釈されるべきではない。
明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で特
に言及される全ての出版物および特許は、本発明と関連して用いられ得る出版物で報告さ
れる化学物質、装置、統計解析および方法論を記述することおよび開示することを含む全
ての目的で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される全て
の参照は、当業界の技術レベルを指し示すものとして理解されるべきである。本明細書中
のいかなるものも、本発明が先発明としてそれらの開示に先行する資格がないと認めるも
のと解釈されるべきではない。
II.組成物および方法
異種移植における使用に好適なトランスジェニック動物、および、異種移植における使
用に好適な哺乳動物を生産する方法が提供される。特に、本出願は、α1,3ガラクトシ
ルトランスフェラーゼ(αGal)、β1,4N-アセチルガラクトサミントランスフェ
ラーゼ(β4GalNT2)およびシチジン一リン酸N-アセチルノイラミン酸ヒドロキ
シラーゼ(CMAH)の発現が減少したトリプルトランスジェニックブタの生産について
記載する。
異種移植における使用に好適なトランスジェニック動物、および、異種移植における使
用に好適な哺乳動物を生産する方法が提供される。特に、本出願は、α1,3ガラクトシ
ルトランスフェラーゼ(αGal)、β1,4N-アセチルガラクトサミントランスフェ
ラーゼ(β4GalNT2)およびシチジン一リン酸N-アセチルノイラミン酸ヒドロキ
シラーゼ(CMAH)の発現が減少したトリプルトランスジェニックブタの生産について
記載する。
本発明の実施形態において、αGal、β4GalNT2およびCMAH遺伝子の活性
がより低く、結果として得られるαGal、β4GalNT2およびCMAH産物が、細
胞表面上のα1、3-ガラクトシルエピトープ、Sda様エピトープ、もしくはNeu5
Gc、糖タンパク質、または糖脂質の野生型レベルをもはや産生しない、ブタ並びに、ブ
タ由来のブタの臓器、組織および細胞が提供される。別の実施形態において、αGal、
β4GalNT2およびCMAH遺伝子は、該遺伝子の転写が生じないように、不活性化
される。いくつかの実施形態において、αGal/B4GalNT2/CMAHトリプル
ノックアウトブタが作製される。トランスジェニックブタを作製する方法、およびそれに
対する挑戦は、Galli et al 2010 Xenotransplantation 17(6) p.397-410において議論さ
れている。本発明の方法および細胞培養物は、本明細書の下記にさらに詳述されている。
がより低く、結果として得られるαGal、β4GalNT2およびCMAH産物が、細
胞表面上のα1、3-ガラクトシルエピトープ、Sda様エピトープ、もしくはNeu5
Gc、糖タンパク質、または糖脂質の野生型レベルをもはや産生しない、ブタ並びに、ブ
タ由来のブタの臓器、組織および細胞が提供される。別の実施形態において、αGal、
β4GalNT2およびCMAH遺伝子は、該遺伝子の転写が生じないように、不活性化
される。いくつかの実施形態において、αGal/B4GalNT2/CMAHトリプル
ノックアウトブタが作製される。トランスジェニックブタを作製する方法、およびそれに
対する挑戦は、Galli et al 2010 Xenotransplantation 17(6) p.397-410において議論さ
れている。本発明の方法および細胞培養物は、本明細書の下記にさらに詳述されている。
用語「トランスジェニック哺乳動物」は、所与の遺伝子が改変、除去、または破壊され
たトランスジェニック哺乳動物を指す。該用語は、全ての子孫世代を含むことが意図され
ていることは、強調されるべきである。従って、子孫が創始動物または子孫動物から体細
胞核移植(SCNT)により生み出されたか、伝統的生殖方法により生み出されたかにか
かわらず、創始動物並びに、そのF1、F2、F3などの子孫全てが含まれる。「シング
ルトランスジェニック」は、1つの遺伝子が改変、除去、または破壊されているトランス
ジェニック哺乳動物を意味する。「ダブルトランスジェニック」は、2つの遺伝子が改変
、除去または破壊されているトランスジェニック哺乳動物を意味する。「トリプルトラン
スジェニック」は、3つの遺伝子が改変、除去、または破壊されているトランスジェニッ
ク哺乳動物を意味する。「クワドループルトランスジェニック」は、4つの遺伝子が改変
、除去、または破壊されているトランスジェニック哺乳動物を意味する。
たトランスジェニック哺乳動物を指す。該用語は、全ての子孫世代を含むことが意図され
ていることは、強調されるべきである。従って、子孫が創始動物または子孫動物から体細
胞核移植(SCNT)により生み出されたか、伝統的生殖方法により生み出されたかにか
かわらず、創始動物並びに、そのF1、F2、F3などの子孫全てが含まれる。「シング
ルトランスジェニック」は、1つの遺伝子が改変、除去、または破壊されているトランス
ジェニック哺乳動物を意味する。「ダブルトランスジェニック」は、2つの遺伝子が改変
、除去または破壊されているトランスジェニック哺乳動物を意味する。「トリプルトラン
スジェニック」は、3つの遺伝子が改変、除去、または破壊されているトランスジェニッ
ク哺乳動物を意味する。「クワドループルトランスジェニック」は、4つの遺伝子が改変
、除去、または破壊されているトランスジェニック哺乳動物を意味する。
原則として、トランスジェニック動物は、目的の遺伝子配列の一方または両方のコピー
が破壊されていてよい。目的の核酸配列の1つのコピーまたは対立遺伝子のみが破壊され
ている場合、該ノックアウトマウスは「ヘテロ接合性(heterozygous)トランスジェニッ
ク動物」と呼ばれる。用語「ヌル」変異は、目的のヌクレオチド配列の2つのコピーが、
異なるかたちで破壊されているが、ある遺伝物質が両対立遺伝子から除去されるように破
壊が重複している例、および、目的のヌクレオチド配列の両対立遺伝子が、同じ破壊を有
する例の両方を包含する。いくつかの実施形態において、目的の3つの遺伝子の破壊は、
トランスジェニック動物の少なくとも1つの細胞、少なくとも複数の動物細胞、少なくと
も半数の動物細胞、少なくとも多数の動物細胞、少なくとも圧倒的多数の動物細胞、少な
くとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%の動物細
胞において生じ得る。
が破壊されていてよい。目的の核酸配列の1つのコピーまたは対立遺伝子のみが破壊され
ている場合、該ノックアウトマウスは「ヘテロ接合性(heterozygous)トランスジェニッ
ク動物」と呼ばれる。用語「ヌル」変異は、目的のヌクレオチド配列の2つのコピーが、
異なるかたちで破壊されているが、ある遺伝物質が両対立遺伝子から除去されるように破
壊が重複している例、および、目的のヌクレオチド配列の両対立遺伝子が、同じ破壊を有
する例の両方を包含する。いくつかの実施形態において、目的の3つの遺伝子の破壊は、
トランスジェニック動物の少なくとも1つの細胞、少なくとも複数の動物細胞、少なくと
も半数の動物細胞、少なくとも多数の動物細胞、少なくとも圧倒的多数の動物細胞、少な
くとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%の動物細
胞において生じ得る。
用語「キメラ」、「モザイク」または「キメラ哺乳動物」は、そのゲノム含有細胞のい
くつかにおいて、ノックアウトを有するトランスジェニック哺乳動物を指す。キメラは、
未変化の遺伝子配列を有する少なくとも1つの細胞、未変化の遺伝子配列を有する少なく
とも数個の細胞、または未変化の配列を有する多数の細胞を有する。
くつかにおいて、ノックアウトを有するトランスジェニック哺乳動物を指す。キメラは、
未変化の遺伝子配列を有する少なくとも1つの細胞、未変化の遺伝子配列を有する少なく
とも数個の細胞、または未変化の配列を有する多数の細胞を有する。
用語「ヘテロ接合性」または「ヘテロ接合性哺乳動物」は、そのゲノム含有細胞の全て
において、染色体対の一方に破壊を有するトランスジェニック哺乳動物を指す。
において、染色体対の一方に破壊を有するトランスジェニック哺乳動物を指す。
用語「ホモ接合性」または「ホモ接合性哺乳動物」は、そのゲノム含有細胞の全てにお
いて、染色体対の両方に破壊を有するトランスジェニック哺乳動物を指す。「ホモ接合性
改変」は、染色体対の両方における改変を指す。
いて、染色体対の両方に破壊を有するトランスジェニック哺乳動物を指す。「ホモ接合性
改変」は、染色体対の両方における改変を指す。
本出願の「非ヒト哺乳動物」には、げっ歯類、ヒツジ(sheep)、イヌ、ヒツジなどの
ヒツジ類(ovine)、肉牛および乳牛などのウシ、およびブタ(pig)やイノシシ(hog)など
のブタ類(swine)を例とする哺乳動物が含まれる。本出願は典型的な非ヒト動物(ブタ)
を提供するが、他の動物も同様に遺伝子組換えされ得る。
ヒツジ類(ovine)、肉牛および乳牛などのウシ、およびブタ(pig)やイノシシ(hog)など
のブタ類(swine)を例とする哺乳動物が含まれる。本出願は典型的な非ヒト動物(ブタ)
を提供するが、他の動物も同様に遺伝子組換えされ得る。
「変異」は、子孫に伝達される、動物の遺伝物質における検出可能な変化である。変異
はたいてい、1つ以上のデオキシリボヌクレオチドにおける変化、例えば、ヌクレオチド
の付加、挿入、欠失、反転または置換などである。
はたいてい、1つ以上のデオキシリボヌクレオチドにおける変化、例えば、ヌクレオチド
の付加、挿入、欠失、反転または置換などである。
「ブタ」は、野生ブタ、家畜ブタ、ミニブタ、Sus scrofaブタ、Sus scrofa domesticu
sブタ、並びに近交系ブタを含むがこれらに限定されない、当業界で知られる任意のブタ
を意図している。限定されることなく、ブタは、Landrace、Yorkshire、Hampshire、Duro
c、Chinese Meishan、Chester White、Berkshire Goettingen、Landrace/York/Chester W
hite、Yucatan、Bama Xiang Zhu、Wuzhishan、Xi Shuang Banna およびPietrain ブタを
含む群から選択され得る。ブタの臓器、組織、細胞または輸血製剤は、ブタ由来の、臓器
、組織、失活させた動物組織、細胞、または輸血製剤である。
sブタ、並びに近交系ブタを含むがこれらに限定されない、当業界で知られる任意のブタ
を意図している。限定されることなく、ブタは、Landrace、Yorkshire、Hampshire、Duro
c、Chinese Meishan、Chester White、Berkshire Goettingen、Landrace/York/Chester W
hite、Yucatan、Bama Xiang Zhu、Wuzhishan、Xi Shuang Banna およびPietrain ブタを
含む群から選択され得る。ブタの臓器、組織、細胞または輸血製剤は、ブタ由来の、臓器
、組織、失活させた動物組織、細胞、または輸血製剤である。
α1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ(αGal、GGTA、GGT1、GT、α
GT、GGTA1、GGTA-1)遺伝子は、酵素(GT、αGal、α1、3ガラクト
シルトランスフェラーゼ)をコードする。Ensemble transcript ENSSSCG00000005518には
、ブタのGGTA1ヌクレオチド配列が含まれる。機能性のα1,3ガラクトシルトラン
スフェラーゼは、糖タンパク質上のガラクトース-α1,3-ガラクトース(αGal、
Gal、Gal、gal1,3gal、gal1-3gal)残基の形成を触媒する。ガ
ラクトース-α1,3-ガラクトース(αGal)残基は、ヒト免疫系により認識される
、抗原性エピトープまたは抗原である。トランスジェニック臓器材料からのαGalの除
去は、外来物の移植へのヒトの免疫応答を取り除くことはなく、異種移植に対する迅速な
免疫応答におけるさらなる抗体の関与を示唆している(Mohiudden et al (2014), Am J. T
ransplantation 14:488-489 and Mohiudden et al 2014 Xenotransplantation 21:35-45)
。機能性のαGalの発現の減少をもたらすαGal遺伝子の破壊は、GからAへの置換
に隣接した3塩基対の欠失、1塩基対の欠失、1塩基対の挿入、2塩基対の挿入、6塩基
対の欠失、10塩基対の欠失、7塩基対の欠失、5塩基対の欠失に代わる8塩基対の挿入
、5塩基対の挿入、11塩基対の欠失、および18塩基対の欠失を含んでよいが、これら
に限定されない(表1参照)。Crispr標的配列は、該遺伝子の、開始コドンの近く
、エクソン3に存在する。
GT、GGTA1、GGTA-1)遺伝子は、酵素(GT、αGal、α1、3ガラクト
シルトランスフェラーゼ)をコードする。Ensemble transcript ENSSSCG00000005518には
、ブタのGGTA1ヌクレオチド配列が含まれる。機能性のα1,3ガラクトシルトラン
スフェラーゼは、糖タンパク質上のガラクトース-α1,3-ガラクトース(αGal、
Gal、Gal、gal1,3gal、gal1-3gal)残基の形成を触媒する。ガ
ラクトース-α1,3-ガラクトース(αGal)残基は、ヒト免疫系により認識される
、抗原性エピトープまたは抗原である。トランスジェニック臓器材料からのαGalの除
去は、外来物の移植へのヒトの免疫応答を取り除くことはなく、異種移植に対する迅速な
免疫応答におけるさらなる抗体の関与を示唆している(Mohiudden et al (2014), Am J. T
ransplantation 14:488-489 and Mohiudden et al 2014 Xenotransplantation 21:35-45)
。機能性のαGalの発現の減少をもたらすαGal遺伝子の破壊は、GからAへの置換
に隣接した3塩基対の欠失、1塩基対の欠失、1塩基対の挿入、2塩基対の挿入、6塩基
対の欠失、10塩基対の欠失、7塩基対の欠失、5塩基対の欠失に代わる8塩基対の挿入
、5塩基対の挿入、11塩基対の欠失、および18塩基対の欠失を含んでよいが、これら
に限定されない(表1参照)。Crispr標的配列は、該遺伝子の、開始コドンの近く
、エクソン3に存在する。
シチジン一リン酸N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ(CMP-Neu5Ac
ヒドロキシラーゼ遺伝子、CMAH)遺伝子は、酵素(CMAH)をコードしている。機
能性のCMAHは、シアル酸N-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)の、N-グリコ
リルノイラミン酸(Neu5Gc)への変換を触媒する。Neu5Gc残基は、ヒト免疫
系により認識される抗原性エピトープまたは抗原である。Ensembl database id Gene: EN
SSSCG00000001099には、ブタのCMAHヌクレオチド配列が含まれ、Crispr標的領
域はエクソン6の近傍である。機能性のCMAHの発現の減少をもたらすCMAH遺伝子
の破壊には、4塩基対の挿入、1塩基対の欠失、2塩基対の欠失、3塩基対の欠失、20
塩基対の欠失、5塩基対の欠失、8塩基対の欠失、11塩基対の欠失、12塩基対の欠失
、1塩基対の挿入、1塩基対の欠失に代わる2塩基対の挿入、4塩基対の挿入に代わる3
塩基対の欠失、66塩基対の欠失/12塩基対の挿入、および5塩基対の欠失/1塩基対
置換が含まれてよいが、これらに限定されない(表1参照)。
ヒドロキシラーゼ遺伝子、CMAH)遺伝子は、酵素(CMAH)をコードしている。機
能性のCMAHは、シアル酸N-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)の、N-グリコ
リルノイラミン酸(Neu5Gc)への変換を触媒する。Neu5Gc残基は、ヒト免疫
系により認識される抗原性エピトープまたは抗原である。Ensembl database id Gene: EN
SSSCG00000001099には、ブタのCMAHヌクレオチド配列が含まれ、Crispr標的領
域はエクソン6の近傍である。機能性のCMAHの発現の減少をもたらすCMAH遺伝子
の破壊には、4塩基対の挿入、1塩基対の欠失、2塩基対の欠失、3塩基対の欠失、20
塩基対の欠失、5塩基対の欠失、8塩基対の欠失、11塩基対の欠失、12塩基対の欠失
、1塩基対の挿入、1塩基対の欠失に代わる2塩基対の挿入、4塩基対の挿入に代わる3
塩基対の欠失、66塩基対の欠失/12塩基対の挿入、および5塩基対の欠失/1塩基対
置換が含まれてよいが、これらに限定されない(表1参照)。
β1,4N-アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ(B4GalNT2、β4G
alNT2、B1,4GalNT2、β1,4GalNT2)遺伝子は、β1,4N-ア
セチルガラクトサミントランスフェラーゼ2グリコシルトランスフェラーゼ(B4Gal
NT2)をコードする。機能性のB4GalNT2は、Sda様グリカンを生産する(Dal
l’Olio et al (2014) Biochemica Biophysica Acta 1840:443-453 and Blanchard et al
(1983) JBC 258:7691-7685)。B4GalNT2は、ほとんどのヒトで発現されると考
えられている;先の研究は、機能性のB4GalNT2の発現を欠くヒトはたった5%で
あることを示唆した。ブタ細胞におけるβ4GalNT2の破壊は、試験したヒトサンプ
ルの5%を超えるサンプルにおいて、交差適合を顕著に減少させる;本結果は予想外だっ
た。Sda様グリカンは、Sda、および血液型または血液型群決定および、胃腸癌抑制
に関連する同様のグリカンを含んでよい。EnsemblデータベースENSSSCG00000030269エン
トリーには、β4GalNT2cDNAおよびアミノ酸配列が含まれる。ゲノムのブタの
β4GalNT2は、およそ40,000塩基対にわたって多数のエクソンにおよび、多
数の遺伝子座で生じ得る。これらの実験において利用されるCrispR標的領域は、エ
クソン2で見られ、CTGTATCGAGGAACACGCTTである。機能性のβ4G
alNT2の発現の減少をもたらすβ4GalNT2遺伝子の破壊には、1塩基対の挿入
、12塩基対の欠失、5塩基対の欠失、14塩基対の欠失、12塩基対の欠失/1塩基対
の置換、271塩基対の欠失/1塩基対の挿入が含まれてよいが、これらに限定されない
。
alNT2、B1,4GalNT2、β1,4GalNT2)遺伝子は、β1,4N-ア
セチルガラクトサミントランスフェラーゼ2グリコシルトランスフェラーゼ(B4Gal
NT2)をコードする。機能性のB4GalNT2は、Sda様グリカンを生産する(Dal
l’Olio et al (2014) Biochemica Biophysica Acta 1840:443-453 and Blanchard et al
(1983) JBC 258:7691-7685)。B4GalNT2は、ほとんどのヒトで発現されると考
えられている;先の研究は、機能性のB4GalNT2の発現を欠くヒトはたった5%で
あることを示唆した。ブタ細胞におけるβ4GalNT2の破壊は、試験したヒトサンプ
ルの5%を超えるサンプルにおいて、交差適合を顕著に減少させる;本結果は予想外だっ
た。Sda様グリカンは、Sda、および血液型または血液型群決定および、胃腸癌抑制
に関連する同様のグリカンを含んでよい。EnsemblデータベースENSSSCG00000030269エン
トリーには、β4GalNT2cDNAおよびアミノ酸配列が含まれる。ゲノムのブタの
β4GalNT2は、およそ40,000塩基対にわたって多数のエクソンにおよび、多
数の遺伝子座で生じ得る。これらの実験において利用されるCrispR標的領域は、エ
クソン2で見られ、CTGTATCGAGGAACACGCTTである。機能性のβ4G
alNT2の発現の減少をもたらすβ4GalNT2遺伝子の破壊には、1塩基対の挿入
、12塩基対の欠失、5塩基対の欠失、14塩基対の欠失、12塩基対の欠失/1塩基対
の置換、271塩基対の欠失/1塩基対の挿入が含まれてよいが、これらに限定されない
。
フレーズ「破壊された遺伝子」は、破壊された遺伝子が、内在性配列のアミノ酸配列と
異なる改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするか、内在性アミノ酸配
列よりも少ないアミノ酸残基を有するポリペプチドをコードするか、あるいは野生型の目
的のヌクレオチド配列はポリペプチドをコードするが破壊された遺伝子はポリペプチドを
コードしないかのいずれかである、目的のヌクレオチド配列の挿入、分断(interruption
)、または欠失を包含することを意図している。
異なる改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするか、内在性アミノ酸配
列よりも少ないアミノ酸残基を有するポリペプチドをコードするか、あるいは野生型の目
的のヌクレオチド配列はポリペプチドをコードするが破壊された遺伝子はポリペプチドを
コードしないかのいずれかである、目的のヌクレオチド配列の挿入、分断(interruption
)、または欠失を包含することを意図している。
本明細書は、機能性のαGal、β4GalNT2およびCMAH遺伝子の発現が低減
されたトランスジェニック動物を提供する。動物は、異種移植に好適な任意の哺乳動物で
あってよい。特定の実施形態において、動物はブタである。「MAH/αGALダブルノ
ックアウト」、「MAH/αGAL DKO」、「CMAH/αGal」、「CMAH/
αGal DKO」、「CMAH-/-/GAL-/-」、「αGal/CMAH DKO
s」、「αGAL/CMAH ダブルノックアウト」、「GGTA1/CMAH DKO」
、「GT1/CMAH DKO」、「GGTA1-/-/CMAH-/-」、「GGT1
-/-/CMAH-/-」、「CMAH/GGTA DKO」、「GT/CMAH-KO
」、「GGTA1/CMAH KO」、「DKO(αGal/CMAH)」、「DKO(
αGAL&CMAH)」、「CMAH-/αGal-」、「αGal-/CMAH-」、
「CMAH-/αGAL-」およびその変異体は、機能性のα1,3ガラクトシルトラン
スフェラーゼおよびシチジン一リン酸N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼの発現
を欠いているトランスジェニック動物、細胞、または組織を指す。トリプルノックアウト
産物または豚は、野生型のバックグラウンドまたはCMAH/αGalダブルノックアウ
トバックグラウンドにおいて作製されてよい。「CMAH/αGAL/B4GalNT2
トリプルノックアウト」、「CMAH/αGAL/β4GalNT2トリプルノックアウ
ト」、「CMAH/αGAL/B4GalNT2 TKO」、「CMAH/αGal/β
4GalNT2」、「CMAH/αGal/B4GalNT2 TKO」、「MAH-/
-/GAL-/-/B4GalNT2-/-」、「αGal/CMAH/β4GalNT
2 TKOs」、「αGAL/CMAH/β4Galトリプルノックアウト」、「GGT
A1/CMAH/B4GalNT2 TKO」、「GT1/CMAH/β4GalNT2
TKO」、「GGTA1-/-/CMAH-/-/β4GalNT2-/-」、「GGT
1-/-/CMAH-/-/β4GalNT2-/-」、「CMAH/GGTA/β4G
alNT2 TKO」、「GT/CMAH/β4GalNT2-KO」、「GGTA1/
CMAH/β4GalNT2 KO」、「TKO(αGal/CMAH/β4GalNT
2)」、「TKO(αGAL、CMAH、β4GalNT2)」、「CMAH-/αGa
l-/β4GalNT2-」、「αGal-/CMAH-/β4GalNT2-」、「C
MAH-/αGAL-β4GalNT2-」およびその変異体は、機能性のα1、3ガラ
クトシルトランスフェラーゼ、シチジン一リン酸N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラ
ーゼおよびβ4GalNT2の発現を欠いているトランスジェニック動物、細胞、または
組織を指す。
されたトランスジェニック動物を提供する。動物は、異種移植に好適な任意の哺乳動物で
あってよい。特定の実施形態において、動物はブタである。「MAH/αGALダブルノ
ックアウト」、「MAH/αGAL DKO」、「CMAH/αGal」、「CMAH/
αGal DKO」、「CMAH-/-/GAL-/-」、「αGal/CMAH DKO
s」、「αGAL/CMAH ダブルノックアウト」、「GGTA1/CMAH DKO」
、「GT1/CMAH DKO」、「GGTA1-/-/CMAH-/-」、「GGT1
-/-/CMAH-/-」、「CMAH/GGTA DKO」、「GT/CMAH-KO
」、「GGTA1/CMAH KO」、「DKO(αGal/CMAH)」、「DKO(
αGAL&CMAH)」、「CMAH-/αGal-」、「αGal-/CMAH-」、
「CMAH-/αGAL-」およびその変異体は、機能性のα1,3ガラクトシルトラン
スフェラーゼおよびシチジン一リン酸N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼの発現
を欠いているトランスジェニック動物、細胞、または組織を指す。トリプルノックアウト
産物または豚は、野生型のバックグラウンドまたはCMAH/αGalダブルノックアウ
トバックグラウンドにおいて作製されてよい。「CMAH/αGAL/B4GalNT2
トリプルノックアウト」、「CMAH/αGAL/β4GalNT2トリプルノックアウ
ト」、「CMAH/αGAL/B4GalNT2 TKO」、「CMAH/αGal/β
4GalNT2」、「CMAH/αGal/B4GalNT2 TKO」、「MAH-/
-/GAL-/-/B4GalNT2-/-」、「αGal/CMAH/β4GalNT
2 TKOs」、「αGAL/CMAH/β4Galトリプルノックアウト」、「GGT
A1/CMAH/B4GalNT2 TKO」、「GT1/CMAH/β4GalNT2
TKO」、「GGTA1-/-/CMAH-/-/β4GalNT2-/-」、「GGT
1-/-/CMAH-/-/β4GalNT2-/-」、「CMAH/GGTA/β4G
alNT2 TKO」、「GT/CMAH/β4GalNT2-KO」、「GGTA1/
CMAH/β4GalNT2 KO」、「TKO(αGal/CMAH/β4GalNT
2)」、「TKO(αGAL、CMAH、β4GalNT2)」、「CMAH-/αGa
l-/β4GalNT2-」、「αGal-/CMAH-/β4GalNT2-」、「C
MAH-/αGAL-β4GalNT2-」およびその変異体は、機能性のα1、3ガラ
クトシルトランスフェラーゼ、シチジン一リン酸N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラ
ーゼおよびβ4GalNT2の発現を欠いているトランスジェニック動物、細胞、または
組織を指す。
トランスジェニックの移植材料。移植材料は、異種移植片として用いられる、動物由来
の臓器、組織、輸血製剤および/または細胞を包含する。異種移植片として用いられる移
植材料は、αGal、β4GalNT2およびCMAHの発現が減少したトランスジェニ
ック動物から単離されてよい。トランスジェニックブタまたはノックアウトブタ由来のト
ランスジェニックの移植材料は、出生前の、新生児の、未熟なまたは完全に成熟したトラ
ンスジェニック動物から単離され得る。移植材料は、臓器移植を必要とするヒト対象に対
する持続性または一時的な臓器置換(organ replacement)として用いられてよい。脳、
心臓、肺、眼、胃、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、腺、鼻、
口、唇、脾臓、歯肉、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸(smallintesti
ne)、小腸(smallbowel)、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、軟骨、腱、靱帯、腎上体、
骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、幽門、副腎
腺、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節およびリンパ管
を含むがこれらに限定されない、任意のブタの臓器が用いられ得る。
の臓器、組織、輸血製剤および/または細胞を包含する。異種移植片として用いられる移
植材料は、αGal、β4GalNT2およびCMAHの発現が減少したトランスジェニ
ック動物から単離されてよい。トランスジェニックブタまたはノックアウトブタ由来のト
ランスジェニックの移植材料は、出生前の、新生児の、未熟なまたは完全に成熟したトラ
ンスジェニック動物から単離され得る。移植材料は、臓器移植を必要とするヒト対象に対
する持続性または一時的な臓器置換(organ replacement)として用いられてよい。脳、
心臓、肺、眼、胃、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、腺、鼻、
口、唇、脾臓、歯肉、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸(smallintesti
ne)、小腸(smallbowel)、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、軟骨、腱、靱帯、腎上体、
骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、幽門、副腎
腺、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節およびリンパ管
を含むがこれらに限定されない、任意のブタの臓器が用いられ得る。
別の実施形態において、本出願は異種移植に有用な非ヒト組織を提供する。いくつかの
実施形態において、非ヒト組織は、αGal/CMAH/β4GalNT2トリプルトラ
ンスジェニックブタ由来のブタの組織である。上皮、結合組織、血液、骨、軟骨、筋肉、
神経、腺様(adenoid)組織、脂肪組織、疎性結合組織、褐色脂肪組織、海綿骨組織、筋
肉、軟骨組織、海綿(cavernous)組織、軟骨様組織、クロム親和性組織、肉様組織、弾
性組織、上皮、脂肪組織、線維硝子組織、線維組織、ギャンジー包帯、ゼラチン状組織、
肉芽組織、腸管関連リンパ系組織、骨格筋組織、ハラー脈管組織、未分化組織、間質組織
、被覆組織、島組織、リンパ組織、リンパ系組織、間葉組織、中腎組織、多房性脂肪組織
、胸腺組織、膠様結合組織、骨髄組織、軟組織鼻点、腎発生組織、結節組織、骨様組織、
骨組織、造骨組織、骨髄組織、網状組織、根尖周囲組織、細網組織、平滑筋、硬性造血組
織および皮下組織、心臓弁、皮膚および腱を含む失活した動物組織および生きたブタの皮
膚を含むがこれらに限定されない任意のブタ組織が用いられ得る。
実施形態において、非ヒト組織は、αGal/CMAH/β4GalNT2トリプルトラ
ンスジェニックブタ由来のブタの組織である。上皮、結合組織、血液、骨、軟骨、筋肉、
神経、腺様(adenoid)組織、脂肪組織、疎性結合組織、褐色脂肪組織、海綿骨組織、筋
肉、軟骨組織、海綿(cavernous)組織、軟骨様組織、クロム親和性組織、肉様組織、弾
性組織、上皮、脂肪組織、線維硝子組織、線維組織、ギャンジー包帯、ゼラチン状組織、
肉芽組織、腸管関連リンパ系組織、骨格筋組織、ハラー脈管組織、未分化組織、間質組織
、被覆組織、島組織、リンパ組織、リンパ系組織、間葉組織、中腎組織、多房性脂肪組織
、胸腺組織、膠様結合組織、骨髄組織、軟組織鼻点、腎発生組織、結節組織、骨様組織、
骨組織、造骨組織、骨髄組織、網状組織、根尖周囲組織、細網組織、平滑筋、硬性造血組
織および皮下組織、心臓弁、皮膚および腱を含む失活した動物組織および生きたブタの皮
膚を含むがこれらに限定されない任意のブタ組織が用いられ得る。
別の実施形態は、αGal、B4GalNT2およびCMAHの発現が低減または減少
したブタのトリプルトランスジェニック動物由来の細胞または細胞株を提供する。ある実
施形態において、これらの細胞または細胞株は、異種移植に用いられ得る。上皮細胞、線
維芽細胞、神経細胞、角化細胞、造血細胞、メラニン形成細胞、軟骨細胞、リンパ細胞(
BおよびT)、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋肉細胞、顆粒膜細胞
、卵丘細胞、上皮細胞、内皮細胞、ランゲルハンス膵島細胞、膵臓インスリン分泌細胞、
骨細胞、骨前駆細胞、神経幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、大動脈内皮細胞、毛細血管内皮
細胞、線維芽細胞、肝星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クッパ-細胞
、平滑筋細胞、シュワン細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ細胞、単球、好酸球、好
塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺
細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球、白血球、マクロファージ、体細胞、下垂体細胞、
副腎細胞、毛髪細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、網膜細胞、桿体細胞、錐体細胞、心臓細胞、
ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、免疫記憶細胞、T細胞、B細胞、プラズ
マ細胞、筋肉細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精細胞、精巣細胞、
生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、尿細管周囲細胞、セルトリ細胞、黄体細胞、頸部
細胞、子宮内膜細胞、乳腺細胞、濾胞細胞、粘液細胞、線毛細胞、非角化上皮細胞、角化
上皮細胞、肺細胞、ゴブレット細胞、円柱上皮細胞、ドーパミン作動性細胞、扁平上皮細
胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨髄、胚性幹細胞、線維芽細胞および胎生線維芽細胞
を含むが、これらに限定されない任意のブタの組織または臓器由来の細胞が、用いられ得
る。
したブタのトリプルトランスジェニック動物由来の細胞または細胞株を提供する。ある実
施形態において、これらの細胞または細胞株は、異種移植に用いられ得る。上皮細胞、線
維芽細胞、神経細胞、角化細胞、造血細胞、メラニン形成細胞、軟骨細胞、リンパ細胞(
BおよびT)、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋肉細胞、顆粒膜細胞
、卵丘細胞、上皮細胞、内皮細胞、ランゲルハンス膵島細胞、膵臓インスリン分泌細胞、
骨細胞、骨前駆細胞、神経幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、大動脈内皮細胞、毛細血管内皮
細胞、線維芽細胞、肝星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クッパ-細胞
、平滑筋細胞、シュワン細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ細胞、単球、好酸球、好
塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺
細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球、白血球、マクロファージ、体細胞、下垂体細胞、
副腎細胞、毛髪細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、網膜細胞、桿体細胞、錐体細胞、心臓細胞、
ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、免疫記憶細胞、T細胞、B細胞、プラズ
マ細胞、筋肉細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精細胞、精巣細胞、
生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、尿細管周囲細胞、セルトリ細胞、黄体細胞、頸部
細胞、子宮内膜細胞、乳腺細胞、濾胞細胞、粘液細胞、線毛細胞、非角化上皮細胞、角化
上皮細胞、肺細胞、ゴブレット細胞、円柱上皮細胞、ドーパミン作動性細胞、扁平上皮細
胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨髄、胚性幹細胞、線維芽細胞および胎生線維芽細胞
を含むが、これらに限定されない任意のブタの組織または臓器由来の細胞が、用いられ得
る。
生育不能な派生物には、酵素的または化学的処理により生細胞を剥離させた組織が含ま
れ、これらの組織派生物は、移植における使用に先立ち、架橋または他の化学的処理によ
り、さらに処理され得る。好ましい実施形態において、該派生物には、皮膚、骨、尿、膀
胱または臓器の粘膜下組織を含む様々な組織由来の細胞外マトリックスが含まれる。さら
に、医療機器として、限定されないが心臓弁および他の生育不能な組織を含むように生存
組織を剥離された腱、関節、および骨が提供される。ある実施形態において、細胞培養に
好適で、かつ、本発明のトランスジェニックブタから単離された、血清または培地が提供
される。ブタのトランスジェニック臓器、組織、または細胞の構成成分もまた提供される
。構成成分は、架橋およびアルデヒド架橋を含むがこれらに限定されない、当業界で知ら
れる任意の方法によってもまた、修飾されてよい。構成成分は、該構成成分を取得したよ
り大きな臓器または組織に応じて変化してよい。皮膚の構成成分は、剥離皮膚、コラーゲ
ン、上皮細胞、線維芽細胞および真皮を含んでよいが、これらに限定されない。骨の構成
成分は、コラーゲンおよび細胞外マトリックスを含んでよいが、これらに限定されない。
心臓の構成成分は、弁および弁組織を含んでよいが、これらに限定されない。
れ、これらの組織派生物は、移植における使用に先立ち、架橋または他の化学的処理によ
り、さらに処理され得る。好ましい実施形態において、該派生物には、皮膚、骨、尿、膀
胱または臓器の粘膜下組織を含む様々な組織由来の細胞外マトリックスが含まれる。さら
に、医療機器として、限定されないが心臓弁および他の生育不能な組織を含むように生存
組織を剥離された腱、関節、および骨が提供される。ある実施形態において、細胞培養に
好適で、かつ、本発明のトランスジェニックブタから単離された、血清または培地が提供
される。ブタのトランスジェニック臓器、組織、または細胞の構成成分もまた提供される
。構成成分は、架橋およびアルデヒド架橋を含むがこれらに限定されない、当業界で知ら
れる任意の方法によってもまた、修飾されてよい。構成成分は、該構成成分を取得したよ
り大きな臓器または組織に応じて変化してよい。皮膚の構成成分は、剥離皮膚、コラーゲ
ン、上皮細胞、線維芽細胞および真皮を含んでよいが、これらに限定されない。骨の構成
成分は、コラーゲンおよび細胞外マトリックスを含んでよいが、これらに限定されない。
心臓の構成成分は、弁および弁組織を含んでよいが、これらに限定されない。
「異種移植」は、細胞、組織、または臓器の、異なる種からレシピエント対象への移植
、埋め込み、または注入を含む任意の手順を包含する。レシピエントがヒトである異種移
植が、特に想定される。従って、異種移植には、血管柄付き異種移植、部分的血管柄付き
異種移植、非血管柄付き異種移植、異種ドレッシング材、異種包帯、異種構造および異種
輸血が含まれるが、これらに限定されない。
、埋め込み、または注入を含む任意の手順を包含する。レシピエントがヒトである異種移
植が、特に想定される。従って、異種移植には、血管柄付き異種移植、部分的血管柄付き
異種移植、非血管柄付き異種移植、異種ドレッシング材、異種包帯、異種構造および異種
輸血が含まれるが、これらに限定されない。
実施形態において、破壊されたα(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、β4
GalNT2およびCMAH遺伝子を含むトランスジェニックブタから単離された細胞培
養試薬が提供される。細胞培養試薬は、組織培養、インビトロ組織培養、微少流体の組織
培養、細胞培養、または単離した細胞もしくは細胞株を成長させるための他の方法に利用
される試薬である。細胞培養試薬には、細胞培養培地、細胞培養血清、細胞培養添加物、
フィーダー細胞、および増殖可能な単離細胞が含まれるが、これらに限定されない。「増
殖可能な単離細胞」は、細胞が少なくとも1つのさらなるクローン細胞に増殖、分裂、ま
たは繁殖可能である、他の細胞型または他の細胞から、単離されたまたは部分的に単離細
胞を意図している。
GalNT2およびCMAH遺伝子を含むトランスジェニックブタから単離された細胞培
養試薬が提供される。細胞培養試薬は、組織培養、インビトロ組織培養、微少流体の組織
培養、細胞培養、または単離した細胞もしくは細胞株を成長させるための他の方法に利用
される試薬である。細胞培養試薬には、細胞培養培地、細胞培養血清、細胞培養添加物、
フィーダー細胞、および増殖可能な単離細胞が含まれるが、これらに限定されない。「増
殖可能な単離細胞」は、細胞が少なくとも1つのさらなるクローン細胞に増殖、分裂、ま
たは繁殖可能である、他の細胞型または他の細胞から、単離されたまたは部分的に単離細
胞を意図している。
培養で増殖される細胞は、抗原性エピトープを合成するか、あるいは、培養細胞により
生産される目的化合物に組み込み得る。抗原性エピトープは、ヒト抗体による結合の増加
と、目的化合物の活性の減少をもたらし得る。Ghaderi et al 2010 Nature Biotechnolog
y 28(8):863-867を参照されたい(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。α
Gal、B4GalNT2またはNeu5Gcのレベルの低減などの、改変されたエピト
ーププロファイルを有する細胞培養試薬で産生細胞を増殖させることは、目的化合物上の
、αGal抗原、Neu5Gc抗原、および/またはSda様抗原のレベルを低減させ得
る。目的化合物は、糖タンパク質および糖脂質を含み得るが、これらに限定されない。目
的の糖タンパク質は、抗体、増殖因子、サイトカイン、ホルモンまたは凝固因子を含み得
るが、これらに限定されない。目的の糖脂質は、治療薬、抗原、および生物界面活性剤を
含み得るが、これらに限定されない。
生産される目的化合物に組み込み得る。抗原性エピトープは、ヒト抗体による結合の増加
と、目的化合物の活性の減少をもたらし得る。Ghaderi et al 2010 Nature Biotechnolog
y 28(8):863-867を参照されたい(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。α
Gal、B4GalNT2またはNeu5Gcのレベルの低減などの、改変されたエピト
ーププロファイルを有する細胞培養試薬で産生細胞を増殖させることは、目的化合物上の
、αGal抗原、Neu5Gc抗原、および/またはSda様抗原のレベルを低減させ得
る。目的化合物は、糖タンパク質および糖脂質を含み得るが、これらに限定されない。目
的の糖タンパク質は、抗体、増殖因子、サイトカイン、ホルモンまたは凝固因子を含み得
るが、これらに限定されない。目的の糖脂質は、治療薬、抗原、および生物界面活性剤を
含み得るが、これらに限定されない。
単語「提供する」は、製造する、調達する、用意する、準備する、供給する、または備
え付ける、を包含することを意図している。細胞を提供する方法は対象を提供する方法と
は異なり得、臓器を提供する方法はブタを提供する方法とは異なり得、腎臓を提供する方
法は肝臓を提供する方法とは異なり得、臓器を提供する方法は輸血に好適な材料を提供す
る方法と異なり得ることは、認識されている。
え付ける、を包含することを意図している。細胞を提供する方法は対象を提供する方法と
は異なり得、臓器を提供する方法はブタを提供する方法とは異なり得、腎臓を提供する方
法は肝臓を提供する方法とは異なり得、臓器を提供する方法は輸血に好適な材料を提供す
る方法と異なり得ることは、認識されている。
移植拒絶反応は、移植された組織、臓器、細胞または物質がレシピエントの体に受け入
れられなかった場合に起こる。移植拒絶反応では、レシピエントの免疫系が移植された物
質を攻撃する。複数のタイプの移植拒絶反応が存在し、別々にまたは一緒に生じてよい。
拒絶反応プロセスには、超急性拒絶反応(HAR)、急性体液性異種移植拒絶反応(AH
XR)、血小板減少症、急性体液性拒絶反応、超急性血管拒絶反応、抗体媒介性拒絶反応
および移植片対宿主病が含まれるが、これらに限定されない。「超急性拒絶反応」は、1
つ以上の拒絶反応メカニズムと関連する、移植後最初の24時間以内に生じる、または始
まる移植された物質の拒絶反応を意味する。拒絶反応は、「超急性拒絶反応」、「体液性
拒絶反応」、「急性体液性拒絶反応」、「細胞性拒絶反応」および「抗体媒介性拒絶反応
」を包含するが、これらに限定されない。急性体液性異種移植反応(AHXR)は、病理
学の領域で特徴付けられており、移植後数日以内に生じる急性抗体媒介性拒絶反応、血栓
性微小血管症(TMA)の発症、微少血管性血管障害(microvascular angiopathy)、既
に形成された非Gal IgMおよびIgG結合、補体活性化、微小血管血栓症、および
移植後最初の数週間内の消費性血小板減少症を含むが、これらに限定されない。血小板減
少症は、血小板の量が、通常の範囲の140,000から440,000/μlを下回る
。血小板減少症関連の症状には、内出血、脳内出血、血尿、吐血、歯肉出血、腹部膨満、
タール状便、過長月経、鼻出血、斑状出血、点状出血または紫斑が含まれるが、これらに
限定されない。ブタ肝臓によるヒト血小板の取り込みが、異種移植レシピエントにおける
血小板減少症の発症の一因である。血小板減少症は、異種移植された臓器の再灌流時、ま
たは、再灌流の期間の直後に起こりうる。
れられなかった場合に起こる。移植拒絶反応では、レシピエントの免疫系が移植された物
質を攻撃する。複数のタイプの移植拒絶反応が存在し、別々にまたは一緒に生じてよい。
拒絶反応プロセスには、超急性拒絶反応(HAR)、急性体液性異種移植拒絶反応(AH
XR)、血小板減少症、急性体液性拒絶反応、超急性血管拒絶反応、抗体媒介性拒絶反応
および移植片対宿主病が含まれるが、これらに限定されない。「超急性拒絶反応」は、1
つ以上の拒絶反応メカニズムと関連する、移植後最初の24時間以内に生じる、または始
まる移植された物質の拒絶反応を意味する。拒絶反応は、「超急性拒絶反応」、「体液性
拒絶反応」、「急性体液性拒絶反応」、「細胞性拒絶反応」および「抗体媒介性拒絶反応
」を包含するが、これらに限定されない。急性体液性異種移植反応(AHXR)は、病理
学の領域で特徴付けられており、移植後数日以内に生じる急性抗体媒介性拒絶反応、血栓
性微小血管症(TMA)の発症、微少血管性血管障害(microvascular angiopathy)、既
に形成された非Gal IgMおよびIgG結合、補体活性化、微小血管血栓症、および
移植後最初の数週間内の消費性血小板減少症を含むが、これらに限定されない。血小板減
少症は、血小板の量が、通常の範囲の140,000から440,000/μlを下回る
。血小板減少症関連の症状には、内出血、脳内出血、血尿、吐血、歯肉出血、腹部膨満、
タール状便、過長月経、鼻出血、斑状出血、点状出血または紫斑が含まれるが、これらに
限定されない。ブタ肝臓によるヒト血小板の取り込みが、異種移植レシピエントにおける
血小板減少症の発症の一因である。血小板減少症は、異種移植された臓器の再灌流時、ま
たは、再灌流の期間の直後に起こりうる。
別の実施形態において、本発明は、ブタの臓器、組織または細胞上のαGal、β4G
alNT2およびNeu5Gcの発現が低減しているブタの臓器、組織または細胞を、ヒ
トに移植することを含む、患者において拒絶反応関連症状を改善する方法であって、1つ
以上の拒絶反応関連症状が、野生型のブタ由来の組織がヒトに移植される場合と比較して
改善される方法を提供する。「改善する」、「向上させる」、「改良する」、「増強する
」および「助ける」は、望ましいものにおいて、前進するまたは進歩することを意図する
。拒絶反応関連症状を改善することは、望ましくない症状を減少、軽減、または縮小する
ことを包含し得ることもまた、想定される。拒絶反応関連症状は、別の拒絶反応関連症状
が変化すると同時に改善され得ることも、さらに認められている。変化した第二の拒絶反
応関連症状は、改善されるか、あるいは増加し得る。変化した第二の拒絶反応関連症状は
、あまり望ましくない方法で変化し得る。拒絶反応関連症状には、超急性拒絶反応関連症
状および急性体液性異種移植反応関連症状が含まれるが、これらに限定されない。拒絶反
応関連症状には、血栓性微小血管症(TMA)、微少血管性血管障害、既に形成された非
GalIgMおよびIgG結合、補体活性化、凝集、線維症、微小血管血栓症、消費性血
小板減少症、消費性凝固障害、最重度血小板減少症、難治性凝固障害、移植片間質性出血
、斑紋(mottling)、チアノーゼ、浮腫、血栓症、壊死、フィブリン血栓形成、全身性播
種性血管内凝固、糸球体毛細血管におけるIgM沈着、糸球体毛細血管におけるIgG沈
着、クレアチニンレベルの上昇、BUNレベルの上昇、T細胞の浸潤、浸潤性好酸球、浸
潤性プラズマ細胞、浸潤性好中球、動脈炎、内皮への抗体結合、ICOS、CTLA-4
、BTLA、PD-1、LAG-3、またはTIM-3の発現の変化、および全身性炎症
が含まれるが、これらに限定されない。
alNT2およびNeu5Gcの発現が低減しているブタの臓器、組織または細胞を、ヒ
トに移植することを含む、患者において拒絶反応関連症状を改善する方法であって、1つ
以上の拒絶反応関連症状が、野生型のブタ由来の組織がヒトに移植される場合と比較して
改善される方法を提供する。「改善する」、「向上させる」、「改良する」、「増強する
」および「助ける」は、望ましいものにおいて、前進するまたは進歩することを意図する
。拒絶反応関連症状を改善することは、望ましくない症状を減少、軽減、または縮小する
ことを包含し得ることもまた、想定される。拒絶反応関連症状は、別の拒絶反応関連症状
が変化すると同時に改善され得ることも、さらに認められている。変化した第二の拒絶反
応関連症状は、改善されるか、あるいは増加し得る。変化した第二の拒絶反応関連症状は
、あまり望ましくない方法で変化し得る。拒絶反応関連症状には、超急性拒絶反応関連症
状および急性体液性異種移植反応関連症状が含まれるが、これらに限定されない。拒絶反
応関連症状には、血栓性微小血管症(TMA)、微少血管性血管障害、既に形成された非
GalIgMおよびIgG結合、補体活性化、凝集、線維症、微小血管血栓症、消費性血
小板減少症、消費性凝固障害、最重度血小板減少症、難治性凝固障害、移植片間質性出血
、斑紋(mottling)、チアノーゼ、浮腫、血栓症、壊死、フィブリン血栓形成、全身性播
種性血管内凝固、糸球体毛細血管におけるIgM沈着、糸球体毛細血管におけるIgG沈
着、クレアチニンレベルの上昇、BUNレベルの上昇、T細胞の浸潤、浸潤性好酸球、浸
潤性プラズマ細胞、浸潤性好中球、動脈炎、内皮への抗体結合、ICOS、CTLA-4
、BTLA、PD-1、LAG-3、またはTIM-3の発現の変化、および全身性炎症
が含まれるが、これらに限定されない。
「超急性拒絶反応関連症状」は、超急性拒絶反応に関連するとして、または超急性拒絶
反応により引き起こされるとして、当分野に知られる任意の症状を包含することを意図し
ている。超急性拒絶反応関連症状は、移植された臓器、組織、または細胞のタイプに応じ
て変化し得ることが認められている。超急性拒絶反応関連症状には、血栓性閉塞、移植片
脈管構造の出血、好中球流入、虚血、斑紋、チアノーゼ、浮腫、臓器不全、臓器機能の低
下、壊死、糸球体毛細血管血栓症、機能不全、溶血、発熱、凝固、胆汁産生量の減少、無
力症、低血圧、乏尿、凝固障害、血清アミノトランスフェラーゼレベルの上昇、アルカリ
ホスファターゼレベルの上昇、黄疸、嗜眠、アシドーシスおよび高ビリルビン血症および
血小板減少症が含まれ得るが、これらに限定されない。
反応により引き起こされるとして、当分野に知られる任意の症状を包含することを意図し
ている。超急性拒絶反応関連症状は、移植された臓器、組織、または細胞のタイプに応じ
て変化し得ることが認められている。超急性拒絶反応関連症状には、血栓性閉塞、移植片
脈管構造の出血、好中球流入、虚血、斑紋、チアノーゼ、浮腫、臓器不全、臓器機能の低
下、壊死、糸球体毛細血管血栓症、機能不全、溶血、発熱、凝固、胆汁産生量の減少、無
力症、低血圧、乏尿、凝固障害、血清アミノトランスフェラーゼレベルの上昇、アルカリ
ホスファターゼレベルの上昇、黄疸、嗜眠、アシドーシスおよび高ビリルビン血症および
血小板減少症が含まれ得るが、これらに限定されない。
血小板減少症は、血小板の量が、通常の範囲の140,000から440,000/μ
lを下回る。血小板減少症関連の症状には、内出血、脳内出血、血尿、吐血、歯肉出血、
腹部膨満、タール状便、過長月経、鼻出血、斑状出血、点状出血または紫斑が含まれるが
、これらに限定されない。ブタ肝臓によるヒト血小板の取り込みが、異種移植レシピエン
トにおける血小板減少症の発症の一因である。
lを下回る。血小板減少症関連の症状には、内出血、脳内出血、血尿、吐血、歯肉出血、
腹部膨満、タール状便、過長月経、鼻出血、斑状出血、点状出血または紫斑が含まれるが
、これらに限定されない。ブタ肝臓によるヒト血小板の取り込みが、異種移植レシピエン
トにおける血小板減少症の発症の一因である。
血小板(plateletまたはthrombocyte)は、血液凝固、止血、および血液血栓形成に関
連する巨核球の除核断片である。ヒト血小板は、血小板アフェレーシス、血小板フェレー
シスおよび超遠心分離を含むがこれらに限定されない、様々な方法により、通常通りに単
離される。
連する巨核球の除核断片である。ヒト血小板は、血小板アフェレーシス、血小板フェレー
シスおよび超遠心分離を含むがこれらに限定されない、様々な方法により、通常通りに単
離される。
フレーズ「血小板取り込み」は、血小板の肝臓または肝臓細胞への取り込みを包含する
ことを意図している。メカニズムにより限定されないが、この取り込みは、貪食プロセス
により生じ得る。血小板取り込みは、当業界で知られる任意の血小板取り込みモニタリン
グアッセイによりモニターされ得る。血小板取り込みモニタリングアッセイには、免疫学
的方法、ウエスタンブロット、免疫ブロット、顕微鏡、共焦点顕微鏡、透過型電子顕微鏡
およびファゴソーム単離が含まれるが、これらに限定されない。適切な血小板取り込みモ
ニタリングアッセイは、用いられる標識のタイプによって決まり得ることが認識されてい
る。血小板取り込みは、吸収された血小板全体のパーセンテージ、吸収されなかった血小
板全体のパーセンテージ、吸収されなかった血小板に対する吸収された血小板の比率、少
なくとも1つの血小板を吸収している細胞のパーセンテージ、血小板を吸収していない細
胞のパーセンテージ、または、細胞当たりの吸収された血小板の数として測定され得る。
2以上の細胞型による血小板取り込みが肝臓の血小板取り込み全体に寄与し得ることが、
認識されている。動物の肝臓による血小板取り込み全体には、肝臓の類洞内皮細胞による
血小板取り込み、クッパー細胞による血小板取り込み、LSECおよびクッパ-細胞によ
る血小板取り込み、およびさらなる細胞型による血小板取り込みが含まれ得る。異なる細
胞型による血小板取り込みが肝臓による血小板取り込み全体の同様のまたは異なる部分に
寄与し得ることが、認識されている。従って、肝臓による血小板取り込みの改変、阻害、
低減、減少、または低下は、1つ以上の肝臓細胞型による血小板取り込みの改変、阻害、
低減、減少、または低下を含む。
ことを意図している。メカニズムにより限定されないが、この取り込みは、貪食プロセス
により生じ得る。血小板取り込みは、当業界で知られる任意の血小板取り込みモニタリン
グアッセイによりモニターされ得る。血小板取り込みモニタリングアッセイには、免疫学
的方法、ウエスタンブロット、免疫ブロット、顕微鏡、共焦点顕微鏡、透過型電子顕微鏡
およびファゴソーム単離が含まれるが、これらに限定されない。適切な血小板取り込みモ
ニタリングアッセイは、用いられる標識のタイプによって決まり得ることが認識されてい
る。血小板取り込みは、吸収された血小板全体のパーセンテージ、吸収されなかった血小
板全体のパーセンテージ、吸収されなかった血小板に対する吸収された血小板の比率、少
なくとも1つの血小板を吸収している細胞のパーセンテージ、血小板を吸収していない細
胞のパーセンテージ、または、細胞当たりの吸収された血小板の数として測定され得る。
2以上の細胞型による血小板取り込みが肝臓の血小板取り込み全体に寄与し得ることが、
認識されている。動物の肝臓による血小板取り込み全体には、肝臓の類洞内皮細胞による
血小板取り込み、クッパー細胞による血小板取り込み、LSECおよびクッパ-細胞によ
る血小板取り込み、およびさらなる細胞型による血小板取り込みが含まれ得る。異なる細
胞型による血小板取り込みが肝臓による血小板取り込み全体の同様のまたは異なる部分に
寄与し得ることが、認識されている。従って、肝臓による血小板取り込みの改変、阻害、
低減、減少、または低下は、1つ以上の肝臓細胞型による血小板取り込みの改変、阻害、
低減、減少、または低下を含む。
メカニズムにより限定されないが、血小板取り込みは、LSECおよびクッパ-細胞に
よる貪食により生じ得る。貪食は、分解酵素を含むリソソームの融合によりファゴソーム
となる、エンドソームの形成により特徴付けられる。
よる貪食により生じ得る。貪食は、分解酵素を含むリソソームの融合によりファゴソーム
となる、エンドソームの形成により特徴付けられる。
当業界で知られる、拒絶反応関連症状を評価する、検討する、解析する、測定する、定
量する、決定する任意の方法は、請求項に係る組成物および方法と共に用いられ得る。拒
絶反応関連症状を解析する方法には、血小板計算を伴うCBC、凝固研究、肝臓機能検査
、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査、標準的診断基準、免疫学的方法、ウエス
タンブロット、免疫ブロット、顕微鏡、共焦点顕微鏡、透過型電子顕微鏡、IgG結合ア
ッセイ、IgM結合アッセイ、発現アッセイ、クレアチニンアッセイおよびファゴソーム
単離などの実験的評価が含まれるが、これらに限定されない。
量する、決定する任意の方法は、請求項に係る組成物および方法と共に用いられ得る。拒
絶反応関連症状を解析する方法には、血小板計算を伴うCBC、凝固研究、肝臓機能検査
、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査、標準的診断基準、免疫学的方法、ウエス
タンブロット、免疫ブロット、顕微鏡、共焦点顕微鏡、透過型電子顕微鏡、IgG結合ア
ッセイ、IgM結合アッセイ、発現アッセイ、クレアチニンアッセイおよびファゴソーム
単離などの実験的評価が含まれるが、これらに限定されない。
遺伝子産物の発現は、遺伝子産物の発現全体が減少した場合、改変されたサイズの遺伝
子産物が生産された場合、または遺伝子産物が変化した機能性を示す場合に減少する。従
って、遺伝子が野生型の量の産物を発現しているが、該産物が酵素活性変化、サイズ変化
、細胞局在パターン変化、受容体-リガンド結合変化、または他の活性変化を有する場合
、その遺伝子産物の発現は減少していると考えられる。発現は、RT-PCR、ウエスタ
ンブロット、ノーザンブロット、マイクロアレイ解析、免疫沈降、放射線学的アッセイ、
ポリペプチド精製、分光光度分析、アクリルアミドゲルのクーマシー染色、ELISA、
2次元ゲル電気泳動、インサイツハイブリダイゼーション、化学発光、銀染色、酵素試験
、ポンソーS染色、多重RT-PCR、免疫組織化学アッセイ、ラジオイムノアッセイ、
比色測定法、免疫放射定量測定法、ポジトロン断層撮影、蛍光測定アッセイ、透過性細胞
の蛍光活性化細胞選別染色、放射性免疫吸着試験、リアルタイムPCR、ハイブリダイゼ
ーションアッセイ、サンドイッチ免疫測定法、フローサイトメトリー、SAGE、差動増
幅または電子解析を含むがこれらに限定されない、当業界で知られる任意の方法により解
析され得る。発現は、直接的または間接的に解析され得る。間接的発現解析には、酵素に
より触媒される産物のレベルを解析して、酵素の発現を評価することが含まれ得るが、こ
れに限定されない。例えば、Ausubel et al, eds (2013) Current Protocols in Molecul
ar Biology, Wiley-Interscience, New York, N.Y. and Coligan et al (2013) Current
Protocols in Protein Science, Wiley-Interscience New York, NYを参照されたい。ブ
タのASGR1の遺伝子発現アッセイが市販されている(Applied Biosystems商標, Carls
bad CA)。
子産物が生産された場合、または遺伝子産物が変化した機能性を示す場合に減少する。従
って、遺伝子が野生型の量の産物を発現しているが、該産物が酵素活性変化、サイズ変化
、細胞局在パターン変化、受容体-リガンド結合変化、または他の活性変化を有する場合
、その遺伝子産物の発現は減少していると考えられる。発現は、RT-PCR、ウエスタ
ンブロット、ノーザンブロット、マイクロアレイ解析、免疫沈降、放射線学的アッセイ、
ポリペプチド精製、分光光度分析、アクリルアミドゲルのクーマシー染色、ELISA、
2次元ゲル電気泳動、インサイツハイブリダイゼーション、化学発光、銀染色、酵素試験
、ポンソーS染色、多重RT-PCR、免疫組織化学アッセイ、ラジオイムノアッセイ、
比色測定法、免疫放射定量測定法、ポジトロン断層撮影、蛍光測定アッセイ、透過性細胞
の蛍光活性化細胞選別染色、放射性免疫吸着試験、リアルタイムPCR、ハイブリダイゼ
ーションアッセイ、サンドイッチ免疫測定法、フローサイトメトリー、SAGE、差動増
幅または電子解析を含むがこれらに限定されない、当業界で知られる任意の方法により解
析され得る。発現は、直接的または間接的に解析され得る。間接的発現解析には、酵素に
より触媒される産物のレベルを解析して、酵素の発現を評価することが含まれ得るが、こ
れに限定されない。例えば、Ausubel et al, eds (2013) Current Protocols in Molecul
ar Biology, Wiley-Interscience, New York, N.Y. and Coligan et al (2013) Current
Protocols in Protein Science, Wiley-Interscience New York, NYを参照されたい。ブ
タのASGR1の遺伝子発現アッセイが市販されている(Applied Biosystems商標, Carls
bad CA)。
「~と比較して」は、何かを同様だが異なるものと比較すること、例えば、トランスジ
ェニックブタによる実験から得られたデータポイントを、野生型ブタによる同様の実験か
ら得られたデータポイントと比較することを包含することを意図している。単語「比較す
る」は、比較しているものの間の類似点または相違点を見出すために、特徴、質、値、量
、または割合を調べることを包含する。比較することは、比較しているものにおける有意
差を明らかにし得る。「有意差」は、トランスジェニックブタ由来の物質および野生型ブ
タ由来の物質についての結果などの、複数の群について得られた結果における統計的に有
意な差を意図している。一般的に、統計的有意差は、限定されないが、スチューデントt
検定、カイ二乗、片側t検定、両側t検定、ANOVA、ダネットの事後検定、フィッシ
ャー検定およびz検定などの統計的有意差検定により評価される。2つの結果の間の有意
差は、p<0.1、p<0.05、p<0.04、p<0.03、p<0.02、p<0
.01以上を有する結果であり得る。
ェニックブタによる実験から得られたデータポイントを、野生型ブタによる同様の実験か
ら得られたデータポイントと比較することを包含することを意図している。単語「比較す
る」は、比較しているものの間の類似点または相違点を見出すために、特徴、質、値、量
、または割合を調べることを包含する。比較することは、比較しているものにおける有意
差を明らかにし得る。「有意差」は、トランスジェニックブタ由来の物質および野生型ブ
タ由来の物質についての結果などの、複数の群について得られた結果における統計的に有
意な差を意図している。一般的に、統計的有意差は、限定されないが、スチューデントt
検定、カイ二乗、片側t検定、両側t検定、ANOVA、ダネットの事後検定、フィッシ
ャー検定およびz検定などの統計的有意差検定により評価される。2つの結果の間の有意
差は、p<0.1、p<0.05、p<0.04、p<0.03、p<0.02、p<0
.01以上を有する結果であり得る。
単語「単離された」は、別のエンティティーまたはグループから物理的に分離されたエ
ンティティーを包含することを意図する。単離細胞は、別の細胞グループから物理的に分
離されている。細胞グループの例には、成長中の細胞塊、細胞培養液、細胞株、組織、お
よび動物が含まれるが、これらに限定されない。単語「単離する」は、別のエンティティ
ーまたはグループから物理的にエンティティーを分離することを包含することを意図する
。例には、他の細胞からある細胞を物理的に分離すること、細胞の残部から細胞構成成分
を物理的に分離すること、および動物から組織または臓器を物理的に分離することが含ま
れる。単離細胞または細胞構成成分は、他の天然の細胞または細胞構成成分から10%、
15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、
65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、
99%、最大100%で分離される。1つ以上の細胞を、別の細胞グループから単離する
方法は、当業界で知られている。例えば、Freshney (ED) Culture of Animal Cells: a m
anual of basic techniques (3rd Ed.) 1994、 Wiley-Liss; Spector et al (Eds)(1998)
Cells: a Laboratory Manual (vol.1) Cold Spring Harbor Laboratory Press and Darl
ing et al (1994) Animal Cells: culture and media John Wiley & Sonsを参照された
い。動物から組織または臓器を単離する方法は当業界で知られており、単離される組織ま
たは臓器、および組織または臓器を移植する所望の方法によって変わる。動物またはサン
プルから輸血製剤を単離する方法は、当業界で知られており、所望の輸血製剤によって変
わる。これらの方法には、遠心分離、透析、溶出、アフェレーシスおよび寒冷沈降反応が
含まれるが、これらに限定されない。
ンティティーを包含することを意図する。単離細胞は、別の細胞グループから物理的に分
離されている。細胞グループの例には、成長中の細胞塊、細胞培養液、細胞株、組織、お
よび動物が含まれるが、これらに限定されない。単語「単離する」は、別のエンティティ
ーまたはグループから物理的にエンティティーを分離することを包含することを意図する
。例には、他の細胞からある細胞を物理的に分離すること、細胞の残部から細胞構成成分
を物理的に分離すること、および動物から組織または臓器を物理的に分離することが含ま
れる。単離細胞または細胞構成成分は、他の天然の細胞または細胞構成成分から10%、
15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、
65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、
99%、最大100%で分離される。1つ以上の細胞を、別の細胞グループから単離する
方法は、当業界で知られている。例えば、Freshney (ED) Culture of Animal Cells: a m
anual of basic techniques (3rd Ed.) 1994、 Wiley-Liss; Spector et al (Eds)(1998)
Cells: a Laboratory Manual (vol.1) Cold Spring Harbor Laboratory Press and Darl
ing et al (1994) Animal Cells: culture and media John Wiley & Sonsを参照された
い。動物から組織または臓器を単離する方法は当業界で知られており、単離される組織ま
たは臓器、および組織または臓器を移植する所望の方法によって変わる。動物またはサン
プルから輸血製剤を単離する方法は、当業界で知られており、所望の輸血製剤によって変
わる。これらの方法には、遠心分離、透析、溶出、アフェレーシスおよび寒冷沈降反応が
含まれるが、これらに限定されない。
「皮膚関連物」は、皮膚から単離された物、および皮膚と共に用いることが意図される
物を包含する。皮膚または他の組織から単離された皮膚関連物は、皮膚と共に用いられる
前に修飾されてよい。皮膚関連物には、交換用ドレッシング材、熱傷被覆、皮膚産物、置
換真皮、皮膚線維芽細胞、コラーゲン、コンドロイチン、結合組織、角化細胞、セルフリ
ーの異種真皮、セルフリーのブタ真皮、複合皮膚代替、および表皮並びに一時的創傷被覆
が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Matou-Kovd et al (1994) Ann Med Burn
Club 7:143を参照されたい(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
物を包含する。皮膚または他の組織から単離された皮膚関連物は、皮膚と共に用いられる
前に修飾されてよい。皮膚関連物には、交換用ドレッシング材、熱傷被覆、皮膚産物、置
換真皮、皮膚線維芽細胞、コラーゲン、コンドロイチン、結合組織、角化細胞、セルフリ
ーの異種真皮、セルフリーのブタ真皮、複合皮膚代替、および表皮並びに一時的創傷被覆
が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Matou-Kovd et al (1994) Ann Med Burn
Club 7:143を参照されたい(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
皮膚関連物の付着期間は、皮膚関連物のヒト対象への適用と、皮膚関連物のヒト対象か
らの自然な分離との間の時間である。ヒト対象の皮膚創傷が塞がれている場合、皮膚関連
物は自然な分離または機械的分離で除去され得る。しかしながら、皮膚関連物のヒト対象
からの自然な分離は、早期に起こり得る。早期の自然な分離は、医師が分離を望む前に起
こる。例示を目的とし、限定を目的としないが、早期の自然な分離は、創傷が塞がれる前
に起こり得る。早期の自然な分離はまた、「脱落(sloughing)」、「剥落(shedding)
」、または「剥離(flaking)」と呼ばれ得る。早期の自然な分離の臨床管理には、皮膚
関連物の再適用、ドレッシング材の適用、包帯の適用、抗生物質の投与、および輸液の投
与を含み得る。皮膚創傷は、対象の皮膚の成長、および皮膚移植を含むがこれらに限定さ
れない、当業界で知られる任意の方法により塞がれ得る。早期分離の低減には、分離を医
師が望む前の皮膚関連物の自然な分離の減少、低下、頻度の低下、減退、量の減少が包含
される。早期分離の低減は、野生型のブタから得られる皮膚関連物と比較した、完全な早
期分離の事象の減少、部分的な早期分離の事象の減少、および部分的な早期分離における
皮膚関連物のより小さな部分の関与に関連し得る。目的の皮膚関連物の適用はまた、付着
期間の増加、伸長、改善、延長、または拡張を示し得る。本願の皮膚関連物の使用は、付
着期間を増加させ得る。
らの自然な分離との間の時間である。ヒト対象の皮膚創傷が塞がれている場合、皮膚関連
物は自然な分離または機械的分離で除去され得る。しかしながら、皮膚関連物のヒト対象
からの自然な分離は、早期に起こり得る。早期の自然な分離は、医師が分離を望む前に起
こる。例示を目的とし、限定を目的としないが、早期の自然な分離は、創傷が塞がれる前
に起こり得る。早期の自然な分離はまた、「脱落(sloughing)」、「剥落(shedding)
」、または「剥離(flaking)」と呼ばれ得る。早期の自然な分離の臨床管理には、皮膚
関連物の再適用、ドレッシング材の適用、包帯の適用、抗生物質の投与、および輸液の投
与を含み得る。皮膚創傷は、対象の皮膚の成長、および皮膚移植を含むがこれらに限定さ
れない、当業界で知られる任意の方法により塞がれ得る。早期分離の低減には、分離を医
師が望む前の皮膚関連物の自然な分離の減少、低下、頻度の低下、減退、量の減少が包含
される。早期分離の低減は、野生型のブタから得られる皮膚関連物と比較した、完全な早
期分離の事象の減少、部分的な早期分離の事象の減少、および部分的な早期分離における
皮膚関連物のより小さな部分の関与に関連し得る。目的の皮膚関連物の適用はまた、付着
期間の増加、伸長、改善、延長、または拡張を示し得る。本願の皮膚関連物の使用は、付
着期間を増加させ得る。
皮膚創傷には、開放創、熱傷、裂傷、潰瘍、下腿潰瘍、足部潰瘍、メラノーマ除去、癌
除去、形成手術、および咬傷を含むがこれらに限定されない、外皮への任意の損傷が包含
される。
除去、形成手術、および咬傷を含むがこれらに限定されない、外皮への任意の損傷が包含
される。
「外科的に取り付ける」は、当業界で知られる任意の外科的な方法により、連結するこ
と、結合させること、合体させること、取り付けること、固定すること、繋げること、連
結すること、または結びつけることを意図している。
と、結合させること、合体させること、取り付けること、固定すること、繋げること、連
結すること、または結びつけることを意図している。
ある実施形態において、本出願は、αGal、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子
の発現が減少した、複数ノックアウトしたブタ動物由来の、輸血に好適な非ヒト物質を提
供する。輸血に好適なこれらの物質には、血液、全血、血漿、血清、赤血球、血小板、お
よび白血球細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。これらの物質は、単離、濃縮ま
たは精製され得る。輸血に好適な物質を単離、濃縮、または精製する方法は、当業界で知
られている。血清学的に、ブタの赤血球(RBC)は、ヒトRBCと多くの共通した特徴
を有するPond W.G, Houpt K.A, The Biology of the Pig Ithaca: Comstock Pub. Associ
ates, 1978 and Jandl, J. H. Blood: Textbook of Hematology, Boston:Little, Brown,
1996)。他の哺乳動物のように、ブタにおける赤血球生成の主要な部位は骨髄である。p
RBCは、直径およそ4-8ミクロンの、両凹面の円盤である。ブタ血液のヘマトクリッ
ト値は35-47%であり、ヘモグロビン濃度は6-17g/100mlである。pRB
Cの半減期は、ヒトRBCの60日と比較して、およそ40日である。
の発現が減少した、複数ノックアウトしたブタ動物由来の、輸血に好適な非ヒト物質を提
供する。輸血に好適なこれらの物質には、血液、全血、血漿、血清、赤血球、血小板、お
よび白血球細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。これらの物質は、単離、濃縮ま
たは精製され得る。輸血に好適な物質を単離、濃縮、または精製する方法は、当業界で知
られている。血清学的に、ブタの赤血球(RBC)は、ヒトRBCと多くの共通した特徴
を有するPond W.G, Houpt K.A, The Biology of the Pig Ithaca: Comstock Pub. Associ
ates, 1978 and Jandl, J. H. Blood: Textbook of Hematology, Boston:Little, Brown,
1996)。他の哺乳動物のように、ブタにおける赤血球生成の主要な部位は骨髄である。p
RBCは、直径およそ4-8ミクロンの、両凹面の円盤である。ブタ血液のヘマトクリッ
ト値は35-47%であり、ヘモグロビン濃度は6-17g/100mlである。pRB
Cの半減期は、ヒトRBCの60日と比較して、およそ40日である。
これまでに15のブタ式血液型が同定されている。最も重要で、よく研究されているの
はA-O(H)であり、ヒトのABO式血液型に密接に関連している。pRBC上のAお
よびO抗原は、ヒトのルイス抗原と同様のメカニズムで、循環血漿スフィンゴ糖脂質から
受動的に吸着される(Marcus, D.M. & Cass, L.E. (1969) Science 164:553-555)。pRB
C表現型の解析は、完全に信頼できるものではない。ブタの表現型解析は、抗Aモノクロ
ーナル抗体 (mAb)(血液バンクで用いられる)および抗Hレクチン抗体(Ulex europaeus)
による、頬側の上皮細胞の免疫組織化学染色によって、達成され得る(Villarroya H et a
l 1990 Autoimmunity 6:47-60)。血液型Aを有する糖脂質が、ブタの胃粘膜、上皮細胞お
よび赤血球から単離されている。pRBCに由来する特徴がはっきりしたいくつかのタン
パク質の中で、ブタのヘモグロビンは、ヒト対応物と85%の配列同一性を共有し、2.
8Åの分解能で同様の三次元構造を示す。たいていの組織細胞とは異なり、ブタのRBC
は核を有さず、それゆえ、限定されないが、ブタ内在性レトルトウイルス(PERV)な
どのレトロウイルスを抱える可能性は低い。pRBCはまた、細胞内オルガネラを欠き、
インビボにおいて比較的半減期が短い。
はA-O(H)であり、ヒトのABO式血液型に密接に関連している。pRBC上のAお
よびO抗原は、ヒトのルイス抗原と同様のメカニズムで、循環血漿スフィンゴ糖脂質から
受動的に吸着される(Marcus, D.M. & Cass, L.E. (1969) Science 164:553-555)。pRB
C表現型の解析は、完全に信頼できるものではない。ブタの表現型解析は、抗Aモノクロ
ーナル抗体 (mAb)(血液バンクで用いられる)および抗Hレクチン抗体(Ulex europaeus)
による、頬側の上皮細胞の免疫組織化学染色によって、達成され得る(Villarroya H et a
l 1990 Autoimmunity 6:47-60)。血液型Aを有する糖脂質が、ブタの胃粘膜、上皮細胞お
よび赤血球から単離されている。pRBCに由来する特徴がはっきりしたいくつかのタン
パク質の中で、ブタのヘモグロビンは、ヒト対応物と85%の配列同一性を共有し、2.
8Åの分解能で同様の三次元構造を示す。たいていの組織細胞とは異なり、ブタのRBC
は核を有さず、それゆえ、限定されないが、ブタ内在性レトルトウイルス(PERV)な
どのレトロウイルスを抱える可能性は低い。pRBCはまた、細胞内オルガネラを欠き、
インビボにおいて比較的半減期が短い。
以下の実施例は、例示的な目的のみに提示されたものであり、本発明の範囲を限定する
ことを決して意図していない。実際に、本明細書に示された、および記載されたものに加
えて様々な改変が、先の記述および以下の実施例から当業者に明らかになっているであろ
うし、添付の特許請求の範囲の範囲内に入るだろう。
ことを決して意図していない。実際に、本明細書に示された、および記載されたものに加
えて様々な改変が、先の記述および以下の実施例から当業者に明らかになっているであろ
うし、添付の特許請求の範囲の範囲内に入るだろう。
実施例1.標的であるCMAH、GGTA1およびβ4GalNT2領域のDNAシーケ
ンシング解析
クローンブタ由来のゲノムDNAを、GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を用いて抽出した。CMAH、GGTA1およびβ4G
alNT2 Crispr/Cas9標的領域のPCR増幅を行った。標的CMAH、G
GTA1およびβ4GalNT2領域の配列決定をするために、プライマーを用いた。
ンシング解析
クローンブタ由来のゲノムDNAを、GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を用いて抽出した。CMAH、GGTA1およびβ4G
alNT2 Crispr/Cas9標的領域のPCR増幅を行った。標的CMAH、G
GTA1およびβ4GalNT2領域の配列決定をするために、プライマーを用いた。
Pwo Master (Roche, Indianapolis IN)を使用し、Pwo SuperYield DNA ポリメラーゼ、
dNTPack (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)を使用した。GGTA1のPCR
条件は、以下の通りであった:94℃、2分;94℃、15秒、54℃、30秒、および
72℃、45秒を15サイクル;94℃、15秒、54℃、30秒、72℃、45秒、各
サイクルさらに5秒を25サイクル;および72℃5分の最後の伸長ステップ。CMAH
に対しては、94℃、2分;94℃、15秒、56℃、30秒および72℃、45秒を1
5サイクル;94℃、15秒、56℃、30秒、72℃、45秒、各サイクルさらに5秒
を25サイクル;および72℃5分の最後の伸長ステップ。β4GALNT2に対しては
、94℃、2分;94℃、15秒、62℃、30秒、72℃、40秒を15サイクル、9
4℃15秒、62℃、30秒、72℃40秒、各サイクルさらに5秒を25サイクル;お
よび72℃5分の最後の伸長ステップ。PCR産物は、1%アガロースゲル上で分離し、
GenElute Gel Extraction Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で精製した。PCR産物
を、特定の塩基配列決定用プライマー、GGTA1に対しては5’ CCTTAGTATCCTTCCCAACC
CAGAC 3’ (配列番号5);CMAHに対しては5’ CATTTTCTTCGGAGTTGAGGGC 3’ (配列番
号6);β4GALNT2に対しては5’ AAAGCCACAGGAGGAGCCAG 3’ (配列番号7)により、
サンガー法(DNA Sequencing Core Facility, Indiana University School of Medicine)
で配列決定した。変異が検出されると、PCR産物をpCR4blunt-TOPOベク
ターへ挿入し、大腸菌に形質転換した。個々の遺伝子のそれぞれの対立遺伝子における変
異をさらに調べるために、個々のクローンを再度配列決定した。
dNTPack (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)を使用した。GGTA1のPCR
条件は、以下の通りであった:94℃、2分;94℃、15秒、54℃、30秒、および
72℃、45秒を15サイクル;94℃、15秒、54℃、30秒、72℃、45秒、各
サイクルさらに5秒を25サイクル;および72℃5分の最後の伸長ステップ。CMAH
に対しては、94℃、2分;94℃、15秒、56℃、30秒および72℃、45秒を1
5サイクル;94℃、15秒、56℃、30秒、72℃、45秒、各サイクルさらに5秒
を25サイクル;および72℃5分の最後の伸長ステップ。β4GALNT2に対しては
、94℃、2分;94℃、15秒、62℃、30秒、72℃、40秒を15サイクル、9
4℃15秒、62℃、30秒、72℃40秒、各サイクルさらに5秒を25サイクル;お
よび72℃5分の最後の伸長ステップ。PCR産物は、1%アガロースゲル上で分離し、
GenElute Gel Extraction Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で精製した。PCR産物
を、特定の塩基配列決定用プライマー、GGTA1に対しては5’ CCTTAGTATCCTTCCCAACC
CAGAC 3’ (配列番号5);CMAHに対しては5’ CATTTTCTTCGGAGTTGAGGGC 3’ (配列番
号6);β4GALNT2に対しては5’ AAAGCCACAGGAGGAGCCAG 3’ (配列番号7)により、
サンガー法(DNA Sequencing Core Facility, Indiana University School of Medicine)
で配列決定した。変異が検出されると、PCR産物をpCR4blunt-TOPOベク
ターへ挿入し、大腸菌に形質転換した。個々の遺伝子のそれぞれの対立遺伝子における変
異をさらに調べるために、個々のクローンを再度配列決定した。
例示的なDNA配列解析の結果を、図1のパネルA-Cに要約した。DNA配列解析に
より、少なくとも1匹のブタにおける両対立遺伝子のGGTA1およびCMAH遺伝子の
改変が確認された。配列解析により、GGTA1標的領域における、重複する5つおよび
7つの塩基対の欠失が示された(パネルA)。同じブタにおいて、配列解析により、一方
の対立遺伝子上の12塩基対の欠失、および、他方の対立遺伝子上の3塩基対の欠失に代
わる重複する5塩基対の置換からなるCMAH遺伝子の破壊が確認された(パネルB)。
DNA配列解析により、同じブタにおけるβ4GalNT2遺伝子配列の改変が確認され
た。β4GalNT2遺伝子配列データは、3つのバリエーションを示している;3つの
変異の存在は、β4GalNT2遺伝子が少なくとも2つの遺伝子座で生じることを示唆
し得る。β4GalNT2遺伝子の重複している領域において、1つの対立遺伝子は1塩
基対の挿入を示し、1つの対立遺伝子は5塩基対の欠失を示し、1つの対立遺伝子は12
塩基対の欠失/1塩基対の置換を示す。野生型β4GalNT2配列の根拠は発見されな
かった(パネルC)。図13は、さらなるトリプルノックアウトブタ単離物のDNA配列
解析を要約するものである。
より、少なくとも1匹のブタにおける両対立遺伝子のGGTA1およびCMAH遺伝子の
改変が確認された。配列解析により、GGTA1標的領域における、重複する5つおよび
7つの塩基対の欠失が示された(パネルA)。同じブタにおいて、配列解析により、一方
の対立遺伝子上の12塩基対の欠失、および、他方の対立遺伝子上の3塩基対の欠失に代
わる重複する5塩基対の置換からなるCMAH遺伝子の破壊が確認された(パネルB)。
DNA配列解析により、同じブタにおけるβ4GalNT2遺伝子配列の改変が確認され
た。β4GalNT2遺伝子配列データは、3つのバリエーションを示している;3つの
変異の存在は、β4GalNT2遺伝子が少なくとも2つの遺伝子座で生じることを示唆
し得る。β4GalNT2遺伝子の重複している領域において、1つの対立遺伝子は1塩
基対の挿入を示し、1つの対立遺伝子は5塩基対の欠失を示し、1つの対立遺伝子は12
塩基対の欠失/1塩基対の置換を示す。野生型β4GalNT2配列の根拠は発見されな
かった(パネルC)。図13は、さらなるトリプルノックアウトブタ単離物のDNA配列
解析を要約するものである。
実施例2.ノックアウトブタ(トリプルトランスジェニックブタ)の生産
gRNA発現を進めるためのPX330プラスミドへのオリゴアニーリングおよびクロ
ーニングを、Addgeneプラスミド42230 [http://www.addgene.org/42230 and 20]を用いて
行った。標的遺伝子のためのオリゴペアは、GGTA1(NCB1 Accession:XM_005660398.1
)、 5’CACCGAGAGAAAATAATGAATGTCAA-3’ フォワード) (配列番号8)、 5’AAATTGACATTCA
TTATTTTCTC-3’ (リバース) (配列番号9); CMAH (NCBI Accession: NM_001113015.1)
5’-CACCGAGTAAGGTACGTGATCTGT-3’ (フォワード) (配列番号10)、 5’-AAACACAGATCACG
TACCTTACTC-3’ (リバース) (配列番号11; β4GalNT2 (NCBI Accession: NM_0012
44330.1) 5’-CACCGTGTATCGAGGAACACGCTT-3’ (フォワード) (配列番号12)、 5’-AAACAA
GCGTGTTCCTCGATACAC-3’ (リバース) (配列番号13)である。
gRNA発現を進めるためのPX330プラスミドへのオリゴアニーリングおよびクロ
ーニングを、Addgeneプラスミド42230 [http://www.addgene.org/42230 and 20]を用いて
行った。標的遺伝子のためのオリゴペアは、GGTA1(NCB1 Accession:XM_005660398.1
)、 5’CACCGAGAGAAAATAATGAATGTCAA-3’ フォワード) (配列番号8)、 5’AAATTGACATTCA
TTATTTTCTC-3’ (リバース) (配列番号9); CMAH (NCBI Accession: NM_001113015.1)
5’-CACCGAGTAAGGTACGTGATCTGT-3’ (フォワード) (配列番号10)、 5’-AAACACAGATCACG
TACCTTACTC-3’ (リバース) (配列番号11; β4GalNT2 (NCBI Accession: NM_0012
44330.1) 5’-CACCGTGTATCGAGGAACACGCTT-3’ (フォワード) (配列番号12)、 5’-AAACAA
GCGTGTTCCTCGATACAC-3’ (リバース) (配列番号13)である。
肝臓由来細胞、3つのgRNA/Cas9プラスミド全てで同時導入した。48時間後
、α-Galヌル細胞を単離するために、処理した細胞をIB4レクチンカラムに通過さ
せた。2,000,000個のα-Galネガティブ細胞を、さらに0.5%BSAを伴
う500μlHBSS中の2μg/mlのフルオレセイン標識ドリコスビフロラスアグル
チニン(DBA)-FITC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)で染色し、
BD FACSARia sorter (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)を用いて、DBA-ネガティ
ブ細胞をフロー選別した。CMAH遺伝子機能の指標である、Neu5Gcの存在は、体
細胞核移植の前に、解析しなかった。
、α-Galヌル細胞を単離するために、処理した細胞をIB4レクチンカラムに通過さ
せた。2,000,000個のα-Galネガティブ細胞を、さらに0.5%BSAを伴
う500μlHBSS中の2μg/mlのフルオレセイン標識ドリコスビフロラスアグル
チニン(DBA)-FITC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)で染色し、
BD FACSARia sorter (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)を用いて、DBA-ネガティ
ブ細胞をフロー選別した。CMAH遺伝子機能の指標である、Neu5Gcの存在は、体
細胞核移植の前に、解析しなかった。
体細胞核移植(SCNT)は、インビトロの成熟卵母細胞を用いて行った(DeSoto Bioscien
ces Inc., St. Seymour TN and Minitube of America (Mount Horeb WI)。卵丘細胞を0
.1%ヒアルロニダーゼ中でのピペッティングにより卵母細胞から除去した。正常な形態
および可視極体を有する卵母細胞を選択して、操作培地で培養した(5μg/mlビスベ
ンズイミドおよび7.5μg/mlサイトカラシンBを含む、5%ウシ胎児血清(FBS
)を伴うカルシウムフリーNCSU-23で15分間)。この培養期間に続いて、第一極
体および減数第二分裂中期プレートを除去するために、卵母細胞を除核した。トリプルト
ランスジェニックブタのため、部位標的の、IB4対抗選択された、DBAネガティブ肝
臓由来細胞(LDC)の単一細胞を、各除核された卵母細胞に注入した。部位標的の、I
B4対抗選択された、DBAネガティブ肝臓由来細胞から作製されたトリプルノックアウ
トブタ中絶胎児から取得した胎仔線維芽細胞のSCNTから、いくつかのトリプルトラン
スジェニックブタを生育させた。電気的融合は、BTXエレクトロポレーター(Harvard A
pparatus, Holliston MA)で誘導した。様々な例において、細胞を注入した除核された卵
母細胞(一対)を、280mMマンニトール、0.001mMCaCl2および0.05
mMMgCl2中での140V、50μsの、または、280mMマンニトール、0.1
mMCaCl2、および0.05mMMgCl2中での180V、50μsの2つのDC
パルスに曝露した。活性化の後、卵母細胞を、0.4%ウシ血清アルブミン(BSA)を
有するNCSU-23培地中に置き、38.5℃、5%CO2の加湿環境下で、1時間未
満培養した。活性化後1時間以内に、卵母細胞をレシピエントブタに移した。レシピエン
トブタは、発情期の初日に同期化された西洋ブタ(occidental pig)であった。胚移植後
25日目または26日目に、超音波により妊娠を確認した。
ces Inc., St. Seymour TN and Minitube of America (Mount Horeb WI)。卵丘細胞を0
.1%ヒアルロニダーゼ中でのピペッティングにより卵母細胞から除去した。正常な形態
および可視極体を有する卵母細胞を選択して、操作培地で培養した(5μg/mlビスベ
ンズイミドおよび7.5μg/mlサイトカラシンBを含む、5%ウシ胎児血清(FBS
)を伴うカルシウムフリーNCSU-23で15分間)。この培養期間に続いて、第一極
体および減数第二分裂中期プレートを除去するために、卵母細胞を除核した。トリプルト
ランスジェニックブタのため、部位標的の、IB4対抗選択された、DBAネガティブ肝
臓由来細胞(LDC)の単一細胞を、各除核された卵母細胞に注入した。部位標的の、I
B4対抗選択された、DBAネガティブ肝臓由来細胞から作製されたトリプルノックアウ
トブタ中絶胎児から取得した胎仔線維芽細胞のSCNTから、いくつかのトリプルトラン
スジェニックブタを生育させた。電気的融合は、BTXエレクトロポレーター(Harvard A
pparatus, Holliston MA)で誘導した。様々な例において、細胞を注入した除核された卵
母細胞(一対)を、280mMマンニトール、0.001mMCaCl2および0.05
mMMgCl2中での140V、50μsの、または、280mMマンニトール、0.1
mMCaCl2、および0.05mMMgCl2中での180V、50μsの2つのDC
パルスに曝露した。活性化の後、卵母細胞を、0.4%ウシ血清アルブミン(BSA)を
有するNCSU-23培地中に置き、38.5℃、5%CO2の加湿環境下で、1時間未
満培養した。活性化後1時間以内に、卵母細胞をレシピエントブタに移した。レシピエン
トブタは、発情期の初日に同期化された西洋ブタ(occidental pig)であった。胚移植後
25日目または26日目に、超音波により妊娠を確認した。
本研究で用いた動物は全て、Institutional Biosafety Committee (IBC)およびInstitu
tional Animal Care and Use Committee (IACUC)により承認された。
tional Animal Care and Use Committee (IACUC)により承認された。
実施例3.トリプルノックアウトのIB4対抗選択
肝臓由来細胞(LDC)を、3セットの標的コンストラクト(αGal、β4GalN
T2およびCMAH)で遺伝子導入した。細胞を、αGalに結合する物質であるIB4
で選択した。IB4対抗選択を生き延びた大きな細胞集団の細胞由来のDNAを得て、標
的遺伝子配列を評価した。IB4対抗選択を生き延びた大きな細胞集団を、妊娠ブタを作
製するために、SCNTに直接用いた。
肝臓由来細胞(LDC)を、3セットの標的コンストラクト(αGal、β4GalN
T2およびCMAH)で遺伝子導入した。細胞を、αGalに結合する物質であるIB4
で選択した。IB4対抗選択を生き延びた大きな細胞集団の細胞由来のDNAを得て、標
的遺伝子配列を評価した。IB4対抗選択を生き延びた大きな細胞集団を、妊娠ブタを作
製するために、SCNTに直接用いた。
実施例4.標的ベクターの設計
CrispRコンストラクト、ジンクフィンガーコンストラクトおよびTALENコン
ストラクトなどの標的ベクターを、好適な部位でブタのCMAH(Ensemble transcript E
NSSSCT00000001195)の配列を標的とするように設計する。ターゲティングベクターコンス
トラクトを、好適な部位でGGTA1(Ensemble transcript ENSSSCT00000006069)を標的
とするように設計する。ターゲティングベクターコンストラクトを、NCBI GeneID:100621
328およびEnsemble: ENSSSCG00000030269における好適な部位でβ4GalNT2を標的
とするように設計する。
CrispRコンストラクト、ジンクフィンガーコンストラクトおよびTALENコン
ストラクトなどの標的ベクターを、好適な部位でブタのCMAH(Ensemble transcript E
NSSSCT00000001195)の配列を標的とするように設計する。ターゲティングベクターコンス
トラクトを、好適な部位でGGTA1(Ensemble transcript ENSSSCT00000006069)を標的
とするように設計する。ターゲティングベクターコンストラクトを、NCBI GeneID:100621
328およびEnsemble: ENSSSCG00000030269における好適な部位でβ4GalNT2を標的
とするように設計する。
Ensemble transcriptに挙げられた配列の一部の逆相補であるプライマー配列を有する
CMAH Crisprコンストラクトを作製して、トリプルノックアウトブタの作製に
利用した。適切なEnsemble transcriptに挙げられた配列の一部に同一であるプライマー
配列を有するGal Crisprコンストラクトを作製して、トリプルトランスジェニ
ックブタの作製に利用した。上記に示したNCBI配列NCBI GeneID:100621328の一部に同一
であるプライマー配列を有するβ4GalNT2 Crisprコンストラクトを作製し
て、トリプルトランスジェニックブタの作製に利用した。
CMAH Crisprコンストラクトを作製して、トリプルノックアウトブタの作製に
利用した。適切なEnsemble transcriptに挙げられた配列の一部に同一であるプライマー
配列を有するGal Crisprコンストラクトを作製して、トリプルトランスジェニ
ックブタの作製に利用した。上記に示したNCBI配列NCBI GeneID:100621328の一部に同一
であるプライマー配列を有するβ4GalNT2 Crisprコンストラクトを作製し
て、トリプルトランスジェニックブタの作製に利用した。
実施例5.ヒト血清とトランスジェニックPBMCとの交差適合
トランスジェニックブタ(たとえばトリプルGGTA-1/β4GalNT2/CMA
H)および野生型のブタの全血を、静脈穿刺から、ACDに回収した。全血をPBSと1
:1で混合し、フィコールで分離した。Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)を用いて、
全血からブタの末梢血単核球(PBMC)を調製した。PBMCをフィコール層から除去
して、PBSで数回洗浄し、その後赤血球を除去する必要がある場合に溶解液で洗浄した
。PBMCを、4,000,000cells/mlでEX-CELL培地に懸濁した(ハイブリ
ドーマ細胞14610CのためのEX-Cell 610HSF-血清フリー培地)。
トランスジェニックブタ(たとえばトリプルGGTA-1/β4GalNT2/CMA
H)および野生型のブタの全血を、静脈穿刺から、ACDに回収した。全血をPBSと1
:1で混合し、フィコールで分離した。Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)を用いて、
全血からブタの末梢血単核球(PBMC)を調製した。PBMCをフィコール層から除去
して、PBSで数回洗浄し、その後赤血球を除去する必要がある場合に溶解液で洗浄した
。PBMCを、4,000,000cells/mlでEX-CELL培地に懸濁した(ハイブリ
ドーマ細胞14610CのためのEX-Cell 610HSF-血清フリー培地)。
血清は、44名の健常なヒトボランティアから取得した。25%の熱失活血清を調製し
た。25μlの熱失活血清、25μlのEX-CELL培地および50μlの懸濁細胞を
、96ウェルのV字底プレートの各ウェルに添加した。細胞を4℃で30分間培養し、そ
の後EX-CELL培地で3回洗浄した。細胞を次のように二次抗体で染色した:EX-
CELL培地中で1:250濃度のAlexa Flour 488 ヤギ抗ヒトIgG 109-546-170、E
X-CELL培地中で1:250濃度のAlexa Flour 488 ヤギ抗ヒトIgM 709-546-073
;100μlの二次抗体を添加した。細胞をピペットで懸濁した。細胞をEX-CELL
培地で1回洗浄し、EX-CELL培地中または1:1のEX-CELL培地およびFlow
Fixative Solution中(1%緩衝パラホルムアルデヒド)にてピペットで再懸濁した。Al
exa flour 488に対するチャネルFL-1ゲーティングで、フローサイトメトリー分析を
達成した。この実験の結果は図3、パネルBに示している。
た。25μlの熱失活血清、25μlのEX-CELL培地および50μlの懸濁細胞を
、96ウェルのV字底プレートの各ウェルに添加した。細胞を4℃で30分間培養し、そ
の後EX-CELL培地で3回洗浄した。細胞を次のように二次抗体で染色した:EX-
CELL培地中で1:250濃度のAlexa Flour 488 ヤギ抗ヒトIgG 109-546-170、E
X-CELL培地中で1:250濃度のAlexa Flour 488 ヤギ抗ヒトIgM 709-546-073
;100μlの二次抗体を添加した。細胞をピペットで懸濁した。細胞をEX-CELL
培地で1回洗浄し、EX-CELL培地中または1:1のEX-CELL培地およびFlow
Fixative Solution中(1%緩衝パラホルムアルデヒド)にてピペットで再懸濁した。Al
exa flour 488に対するチャネルFL-1ゲーティングで、フローサイトメトリー分析を
達成した。この実験の結果は図3、パネルBに示している。
実施例6.DBAレクチンフローサイトメトリー染色
目的のトランスジェニックブタおよび他のブタ由来の全血を、抗凝血性クエン酸デキス
トロース(ACD)中に回収した。全血をPBSと1:1で混合し、フィコールで分離し
た(Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare 17-1440-03)。カルシウム含有のフローウオッシ
ュバッファーおよび染色バッファーを得た。フローウオッシュバッファーは、微粒子を除
去するために0.45μMでフィルター濾過した、0.5%BSA IgGフリー、0.
1%アジ化ナトリウムを有するHBSS(pH7.4)であった。PBMCを2x106
cells/mlで、フローウオッシュバッファー中に再懸濁し、均一に懸濁した。氷上
で細胞を15分間ブロックした。細胞を再度、再懸濁した。100μl(2X105細胞
)を5mlのフローチューブへ添加した。DBA-フルオレセイン(2mg/mlストッ
ク)を得た。DBA-フルオレセインレクチンストックを、フローバッファーに1:10
で希釈して、最終濃度0.2μg/mlとした。DBA-フルオレセインレクチンを、1
μgDBA:1x106細胞(0.2μg/2x105細胞または1μl)の比率で細胞
に添加した。DBAレクチンおよび細胞を室温で30分間インキュベートした。細胞を、
4mlのFlow Wash HBSSで完全に洗浄した。細胞を400xgで5分間回転させ、洗浄上
清を除去した。細胞を200μlのFlow Wash HBSSに再懸濁した。さらなる洗浄を行う場
合は、同じパラメーターを利用した。必要に応じて、最後の洗浄後に、細胞をおよそ20
0μlのFlow Fixativeに、2x105細胞で固定し、解析まで4℃で保管した。フロー
サイトメトリー分析を、前方および側方錯乱に基づくゲートで行った。細胞蛍光現象は、
FL-1で回収した;10,000現象を、散乱ゲートで回収した。各細胞株について、
細胞のみおよびDBA-フルオレセインのデータの両方を回収した。IB4レクチンは、
αGal遺伝子産物により産生された、αGal結合糖質と相互作用する。HD抗体は、
CMAH遺伝子産物により産生されたNeu5Gc糖質と相互作用する。DBAレクチン
は、β4GalNT2遺伝子産物により産生された糖質構造と相互作用する。これらの実
験から得られた結果は、図3、パネルAに示している。
目的のトランスジェニックブタおよび他のブタ由来の全血を、抗凝血性クエン酸デキス
トロース(ACD)中に回収した。全血をPBSと1:1で混合し、フィコールで分離し
た(Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare 17-1440-03)。カルシウム含有のフローウオッシ
ュバッファーおよび染色バッファーを得た。フローウオッシュバッファーは、微粒子を除
去するために0.45μMでフィルター濾過した、0.5%BSA IgGフリー、0.
1%アジ化ナトリウムを有するHBSS(pH7.4)であった。PBMCを2x106
cells/mlで、フローウオッシュバッファー中に再懸濁し、均一に懸濁した。氷上
で細胞を15分間ブロックした。細胞を再度、再懸濁した。100μl(2X105細胞
)を5mlのフローチューブへ添加した。DBA-フルオレセイン(2mg/mlストッ
ク)を得た。DBA-フルオレセインレクチンストックを、フローバッファーに1:10
で希釈して、最終濃度0.2μg/mlとした。DBA-フルオレセインレクチンを、1
μgDBA:1x106細胞(0.2μg/2x105細胞または1μl)の比率で細胞
に添加した。DBAレクチンおよび細胞を室温で30分間インキュベートした。細胞を、
4mlのFlow Wash HBSSで完全に洗浄した。細胞を400xgで5分間回転させ、洗浄上
清を除去した。細胞を200μlのFlow Wash HBSSに再懸濁した。さらなる洗浄を行う場
合は、同じパラメーターを利用した。必要に応じて、最後の洗浄後に、細胞をおよそ20
0μlのFlow Fixativeに、2x105細胞で固定し、解析まで4℃で保管した。フロー
サイトメトリー分析を、前方および側方錯乱に基づくゲートで行った。細胞蛍光現象は、
FL-1で回収した;10,000現象を、散乱ゲートで回収した。各細胞株について、
細胞のみおよびDBA-フルオレセインのデータの両方を回収した。IB4レクチンは、
αGal遺伝子産物により産生された、αGal結合糖質と相互作用する。HD抗体は、
CMAH遺伝子産物により産生されたNeu5Gc糖質と相互作用する。DBAレクチン
は、β4GalNT2遺伝子産物により産生された糖質構造と相互作用する。これらの実
験から得られた結果は、図3、パネルAに示している。
実施例7.RBCに結合するIgG抗体
ヒトA血清および2つのヒトO血清およびRBCを取得した。ブタの野生型およびj/
CMAH/GALトリプルノックアウトRBCを取得した。Ficoll-Paque Plus (GE Heal
th, Uppsala Sweden)を用いて、クエン酸デキストロースチューブ(Becton Dickinson & C
o., Franklin Lakes NJ)に回収された全血から、赤血球を単離した。抗凝血剤非存在下で
全血を回収し、遠心分離して凝固物質を除去することにより、新鮮な血清を単離した。密
度分離後、RBCをPBSで3回洗浄して、室温でPBSに1:10で希釈した。RBC
に結合する抗体を決定するために、RBC(2×105細胞/ウェル)を、希釈した熱失
活ヒト血清と、30分間4℃でインキュベートし、最終血清濃度は25%であった。細胞
を、アジ化物を含むPBS中で3回洗浄して、ヤギ抗ヒトIgG Alexa Fluor 488または
ロバ抗ヒトIgM Alexa Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Wes
t Grove, PA, USA)で染色した。フローサイトメトリー分析を、Accuri C6フローサイトメ
ーターおよびCFlowソフトウエア (Accuri, Ann Arbor, MI USA)を用いて行った。RBC
ゲーティングは、前方散乱および側方散乱に基づいた。RBCへのIgG抗体結合の例示
的なフローサイトメトリー図を、図5に示している。
ヒトA血清および2つのヒトO血清およびRBCを取得した。ブタの野生型およびj/
CMAH/GALトリプルノックアウトRBCを取得した。Ficoll-Paque Plus (GE Heal
th, Uppsala Sweden)を用いて、クエン酸デキストロースチューブ(Becton Dickinson & C
o., Franklin Lakes NJ)に回収された全血から、赤血球を単離した。抗凝血剤非存在下で
全血を回収し、遠心分離して凝固物質を除去することにより、新鮮な血清を単離した。密
度分離後、RBCをPBSで3回洗浄して、室温でPBSに1:10で希釈した。RBC
に結合する抗体を決定するために、RBC(2×105細胞/ウェル)を、希釈した熱失
活ヒト血清と、30分間4℃でインキュベートし、最終血清濃度は25%であった。細胞
を、アジ化物を含むPBS中で3回洗浄して、ヤギ抗ヒトIgG Alexa Fluor 488または
ロバ抗ヒトIgM Alexa Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Wes
t Grove, PA, USA)で染色した。フローサイトメトリー分析を、Accuri C6フローサイトメ
ーターおよびCFlowソフトウエア (Accuri, Ann Arbor, MI USA)を用いて行った。RBC
ゲーティングは、前方散乱および側方散乱に基づいた。RBCへのIgG抗体結合の例示
的なフローサイトメトリー図を、図5に示している。
αGalに対しては抗体/レクチン イソレクチン Griffonia simplicifolia GS-IB4 Al
exa Fluor 647 (Invitrogen, Grand Island NY, USA)を用いて、Neu5Gcに対しては
ニワトリ抗Neu5Gc抗体キット (BioLegend, San Diego CA)を用いて、β4GalN
T2由来糖質に対してはフルオレセインドリコスビフロラスアグルチニン(DBA) (Ve
ctor Laboratories, Inc. Burlingame, CA USA)を用いて、ブタのRBC細胞表面グリカ
ンの細胞表面解析を行った。これらの一連の実験から得られた図は、図6に示している。
[Matt-実験の詳細を確認のこと。]
exa Fluor 647 (Invitrogen, Grand Island NY, USA)を用いて、Neu5Gcに対しては
ニワトリ抗Neu5Gc抗体キット (BioLegend, San Diego CA)を用いて、β4GalN
T2由来糖質に対してはフルオレセインドリコスビフロラスアグルチニン(DBA) (Ve
ctor Laboratories, Inc. Burlingame, CA USA)を用いて、ブタのRBC細胞表面グリカ
ンの細胞表面解析を行った。これらの一連の実験から得られた図は、図6に示している。
[Matt-実験の詳細を確認のこと。]
実施例8.RBCストリッピングおよび関連するフローサイトメトリー
密度分離に続いて、RBCをPBS中で3回洗浄して、50%Alsever’s 溶液中に懸
濁した。RBCを、21,300×g、二分間でペレットにした。血清容量に対する細胞
ペレット容量1:1で、血清をペレット状の細胞に添加した。血清RBC混合物を混合し
、4℃で20分間インキュベートした。細胞を、21,300×g、二分間でペレットに
し、Alsever’s 溶液で1回洗浄した。細胞を、酸性ストリッピングバッファー(pH2
.75クエン酸/リン酸塩、300mOs/kg)と混合して結合抗体を除去し、1M
Tris塩基、pH9.0(Calbiochem, LaJolla CA)で中和した。低pH処理の間に溶出
した物質を、SDS-PAGEおよびマススペクトロメトリーで解析した(以下参照)。
抗体溶出サンプルに対するフローサイトメトリー分析の適合を、2x106RBCを用い
て達成した。0.1%アジ化ナトリウムを含むEX-CELL 610-HSF血清フリ
ー培地 (Sigma, St. Louis, MO USA)中に細胞を懸濁し、25%の熱失活血清の混合液と
4℃で30分間インキュベートした。RBCを3回洗浄し、ヤギ抗ヒトIgG Alexa Flu
or 488またはロバ抗ヒトIgM Alexa Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Laboratorie
s Inc., West Grove PA、 USA) 抗体で染色した。二次抗体を、4℃で30分間RBCと
インキュベートして洗浄した。フローサイトメトリー分析はBD Accuri C6 フローサイト
メーター (Accuri, Ann Arbor, MI, USA)で達成し、ヒストグラムはFlowJo 7.6.5 (FlowJ
o LLC, Ashland OR, USA)を用いて作製した。代表的な図を図8に示している。RBCゲ
ーティングは、前方散乱および側方散乱に基づいた。代表的なゲーティングは図10に示
している。
密度分離に続いて、RBCをPBS中で3回洗浄して、50%Alsever’s 溶液中に懸
濁した。RBCを、21,300×g、二分間でペレットにした。血清容量に対する細胞
ペレット容量1:1で、血清をペレット状の細胞に添加した。血清RBC混合物を混合し
、4℃で20分間インキュベートした。細胞を、21,300×g、二分間でペレットに
し、Alsever’s 溶液で1回洗浄した。細胞を、酸性ストリッピングバッファー(pH2
.75クエン酸/リン酸塩、300mOs/kg)と混合して結合抗体を除去し、1M
Tris塩基、pH9.0(Calbiochem, LaJolla CA)で中和した。低pH処理の間に溶出
した物質を、SDS-PAGEおよびマススペクトロメトリーで解析した(以下参照)。
抗体溶出サンプルに対するフローサイトメトリー分析の適合を、2x106RBCを用い
て達成した。0.1%アジ化ナトリウムを含むEX-CELL 610-HSF血清フリ
ー培地 (Sigma, St. Louis, MO USA)中に細胞を懸濁し、25%の熱失活血清の混合液と
4℃で30分間インキュベートした。RBCを3回洗浄し、ヤギ抗ヒトIgG Alexa Flu
or 488またはロバ抗ヒトIgM Alexa Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Laboratorie
s Inc., West Grove PA、 USA) 抗体で染色した。二次抗体を、4℃で30分間RBCと
インキュベートして洗浄した。フローサイトメトリー分析はBD Accuri C6 フローサイト
メーター (Accuri, Ann Arbor, MI, USA)で達成し、ヒストグラムはFlowJo 7.6.5 (FlowJ
o LLC, Ashland OR, USA)を用いて作製した。代表的な図を図8に示している。RBCゲ
ーティングは、前方散乱および側方散乱に基づいた。代表的なゲーティングは図10に示
している。
実施例9.RBCから溶出するタンパク質のSDS-PAGEゲル解析
単一のヒト血清を、様々なRBC(野生型ブタ(W)、CMAH/GAL DKO(D
)、CMAH/GAL/β4GalNT2(T);および自家性ヒト(A))とインキュ
ベートした。上述のストリッピングの後、100μlの溶出液を900μlのアセトンに
希釈することで、中和された溶出液を沈降させ、-20℃で30分間インキュベートした
。沈降物を、20,000xg、4℃で15分間回転させた。上清を廃棄し、ペレットを
水に溶解した70%v/vエタノールで洗浄した。沈降物を、再度20,000xg、4
℃で15分間回転させた。再度上清を廃棄し、ペレットをVacufuge Plus (Eppendorf, Ha
uppauge, NY, USA)にて37℃で30分間乾燥させた。その後サンプルを、製造業者の説
明書に従い、2-メルカプトエタノール (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO、 USA)を含む
100μlの2X Laemmeli Buffer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)に溶解した。サンプ
ルをその後95℃で5分間加熱し、室温まで冷却した。各サンプル15μlを、26ウェ
ルの4-20% Stain-Free TGX ゲル(Bio-Rad)に添加し、Bio-Rad criterion システム
を用いて、200Vで42分間、変性および還元条件下で電気泳動した。電気泳動後、ゲ
ルを取り除き、100ミリリットルのG-250 Bio-Safe Coomassie Stain (Bio-Rad)で30
分間染色した。その後、ゲルを水中で脱染し、Li-Cor Classic Imager (LiCor Bioscienc
es, Lincoln, NE USA)上で700nmのレーザーを用いて画像化した。それぞれのサンプ
ルを、その後マススペクトロメトリーの準備および解析のために、ドライアイスで運んだ
。プロセスの概略図を図7のパネルAに示している;RBCから溶出した物質の代表的な
ゲルを、図7のパネルCに示している。
単一のヒト血清を、様々なRBC(野生型ブタ(W)、CMAH/GAL DKO(D
)、CMAH/GAL/β4GalNT2(T);および自家性ヒト(A))とインキュ
ベートした。上述のストリッピングの後、100μlの溶出液を900μlのアセトンに
希釈することで、中和された溶出液を沈降させ、-20℃で30分間インキュベートした
。沈降物を、20,000xg、4℃で15分間回転させた。上清を廃棄し、ペレットを
水に溶解した70%v/vエタノールで洗浄した。沈降物を、再度20,000xg、4
℃で15分間回転させた。再度上清を廃棄し、ペレットをVacufuge Plus (Eppendorf, Ha
uppauge, NY, USA)にて37℃で30分間乾燥させた。その後サンプルを、製造業者の説
明書に従い、2-メルカプトエタノール (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO、 USA)を含む
100μlの2X Laemmeli Buffer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)に溶解した。サンプ
ルをその後95℃で5分間加熱し、室温まで冷却した。各サンプル15μlを、26ウェ
ルの4-20% Stain-Free TGX ゲル(Bio-Rad)に添加し、Bio-Rad criterion システム
を用いて、200Vで42分間、変性および還元条件下で電気泳動した。電気泳動後、ゲ
ルを取り除き、100ミリリットルのG-250 Bio-Safe Coomassie Stain (Bio-Rad)で30
分間染色した。その後、ゲルを水中で脱染し、Li-Cor Classic Imager (LiCor Bioscienc
es, Lincoln, NE USA)上で700nmのレーザーを用いて画像化した。それぞれのサンプ
ルを、その後マススペクトロメトリーの準備および解析のために、ドライアイスで運んだ
。プロセスの概略図を図7のパネルAに示している;RBCから溶出した物質の代表的な
ゲルを、図7のパネルCに示している。
実施例10.RBCから溶出した免疫グロブリンのマススペクトロメトリー定量
マススペクトロメトリー解析をMSBioworks、LLCにより行った。製造業者の説明書に従
い、各サンプル50μlの分注液を、PNGase F(New England Biolabs)で処理した
。各サンプルを30分間アセトン沈殿し、続いてクライアントプロトコルごとに70%エ
タノールで、4℃にて洗浄した。結果として得られた沈殿物を乾燥させ、DTTを伴う4
0μlの1.4×LDSローディングバッファーに再懸濁した。MOPSバッファーシス
テムにおいて、4-12%ビストリスSDSPAGEゲル上に、20μlを流した。
マススペクトロメトリー解析をMSBioworks、LLCにより行った。製造業者の説明書に従
い、各サンプル50μlの分注液を、PNGase F(New England Biolabs)で処理した
。各サンプルを30分間アセトン沈殿し、続いてクライアントプロトコルごとに70%エ
タノールで、4℃にて洗浄した。結果として得られた沈殿物を乾燥させ、DTTを伴う4
0μlの1.4×LDSローディングバッファーに再懸濁した。MOPSバッファーシス
テムにおいて、4-12%ビストリスSDSPAGEゲル上に、20μlを流した。
重鎖含有領域(50kDa)を切り取り、トリプシン消化を以下のプロトコルでrobot
(ProGest, DigiLab)を用いて行った:1)25mM重炭酸アンモニウム、その後アセトニ
トリルで洗浄した。2)10mMジチオスレイトールにて60℃で還元した後、50mM
のヨードアセトアミドにて室温でアルキル化した。3)トリプシンにて37℃で4時間消
化した。4)ギ酸でクエンチして、上清をさらに処理することなく直接解析した。
(ProGest, DigiLab)を用いて行った:1)25mM重炭酸アンモニウム、その後アセトニ
トリルで洗浄した。2)10mMジチオスレイトールにて60℃で還元した後、50mM
のヨードアセトアミドにて室温でアルキル化した。3)トリプシンにて37℃で4時間消
化した。4)ギ酸でクエンチして、上清をさらに処理することなく直接解析した。
ゲル消化物を、ThermoFisher Q ExactiveにインターフェイスしたWaters NanoAcquity
HPLCシステムで、ナノLC/MS/MSにより解析した。ペプチドを、捕捉カラムに添加
し、75μmの分析カラムを350nL/minで溶出した;両カラムはJupiter Proteo
樹脂 (Phenomenex)で充填されていた。質量分析計は、データ依存モード(data-depende
nt mode)で操作し、MSおよびMS/MSはそれぞれ、70,000FWHM分解能お
よび17,500FWHM分解能でOrbitrapにおいて行った。MS/MSに対し、最も豊
富な15個のイオンを選択した。曲線下面積(AUC)を、それぞれのアイソタイプ特異
的ペプチドに対して同定して計算した。AUCの比較により、サンプル中の各抗体レベル
の定量的な評価が可能となる。代表的な図を図9に示している。質量分析により各抗体を
同定および定量するために用いられるペプチドの配列を表2に示している。
HPLCシステムで、ナノLC/MS/MSにより解析した。ペプチドを、捕捉カラムに添加
し、75μmの分析カラムを350nL/minで溶出した;両カラムはJupiter Proteo
樹脂 (Phenomenex)で充填されていた。質量分析計は、データ依存モード(data-depende
nt mode)で操作し、MSおよびMS/MSはそれぞれ、70,000FWHM分解能お
よび17,500FWHM分解能でOrbitrapにおいて行った。MS/MSに対し、最も豊
富な15個のイオンを選択した。曲線下面積(AUC)を、それぞれのアイソタイプ特異
的ペプチドに対して同定して計算した。AUCの比較により、サンプル中の各抗体レベル
の定量的な評価が可能となる。代表的な図を図9に示している。質量分析により各抗体を
同定および定量するために用いられるペプチドの配列を表2に示している。
実施例11.データ処理
データを、Mascotのローカルコピーを用いて、以下のパラメーターで検索した: Enzyme
: Tripsin、Database: Swissprot Human (forward and reverse appended with common c
ontaminants)、 Fixed modification: Carbidomethyl (C)、 Variable modifications: O
xidation (M)、 Acetyl (Protein N-term)、 Deamidation (NQ)、 Pyro-Glu (N-term Q)
。 Mass values: Monoisotopic Peptide Mass Tolerance: 10 ppm Fragment Mass Toler
ance: 0.02 Da Max Missed Cleavages: 2 Mascot DATファイルを、バリデーション、フィ
ルタリングのために、また、サンプルごとに非重複リストを作製するために、Scaffoldソ
フトウエアに組み込んで解析した。データは1%タンパク質およびペプチドレベル偽発見
率でフィルターをかけ、タンパク質あたり少なくとも2つの固有のペプチドを必要とした
。LC/MSの生データを、標的ペプチドの正確なm/z値についてチェックし、選択イ
オンのクロマトグラムをQualBrowser (Thermo)で抽出した;それぞれの場合について、ピ
ークエリアを計算した。
データを、Mascotのローカルコピーを用いて、以下のパラメーターで検索した: Enzyme
: Tripsin、Database: Swissprot Human (forward and reverse appended with common c
ontaminants)、 Fixed modification: Carbidomethyl (C)、 Variable modifications: O
xidation (M)、 Acetyl (Protein N-term)、 Deamidation (NQ)、 Pyro-Glu (N-term Q)
。 Mass values: Monoisotopic Peptide Mass Tolerance: 10 ppm Fragment Mass Toler
ance: 0.02 Da Max Missed Cleavages: 2 Mascot DATファイルを、バリデーション、フィ
ルタリングのために、また、サンプルごとに非重複リストを作製するために、Scaffoldソ
フトウエアに組み込んで解析した。データは1%タンパク質およびペプチドレベル偽発見
率でフィルターをかけ、タンパク質あたり少なくとも2つの固有のペプチドを必要とした
。LC/MSの生データを、標的ペプチドの正確なm/z値についてチェックし、選択イ
オンのクロマトグラムをQualBrowser (Thermo)で抽出した;それぞれの場合について、ピ
ークエリアを計算した。
実施例12.RBCへの抗体結合を定量化するためのマススペクトロメトリーおよびフロ
ーサイトメトリー技術の比較
蛍光二次抗体の利用、人工的マスキングの可能性、および異なるIgGアイソタイプの
報告の困難性は、フローサイトメトリーの結果に影響を与え得る。定量的マススペクトロ
メトリーは、二次試薬なしの直接ペプチド解析を可能にし得、また、個々のアイソタイプ
レベルについての情報を与え得る。マススペクトロメトリーおよびフローサイトメトリー
は、本方法における様々な固有のバイアスを反映し得る抗体結合の指標を提供する。個々
のアイソタイプレベルは、それぞれに、様々な免疫エフェクター機能に寄与し得る。血清
およびRBCを3名のヒトから回収した。各血清を、その自家性のRBC(A)およびブ
タRBC(野生型(W)またはトリプルノックアウト(T))とインキュベートした。免
疫グロブリン結合を、フローサイトメトリーおよびマススペクトロメトリーを用いて評価
した。図8のパネルAおよびBは、この実験から得られたフローサイトメトリーの図を提
供している。マススペクトロメトリー定量は、トリプルノックアウトブタ細胞(T)が、
3つの血清のうち2つで、自家性RBC(A)よりも少ないIgGに結合し、3つの血清
全てで、より少ないIgMに結合したことを示した。フローサイトメトリーおよび定量マ
ススペクトロメトリーの両方が、トリプルノックアウトブタ由来のRBCへのヒト免疫グ
ロブリンの結合レベルが低いことを示した。ヒトの血液型O型RBCの抗原性は、免疫抑
制非存在下においても体液性損傷を避ける上で十分低いために、非会はヒトの血液型O型
RBCに対して行った。
ーサイトメトリー技術の比較
蛍光二次抗体の利用、人工的マスキングの可能性、および異なるIgGアイソタイプの
報告の困難性は、フローサイトメトリーの結果に影響を与え得る。定量的マススペクトロ
メトリーは、二次試薬なしの直接ペプチド解析を可能にし得、また、個々のアイソタイプ
レベルについての情報を与え得る。マススペクトロメトリーおよびフローサイトメトリー
は、本方法における様々な固有のバイアスを反映し得る抗体結合の指標を提供する。個々
のアイソタイプレベルは、それぞれに、様々な免疫エフェクター機能に寄与し得る。血清
およびRBCを3名のヒトから回収した。各血清を、その自家性のRBC(A)およびブ
タRBC(野生型(W)またはトリプルノックアウト(T))とインキュベートした。免
疫グロブリン結合を、フローサイトメトリーおよびマススペクトロメトリーを用いて評価
した。図8のパネルAおよびBは、この実験から得られたフローサイトメトリーの図を提
供している。マススペクトロメトリー定量は、トリプルノックアウトブタ細胞(T)が、
3つの血清のうち2つで、自家性RBC(A)よりも少ないIgGに結合し、3つの血清
全てで、より少ないIgMに結合したことを示した。フローサイトメトリーおよび定量マ
ススペクトロメトリーの両方が、トリプルノックアウトブタ由来のRBCへのヒト免疫グ
ロブリンの結合レベルが低いことを示した。ヒトの血液型O型RBCの抗原性は、免疫抑
制非存在下においても体液性損傷を避ける上で十分低いために、非会はヒトの血液型O型
RBCに対して行った。
実施例13.RBCに結合する抗体のアイソタイプ解析
異なるRBCへの各アイソタイプの結合を定量化するために、AUCを用いた。GGT
A1/CMAHノックアウトRBC(D)、GGTA1/CMAH/β4GalNT2ノ
ックアウトRBC(T)および自家性ヒトRBC(A)を用いて評価を行った。血清1の
ゼロ値は、特定のアイソタイプの標的細胞への結合がないことを示す。血清2、3および
4における自家性ヒト細胞へのIgG4の結合は、10倍から16倍の範囲で増加した。
IgG2は、複数の血清において、ブタ(T)RBCと比較してヒト細胞(A)への結合
の増加を示す唯一の他のアイソタイプであったが、その増加はIgG4で見られる増加よ
りも小さかった(3~6倍の範囲、血清2、3および4参照)。これらの一連の実験の結
果は、図10に示している。
異なるRBCへの各アイソタイプの結合を定量化するために、AUCを用いた。GGT
A1/CMAHノックアウトRBC(D)、GGTA1/CMAH/β4GalNT2ノ
ックアウトRBC(T)および自家性ヒトRBC(A)を用いて評価を行った。血清1の
ゼロ値は、特定のアイソタイプの標的細胞への結合がないことを示す。血清2、3および
4における自家性ヒト細胞へのIgG4の結合は、10倍から16倍の範囲で増加した。
IgG2は、複数の血清において、ブタ(T)RBCと比較してヒト細胞(A)への結合
の増加を示す唯一の他のアイソタイプであったが、その増加はIgG4で見られる増加よ
りも小さかった(3~6倍の範囲、血清2、3および4参照)。これらの一連の実験の結
果は、図10に示している。
実施例14.様々なブタのレクチン染色
GGTA1/CMAH DKOブタ由来のブタの腎臓を、ヒストリチクム菌(Clostridi
um histolyticum)由来の、0.025%のコラゲナーゼタイプIV(Sigma, St. Louis,
MO, USA)と共に流した。一次RMECを単離して、10%のDKOブタ血清、100μg
/mlの内皮細胞特異的増殖因子、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリ
シンBを添加したRPMI培地で培養した。3日間培養後、cDNAがSV40の大きな抗原
および小さな抗原を発現するレンチウイルスベクター(Applied Biological Materials In
c, Richmond, BC, Canada)を含む、レンチウイルス上清で、24時間、ブタのRMECを
感染させた。単一細胞クローンを単離して、10継代まで増幅した。iRMECを、10
%のDKOブタ血清、100μg/mlの内皮細胞特異的増殖因子、ペニシリン、ストレ
プトマイシンを添加したRPMI培地で培養して、15-40継代内で特徴づけのために
使用した。αGal/CMAH/β4GalNT2/SLA抗原破壊iRECを得た。
GGTA1/CMAH DKOブタ由来のブタの腎臓を、ヒストリチクム菌(Clostridi
um histolyticum)由来の、0.025%のコラゲナーゼタイプIV(Sigma, St. Louis,
MO, USA)と共に流した。一次RMECを単離して、10%のDKOブタ血清、100μg
/mlの内皮細胞特異的増殖因子、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリ
シンBを添加したRPMI培地で培養した。3日間培養後、cDNAがSV40の大きな抗原
および小さな抗原を発現するレンチウイルスベクター(Applied Biological Materials In
c, Richmond, BC, Canada)を含む、レンチウイルス上清で、24時間、ブタのRMECを
感染させた。単一細胞クローンを単離して、10継代まで増幅した。iRMECを、10
%のDKOブタ血清、100μg/mlの内皮細胞特異的増殖因子、ペニシリン、ストレ
プトマイシンを添加したRPMI培地で培養して、15-40継代内で特徴づけのために
使用した。αGal/CMAH/β4GalNT2/SLA抗原破壊iRECを得た。
GGTA1/CMAH/B4GALNT2 KOブタの胸部および腹部大動脈分枝由来
の初代大動脈内皮細胞を、ヒストリチクム菌由来の0.025%コラゲナーゼタイプIV
(Sigma, St.Louis, MO, USA) 2で単離した。該AECを、GGTA1/CMAH/B4G
ALNT2 KOブタ血清、100ug/ml内皮細胞特異的増殖因子、ペニシリン、ス
トレプトマイシン、およびアンホテリシンBを添加したRPMI1640培地で培養し、
同様に、WT/GGTA1 KO AECについては10%FBSで、あるいは、GGTA
1/CMAH DKOおよびGGTA1/CMAH/B4GALNT2 AECについては
5%GGTA1/CMAH DKOブタ血清を添加した培地で培養した。これらの細胞を
5継代以内に使用した。CMAH欠損ブタの細胞は、ウシ血清からのNeu5Gcの取り
込みを妨げるため、GGTA1/CMAH DKOブタ血清において生育させた。
の初代大動脈内皮細胞を、ヒストリチクム菌由来の0.025%コラゲナーゼタイプIV
(Sigma, St.Louis, MO, USA) 2で単離した。該AECを、GGTA1/CMAH/B4G
ALNT2 KOブタ血清、100ug/ml内皮細胞特異的増殖因子、ペニシリン、ス
トレプトマイシン、およびアンホテリシンBを添加したRPMI1640培地で培養し、
同様に、WT/GGTA1 KO AECについては10%FBSで、あるいは、GGTA
1/CMAH DKOおよびGGTA1/CMAH/B4GALNT2 AECについては
5%GGTA1/CMAH DKOブタ血清を添加した培地で培養した。これらの細胞を
5継代以内に使用した。CMAH欠損ブタの細胞は、ウシ血清からのNeu5Gcの取り
込みを妨げるため、GGTA1/CMAH DKOブタ血清において生育させた。
初代AEC細胞(2×105細胞)を、フルオレセイン標識ドリコスビフロラスアグル
チニンレクチン(HBSS中で1:1000に希釈) (DBA, Vector Laboratories, Burlin
game, CA, USA)、フルオレセイン標識Artocarpus integrifoliaレクチン (HBSS中で
1:1000に希釈)(AIL, Vector Laboratories)、フルオレセイン標識Vicia villosa
レクチン (HBSS中で1:1000に希釈)(VVL, Vector Laboratories)、フルオレセ
イン標識Arachis hypogaea レクチン (HBSS中で1:1000に希釈) (PNA, Vector
Laboratories)、およびグリフォニアシンプリシフォリア(Griffonia simplicifolia)由
来のAlexa Fluor 488標識イソレクチンIB4 (HBSS中で1:1000に希釈) (Invi
trogen, Grand Island, NY, USA )を用いて染色した。Neu5GCについては、Alexa
Fluor標識抗Neu5GCまたは健常ニワトリIgY (BioLegend)により、0.5mg/
mLストックから1:5000の最終希釈比率で、細胞を染色した。細胞を30分間、4
℃で染色した。細胞をその後洗浄し、C6フローサイトメーター (BD Biosciences)を用い
て解析した。次に、蛍光強度を、レクチンの場合は無染色細胞、あるいは、Neu5GC
の場合はアイソタイプコントロールの、いずれかと比較して計算した。代表的な図は図2
に示している。
チニンレクチン(HBSS中で1:1000に希釈) (DBA, Vector Laboratories, Burlin
game, CA, USA)、フルオレセイン標識Artocarpus integrifoliaレクチン (HBSS中で
1:1000に希釈)(AIL, Vector Laboratories)、フルオレセイン標識Vicia villosa
レクチン (HBSS中で1:1000に希釈)(VVL, Vector Laboratories)、フルオレセ
イン標識Arachis hypogaea レクチン (HBSS中で1:1000に希釈) (PNA, Vector
Laboratories)、およびグリフォニアシンプリシフォリア(Griffonia simplicifolia)由
来のAlexa Fluor 488標識イソレクチンIB4 (HBSS中で1:1000に希釈) (Invi
trogen, Grand Island, NY, USA )を用いて染色した。Neu5GCについては、Alexa
Fluor標識抗Neu5GCまたは健常ニワトリIgY (BioLegend)により、0.5mg/
mLストックから1:5000の最終希釈比率で、細胞を染色した。細胞を30分間、4
℃で染色した。細胞をその後洗浄し、C6フローサイトメーター (BD Biosciences)を用い
て解析した。次に、蛍光強度を、レクチンの場合は無染色細胞、あるいは、Neu5GC
の場合はアイソタイプコントロールの、いずれかと比較して計算した。代表的な図は図2
に示している。
実施例15.PBMCの表現型解析
末梢血単核球(PBMC)をFicoll-Paque (GE Healthcare、 Uppsala、 Sweden)によ
り単離して数えた。次に、製造業者の説明書によって、Hank’s Balanced Salt Solution
(HBSS)に希釈したNeu5GCブロッキングバッファー (Biolegend、 San Diego
、 CA、 USA)にて、2x106細胞/ミリリットルの密度で細胞を再懸濁した。細胞を、
染色に先立ち、氷上で15分間インキュベートした。100マイクロリットル(2x10
5細胞)を、12x75mmのポリスチレンフロー染色チューブ(BD Biosciences、 Bedf
ord、 MA、 USA)に添加した。細胞を、1×106細胞当たり、下記1マイクログラムの
比率で染色した:フルオレセイン標識ドリコスビフロラスアグルチニンレクチン (DBA、
Vector Laboratories、 Burlingame、 CA、 USA)、フルオレセイン標識Artocarpus integ
rifolia レクチン (AIL、 Vector Laboratories)、フルオレセイン標識Vicia villosa レ
クチン (VVL、 Vector Laboratories)、フルオレセイン標識Arachis hypogaea レクチン
(PNA、 Vector Laboratories)、およびグリフォニアシンプリシフォリア(Griffonia sim
plicifolia)由来のAlexa Fluor 488 標識イソレクチン IB4 (Invitrogen、 Grand Islan
d、 NY、 USA )。Neu5GCについては、Alexa Fluor標識抗Neu5GCまたは健常
ニワトリIgY(BioLegend)により、0.5mg/mLストックから1:5000の最終
希釈比率になるよう、細胞を染色した。細胞を氷上でインキュベートしながら、30分間
染色した。次に、細胞を4ミリリットルのNeu5GCブロッキングバッファーで洗浄し
、400xgで5分間、ペレット状にした。上清を廃棄し、細胞を200マイクロリット
ルのブロッキングバッファーで再懸濁して直ちに解析した。前方散乱および側方散乱ゲー
ティング法を用いて10,000現象を回収することにより、細胞をC6フローサイトメー
ター (BD Biosciences)を用いて解析した。次に、蛍光強度を、レクチンの場合は無染色
細胞、あるいは、Neu5GCの場合はアイソタイプコントロールの、いずれかと比較し
て計算した。
末梢血単核球(PBMC)をFicoll-Paque (GE Healthcare、 Uppsala、 Sweden)によ
り単離して数えた。次に、製造業者の説明書によって、Hank’s Balanced Salt Solution
(HBSS)に希釈したNeu5GCブロッキングバッファー (Biolegend、 San Diego
、 CA、 USA)にて、2x106細胞/ミリリットルの密度で細胞を再懸濁した。細胞を、
染色に先立ち、氷上で15分間インキュベートした。100マイクロリットル(2x10
5細胞)を、12x75mmのポリスチレンフロー染色チューブ(BD Biosciences、 Bedf
ord、 MA、 USA)に添加した。細胞を、1×106細胞当たり、下記1マイクログラムの
比率で染色した:フルオレセイン標識ドリコスビフロラスアグルチニンレクチン (DBA、
Vector Laboratories、 Burlingame、 CA、 USA)、フルオレセイン標識Artocarpus integ
rifolia レクチン (AIL、 Vector Laboratories)、フルオレセイン標識Vicia villosa レ
クチン (VVL、 Vector Laboratories)、フルオレセイン標識Arachis hypogaea レクチン
(PNA、 Vector Laboratories)、およびグリフォニアシンプリシフォリア(Griffonia sim
plicifolia)由来のAlexa Fluor 488 標識イソレクチン IB4 (Invitrogen、 Grand Islan
d、 NY、 USA )。Neu5GCについては、Alexa Fluor標識抗Neu5GCまたは健常
ニワトリIgY(BioLegend)により、0.5mg/mLストックから1:5000の最終
希釈比率になるよう、細胞を染色した。細胞を氷上でインキュベートしながら、30分間
染色した。次に、細胞を4ミリリットルのNeu5GCブロッキングバッファーで洗浄し
、400xgで5分間、ペレット状にした。上清を廃棄し、細胞を200マイクロリット
ルのブロッキングバッファーで再懸濁して直ちに解析した。前方散乱および側方散乱ゲー
ティング法を用いて10,000現象を回収することにより、細胞をC6フローサイトメー
ター (BD Biosciences)を用いて解析した。次に、蛍光強度を、レクチンの場合は無染色
細胞、あるいは、Neu5GCの場合はアイソタイプコントロールの、いずれかと比較し
て計算した。
実施例16.臨床交差適合検査
トリプルトランスジェニックブタ由来のPBMCを、同種移植に利用されるヒト臨床交
差適合検査に供した。反応性抗体パネル(PRA)が0である31名のヒト対象(上図)
および、PRAスコアが80を超える19名のヒト対象(下図)から、血清を取得した。
臨床医は、通常、細胞傷害性スコア1のヒトの臓器を移植する。トランスジェニックブタ
由来のフィコール処理したPBMCを、2×106細胞/mlの細胞濃縮物に調整した。
いくつかの血清分注液をDTTで処理した。交差適合トレイを2セット準備した。血清お
よびコントロールを、交差適合トレイに添加した。該細胞調製物を完全に混合し、Hamilt
on リピーティングディスペンサーにおいてゆっくりと引き上げた。1マイクロリットル
の細胞を、照射された表示箱(view box)上の、血清を含む各ウェルに添加した。テスト
細胞は、ポジティブコントロールウェルに、最後に添加した。同じ数のトレイを、Sorval
l 遠心機の反対側のバケットに設置した。遠心機をオンにし、1000rpmに達した後
、遠心機をオフにした。トレイを照射された表示箱上で調べて、細胞小滴が血清と混合し
ていることを確認した。トレイを室温で30分間インキュベートした。すべてのトレイを
、Jet Pipetteを用いて、各ウェルに対して15μlのPBSで4回洗浄した。細胞を穏
やかに洗浄する技術を用いて、2-3分間落ち着かせた。PBS、油、および血清を除去
した。
トリプルトランスジェニックブタ由来のPBMCを、同種移植に利用されるヒト臨床交
差適合検査に供した。反応性抗体パネル(PRA)が0である31名のヒト対象(上図)
および、PRAスコアが80を超える19名のヒト対象(下図)から、血清を取得した。
臨床医は、通常、細胞傷害性スコア1のヒトの臓器を移植する。トランスジェニックブタ
由来のフィコール処理したPBMCを、2×106細胞/mlの細胞濃縮物に調整した。
いくつかの血清分注液をDTTで処理した。交差適合トレイを2セット準備した。血清お
よびコントロールを、交差適合トレイに添加した。該細胞調製物を完全に混合し、Hamilt
on リピーティングディスペンサーにおいてゆっくりと引き上げた。1マイクロリットル
の細胞を、照射された表示箱(view box)上の、血清を含む各ウェルに添加した。テスト
細胞は、ポジティブコントロールウェルに、最後に添加した。同じ数のトレイを、Sorval
l 遠心機の反対側のバケットに設置した。遠心機をオンにし、1000rpmに達した後
、遠心機をオフにした。トレイを照射された表示箱上で調べて、細胞小滴が血清と混合し
ていることを確認した。トレイを室温で30分間インキュベートした。すべてのトレイを
、Jet Pipetteを用いて、各ウェルに対して15μlのPBSで4回洗浄した。細胞を穏
やかに洗浄する技術を用いて、2-3分間落ち着かせた。PBS、油、および血清を除去
した。
実用的な希釈率のAHG/C’ Class 1混合物を調製した。一方のセットのトレ
イを、5μlのAHG/C’で処理した;他方のセットのトレイを5μlの希釈していな
いウサギ補体で処理した(AHGなしトレイ)。トレイを、場合により4分間60rpm
で、ローター上に置いた。トレイを、60分間室温でインキュベートした。細胞を5μl
のフルオロクエンチで染色して、5分間そのままにした。トレイを逆相蛍光顕微鏡に設置
した;各ウェルを160×の総合倍率を用いて評価した。
イを、5μlのAHG/C’で処理した;他方のセットのトレイを5μlの希釈していな
いウサギ補体で処理した(AHGなしトレイ)。トレイを、場合により4分間60rpm
で、ローター上に置いた。トレイを、60分間室温でインキュベートした。細胞を5μl
のフルオロクエンチで染色して、5分間そのままにした。トレイを逆相蛍光顕微鏡に設置
した;各ウェルを160×の総合倍率を用いて評価した。
各ウェルの死細胞のパーセンテージを推定した。AOは生細胞のインタクトな細胞膜を
通過し、DNAに入り込み、490nmで励起された場合に緑の蛍光(535nm)を発
する。エチジウムブロマイドで染色された死細胞は、490nmで励起された場合に赤の
蛍光(605nm)を発する。各ウェルは、以下に記載のシステムを用いてスコア付けし
た:
通過し、DNAに入り込み、490nmで励起された場合に緑の蛍光(535nm)を発
する。エチジウムブロマイドで染色された死細胞は、490nmで励起された場合に赤の
蛍光(605nm)を発する。各ウェルは、以下に記載のシステムを用いてスコア付けし
た:
これらの一連の実験の結果は、図14に示している。複数の血清が細胞傷害性スコア1
を有することに注目されたい。
を有することに注目されたい。
実施例17.エクスビボにおけるトランスジェニック肝臓へのヒト血小板の灌流
トリプルトランスジェニックGGTA1/CMAH/β4GalNT2ブタを麻酔して
、挿管する。正中線腹部切開を行う。肝臓を除去して、正常体温の条件下で灌流装置に設
置する。湿度、温度および気流が灌流装置内で維持される。灌流装置は、流速を変化させ
ることで一定の圧力を維持する。門脈を通る遠心流と、肝動脈を通る拍動流とを用いる。
両方の流速を、ブタの生理学的な血圧値にセットする。ベースの灌流溶液は、生理学的栄
養およびインスリンを有する酸素化されたリンゲル液である。
トリプルトランスジェニックGGTA1/CMAH/β4GalNT2ブタを麻酔して
、挿管する。正中線腹部切開を行う。肝臓を除去して、正常体温の条件下で灌流装置に設
置する。湿度、温度および気流が灌流装置内で維持される。灌流装置は、流速を変化させ
ることで一定の圧力を維持する。門脈を通る遠心流と、肝動脈を通る拍動流とを用いる。
両方の流速を、ブタの生理学的な血圧値にセットする。ベースの灌流溶液は、生理学的栄
養およびインスリンを有する酸素化されたリンゲル液である。
ヒト血小板を、健常なボランティア対象から得るか、単離から6日未満に商業的に購入
し、20-24℃で保管する。およそ1×1011個のヒト血小板を、抗凝血性クエン酸
デキストロース含有滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄する。血小板を、製造業者の
プロトコルに従い、CFSEで標識してよい。
し、20-24℃で保管する。およそ1×1011個のヒト血小板を、抗凝血性クエン酸
デキストロース含有滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄する。血小板を、製造業者の
プロトコルに従い、CFSEで標識してよい。
ブタ肝臓を、血小板添加に先立ち、2時間灌流する。灌流システムへの添加前と、血小
板の添加後の予め決定した時点で、血小板サンプルを得る。灌流前および灌流後のサンプ
ルにおける血小板レベルを評価する。ブタ肝臓の灌流前後の評価を行う。野生型ブタの肝
臓を得、同様の条件下で該肝臓を灌流する。
板の添加後の予め決定した時点で、血小板サンプルを得る。灌流前および灌流後のサンプ
ルにおける血小板レベルを評価する。ブタ肝臓の灌流前後の評価を行う。野生型ブタの肝
臓を得、同様の条件下で該肝臓を灌流する。
実施例18.トランスジェニック異種移植片に対する反応の評価
ブタの肝臓を、トリプルノックアウトブタ(αGal、CMAH、β4GalNT2)
から得る。肝臓を、ピギーバック法を用いて、死亡したばかりヒトの死体に外科的に移植
する。手術後、生体試料をヒトの死体から得る。拒絶反応関連反応の臨床指標をモニター
する。
ブタの肝臓を、トリプルノックアウトブタ(αGal、CMAH、β4GalNT2)
から得る。肝臓を、ピギーバック法を用いて、死亡したばかりヒトの死体に外科的に移植
する。手術後、生体試料をヒトの死体から得る。拒絶反応関連反応の臨床指標をモニター
する。
実施例19.トランスジェニック異種移植片に対する反応の評価
ブタの腎臓を、トリプルトランスジェニックブタ(αGal、CMAH、β4GalN
T2)から得る。既存の、および新規のドナー特異的抗体を管理する化合物を、高度に感
作されたヒト対象に投与する。ブタの腎臓を、該対象に外科的に移植する。手術後、ヒト
の死体から生体試料を得る。移植片拒絶反応の臨床指標をモニターする。
ブタの腎臓を、トリプルトランスジェニックブタ(αGal、CMAH、β4GalN
T2)から得る。既存の、および新規のドナー特異的抗体を管理する化合物を、高度に感
作されたヒト対象に投与する。ブタの腎臓を、該対象に外科的に移植する。手術後、ヒト
の死体から生体試料を得る。移植片拒絶反応の臨床指標をモニターする。
実施例20.共焦点顕微鏡解析
子ブタ(GGTA1、CMAH、βGalNT2トリプルノックアウト、野生型または
目的の他の子ブタ)を安楽死させる。肝臓、心臓および腎臓組織を該ブタから得る。各組
織の凍結切片を調製する。マウントした組織を、HBSS中のOdysseyブロッキングバッ
ファー (Li-Cor Biosciences、 Lincoln NE)で1時間ブロックする。該スライドを、4%
パラホルムアルデヒドで10分間固定する。組織をIB4レクチン Alexa Fluor 647 (In
vitrogen、 Grand Island NY)で染色して、Galエピトープの存在を可視化する。Ne
u5Gcエピトープを可視化するために、組織をニワトリ抗Neu5Gc抗体またはコン
トロール抗体(Sialix、 Vista CA)で1時間染色する。組織を、DBAで染色してSda
様エピトープ組織の存在を可視化し、HBSSで3回洗浄する。ロバ抗ニワトリ Dylight
649 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc、 West Grove PA)二次抗体を、およそ
1時間、該組織とインキュベートする。組織を、0.1%HBSS Tweenで3回洗
浄する。核を染色するために、DAPI染色剤(Invitrogen、 Grand Island NY)を、全ス
ライドに1分間添加後、2回の0.1%HBSS洗浄を行う。組織を、ProLong Gold (In
vitrogen、 Grand Island NY)にマウントする。共焦点顕微鏡観察を、Olympus FV1000を
用いて行う。
子ブタ(GGTA1、CMAH、βGalNT2トリプルノックアウト、野生型または
目的の他の子ブタ)を安楽死させる。肝臓、心臓および腎臓組織を該ブタから得る。各組
織の凍結切片を調製する。マウントした組織を、HBSS中のOdysseyブロッキングバッ
ファー (Li-Cor Biosciences、 Lincoln NE)で1時間ブロックする。該スライドを、4%
パラホルムアルデヒドで10分間固定する。組織をIB4レクチン Alexa Fluor 647 (In
vitrogen、 Grand Island NY)で染色して、Galエピトープの存在を可視化する。Ne
u5Gcエピトープを可視化するために、組織をニワトリ抗Neu5Gc抗体またはコン
トロール抗体(Sialix、 Vista CA)で1時間染色する。組織を、DBAで染色してSda
様エピトープ組織の存在を可視化し、HBSSで3回洗浄する。ロバ抗ニワトリ Dylight
649 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc、 West Grove PA)二次抗体を、およそ
1時間、該組織とインキュベートする。組織を、0.1%HBSS Tweenで3回洗
浄する。核を染色するために、DAPI染色剤(Invitrogen、 Grand Island NY)を、全ス
ライドに1分間添加後、2回の0.1%HBSS洗浄を行う。組織を、ProLong Gold (In
vitrogen、 Grand Island NY)にマウントする。共焦点顕微鏡観察を、Olympus FV1000を
用いて行う。
実施例21.抗体媒介性補体依存性細胞傷害
抗体媒介性補体依存性細胞傷害アッセイは、当業界で知られている。Diaz et al (Diaz
et al.、 2004 Transplant Immunology 13(4):313-317)の方法を行う。ヒト血清を、健
常なボランティアから得る。25%の熱失活血清を調製する。熱失活ヒト血清を段階的に
希釈して、各濃度100μlを、96ウェルのV字底アッセイプレートに入れる。血清を
、目的のブタ(GGTA1/CMAH/4GalNT2トリプルトランスジェニックまた
はその他)から得た100μlに分取したPBMCと混合する。PBMC最終濃度は、5
x106/mlまたは1x106/mlのいずれかである。血清濃度は、50%、17%
、2%、0.6%、0.2%、および0.07%と様々である。混合物を、4℃で30分
間インキュベートする。30分後、プレートを400xgで4分間遠心分離する。プレー
トをデカントして、HBSSで洗浄する。ウサギ補体(1:15希釈を150μl)を各
ウェルに添加して、37℃で30分間インキュベートする。PBMCを、アセトン中の1
mg/mlストック溶液から常に用時調製したフルオレセイン二酢酸(FDA)ストック
溶液、および、リン酸緩衝食塩水(PBS)中で50μg/mlで調製したヨウ化プロピ
ジウム(PI)で標識する。補体中で培養後、Accuri C6 フローサイトメーターを用いた
解析のために、250μlのHBSSおよび10μlのFDA/PIを含むチューブにピ
ペットで移す。
抗体媒介性補体依存性細胞傷害アッセイは、当業界で知られている。Diaz et al (Diaz
et al.、 2004 Transplant Immunology 13(4):313-317)の方法を行う。ヒト血清を、健
常なボランティアから得る。25%の熱失活血清を調製する。熱失活ヒト血清を段階的に
希釈して、各濃度100μlを、96ウェルのV字底アッセイプレートに入れる。血清を
、目的のブタ(GGTA1/CMAH/4GalNT2トリプルトランスジェニックまた
はその他)から得た100μlに分取したPBMCと混合する。PBMC最終濃度は、5
x106/mlまたは1x106/mlのいずれかである。血清濃度は、50%、17%
、2%、0.6%、0.2%、および0.07%と様々である。混合物を、4℃で30分
間インキュベートする。30分後、プレートを400xgで4分間遠心分離する。プレー
トをデカントして、HBSSで洗浄する。ウサギ補体(1:15希釈を150μl)を各
ウェルに添加して、37℃で30分間インキュベートする。PBMCを、アセトン中の1
mg/mlストック溶液から常に用時調製したフルオレセイン二酢酸(FDA)ストック
溶液、および、リン酸緩衝食塩水(PBS)中で50μg/mlで調製したヨウ化プロピ
ジウム(PI)で標識する。補体中で培養後、Accuri C6 フローサイトメーターを用いた
解析のために、250μlのHBSSおよび10μlのFDA/PIを含むチューブにピ
ペットで移す。
死細胞(PI+/FDA-)、損傷細胞(PI+/FDA+)および生細胞のパーセン
テージを決定する。ダブルネガティブな事象(PI-/FDA-)を、計算から除外する
。血清に曝されていない細胞における細胞傷害性のパーセンテージを、自然な死滅と考え
る。細胞傷害性の値を、自然な死滅に関して補正する。
テージを決定する。ダブルネガティブな事象(PI-/FDA-)を、計算から除外する
。血清に曝されていない細胞における細胞傷害性のパーセンテージを、自然な死滅と考え
る。細胞傷害性の値を、自然な死滅に関して補正する。
実施例22.ブタ肝臓の調達
ブタを、プロポフォールにより、前投与、挿管および麻酔して、仰臥位にする。腹部へ
の正中切開を行う。肝臓への靱帯の付着を取り除く。門脈および肝動脈をカニューレ処置
し、2リットルの冷却したヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸溶液(Essential
Pharmaceuticals、 LLC)を流す。肝臓をブタから除去し、肝臓灌流回路に設置するまで
、氷上にて4℃でヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸溶液に保管する。冷阻血
時間は45分から3時間の範囲で様々である。特定の実験において、ブタの肝臓を屠殺場
から得てもよい。屠殺場から得たブタの肝臓に、失血している2分間以内に、ヘパリン(
2000U/L)を含むヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸溶液を流す。
ブタを、プロポフォールにより、前投与、挿管および麻酔して、仰臥位にする。腹部へ
の正中切開を行う。肝臓への靱帯の付着を取り除く。門脈および肝動脈をカニューレ処置
し、2リットルの冷却したヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸溶液(Essential
Pharmaceuticals、 LLC)を流す。肝臓をブタから除去し、肝臓灌流回路に設置するまで
、氷上にて4℃でヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸溶液に保管する。冷阻血
時間は45分から3時間の範囲で様々である。特定の実験において、ブタの肝臓を屠殺場
から得てもよい。屠殺場から得たブタの肝臓に、失血している2分間以内に、ヘパリン(
2000U/L)を含むヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸溶液を流す。
実施例23.血小板取り込み解析I
血小板を、蛍光緑色細胞質マーカーである、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミ
ジルエステル(CFSE)、で標識する。正常体温のブタ肝臓灌流システムを用いる。目
的のノックアウトブタまたは野生型ブタ由来のブタ肝臓を、血小板の添加に先立ち2時間
灌流する。およそ3,000億個の血小板(非標識70%、標識30%)を、灌流システ
ムに添加する。様々な所定の時点で、生検材料をブタ肝臓から取得する。生検材料を、共
焦点顕微鏡により調べる。生検材料を、バイベル・パラーデ小体に特異的な染色剤で処理
する。バイベル・パラーデ小体は、血小板および内皮細胞内で生じる。蛍光ELISAに
基づくアッセイを行う。血小板はヒトまたはヒヒである。あるいは、共焦点顕微鏡観察の
前に、生検材料を内皮細胞マーカーおよびリソソームマーカーで標識する。
血小板を、蛍光緑色細胞質マーカーである、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミ
ジルエステル(CFSE)、で標識する。正常体温のブタ肝臓灌流システムを用いる。目
的のノックアウトブタまたは野生型ブタ由来のブタ肝臓を、血小板の添加に先立ち2時間
灌流する。およそ3,000億個の血小板(非標識70%、標識30%)を、灌流システ
ムに添加する。様々な所定の時点で、生検材料をブタ肝臓から取得する。生検材料を、共
焦点顕微鏡により調べる。生検材料を、バイベル・パラーデ小体に特異的な染色剤で処理
する。バイベル・パラーデ小体は、血小板および内皮細胞内で生じる。蛍光ELISAに
基づくアッセイを行う。血小板はヒトまたはヒヒである。あるいは、共焦点顕微鏡観察の
前に、生検材料を内皮細胞マーカーおよびリソソームマーカーで標識する。
実施例24.血小板取り込み解析II
血小板を、蛍光緑色細胞質マーカーである、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミ
ジルエステル(CFSE)で標識する。正常体温のブタ肝臓灌流システムを用いる。目的
のノックアウトブタまたは野生型ブタ由来のブタ肝臓を、血小板の添加に先立ち2時間灌
流する。生検材料を、透過型電子顕微鏡観察(TEM)により解析する。
血小板を、蛍光緑色細胞質マーカーである、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミ
ジルエステル(CFSE)で標識する。正常体温のブタ肝臓灌流システムを用いる。目的
のノックアウトブタまたは野生型ブタ由来のブタ肝臓を、血小板の添加に先立ち2時間灌
流する。生検材料を、透過型電子顕微鏡観察(TEM)により解析する。
実施例25.インビトロ血小板取り込み
初代肝臓類洞内皮細胞(LSEC)を、目的のブタ肝臓の類洞から単離する。初代野生
型ブタLSECは、5日間培養後に食作用能を失う;これらの実験は、3日目および4日
目のLSECで行う。ヒトまたはヒヒ血小板を、本明細書の他の部分に記載したように、
CFSEで標識する。単離したLSECと、標識した血小板とを、共にインキュベートす
る。サンプルを共焦点顕微鏡観察により解析する。
初代肝臓類洞内皮細胞(LSEC)を、目的のブタ肝臓の類洞から単離する。初代野生
型ブタLSECは、5日間培養後に食作用能を失う;これらの実験は、3日目および4日
目のLSECで行う。ヒトまたはヒヒ血小板を、本明細書の他の部分に記載したように、
CFSEで標識する。単離したLSECと、標識した血小板とを、共にインキュベートす
る。サンプルを共焦点顕微鏡観察により解析する。
実施例26.NHPにおける腎臓異種移植
レシピエント非ヒト霊長類(NHP)を、抗CD4/抗CD8(50mg/kg)、抗
CD154/抗CD28dAb、MMFおよびステロイドの単回投与で処置する。いくつ
かの研究において、タクロリムスを用いる(目標レベル8-12)。アカゲザル(Macaca
mulatta)を、NHPとして用いる。いくつかの実験において、アカゲザルは3-5歳およ
び6kg未満であってよい。ノックアウトブタの腎臓(または野生型コントロールの腎臓
)を、NHPレシピエントに移植する。サンプル(血液、尿、および腎臓生検サンプル)
を、解析のために規定した時点で回収する。腎臓の機能、血清クレアチニン、異種抗体の
存在と量(フローサイトメトリーおよびマルチパラメーターフローサイトメトリー)、サイ
トカイン分泌、末梢血液、尿および移植片生検材料からの転写プロファイル、異種移植片
組織学的検査および抗ブタ抗体の開発(フローベース異種交差適合アッセイ)を続いて行
う。CMAHの欠失は、NHPにおける研究にとって有用でない。NHP研究に対して、
野生型CMAH遺伝子を有するブタを用いる(Gal-/β4GalNT2)。超音波ガ
イド針生検を、移植後2、5および10週間目に行う。
レシピエント非ヒト霊長類(NHP)を、抗CD4/抗CD8(50mg/kg)、抗
CD154/抗CD28dAb、MMFおよびステロイドの単回投与で処置する。いくつ
かの研究において、タクロリムスを用いる(目標レベル8-12)。アカゲザル(Macaca
mulatta)を、NHPとして用いる。いくつかの実験において、アカゲザルは3-5歳およ
び6kg未満であってよい。ノックアウトブタの腎臓(または野生型コントロールの腎臓
)を、NHPレシピエントに移植する。サンプル(血液、尿、および腎臓生検サンプル)
を、解析のために規定した時点で回収する。腎臓の機能、血清クレアチニン、異種抗体の
存在と量(フローサイトメトリーおよびマルチパラメーターフローサイトメトリー)、サイ
トカイン分泌、末梢血液、尿および移植片生検材料からの転写プロファイル、異種移植片
組織学的検査および抗ブタ抗体の開発(フローベース異種交差適合アッセイ)を続いて行
う。CMAHの欠失は、NHPにおける研究にとって有用でない。NHP研究に対して、
野生型CMAH遺伝子を有するブタを用いる(Gal-/β4GalNT2)。超音波ガ
イド針生検を、移植後2、5および10週間目に行う。
実施例27.NHPの獣医による治療
NHPを個々のケージに入れ、清潔で適切な大きさの居住区を与える;1日2回餌を与
え;動物ケア技術者が少なくとも1日2回チェックし、臨床獣医スタッフが1日1回チェ
ックする。動物を採血または他の手順のために麻酔するたびに、身体検査を行う。
NHPを個々のケージに入れ、清潔で適切な大きさの居住区を与える;1日2回餌を与
え;動物ケア技術者が少なくとも1日2回チェックし、臨床獣医スタッフが1日1回チェ
ックする。動物を採血または他の手順のために麻酔するたびに、身体検査を行う。
実施例28.NHP静脈切開および組織サンプリング
NHPの静脈切開および組織サンプリング(例えば:採血、リンパ節生検および骨髄穿
刺)を、ケタミン(10mg/kg)またはテラゾール(4mg/kg)麻酔下のいずれ
かで、飢餓状態の動物に行う。ブプレノルフィン(6時間ごとに0.01mg/kg)を
、腎臓移植をうけている動物の術後鎮痛として、必要に応じて担当獣医により決定された
場合に、投与する。例えば、ベースラインからの25%の体重の減少;4日間の完全な食
欲不振;主要臓器不全または治療に非応答性の症状、例えば呼吸困難、黄疸、尿毒症、難
治性下痢症、自傷または持続性嘔吐、および即時介入(immediate intervention)に非応
答性の手術合併症:出血、血管移植/循環不全、感染および創し開などであるが、これら
に限定されない「不可逆的な重症疾患」について、動物をモニターする。
NHPの静脈切開および組織サンプリング(例えば:採血、リンパ節生検および骨髄穿
刺)を、ケタミン(10mg/kg)またはテラゾール(4mg/kg)麻酔下のいずれ
かで、飢餓状態の動物に行う。ブプレノルフィン(6時間ごとに0.01mg/kg)を
、腎臓移植をうけている動物の術後鎮痛として、必要に応じて担当獣医により決定された
場合に、投与する。例えば、ベースラインからの25%の体重の減少;4日間の完全な食
欲不振;主要臓器不全または治療に非応答性の症状、例えば呼吸困難、黄疸、尿毒症、難
治性下痢症、自傷または持続性嘔吐、および即時介入(immediate intervention)に非応
答性の手術合併症:出血、血管移植/循環不全、感染および創し開などであるが、これら
に限定されない「不可逆的な重症疾患」について、動物をモニターする。
実施例29.ブタの胚移植手術、静脈切開および摘出手順
胚移植手術:手術前に、挿管のためにTKX(テラゾール(500mg)+ケタミン(
250mg)およびキシラジン(250mg);50ポンド当たり1cc、筋肉内)によ
り雌ブタに麻酔をし、また、精密気化器を用いて排ガスを排除して、ETチューブを通じ
た吸入によりイソフルランにより麻酔した。回復期の間、動物を少なくとも15分に1回
モニターし、バイタルサイン(体温、脈拍、呼吸速度および毛細血管の再充満時間)を評
価して記録する。訓練された動物ケア技術者または獣医は、該動物を、自発的に胸骨臥位
において自立できるまで、モニターする。担当獣医の承認により、動物を通常の居住エリ
アに返す。術後の鎮痛薬には、8~12時間ごとの0.01-0.05mg/kgの筋肉
内ブプレノルフィン投与、または、毎日の2-4mg/kgの皮下投与が含まれる。胚移
植のおよそ26日後に、超音波を行い、雌ブタが食事で注意をそらしている間に、妊娠の
成立を確認する。約10日後に、2回目の超音波を行う。臨床上の困難が生じなければ、
出生は自然分娩で生じる。帝王切開は、獣医スタッフが推奨した場合に行う。標準的な帝
王切開プロトコルは、胚移植手術で用いられる一般的な麻酔プロトコルと共に用いられる
。実験用子ブタを無菌状態にし、臍帯を消毒する。全ての子ブタは、出生後最初の数時間
の間に、初乳をもらう。子ブタは、少なくとも7日齢まで、24時間観察する。子ブタが
乳を飲む能力を維持している間、子ブタをその母親から保護するために、出産クレート(
Farrowing crate)を用いる。
胚移植手術:手術前に、挿管のためにTKX(テラゾール(500mg)+ケタミン(
250mg)およびキシラジン(250mg);50ポンド当たり1cc、筋肉内)によ
り雌ブタに麻酔をし、また、精密気化器を用いて排ガスを排除して、ETチューブを通じ
た吸入によりイソフルランにより麻酔した。回復期の間、動物を少なくとも15分に1回
モニターし、バイタルサイン(体温、脈拍、呼吸速度および毛細血管の再充満時間)を評
価して記録する。訓練された動物ケア技術者または獣医は、該動物を、自発的に胸骨臥位
において自立できるまで、モニターする。担当獣医の承認により、動物を通常の居住エリ
アに返す。術後の鎮痛薬には、8~12時間ごとの0.01-0.05mg/kgの筋肉
内ブプレノルフィン投与、または、毎日の2-4mg/kgの皮下投与が含まれる。胚移
植のおよそ26日後に、超音波を行い、雌ブタが食事で注意をそらしている間に、妊娠の
成立を確認する。約10日後に、2回目の超音波を行う。臨床上の困難が生じなければ、
出生は自然分娩で生じる。帝王切開は、獣医スタッフが推奨した場合に行う。標準的な帝
王切開プロトコルは、胚移植手術で用いられる一般的な麻酔プロトコルと共に用いられる
。実験用子ブタを無菌状態にし、臍帯を消毒する。全ての子ブタは、出生後最初の数時間
の間に、初乳をもらう。子ブタは、少なくとも7日齢まで、24時間観察する。子ブタが
乳を飲む能力を維持している間、子ブタをその母親から保護するために、出産クレート(
Farrowing crate)を用いる。
全ての静脈切開を、ケタミン(10mg/kg)またはテラゾール(4mg/kg)麻
酔下のいずれかで、飢餓状態の動物に行う。臓器摘出、最終外科手技は、挿管のための、
必要に応じてペントタール(10-20mg/kg)を加える麻酔プロトコル(テラゾー
ル(500mg)+ケタミン(250mg)+キシラジン(250mg);50ポンド当
たり1cc;筋肉内)、および、排ガス排除に影響を与える精密気化器を用いた、ETチ
ューブを通じた吸入によるイソフルランを用いる。ブタを生理食塩水で灌流後、心臓およ
び他の組織/臓器を除去する。または、ブタを吸入麻酔薬で麻酔し、バルビツール酸誘導
体(100-150mg/kg)で処理して、両側の気胸術(bilateral pneumothorax)
を行う。
酔下のいずれかで、飢餓状態の動物に行う。臓器摘出、最終外科手技は、挿管のための、
必要に応じてペントタール(10-20mg/kg)を加える麻酔プロトコル(テラゾー
ル(500mg)+ケタミン(250mg)+キシラジン(250mg);50ポンド当
たり1cc;筋肉内)、および、排ガス排除に影響を与える精密気化器を用いた、ETチ
ューブを通じた吸入によるイソフルランを用いる。ブタを生理食塩水で灌流後、心臓およ
び他の組織/臓器を除去する。または、ブタを吸入麻酔薬で麻酔し、バルビツール酸誘導
体(100-150mg/kg)で処理して、両側の気胸術(bilateral pneumothorax)
を行う。
実施例30.T細胞増殖応答に対する免疫抑制剤のCFSE MLR検討
アカゲザル由来のPBMCを、GGTA-/β4GalNT2-ダブルノックアウトブ
タまたはコントロールブタ由来のブタPBMCとともにインキュベートする。CFSEの
希釈液を、T細胞サブセットにおけるT細胞増殖を評価するために用いる。
アカゲザル由来のPBMCを、GGTA-/β4GalNT2-ダブルノックアウトブ
タまたはコントロールブタ由来のブタPBMCとともにインキュベートする。CFSEの
希釈液を、T細胞サブセットにおけるT細胞増殖を評価するために用いる。
実施例31.腎臓の異種移植における免疫抑制剤の検討
レシピエントマカクは、免疫学的に成熟し(CMV+、LCV+、SV40+、>4k
g)、MHCおよび系統が規定されている。免疫抑制の候補(抗CD154dAb、クロ
ーン5C8抗CD154)を、アカゲザルに投与する。レシピエントマカクを、移植に先
立ち、T細胞除去(抗CD4/抗CD8、単回投与)、MMF、ステロイドおよび免疫抑
制の候補で処理する。腎臓の機能を、血清クレアチニンを用いて評価する。クレアチニン
の増加、および/または、BUN>5.0mg/dlもしくは100mg/dlはそれぞ
れ、負の結果と考えられる。超音波ガイド針生検材料を、移植後2、5および10週間目
に行う。マルチパラメーターフローサイトメトリー(T、Bおよび他の細胞サブセット)
を用いた免疫表現型検査のために、移植前、および移植後毎週、末梢血液サンプルを回収
する。サイトカイン分泌並びに転写プロファイルのエクスビボ検討を含む機能性アッセイ
は、規定した時点の末梢血液、尿および移植片生検材料である。末梢血液サンプルにおけ
る、共刺激および共抑制の受容体(例えば、ICOS、CTLA-4、BTLA、PD-
1、LAG-3、TIM-3であるがこれらに限定されない)の発現を評価してよい。
レシピエントマカクは、免疫学的に成熟し(CMV+、LCV+、SV40+、>4k
g)、MHCおよび系統が規定されている。免疫抑制の候補(抗CD154dAb、クロ
ーン5C8抗CD154)を、アカゲザルに投与する。レシピエントマカクを、移植に先
立ち、T細胞除去(抗CD4/抗CD8、単回投与)、MMF、ステロイドおよび免疫抑
制の候補で処理する。腎臓の機能を、血清クレアチニンを用いて評価する。クレアチニン
の増加、および/または、BUN>5.0mg/dlもしくは100mg/dlはそれぞ
れ、負の結果と考えられる。超音波ガイド針生検材料を、移植後2、5および10週間目
に行う。マルチパラメーターフローサイトメトリー(T、Bおよび他の細胞サブセット)
を用いた免疫表現型検査のために、移植前、および移植後毎週、末梢血液サンプルを回収
する。サイトカイン分泌並びに転写プロファイルのエクスビボ検討を含む機能性アッセイ
は、規定した時点の末梢血液、尿および移植片生検材料である。末梢血液サンプルにおけ
る、共刺激および共抑制の受容体(例えば、ICOS、CTLA-4、BTLA、PD-
1、LAG-3、TIM-3であるがこれらに限定されない)の発現を評価してよい。
本発明は、例示のために本明細書で説明される実施形態に限定されるのでなく、特許請
求の範囲の範囲内にある全てを含む。例示的な実施形態を参照して本発明を記述している
が、本明細書で述べられる例示的な実施形態を記載しているいかなる限定または因子も、
明示的に特許請求の範囲に挙げられているのでなければ、特許請求の範囲の意味に組み込
まれることを意図していないことは、理解されるべきである。同様に、請求項の範囲内に
入るために、本明細書に記載される発明の特定された利点または目的の、いずれかまたは
全てを満たす必要はないことは、理解されるべきである。なぜなら、本発明は特許請求の
範囲により規定されているためであり、また、本発明の固有の、および/または予期しな
い利点が、たとえ本明細書内で明示的に論じられていなくても、存在し得るためである。
求の範囲の範囲内にある全てを含む。例示的な実施形態を参照して本発明を記述している
が、本明細書で述べられる例示的な実施形態を記載しているいかなる限定または因子も、
明示的に特許請求の範囲に挙げられているのでなければ、特許請求の範囲の意味に組み込
まれることを意図していないことは、理解されるべきである。同様に、請求項の範囲内に
入るために、本明細書に記載される発明の特定された利点または目的の、いずれかまたは
全てを満たす必要はないことは、理解されるべきである。なぜなら、本発明は特許請求の
範囲により規定されているためであり、また、本発明の固有の、および/または予期しな
い利点が、たとえ本明細書内で明示的に論じられていなくても、存在し得るためである。
さらに、本明細書で引用される全ての参考文献は、本明細書で完全に説明されるかのよ
うに、その全体が、全ての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
うに、その全体が、全ての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (32)
- 少なくとも1つの細胞の核ゲノムにおいて、破壊されたα(1、3)-ガラクトシルト
ランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α(1、3)-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現が野生型のブタと
比べて減少している、トランスジェニックブタ。 - 請求項1に記載のトランスジェニックブタから単離された、ブタの臓器、組織、輸血製
剤、または細胞。 - 皮膚、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、甲状腺、小腸、血液、およびそれらの構成成分か
らなる群から選択される、請求項2に記載のブタの臓器、組織、輸血製剤、または細胞。 - 該ブタ由来の臓器、組織、輸血製剤、または細胞がヒトに移植される場合に、野生型の
ブタ由来の臓器、組織、輸血製剤または細胞がヒトに移植される場合と比較して、拒絶反
応関連症状が改善される、請求項1に記載のトランスジェニックブタ。 - 該ブタ由来の臓器、組織、輸血製剤、または細胞がヒトに移植される場合に、拒絶反応
関連症状が細胞性拒絶反応関連症状、体液性拒絶反応関連症状、超急性拒絶反応関連症状
、急性体液性異種移植反応拒絶反応関連症状および急性血管性拒絶反応関連症状を含む群
から選択される、請求項4に記載のトランスジェニックブタ。 - 該ブタ由来の臓器、組織、輸血製剤、または細胞がヒトに移植される場合に、野生型の
ブタ由来の臓器、組織、輸血製剤または細胞がヒトに移植される場合と比較して、血小板
減少症が減少する、請求項4に記載のトランスジェニックブタ。 - 該トランスジェニックブタ由来の肝臓がヒト血小板に暴露される場合に、野生型のブタ
由来の肝臓がヒト血小板に暴露される場合と比較して、肝臓が血小板取り込みの減少を示
す、請求項1に記載のトランスジェニックブタ。 - 創傷からの早期分離の低減を示す、請求項1に記載のトランスジェニックブタから得ら
れる皮膚関連物。 - 創傷が、ヒトの皮膚の創傷である、請求項8に記載の皮膚関連物。
- 該トランスジェニックブタ由来の腎臓がヒトに移植される場合に、野生型のブタ由来の
腎臓がヒトに移植される場合と比較して、拒絶反応関連症状が減少する、請求項4に記載
のトランスジェニックブタ。 - ヒトに異種移植するための移植材料を製造する方法であって、請求項1に記載のトラン
スジェニックブタを該移植材料の供給源として提供することを含む方法であり、該移植材
料は、臓器、組織、輸血製剤および細胞からなる群から選択され、かつ、該移植材料はα
Gal抗原のレベルが低減し、Neu5GC抗原のレベルが低減し、またSda様抗原の
レベルが低減している、方法。 - 少なくとも1つの細胞の核ゲノムにおいて、破壊されたα(1、3)-ガラクトシルト
ランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含むトランスジェニックブ
タであって、ここで、該α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が
、GからAへの置換に隣接した3塩基対の欠失、1塩基対の欠失、1塩基対の挿入、2塩
基対の挿入、6塩基対の欠失、10塩基対の欠失、7塩基対の欠失、5塩基対の欠失に代
わる8塩基対の挿入、5塩基対の挿入、11塩基対の欠失および18塩基対の欠失を含む
破壊の群から選択され;ここで、該CMAH遺伝子の破壊が4塩基対の挿入、1塩基対の
欠失、2塩基対の欠失、3塩基対の欠失、5塩基対の欠失、8塩基対の欠失、20塩基対
の欠失、11塩基対の欠失、12塩基対の欠失、1塩基対の挿入、1塩基対の欠失に代わ
る2塩基対の挿入、4塩基対の挿入に代わる3塩基対の欠失、66塩基対の欠失かつ12
塩基対の挿入、および1塩基対の置換を伴う5塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され
、ここで、該β4GalNT2遺伝子の破壊が12塩基対の欠失、5塩基対の欠失、14
塩基対の欠失、12塩基対の欠失かつ1塩基対の置換、1塩基対の挿入を伴う271塩基
対の欠失、および1塩基対の挿入を含む破壊の群から選択され、ここで、α(1、3)-
ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現が野生型のブ
タと比較して減少しており、該トランスジェニックブタ由来の組織がヒトへ移植される場
合に、野生型のブタ由来の組織がヒトへ移植される場合と比較して、超急性拒絶反応関連
症状が改善される、トランスジェニックブタ。 - 該α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が5塩基対の欠失、7
塩基対の欠失、および5塩基対の欠失と7塩基対の欠失の両方を含む群から選択され、該
CMAH遺伝子の破壊が12塩基対の欠失および3塩基対の欠失に代わる4塩基対の置換
を含む破壊の群から選択され、該β4GalNT2遺伝子の破壊が12塩基対の欠失、5
塩基対の欠失および1塩基対の挿入を含む破壊の群から選択され、α(1、3)-ガラク
トシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現が野生型のブタと比
較して減少しており、該トランスジェニックブタ由来の組織がヒトへ移植される場合に、
野生型のブタ由来の組織がヒトへ移植される場合と比較して、超急性拒絶反応関連症状が
改善される、請求項12に記載のトランスジェニックブタ。 - α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が11塩基対の欠失およ
び18塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され、CMAH遺伝子の破壊が66塩基対の
欠失/12塩基対の挿入および5塩基対の欠失/1塩基対の置換を含む破壊の群から選択さ
れ、β4GalNT2遺伝子の破壊が14塩基対の欠失、12塩基対の欠失、および27
1塩基対の欠失/1塩基対の挿入を含む破壊の群から選択され、α(1、3)-ガラクト
シルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現が野生型のブタと比較
して減少しており、該トランスジェニックブタ由来の組織がヒトへ移植される場合に、野
生型のブタ由来の組織がヒトへ移植される場合と比較して、超急性拒絶反応関連症状が改
善される、請求項12に記載のトランスジェニックブタ。 - ヒト対象がヒト臓器移植を必要とする対象として同定されてから、ヒト臓器移植が行わ
れるまでの期間を拡大させる方法であって、少なくとも1つの細胞の核ゲノムにおいて破
壊されたα(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalN
T2遺伝子を含み、α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ
4GalNT2の発現が野生型のブタと比較して減少しているトランスジェニックブタ由
来の臓器を提供すること、および治療的に有効な方法で該トランスジェニックブタ由来の
該臓器を該ヒト対象に取り付けることを含む方法。 - 該トランスジェニックブタ由来の臓器が、ヒト対象に体内に外科的に取り付けられる、
請求項15に記載の方法。 - 該トランスジェニックブタ由来の臓器が、ヒト対象に外部に外科的に取り付けられる、
請求項15に記載の方法。 - 該臓器が、直接的または間接的に該対象に取り付けられる、請求項15に記載の方法。
- ヒト対象がヒト肝臓移植を必要とする対象として同定されてから、ヒト肝臓移植が行わ
れるまでの期間を拡大させる方法であって、少なくとも1つの細胞の核ゲノムにおいて破
壊されたα(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalN
T2遺伝子を含み、α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ
4GalNT2の発現が野生型のブタと比較して減少しているトランスジェニックブタ由
来の肝臓を提供すること、および治療的に有効な方法で該トランスジェニックブタ由来の
該肝臓を該ヒト対象に取り付けることを含む方法。 - ヒトからの皮膚関連物の早期分離を低減する方法であって、破壊されたα(1、3)-
ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAH、およびβ4GalNT2を含み、α(1、
3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現が野生
型のブタと比較して減少しているトランスジェニックブタを提供すること、および、該ト
ランスジェニックブタ由来の皮膚関連物を製造することのステップを含む方法。 - αGal抗原、Sda様抗原およびNeu5GC抗原のレベルが低減されたブタの移植
材料を、移植を必要とする対象に移植することを含む、ヒト対象における超急性拒絶反応
関連症状を改善する方法であって、野生型のブタ由来のブタの移植材料がヒト対象に移植
される場合と比較して、超急性拒絶反応関連症状が改善される方法。 - 破壊されたα(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAH、およびβ4G
alNT2遺伝子を含み、α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHお
よびβ4GalNT2の発現が野生型のブタと比較して減少しているトランスジェニック
ブタから単離された、改変されたエピトーププロファイルを示す細胞培養試薬。 - 細胞培養培地、細胞培養血清、細胞培養添加物および増殖可能な単離細胞を含む群から選
択される、請求項22に記載の細胞培養試薬。 - 該α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が5塩基対の欠失、7
塩基対の欠失、および5塩基対の欠失と7塩基対の欠失の両方を含む群から選択され、該
CMAH遺伝子の破壊が12塩基対の欠失および3塩基対の欠失に代わる5塩基対の置換
を含む破壊の群から選択され、該β4GalNT2遺伝子の破壊が12塩基対の欠失、5
塩基対の欠失および1塩基対の挿入を含む破壊の群から選択されるトランスジェニックブ
タから単離される、請求項22に記載の細胞培養試薬。 - 該α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が11塩基対の欠失お
よび18塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され、CMAH遺伝子の破壊が66塩基対
の欠失/12塩基対の挿入および5塩基対の欠失/1塩基対の置換を含む破壊の群から選択
され、β4GalNT2遺伝子の破壊が14塩基対の欠失、12塩基対の欠失/1塩基対
の置換、および271塩基対の欠失/1塩基対の挿入を含む破壊の群から選択されるトラ
ンスジェニックブタから単離される、請求項22に記載の細胞培養試薬。 - 改変されたエピトーププロファイルを有する目的化合物を生産する方法であって、破壊
されたα(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAH、およびβ4GalN
T2遺伝子を含み、α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ
4GalNT2の発現が野生型のブタと比較して減少しているトランスジェニックブタか
ら単離される、改変されたエピトーププロファイルを示す細胞培養試薬を提供するステッ
プと、目的化合物を発現できる単離細胞を該細胞培養試薬と共に培養するステップとを含
み、目的化合物上のNeu5Gcエピトープ、Sda様エピトープまたはalphaGa
lエピトープのレベルが、野生型のブタから単離された細胞培養試薬と共に培養された単
離細胞から目的化合物が生産された場合の目的化合物上の該エピトープのレベルよりも低
い、方法。 - 目的化合物が、糖脂質および糖タンパク質を含む群から選択される、請求項26に記載
の方法。 - 目的化合物が、抗体、増殖因子、サイトカイン、ホルモンおよび凝固因子を含む糖タン
パク質の群から選択される糖タンパク質である、請求項27に記載の方法。 - 該α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が5塩基対の欠失、7
塩基対の欠失、および5塩基対の欠失と7塩基対の欠失の両方を含む群から選択され、C
MAH遺伝子の破壊が12塩基対の欠失および、3塩基対の欠失に代わる5塩基対の置換
を含む破壊の群から選択され、該β4GalNT2遺伝子が12塩基対の欠失、5塩基対
の欠失および1塩基対の挿入を含む破壊の群から選択されるトランスジェニックブタから
細胞培養試薬が単離される、請求項26に記載の方法。 - 該α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が11塩基対の欠失お
よび18塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され、該CMAH遺伝子の破壊が66塩基
対の欠失/12塩基対の挿入および5塩基対の欠失/1塩基対の置換を含む破壊の群から選
択され、該β4GalNT2遺伝子の破壊が14塩基対の欠失、12塩基対の欠失/1塩
基対の置換、および271塩基対の欠失/1塩基対の挿入を含む破壊の群から選択され、
α(1、3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発
現が野生型のブタと比較して減少しているトランスジェニックブタから細胞培養試薬が単
離される、請求項26に記載の方法。 - αGal抗原のレベルが低減し、Sda様抗原のレベルが低減し、かつ、Neu5Gc
抗原のレベルが低減している、ヒトへの移植のためのブタの移植材料。 - 少なくとも1つの細胞の核ゲノムにおいて破壊されたα(1、3)-ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子を含み、α(1、3)-ガラク
トシルトランスフェラーゼ、CMAHおよびβ4GalNT2の発現が野生型のブタと比
較して減少しており、VVL結合が低減している、トランスジェニックブタ。
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